DK153521B - Fremgangsmaade til fremstilling af proteinkoncentrater indeholdende immunologiske faktorer fra maelk - Google Patents

Description

DK 153521 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af proteinkoncentrater indeholdende immunologiske faktorer fra mælk, specielt aktive ikke-denaturerede immunoglobuliner.

Man har allerede foreslået at indføre immunologiske faktorer stammende fra mælk i diætetiske produkter til nyfødte og ammebørn ved i mælken at inkorporere disse faktorer, idet den orale indtagelse af disse produkter vil muliggøre transporten i ammebarnets blod af disse faktorer uden samtidig at se de ledsagende omstændigheder eller følgerne af en sådan generel passiv immunisering.

I fremlæggelsesskriftet DE 1 810 438 foreslås med henblik på immunisering af kalve at isolere immunlactoglobulinerne fra mælken fra vaccinerede køer ved koagulation af mælk, ved udvindelse af lac-

2 DK 153521 B

toserum og selektiv udfældning af lactoglobulinerne med f.eks. ammoniumsulfat efterfulgt af dialyse overfor rent vand, filtrering og tørring. Undersøgelse af serobeskyttelse hos mus i forbindelse hermed har vist, at parenteral injektion af disse immuniserende principper frembringer en almindelig passiv beskyttelse overfor visse enteropathogene bakterier og vira, dersom mikroorganismerne indføres i dyrene på samme måde.

Endvidere kan nævnes DK paténtskrift 87.610, hvori angives en fremstillingsmetode til beskyttelsesstoffer mod antigener. Man indsprøjter udvalgte antigener i yveret på et kl'ovdyr i dyrets ikke-malkende periode og fortsætter med infusioner i den malkende periode. Mælk eller colostrum indsamles, skummes og casein fjernes ved sur fældning. Herefter udfældes γ-globulin med kold alkohol, ud-dispergeres i en vandig saltopløsning, genudfældes med alkohol og lyophiliseres.

I US patent 3.911.108 beskrives lignende fremstillingsmetoder for beskyttelsesstoffer mod antigener. Disse beskyttelsesstoffer skal anvendes på smågrise.

Ved fremgangsmåden benytter man et kemisk antibakteriemiddel, nemlig β-propiolakton, til sterilisering og fraskiller antistof ved fældning med ammoniumsulfat og påfølgende dialyse.

Ingen af disse fremgangsmåder er særlig egnet til industriel udnyttelse.

Man har nu fundet en fremgangsmåde til i industriel målestok at fremstille proteinkoncentrater indeholdende immunoglobuliner uden denaturering af disse ved hjælp af teknologiske processer. Dette produkt frembringer en lokal passiv immunisering i tarmen uden resorption og uden bemærkelsesværdig ødelæggelse af aktiviteten i fordøjelseskanalen.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man a) opsamler fra mælkeproducerende drøvtyggere, især køer, der er hyper immuniserede ved vaccination, idet der successivt administreres antigener paren-teralt og lokalt ca. 8 til 1-2 uger før kælvningen og peroralt i de ca. 2 uger før kælvningen og, eventuelt, en serie successive administreringer af antigen fra ca. 2\ måned før det antagne ophør af mælkesekretionen med skift mellem parenteral, lokal og peroral administrering. Ovennævnte mælk består af colostrum fra 1 og 2 timer efter kælvningen, overgangsmælk fra 3-8 dage efter kælvningen og, eventuelt, mælk fra de sidste 60 dage af lacta- 3

DK 153521 B

tionsperioden; b) fraskiller fløden og urenhederne; c) koagulerer den klarede og skummede mælk; d) fraskiller caseinet, filtrerer./ ultrafiltrerer og steriliserer proteinet fra vallen ved filtrering.; : og e) inddamper og tørrer produktet under sådanne betingelser, at man ikke denaturerer immunoglobulinerne og bevarer steriliteten.

Den medfølgende tegning er en skematisk gengivelse af fremgangsmådens forskellige trin.

