CH627079A5 - Process for preparing a protein concentrate containing immunological factors of milk origin - Google Patents
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Description
La présente invention concerne un procédé de fabrication d'un concentré protéique contenant des facteurs immunologiques d'origine lactique, notamment des immunoglobulines actives.
On a déjà proposé d'introduire des facteurs immunologiques d'origine lactique dans des produits diététiques pour nouveau-nés et nourrissons par incorporation au lait de ces facteurs, l'ingestion orale
2
de ces produits devant permettre le transfert dans le sang du nourrisson de ces facteurs, sans toutefois indiquer les modalités ni les résultats d'une telle immunisation passive généralisée.
On a également proposé d'isoler des lactoglobulines immunes à 5 partir de lait de vaches vaccinées, par coagulation du lait, récupération du lactosérum et précipitation sélective des lactoglobulines par le sulfate d'ammonium suivie de dialyse contre l'eau pure, filtration et séchage. Des tests de séroprotection chez la souris en liaison avec ces travaux ont montré que l'injection parentérale de ces principes io immunisants procurait une protection passive généralisée contre certaines bactéries et virus entéropathogènes, lorsque ces parasites étaient injectés aux animaux par la même voie.
On a maintenant trouvé une méthode de fabrication, à l'échelle industrielle, d'un concentré protéique contenant des immunoglobuli-15 nés sans dénaturation de celles-ci au cours du processus technologique. Ce produit procure une immunisation passive locale au niveau de la paroi intestinale sans résorption et sans destruction notable de son activité dans le tractus.
Le procédé selon l'invention est caractérisé par les étapes 20 suivantes:
On hyperimmunise des femelles laitières en les vaccinant avec un antigène d'origine virale ou bactérienne, on recueille leur lait contenant les anticorps qu'elles ont produits, on sépare la crème et les impuretés, on coagule le lait clarifié et écrémé, on sépare la 25 caséine, on filtre, ultrafiltre et stérilise les protéines du petit-lait par filtration, on évapore et on sèche le produit dans des conditions ne dénaturant pas les immunoglobulines et conservant la stérilité.
Le dessin annexé est une représentation schématique des différentes étapes du procédé.
30 Les femelles laitières utilisées sont des bovidés, en particulier des vaches.
Le lait à traiter peut être de différents types plus ou moins riches en anticorps: Colostrum, lait de transition (lait des 8 jours suivant le vêlage) ou lait de fin de lactation (des 2 derniers mois de sécrétion 35 lactée).
On préfère traiter un mélange de ces laits pour obtenir un taux d'anticorps élevé pendant la période la plus longue possible.
L'hyperimmunisation de la vache s'effectue par vaccination ou injection. Par exemple par injection dans la glande mammaire, 40 parentérale (sous-cutanée, intraveineuse), dans le système ganglionnaire rétromammaire, par scarification, par ingestion orale ou par combinaison de plusieurs de ces modes.
On préfère utiliser une combinaison de ces modes suivant un schéma d'immunisation soigneusement établi afin d'obtenir un titre 45 d'anticorps satisfaisant dans chaque type de lait utilisé. Ainsi, pour le Colostrum et le lait de transition, la vaccination est parentérale dans les 8-2 semaines avant le vêlage et orale pendant la semaine précédant le vêlage.
Pour le lait de fin de lactation, on procède à une alternance de so vaccination parentérale et orale à partir de 2 Vi mois avant le tarissement présumé de la sécrétion lactée.
Le vaccin utilisé est avantageusement un mélange de l'antigène choisi et d'un adjuvant à base de sérum sanguin homologue de celui de vaches immunisées, permettant ainsi une détoxication du vaccin. 55 La vache servant comme animal de production, les Ig contenues dans le concentré protéique sont principalement des IgG (spécialement des IgGi), à la différence du lait maternel qui contient des IgA.
Le titre en Ig dans le concentré protéique dans lequel les protéines représentent 70 à 80% en poids est de 25 à 35% en poids. Certains 60 avantages sont liés au fait que, dans la mise en œuvre du procédé, les Ig ne sont pas séparées des autres protéines du lactosérum, lesquelles sont donc également présentes dans le concentré obtenu. On évite ainsi les opérations de précipitation sélective par le sulfate d'ammonium et dialyse.
65 De plus, certains facteurs bactériostatiques ou antiviraux, par exemple la lactoferrine ou les systèmes enzymatiques tels que lactoperoxydase, ribonucléase qui sont présents dans le lactosérum se retrouvent dans lé concentré protéique.
3
627079
Toutes sortes d'antigènes d'origine virale ou bactérienne peuvent être utilisés et les anticorps obtenus sont fonction de la nature des antigènes administrés à la vache. On peut, par exemple, obtenir une protection contre les bactéries et virus entéropathogènes responsables de gastro-entérites accompagnées de fortes diarrhées avec déshydratation, par incorporation du concentré protéique contenant les Ig dans tout support convenant à une administration orale. Ce support peut être un excipient quelconque ou de préférence un produit diététique tel qu'un lait ou une farine lactée pour petit enfant, un lait dit humanisé ou adapté pour nourrisson, un lait spécialement adapté à un groupe particulier de nouveau-nés, comme par exemple un lait pour prématuré ou enfant de faible poids de naissance, etc.
