CA1101333A

CA1101333A - Procede de fabrication d'un concentre proteique contenant des facteurs immunologiques d'origine lactique

Info

Publication number: CA1101333A
Application number: CA300,770A
Authority: CA
Inventors: Helmut Hilpert
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA
Priority date: 1977-04-15
Filing date: 1978-04-10
Publication date: 1981-05-19
Also published as: MY8100294A; AU519091B2; FR2387039A1; FR2387039B1; AR218482A1; DK131078A; JPS6340771B2; AU3490378A; ZA781607B; NL187516C; MX5007E; CH627079A5; NL187516B; SE7804190L; OA05938A; IT7848896A0; GR64433B; JPS53130411A; DE2813984C2; PH17782A

Abstract

Procédé de fabrication d'un concentre protéique contenant des facteurs immunologiques d'origine lactique. notamment des immunoglobulines actives non-dénaturées. Ce procédé est caractérise en ce que l'on recueille le lait de femelles laitières hyperimmunisées, on sépare la crème et les impuretés, on coagule le lait clarifié et écrémé, on sépare la caséine, on filtre, ultrafiltre et stérilise les protéines du petit-lait par filtration, on évapore et on sèche le produit dans des conditions ne dénaturant pas les immunoglobulines et conservant la stérilité Le produit rich en immunoglobulines actives non-dénaturées obtenu par le procédé selon l'invention est particulièrement utile à titre de médicament contre les gastro-entérites provoquées par E. coli chez les nouveaux-nés.

Description

La présente invention concerne un proc~idé de - -fabrication d'un concentré protcique contenant des facteurs -immunologiques d'origine lactlque, notamment des immuno-globulines actives.
On a déjà proposé d'introduire des facteurs immunologiques d'origine lactique dans des produits diété-tiques pour nouveaux-nés et nourrissons par incorporation au lait de ces facteurs, l'ingestion orale de ces produits devant permettre le transfert dans le sang du nourrisson de ces facteurs sans toutefois indiquer les modalités ni les résultats d'une telle immunisation passive généralisée. -On a également proposé d'isoler des lactoglobu-lines immunes à partir de lait de vaches vaccinées, par coa-gulation du lait, récupération du lactosérum et précipitation sélective des lactoglobulines par le sulfate d'ammonium sui-vie de dialyse contre l'eau pure, filtration et séchage.
Des tests de séroprotection chez la souris en liaison avec ces travaux ont montré que l'injection parentérale de ces principes immunisants procurait une protection passive g,i5né~
ralisée contre certaines bactéries et virus entéropathog3nes, lorsque ces micro-organismes étaient injectés aux animaux par la meme voie. - -On a maintenant trouvé une méthode de fabrica- ~"",!
tio~ à l'~chelle industrielle d'un concentré protéique conte~
: . .
~25 nant des immunoglobulines sans dena~uration de celles-ci au ~ ~-cours du processus technologique. Ce produit procure une immu-nisation passiVP locale au niveau de l'intestin sans résorption et sans destruction notable de son activité
~ dans le tractus digestif.
Le procédé selon l'invention est caractérisé par les etapes suivantes :
On recueille le lait de femelles laitières hyperimmunisees, -: ~;
, ~

- 2 - ~ 333 ~ .
On sépare la cr~me et les impuretés, on coagule le lait clarifi~ et écrémé, on sépare la caséine, on filtre, ultrafiltre et stérilise les protéines du petit-lait par ultrafiltration, on évapore et on sèche le produit dans des conditions ne dénaturant pas les immunoglobulines et conser- ~
vant la stérilité. ~~
Le dessin annexé est une représentation schématique des différentes étapes du procedé.
Les femelles laiti~res utilisees sont des bovidés, en particulier des vaches.
Le lait à traiter peut etre de différents types plus ou moins riches en anticorps : colostrum, lait de transition (lait des 8 jours suivant le vêlage) ou lait de fin de lactation (2 derniers mois de sécrétion lactée).
On préfère traiter un m~lange de ces laits pour obtenir un taux dlanticorps élevé pendant la période la plus longue possible.
L'hyperimmunisation de la vache s'ef~ectue par une vaccination combinee. Par exemple par instillation ~ntra-c~sternale dans la glande mammaire, injection parenterale (sous-cutanée, intraveineuse), injection dans le système ganglionnaire rétromammaire, par scarification, par ingastion orale ou par combinaison de plusieurs de ces modes.
On préfère utiliser une combinaison de ces modes suivant un schéma d'immunisation soigneusement établi afin d'obtenir un titre d'anticorps satisfaisant dans chaque type de la~t utilise. Ainsi, pour le colostrum et le lait de ,i transition, la vaccination est parentérala et intracisternale dans les 8-2 semaines avant vêlage et orale pendant la semaine précédant le vêlage. ~ -, , .
' '