Det foretrækkes at behandle en blanding af ovennævnte mælkearter for at få en forhøjet antistofmængde under perioden så længe som muligt.

Hyperimmuniseringen af koen udføres ved en kombineret vaccination. F.eks. ved intracisternal indførsel i .brystkirtlen, ved parenteral injektion (subcutan, intravenøs), ved injektion i det retromammære lymfesystem, ved skarifikation, ved peroral indgift eller ved en kombination af flere af metoderne.

Det foretrækkes at anvende en kombination af metoderne, idet man følger et omhyggeligt lagt immuniseringsskema for at opnå en tilfredsstillende antistoftiter i hver type anvendt mælk. Således er vaccinationen for colostrum og overgangsmælken parenteral og intracisternal i 8-2 uger førend kælvningen og peroral i ugen førend kælvningen.

Til mælken fra slutningen af lactationen anvender man et vaccinationsskift mellem parenteral, lokal og peroral indgift fra 2.1/2 måned før det antagne ophør af mælkesekretionen.

Den anvendte vaccine er fordelagtig en udvalgt blanding af antigener og et adjuvang på basis af homolog blodserum fra immuniserede køer, idet det således tillader en detoksificering af vaccinen og dannelsen af immunkomplekser.

Koen tjener som produktionsdyr, de i proteinkoncentratet indeholdte Ig-forbindelser er principielt IgG-forbindelser (specielt IgG·^) forskellige fra modermælken, som fremherskende indeholder IgA som Ig-forbindelsen.

Indholdet af Ig i proteinkoncentratet, af hvilket proteinerne udgør 70 til 80 vægt-%, er 25 til 35 vægt-%. Visse fordele er knyttet til den kendsgerning, at Ig-forbindelserne ikke ved processens i-

DK 153521 B

4 gangsætning er adskilt fra de øvrige proteiner i lactoserum, som således ligeledes er til stede i det opnåede koncentrat. Man undgår således de selektive udfældningstrin, f.eks. med ammoniumsulfatet og dialysen.

Yderligere genfindes i proteinkoncentratet visse bakteriosta-tiske eller antivirusfaktorer, f.eks. lactoferrinet, eller de enzymatiske systemer, som f.eks. lactoperoxidase, ribonuclease, som er til stede i lactoserummet.

Alle slags antigener af virus eller bakterieoprindelse kan anvendes, og de opnåede antistoffer er afhængige af de antigeners natur, det er administreret til koen. Man kan f.eks. opnå en beskyttelse mod enteropathogene bakterier og virus, der er ansvarlige for gastroenteriter med samtidig kraftig diarré med dehydrering, ved inkorporering af proteinkoncentrater indeholdende Ig-forbindel-serne i alt tilskud anvendt til peroral administrering. Dette tilskud kan være et vilkårligt hjælpestof eller fortrinsvis et diætetisk produkt som mælk eller mælkepulver til småbørn, en såkaldt"hu-maniseretf' mælk eller tilpasset ammebørn, mælk specielt tilpasset en særlig gruppe nyfødte, som f.eks. mælk til for tidligt fødte børn eller børn med ringe fødselsvægt osv.

Dersom man vil anvende f.eks. et koncentrat indeholdende Ig-anti E. coli i profylaktisk dosis med mælk som tilskud, inkorporere] man fra 0,8 til 3 g af koncentratet i 100 g af det tørre materiale og indtil 6 g, når det drejer sig om en terapeutisk dosis.

For at udføre fremgangsmåden er det nødvendigt at sørge for, at afskumningstrinnene og klaringen foregår meget omhyggeligt for at undgå en efterfølgende tilstopning af filtrene og ultrafiltrene.

Afskumningen udføres fortrinsvis i to etaper, først under køling for at fjerne størstedelen af fedtstofferne og urenhederne (f. eks. blod, der ofte findes i colostrum) og til sidst under opvarmninc for fuldstændig at fraskille disse. Koagulationen kan udføres ved caseiriets isoelektriske pH i nærværelse af osteløbe med tilsætning af syre, f.eks. citronsyre.