Si on veut utiliser par exemple un concentré contenant des Ig anti-.E. coli en dose prophylactique avec un lait comme support, on incorporera de 0,8 à 3 g de concentré à 100 g de matière sèche et jusqu'à 6 g en dose thérapeutique.
Pour mettre en œuvre le procédé, il est nécessaire de veiller à ce que les opérations d'écrémage et de clarification soient très poussées pour éviter une obturation subséquente des filtres et ultrafiltres.
La coagulation se fait avantageusement au pH isoélectrique de la caséine sans chauffage, de préférence en présence de présure.
Ainsi, l'écrémage s'effectue de préférence en deux étapes, d'abord à froid pour éliminer la majeure partie des matières grasses et des impuretés (comme par exemple le sang souvent contenu dans le Colostrum), et ensuite à chaud pour séparer complètement celles-ci. De même, la séparation de la caséine s'accompagne d'un débourbage du sérum permettant de séparer les fines.
D'autre part, il est essentiel de conduire les opérations nécessitant un traitement thermique (évaporation et séchage) dans des conditions ménagées pour éviter d'inactiver les Ig.
Pour diminuer les pertes en Ig, dont une partie est éliminée dans l'écrémage avec la crème et une autre avec la caséine lors de la séparation de celle-ci, il est indiqué d'extraire à l'eau et la crème et le caillé, et de traiter les eaux de lavage contenant les Ig pour les récupérer.
Les exemples suivants, dans lesquels les quantités et proportions sont en poids sauf indication contraire, illustrent la façon dont l'invention peut être mise en œuvre.
Exemple 1:
5 Des vaches de différentes races ont été hyperimmunisées suivant le schéma ci-dessous avec un vaccin dont la préparation est indiquée ci-après, et on a recueilli le lait des 2 derniers mois de sécrétion lactée et des 8 premiers jours après vêlage.
]0 Préparation du vaccin
On a utilisé les sérotypes E. coli entéropathogènes suivants:
20
0
18
K76
(B20)
0
111
K58
(B4)
0
20
K17
(L)
0
112
K68
(B 11)
0
26
K60
(B6)
0
119
K69
(B 14)
0
44
K74
(L)
0
124
K72
(B 17)
0
55
K59
(B 5)
0
125
K70
(B 15)
0
78
K.80
(-)
0
126
K71
(B 16)
0
86
K61
(B 7)
0
127
K63
(BS)
0
128
K68
(B 12)
Les différentes souches provenaient de cas de gastro-entérites chez des enfants hospitalisés. Le sérotypage a été fait avec des antisérums multi- et monovalents (Difco). Les bactéries ont été 25 cultivées en milieu liquide minimal contenant 2% d'acides casaminés (Difco) et 2% de glucose pendant 24 h à + 37° C sans agitation des flacons. Pour inactiver les germes, on a séparé les cultures par centrifugation entre cellules sédimentées et surnageant. Les cellules ont été remises en suspension et incubées à -I- 37°C pendant 24 h en 30 présence de 0,5% de formaldéhyde, cependant que le surnageant a été inactivé comme indiqué ci-dessus, mais avec 0,05% de formaldéhyde. Après ime nouvelle centrifugation et élimination du surnageant, les bactéries ont été remises en suspension dans le surnageant inactivé d'origine. Cette procédure permet de conserver le 35 surnageant contenant des exotoxines bactériennes pour le vaccin. On a obtenu un vaccin à 1-2 x 10® bactéries/ml, qu'on a ensuite dilué par mélange avec une solution à 2% d'Al(OH)3 et du sérum sanguin homologue de celui de vaches immunisées.
Procédure d'immunisation
A. Schéma d'immunisation pour l'obtention de lait colostral et de transition contenant des Ig anti-£. coli
Jour de vêlage présumé = X
Moment du traitement
Vaccin + adjuvant éventuel
Mode d'administration
X — 8 semaines
5 ml vaccin (5 x 107 bactéries/ml) + 5 ml sérum*
injection sous-cutanée
X — 7 semaines
5 ml vaccin (5 x 107 bactéries/ml) + 5 ml 2% AI(OH)3 + 5 ml sérum*
injection intraveineuse
X — 6 semaines
10 ml vaccin (5 x 107 bactéries/ml)
injection sous-cutanée
X — 5 Vi semaines
20 ml vaccin (5 x 107 bactéries/ml) + 10 ml 2% Al(OH)3
injection dans le système ganglionnaire rétromammaire
X — 5 semaines
40 ml vaccin (5 x 107 bactéries/ml) + 20 ml sérum instillation de 4 x 15 ml dans le pis par les canaux des trayons
X — 4'A semaines
24 ml vaccin (5 x 108 bactéries/ml) + 8 ml sérum*
injection sous-cutanée**
X — 4 semaines
40 ml vaccin (5 x 107 bactéries/ml) + 20 ml sérum instillation de 4 x 15 ml dans le pis par les canaux des trayons
X — 3 semaines
10 ml vaccin (5 x 108 bactéries/ml)
injection sous-cutanée
X — 2 semaines
5 ml vaccin (5 x 10® bactéries/ml) + 5 ml 2% Al(OH)3
injection intraveineuse
X — 1 semaine
100 ml vaccin
(1 x 109 bactéries/ml)
ingestion orale pendant le ruminement
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4
Jour de vêlage présumé = X
Moment du traitement
Vaccin + adjuvant éventuel
Mode d'administration
X — Zi semaine
100 ml vaccin
(1 x 109 bactéries/ml)
ingestion orale pendant le ruminement
* Ces additions de sérum sont faites uniquement dans le cas où une vache est immunisée pour la première fois.