3 ~ L333 pour le lait de fin de lactation, on procede une alternance de vaccinatio~ parenter~e~locale et orale à partir de 2 mois et demi avant le tarissement presumé de la secre-tion lactee.
Le vaccin utilis~ est avantageusement un mélange de l'antigène choisi et d'un adjuvant à base de sérum sanguin homologue de vaches immunisées permettant ainsi une detoxi-fication du vaccin et la formation des complexes immuns.
La vache servant comme animal de production, les Ig contenues dans le concentre protéique sont principalement des IgG (spécialement des IgGl) à la différence du lait mater-nel qui contient des IgA comme Ig préponderantes.
ha teneur en Ig dans le concentré protéique dans lequel les protéines représentent 70 à 80 ~ en poids est ;15 de 25 à 35 % en poids. Certains avantages sont lies au fait que, dans la mise en oeuvre du procedé, les Ig ne sont pas separées des autres proteines du lactoserum, lesquelles sont donc egalement presentes dans le concentre obtenu. On evite , ainsi les operations de precipitation selective par exemple par le ~20 sulfate d'ammonium et dialyse.
De plus, certains facteurs bacteriostatiques ou -anti-viraux, par èxemple la lactoferrine ou les systèmes en-zymatiques tels ~ue lactoperoxydase, ribonuclease qui sont presents dans le lactoserum se retrouvent dans le concentre proteique. ~'~
Toutes sortes d'antigènes d'origine virale ou bacte-rienne peuvent être utilises et les anticorps obtenus sont fonction de la nature des antigènes administrés à la vache.
On peut, par exemple, obtenir une protection contre les bacte-ries et virus enteropathogènes responsables de gastroenterites accompagnees de fortes diarrhées avec déshydratation, par incorporation du concentre proteique contenant les Ig dans tout support convenant à une administration orale. Ce support , .
_ 4 ~ D1333 peut être un excipient ~uelconque ou de préférence un produit diététique tel qu'un lait ou une farine lactée pour petit enfant, un lait dit "humanisé" ou adapté pour nourrisson, un lait spécia-lement adapte ~ un groupe particulier de nouveaux-nés comme par exemple un lait pour prémature ou enfant de faible poids de naissance, etc.
Si on veut utiliser par exemple un concentré contenant des Ig anti E.coli en dose prophylactique avec un lait comme support, on incorporera de 0,8 à 3 g de concentré à 100 g de matière sèche et jusqu'à 6 g en dose thérapeutique.
Pour mettre en oeuvre le procédé, il est nécessaire de velller à ce ~ue les opérations d'écrémage et de clarifica-tion soient très poussées pour ~viter une obturation subséquente des filtres et ultrafiltres.
L'écrémage s'effectue de prérérence en deux étapes, d'abord ~ froid pour éliminer la majeure partie des matières grasses et des impuretés (comme par exemple le sang souvent ~ -contenu dans le colos~rum) et ensuite à chaud pour séparer complètement celles-ci. La coagulation peut se faire au pH
isoélectrique de la caséine en présence de présure avec addition d'acide, par exemple d'acide citrique.
On préfère erfectuer la coagulation par adjonction d'acide, par exemple d'acide chlorhydrique, jusqu'à pH d'environ

4,6 et chauffage jus~u'à 40~C.
La séparation de la caséine s'accompagne d'un débour-bage du sérum permettant de séparer les fines.
D'autre part, il est essentiel de conduire les opé-rations nécessitant un traitement thermique (évaporation et séchage) dans des conditions ménagées pour éviter d'inactiver -les Ig.
Pour diminuer les pertes en Ig, dont une partie est éliminée dans l'écxémage avec la crème et une autre avec la caséine lors de la séparation de celle-ci, il est indiqué
d'extraire ~ l'eau et la crème et le caillé et de traiter .~ .
~ les eaux de lavage contenant les Ig pour les récupérer.

Les exemples suivants, dans lesquels les quantités et proportions sont en poids sauf indications contraire, illustrent la façon dont l'invention peut etre mise en oeuvre.
E X E M P L E
Des vaches de différentes races ont été hyperimmu-nisees suivant le schema ci-dessous avec un vaccin dont la preparation est indiquée ci-àprès, et on a recueilli le lait des deux derniers'mois de sécrétion lactée et des 8 premiers jours après vêlage.
Préparation du vaccin On a utilisé les serotypes E.coli enteropathogenes ::
suivants :
0 18 : K 76 (B 20) 0 111 : K 58 (B 4) 0 20 : K 17 (L) 0 112 : K 68 (B 11) 0 26 : K 60 (B 6) 0 119 : K 69 (B 14) 0 44 : K 74 ~L) 0 124 : K 72 (B 17) 0 55 : K 59 (B 5) 0 125 . K 70 (B 15) ; 0 78 : K 30 (-) 0 126 : K 71 (B 16) 0 86 : K 61 (B 7) 0 127 : X 63 (B 8) 0 128 : K 68 IB 12) Les differentes souches provenaient de cas de gastro-enterites chez des enfants hospitalises. Le serotypage a ete fait avec des anti-sera multi et monovalents (Difco)*. Les ; bacteries ont ete cultivees en milieu liquide minimal contenant 2~ d'acides amines derives de la caseine (casaminoacids Difco~*
et 2% de glucose pendant 24 heures à ~37~C sans agitation des flacons. Pour inactiver les germes, on a separé les cultures par centrifugation entre cellules sédimentées et sur~ageant. -Les cellules ont eté remises en suspension et incubées à ~37~C
pendant 24 heures en présence de 0,5 ~ de formaldehyde, cepen-dant que le surna-.

- 5 -* Marque de commerce . ~ .
: ' ' , ,. , , .,, ., ., , ... , ~, . .. " . . ,; . ' ; ' ' : ! ' .
- - 6 - 11~l33~
geant a été inactive comme indique ci-dessus mais avec 0,05 de formaldehyde. Apres une nouvelle centrifugation et elimi-nation du surnageant, les bacteries ont ete remises en sus-pension dans le surnageant inactive d'origine. Cette proce-dure permet de conserver le surnageant contenant des exoto-xines bacteriennes pour le vaccin. On a obtenu un vaccin à
1-2 x 109 bacteries/ml, ~u'on a ensuite dilue par mélange avec une solution à 2 % d'Al (OH)3 et du sérum sanguin homologue de vaches immunisées.
", .'':
.
.
, .-~ - .
'~
,'"- ' ' ;

