DE68906054T2

DE68906054T2 - Hyperimmunizierte milch gegen bluthochdruck.

Info

Publication number: DE68906054T2
Application number: DE8989301918T
Authority: DE
Inventors: Lee R Beck; Ralph J Stolle
Original assignee: Stolle Research and Development Corp
Current assignee: Stolle Milk Biologics Inc
Priority date: 1988-02-26
Filing date: 1989-02-27
Publication date: 1993-09-16
Anticipated expiration: 2009-02-28
Also published as: AU3350089A; IE63032B1; ES2039847T3; DK201590D0; EP0330521B1; DK201590A; CA1339760C; US4879110A; ATE88349T1; IL89352A; JP2792973B2; JPH03505866A; IE890607L; EP0330521A2; DE68906054D1; IL89352A0; MX168997B; EP0330521A3; AU621604B2; HK1005013A1

Description

Diese Erfindung betrifft die Herstellung einer biologischen, den Blutdruck senkenden Zusammensetzung und die Verwendung solcher Zusammensetzungen zur Senkung erhöhten arteriellen Drucks bei Patienten.
Ein erhöhter arterieller Druck (d.h. Hypertonie, hoher Blutdruck) ist wahrscheinlich das wichtigste allgemeine Gesundheitsproblem in entwickelten Ländern - er ist weitverbreitet, asymptomatisch, leicht nachzuweisen und führt oftmals zu letalen Komplikationen, wenn er nicht behandelt wird. Williams, G.H. et al., in: Harrison's Principles of Internal Medicine, 10. Aufl., Petersdorf, R.G., et al., Hrsg., McGraw-Hill, New York, 1983, Kapitel 247.
Hypertonische Patienten werden in zwei große Kategorien eingeteilt. Ein verhältnismäßig kleiner Teil der Patienten entwickelt Hypertonie als Manifestation einer identifizierbaren und spezifisch behandelbaren zugrundeliegenden Ursache, wie Phäochromozytome, Nierenarterienstenose oder Erkrankung der innersekretorischen Drüsen. Bei diesen Patienten spricht man von einer sekundären Hypertonie.
80 - 95% der Patienten mit anhaltend erhöhtem arteriellen Druck haben keinen erkennbaren zugrundeliegenden verursachenden Faktor. Bei diesen Patienten spricht man von einer essentiellen oder primären oder idiopathischen Hypertonie.
Die Ätiologie der essentiellen Hypertonie umfaßt höchstwahrscheinlich mehrere Faktoren. Zu solchen Faktoren zählen das sympathische und parasympathische Nervensystem, die Barorezeptorfunktion, das Renin-Angiotensin-Aldosteron- und das Atrio-Natriuresefaktor-System, die den renalen Natrium- und Wasserfluß regulieren. Zusätzlich wurden genetische und kardiovaskuläre Risikofaktoren wie Fettleibigkeit, Hypercholesterinämie, Diabetes, Salzeinnahme, Beruf und Rauchen lange bei der Entstehung der essentiellen Hypertonie als wichtig erachtet.
Unabhängig von der Ätiologie der Krankheit sterben Patienten mit unbehandelter Hypertonie frühzeitig, häufig aufgrund einer Herzerkrankung, aber oftmals mit häufig auftretenden Schlaganfallen und Nierenversagen. Das Ergebnis von klinischen Versuchen liefert einen sicheren Beweis, daß die Verringerung des diastolischen Blutdrucks über 90 mm Hg bei Patienten mittleren Alters mit einer Verringerung der kardiovaskulären Morbidität und Mortalität verbunden ist. Blaschke, T.F., et al., in: Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Gilman, A.G., et al., Hrsg., McMiilan, New York, 1980, Kapitel 32.
Gegenwärtige Behandlungen der Hypertonie bestehen aus allgemeinen und spezifischen Maßnahmen. Zu den allgemeinen Maßnahmen zählen die kontrollierte Ernährung und das Ausschalten von kardiovaskulären Risikofaktoren wie Übergewicht, Rauchen, hohe Salzeinnahme, Streß usw..
Spezifische Maßnahmen zur Behandlung der Hypertonie bestehen aus der Therapie mit blutdrucksenkenden Medikamenten. Viele klinische Studien haben gezeigt, daß in nahezu allen Fällen einer hypertonischen kardiovaskulären Erkrankung der Blutdruck durch fachkundige Verwendung der gegenwärtig verfügbaren Arzneimittel erfolgreich reguliert werden kann. Es wurde jedoch auch geschätzt, daß nur ein kleiner Prozentsatz aller in Behandlung stehender hypertonischer Patienten auch nur annähernd optimal kontrolliert wird. Die wirksame Verwendung von blutdrucksenkenden Arzneimitteln ist daher nicht "Routine" und die Therapie muß auf den einzelnen Patienten abgestimmt und der Notwendigkeit entsprechend eingestellt werden, um ein optimales Gleichgewicht zwischen den therapeutischen Wirkungen und den gut bekannten Nebenwirkungen, die mit dem gegenwärtig verwendeten blutdrucksenkenden Arzneimitteln verbunden sind, zu erzielen. Blaschke et al., supra bei 809.
Gegenwärtig werden vier Klassen von blutdrucksenkenden Mitteln verwendet, von welchen jede auf einen anderen Krankheitsmechanismus gerichtet ist. Zu diesen Klassen zählen: Diuretika, Antiadrenergika, Vasodilatoren und Angiotensinblocker. Jede ist bei entsprechenden Patienten therapeutisch wirksam, aber jede kann starke Nebenwirkungen auslösen; alle sind teuer.
Die beliebten Thiazindiuretika sind rasch wirksam, können aber unerwünschte Nebenwirkungen wie Hypokaliämie, Hypourikämie und Kohlehydratunverträglichkeit hervorrufen. Antiadrenergische Arzneimittel (d.h. "Betablocker") sind bei einigen Arten von Hypertonie wirksam, d.h. wenn eine erhöhte Herz-Sympathikusaktivität vorliegt, aber solche Arzneimittel können eine Stauungsinsuffizienz des Herzens und Asthma auslösen und müssen bei Diabetikern mit Vorsicht angewendet werden; weitere Nebenwirkungen umfassen Schwindel, Depression, Übelkeit, Erbrechen, Diarrhoe und Verstopfung. Vasodilatoren, die primär auf den Arterienwiderstand und nicht auf die venöse Kapazität wirken, sind bei Hypertonie wirksam, aber die Wirkungen solcher Mittel werden leider durch Reflexanstiege in sympathischen Entladungen, die zu einem Anstieg der Herzfrequenz und der Herzfördermenge führen, unwirksam gemacht. Somit sind Vasodilatoren bei schwerer Koronararterienerkrankung kontraindiziert und es ist auch bekannt, daß sie unerwünschte Nebenwirkungen wie Kopfschmerzen, Tachykardie, Angina pectoris, Anoxie, Übelkeit, Erbrechen, Diarrhoe und ein flechtenähnliches Syndrom hervorrufen. Angiotensinblocker sind vielversprechend, aber zu häufigen Nebenwirkungen zählen Leukopenie, Panzytopenie, Proteinurie, Nephrose-Syndrom, Ausschlag, Fieber und Geschmacksverlust. Williams et al., supra bei 1485.