** Cette injection sous-cutanée est répartie dans le système lymphatique comme suit:
2 x 4 ml dans les ganglions lymphatiques préscapulaires 2 x 4 ml dans les ganglions lymphatiques postscapulaires
Exemple 2:
Le lait recueilli à partir de vaches vaccinées selon l'exemple 1 a été traité comme suit:
— l'écrémage s'effectue en deux étapes: étape A à froid, et étape B à chaud.
A) 1100 kg de lait passent à froid dans une écrémeuse centrifuge et sont dirigés vers une cuve tampon de 25001, puis pompés dans une débourbeuse centrifuge à accélérations élevées (environ 11000 g) afin d'éliminer sang et impuretés (boues).
B) Le lait débourbé froid est stocké dans un réservoir de 25001 et pompé à travers un réchauffeur tempéré à 40°C dans l'écrémeuse centrifuge qui a déjà servi précédemment, séparant ainsi 110 kg de crème qu'on récupère et 5 kg de boues qui sont détruites. En variante, on peut utiliser une écrémeuse autodébourbeuse dans les opérations d'écrémage à froid et à chaud, et une débourbeuse entre ces opérations, réduisant ainsi la durée de l'écrémage.
— On procède alors à la filtration, suivie de l'ultrafiltration du sérum. La filtration doit être très soignée, afin d'éliminer toute difficulté à l'ultrafiltration, en séparant les particules très fines de caséine. Elle s'opère par filtre Seitz KOth7 à 7 plaques d'amiante de 20 x 20 cm. Le filtrat est stocké dans un réservoir de 30001 puis pompé vers l'ultrafiltre. L'ultrafiltration s'opère en 2 ou 3 étapes avec recyclage du rétentat dans le réservoir. Deux pompes centrifuges en série fournissent le débit contre une pression d'entrée d'environ
7 bars dans le compartiment d'entrée de l'ultrafiltre, à la sortie duquel la pression est maintenue à environ 4,5 bars. Pour éviter le réchauffement du rétentat par l'énergie fournie aux pompes, celui-ci est refroidi à environ 10-12°C.
io 2 x 4 ml dans les ganglions lymphatiques inguinals 2 x 4 ml dans les ganglions lymphatiques poplités B. Schéma d'immunisation pour l'obtention de lait de fin de lactation (2 derniers mois de lactation) contenant des Ig anti-if. coli. Cette immunisation s'applique uniquement aux vaches ayant déjà 15 été immunisées pour la période colostrale et de transition.
La première étape ou ultrafïltration propre permet de séparer les solutés à haut poids moléculaire, les protéines, retenues sur la membrane (qui se trouvent dans le rétentat), tandis qu'une partie du lactose, des vitamines, des sels minéraux et de l'eau sont évacués dans 45 le perméat, En utilisant un module DDS avec membrane 800 (surface membrane = 7 m2), le rapport rétentat/perméat étant d'environ 1 à 3,1, on obtient 580 kg de perméat I et 274,7 kg de rétentat avec un débit moyen de 14,17 kgperméat/m2 h.
La seconde étape est une diafiltration, au cours de laquelle on ajoute continuellement au rétentat 825 kg d'eau, et on fait circuler la solution dans les mêmes conditions que dans la première étape. La diafiltration est arrêtée lorsque la conductibilité électrique du perméat atteint la valeur désirée, le rapport rétentat/eau ajoutée étant d'environ 1 à 3. On sépare ainsi 825 kg de perméat II et 274,7 kg de 55 rétentat avec un débit moyen de 11,77 kg perméat/m2 h.
La troisième est une concentration qu'on opère facultativement par recyclage du rétentat sur la membrane jusqu'à un taux de matières sèches d'environ 10%, par élimination de 82,5 kg de perméat III. On obtient ainsi 192,2 kg de solution préconcentrée. En 60 variante, on supprime cette troisième étape et on procède directement à la filtration stérile.
La filtration stérile représente une étape importante dans l'ensemble du procédé, les traitements thermiques n'étant pas applicables pour la stérilisation, car ils conduisent à une dénaturation des Ig. La 65 filtration stérile débarrasse le rétentat des micro-organismes qui pourraient encore s'y trouver (la majeure partie de ceux-ci ont déjà été éliminés lors de la séparation de la crème, de la caséine et des boues). Afin d'éviter le blocage des filtres stérilisants, un dêbourbage
Jour présumé de tarissement de la sécrétion lactée = X
Moment du traitement
Vaccin + adjuvant éventuel
Mode d'administration
X — 70 jours
5 ml vaccin (5 x 107 bactéries/ml)
injection intraveineuse
+ 5 ml 2% Al(OH)3
X — 65 jours
20 ml vaccin (5 x 108 bactéries/ml)
injection dans le système ganglionnaire
rétromammaire
X — 60 jours
24 ml vaccin (5 x 108 bactéries/ml)
injection sous-cutanée**
(comme ci-dessus, sous A)
X — 55 jours
100 ml vaccin (1 x 109 bactéries/ml)
ingestion orale pendant ruminement
X — 50 jours
40 ml vaccin (5 x 107 bactéries/ml)
instillation dans le pis
+ 20 ml sérum
(comme ci-dessus, sous A)
X — 40 jours
100 ml vaccin (1 x 109 bactéries/ml)
ingestion orale pendant ruminement
X — 30 jours
20 ml vaccin (5 x 108 bactéries/ml)
injection dans le système ganglionnaire
rétromammaire
X — 25 jours
40 ml vaccin (5 x 107 bactéries/ml)
instillation dans le pis
+ 20 ml sérum
(comme ci-dessus, sous A)
X — lOjoiirs
100 ml vaccin (1 x 109 bactéries/ml)
ingestion orale pendant ruminement
50
5
627079
par centrifugation et une triple filtration du rétentat sont nécessaires. Après débourbage, le rétentat est stocké dans un réservoir et passé par une ligne de filtration comprenant une préfiltration sur trois filtres Seitz KOth7, EK, EKS montés en série, puis filtration stérile sur filtres Seitz Supra 20 et Millipore HA 0,45p., montés en série et préalablement stérilisés à l'eau surchauffée. Le rétentat stérile est stocké dans un réservoir stérile de 5001.