l~,, Procedure d'immunisation A. Schema d'immunisation pour l'obten~ion de lait colostral et de transition contenant des Ig anti-E.coli :
Jour de vêlage presume = X
Moment du traitement Vaccin + adjuvant ev. Mode d'adminis-~ tration.
X - 8 semaines 5 ml vaccin (5 x 107 injection sous-: bactéries/ml) cutanée 5 ml serum *
X - 7 semaines 5 ml vaccin ~5 x 107 in~ection intra-bacteries/ml) veineuse - + 5 ml 2% A1 (OH) + 5 ml serum * 3 - . X - 6 semaines - 10 ml vaccin (5 x 10' injection sous-bacteries/ml) cutanee X - 51/2 semaines 20 ml vaccin (5 x 107 injection dans le ; bacteries/ml) systeme ganglion-~ + 10 ml 2~ Al ~OH)3 naire retromammaire X - 5 semaines 40 ml vaccin (5 x 107 instillation de : bacteries/ml) 4 x 15 ml dans le + 20 ml serum pis par les canaux . . des trayons X - 41/2 semaines 24 ml vaccin (5x 108 injection sous-bacteries/ml) ~ cutanee **
~ 8 ml serum *
X - 4 semainès 40 ml vaccin ~5x 107~ instillation de - : bacteries/ml) . 4 x 15 ml dans ~ 20 ml serum le pis par les : canaux des trayons X - 3 semaines 10 ml vaccin (5x 108: injection sous- -. bacteries/ml) ~ cutanee X - 2 semaines 5 ml vaccin (5x 108 injection intra-bacteries/ml) ~ veineuse . + 5 ml 2% Al (OH)3 X - l semaine 100 ml vaccin ingestion ora~e 1 x 109 bactéries/ pendant le rumi-~ . ml) . nement X - l/2 semaine 100 ml vaccin ingestion oral~
(lx 109 bactéries/ pendan~ le ru-ml) minement ..... _ ._ ......... , ..... , __ ...... . _ ._ . .~
.
- 8 - 1~ 333 * Ces additions de serum sont faites uniquement dans le cas o~ une vache est immunisee pour la premiere fois.
** Cette injection sous-cutanée est repartie dans le système lymphatique comme suit :
2 x 4 ml dans les ganglions lymphatiques pre-scapulaires 2 x 4 ml dans les ganglions lymphatiques post-scapulaires 2 x 4 ml dans les ganglions lymphatiques inguinals 2 x 4 ml dans les ganglions lymphatiques poplités B. Schema d'immunisation pour l'obtention de lait de fin de lactation (2 derniers mois de lactation) contenant des Ig anti-E.coli.
Cette immunisation s'applique uniquement aux vaches ayant deja eté immunisées pour la période colostrale et de transition.
Jour présumé de tarissement de la sécrétion lactée = X
.~
Mcment du traitenent Vaccin + adjuvant év. Mcde d'admunistration X - 70 jours 5 ml vaccin t5 x 10 injection bactéries/ml) intraveineuse + 5 ml 2~ Al (OH) X - 65 jours 20 ml vaccin (5 x 108 injection dans le s bactéries/ml) syst'eme ganglionnaire retrom~aire "
- X - 60 jours 24 ml vaccin (5 x 10~ injection sous- cutanee **
bactéries/ml) (ax~Se ci-dessus sous A) X - 55 jours 100 ml vaccin (1 x 109 ingestion orale bactéries/ml) pendant ruminement X - 50 jours 40 ml vaccin (5 x 10 instillation dans bactéries/ml) le pis ccmmesci-dessus - + 20 ml s~rum sous A
X - 40 jours 100 ml vaccin (1 x 10 ingestion orale bactéries/ml) pendant ruminement X - 30 jours 20 ml vaccin (5 x 10~ injection dans le syste'me bactéries~ml) ganglionnaire retra~n~ire X - 25 jours 40 ml vaccin (5 x 107 instillation dans le pis bacteries/ml) cc~me ci-dessus sous A
-, + 20 ml sérum 9 ,.
X - 10 jours 100 ml vaccin (1 x 10 ingestion orale pendant bacteries/ml) n~nement ~1333 E ~ E M P L E 2 Le lait des huit premiers jours après velage recueilli a partir de vaches vaccinées selon l'exemple 1 a été *raite comme suit : -- l'écremage s'effectue en deux etapes : etape A, a froid et etape B a chaud.
A / 1100 kg de lait passent à froid dans une ecre-meuse centrifuge et sont dirigés vers une cuve tampon de 2500 1 puis pompes dans une débourbeuse centrifuge à accélé-rations élevées (environ 11.000 gt afin d'éliminer san~ et impuretés (boues).
B / Le lait débourbé froid est stocké dans un réser-voir de ~500 1 et pompé à travers un réchauffeur tempéré à
40~C dans l'écrémeuse centrifuge qui a déjà servi précédemment, séparant ainsl 110 kg de crème qu'on récupère et 5 kg de boues ~ui sont detruites. En variante, on peut utiliser une ecre-meuse autodebourbeuse dans les opérations d-'écremage à froid et une débourbeuse entre ces opérations et réduire ainsi la durée de l'écremage.
- le lait ecreme et debourbe chaud (985 kg) est alors reparti dans 4 bacs à coagulation carres de 750 1 chacun munis de brasseurs pour l'operation de coagulation.
On ajoute une solution d'acide chlorhydrique 1 N ~
37~C jusqu'à stabilisation du pH à environ 4,6 et on maintient la temperature pendant 20 mn avec brassage. On refroidit ensuite à en~iron 15~C.
- l'operation suivante est la separation de la caséine. ~lle consis-te en deux cen~riEu~ations en série du lait écrémé, caillé et coupé. La premiere sépar~ la majeure partie de la casëine caillée au moyen d'une clarifieuse-auto-débourbeuse separant 150 Ig de caséine, le serum passant dans un reservoir tampon. La seconde centrifugation enlève toute 1~ 33 .