Bei allen außer schwach hypertonischen Patienten, die auf Diuretika oder Betablocker gut ansprechen, werden Arzneimittelkombinationen verwendet. Eine erfolgreiche Kombination ist eine, deren Bestandteile eine therapeutische Summations- oder Synergiewirkung hervorrufen, während sie eine geringe Toxizität verursachen. Im idealen Fall sollte die Therapie den Blutdruck wirksam senken, ohne Nebenwirkungen hervorzurufen, die für den Patienten so unerträglich werden, daß das Einhalten der Maßnahmen bedroht ist, oder die Lebensfunktion des Gehirns, Herzens oder der Niere gefährden.
Ein sehr schwieriges und wichtiges Problem bei der Arzneimitteltherapie der Hypertonie ist die Bestimmung, welche Nebenwirkungen als "annehmbar" einzustufen sind. Alle wirksamen blutdrucksenkenden Arzneimittel können so starke Nebenwirkungen hervorrufen, daß sich Patienten, denen Placebo verabreicht wurde, in klinischen Versuchen besser fühlten, als jene, die blutdrucksenkende Arzneimittel erhielten. Blaschke et al., supra bei 809.
Angesichts dieser Nachteile sind die Einschränkungen der blutdrucksenkenden Arzneimitteltherapie nach dem Stand der Wissenschaft leicht erkennbar. Es besteht daher ein besonderer Bedarf an einem Mittel gegen Bluthochdruck, das kostengünstig, leicht verfügbar, von einer natürlichen Quelle abgeleitet, leicht zu verabreichen, hochwirksam bei Hypertonie und frei von unerwünschten Nebenwirkungen ist. Die hyperimmunifizierte Kuhmilch der vorliegenden Erfindung ist ein solches Mittel gegen Bluthochdruck.
Nach dem Stand der Wissenschaft ist bekannt, Milch mit einer Reihe von therapeutischen Wirkungen herzustellen. Zum Beispiel offenbarte Beck eine Milch, die Antikörper zu Staphylococcus mutans enthält und karieshemmende Wirkungen besitzt (Beck, U.S. Patent Nr. 4.324.782; Britisches Patent 1.505.513). Die Milch wird durch Hyperimmunisierung einer Kuh mit Streptococcus mutans-Antigen und Entnahme der therapeutischen Milch erhalten. Beck hat auch eine Milch mit antiarthritischen Eigenschaften beschrieben (U.S. Patent Nr. 4.732.757) und hat ein Verfahren zur Behandlung von Entzündung unter Verwendung von Milch von hyperimmunisierten Kühen patentieren lassen (Beck, U.S. Patent 4.284.623). Stolle offenbarte ein Verfahren zur Verwendung von Milch von einer hyperimmunisierten Kuh zur Behandlung von Erkrankungen der vaskulären und pulmonalen Systeme (Stolle et al., U.S. Patent 4.636.384). Heinbach, U.S. Patent 3. 128.230, offenbarte Milch, die Alpha-, Beta- und Gammaglobuline gegen anti-9-enische Haptene enthält. Singh (U.S. Patent 3.911.108), Peterson (U.S. Patent 3.376.198 und Kanadisches Patent 587.849), Holm (U.S. Anmeldung (veröffentlicht) Seriennr. 628.987), Tannah et al. (Britisches Patent 1.211.876) und Biokema S.A. (Britisches Patent 1.442.283) haben auch antikörperhältige Milcharten beschrieben. Steffkoff et al., Minerva Medica (Italien) 56:4163-4 (1965) haben die Behandlung von hypertonischen Erkrankungen mit saurer Milch beschrieben.
Es ist dem Fachmann der Immunologie gut bekannt, daß Serumglobulinfraktionen, die aus verschiedenen Antikörperarten wie IgA, IgG und IgM bestehen, verwendet werden können, um den entsprechenden Antigenen entgegenzuwirken, wodurch die Wirkungen der Antigene neutralisiert werden. Es gibt eine nahezu unbegrenzte Zahl schädlicher Antigene, denen Tiere ausgesetzt werden können, einschließlich karzinogener, bakterieller, viraler und regulierender Faktoren pflanzlichen und tierischen Ursprungs, wie auch Toxine und Gifte.
Bei Kontakt mit einem fremden Antigen, z.B. einem Bakterium, erzeugt das Immunsystem des Wirts Antikörper, die die Wirkungen des Antigens neutralisieren.
Solchen fremden Antigenen wird ein Wirt entweder auf natürliche Weise oder willkürlich durch Verabreichung des Antigens in Impfstofform ausgesetzt. Letzteres wird im allgemeinen als aktive Immunisierung der Wirtsart, die dem Antigen ausgesetzt ist, bezeichnet. Die als Rektion auf eine solche Impfung erzeugten Antikörper sind für diese bestimmte Tierart homolog und zu dem Antigenepitop.
U.S. Patent 4.636.384 und U.S. Anmeldung Nr. 001.848, eingereicht am 9. Jänner 1987, betreffen ein Verfahren zur Senkung des Blutfettspiegels und Behandlung von fettbedingten vaskulären Erkrankungen wie auch die Behandlung von makrophagenbedingten pulmonalen Erkrankungen und umfassen die Verabreichung von antikörperhältiger Milch von Kühen, die durch Injektionen polyvalenter Antigene, die von Mischungen aus getöteten Bakterien erhalten werden, in einem hyperimmunisierten Zustand gehalten werden, an Versuchstiere und Menschen. Eine weitere schwebende Anmeldung (U.S. Anmeldung Nr. 069.139, eingereicht am 2. Juli 1987) betrifft antikörperhältige Milch von hyperimmunisierten Kühen zur Behandlung von Magendarmerkrankungen. Die vorliegende Erfindung ist eine Weiterentwicklung der offenbarten und in den obengenannten Anmeldungen beanspruchten Erfindungen.