Det foretrækkes at udføre koaguleringen ved syretilsætning, f.eks. saltsyre, indtil en pH-værdi omkring 4,6 og opvarmning indtil 40°C.

Fraskillelsen af caseinet medfører en klaring af serummet, der muliggør, fraskillelse af udfældningerne.

DK 153521 B

5 .......................... :

Det er nødvendigt at udføre trinnene, der nødvendiggør en termisk behandling (inddampning og tørring) under styrede forhold for at undgå inaktivering af Ig-forbindeiserne.

For at formindske tabene aflg, hvoraf en del fjernes under af-skumningen af fløden og en anden del med caseinet, når dette fraskilles, anbefales det at ekstrahere fløden og tykmælken med vand og behandle vaskevandet indeholdende Ig-forbindelserne for at genvinde dissei ; I de følgende eksempler belyses opfindelsen nærmere, idet mængder og dele er angivet i vægtenheder, med mindre andet er anført.

Eksempel 1 Køer af forskellig race blev hyperimmuniseret efter nedenfor anførte skema med en vaccine, hvis fremstilling er anført nedenfor, og man opsamlede mælken de to sidste måneder af lactationsperioden og de otte første dage efter kælvningen.

Fremstilling af vaccine:

Man anvendte følgende enteropathogene serumtyper af E. coli: 0 18 : K 76 (B 20) 0 111 : K 58 (B 4) 0 20 : K 17 (L) 0 112 : K 68 (B 11) 0 26 : K 60 (B 6) 0 119 : K 69 (B 14) 0 44 : K 74 (L) 0 124 : K 72 (B 17) 0 55 : K 59 (B 5) 0 125 : K 70 (B 15) 0 78 : K 80 (-) 0 126 : K 71 (B 16) 0 86 : K 61 (B 7) 0 127 : K 63 (B 8) 0 128 : K 68 (B 12)

De forskellige stammer gav gastroenteriter hos hospitalsindlagte børn. Serotypningen udførtes med antisera, der var multi- og monovalente (Difco). Bakterierne dyrkedes på flydende minimalsubstrat indeholdende 2% aminosyrer fra casein (casaminosyrer Difco) og 2% glucose i 24 timer ved +37°C uden omrystning af kolberne. For at inaktivere bakterierne adskilte man kulturerne ved centrifugering i bundfældede celler og supernatant. Cellerne genopslemmedes i suspension og inkuberedes ved 37°C i 24 timer i nærværelse af 0,5% formaldehyd, medens den supernatante væske inåktiveredes som angivet, men med 0,05% formaldehyd. Efter en ny centrifugering og fjernelse af su-pernatanten anbragtes bakterierne i opslemning i den oprindeligt in-aktiverede supernatant. Denne fremgangsmåde tillader at bevare den supernatante væske indeholdende bakterieexotoksiner til vaccinen.

DK 153521 B

6

U

Man opnåede en vaccine med 1-2 x 10 bakterie/ml, og man fortyndede herefter blandingen med en opløsning af 2% Al(OH)g og homolog blodserum fra immuniserede køer.

Fremgangsmåde ved immuniseringen.

