DE2813984C2

DE2813984C2 -

Info

Publication number: DE2813984C2
Application number: DE2813984A
Authority: DE
Inventors: Helmut St. Legier Ch Hilpert
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA
Priority date: 1977-04-15
Filing date: 1978-03-31
Publication date: 1987-11-26
Also published as: CH627079A5; DK153521C; ES468808A1; PH17782A; FR2387039B1; CA1101333A; AU3490378A; OA05938A; IT1156193B; NL187516B; GB1573995A; NL7804015A; FR2387039A1; ZA781607B; MX5007E; SE448062B; NL187516C; SE7804190L; DK131078A; PH14031A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Proteinkonzentrat aus Kuhmilch, das aktive, nicht-denaturierte Immunglobuline (IgG) enthält, ein Verfahren zu seiner Herstellung sowie seine Verwendung.

Es wurde bereits vorgeschlagen, in diätetische Produkte für Neugeborene und Säuglinge immunologische Faktoren der Milch einzubauen. Die orale Verabreichung dieser Produkte sollte zum Übergang der Faktoren in die Blutbahn des Säuglings führen. Diese Idee wurde jedoch weder durch Angaben über die Art und Weise, noch über Resultate einer solchen generalisierten passiven Immunisierung näher erläutert.

Aus der DE-AS 10 22 356 ist es bekannt, durch Impfen von Kühen mit verschiedenen Antigenen, z. B. auch von Escherichia coli, während der 8. Woche vor dem Kalben bis zum Kalben, durch Gewinnen der Milch von diesen hyperimmunisierten Kühen, Entrahmen der Milch, Abtrennen des Kaseins durch Koagulation und Ausfällen des γ-Globulins aus dem an immunologischem Faktor angereichertem Serum ein Proteinkonzentrat in Form eines rohen γ-Globulins herzustellen.

Es ist außerdem aus der US-PS 39 11 108 bekannt, Immunlaktoglobuline aus der Milch von vakzinierten Kühen dadurch zu isolieren, daß man die Milch koaguliert, das Milchserum abtrennt und die Laktoglobuline mittels Ammoniumsulfat selektiv ausfällt und anschließend gegebenenfalls weiter reinigt, wobei Ziel dieser Arbeit die Gewinnung eines Produktes war, den Schweinen einen Schutz gegen übertragbare Gastroenteritis (TGE) zu verleihen, die eine hochinfektiöse Viruserkrankung darstellt.

Die im gennanten Stand der Technik und im dort zitierten weiterführenden Stand der Technik beschriebenen Herstellungs- und Anwendungsverfahren erwiesen sich jedoch für die Herstellung eines Proteinkonzentrats der genannten Art im industriellen Maßstab als ungeeignet.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die industrielle Herstellung eines Proteinkonzentrats aus Kuhmilch, das aktive, nicht-denaturierte Immunglobuline (IgG) enthält, zu schaffen, bei welchem diese Immunglobuline nicht denaturiert werden und in großem Maßstabe in konstanter Qualität gewonnen werden können, so daß sie, gegebenenfalls in Verbindung mit geeigneten Trägermaterialien, für Produkte verwendet werden können, bei denen die Schutzwirkung der aktiven Immunglobuline ausgenutzt werden kann.

Diese Aufgabe wird durch ein Proteinkonzentrat gemäß Patentanspruch 1, ein Verfahren zu seiner Herstellung gemäß Patentanspruch 2 und seine Verwendung gemäß Patentanspruch 6 gelöst.

Vorteilhafte Ausgestaltungen des Herstellungsverfahrens sind den Ansprüchen 3 bis 5 zu entnehmen.

Das erfindungsgemäße Proteinkonzentrat verleiht eine passive lokale Immunisation im Darmkanal, ohne daß eine wesentliche Beeinträchtigung seiner Aktivität im Verdauungstrakt erfolgt.

Die verschiedenen Stufen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in der Zeichnung schematisch dargestellt und werden nachfolgend noch ergänzend erläutert.

Die Kuhmilch, die das Ausgangsprodukt für das erfindungsgemäße Produkt bzw. das Verfahren zu seiner Herstellung darstellt, kann verschiedener Art und mehr oder weniger reich an Antikörpern sein. Sie ist ein Gemisch von Milch verschiedener Kühe, wobei für dieses Milchgemisch Kolostralmilch, Übergangsmilch (Milch der ersten 8 Tage nach dem Kalben) oder Milch am Ende der Laktation (Milch der letzten beiden Monate der Milchabsonderung) in Frage kommen.

Die Ausbeute an immunologisch aktivem Material pro Kuh wird dabei erhöht, wenn ein Gemisch dieser Milcharten behandelt wird.

Das Impfen der Kühe erfolgt zur Schonung der Kühe und zur Vermeidung von Euterentzündungen nach einem kombinierten Impfschema, das eine intracisternale Instillation in die Milchdrüse, eine parenterale (subkutane oder intravenöse) Injektion, eine Injektion in das retromammäre Lymphknotensystem, eine Skarifikation, eine orale Verabreichung umfassen kann.

Vorzugsweise werden die genannten Verfahren nach einem sorgfältig erarbeiteten Immunisierungsschema angewandt, um in jedem verwendeten Milchtyp einen zufriedenstellenden Antikörpertiter zu erzielen. So erfolgt für die Milch des 1. bis 8. Tages nach dem Kalben die Vakzinierung während der 8. bis 2. Woche vor dem Kalben parenteral und intracisternal und während der Woche vor dem Kalben oral.

Bei der Milch am Ende der Laktation wählt man eine alternierende parentale, lokale und orale Vakzinierung, beginnend 2½ Monate vor dem vermuteten Ende der Milchabsonderung.

Es ist dabei bevorzugt, daß das den Kühen verabreichte Antigen homologes Blutserum von immunisierten Kühen als Adjuvans enthält, wodurch eine Detoxifizierung der Vakzine und die Bildung von Immunkomlexen erreicht wird.