Alle diese Verweise betreffen jedoch nur die Isolierung von Immunglobulinen von hyperimmunisierten Tieren, die gegen verschiedene Antigene gebildet wurden, und die anschließende Verwendung dieser Antigene für diagnostische Verfahren, homologe oder heterologe passive Immunisierung oder aktive Immunisierung. In keiner dieser Verweisstellen wird ein Vorschlag gebracht oder eine Mutmaßung angestellt, daß Milch von hyperimmunisierten Kühen zum Senken des arteriellen Blutdrucks zweckmäßig wäre.
Die Erfinder haben bereits hyperimmunisierte Kuhmilch mit entzündungshemmenden Wirkungen und mit günstigen Wirkungen auf vaskuläre, pulmonale und Magendarmerkrankungen beschrieben.
Die günstigen vaskulären Wirkungen der hyperimmunisierten Kuhmilch veranlaßte die Erfinder, mögliche Wirkungen der Milch auf erhöhten arteriellen Druck bei Menschen und anderen Tieren zu untersuchen.
Mit dieser Absicht gelang dann den Erfindern eine unerwartete Entdeckung, daß Milch, die von Kühen erhalten wurde, die gegen gewisse bakterielle Antigene hyperimmunisiert sind, (d.h. die hyperimmunisierte Milch der Erfindung) bei oraler Verabreichung an hypertonische Patienten den Blutdruck stark auf normale Blutdruckwerte senkte und dies ohne nachweisbare unerwünschte Nebenwirkungen. Es wurde auch entdeckt, daß Milch von nicht hyperimmunisierten Kühen auch antihypertonische Aktivität besitzt, daß aber diese Aktivität stark durch die Hyperimmunisierung der Spenderkuh verstärkt wird.
Daher betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von hyperimmunisierter Kuhmilch, eine Zusammensetzung der Milch, die zur Verabreichung an einen Patienten geeignet ist, und die Verwendung der Zusammensetzung zur Senkung von erhöhtem arteriellen Druck bei solchen Patienten.
In einem ersten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird ein Faktor gegen Bluthochdruck in im wesentlichen reiner Form geschaffen, herstellbar durch ein Verfahren, bestehend aus:
i) Erhalten von Milch von einem hyperimmunisierten Tier;
ii) Entfernen von Makromolekülen mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 10.000 Dalton aus der Milch;
iii) Fraktionieren durch Ionenaustausch-Chromatographie des Produktes mit weniger als 10.000 Dalton aus Schritt (ii), um ein negativ geladenes Produkt mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 10.000 Dalton zu erhalten;
iv) Fraktionieren des negativ geladenen Produktes aus Schritt (iii) durch Molekularsiebchromatographie;
v) Isolieren des in Schritt (iv) fraktionierten Produktes gegen Bluthochdruck durch isoelektrische Fällung.
Die isoelektrische Fällung kann bei pH-Werten über etwa 9 und unter etwa 10, vorzugsweise bei etwa pH 10,5, durchgeführt werden.
In einem zweiten Merkmal der Erfindung wird ein Verfahren zur Isolierung eines im wesentlichen reinen Milchfaktors gegen Bluthochdruck geschaffen, wobei das Verfahren dem zuvor beschriebenen des ersten Merkmals der Erfindung entspricht.
In einem dritten Merkmal der Erfindung wird die Verwendung der Milch von einem hyperimmunisierten Tier in der Zubereitung eines Mittels gegen Bluthochdruck beschrieben.
Die Milch kann Vollmilch (zum Beispiel Vollmilchpulver), Magermilch (zum Beispiel Magermilchpulver), Molke oder eine Subfraktion von Molke umfassen.
In einem weiteren Merkmal zeigt die Erfindung die Verwendung des obenbeschriebenen Faktors gegen Bluthochdruck in der Zubereitung eines Mittels gegen Bluthochdruck.
Vorzugsweise umfaßt der Milchfaktor gegen Bluthochdruck das im wesentlichen reine Molekül mit einem Molekulargewicht unter etwa 10.000 Dalton.
In einem weiteren Merkmal der Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung geschaffen, die einen Faktor gegen Bluthochdruck wie oben beschrieben und einen pharmazeutisch oder veterinärisch verträglichen Träger umfaßt.
Die Zusammensetzung kann zur oralen, parenteralen oder intranasalen Verabreichung bestimmt sein. Wenn sie zur oralen Verabreichung dient, kann die Zusammensetzung eine Suspension des Faktors in einem pharmazeutisch oder veterinärisch verträglichen Träger oder auch eine eingekapselte Form des Faktors umfassen, wobei die eingekapselte Form eine Kapselform mit verzögerter Freisetzung und/oder magensaftresistentem Überzug ist.
Wenn die Zusammensetzung zur parenteralen Verabreichung dient, kann die Verabreichung über den intravenösen, intraperitoneal, intramuskulären oder subkutanen Weg erfolgen.
In einem weiteren Merkmal der Erfindung wird eine sterile pharmazeutische Formulierung geschaffen, die einen Faktor gegen Bluthochdruck wie oben beschrieben umfaßt.
Eine umfassendere Kenntnis der Erfindung und vieler ihrer zugehörigen Vorteile wird mit Bezugnahme auf die folgende genaue Beschreibung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen vermittelt, von welchen:
Figur 1 die durchschnittliche prozentuelle Veränderung im systolischen Blutdruck bei menschlichen Patienten zeigt, die Kontrollmilch und hyperimmunisierte Milch tranken.
Figur 2 die Wirkung auf den systolischen Blutdruck im Laufe der Zeit nach intrabukkaler Absorption einer 5 mg Dosis von im wesentlichen reinem Milchfaktor gegen Bluthochdruck zeigt.
Figur 3 das Elutionsprofil mit einem Salzgradienten des Milchfaktors gegen Bluthochdruck von einer DEAE-Sepharose CL-6B Ionenaustauschsäule (Schritt 2) zeigt.
Figur 4 die Elutionsprofile mit Wasser des Milchfaktors gegen Bluthochdruck von einer Sephadex G-10 Molekularsiebsäule (Schritt 3) zeigt.