A. Immuniseringsskema til opnåelse af colostrum og overgangsmælk indeholdende Ig-anti-E.coli-forbindelser:

Dage for forventet kælvning = X

Behandlingstidspunkt Vaccine + evt. .adjuvans Administreringsmåde 7 X - 8 uger 5 ml vaccine (5 x 10 Subcutan injektion bakterier/ml)^ + 5 ml serum 7 X - 7 " 5 ml vaccine (5 x 10 Intravenøs injektior bakterier/ml + 5 ml 2% Α1#(ΌΗ)3 + 5 ml serum 7 X - 6 " 10 ml vaccine (5 x 10 Subcutan injektion bakterier/ml 7 X - 5 1/2 uger 20 ml vaccine (5 x 10 Injektion i det re- bakterier/ml + tromammære lymfesy- 10 ml 2% Al(OH), stem ό 7 X - 5 uger 40 ml vaccine (5 x 10 Infusion på 4 x 15 bakterier/ml) ml i yveret med pat- + 20 ml serum tekanyler Q ££ X - 4 1/2 uger 24 ml vaccine (5 x 10 Subcutan injektion bakterier/ml) + 8 ml serum* 7 X - 4 uger 40 ml vaccine (5 x 10 Infusion på 4 x 15 bakterier/ml) ml i yveret med pat- + 20 ml serum tekanyler

O

X - 3 " 10 ml vaccine (5 x 10 Subcutan injektion bakterier/ml) 8 X - 2 uger 5 ml vaccine (5 x 10 Intravenøs injektion bakterier/ml),+ 5 ml 2% Al (OH) , X - 1 uge 1(50 ml xaccine·3 (1 x 10y bakterier/ml) Peroral indgift under drøvtygningen X - 1/2 uge 100 ml yaccine (1 x 10y bakterier/ml) Peroral indgift under drøvtygningen + Disse serumtilsætninger foretages kun, når man er nødt til det, eller en ko immuniseres for første gang.

++ Dénne subcutane injektion gentages i det lymphatiske system, som følger: DK 153521 7 2 x 4 ml i de pre-scapulære lymfesystemer 2 x 4 ml i depost-scapulære lymfesystemer 2 x 4 ml i lyskelymfesystemerne 2 x 4 ml i de poplitiske lymfesystemer.

B. Immuniseringsskema til opnåelse af mælken fra lactationens slutning (to sidste måneder af lactationen) indeholdende Ig-anti- E.coli-forbindelser.

Denne immunisering foretages kun på køer, der allerede er blevet immuniseret under den colostrale periode og overgangsperioden.

Antal dage for ophør af mælkesekretionen = X Behandlingstidspunkt Vaccine + øvt. adjuvans. Administreringsmåde 7 X - 70 dage 5 ml vaccine (5 x 10 Intravenøs injektion bakterier/ml) + „ „ 5 ml 2% Al (OH)-, a X - 65 20 ml vaccine ^5 x 10 Injektion i det retro- bakterier/ml mammære lymfesystem X - 60 " 24 ml vaccine (5 x 10^ Subcutan injektion** bakterier/ml) (som under A) X - 55 " 100 ml vaccine (1 x 10^ Peroral indgift under bakterier/ml) drøvtygning 7 X - 50 " 40 ml vaccine (5 x 10 Infusion i yveret som

bakterier/ml + 20 ml i A

serum 9 X - 40 lOO ml vaccine (1 x 10 Peroral indgift under bakterier/ml) drøvtygning

O

X - 30 " 20 ml vaccine (5 x 10 Injektion i det retro- bakterier/ml) mammære lymfesystem 7 X ~ 25 " 40 ml vaccine (5 x 10 Infusion i yveret som

bakterier/ml) + 20 ml i A

„ serum g X - 10 100 ml vaccine (1 x 10 Indgift under drøvtyg- bakterier/ml) ningen.

Eksempel 2 Mælk fra de otte første dage efter kælvningen opsamledes fra vaccinerede køer som beskrevet i eksempel 1 og behandledes på følgende måde:

Afskumningen udførtes i to trin: trin A koldt og trin B varmt. A. 1100 kg mælk sattes koldt til en afskumningscentrifuge og ledtes til en tillukket beholder på 1500 liter, hvorefter den pumpedes i en slamcentrifuge ved forhøjede accelerationer (ca. 11000 g) for til sidst at fjerne blod og urenheder (snavs).