Da eine Kuh als Produktionstier dient, sind die in dem Proteinkonzentrat enthaltenen Ig hauptsächlich IgG (insbesondere IgG₁), im Unterschied zu Muttermilch, welche als Ig überwiegend IgA enthält.

Der Gehalt an Ig im Proteinkonzentrat, in welchem die Proteine 70 bis 80 Gew.-% ausmachen, beträgt 25 bis 35 Gew.-%. Gegenüber einer Isolierung der reinen IgG ergeben sich durch die Verwendung eines Proteinkonzentrats einige zusätzliche Vorteile, indem die Ig nicht von den anderen Proteinen des Milchserums abgetrennt werden, die deshalb ebenfalls im erhaltenen Konzentrat vorliegen. Hierdurch werden selektive Fällungsoperationen, beispielsweise durch Ammoniumsulfat, und eine anschließende Reinigung, beispielsweise durch Dialyse, vermieden.

In dem erhaltenen Proteinkonzentrat finden sich zusätzlich zu den Ig gewisse bakteriostatische und antivirale Faktoren, wie z. B. Lactoferrin oder die enzymatischen Systeme wie Lactoperoxydase und Ribonuklease, wie sie im Milchserum enthalten sind.

Das erfindungsgemäße Proteinkonzentrat bietet einen Schutz gegen enteropathogene Escherichia coli-Bakterien, die für eine Gastroenteritis verantwortlich sind, welche von einer Diarrhöe und von einem starken Wasserverlust begleitet sind, wenn man das Proteinkonzentrat, welches die Ig enthält, mit irgendeinem für die orale Verabreichung geeigneten Träger verabreicht. Ein solcher Träger ist vorzugsweise ein diätetisches Produkt, beispielsweise eine Milch oder ein Milchpulver für Kleinkinder, eine "humanisierte" oder eine für Säuglinge adaptierte Milch oder eine Milch, die speziell für eine besondere Gruppe von Neugeborenen adaptiert ist, wie z. B. eine Milch für Frühgeburten oder Kinder mit geringem Geburtsgewicht. Durch eine Änderung des gewählten Antigens kann das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Herstellung von Proteinkonzentraten ausgestaltet werden, die in Abhängigkeit vom verwendeten Antigen einen Schutz gegen enteropathogene Bakterien oder Viren liefern.

Bei der Verwendung des erfindungsgemäßen Proteinkonzentrats, das Ig gegen E. coli enthält, kann man es mit einer Milch als Träger prophylaktisch verabreichen, indem man 0,8 bis 3 g des Konzentrats auf 100 g Trockensubstanz zugibt. Therapeutische Dosen geben bis zu 6 g/100 g Milchpulver.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es nötig, darauf zu achten, daß die Entrahmung und die Klärung sehr weit getrieben werden, um eine nachfolgende Verstopfung der Filter und Ultrafilter zu vermeiden.

Die Entrahmung erfolgt vorzugsweise in zwei Stufen, und zwar zunächst in der Kälte, um den größten Teil der Fette und der Verunreinigungen (wie z. B. Blut, das oft in der Kolostralmilch enthalten ist) zu entfernen, und dann in der Wärme, um eine vollständige Entfernung der Fettbestandteile der Milch zu erzielen.

Die Koagulation erfolgt durch Ansäuern bis zu einem pH von etwa 4,6 unter Erwärmung bis auf +40°C, vorzugsweise auf 37°C. Das Ansäuern erfolgt vorzugsweise durch Zusatz einer Säure, wie z. B. Salzsäure. Die Koagulation kann auch in Gegenwart von Lab unter Zugabe von Säure, wie z. B. Zitonensäure, erfolgen.

Der Abtrennung des Kaseins durch Zentrifugation folgt eine Klärung des Milchserums, wodurch eine Abtrennung der Feinstoffe ermöglicht wird.

Es ist ferner wesentlich, die eine thermische Behandlung erfordernden Operationen (Eindampfen und Trocknen) unter schonenden Bedingungen durchzuführen, um eine Inaktivierung der Ig zu vermeiden.

Um die Verluste an Ig zu verringern, von denen ein Teil zusammen mit dem Rahm beim Entrahmen und ein anderer Teil zusammen mit dem Kasein bei der Abtrennung desselben abgetrennt wird, ist es angezeigt, den Rahm und das Gerinnungsprodukt mit Wasser zu extrahieren und die Waschwässer, welche die Ig enthalten, zum Zwecke der Rückgewinnung zu behandeln.

Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung in Beispielen noch näher erläutert, in denen die Mengen und Verhältnisse in Gewicht ausgedrückt sind, sofern nichts anderes angegeben ist.

Beispiel 1

Kühe verschiedener Rassen wurden entsprechend dem unten stehenden Schema mit einer Vakzine hyperimmunisiert, deren Herstellung nachstehend angegeben ist. Die Milch der letzten beiden Monate der Milchabsonderung und der ersten 8 Tage nach dem Kalben wurde gesammelt.

Herstellung der Vakzine

Es wurden die folgenden enteropathogenen Serotypen von E. coli verwendet:

0 18 : K 76 (B 20)0 111 : K 58 (B 4) 0 20 : K 17 (L)0 112 : K 68 (B 11) 0 26 : K 60 (B 6)0 119 : K 69 (B 14) 0 44 : K 74 (L)0 124 : K 72 (B 17) 0 55 : K 59 (B 5)0 125 : K 70 (B 15) 0 78 : K 80 (-)0 126 : K 71 (B 16) 0 86 : K 61 (B 7)0 127 : K 63 (B 8) 0 128 : K 68 (B 12)