GENAUE BFSCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die Erfindung umfaßt ein natürliches Nahrungsmittel (Milch), das blutdrucksenkende Eigenschaften aufweist, ein Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung bei der Behandlung von Patienten mit erhöhtem arteriellen Druck. Die Erfindung stellt einen deutlichen Fortschritt im Stand der Wissenschaft der blutdrucksenkenden Pharmakologie dar, da das Produkt dieser Erfindung keine unerwünschten Nebenwirkungen besitzt. Milch gegen Bluthochdruck kann zur Behandlung von Bluthochdruck verwendet werden, der mit jeder Krankheit bei Tieren und Menschen verbunden ist, ohne Nebenwirkungen befürchten zu müssen, da es ein natürliches Nahrungsmittel ist. Beispiele für Krankheitszustände von Menschen, die mit der Milch gegen Bluthochdruck behandelt werden können, umfassen: primäre und sekundäre Hypertonie jeder Ätiologie. Mit dem Begriff "Hypertonie" ist für den Zweck dieser Erfindung erhöhter diastolischer arterieller Druck von zumindest 90 mm Hg gemeint. Mit dem Begriff "Faktor gegen Bluthochdruck" ist ein Faktor gemeint, der aus hyperimmunisierter Milch mit arteriendrucksenkender Aktivität gewonnen wird. Die Hyperimmunisierung des milcherzeugenden Tieres ergibt eine über dem Normalwert liegende Konzentration des Faktors gegen Bluthochdruck in der Milch, die für deren therapeutische Verwendung ausreicht. Mit dem Begriff "hyperimmunisierte Milch" ist für den Zweck der Erfindung Milch gemeint, die von milcherzeugenden Tieren gewonnen wird, die in einem hyperimmunisierten Zustand gehalten werden, wobei die Einzelheiten zur Hyperimmunisierung in der Folge genauer beschrieben werden. Mit dem Begriff "über dem Normalwert liegende Konzentration des Faktors gegen Bluthochdruck" ist eine Konzentration gemeint, die höher ist als jene, die in der Milch eines nicht hyperimmunisierten Tieres vorhanden ist.
Mit dem Begriff "milcherzeugendes Tier" sind für den Zweck dieser Erfindung Säugetiere gemeint, die Milch in wirtschaftlich geeigneten Mengen erzeugen, vorzugsweise Kühe, Schafe und Ziegen, besonders bevorzugt Milchkühe der Gattung Bos (Rinder), besonders jene Rassen, die die höchsten Milcherträge liefern, wie Holstein.
Mit dem Begriff "bakterielles Antigen" ist für den Zweck dieser Erfindung eine lyophilisierte Zubereitung von hitzegetöteten bakteriellen Zellen gemeint.
Mit dem Begriff "Behandeln" ist für den Zweck dieser Erfindung gemeint, daß die Symptome der Erkrankung verbessert oder vollständig beseitigt werden. Mit dem Begriff "verabreicht" ist für den Zweck dieser Erfindung jedes Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit einer Substanz, wie oral, intranasal, parenteral (intravenös, intramuskulär oder subkutan) oder rektal, in einem pharmazeutisch verträglichen Träger gemeint. Mit dem Begriff "Tier" ist für den Zweck dieser Erfindung jedes Lebewesen gemeint, das an Hypertonie leidet, einschließlich Menschen und Tieren.
Die Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß, wenn ein Rind durch periodische Auffrischungen mit einem Antigen oder einer Mischung von Antigenen in einen spezifischen Immunisierungszustand gebracht wird, das Rind Milch erzeugt, die äußerst günstige Eigenschaften in der Behandlung von Hypertonie besitzt. Die günstigen Eigenschaften der Milch werden verstärkt, wenn die Rinder immunisiert sind. Es genügt nicht, nur die Immunsensibilität auszulösen, um die blutdrucksenkenden Eigenschaften in der Milch zu verstärken, wie durch die Tatsache belegt wird, daß normale Kuhmilch einen geringeren Wert an Aktivität enthält als Milch von hyperimmunisierten Kühen, selbst wenn Kühe bei der normalen Immunisierung gegen Kuhkrankheiten gegen verschiedene Antigene sensibilisiert wurden.
Die blutdrucksenkenden Eigenschaften der Milch werden in der Milch, die von Kühen erzeugt wird, die durch Auffrischinjektionen in dem immunisierten Zustand gehalten werden, maximiert. Die Hyperimmunisierung wird durch Verabreichung periodischer Auffrischungen mit ausreichend hohen Dosen von Antigenen oder Mischungen von Antigenen erzielt. Der bevorzugte Dosisbereich sollte gleich oder größer als 50% der für die primäre Sensibilisierung des Rindes erforderlichen Dosis sein. Es gibt somit einen Schwellenwert für die Auffrischungsdosis unter dem die maximalen Eigenschaften bei der Kuh nicht erzeugt werden, selbst wenn sich die Kuh in einem sogenannten immunisierten Zustand befindet. Zur Erreichung des hyperimmunisierten Zustands ist es wesentlich, die Kuhmilch nach einer ersten Serie von Auffrischungen zu prüfen. Wenn die Milch die gewünschten Eigenschaften nicht aufweist, muß eine zweite Serie von Auffrischungen mit höherer Dosis verabreicht werden. Dieser Vorgang wird wiederholt, bis die maximalen Eigenschaften in der Milch auftreten. Der Vorgang zur Erzeugung der hyperimmunisierten Milch wurde im U.S. Patent 4.284.623 an Beck offenbart, das Einzelheiten zur Herstellung von hyperimmunisierter Milch enthält. Zusammenfassend umfaßt das Verfahren die folgenden Schritte:
1. Wahl des Antigens.
2. Sensibilisierung der Kuh durch primäre Immunisierung.
3. Testen des Kuhserums zur Bestätigung der ausgelösten Sensibilisierung.
4. Verabreichung von Auffrischungen in geeigneten Dosen, um einen hyperimmunisierten Zustand herbeizuführen und aufrechtzuerhalten.
5. Testen der blutdrucksenkenden Eigenschaften der Milch.
6. Entnahme der Milch von der Kuh während des hyperimmunisierten Zustandes.
Die Milch der Erfindung kann durch herkömmliche Verfahren entnommen werden; es ist jedoch eine besondere Verarbeitung notwendig, um die biologischen Eigenschaften der Milch zu bewahren. Es ist eine Pasteurisierung bei niederer Temperatur erforderlich; die Pasteurisierungstemperatur sollte 140ºC nicht übersteigen. Nach der Pasteurisierung wird das Fett durch Standardverfahren entfernt. Die Milch wird konzentriert und sprühgetrocknet. Die Magermilch wird unter Vakuum bei geringen Temperaturen konzentriert, so daß der Faktor gegen Bluthochdruck nicht zerstört wird. (Siehe z.B. Kozakowskl, F., "Cheese and Fermented Milk Products", 2. Auflage, 1977). Das Endprodukt ist ein Milchpulver, das die blutdrucksenkenden Eigenschaften aufweist.
Es kann natürlich auch flüssige Milch verwendet werden, wie auch konzentrierte Milchprodukte oder eine Fraktion der Milch, die den biologisch aktiven Faktor enthält, wie die saure Molkefraktion. Mit dem Begriff "Molke" ist für den Zweck der Erfindung Milch gemeint, von der Rahm und kaseinöses Material abgetrennt wurde.
Die Milch der Erfindung kann in jeder Menge bereitet werden, die eine Besserung des hypertonischen Zustands bei Tieren bewirkt. Abhängig von den besonderen Umständen des Bluthochdrucks und der Tierart können tägliche Mengen gleich 1 ml bis 10 Liter flüssiger Vollmilch vorgesehen sein. Die bevorzugte Dosis beträgt 0,5 - 1,0 g Magermilchpulver pro kg Körpergewicht.
Die fettfreie Milch kann natürlich in jedem Nahrungsmittel enthalten sein, solange das Nahrungsmittel nicht bei zu hoher Temperatur behandelt wird, die die blutdrucksenkenden Eigenschaften des Produkts beeinträchtigen. Es wird eine Temperatur unter 140ºC bevorzugt. Zum Beispiel kann Pudding oder Joghurt mit blutdrucksenkender Milch bereitet werden.