8

DK 153521 B

B. Den slamc entrif ugerede kolde mælk opbevaredes i en beholder på 2500 liter og pumpedes gennem en tempereret opvarmningsanordning på 40°C ud i afskumningscentrifugen, som allerede havde været anvendt forud, hvorved der fraskiltes 110 kg fløde, som man opsamlede, og 5 kg snavs, som man bortkastede. Som en variant kan man anvende en selvudtømmende slamafskummer til det kolde og varme afskumningstrin og en slamcentrifuge mellem operationerne og således nedskære afskumningens varighed.

Den afskummede og afslammede varme mælk (985 kg) anbragtes herefter i fire firkantede koaguleringskar på hver 750 liter udstyret med et rør'eværk for at koagulere.

Man tilsætter en opløsning af saltsyre på 1 N ved 37°C, indtil pH stabiliseres omkring 4,6, og man opretholder temperaturen i 20 minutter under omrøring. Derefter afkøler man til ca. 15°C.

Det efterfølgende trin er adskillelsen af caseinet. Den består af to centrifugeringer efter hinanden af vallen efter afskumning af mælk, koagulering og skæring. Den første centrifugering f rå skiller størstedelen af det udfældede casein ved hjælp af en klarings-autoslamcen-trifuge, idet der fraskilles 150 kg casein, og serummet går over i en tillukket beholder. Den anden centrifugering fjerner alle spor af partikler, som kan forstyrre den efterfølgende filtrering og ultrafiltrering, f.eks. ved hjælp af slamanordningen anvendt i operation A til afskumning. Man opnår 854,7 kg klaret serum, som pumpes over i en beholder på 2500 liter.

Herefter fortsætter man med filtrering efterfulgt af ultrafiltrering af serummet. Filtreringen skal være meget omhyggelig for at lette ultrafiltreringen, idet man fraskiller de meget fine partikler af casein. Man anvender "Seitz Supra" 100 filter i stykker på 20 x 20 cm. Filtratet oplagres i et reservoir på 3000 liter og pumpes derefter til uitrafiltret. Ultrafiltreringen sker i to eller tre etaper med recyclisering af det tilbageholdte materiale (for nemheds skyld i det følgende kaldet retentatet) til reservoiret. To centrifugepumper i serie sikrer strømningen mod et indgangstryk i ultrafiltrets indgangsafdeling på ca. 7 bar, idet udgangstrykket holdes på ca. 4,5 bar. For at undgå genopvarmning af retentatet ved den energi, som kommer fra pumperne, afkøles dette til 10-12°C.

9 ______________________________ DK 153521 B:

Det første trin eller selve ultrafiltreringen muliggør adskillelse af de opløste stoffer med høj molekylvægt, proteinerne, der er tilbageholdt på membranen, og som findes i retentatet, medens en del af lactosen, vitaminerne, mineralsaltene og vandet overføres til per- meatet. Dersom man anvender en model DDS med membran 800 (overflade-2 membran = 7 m ), vil forholdet mellem retentat/permeat være ca. 1 til 3,1, idet man således opnår 580 kg permaet I og 274,7 kg re- 2 tentat med en strømningsmængde på 14,17 kg permeat/m time.

Det andet trin erN en diafiltrering, i løbet af hvilken man kontinuert til retentatet sætter 825 kg vand, og man cirkulerer opløsningen under samme betingelser, som forefindes i det første trin. Diafiltreringen standses, når den elektriske ledningsevne af permea-tet opnår den ønskede værdi, idet forholdet mellem retentat/tilføjet vand vil være ca. 1 til 3. På denne måde fremstiller man 825 kg per- meat II og 274,7 kg retentat med en middelstrømning på 11,77 kg per-2 meat/m time. Det tredje trin er en koncentrering, hvor man, dersom det ønskes, recirkulerer retentatet på membranen indtil et indhold af tørstof på ca. 10%, idet man fjerner 82,5 kg permeat III. Man opnår således 192,2 kg prekoncentreret opløsning. Som alternativ kan man undlade dette tredje trin, og gå direkte til sterilfiltrering.