Die verschiedenen Stämme wurden von Kindern mit klinischen E. coli Gastroenteritiden isoliert. Die Serotypisierung erfolgte mit multi- und monovalenten Antiseren. Die Bakterien wurden mit einem flüssigen Minimalmedium kultiviert, das 2% Aminosäuren eines Kaseinhydrolysats und 0,2% Glucose enthielt. Die Kultivierung erfolgte während 24 h bei +37°C ohne Schütteln der Kulturgefäße. Zur Inaktivierung der Keime wurden die Kulturen durch Zentrifugieren in sedimentierte Bakterien und Kulturüberstand getrennt. Die Bakterienzellen wurden wieder in Suspension gebracht und 24 h bei +37°C in Gegenwart von 0,5% Formaldehyd inkubiert, währenddessen der Überstand durch Zugabe von 0,05% Formaldehyd inaktiviert wurde. Nach einer erneuten Zentrifugierung und Abtrennung des Überstands wurden die Bakterien im ursprünglichen inaktivierten Überstand wieder in die Suspension gebracht. Dieses Verfahren gestattet es, den Überstand, welcher die bakteriellen Exotoxine enthält, für die Vakzine zu konservieren. Es wurde eine Vakzine mit 1-2 × 10⁹ Bakterien/ml erhalten, die hierauf entsprechend dem Immunisierungsschema verdünnt wurde und mit einer 2%igen Lösung von Al(OH)₃ und homologem Blutserum von immunisierten Kühen vermischt wurde.

Immunisierungsverfahren

A. Immunisierungsschema für die Herstellung von Kolostralmilch und Übergangsmilch mit anti-E.-coli-Ig:

Der Tag der vermuteten Kalbung = X

B. Immunisierungsschema für die Herstellung von Spätlaktationsmilch (die letzten beiden Monate der Laktation) mit anti-E. coli-Ig.

Diese Immunisierung erfolgte nur bei Kühen, die bereits während der Kolostralperiode und der Übergangsperiode immunisiert worden waren.

Vermuteter Tag der Trockenlegung = X

Beispiel 2

Die Milch der ersten 8 Tage nach dem Kalben von gemäß Beispiel 1 vakzinierten Kühen wurde die folgt behandelt:

Die Entrahmung erfolgte in zwei Stufen. Stufe A in der Kälte und Stufe B in der Wärme.

A. 1100 kg Milch durchliefen kalt eine Entrahmungszentrifuge, wurden in einen 2500 l fassenden Speicherbehälter geleitet und dann in eine Klärzentrifuge mit erhöhter Beschleunigung (ungefähr 11 000 g) gepumpt, um Blut und Verunreinigungen (Schlammstoffe) zu entfernen.

B. Die kalte geklärte Milch wurde in einem 2500 l fassenden Reservoir aufgefangen und über einen auf 40°C gehaltenen Erhitzer in die gleiche Entrahmungszentrifuge wie oben gepumpt.

Auf diese Weise wurden 110 kg Rahm, die aufbewahrt wurden, und 5 kg Schlammstoffe, die verworfen wurden, erhalten.

Gemäß einer Variante kann man bei der kalten und warmen Entrahmung eine selbstklärende Rahmzentrifuge und eine Klärzentrifuge zwischen den beiden Vorgängen verwenden, um so die Dauer des Entrahmens zu verkürzen.

Die entrahmte und geklärte kalte Milch (985 kg) wurde dann in 4 viereckige Koagulationswannen mit jeweils 750 l Fassungsvermögen geleitet, welche mit Rührern ausgerüstet waren, um die Koagulation durchzuführen.

Es wurde in eine 1 n Salzsäure bei 37°C bis zur Stabilisierung des pH bei etwa 4,6 zugegeben, worauf die Temperatur 20 min unter Rühren aufrechterhalten wurde. Hierauf wurde auf 15°C abgekühlt.

Anschließend erfolgte die Abtrennung des Kaseins. Sie erfolgte in zwei hintereinandergeschalteten Zentrifugationen der entrahmten, koagulierten und geschnittenen Milch. Die erste entfernte den Hauptteil des ausgefällten Kaseins mit Hilfe einer selbstreinigenden Trommelzentrifuge, wobei 150 kg Kasein abgetrennt wurden und das Milchserum in einen Speicherbehälter geleitet wurde. Die zweite Zentrifugation entfernte noch alle Spuren von Teilchen, welche die nachfolgende Filtration und Ultrafiltration gestört hätten. Hierzu wurde die im Vorgang A der Entrahmung verwendete Klärzentrifuge herangezogen. Es wurden 854,7 kg geklärtes Milchserum erhalten, welches in ein 2500 l fassendes Reservoir gepumpt wurde.

Hierauf erfolgte die Filtration und die anschließende Ultrafiltration des Milchserums. Die Filtration erfolgte sehr sorgfältig, um alle Schwierigkeiten bei der Ultrafiltration von vornherein auszuschalten, indem die sehr feinen Kaseinteilchen abgetrennt wurden. Es wurde ein Seitz-Supra-100-Filter mit Platten von 20 × 20 cm verwendet. Das Filtrat wurde in einem Reservoir mir einem Fassungsvermögen von 3000 l aufgefangen und dann zum Ultrafilter gepumpt. Das Ultrafilter arbeitete in 2 oder 3 Stufen mit Rückführung des Retentats zum Reservoir. Zwei hintereinandergeschaltete Zentrifugalpumpen lieferten den Durchsatz gegen einen Eintrittsdruck des Ultrafilters von etwa 7 bar, wobei am Austritt des Ultrafilters der Druck auf ungefähr 4,5 bar gehalten wurde. Um eine Aufheizung des Retentats durch die Pumpen gelieferte Energie zu vermeiden, wurde das Retentat auf etwa 10-12°C abgekühlt.

Die erste Stufe, die eigentliche Ultrafiltration, gestattete die Abtrennung von gelösten Stoffen mit hohem Molekulargewicht, nämlich der Proteine, die auf der Membran zurückgehalten wurden und die sich im Retentat befanden, während ein Teil der Lactose, Vitamine, Mineralsalze und Wasser im Permeat abgeführt wurden. Die Verwendung einer DDS-Zelle mit der Membran 800 (Membranoberfläche = 7 m²) wurden 580 kg Permeat I und 274,7 kg Retentat bei einer mittleren Durchflußleistung von 14,17 kg Permeat/m²/h erhalten, wobei das Verhältnis Retentat/Permeat etwa 1 : 3,1 war.