Wenn die fettfreie Milch ferner mit Lab behandelt wird und das Kasein nach dessen Niederschlag abgetrennt wird, hat sich gezeigt, daß die Süßmolkenfraktion im Überstand den Faktor gegen Bluthochdruck enthält. Dieser Süßmolkenfaktor kann auch Sirup, Eiscrememischungen, Süßwaren, Getränken, Rinderfutter oder ähnlichem zugegeben werden (siehe Kozakowski, supra, bei 446).
Das Verfahren zur Herstellung der hyperimmunisierten Milch, die den Faktor gegen Bluthochdruck in über dem Normalwert liegenden Mengen enthält, ist wie folgt. Zusammenfassend umfaßt ein Verfahren zur Herstellung der hyperimmunisierten Milch, die den Faktor gegen Bluthochdruck in über dem Normalwert liegenden Mengen enthält, die folgenden Schritte: (1) Wahl des Antigens; (2) Primäre Immunisierung der Kuh; (3) Testen des Serums zur Bestätigung der ausgelösten Sensibilisierung; (4) Hyperimmunisierung mit Auffrischungen in geeigneten Dosen; und gegebenenfalls (5) Testen der blutdrucksenkenden Eigenschaften der Milch; (6) Entnahme der Milch von der hyperimmunisierten Kuh; und (7) Verarbeitung der Milch zur Fraktionierung des Faktors gegen Bluthochdruck.
Schritt 1: Jedes Antigen oder jede Kombination von Antigenen kann verwendet werden. Die Antigene können bakteriell, viral, protozoisch, fungal, zellulär oder jede andere Substanz sein, auf die das Immunsystem des milcherzeugenden Tieres anspricht. Der kritische Punkt in diesem Schritt ist, daß das oder die Antigene fähig sein müssen, nicht nur den immunisierten und hyperimmunisierten Zustand bei dem milcherzeugenden Tier auszulösen, sondern auch Werte des Faktors gegen Bluthochdruck über dem Normalwert in der Milch zu erzeugen. Vorzugsweise werden polyvalente bakterielle Mittel verwendet. Ein bevorzugter Impfstoff ist eine Mischung aus polyvalenten bakteriellen Antigenen, die in der Folge in Beispiel 1 näher beschrieben wird.
Schritt 2: Das oder die Antigene können mit jeder Methode, die eine Sensibilisierung bewirkt, verabreicht werden. Bei einer Methode wird ein Impfstoff durch intramuskuläre Injektion verabreicht, der aus Antigen besteht, das von 1 x 10&sup6; bis 1 x 10²&sup0;, vorzugsweise 10&sup8; bis 10&sub1;&sub0;, besonders bevorzugt 2 x 10&sup8;, hitzegetöteten Bakterien erhalten wurde. Es können aber auch andere Methoden wie intravenöse Injektion, intraperitoneale Injektion, rektale Zäpfchen oder orale Verabreichung angewendet werden.
Schritt 3: Es muß bestimmt werden, ob das milcherzeugende Tier gegen das Antigen sensibilisiert wurde. Es gibt eine Reihe von Methoden zur Testung der Sensibilisierung, die dem Fachmann der Immunologie bekannt sind (Methods in Immunology and Immunochemistry, Williams, C.A. et al., Academic Press, New York, Band 1-5 (1975)). Die bevorzugte Methode ist die Verwendung eines polyvalenten Impfstoffes, bestehend aus zahlreichen Bakterienarten als Antigen, und Testung auf Vorhandensein von agglutinierten Antikörpern in dem Serum des Tieres vor und nach der Impfstoffexposition. Das Auftreten von Milchantikörpern nach der Immunisierung mit dem Impfstoff zeigt eine Sensibilisierung an; zu diesem Zeitpunkt kann mit Schritt 4 fortgefahren werden.
Schritt 4: Dieser Schritt umfaßt das Auslösen und Aufrechterhalten des hyperimmunisierten Zustandes in dem sensibilisierten Tier. Dies erfolgt durch wiederholte Auffrischungen in bestimmten Zeitabständen mit demselben polyvalenten Impfstoff, der zur Erzielung der primären Sensibilisierung verwendet worden war. Für polyvalente bakterielle Antigene ist ein zweiwöchiger Abstand für die Auffrischungen optimal. Es muß jedoch gewährleistet sein, daß das Tier nicht von einem hyperimmunisierten Zustand in einen Zustand der Immuntoleranz gegenüber dem Antigen übergeht.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Hyperimmunisierung von Rindern durch eine Einzelverabreichung von Impfstoff in Mikrokapseln erzielt werden, deren Herstellung in Beispiel 1B genau beschrieben ist.
Bei einer anderen Ausführungsform ist es möglich, verschiedene Immunisierungsvorgänge zu kombinieren, z.B. gleichzeitige Verabreichung von Antigen in Mikrokapseln und flüssiger Form oder intramuskuläre Injektion zur primären Immunisierung und Auffrischungen durch orale Verabreichung oder parenterale Verabreichung mit Mikrokapseln. Dem Fachmann sind viele unterschiedliche Kombinationen von primärer und Hyperimmunisierung bekannt.
Schritt 5: Es ist notwendig, die Milch auf den Wert der blutdrucksenkenden Aktivität zu testen. Dies kann durch jede wissenschaftliche Methode erfolgen, die die Wirkungen von entweder der hyperimmunisierten Milch oder der davon abgeleiteten Produkte auf die Hypertonie testet.
Schritt 6: Dieser umfaßt die Entnahme und Verarbeitung der Milch. Die Milch kann durch herkömmliche Verfahren entnommen werden. Dann kann die Fraktionierung der Milch zur Gewinnung des Faktors gegen Bluthochdruck durchgeführt werden.
Schritt 7: Das allgemeine Verfahren zur Isolierung und Reinigung des Faktors gegen Bluthochdruck von hyperimmunisierter Milch ist wie folgt; (a) die Milch wird zur Erzeugung von Magermilch entfettet; (b) gegebenen falls wird Kasein zur Erzeugung von Molke von der Magermilch entfernt; (c) aus der Molke werden Makromoleküle mit einem Molekulargewicht > 10.000 Dalton entfernt; (d) das Produkt aus dem vorhergehenden Schritt wird auf einer Ionenaustauschsäule fraktioniert, so daß negativ geladene Moleküle mit einem Molekulargewicht < 10.000 Dalton erhalten werden; (e) die < 10.000 Dalton Fraktion, die den Milchfaktor gegen Bluthochdruck enthält, kann auf einem Molekularsiebgel größer fraktioniert werden; (f) der pH der < 10.000 Dalton Fraktion wird auf alkalische Werte von etwa 9 bis 12, vorzugsweise von 10,5, erhöht, und der Niederschlag, der den Milchfaktor gegen Bluthochdruck (kurz: MAF) enthält, wird entnommen; und (g) der Niederschlag aus dem vorhergehenden Schritt wird lyophilisiert.
Die Erfindung beruht teilweise auf der unerwarteten Entdeckung, daß ein Faktor gegen Bluthochdruck, der normalerweise in der Milch vorhanden ist, aber durch Hyperimmunisierung eines milcherzeugenden Tieres gegen einen bakteriellen Antigenimpfstoff in großen Mengen hergestellt werden kann, in der Behandlung einer Reihe von hypertonischen Prozessen bei Menschen und Tieren, einschließlich Hunden, wirksam ist. Der Impfstoff, der zur Hyperimmunisierung der Tiere verwendet wird, enthält keine blutdrucksenkende Aktivität. Es ist daher überraschend, daß die Behandlung mit einem Milchfaktor, der von Tieren erhalten wird, die gegen einen gemischten Totbakterien-Antigenimpfstoff immunisiert sind, zur Milderung oder Beseitigung von hypertonischen Vorgängen wirksam ist.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, wird sie mit Bezugnahme auf einige spezifische Beispiele, die hier nur zur Erklärung angeführt sind und wenn nicht ausdrücklich angegeben, nicht als Einschränkung dienen, näher verdeutlicht.