trace de particules qui pourraient entraver lloparation sui vante de filtration et ultrafiltration, par exemple au moyen da la débourbeuse utilisaa dans l'operation A de l'ecremage.
On obtient 854,7 kg de serum d~ibourbe qui est pompé dans un reservoir de ~.500 1.
On procède alors à la filtration suivie d'ultra-filtration du serum. La filtration doit être très soignée pour éliminer toute difficulté à l'ultrafiltration en saparant les particules très Eine~ decaseine. Elle s'opère par filtre . _ , . .. ... .
Seitz Supra 100* ~ plaques de ... _ . . .. . . .. . .. . _ 20 x 2~t cm. Le ftltrat est stocke dans un réservolx de 3000 1 puis pompe vers l'ultrafiltre. L'ultra~iltration s'opère en 2 ou 3 étapes avec ~ecyclage du retentat dans le r~servoir. Deux pompes centrifuges en scrie fournissent le debit con~re une pression d'entrée dans le compartiment d'entrée de l'ultrafiltre d'environ 7 bars, à la sortie duquel la pression est maintenue a environ 4,5 bars. Pour éviter le réchauffement du rétentat par l'energie fournie aux pompes, celui-ci est refroidi à environ 10-12~C.
La première étape ou ultrafiltration propre permet de séparer les solutés à haut poids moléculaire, les protéines, retenues sur la membrane, qui se trouvent dans le rétentat, tandis qu'une partie du lactose, des vitamines, sels minéraux et de l'eau sont évacués dans le perméat. En utilisant un module DDS avec me~rane 800 ~surface membrane = 7 m2), le rapport rétentat/perméat étant d'en-viron 1 à 3,1, on obtient ainsi 580 kg de perméat I et 274,7 kg de rétentat avec un débit moyen de 14,17 kg perméat/m h.
La seconde étape est une diafiltration, au cours de laquelle on ajoute continuellement au rétentat 825 k~ d'eau et on fait cir-culer la solution dans les ~nêmes conditions que dans la première etape. La diafiltration est arretée lorsque la conductabilité
électrique du permeat atteint la valeur désiree, le rapport retentat/eau ajoutée étant d'environ 1 à 3. On sépare ainsi 825 kg de perméat II et 274,7 kg de rétentat avec un débit moyen de 11,77 kg perméat/m h. La 3ème étape est une concentration qu'on opère faculta~
tivement par recyclage du rétentat sur la membrane jusqu'à un taux de matières sèches d'environ 10 %, par élimination de 82,5 kg de ;~ permeat III. On obtient ainsi 192,2 kg de solution préconcentrée.
En variante on supprime cette 3ème étape et on procède directement à la fil~ration stérile.
La filtration stérile represente une étape importante dans 1'ensemble du procédé parce que les traitements thermiques ne sont pas applicables pour la stérilisation, car ils conduisent a une déna-turation des Ig. La filtration stérile débarrasse le rétentat des microorganismes qui pourraient encore s'y trouver tla majeure partie de ceux-ci ont déj~ eté éliminés lors de la séparation de la crème, -de la caseine et des boues). Afin d'eviter le bloquage des filtres sterilisants, un debourbage par centrifugation et une triple filtra--- tion du retentat sont nécessaires. Après débourbage, le ;-~
retentat est stocké dans un réservoir et passé par une ligne .
~1333 de filtration comprenant une préfiltration sur triple filtre Seitz Supra 100*, EK, EKS montes en serie, puis filtration sterile sur filtre Seitz Supra 20* et Millipore HA 0,45~*, montes en serie et prealablement sterilises à l'eau surc~auffee.
Le retentat sterile est stocke dans un reservoir sterile de 500 1.
Toutes les operations ulterieures se feront sous conditi~ns stériles. A l'aide d'azote comprime et filtre ste- -;
; rile, par exemple, on peut transferer à l'opera-tion suivante dlevaporation.
L'evaporation est effectuee avec un evaporateur à
couche mince (à flot tom~ant de surface 1 m2) à temperature de chauffage de 75~C, celle du produit etant d'environ 30~C
jusqu'à un taux de matières sèches d'au moins 20 ~. Pour eviter toute infection, le transfert se fait par pompe peris-taltique du reservoir retentat au reservoir concentrat, lequel est relie à une boucle comprenant l'evaporateur, l'operation de concentration se faisant en circuit ferme. Cette operation , n'affecte pas l'activite des Ig.
- On procede alors au sechage du concentrat (96 kg) par tout moyen convenable, par exemple par congelation suivie d'une lyophilisation. La congelation peut s'effectuer sur plateaux à -40~C. Les Ig peuvent être stockes à -30~C sans ; perte d'activite pendant environ 45 jours. Le produit à -30~C
est lyophilise dans des plateaux dans une enceinte ~ 0,5 torr, avec une temperature du condenseur de -50~C et chauffe à tem- ;
perature de 30-35~C. I,e mode de sechage n'affecte pas l'acti-vite des Ig. On obtient ainsi 19,1 kg de produit sec conte-nant 25-35 % d'Ig que l'on conditionne sterilement.
* Marque de commerce.