Die zweite Stufe war eine Diafiltration, während welcher kontinuierlich dem Retentat 825 kg Wasser zugegeben wurden und die Lösung unter den gleichen Bedingungen wie in der ersten Stufe zirkuliert wurde. Die Diafiltration wurde beendet, nachdem die elektrische Leitfähigkeit des Permeats den gewünschten Wert erreicht hatte, wobei das Verhältnis von Retentat/zugesetztem Wasser etwa 1 : 3 betrug. Hierdurch wurden 825 kg Permeat II und 274,7 kg Retentat mit einer mittleren Durchflußleistung von 11,77 kg Permeat/m²/h erhalten.

Die dritte Stufe war eine Konzentrierung, die unter Rückführung des Retentats zur Membran durchgeführt werden kann, bis ein Trockenmassegehalt von etwa 10% erreicht wurde, und zwar durch Abtrennung von 82,5 kg Permeat III. Auf diese Weise wurden 192,2 kg vorkonzentrierte Lösung erhalten. Gemäß einer Variante kann man die dritte Stufe weglassen und direkt zur Sterilfiltration übergehen.

Die Sterilfiltration stellte eine wichtige Stufe im gesamten Verfahren dar, da thermische Behandlungen für die Sterilisation nicht anwendbar sind, da sie zu einer Denaturierung der Ig führen würden. Durch die Sterilfiltration wurde das Retentat von Mikroorganismen befreit, die eventuell noch vorhanden waren. (Der Hauptteil derselben wurde bereits während der Abtrennung des Rahms, des Kaseins und der Schlammstoffe entfernt.) Um eine Verstopfung der Sterilfilter zu vermeiden, war eine Klärung durch Zentrifugieren und eine Dreifachfiltration des Retentats nötig. Nach der Klärung wurde das Retentat in einem Reservoir aufbewahrt und einer Serienfiltration unterworfen, die eine Vorfiltration auf einem Dreifachfilter Seitz Supra 100, EK und EKS (hintereinandergeschaltet) und dann eine Sterilfiltration auf einem Seitz-Filter Supra 20 und Millipore HA 0,45 µ, die hintereinandergeschaltet und vorher durch überhitztes Wasser sterilisiert worden waren, umfaßte. Das sterile Retentat wurde in einem sterilen 500 l fassenden Reservoir aufbewahrt. Mit Hilfe von komprimiertem und steril filtriertem Stickstoff wurde es den nachfolgenden Eindampfungsvorgängen zugeführt. Alle nachfolgenden Arbeitsgänge erfolgten unter sterilen Bedingungen.

Die Eindampfung erfolgte mittels eines Dünnschichtverdampfers (fallender Film mit 1 m² Oberfläche) bei einer Temperatur von 75°C, wobei die Temperatur des Produkts ungefähr 30°C betrug, bis ein Trockenmassegehalt von mindestens 20% erreicht war. Um jegliche Infektion zu vermeiden, erfolgte die Überführung vom Retentatreservoir zum Konzentratreservoir mittels einer Schlauchpumpe, wobei das Konzentratreservoir dem Verdampfer direkt angeschlossen war. Die Konzentrierung erfolgte somit in einem geschlossenen Kreislauf. Diese Arbeitsweise beeinflußte die Aktivität der Ig nicht.

Hierauf wurde das Konzentrat (96 kg) in entsprechender Weise getrocknet, zum Beispiel durch Gefrieren und anschließende Lyophilisation. Das Gefrieren erfolgte auf Platten bei -40°C. Die Ig konnten bei -30°C 45 Tage ohne Aktivitätsverlust gelagert werden. Das Produkt wurde bei -30°C auf Platten in einem verschlossenen Behälter bei 0,5 mmHg lyophilisiert, bei einer Kondensatortemperatur von -50°C und unter Erwärmung auf +30-30°C. Diese Trocknungsweise beeinflußte die Aktivität der Ig nicht. Es wurden 19,1 kg trockenes Produkt erhalten, das 25-35% Ig enthielt. Das Produkt wurde steril verpackt.

Beispiel 3

Es wurde wie in Beispiel 2 verfahren, wobei die Milch der ersten 8 Tage nach dem Kalben und die während der letzten 4 Wochen der Laktation gesammelte Milch behandelt wurde. Es wurde ein Proteinkonzentrat der folgenden mittleren Zusammensetzung erhalten:

Proteine75 ± 5% 40 ± 5% Immunglobuline
15 ± 5% α-Laktalbumine
35 ± 5% β-Lactoglobuline
5 ± 2% Seralbumin
5 ± 2% andere Spuren-Proteine

Restfeuchtigkeit 4 ± 0,5% Lactose10 ± 2% Mineralsalze 5 ± 2% nicht-proteinische stickstoffhaltige Substanzen 5 ± 2%

Beispiel 4

Es wurde wie in Beispiel 2 verfahren, mit dem Unterschied, daß der Rahm und das Kasein mit Wasser extrahiert wurden, um einen Teil der verlorengegangenen Ig zurückzugewinnen. Dabei wurden die Waschwasser wieder in den Verarbeitungsprozeß zurückgeführt.

Die kalte Entrahmung (Stufe A) erfolgte in einer parallelen Verarbeitungslinie. Dabei wurde mit Wasser die Ig enthaltende Proteinfraktion, die durch den Rahm mitgeführt worden war, etrahiert. Der Rahm aus der ersten Zentrifugierung (115 kg) wurde in einem Reservoir mit einem Fassungsvermögen von 1000 l und mit einem Rührer aufgefangen und mit 150 kg Wasser von 40°C gemischt, worauf das Ganze 30 min gerührt und dann in einer Entrahmungsvorrichtung zentrifugiert wurde. Auf diese Weise wurden 115 kg Rahm und 150 kg Lösung voneinander getrennt, wobei die letztere mit der entrahmten und geklärten Milch vereinigt wurde. Auf diese Weise wurden 1130 kg Flüssigkeit erhalten, welche der warmen Entrahmung (Stufe B) und der Koagulation zugeführt wurden.