Sterilfiltreringen udgør et vigtigt trin i hele fremgangsmåden, fordi varmebehandlinger ikke er anvendelige til sterilisering, da · de vil føre til denaturering af Ig-forbindelserne. Sterilfiltreringen fjerner mikroorganismer fra retentatet, som endnu måtte findes dér (størstedelen af disse er allerede fjernet under fraskil-lelsen af fløden, caseinet og urenhederne). For at undgå tilstopning af sterilfiltrene er en fjernelse af urenheder ved centrifugering og en tredje filtrering af retentatet nødvendig. Efter fjernelse af u-renheder opbevarer retentatet i reservoiret, og ledes ad en filtreringslinie, der omfatter en prefiltrering på tre filtre "Seitz Supra" 100,ΕΚ, EKS anbragt i række, derefter sterilfiltrering på filtrene "Seitz Supra" 20 og "Millipore" HA 0,45μ anbragt i række og fortrinsvis steriliseret med overopvarmet vand. Det steriliserede retentat opbevares i et sterilt reservoir på 500 liter.

Alle de øvrige operationer sker under sterile forhold. Ved

DK 153521 B

10 hjælp af komprimeret nitrogen og sterilt filter kan man f.eks. overføre til den efterfølgende inddampning.

Inddampningen udføres med en filminddamper (med en strøm, der 2 falder over en overflade på 1 m ) ved en opvarmningstemperatur på 75°C, idet produktets temperatur vil være på ca. 30°C indtil et indhold af tørstof på mindst 20%. Por at undgå enhver infektion udføres overførelsen med en peristaltisk pumpe fra retentatreservoiret til koncentratreservoiret, hvilket er forbundet i en ring omfattende inddamperen, idet koncentreringen foregår i et lukket kredsløb. Denne operation påvirker ikke aktiviteten af Ig-forbindelserne.

Man fortsætter herefter med tørring af koncentratet (96 kg) ved almindelige metoder, f.eks. ved frysning efterfulgt af lyofilise-ring. Frysningen kan udføres på plader på -40°C. Ig.forbindelserne kan opbevares ved -30°C uden at tabe aktiviteten i ca. 45 dage. Produktet ved -30°C lyofiliseres på plader i en ovn ved 0,5 torr ved en kondensationstemperatur på -50°C og en opvarmningstemperatur på 30-35°C. Tørringsmetoden påvirker ikke aktiviteten af Ig-forbindelserne. Man opnår på denne måde 19,1 kg af et tørt produkt indeholdende 25-35% Ig-forbindelser, som man konditionerer sterilt.

Eksempel 3

Man går frem som i eksempel 1, idet man behandler mælken fra de første otte dage efter kælvningen og mælken, der er opsamlet i løbet af de sidste fire uger af lactationsperioden, hvorved man opnår et proteinkoncentrat med gennemsnitssammensætningen:

Proteiner 75-5% 40 -5 % immunogluboliner 15-5 % α-lactalbuminer 35-5 3-lactoglobuliner 5 -2 % serumalbuminer 5 -2 % andre mindre proteiner rest fugtighed 4-0,5% lactose 10-2 % mineralsalte 5-2 % nitrogenforbindelser, + ikke-proteiner. 5-2 % 11

DK 153521 B

Eksempel 4

Man går frem således som beskrevet i eksempel 2, men med den forskel, at fløden og caseinet ekstraheres med vand for at genudvinde en del af de tabte Ig-forbindelser, idet vaskevandet recirkuleres på fabrikationslinien.

Den kolde afskumning (etape A) udføres med en linie parallel med vandekstraktionen af proteinfraktionen, der indeholder Ig-forbindelserne fjernet med fløden. Den fløde, der fremkommer ved den første centrifugering (115 kg), opbevares i et reservoir på 1000 liter med omrøring og blandes med 150 kg lunkent vand ved 40°C, hvorefter det hele blandes i 30 minutter og centrifugeres i en mejericentrifuge.