~ ' ~'''.
11~1333 .

Lorsqu'on procède comme à l'exemple 2 en traitant le lait des premiers 8 jours apres velage et le lait recueilli rendant les dernières 4 semaines de la lactation, on obtient un concentré proteique de composition moyenne :
Proteines 75 +5 %
30 +5 % immunoglobulines 15 +5 % ~-lactalbumines - 35 -5 ~- lactoglobulines . . ~--' ' ' , 5 -2 ~ sérum albumines 5 ~2 % autres protéines mineures humidité residuelle 4 -0.5 lactose 10 ~2 sels minéraux 5 -2 ~ ;
substances azotées non-protéiques 5 ~2 . .
E x e m p 1 e 4 . .
'." ~, On procède comme à l'exemple 2 à la difference que la crème et la caséine sont extraites à l'eau pour récupérer une partie des Ig perdues, les eaux de lavage étant recyclées dans la ligne de fabrication. --- L'écrémage à froid (etape A) s'effectue avec une ligne parallèle d'extraction à l'eau de la fraction de pro-teines contenant les Ig entraînee avec la crème. La crème provenant de la première centri~ugation (115 kg) est stockée -dans un réservoir de 1000 1 avec brasseur et mélangée à
150 kg d'eau tiède à 40~C, le tout hrasse pendant 30 minutes - et centrifuge dans une écrémeuse. On sépare ainsi 115 kg de crème et 150 kg de solution qui est reunie au lait ecreme ~
et debourbé. On obtient ainsi 1130 kg de liquide qui est ~, conduit vers l'écremage à chaud (etape B) et la coagulation.
' ~ - La separation de la caséine donne à partir de 1'145 kg de lait ecrémé emprésuré et acidifié 991 kg de sérum et 154 kg de caséine. Une ligne parallèle permet d'extraire la fraction de protéines contenant les Ig du caillé à l'eau.
Le caillé est stocké à la sortie de la clarifieuse-autodé-bourbeuse dans un réservoir muni d'un brasseur et brassé
avec 300 kg d'eau tiède à 40~C pendant 30 minutes et dirigée vers un moulin colloidal. La suspension de caillé broye est - ' àlors séparée dans une clarifieuse-autodébourbeuse. On ré-cupère 154 kg de caseine lavee et 300 kg de liquide de lavage qu'on reunit au serum pour les operations ulterieures.
1291 kg de serum sont filtres et ultrafiltres conduisant a 2010 kg de permeats (I, II et III) et 216 kg de preconcentrat.
L'evaporation fournit 108 kg de concentrat qui donne 21,6 kg de produit sec par sechage. On gagne ainsi environ 14 % d'Ig par rapport au procede selon l'exemple 2.