Die Abtrennung des Kaseins ergab ausgehend von 1145 kg entrahmter, mit Lab versetzter und angesäuerter Milch 991 kg Milchserum und 154 kg Kasein. In einer parallelen Linie wurde die Proteinfraktion, welche die Ig enthielt, mit Wasser aus dem ausgefällten Kasein extrahiert. Das ausgefällte Kasein wurde am Ausgang der selbstreinigenden Trommelzentrifuge in ein mit einem Rührer ausgerüstetes Reservoir eingeführt und mit 300 kg Wasser von 40°C während 30 min gerührt und dann in eine Kolloidalmühle geführt. Die Suspension des gemahlenen Kaseins wurde dann in einer selbstreinigenden Trommelzentrifuge agetrennt. Es wurden 154 kg gewaschenes Kasein und 300 kg Waschwasser erhalten, welche für die nachfolgenden Arbeitsgänge mit dem Milchserum vereinigt wurden. 1291 kg Milchserum wurden filtriert und ultrafiltriert, was zu 2010 kg Permeat (I, II und III) und 216 kg Vorkonzentrat führte. Die Eindampfung lieferte 108 kg Konzentrat, das beim Trocknen 21,6 kg Produkt ergab. Auf diese Weise wurden im Verhältnis zum Verfahren von Beispiel 2 zusätzliche 14% Ig erhalten.

Beispiel 5

1 kg des gemäß Beispiel 2 oder Beispiel 4 hergestellten Pulvers bzw. 2 kg des gemäß Beispiel 3 hergestellten Pulvers wurden mit 100 kg Milchpulver homogen vermischt, worauf das Gemisch steril konditioniert wurde. Dabei wurde ein Produkt erhalten, das bei einer isokalorischen Verabreichung für ein frühgeborenes Kind von 140 cal/kg/Tag eine prophylaktische Dosis Ig enthielt, was 250 mg Ig-Konzentrat/kg/Tag bei Herstellung gemäß den Beispielen 2 oder 4 bzw. 500 mg Ig-Konzentrat/kg/Tag bei Herstellung gemäß Beispiel 3 entspricht.

Beispiel 6

Es wurden verschiedene Tests in vitro und in vivo mit den Proteinkonzentraten der Beispiele 2 oder 4, die in der Folge mit "Ig-Konzentrat" bezeichnet werden, durchgeführt, um zu zeigen, daß die Milch-Ig eine Antikörperspezifizität aufweisen, die man normalerweise bei menschlichen Ig findet, und daß diese im Verlauf des Herstellungverfahrens bewahrt wird; und daß die spezifischen Milch-Ig eine schützende Aktivität zeigen, indem sie in die Pathomechanismen der enteropathogenen Mikroorganismen eingreifen.

Passive Hämagglutination

Rote Blutkörperchen vom Schaf wurden mit einem Harnstoffextrakt eines spezifischen Serotyp von E. coli sensibilisiert. Dieser Extrakt wurde gemäß Brodhage (Brodhage H. (1961), J. Hyg., 1961, 148, 94) erhalten. Die Bakterien wurden auf einem Nähragar (Difco) bei 37°C während 30 h in Roux-Flaschen kultiviert. Die Kultur wurde mit 10 ml phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung pH 7,2 (8,8 g NaCl + 1,86 g Na₂HPO₄ · 2H₂O + ¼,43 g KH₂PO₄/1000 ml H₂O) geerntet. Nach Zusatz von 10 g Harnstoff wurde die Suspension 90 h bei 37°C unter mäßigem Rühren stehen gelassen. Nach Abzentrifugierung wurde der Überstand erschöpfend gegen phosphat-gepufferte physiologische Kochsalzlösung pH 7,2 dialysiert, bis zu einem Gesamtvolumen von 50 ml mit phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung pH 7,2 verdünnt und in kleinen Portionen bei -20°C gefroren. Die Sensibilisierung der roten Blutkörperchen vom Schaf mit diesem Antigen erfolgte durch eine Kombination der Verfahren gemäß Avrameas et al. (Avrameas S., Taudou B., Chuilon S., Immunochemistry, 1969, 6, 67) und gemäß Otto et al. (Otto H., Takamiya H., Vogt A., J. Immunol. Methods, 1973, 3, 137). Die roten Blutkörperchen vom Schaf wurden mit Glutaraldehyd vorbehandelt (Endkonzentration der roten Blutkörperchen vom Schaf 5% und Glutaraldehyd 0,5%), dann gewaschen und in einer phosphat-gepufferten physiologischen Kochsalzlösung, pH 7,2, in eine 20%ige Suspension gebracht und schließlich mit dem gleichen Volumen Harnstoffextrakt gemischt. Nach 16 h Inkubationszeit bei 20°C unter schwachem Rühren wurden die sensibilierten roten Blutkörperchen vom Schaf mehrere Male gewaschen und für die sofortige Verwendung in eine 1%ige Suspension gebracht. Die roten Blutkörperchen vom Schaf konnten in einer 10%igen Suspension bei 4°C mehrere Wochen gelagert werden.

Vor der Titration mußte jede zu untersuchende Probe mit roten Blutkörperchen vom Schaf, welche mit Glutaraldehyd vorbehandelt worden waren, absorbiert werden (0,1 ml sedimentierte rote Blutkörperchen vom Schaf auf 1 ml Ig-Konzentrat, 37°C, 60 min.).

Die Titrationen wurden mit dem System Microtiter (Sever J. L., J. Immunol., 1962, 88, 320 und Conrath T.B., Handbook of Microtiter Procedures, 1972) durchgeführt, wobei Polystyrolplatten mit Kavitäten in Form eines V verwendet wurden. Es wurde eine Verdünnungsreihe von jeweils 50 µl in einem 1/200 verdünnten normalen Serum vom Kaninchen hergestellt, worauf 25 µl sensibilisierte rote Blutkörperchen vom Schaf in einer Konzentration von 1% zu jeder Verdünnung zugegeben wurden. Eine Verdünnungsreihe wurde mit nicht-sensibilisierten roten Blutkörperchen vom Schaf versetzt zur Kontrolle auf nicht-spezifische Agglutination. Die Resultate wurden nach 2 h abgelesen, wobei als Hämagglutinationstiter die letzte Verdünnung verwendet wurde, die zu einer klaren positiven Reaktion führte.