HERSTELLUNG DER MILCH BEISPIEL 1A

Herstellung des Mischbakterienimpfstoffes

Eine Bakterienkultur, die das in der folgenden Tabelle 1 dargestellte Bakterienspektrum enthält, das von der American Type Culture Collection erhalten wurde, wurde mit 15 ml Nährmedium verdünnt und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Sobald ein gutes Wachstum erreicht war, wurde etwa die Hälfte der bakteriellen Suspension zur Beimpfung eines Liters Nährlösung verwendet, wobei die Impfkultur bei 37ºC inkubiert wurde. Die verbleibende Suspension wurde in sterile Glykolröhrchen überführt und bei -20ºC bis zu sechs Monate gelagert.
Nachdem ein gutes Wachstum in der Kultur sichtbar war, wurden die Zellen durch 20-minütige Zentrifugation der Suspension zur Entfernung des Nährmediums gewonnen. Das erhaltene bakterielle Pellet wurde in steriler Kochsalzlösung resuspendiert, und die Bakterienprobe wurde dreimal zentrifugiert, um das Medium von den Zellen abzuwaschen. Nach der dritten Waschung mit steriler Kochsalzlösung wurde das bei der Zentrifugation erhaltene Bakterienpellet in einer kleinen Menge von doppelt destilliertem Wasser resuspendiert.
Die mediumfreie Bakteriensuspension wurde hitzegetötet, indem die Suspension in einem Glaskolben in einem 80ºC Wasserbad über Nacht stehengelassen wurde. Die Lebensfähigkeit der Nährlösungkultur wurde mit einer kleinen Menge von hitzegetöteten Bakterien wie folgt getestet: Die Nährlösung wurde mit hitzegetöteten Bakterien. beimpft, bei 37ºC fünf Tage inkubiert und täglich auf Wachstum geprüft. Zur Sicherheit der Kuh sollten die Bakterien zur Verwendung in dem Impfstoff getötet werden.
Die hitzegetöteten Bakterien wurde bis zur Trockenheit lyophilisiert. Die trockenen Bakterien wurden dann mit steriler Kochsalzlösung zu einer Konzentration von etwa 2,2 x 10&sup8; Bakterienzellen/ml Kochsalzlösung (1,0 optische Dichteeinheiten bei 660 nm) vermischt. Tabelle 1 Bakterienliste Gram Name Medium + oder -Staph. aureus Staph. epidermidis Strep. pyogenes, A Typ Aerobacter aerogenes Escherichia coli Salmonella enteritidis Pseudomonas aeruginosa Klebsiella pneumoniae Salmonella typhimurium Haemophilus influenza Strep. mitis Proteus vulgaris Shigella dysenteriae Diplococcus pneumoniae Propionibacter acnes Actinomyces (anaerob) Strep. sanguis Strep. salivarius Strep. mutans Strep. agalactiae
Kühe erhielten tägliche Injektionen von 5 ml Proben des flüssigen polyvalenten Impfstoffs. Antikörper- (IgG-) Titerwerte für die injizierten Rinder wurden periodisch bestimmt, indem Ablesungen der optischen Dichte bei 410 nm der von der Kuhmilch erhaltenen, antikörperhältigen flüssigen Proben vorgenommen wurden.

Beispiel 1B

Herstellung von Mischbakterienimpfstoff mit regulierter Freisetzung

Hitzegetötete Bakterien wurden auf die oben beschriebene Weise hergestellt. Das erhaltene polyvalente Antigen wurde durch ein herkömmliches Phasentrennverfahren mikroeingekapselt, um ein polyvalentes antigenhältiges Mikroteilchenprodukt zu erhalten. Im allgemeinen werden die antigenhältigen geformten Matrixmaterialien aus Polymeren von bioverträglichem Material gebildet, vorzugsweise biologisch abbaubaren oder biologisch zersetzbaren Materialien, vorzugsweise Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Kopolymeren von Milch- und Glykolsäure, Polycaptolacton, Copolyoxalaten, Proteinen wie Collagen, Fettsäureester von Glycerol und Celluloseester. Diese Polymere sind in der Wissenschaft gut bekannt und sind zum Beispiel in U.S. 3.773.919, U.S. 3.887.699, U.S. 4.118.470, U.S. 4.076.798 beschrieben. Das verwendete polymere Matrixmaterial war ein biologisch abbaubares Lactid-Glykolid-Copolymer.
Hitzegetötete bakterielle Antigene werden in solchen Matrixmaterialien eingekapselt, vorzugsweise als Mikrokugeln mit einem Durchmesser von 1 bis 500 Mikrometern, vorzugsweise 10 bis 250 Mikrometern. Der Einkapselungsvorgang ist ein herkömmlicher und umfaßt Phasentrennverfahren, Grenzflächenreaktionen und physikalische Verfahren. Viele Kombinationen von Matrizen und viele Konzentrationen von Antigenzusammenstellungen können verwendet werden, um die optimalen Freisetzungsgeschwindigkeiten von bakteriellen Antigenen aus den Mikroteilchen an die Wirtskörper zu erreichen. Diese Kombinationen können von dem Fachmann ohne unnötige Experimente bestimmt werden.
Die Mikroteilchen in dem Beispiel wiesen einen kleineren Durchmesser als 250 Mikron auf. Etwa 750 mg der Mikroteilchen, die 22% (16,5 mg) polyvalenten Antigens enthielten, wurden dann in etwa 3 cc eines Trägers (1 Gew.-% Tween 20 und 2 Gew.-% Carboxymethylcellulose in Wasser) suspendiert.
Eine Meine Gruppe von Rindern wurde aus einer großen Rinderherde ausgewählt. Fünf dieser zufällig gewählten Rinder wurden als Kontrolle bestimmt. Vier Rinder wurden mit einer Injektion der mikroteilchenhältigen Lösung behandelt, die wie zuvor beschrieben hergestellt worden war.
Die vier Kühe erhielten intramuskuläre Injektionen mit den polyvalenten, antigenhäitigen, in Kochsalzlösung suspendierten Mikroteilchen. Die Antigendosis lag über 2 x 10&sup8; bakteriellen Zellen pro ml. Antikörper- (IgG-) Titerwerte wurden periodisch in Proben der Kuhmilch bestimmt, die von den geimpften wie auch den Kontrollkühen erhalten wurden.