Toutes les opérations ultérieures se feront sous conditions stériles. A l'aide d'azote comprimé et filtré stérile, par exemple, on peut transférer à l'opération suivante d'évaporation.
L'évaporation est effectuée avec un évaporateur à couche mince (à flot tombant de surface 1 m2) à température de chauffage de 75°C, celle du produit étant d'environ 30°C, jusqu'à un taux de matières sèches d'au moins 20%. Pour éviter toute infection, le transfert se fait par pompe péristaltique du réservoir de rétentat au réservoir de concentrât, lequel est relié à une boucle comprenant l'évaporateur, l'opération de concentration se faisant en circuit fermé. Cette opération n'affecte pas l'activité des Ig.
— On procède alors au séchage du concentrât (96 kg) par tout moyen convenable, par exemple par congélation suivie d'une lyophilisation. La congélation peut s'effectuer sur plateaux à —40°C. Les Ig peuvent être stockées à — 30° C sans perte d'activité pendant environ 45 j. Le produit à — 30°C est lyophilisé dans des plateaux dans une enceinte à 0,5 torr, avec une température du condenseur de —50°C et granulés chauffés à 30-35°C. Le mode de séchage n'affecte pas l'activité des Ig. On obtient ainsi 19,1 kg de produit sec contenant 25-35% d'Ig que l'on conditionne stérilement.
La composition moyenne du concentré protéique obtenu est
Protéines
75 ± 5%
30 ± 5%
immunoglobulines
15 ± 5%
a-lactalbumines
35 ± 5%"
ß-lactoglobulines
5 + 2%
sérum albumines
5 ± 2%
autres protéines mineures
4 ± 0,5%
humidité résiduelle
10 ± 2%
lactose
5 ± 2%
sels minéraux
5 ± 2%
substances azotées non protéiques
Exemple 3:
On procède comme à l'exemple 2, à la différence que la crème et la caséine sont extraites à l'eau pour récupérer une partie des Ig perdues, les eaux de lavage étant recyclées dans la ligne de fabrication.
— L'écrémage à froid (étape A) s'effectue avec une ligne parallèle d'extraction à l'eau de la fraction de protéines contenant les Ig entraînée avec la crème. La crème provenant de la première centrifugation (115 kg) est stockée dans un réservoir de 10001 avec brasseur et mélangée à 150 kg d'eau tiède à 40° C, le tout brassé pendant 30 min et centrifugé dans une écrémeuse. On sépare ainsi
115 kg de crème et 150 kg de solution qui est réunie au lait écrémé et débourbé. On obtient ainsi 1130 kg de liquide qui est conduit vers l'écrémage à chaud (étape B) et la coagulation.
— La séparation de la caséine donne, à partir de 114,5 kg de lait écrémé emprésuré et acidifié, 991 kg de sérum et 154 kg de caséine. Une ligne parallèle permet d'extraire la fraction de protéines contenant les Ig du caillé à l'eau. Le caillé est stocké à la sortie de la clarifieuse-autodébourbeuse dans un réservoir muni d'un brasseur et brassé avec 300 kg d'eau tiède à 40° C pendant 30 min et dirigé vers un moulin colloïdal. La suspension de caillé broyé est alors séparée dans une clarifieuse-autodébourbeuse. On récupère 154 kg de caséine lavée et 300 kg de liquide de lavage qu'on réunit au sérum pour les opérations ultérieures. 1291 kg de sérum sont filtrés et ultrafiltrés, conduisant à 2010 kg de perméats (I, II et III) et 216 kg de préconcentrat. L'évaporation fournit 108 kg de concentrât qui donne • 21,6 kg de produit sec par séchage. On gagne ainsi environ 14% d'Ig par rapport au procédé selon l'exemple 2.
Exemple 4:
1 kg de la poudre préparée selon les exemples 2 ou 3 est mélangée à 99 kg de poudre de lait de façon homogène, et celle-ci est conditionnée stérilement pour fournir un produit contenant une dose prophylactique d'Ig, pour une alimentation isocalorique de 120 cal/kg/jour, correspondant à 250 mg de concentré Ig/kg/jour.