Die für 5 E. coli Serotypen erhaltenen Resultate sind in der folgenden Tabelle angegeben:

E. coli SerotypAgglutinationstiter

0 551/256 0 1111/ 64 0 1191/128 0 1271/128 0 1281/ 64 Kontrolle-

Bakteriostatische Aktivität in vitro

Es wurde die bakteriostatische Aktivität auf das Wachstum verschiedener E. coli Serotypen durch Zusatz von Ig-Konzentrat zum Kulturmedium studiert. Es wurde das Microtiter System, das für Kulturzwecke adaptiert worden war, verwendet, was es gestattete, minimale Mengen der zu testenden Proben zu verwenden und gleichzeitig eine maximale Anzahl von Proben zu untersuchen.

Jede Kultur hatte ein Endvolumen von 0,25 ml, entweder in einem Minimalmedium, das 1% Glucose enthielt, oder in einem Voll-Kulturmedium. Für jeden untersuchten Wert der Inkubationszeit wurden zwei Proben entnommen, um das Fehlerrisiko aufgrund von Veränderungen des Volumens zu verringern. Die Bestimmung erfolgte durch doppelte Zählung von 10 µl-Aliquots auf Nähragarplatten. Das Bakterieninokulum bestand aus einer Verdünnung einer 16 h alten Kultur in Minimalmedium, das 1 bis 2 × 10³ Bakterien/ml enthielt. Die Inkubation erfolgte in feuchter Atmosphäre bei 37°C. Das Ig-Konzentrat wurde vor der Inokulierung mit 2 × 10³ E. coli/ml entsprechend einer Endkonzentration von 1 µg/ml, 10 µg/ml, 100 µg/ml und 1 mg/ml dem Kulturmedium zugesetzt. Es wurde eine Wachstumsinhibition von E. coli 0 111 : B4 während der ersten 4 h der Inkubation bei einer Konzentration des Ig-Konzentrats von 10 µg/ml festgestellt. Im Vergleich zum Kontrollversuch, bei dem nur Kulturmedium verwendet wurde, wurde in Gegenwart von 1 mg/ml Proteinen von normaler Molke, die von nicht-immunisierten Kühen erhalten worden war, ein noch stärkeres Wachstum beobachtet.

Clearance von E. coli 0 111 : B4 bei Mäusen

Für jeden Versuch wurden Mäuse (weiße männliche Swiss Mäuse mit 20 bis 24 g) verwendet, und zwar 2 zur Kontrolle und 6 für 3 Versuche, die jeweils doppelt durchgeführt wurden. Alle Mäuse erhielten eine subkutane Injektion von 0,1 ml Heparin (500 UI/ml). Eine 16 h Kultur von E. coli 0 111 : B4 wurde 1/10 mit einer sterilen physiologischen Kochsalzlösung verdünnt und dann 1/100 verdünnt durch den Zusatz von 1/10 verdünntem fetalem Kälberserum für die Kontrollen und mit 3 ausgewählten Konzentrationen Ig-Konzentrat. 0,2 ml der erhaltenen Lösung wurden intravenös in die Schwanzvene injiziert, wobei jede Maus (2 Mäuse für die Kontrollen und 2 × 3 Mäuse für die Teste) etwa 2 × 10⁶ Bakterien erhielt, nachdem die ursprüngliche Bakteriensuspension 10⁹ Bakterien/ml enthielt. Unmittelbar nach der Injektion (Zeit t0) und nach 20, 40 und 60 min wurden 50 µl Blut durch Punktion des Orbitalvenenplexus mit Hilfe einer kalibrierten und heparinisierten Kapillare entnommen. Unmittelbar darauf wurden die Proben in 5 ml sterile physiologische Kochsalzlösung (Blutverdünnung 10^-2) überführt, die dann auf 10^-3 und 10^-4 in physiologischer Kochsalzlösung weiter verdünnt wurden. Hierauf wurde mit 1 ml einer jeden Verdünnung eine Zählung aus Agarplatten durchgeführt, worauf der Phagocytose-Index K gemäß Biozzi et al. (Biozzi G., Stiffel, C., Halpern B. N., Le Minor L., Mauton D., J. Immunol., 1961, 87, 296) bestimmt wurde:

C₁ und C₂ entsprechen den Zählungen zu den Zeiten T₁ und T₂.

Dabei wurde eine normale Verringerung der Anzahl der Bakterien durch Elimination im Reticulo-Endothelial-System in Gegenwart des fetalen Kälberserums beobachtet, während durch Zusatz von 10 µg Ig-Konzentrat zur Injektionslösung ein Verschwinden von 99,6% der Bakterien aus der Blutprobe in 20 min hervorgerufen wurde.

Die Resultate sind in der folgenden Tabelle angegeben:

Die Spezifizität der Opsonisation wurde durch erschöpfende Absorption von Ig-Konzentrat mit dem E. coli Serotyp 0 111 : B4 kontrolliert, und es wurde festgestellt, daß diese Absorption praktisch die gesamte Aktivität zur Erhöhung der Phagocytose aufhebt, sogar bei einer Menge von 1 mg Ig-Konzentrat.

In der folgenden Tabelle sind diese Phagocytose-Indizes K angegeben, die in 20 min erhalten wurden:

Schutztest bei Mäusen

Es wurden logarithmische (log₁₀) Verdünnungen einer Kultur von E. coli 0 111 : B4 in einem Nährmedium (Difco), das 10⁹ Bakterien/ml enthielt, in 5%igem Mucin (granulares Mucin, Type 1701-W zur Potenzierung der Virulenz der Bakterien, hergestellt, so daß Verdünnungen von 10^-4, 10^-5, 10^-6 und 10^-7 erhalten wurden.