Beispiel 1C

Herstellung von Impfstoff mit unbekannter Antigenzusammensetzung

Wir haben entdeckt, daß Bienenhonig eine mannigfaltige Gruppe von Antigenen enthält, deren Zusammensetzung unbekannt ist. Wenn das Antigen in Honig Kühen injiziert wird, erzeugt es einen hyperimmunisierten Zustand, der zu maximalen blutdrucksenkenden Eigenschaften der Milch führt.
Zum Beispiel wurde eine Dosis von 1 ml Honig, 1:5 verdünnt in Wasser, 5 Kühen einmal wöchentlich 5 aufeinanderfolgende Wochen lang injiziert, dann alle 2 Wochen 6 Monate lang. Die Milch wurde zwischen dem dritten und sechsten Monat zu Testzwecken entnommen.
Dieses Beispiel wird zur Veranschaulichung der Tatsache angeführt, daß die exakte Zusammensetzung des Antigens für die Durchführung der Erfindung nicht bekannt sein muß, und daß jedes Antigen oder jede Kombination von Antigenen, sei sie nun bekannt oder unbekannt, zur Immunisierung der Kühe für die Herstellung des Faktors gegen Bluthochdruck verwendet werden kann.

TESTUNG DER HYPERIMMUMSIERTEN MILCH AUF BLUTDRUCKSENKENDE AKTIVITÄT

Beispiel 2

Es handelte sich um eine kontrollierte Doppelblindstudie, in der eine Versuchsgruppe von sieben freiwilligen Personen hyperimmunisiertes Milchprodukt erhielt und eine zweite Kontrollgruppe von sieben Personen Milch von nicht hyperimmunisierten Kühen einnahm. Der systolische Blutdruck wurde sowohl vor als auch nach der Behandlung gemessen.
Die Studie war in zwei Phasen unterteilt, mit einer Gesamtdauer von 14 Wochen. Die erste Phase war eine vierwöchige Vorbehandlungsphase, und am Ende der Wochen 1 und 4 wurde der systolische Blutdruck bestimmt. Die zweite Phase bestand aus einer zehnwöchigen Behandlungsperiode, in der die Personen täglich 50 g pulverisierte Magermilch in Wasser suspendiert einnahmen, wobei Blutdruckmessungen am Ende der Wochen 2, 4, 6, 8 und 10 vorgenommen wurden. Dem Fachmann sind pharmazeutischen verträgliche Träger bekannt, in denen Formen von Milchprotein gelöst werden können.
Die Ergebnisse dieser Studie sind sowohl in Tabelle 1 als auch in Figur 1 dargestellt, wobei Tabelle 1 die Rohdaten und Figur 1 einen Vergleich der durchschnittlichen prozentuellen Veränderung im systolischen Blutdruck zwischen der Versuchsgruppe und der Kontrollgruppe zeigt. Der systolische Blutdruck der Personen, die das hyperimmunisierte Milchprodukt einnahmen, sank im Laufe der Zeit in der zehnwöchigen Behandlungsperiode, wobei die Abnahme im Bereich zwischen 5,3% und 8,40% lag. Im Gegensatz dazu waren die Veränderungen bei der Kontrollgruppe, die das nicht hyperimmunisierte Milchprodukt erhielt, wesentlich geringer und lagen im Bereich von 1% und 3,92% in der zehnwöchigen Behandlungsperiode, aber diese Veränderungen hingen auch mit der Dauer der Behandlung zusammen. Tabelle 1 GRUPPE MIT IMMUNISIERTER MILCH WOCHE PATIENT# MITTEL % Änderung GRUPPE MIT NORMALER MILCH

Beispiel 3

In diesem Versuch wurden 5 mg teilweise gereinigtes MAF-Testmaterial (siehe Beispiel 4 für Einzelheiten der Isolierung und Reinigung von MAF) direkt auf die Spitze der Zunge einer freiwilligen Person gebracht und die Bestimmungen des systolischen Blutdrucks wurden in Abständen von 10 bis 15 Minuten in der darauffolgenden Stunde vorgenommen. Die Ergebnisse eines solchen Versuchs sind in Figur 2 dargestellt. Die den systolischen Blutdruck senkende Wirkung war unmittelbar und signifikant und verursachte eine 30-40 prozentige Absenkung des Drucks innerhalb von 30 Minuten. Dieser Versuch wurde einige Male mit Milch-MAF wiederholt, der von Kühen, die mit unterschiedlichen Antigenen behandelt worden waren, erhalten wurde. Die Ergebnisse waren in jedem Fall ähnlich.
Dieses Verfahren kann zur raschen Durchmusterung verschiedener Milchfraktionen auf MAF-Aktivität verwendet werden.

ISOLIERUNG UND REINIGUNG DES MILCHFAKTORS GEGEN BLUTHOCHDRUCK

Beispiel 4

SCHRITT 1: Herstellung des Milchfiltrats

Zwanzig Liter frische Milch von normalen oder hyperimmunisierten Kühen wurden zur Entfettung durch eine Entrahmungszentrifuge (Delaval Modell 102) geleitet.
Die erhaltenen 16 Liter Magermilch wurden zur Entfernung der hochmolekularen Arten (> 10.000 Dalton) unter Verwendung eines Hohlfaserdiafiltration-Konzentrators (Amicon DL-10L) filtriert. Der Konzentrator war mit zwei 10.000 Dalton Molekulargewicht-Abscheidepatronen ausgerüstet. Die Magermilch wurde bei einer Pumpgeschwindigkeit von 80 auf dem Meßgerät und bei einem Einlaß- und Auslaßdruck von 21092 kg/m² bzw 17577 kg/m² (30 psi und 25 psi) durchgeleitet.
Zwölf Liter Filtrat (< 10.000 Dalton), die mit einer Fließgeschwindigkeit von vier Litern pro Stunde aus den Patronen liefen, wurden zur Lagerung oder weiteren Reinigung gefroren oder lyophilisiert.