Exemple 5:
Différents tests in vitro et in vivo ont été effectués avec le concentré protéique selon les exemples 2 ou 3 et désignés ci-après par concentré Ig pour montrer:
— que les Ig lactiques ont une spécificité anticorps que l'on trouve normalement chez les Ig humaines, et que celle-ci est préservée au cours du processus de fabrication;
— que les Ig lactiques spécifiques montrent une activité protectrice en interférant dans les mécanismes pathogènes des microorganismes entéropathogènes.
Hémagglutination passive
Des globules rouges de mouton ont été sensibilisés avec un extrait à l'urée d'un sérotype d'E. coli spécifique. Cet extrait a été obtenu selon Brodhage (Brodhage H., «J. Hyg.», 1961,148,94). Les bactéries ont été cultivées sur agar nutritif (Difco) à 37°C pendant 30 h dans des flacons de Roux. On a récolté la culture par 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate (8,8 g NaCl + 1,86 g Na2HP04 • 2H20 + 0,43 g KH2P04/1000 ml H20) à pH 7,2. Après addition de 10 g d'urée (Merk), la suspension a été laissée au repos pendant 90 h à 37°C avec agitation lente. Après centrifugation, le surnageant a été totalement dialysé contre la solution saline tamponnée au phosphate à pH 7,2, dilué jusqu'à un volume final de 50 ml avec la solution saline tamponnée au phosphate à pH 7,2 et congelé en petites portions à — 20° C. La sensibilisation des globules rouges de mouton avec cet antigène a été effectuée par une combinaison des méthodes selon Avrameas et coll. (Avrameas S., Taudou B., Chuilon S., «Immunochemistry», 1969, 6, 67) et selon Otto et coll. (Otto H., Takamiya H., Vogt A., «J. Immunol. Methods», 1973,3,137). Les globules rouges de mouton ont été prétraités avec le glutaraldéhyde (concentration finale 5% de globules rouges de mouton et 0,5% de glutaraldéhyde) puis lavés et mis en suspension à 20% dans la solution saline tamponnée au phosphate à pH 7,2 et mélangés avec le même volume d'extrait à l'urée. Après 16 h d'incubation à 20° C sous agitation douce, les globules rouges de mouton sensibilisés ont été lavés plusieurs fois et mis en suspension à 1 % pour usage immédiat. Les globules rouges de mouton peuvent être stockés en suspension à 10% à 4°C pendant plusieurs semaines.
Avant filtration, chaque échantillon à examiner doit être absorbé sur globules rouges de mouton prétraités au glutaraldéhyde (0,1 ml globules rouges de mouton sédimentés pour 1 ml de concentré Ig, 37°C, 60 min).
Les titrages ont été effectués avec un appareil Microtiter (Sever J.L., «J. Immunol.», 1962,88,320, et Conrath T.B., «Handbook of Microtiter Procédures», 1972) en utilisant des plaques de polystyrène avec cavités en forme de V. On a effectué une série de dilutions de 50 [il chacune dans le sérum normal de lapin dilué à 1/200 et on a ajouté 25 [il de globules rouges de mouton sensibilisés à 1% à chaque dilution. Une série a été préparée avec des globules rouges de mouton non sensibilisés comme contrôle d'agglutination non spécifique. On a lu les résultats après 2 h, le titre d'hémagglutination étant donné par la dernière dilution conduisant à une réaction positive nette.
Les résultats obtenus pour cinq sérotypes d'E. coli sont donnés dans le tableau ci-dessous:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
627079
6
Sérotype E. coli
Titre en agglutinines
0 55
1/256
0 111
1/ 64
0 119
1/128
0 127
1/128
0 128
1/ 64
contrôle
—
Activité bactériostatique in vitro
On a étudié l'activité bactériostatique sur la croissance de différents sérotypes E. coli par addition de concentré Ig au milieu de culture. On a utilisé le système Microtiter adapté pour la culture, permettant ainsi d'utiliser des quantités minimales d'échantillon à tester et d'examiner simultanément un nombre maximal d'échantillons.
Chaque culture avait un volume final de 0,25 ml soit dans un milieu minimal contenant 1 % de glucose, soit dans un milieu de culture riche. Pour chaque valeur du temps d'incubation étudiée, on a effectué deux prises d'échantillons pour diminuer les risques d'erreurs dues à des variations de volume. L'évaluation a été faite pai double comptage d'aliquots de 10 (il sur plaques d'agar nutritif. L'inoculum bactérien consistait en une dilution d'une culture de 16 h en milieu minimal contenant 1 à 2 x 103 bactéries/ml. L'incubation a été effectuée en atmosphère humide à 37° C. Le concentré Ig aux concentrations finales de 1 |xg/ml, 10 [ig/ml, 100 [ig/ml et 1 mg/ ml a été ajouté au milieu de culture avant inoculation avec 2 x 103 E. colijml. On a constaté une nette inhibition de la croissance de E. coli 0 111 : B4 pendant les 4 premières heures d'incubation à la concentration de concentré Ig de 10 (ig/ml. Par comparaison au contrôle constitué par le milieu de culture seul, on a observé une croissance supérieure en présence de 1 mg/ml de protéines de petit-lait normales obtenues à partir de vaches non immunisées.