Man fraskiller således 115 kg fløde og 150 kg opløsning, som forenes med den skummede og klarede mælk. På denne måde opnår man 130 kg væske, som føres til varmskumning (etape B) og koagulering.

Fraskillelsen af caseinet giver ud fra 1145 kg skummetmælk, der er tilsat løbe og syrnet, 991 kg serum og 154 kg casein. En parallellinie tillader at ekstrahere proteinfraktionen indeholdende Ig-forbindelserne, der er koaguleret i vand. Koagulatet opbevares ved udgangen af klarings-autoslamcentrifugen i et reservoir udstyret med en omrører og omrøres med 300 kg lunkent vand ved 40°C i 30 minutter, hvorefter man leder det til en kolloidmølle. Suspensionen af det formalede koagel adskilles herefter i en klarings-autoslam-centrifuge. Man udvinder 154 kg vasket casein og 300 kg vaskevæske, som man slår sammen med serummet fra de øvrige operationer. 1291 kg serum filtreres og ultrafiltreres, hvilket giver 2010 kg permeat (I, II og III) og 216 kg prekoncentrat. Inddampning giver 108 kg koncentrat, som giver 21,6 kg tørt produkt ved tørring. Man får således ca. 14% Ig-forbindelser mere end ved fremgangsmåden fra eksempel 2.

Eksempel 5 1 kg pulver fremstillet som i eksempel 2 eller 4, henholdsvis 2 kg pulver fremstillet som i eksempel 3, blandes med 100 kg mælkepulver på ensartet måde, og denne konditioneres sterilt til at udgøre et produkt, der indeholder én profylaktisk dosis ig til en næringsmiddeldosis svarende til 140 cal/kg/dag svarende til 250 mg koncentrat Ig/kg/dag fremstillet som i eksemplerne 2 eller 4 henholdsvis til 500 mg koncentrat Ig/kg/dag fremstillet som i eksempel 3.

DK 153521 B

12 ' *

Eksempel 6

Forskellige forsøg in vitro og in vivo er blevet udført med proteinkoncentratet fremstillet som i eksempel 2 eller 4 og i det efterfølgende kaldt "koncentrat Ig" for at vise: at Ig-mælkeforbindelserne har en antistofspecifitet, som man normalt finder hos de menneskelige Ig-forbindelser, og som bevares under fremstillingsprocessen, at de specifikke Ig-mælkeforbindelser udviser en beskyttende aktivitet, idet de interfererer i de pathogene mekanismer fra entero-pathogene mikroorganismer.

Passiv hæmagglutination.

Røde blodlegemer fra får sensibiliseredes med en urinstofekstrakt af specifikke serotype E. coli. Dette ekstrakt fremstilledes som beskrevet af Brodhage (Brodhage H., (1961) J. Hyg., 1961, 148, 94). Bakterierne dyrkedes på næringsagar ("Difco") ved 37°C i 30 timer i en Roux-kolbe. Man høstede kulturen med 10 ml af en saltvandsopløsning buf ret med phosphat (8,8 g NaCl + 1,86 g · 2H20 + 0,43 g KH2P04/1000 ml H20) indtil pH 7,2. Efter tilsætning af 10 g urinstof ("Merk”) henstod opslemningen i 90 timer ved 37°C under let omrøring. Efter centrifugering dialyseredes supernatanten fuldstændig over for en saltvandsopløsning bufret med phosphat til pH 7,2, fortyndedes til et slutrumfang på 50 ml med en saltvandsopløsning bufret med phosphat til pH 7,2, hvorefter man nedfrøs i små portioner ved -20°C. Sensibilisering af røde blodlegemer fra får med dette antigen udførtes ved en kombination af metoderne beskrevet af Avrameas et coll. (Avrameas S., Taudou B., Chuilon S., Immunochemistry, 1969, j5, 67) og Otto et coll. (Otto H., Takamiya H., Vogt A., J. Immul. Methods, 1973, 3^ 1937). Fårets røde blodlegemer var forudbehandlet med glutaraldehyd (slutkoncentrationen af røde blodlegemer fra får 5% og 0,5% glutaraldehyd), hvorefter der vaskedes og opslemmedes med 20% af en saltvandsopløsning bufret med phosphat til pH 7,2, og blanding af det samme ekstraktvolumen med urinstof. Efter 16 timers inku-bering ved 20°C under let omrøring vaskedes de sensibiliserede røde fåreblodlegemer adskillige gange og opslemmedes indtil 1% til umiddelbar brug. De røde fåreblodlegemer kan opbevares i en suspension på 10% ved 4°C i adskillige uger.