Hierauf wurden 3 ml einer jeden Verdünnung mit 0,6 ml einer zu testenden Lösung verdünnt, nämlich mit physiologischer Kochsalzlösung, Ig-Konzentratlösung und Molkenproteinlösung von normaler Milch (nicht-immunisierte Kühe). Es wurden 5 Mäuse für jede Verdünnung verwendet. 0,6 ml des erhaltenen Gemischs wurden auf intraperitonealem Wege in die Mäuse injiziert. Die Resultate der Bestimmung der Anzahl der toten Mäuse je 5 behandelte Mäuse nach 48 h sind in der folgenden Tabelle angegeben.

Es wurde festgestellt, daß 100 µg Ig-Konzentrat einen kompletten Schutz bei allen getesteten Bakterienzahlen ergaben, während 100 µg Molkenproteine, die aus der Milch von nicht-immunisierten Kühen erhalten worden waren, keinerlei Schutz ergaben.

Beispiel 7

I. Eine erste klinische Versuchsreihe zeigte, daß die Milch-Ig einem proteolytischen Abbau in inaktive Bruchstücke im Intestinaltrakt widerstehen.

11 Kinder (9 Knaben, 2 Mädchen), die aus verschiedenen Gründen im Krankenhaus waren, aber nicht an einer Gastroenteritis litten, und deren Alter zwischen 2 Wochen und 1 Jahr lag, wurden mit Milch, die ein gemäß Beispiel 2 oder 4 hergestelltes Ig-Konzentrat enthielt, ernährt, und zwar in einer isokalorischen Dosis entsprechend 2 g/kg Körpergewicht, gleichmäßig verteilt über 24 h. Die erste und letzte Mahlzeit unter Einschluß von Ig-Konzentrat wurde mit 0,2 g Karminrot markiert.

Es wurde vor der Verabreichung des Ig-Konzentrates mindestens ein Stuhl und dann systematisch während 72 h jeder Stuhl gesammelt. Die Stühle wurden bei -20°C aufbewahrt.

Zur Herstellung von Stuhlextrakten wurden zunächst 2 Teile Stuhl mit 1 Teil einer phosphat-gepufferten Kochsalzlösung, pH 7,2, versetzt, worauf der Stuhl bei 0°C mit einem Glasstab verrührt wurde. Dann wurde die Suspension 20 min mittels einer Schüttelmaschine (400 U/min) bei Raumtemperatur geschüttelt. Schließlich wurde die Suspension rasch auf 0°C abgekühlt und bei dieser Temperatur bei 3500 g 15 min lang zentrifugiert. Hierauf wurde der Überstand sorgfältig abgehoben.

Die Anwesenheit von aktiven Ig in den Stuhlextrakten wurde durch doppelte Immunodiffusion (Test nach Ouchterlony) auch durch Immunoelektrophorese bestätigt. Die bei diesen Tests verwendeten Antiseren wurden durch wiederholte subkutane und intravenöse Injektion von 1 mg Milchantikörper oder 0,1 mg IgG₁ in Kaninchen hergestellt. Beim Ouchterlony-Test wurden Glasplatten (94 × 84 mm) mit einer Schicht von 1%igem Agar-Gel in phosphat-gepufferte Kochsalzlösung pH 7,2 beschichtet. In diese Schicht wurden Löcher von 4 mm Durchmesser im Abstand von 9,5 mm mit Hilfe einer Stanze (LKB-Produktor AB) ausgehoben. Es wurde ein Antiserum gegen die Molkenproteine aus Kuhkolostrum und ein spezifisches monovalentes Antiserum gegen IgG, aus Kuhmilch verwendet.

Für die Immunoelektrophorese wurden Glasplatten (100 × 85 mm) mit 12 ml 1%igem Agargel in 0,05 m Barbital-Puffer pH 8,3 (10,3 g Natriumbarbiturat + 0,5 g Zitronensäure + 0,5 g Oxalsäure auf 1 l Wasser) beschichtet. Die Trennung durch Elektrophorese wurde bei Raumtemperatur während 90 min mit 4 V/cm durchgeführt. Nach Diffusion der Antisera (24 h) wurden die Platten mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und mit Azocarmin B entwickelt.

Es wurde die Anwesenheit von Milch-Ig in den Stühlen festgestellt, trotz beträchtlicher Variationen des Zeitpunkts ihres Auftretens und der Dauer der Ig-Sekretion. Weiterhin wurde eine gute Übereinstimmung zwischen dem Auftreten und Verschwinden der karminroten Markierung der der Ig festgestellt.

Zur Bestätigung der Aktivität der Milch-Ig wurde der in vivo-Serumschutztest an Mäusen (wie er in Beispiel 6 beschrieben ist) durchgeführt, wobei 6 Stuhlextrakte in jeder Reihe verwendet wurden. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt:

Es wurde klar ein Zusammenhang zwischen den positiven Resultaten der Immunoelektrophorese und dem Schutzvermögen der in den Stuhlextrakten enthaltenen Stoffe festgestellt. Insbesondere konnte geschätzt werden, daß die Konzentrationen an Milch-Ig im Extrakt V (Kind M. D.) und IV und VI (Kind S. G.) mindestens 1 mg Ig-Konzentrat/ml entsprachen.

II. In einer zweiten klinischen Versuchsreihe wurden die therapeutischen und prophylaktischen Eigenschaften des gemäß Beispiel 2 oder 4 hergestellten Ig-Konzentrats untersucht.