Clearance de E. coli 0 111 : B4 chez la souris
Pour chaque test, on a utilisé 8 souris (souris blanches mâles suisses, de 20 à 24 g), soit 2 comme contrôle et 6 pour 3 tests effectués chacun deux fois. Toutes les souris ont reçu une injection sous-5 cutanée de 0,1 ml d'héparine (500 Ul/ml). Un bouillon de culture de 116 h deE. coli 0 111 :B4 a été dilué au 1/10 avec une solution saline stérile puis dilué au 1/100 par addition de sérum de veau fœtal (Difco) dilué au 1/10 pour les contrôles et contenant trois concentrations choisies de concentré Ig. On a injecté par voie intraveineuse io 0,2 ml de la solution obtenue dans la veine caudale, chaque souris (2 souris pour le contrôle et 2 x 3 pour les tests) recevant environ 2 x 106 bactéries, la suspension bactérienne d'origine contenant 109 bactéries/ml. Immédiatement après l'injection (au temps tO), et après 20,40 et 60 min, on a effectué une ponction sanguine de 50 [il à îs partir du plexus veineux ophtalmique, au moyen de tubes capillaires calibrés héparinisés, et on a transféré immédiatement les échantillons dans 5 ml de solution saline stérile (dilution sanguine 10-2) qu'on a ensuite dilué à IO-3 et 10-4 en solution saline. On a effectué le comptage sur plaques d'agar (Difco) avec 1 ml de chaque dilution et 20 déterminé l'indice de phagocytose K selon Biozzi et coll. (Biozzi G., Stiffel C., Halpern B.N., Le Minor L., Mauton D., «J. Immunol.», 1961,57,296):
log Ci - log C2
25 T2 — Ti
Cj et C2 correspondent aux comptages aux temps Tt etT2.
On a ainsi observé une diminution normale du nombre des 30 bactéries par élimination dans le système réticulo-endothélial en présence de sérum de veau fœtal, tandis que l'addition de 10 [ig de concentré Ig à la solution d'injection a provoqué la disparition de 99,6% des bactéries du flot sanguin en 20 min.
35 Les résultats sont résumés dans le tableau ci-dessous :
Temps
(minutes après l'injection E. coli)
Bactéries en % du nombre initial au temps 0 après injection intraveineuse de 2 x 10® E.coli 0 111 :B4
Contrôle 1:10 sérum fœtal de veau
Tests, concentré Ig
1000 (ig
100 (ig
10 (ig
0
100
100
100
100
20
27,8
0,14
0,22
0,4
40
15,5
0,02
0,02
0,12
60
10,0
0,02
0,02
0,06
On a contrôlé la spécificité de l'opsonisation par absorption exhaustive de concentré Ig avec le sérotype 0 111 : B4 d'E. coli et ón a constaté que cette absorption annihile pratiquement toute l'activité d'augmentation de la phagocytose, même avec une quantité de 1 mg de concentré Ig.
Le tableau ci-après donne les indices de phagocytose K obtenus en 20 min:
55 Test de protection chez la souris
On a préparé des dilutions logarithmiques (log10) d'une culture de E. coli 0 111 : B4 en bouillon nutritif (Difco) contenant 109 bactéries/ml pour donner des dilutions à IO-5,10-6 et 10~7 dans la mucine à 5% (mucine granulaire, type 1701-W pour la potentiation 60 de la virulence des bactéries de Wilson Laboratories, Chicago, Illinois).
On a ensuite mélangé 3 ml de chaque dilution à 0,6 ml de solution à tester, soit respectivement de solution saline, de concentré Ig, de protéines de petit-lait normal (vaches non immunisées). En utilisant 65 5 souris pour chaque dilution, on a injecté 0,6 ml du mélange obtenu à chaque souris par voie intrapéritonéale. Les résultats de l'évaluation du nombre de souris mortes sur 5 souris traitées après 48 h sont indiqués dans le tableau ci-après.
Contrôle
1000 g
1000 g
1:10 sérum concentré Ig concentré Ig
de veau fœtal non absorbé
absorbé
K
0,015
0,128
0,039
7
627079
Matériau testé
Nombre de souris mortes / 5 souris traitées
Concentration en bactéries du traitement
5 x 104
5 x 103
5 x 102
5 x 101
Solution saline
5
5
5
5
10 fi concentré Ig *
5
5
5
3
25 fi concentré Ig *
5
4
0
0
100 [x concentré Ig *
0
0
0
0
10 (a protéines de petit-lait normal
5
5
5
5
(vaches non immunisées)
25 (j. protéines de petit-lait normal
5
5
5
5
100 (a protéines de petit-lait normal
5
5
5
5
* Calculé en protéines totales contenant 35-45% d'Ig lactiques.
On a constaté que 100 |xg de concentré Ig conféraient une La présence d'Ig actives dans les extraits de selles a été confirmée protection totale pour toutes les concentrations en bactéries testées, 20 par double immuriodiffusion (test d'Ouchterlony) et par îmmuno-
tandis que 100 f*g de protéines de petit-lait isolées à partir du lait de électrophorèse. Les antisérums utilisés dans ces tests ont été préparés vaches non immunisées ne donnaient aucune protection. par injections sous-cutanées et intraveineuses répétées de 1 mg d'anticorps lactiques ou 0,1 mg d'Ig G^ Pour le test d'Ouchterlony, .