1 kg de la poudre preparee selon l'exemple 2 ou 4, respectivement 2 kg de la poudre preparée selon l'exemple 3, est melange à 100 kg de poudre le lait de fason homogène et celle-ci est conditionnee sterilement pour fournir un produit contenant une dose prophylactique d'Ig, pour une alimentation isocalorique de 140 cal/kg/jour correspondant à 250 mg de con-centre Ig/kg/jour prepare selon les exemple 2 ou 4 respecti-vement à 500 mg de concentre Ig/kg/jour prepare selon l'exem-ple 3.

Differents tests in vitro et in vivo ont ete effectues avec le concentre proteique selon les exemples 2 ou 4 et de-signes ci-après par ~concentre Ig~ pour montrer :
- que les Ig lactiques ont une specificité anti-corps que 17 on trouve normalement chez les Ig humaines et que celle-ci est preservee au cours du processus de fabrication.
- que les Ig lactiques specifiques montrent une activite protectrice en in-terferant dans les mecanismes pa-thogènes des microorganismes enteropathogènes.
Hemagglutination passive Des globules rouges de mouton ont ete sensibilises avec un extrait a l'urée d'un serotype d'E.coli specifique.
Cet extrait a ete obtenu selon Brodhage (Brodhage H., (1961 J. Hyg., 1961, 148, 94). Les bacteries ont ete cultivees sur agar nutritif ~Difco)* a 37~C pendant 30 heures dans des * Marque de commerce ,, . . : . . . . . ., . . . . ~ . ,.,, , . . .. -flacons de Roux. On a recolte la culture par 10 ml de solu-tion saline temponnee au phosphate (8,8 g NaCl + 1,86 g Na2HPO4.2H2O + 0,43 g KH2PO4/1000 ml H2O) à pH 7,2- Apres addition de 10 g d'uree (Merk)* la suspension a ete laissée au repos pendant 90 heures à 37~C avec agitation lente. Apres centri~ugation le surnageant a eté totalement dialysé contre une solution saline tamponnée au phosphate à pH 7,2, dilué
jusqu'à un volume final de 50 ml avec solution saline tamponnee au phosphate à pH 7,2 et congele en petites portions à -20~C.
La sensibilisation des globules rouges de mou-ton avec cet antigène a été effectuée par une combinaison des méthodes selon Avrameas et coll. (Avrameas S., Taudou B., Chuilon S~, Immunochemistry, 1969, 6, 67) et selon Otto et coll. (Ot-to H., Takamiya H:, Vogt A., J. Immunol. Methods, 1973, 3, 137).
Les globules rouges de mouton ont eté prétraites avec le glu-taraldehyde (concentration finale globules rouges de mouton 5 ~ et 0,5 % de glutaraldehyde) puis laves et mis en suspen-sion à 20 % dans solution saline tamponnce au phosphate à pll 7,2 et mélangés avec le même volume d'extrait à l'urée. Apres 16 heures d'incubation a 20~C sous agita-tion douce, les glo-bules rouges de mouton sensibilises ont éte lavcs plusieurs - fois ct mis en suspension ~ 1 ~ pour usage immediat. Les globules rouges de mouton peuvent être stockes en suspension - a 10 % a 4~C pendant plusieurs semaines.
Avant filtration, chaque échantillon a examiner doit t être absorbé sur globule rouge de mouton prétraite au glutaral-dehyde (0,1 ml globule rouge de mouton sédimente pour 1 ml de concentré Ig, 37~C, 60 minutes).
Les titrations ont ete effectuees selon le syst~me Microtiter (Sever J.L., J. Immunol., 196~, 88, 320 et Conrath ' -~
T.B., Handbook of ~icrotiter Procedures, 1972) en utilisant des plaques de polystyrène avec cavites en forme de V. On a effectué use série de dilutions de 50~1 chacune __ _ _ * Marqjue d~ col~lerce - 14 -l333 dans le sérum normal de lapin dilué ~ l/200 et on a ajouké
25~1 de globule rouge de mouton sensibilisé à l ~ a chaque dilution. Une serie a ete pr~parée avec des globules rouges de mouton non sensibilisés comme contrôle d'agglutination non spécifique. On a lu les résultats après deux heures, le titre d'hémagglutination étant donné par la dernière dilution conduisant à une réaction positive nette.
Les résultats obtenus pour 5 serot~vpes d'E.coli sont donnes dans le tableau ci-dessous :
Serotype E.colititre en agglutinines 0 55 l/256 0 lll l/ 64 -0 ll9 l/128 0 12~ l/ 64 contrôle -Activite bacteriostatique in vitro On a etudie l'activite bactériostatique sur la croissance de differents serotypes E.coli par addition de concentre Ig au milieu de culture. On a utilise le système Microtiter adapte pour la culture, permettant ainsi d'uti-liser des quantites minimales d'echantillon à tester et d'examiner simultanement un nombre maximum d'echantillons.
Chaque culture avait un volume final de 0,25 ml 2S soit dans un milieu minimal contenant l % de glucose, soit dans un milieu de culture riche. Pour chaque valeur du temps d'incubation etudiee on a effectue deux prises d'echan-tillons pour diminuer les risques d'erreurs dues à des variations de volume. L'évaluation a ete faite par double comptage d'aliquots de 10~1 sur plaques d'agar nutritif.
:
~L~0~333 L'inoculum bacterien consistait en une dilution d'une culture de 16 heures en milieu minimal contenant 1 à 2 x 103 bacteries/
ml. L'incubation a ete effectuee en atmosphère humide à 37~C.
Le concentre Ig aux concentrations finales de l~g/ml, 10~g/ml, 100~g/ml et 1 mg/ml a ete ajoute au milieu de culture avant inoculation avec 2 x 10 E.coli/ml. On a constate une nette inhibition de la croissance de E.coli 0 111: B4 pendant les 4 premièresheuresd'incubation a la concentration de concentre Ig de 10~g/ml. Par comparaison au contrôle constitue par le milieu de culture seul, on a observe une croissance superieure ;
en presence de l mg/ml de proteines de petit-lait normales obtenues à partir de vaches non immunisees.
Clearance de E.coli 0 111:B4 chez la souris Pour chaque test on a utilise 8 souris (souris blanches mâles suisses, de 20 à 24 g), 2 comme contrôle et 6 pour 3 tests effectues chacun deux fois. Toutes les souris ont reçu une injection sous-cutanee de 0,1 ml d'heparine (500 UI/ml). Un bouillon de culture de 16 heures de E.coli 0 lll:B4a ete dilue au 1/10 avec une solution saline sterile ' puis dilue au 1/100 par addition de serum de veau foetal (Difco)* dilue au 1/10 pour les contrôles et contenant 3 con-centrations choisies de concen-tre Ig. On a injecte par voie intraveineuse 0,2 ml de la solution obtenue dans la veine ~-caudale, chaque souris (2 souris pour le contrôle et 2 x 3 pour les tests) recevant environ 2 x 106 bacteries, la sus-pension bacterienne d'origine contenant 109 bacteries/ml.
Immediatement après l'injection (au temps t0), et après 20, 40 et 60 minutes, on a effectue une ponction sanguine de 50~1 à partir du plexus velneux ophtalmique, au moyen de tubes capillairescalibres heparinisés, et on a transfére immediate-ment les echantillons dans 5 ml de solution saline sterile (dilution sanguine 10 ) qu'on a ensuite dilue à 10 3 et 10 4 * Marque de cor~merce. - 16 -en solution saline. On a e~fectue le comptage sur plaques d'agar (Difco~* avec 1 ml de chaque dilution et determiné
l'indice de phagocytose K selon Biozzi et coll. (Biozzi G., Stiffel C., ~Ialpern B.N., Le Minor L., Mauton D., J. Immunol., 1961, ~7, 296) :
K = 1 2 Cl et C2 correspondent aux comptages aux temps Tl et T2.
On a ainsi observe une diminution normale du nombre 1 des bacteries par elimination dans le système reticulo-endo-thelial en presence de serum de veau foetal, tandis que l'addition de 10~g de concentre Ig à la solution d'injection a provoque la disparition de 99,6 ~ des bacteries du flot sanguin en 20 minutes.
Les resultats sont resumes dans le tableau ci-dessous:
temps bacteries en ~ du nombre initial au (minutes après temps 0 après injection intravei-l'injection E.coli) neuse de 2 x 106 E.coli 0 lll B4 r Contrôle 1:10 Tests, concentre Ig serum foetal de veau 1000~g 100~g 10~g 27,8 0,14 0,22 0,4 - 40 15,5 0,02 0,02 0,12 10,0 0,02 0,02 0,06 On a contrôle la specificite de l'opsonisation par absorption exhaustive de concentre Ig avec le serotype 0 lll:s4 d'E.coli et on a constate que cette absorption anihile prati-quement toute l'activite d'augmentation de la phagocytose ; même avec une quantite de 1 mg de concentré Ig.
Le tableau ci-apres donne les indices de phagocytose K obtenus en 20 minutes :
Contrôle 1000 g 1000 g 1:10 serum de concentre Ig concentre Ig veau foetal non-absorbe absorbe K 0,015 0,128 0,039 * ~arque de commerce.