SCHRITT 2: Ionenaustauschchromatographie

Der Milchfaktor gegen Bluthochdruck, MAF, in dem Filtrat wurde zunächst durch eine Anionenaustauschchomatographiesäule isoliert.
Bei diesem Vorgang wurde ein DEAE-Sepharose CL-6B Gel (Pharmacia) zur Füllung einer 5x10 cm Glassäule verwendet, die mit sterilem, doppelt destillierten Wasser, pH 7,0, äquilibriert war.
Ein Liter Filtrat (< 10.000 Dalton Fraktion) wurde in die Säule eingebracht und mit sterilem, doppelt destillierten Wasser, pH 7,0, bei einer Fließgeschwindigkeit von 160 ml pro Stunde eluiert. Zehn Milliliter Fraktionen wurden gesammelt und bei 280 nm in einem LKB Uvicord 4700 Absorptiometer geprüft, wobei die optische Dichte auf einem angeschlossenen Recorder (Pharmacia REC-4 82) ausgedruckt wurde.
Die von MAF unterschiedlichen Substanzen mit positiver und neutraler Ladung werden nicht an dem DEAE-Sepharose-Gel gebunden. Sie wurden an dem Fallpeak (erstem Peak) eluiert. Der MAF, der eine negative Ladung aufweist, wurde von dem Gel gehalten.
Zur Elution des MAF wurde die Säule mit einem schrittweisen Gradienten eluiert, wobei eine sterile NaCl-Lösung, pH 7,0, verwendet wurde. Ein charakteristisches Profil ist in Figur 3 dargestellt. Der zweite Peak und sein Wendepunkt enthielten den MAF und andere negativ geladene Arten. Die 20 ml Fraktionen, die den zweiten Peak und seinen Wendepunkt umfaßten, wurden gesammelt und zur Lagerung und weiteren Reinigung lyophilisiert. Gewinnungsstudien zeigten, daß sieben Gramm getrocknetes Pulver erhalten wurden.

SCHRITT 3: Gelfiltrationschromatographie

Die in Schritt 2 erhaltene Fraktion bestand aus MAF und anderen negativ geladenen Bestandteilen; daher war ein zusätzlicher Reinigungsschritt erforderlich. Zur weiteren Reinigung war die Verwendung einer Gelfiltrationssäule notwendig, um diese negativ geladenen Bestandteile auf der Basis der molekularen Größe und Form abzutrennen.
In diesem Verfahren wurde Sephadex G-10-Harz (Pharmacia) in eine 25 x 80 cm Gelsäule gefüllt und mit sterilem, doppelt destillierten Wasser, pH 7,0, äquilibriert. Zwei Gramm der MAF-Fraktion aus Schritt 2 wurden wieder in sterilem, doppelt destillierten Wasser gelöst und auf die Spitze der Säule aufgebracht. Die Säule wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 30 ml pro Stunde eluiert. Fraktionen von 3,3 ml wurden gesammelt und bei 254 nm und 280 nm (Pharmacia Duo Optical Unit) geprüft, wobei die optische Dichte auf einem angeschlossenen Recorder (Pharmacia REC-482) ausgedruckt wurde.
Es gab 3 Peaks in dem Elutionsprofil, wie in Figur 4 dargestellt. Der letzte Peak, der frei von großen negativ geladenen Substanzen ist, enthält den MAF.
Gewinnungsstudien zeigten eine Ausbeute von 260 mg trockenem Pulver aus dem gesamten Verfahren.

Claims

1. Faktor gegen Bluthochdruck in im wesentlichen reiner Form, herstellbar durch ein Verfahren, bestehend aus:

i) Erhalten von Milch von einem hyperimmunisierten Tier;

ii) Entfernen von Makromolekülen mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 10.000 Dalton aus der Milch;

iii) Fraktionieren des Produktes mit weniger als 10.000 Dalton aus Schritt (ii) durch Ionenaustausch-Chromatographie, um ein negativ geladenes Produkt mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 10.000 Dalton zu erhalten;

iv) Fraktionieren des negativ geladenen Produktes aus Schritt (iii) durch Molekularsiebchromatographie; und

v) Isolieren des in Schritt (iv) fraktionierten Produktes gegen Bluthochdruck durch isoelektrische Fällung.

2. Milchfaktor gegen Bluthochdruck nach Anspruch 1, wobei die isoelelektrische Fällung bei pH-Werten über etwa 9 und unter etwa 12, vorzugsweise bei etwa pH 10,5, durchgeführt wird.

3. Verfahren zur Isolierung eines im wesentlichen reinen Milchfaktors gegen Bluthochdruck, bestehend aus:

i) Erhalten von Milch von einem hyperimmunisierten Tier;

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die isoelektrische Fällung bei pH-Werten über etwa 9 und unter etwa 12, vorzugsweise bei etwa pH 10,5, durchgeführt wird.

5. Verwendung von Milch von einem hyperimmunisierten Tier bei der Herstellung eines Mittels gegen Bluthochdruck.

6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Milch Vollmilch (zum Beispiel als Vollmilchpulver), Magermilch (zum Beispiel als Magermilchpulver), Molke oder eine Subfraktion von Molke umfaßt.

7. Verwendung eines Faktors nach Anspruch 1 oder 2 bei der Herstellung eines Mittels gegen Bluthochdruck.

8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei der Milchfaktor gegen Bluthochdruck das im wesentlichen reine Molekül mit einem Molekulargewicht unter etwa 10.000 Dalton umfaßt.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Faktor gegen Bluthochdruck nach Anspruch 1 oder 2 und einen pharmazeutisch oder veterinärisch verträglichen Träger umfaßt.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, die zur oralen, parenteralen oder intranasalen Verabreichung geeignet ist.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, die zur oralen Verabreichung geeignet ist und eine Suspension des Faktors in einem pharmazeutisch oder veterinärisch verträglichen Träger umfaßt.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 10, die zur oralen Verabreichung geeignet ist und eine eingekapselte Form des Faktors umfaßt, wobei die eingekapselte Form eine Kapselform mit verzögerter Freisetzung und/oder magensaftresistentem Überzug ist.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 10, die zur parenteralen Verabreichung geeignet ist, wie zur intravenösen, intraperitonealen, intramuskulären oder subkutanen Verabreichung.

14. Sterile pharmazeutische Formulierung, die einen Faktor gegen Bluthochdruck nach Anspruch 1 oder 2 umfaßt.