Exemple 6: des plaques de verre (94 x 84 mm) ont été recouvertes d'une couche
I. Une première série d'essais cliniques montrent que les Ig 25 de 1 % de gel d'agar dans une solution saline tamponnée au lactiques résistent à la dégradation protéolytique en fragments phosphate à pH 7,2, dans laquelle on a creusé des cavités de 4 mm inactifs dans le tractus intestinal. distantes de 9,5 mm à l'emporte-pièce (LKB-Producteur AB), en
„ „ . utilisant un antisérum antiprotéines de petit-lait colostral bovin et un
Onze enfants (neuf garçons deux filles) hospitalises pour diverses antisérum monovalent spécifique anti-IgG, de lait de vache.
raisons, mais ne souffrant pas de gastro-ententes et dont 1 âge allait 30 pour nmmun0électrOphorèse> des plaques de verre (100 x de 2 semaines a l an, ont ete nourris avec un lait contenant un 85 ^ ont été rec0uvertes de 12 ml de gel d'agar à 1 % dans le concentre Ig prepare selon les exemples 2 ou 3 en dose 1Socalorique barbiturate 0,o5 M tamponné à pH 8,3 (10,3 g barbiturate de sodium correspondant a 2 g/kg de poids corporel distnbuee également sur ^ ^ g ^ oxalique l j d-eau) et la
24 h. Les premier et dernier repas avec incorporation de concentre Ig sé aration électrophorèse conduite à température ambiante ont ete marques par 0,2 g de rouge carmin. On a recueilli au moins 35 dant 90 min à 4 v/cm Après diffusion des antisérums (24 h), les une selle avant 1 administration de concentre Ig et systématiquement ^ lavées ayec ,a solution ^ séchées et réyélées ayec toutes les selles suivantes pendant 72 h. les selles étant conservees a f, • r»
F lazocarmineB.
—20 C *
On a constaté la présence d'Ig lactiques dans les selles malgré des
On a préparé des extraits de selles par addition de deux parties de variations considérables du moment de leur apparition et de la durée selle pour une partie de solution saline tamponnée au phosphate à 40 de la sécrétion Ig ainsi qu'une bonne correspondance entre l'appari-pH 7,2 et dispersé les selles à 0°C avec une tige de verre. On a ensuite tion et la disparition du marqueur rouge carmin et des Ig.
agité la suspension pendant 20 min avec mini-agitateur (400 tr/min) à Pour confirmer l'activité de ces Ig lactiques, on a effectué le test in température ambiante. La suspension a alors été refroidie rapide- vivo de séroprotection chez la souris (comme décrit à l'exemple 5), en ment à 0°C et centrifugée à cette température à 3500 x g pendant utilisant 6 extraits de selles dans chaque série et dont les résultats sont 15 min. On a ensuite soigneusement prélevé les surnageants. 45 résumés dans le tableau suivant:
Extraits de selles
Intensité des Ig dans l'extrait de selles après examen immunoélectrophorétique
Nombre de souris mortes / 5 souris traitées
Nombre de bactéries utilisées dans le traitement
5 x 104
5 x 103
5 x 102
5 x 101
Enfant M.D.
I
5
5
5
5
(2 semaines)
II
5
5
5
5
IV
+ + + +
2
1
0
0
V
+ + + +
0
0
0
0
VI
+ + +
1
1
0
0
IX
5
5
3
4
Enfant S.G.
I
5
5
5
5
(1 mois)
III
4
5
5
5
IV
+ + + +
0
0
0
0
VI
+ + + +
0
0
0
0
X
+ +
3
0
1
0
XI
+
5
2
0
0
627079
8
On constate clairement une corrélation entre les résultats positifs tures sont restées positives. Dans les cas où les coprocultures sont en immunoélectrophorèse et la capacité protectrice de la matière devenues négatives, la consistance des selles s'est améliorée plus contenue dans les extraits de selles. En particulier, on estime que les rapidement lorsque le concentré Ig a été administré dans une formule concentrations en Ig lactiques des extraits V (enfant M.D.) et IV et lactée pauvre en lactose.
VI (enfant S.G.) correspondaient au moins à 1 mg de concentré Ig. s
II. Dans une seconde série d'essais cliniques on a étudié les Propriétés prophylactiques propriétés thérapeutiques et prophylactiques du concentré Ig. Les prématurés représentant un groupe extrêmement sensible aux gastro-entérites par E. coli, c'est ce groupe qui a été choisi pour les
Propriétés thérapeutiques essais cliniques de prophylaxie.
On a effectué cette étude avec des enfants allant jusqu'à 5 mois io Cette étude a été effectuée pendant 6 mois dans 2 salles avec souffrant de gastro-entérites, de bénignes à aiguës, provoquées par E. 8 incubateurs dans chaque salle. On a procédé à la répartition des coli. Dans différentes séries de tests, on a administré à un total de 152 tests et des contrôles dans chaque salle pour que tous les patients patients soit 2 g de concentré Ig/kg/j pendant 5 j, soit 1 g/kg/j soient exposés aux mêmes conditions, 4 incubateurs servant au test et pendant 10 j dans leur nourriture. Les patients n'ont reçu aucun 4 au contrôle. Chaque cas est resté en moyenne 41 j, un enfant étant médicament tel que sulfamides ou antibiotiques, ni oralement ni 15 éloigné après guérison et remplacé par un autre, quelle que soit son parentéralement. On a fait des coprocultures chaque lendemain appartenance (test ou contrôle). 70 cas ont été suivis, 36 comme d'une administration, la dernière entre 36 et 48 h après la dernière contrôle et 34 pour le groupe test.
administration de concentré Ig. 43 patients ont été traités de la même Le groupe test à reçu le concentré Ig à chaque tétée réparti sur manière, mais en remplaçant le concentré Ig par des protéines de 24 h à raison de 0,25 g/kg/j. On a procédé à une coproculture dès le petit-lait provenant de vaches non immunisées. 20 commencement de l'essai et examiné les coprocultures tous les 5 j.