:

,i Test de protection chez la souris . On a préparé des dilutions logarithmiques ~logl0) d'une culture de E.coli 0 ~ B4 en bouillon nutriti~ IDifco)*
contenant 109 bacteries/ml pour donner les dilutions à l0 4 .10 5, 10 6 et 10 7 dans la mucine à 5% (mucine granulaire, type 1701-W pour la potentiation de la virulence des bactéries de Wilson Laboratoires, Chicago, Illinois1.
On a ensuite mélangé 3 ml de chaquP dilution ~ 0,6 ml de solution ~ tester, soit respectivement de solution saline, .de concentré Ig, de protéines de petit-lait normal (vaches non immunisees). En utilisant 5 souris pour chaque dilution, on a injecté 0,6 ml du mélange obtenu à chaque souris par voie intrapéritonéale. Les résultats de l'évaluation du nombre de souris mortes sur 5 souris traitées apr~s 48 heures sont indiqués dans le tableau ci-après ~ ~~~-~~-~~~~~
_ . , . . , . _ . .
g ~ 1333 .
Matériau teste Nombre de souris mortes /
5 souris traitées Concentration en bacteries du traitement S x 104 5 x 103 5 x 1025 x l0 solution saline 5 5 5 5 ' 10 concentré Ig * 5 5 5 3 i 25~ -concentré Ig * 5 4 0 0 ~ .
, 10 lOO,u concentré Ig * 0 0 0 0 l O ,u -' protéines de petit-lait nornal , , .. -, ~vaches non-immunisées) 5 5 5 5 '~ 25~
proteines de petit-lait '. norm~l 5 lOO ,u . 20 ~roteines de petit-lait normal 5 5 5 5 .:.
* calcule en protéines totales contenant 35-45 ~ d'Ig lactiques.
;~ On a constaté que 100 ~g de concentré Ig conferaient ~l~ une protection totale pour toutes les concentrations en bacté- -25: ries testées tandis que 100 ~g de protéines de petit-lait iso-lees à partir du lait de vaches non-immunisees ne donnaient : : aucune protecti~n.
1 ' E x e m p l e 7 I / Une première série d'essais cliniques montrent que les Ig lactiques resistent à la degradation proteolytique en fragments inactifs dans le tractus intestinal.
' - 20 ~ 333 11 enfants (9 ~ar~ons, 2 filles) hospitalisés pour diverses raisons mais ne souffrant p.lS de gastro entérites et dont l'âge allait de 2 semaines à 1 an ont été nourris avec un lait contenant un concentré Ig préparé selon l'exem-ple 2 ou 4 en dose isocalorique correspondant à 2 g/kg de poids corporel distribuée également sur 24 heures. Les pre-mier et dernier repas avec incorporation de concentre Ig ont été marqués par 0,2 g de rouge carmin. On a recueilli au moins une selle avant l'administration de concentré Ig et systématiquement toutes les selles suivantes pendant 72 heures, les sellcsétant conservées à -20~C.
On a prépare des extraits de selles par addition de deux parties de selle pour une partie de solution saline tamponnée au phosphate à pH 7,2 et dispersé les selles à 0~C
lS avec une tige de verre. On a ensuite agité la suspension ! pendant 20 minutes avec mini-agitateur (400 tours/minute) à temperature ambiante. La suspension a alors eté refroidie -~
rapidement à 0~C et centrifugée à cette temperature à
3500 x g pendant lS minutes. On a ensuite soigneusement pr~levé les surnageants.
La présence d'Ig actives dans les extraits de selles a été confirmée par double immunodiffusion (test d'Ouchterlony) et par immunoélectrophorèse. Les antisera ;
utilisés dans ces tests ont été prépares par injections souscutanées et intraveineuses répétées de 1 mg d'anticorps lactiquQs ou O,l mg d'Ig GL che2 le lapir.. Poul le test d'Ouchterlo~y, des plaques de verre (94 x 84 mm) ont été recouvertes d'une . . .
couche de 1 ~ de gel d'agar dans une solution saline tampon- ;~
$ nee au phosphate à pH 7,2, dans laquelle on a creusé des ! 30 cavites de 4 mm distantes de 9,5 mm à l'emporte-pi~ice ~LKB~Producteur AB), en utilisant un antisérum anti-protéines de petit-lait colostral bovin et un antisérum monovalent spécifique anti-IgGl de lait de vache.
,, .~

, Pour l'immunoelectrophorèse, des plaques de verre (100 x 85 mm) ont ete recouvertes de 12 ml de gel d'agar 1 % dans le barbiturate 0,05 M tamponne à pH 8,3 (10,3 g barbiturate de sodium + 0,5 g acide citrique + 0,5 g acide oxalique pour 1 1 d'eau) et la separation par electrophor8se conduite à temperature ambiante pendant 90 minutes à 4 volts/
cm. Après di~fusion des antisera (24 heures), les plaques ont ete lavees avec la solution saline, sechees et revelees avec ,~
l'azocarmine s.
10On a constate la presence d'Ig lactiques dans les selles malgre des variations considerables du moment de leur apparition et de la duree de la secretion Ig ainsi qu'une . . bonne correspondance entre l'apparation et la disparition du marqueur rouge carmin et des Ig.
Pour confirmer l'acitivite de ces Ig lactiques, on a effectue le test in vivo de sero-protection chez la souris (comme decrit à l'exemple 6), en utilisant 6 extraits de selles dans chaque serie et dont les resultats sont resumes dans le ~;
tableau suivant : ~:
Intensite des Ig Nombre de souris mortes/
dans l'extrait 5 souris traitees Extraits de de selles après selles examen immuno-Nombre de bacteries utilisëes ~::
electrophoreti- . dans le traitement . :
que. 5x104 5x103 5X1025X10 Enfant M.D~ I 5 5 5 5 ~ :
(2 semaines) IV~ + + + 2 1 0 0 :
V+ + + + O O O O ~ ' VI+ + + 1 1 0 0 Enfant S.G.
(1 mois) I 5 5 5 5 ~ ' . III 4 5 5 5 . ~
~ - 21 3;3 Extraits de Intensité des Ig Nombre de souris mortes/
selles dans l'extrait 5 souris traitees de selles apres -~
. examen immuno- Nombre de bacteries utilisees electrophoreti- dans le traitement que 5x104 5x103 5X102 . 5xlOl En~ant S.G. IV + + + ~ 0 - 0 0 0 c ) VI + + + + 0 0 0 0 X + ~ 3 0 1 0 XI + 5 2 0 :0 .-' ~
!. ~
: .
.~ , , .
~ ~ - ' ' .
., .
' ' - ' ,~ On constate clairement une correlation entrè les résultats positifs en immunoélectrophorèse et la capacité
f protectrice de la mati~re contenue dans les extraits de selles. En particulier, on estime que les concentrations en Ig lactiques des extraits V (enfant M.D.) et IV et VI
(enfant S.G.) correspondaient au moins à 1 mg de concentré
Ig.
II / Dans une seconde série d'essais cliniques, on a étudié les propriétés thérapeutiques et prophylacti ques du concentré I~ préparé selon l'exemple 2 ou 4.
Proprietés thérapeuti~ues On a effectué cette étude avec des enfants allant jusqu'~ 5 mois souffrant de gastro-entérites de bénignes à
aiguës provoquées par E.coli. Dans di~férentes séries de tests on a administré à un total de 152 patients soit 2 g de concentré Ig/kg/jour pendant 5 jours, soit 1 ~/kg/jour pendant 10 jours dans leur nourriture. Les patients n'ont recu aucun médicament tel que sulfamides ou antibiotiques, ni oralement ni parentéralement. On a fait des coprocultures chaque lendemain d'une administration, la derniere entre 36 et 48 heures après la dernière administration de concen-tre Ig. 43 patients ont été traités de la même manière mais en remplaçant le concentré Ig par des protéines de petit-lait provenant de vaches non-immunisées.
On a obtenu des coprocultures négatives pour 90 enfants (57,7 %) au cours du traitement. Dans la série contrôle, seulement 14 enfants (27,7 %) ont montré une dis-parition spontanée de E.coli dans les coprocultures. II faut tenir compte du fait que les protéines natives de petit-lait provenant de vaches non-immunisées contiennent une faible quantité d'Ig anti-E.coli. On a également constaté que l'absence de réussite du traitement a éte observée plus fréquemment dans les cas ayant rec,u la plus haute dose pen-dant un temps plus court.