Therapeutische Eigenschaften

Diese Studien wurden mit Kindern im Alter bis zu 5 Monaten durchgeführt, die an durch E. coli hervorgerufenen mäßigen bis schweren Gastroenteritis litten. Bei verschiedenen Versuchsreihen wurden an insgesamt 152 Patienten entweder 2 g Ig-Konzentrat/kg/Tag 5 Tage lang oder 1 g/kg/Tag 10 Tage lang mit der Nahrung verabreicht. Die Patienten erhielten keinerlei Medikamente wie z. B. Sulfonamide oder Antibiotika, und zwar weder oral noch parenteral. Es wurden Coprokulturen an jedem auf die Verabreichung folgenden Tag angefertigt, und zwar die letzte zwischen 36 und 48 h nach der letzten Verabreichung des Ig-Konzentrats. 43 Patienten wurden in der gleichen Weise behandelt, wobei jedoch das Ig-Konzentrat durch Molkeproteine, die von nicht-immunisierten Kühen stammten, ersetzt wurde.

Es wurden bei 90 Kindern (57,7%) im Verlauf der Behandlung negative Coprokulturen erhalten. In der Kontrollserie haben lediglich 14 Kinder (27,7%) ein spontanes Verschwinden von E. coli in den Coprokulturen gezeigt. Es ist dabei zu berücksichtigen, daß die nativen Proteine von Molke, die von nicht-immunisierten Kühen stammt, eine schwache Menge Anti-E. coli-Ig enthalten. Es wurde weiterhin festgestellt, daß ein Mißerfolg der Behandlung häufiger in Fällen beobachtet wurde, bei denen die höhere Dosis während einer kürzeren Zeit verabreicht wurde.

Die Konsistenz der Stühle wurde in jedem Fall untersucht. Es wurde ein Verschwinden der Diarrhöe und eine merkliche klinische Besserung in einer großen Anzahl der Fälle beobachtet, auch wenn die Coprokulturen positiv blieben. In den Fällen, in dene die Coprokulturen negativ geworden waren, besserte sich die Konsistenz der Stühle rascher, wenn das Ig-Konzentrat in einer Milchformel, die arm an Lactose war, verabreicht wurde.

Prophylaktische Eigenschaften

Frühgeburten sind gegenüber einer durch E. coli verursachten Gastroenteritis äußerst empfindlich, weshalb diese Gruppe für die prophylaktischen klinischen Versuche ausgewählt wurde.

Diese Studie wurde während 6 Monaten in 2 Sälen mit 8 Inkubatoren in jedem Saal durchgeführt. Die Testversuche und Kontrollversuche wurden in jedem Saal so verteilt, daß alle Patienten den gleichen Bedingungen ausgesetzt wurden, wobei 4 Inkubatoren für den Test und 4 für die Kontrolle dienten. Jeder Fall blieb im Mittel 41 Tage, wobei ein nach der Heilung weggenommenes Kind druch ein anderes ersetzt wurde, unabhängig davon, ob es dem Test oder der Kontrollgruppe angehörte. Es wurden 70 Fälle verfolgt, 36 Kontrollen und 34 Tests.

Die Testgruppe erhielt das Ig-Konzentrat mit jeder Mahlzeit in einer Menge von 0,25 g/kg/Tag über 24 h verteilt. Eine Coprokultur wurde zu Beginn des Versuchs gemacht und weitere Coprokulturen wurden alle 5 Tage untersucht. Von insgesamt 666 Coprokulturen gehörten 339 zur Kontrollgruppe und 327 zur Testgruppe. Unter den letzteren zeigten 33 (10,1%) die Anwesenheit von E. coli, während 96 der 339 Kontrollkulturen (28,3%) positiv waren. Wenn lediglich der E. coli Serotyp 0 119 : B14 untersucht wurde, der häufig mit schwerer verlaufenden Formen der Gastroenteritis verbunden ist, dann war die Häufigkeit der positiven Coprokulturen 5,5% in der Testgruppe gegenüber 23,3% in der Kontrollgruppe.

Es kann also geschlossen werden, daß der Einbau eines Proteinkonzentrats, das gegen E. coli spezifische Milch-Ig enthält, in die Milch für Frühgeburten, in deutlicher Weise die Infektion durch E. coli innerhalb dieser besonders empfindlichen Gruppe von Neugeborenen verringert.

Claims

1. Proteinkonzentrat aus Kuhmilch, das aktive, nicht-denaturierte Immunglobuline (IgG) enthält und das erhalten worden ist durch Impfen von Kühen mit Antigenen von Escherichia coli, die für eine Gastroenteritis bei Neugeborenen verantwortlich sind, während der 8. Woche vor dem Kalben bis zum Kalben, Gewinnen der Milch von diesen hyperimmunisierten Kühen, Entrahmen der Milch, Abtrennen des Kaseins durch Koagulation und Aufbereiten eines an dem immunologischen Faktor angereicherten Serums zu einem Proteinkonzentrat, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) von einem entrahmten Milchgemisch von hyperimmunisierten Kühen ausgeht, das sich zusammensetzt aus der Milch des 1. bis 8. Tages nach dem Kalben und/oder der Milch der letzten 60 Tage vor dem Ende der Laktation,
b) dieses entrahmte Milchgemisch durch Einstellung des pH-Wertes auf etwa 4,6 und Erwärmen auf 37°C koaguliert und das Koagulat abtrennt,
c) die dabei erhaltene Molke einer dreistufigen Ultrafiltration unterwirft und die derart vorkonzentrierten Molkenproteine steril filtriert und
d) das erhaltene Produkt unter Aufrechterhaltung der sterilen und nativen Bedingungen konzentriert und gefriertrocknet.

2. Verfahren zum Herstellen des Proteinkonzentrats nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das den Kühen verabreichte Antigen homologes Blutserum von immunisierten Kühen als Adjuvans enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Entrahmung der Milch in zwei Stufen, nämlich in der Kälte und dann in der Wärme erfolgt und daß das Entrahmen und das Abtrennen des Koagulats von einer weitgehenden Klärung begleitet ist.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der abgetrennte Rahm und das Koagulat mit Wasser extrahiert und diese Extrakte bzw. Waschwässer mit der entrahmten Milch bzw. der Molke vereinigt werden.

6. Verwendung des Proteinkonzentrats nach Anspruch 1 in Verbindung mit Milchpulver oder rekonstituierter Milch als Trägermaterial.