On a obtenu des coprocultures négatives pour 90 enfants (57,7%) Sur un total de 666 coprocultures, 339 appartenaient au contrôle et au cours du traitement. Dans la série contrôle, seulement 14 enfants 327 au test. Parmi ces dernières, 33 ont montré la présence à'E. coli
(27,7%) ont montré une disparition spontanée de E. coli dans les (10,1 %), tandis que 96 des 339 copro cultures de contrôle ont été
coprocultures. Il faut tenir compte du fait que les protéines natives de positives (28,3%). Si on examine seulement le sérotype E. coli petit-lait provenant de vaches non immunisées contiennent une faible 25 0 119 : B 14 qu'on trouve souvent associé à des formes aiguës de quantité d'Ig anti-Ê. coli. On a également constaté que l'absence de gastro-entérite, la fréquence des coprocultures positives a été 5,5%
réussite du traitement a été observée plus fréquemment dans les cas dans le groupe test contre 23,3 % dans le groupe contrôle.
ayant reçu la plus haute dose pendant un temps plus court. On peut conclure que l'incorporation de concentré protéique
La consistance des selles a été examinée dans chaque cas. On a contenant des Ig lactiques spécifiques anti-£. coli au lait pour constaté une disparition de la diarrhée et une amélioration clinique 30 prématurés diminue nettement le degré d'infection par E. coli de ce sensible dans un grand nombre de cas et même lorsque les coprocul- groupe particulièrement sensible de nouveau-nés.
R 1 feuille dessins
Claims (12)
1. Procédé de fabrication d'un concentré protéique contenant des facteurs immunologiques d'origine lactique, notamment des immu-noglobulines actives non dénaturées, caractérisé par les étapes suivantes:
On hyperimmunise des femelles laitières en les vaccinants avec un antigène d'origine virale ou bactérienne, on recueille leur lait contenant les anticorps qu'elles ont produits, on sépare la crème et les impuretés, on coagule le lait clarifié et écrémé, on sépare la caséine, on filtre, ultrafiltre et stérilise les protéines du petit-lait par filtration, on évapore et on sèche le produit dans des conditions ne dénaturant pas les immunoglobulines et conservant la stérilité.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le lait traité se compose
— du Colostrum des 1« et 2e jours après vêlage,
— du lait de transition du 3e au 8e jour après vêlage,
— du lait de lactation finale des 60 derniers jours de la lactation.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le schéma de vaccination comprend, pour le lait colostral et de transition, une série d'administrations successives d'antigènes par voie parentérale d'environ la 8e à la 2e semaine avant vêlage et par voie orale pendant environ les 2 semaines avant vêlage et, pour le lait de fin de lactation, une série d'administrations successives d'antigènes à partir d'environ 2 Vi mois avant le tarissement présumé de la sécrétion lactée, avec alternance de la voie parentérale et de la voie orale.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le vaccin est à base d'antigènes d'Escherichia coli responsables de gastro-entérites néonatales.
5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la coagulation s'effectue au pH isoélectrique de la caséine sans chauffage, de préférence en présence de présure.
6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, pour éviter une obturation subséquente des filtres et ultrafiltres, l'opération d'écrémage s'effectue en deux étapes, d'abord à froid et ensuite à chaud, et en ce que l'écrémage et la séparation de la caséine s'accompagnent de débourbages poussés.
7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'ultrafiltration du petit-lait s'effectue en trois étapes: ultrafiltration propre, diafiltration et préconcentration.
8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le petit-lait préconcentré subit une préfiltration suivie d'une filtration stérile.
9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'évaporation du petit-lait préconcentré et stérilisé a lieu en circuit fermé dans des conditions stériles.
10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le produit concentré est séché par congélation suivie d'une lyophilisation et conditionné stérilement.
11. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, en vue de récupérer les immunoglobulines éliminées lors des opérations d'écrémage et de séparation de la caséine, la crème et le caillé sont extraits à l'eau et les eaux de lavage réunies respectivement au lait écrémé et au petit-lait.
12. Produit riche en immunoglobulines actives non dénaturées obtenu par la mise en œuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 11.
Priority Applications (20)
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|---|---|---|---|
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| ZA00781607A ZA781607B (en) | 1977-04-15 | 1978-03-20 | A process for the production of a protein concentrate containing immunological factors of lactic origin |
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| CA300,770A CA1101333A (fr) | 1977-04-15 | 1978-04-10 | Procede de fabrication d'un concentre proteique contenant des facteurs immunologiques d'origine lactique |
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| PH20991A PH14031A (en) | 1977-04-15 | 1978-04-11 | Process for the production of a protein concentrate containing immunological factors of lactic origin |
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| JP4409378A JPS53130411A (en) | 1977-04-15 | 1978-04-14 | Production of immunoglobulin containing protein concentrate |
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