3;~
La consistance des selles a été ex,~min~e dans chaque cas. On a constaté une disparition de la diarrhée et une amélioration clinique sensible dans un grand no~re de cas et meme lorsque les coprocultures sont restées positives. Dans les cas où les coprocultures sont devenues n~gatives, la consistance des selles s'est améllorée plu5 ~ rapidement lorsque le concentré Ig a été administré dans s une formule lactée pauvre en lactose.
,, Pr ~ lactiques Les prématurés représentant un groupe extrêmement sensible aux gastro-entérites par E.coli, c'est ce groupe qui a été choisi pour les essais cliniques de prophylaxie.
Cette etude a ete effectuee pendant 6 mois dans 2 salles avec 8 incubateurs dans chaque salle. On a procédé
à la répartiiion des tests et des contrôles dans chaque salle pour que tous les patients soient exposés aux mêmes conditions, 4 incubateurs servant au test et 4 au contrôle. ~' Chaque cas est resté en moyenne 41 jours, un enfant étant eloigné apres guerison et remplace par un autre quelque soit son appartenance (test ou contrôle). 70 cas ont ete suivis, 36 comme contrôle et 34 pour le groupe test.
Le groupe test a rec,u le concentre Ig à chaque tetee reparti sur 24 heures ~ raison de 0,25 g/kg/jour.
On a procédé à une coproculture dès le commencement de l'essai et examiné les coprocultures tous les 5 jours. Sur un total de 666 coprocultures, 339 appartenaient au con-trôle et 327 au test. Parmi ces denières, 33 ont montré
la présence d'E.coli (10,1 %) tandis que 96 des 339 cultures de contrôle ont éte positives (28,3 %). Si on examine seulement le sérotype E.coli 0 ll9:B14 qu'on trouve souvent associe à des formes aiguës de gastro-entérite, la fréquence ;
des coprocultures positives a ~t~ 5,5 ~ dans le groupe test contre 23,3 % dans le groupe contrôle.
::'' ..... . . .... .. .. . .
3;~

On peut conclure que l'incorporation de concentré ..
protéique contenant des Ig lactic~ues specificlues anti-E.coli ' au lait pour prématurés diminue nettement le degré d'infec-:~ tion par E.coli de cce groupe particuli~rement sensible de . nouveaux-nés.
, ~ ,, , , :
,1 :
i' ,-.. ~ ,-.
. . .
''"' ' ~'' - ''- '''''' ' ~ .
'.~
_,-.
.

Claims

- 25 -REVENDICATIONS

1. Procédé de fabrication d'un concentré protéique contenant des facteurs immunologiques d'origine lactique, notamment des immunoglobulines actives non-dénaturées, carac-térisé par les étapes suivantes :
on recueille le lait de femelles laitières hyperimmunisées, on sépare la crème et les impuretés, on coagule le lait clarifié et écrémé, on sépare la caséine, on filtre, ultrafiltre et stérilise les protéines du petit-lait par filtration, on évapore et on sèche le produit dans des conditions ne dénaturant pas les immunoglobulines et conservant la stérilité.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le lait traité est du lait de vaches hyperimmunisées par vaccination et se compose - du colostrum des 1 et 2 jours après vêlage, - du lait de transition des 3 à 8 jours après vêlage - et du lait de lactation finale des derniers 60 jours de la lactation.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérise en ce que le schéma de vaccination comprend pour le lait colostral et de transition une série d'administrations suc-cessives d'antigènes par voie parentérale et locale d'environ la 8ème à la 2ème semaine avant vêlage et par voie orale pendant environ les 2 semaines avant vêlage et,pour le lait de fin de lactation,une série d'administrations successives d'anti-gène à partir d'environ 2 mois 1/2 avant le tarissement pré-sumé de la sécrétion lactée avec alternance de la voie parentérale,locale et de la voie orale.

4 Procédé selon la revendication 3, caractérisé
en ce que le vaccin est à base d'antigènes d'Escherichia coli responsables de gastro-entérites néonatales.

Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la coagulation s'effectue par addition d'acide chlorhydrique jusqu'à pH d'environ 4,6 et chauffage jusqu'à 40°C.

6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que, pour éviter une obturation subséquente des filtres et ultrafiltres, l'opération d'écrémage s'effectue en deux étapes d'abord à froid et ensuite à chaud et que l'écrémage et la séparation de la caséine s'accompagnent de débourbages poussés.

7. Procédé selon la revendication l, caractérisé
en ce que l'ultrafiltration du petit-lait s'effectue en 3 étapes, ultrafiltration propre, diafiltration et précon-centration.

8. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé
en ce que le petit-lait préconcentré subit une préfiltra-tion suivie d'une filtration stérile.

9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que l'évaporation du petit-lait préconcentré et sté-rilisé a lieu en circuit ferme dans des conditions stériles.

10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que le produit concentré est séché par congélation suivie d'une lyophilisation et conditionne stérilement.

11. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que, en vue de récupérer les immunoglobulines élimi-nées lors des opérations d'écrémage et de séparation de la caséine, la crème et le caillé sont extraits à l'eau et les eaux de lavage réunies respectivement au lait écrémé et au petit-lait.

12. Produit riche en immunoglobulines actives non-dénaturées obtenu par la mise en oeuvre du procédé
selon la revendication 1, 2 ou 3.