Før filtrering bør hver prøve, der skal undersøges, være absorberet på røde fåreblodlegemer forbehandlet med glutaraldehyd (0,1 ml røde fåreblodlegemer udfældet pr. 1 ml Ig-koncentrat, 37°C, 60 mi- 13

DK 153521 B

nutter).

Titreringerne udførtes med mikrotitersystemet (Sever J.L., J. Immul., 1962, 8j3, 320 og Conrath T.B., Handbook of Microtiter Procedures, 1972), idet man anvendte polystyrenplader med udhulinger i form af V. Man udførte en række fortyndinger på 50μ liter hver i normalt kaninserum fortyndet til 1/200, og man tilføjede 25μ liter sensibiliserede røde fåreblodlegemer på 1% til hver fortynding. Man fremstillede en række med røde fåreblodlegemer, der ikke var sensibiliseret, som ikke-specif ik agglutinationskontrol. Man af læste result-taterne efter 2 timer, idet hæmagglutinationstiteren angaves ved den sidste fortynding, der førte til en klar positiv reaktion.

Resultaterne opnået for 5 serotyper E.coli er angivet i tabellen nedenfor.

Serotype E.coli_Agglutinationstiter 0 55 1/256 0 111 1/ 64 0 119 1/128 0 127 1/128 0 128 1/ 64 kontrol -

Bakteriostatisk aktivitet in vitro.

Man undersøgte den bakteriostatiske virkning på væksten af forskellige serotype E.coli ved tilsætning af Ig-koncentrat midt under dyrkningen. Man anvendte mikrotitersystemet tilpasset til dyrkning, hvilket muliggjorde at anvende minimale prøvemængder og samtidig undersøge et maksimum antal prøver-

Hver kultur havde et slutvolumen på 0,25 ml dels på et substrat indeholdende mindst 1% glucose, dels på et rigt dyrkningssubstrat. For hver undersøgt dyrkningstid udførte man to prøveudtagninger for at formindske fejlen på grund af variationer i rumfanget. Vurderingen udførtes ved dobbelttælling af mængder på 10μ liter på ' plader af næringsagar. Bakterieinoculum bestod af en fortynding af 3· en 16 timers kultur fra et miljø, der mindst indeholdt 1 til 2 x 10 bakterier/ml. Inkuberingen udførtes i en fugtig atmosfære ved 37°C.

Man tilsatte Ig-koncentrater på slutværdier på ^g/ml, 10μg/ml, 3 100μg/ml og 1 mg/ml til dyrkningssubstratet førend podning med 2 x 10 E.coli/ml. Man konstaterede en ren væksthæmning af E.coli 0 111 : B4 i løbet af 4 timers inkubering med en Ig-koncentration på 10μg/ml.

Ved sammenligning med kontrollen, der bestod af dyrkningssubstratet

DK 153521 B

14 alene, fandt man en bedre vækst i nærværelsen af 1 mg/ml protein fra skummetmælk fra ikke immuniserede køer.

Clearance af E.coli 0 111:B4 hos mus.

Til hvert forsøg anvendte man 8 mus (hvide svejtsiske hanmus på 20 til 24 g), 2 som kontroller og 6 til 3 forsøg hver udført to gange. Alle musene modtog en subcutan injektion af 0,1 ml heparin (500 UI/ml). En 16 timers dyrkningsbouillon af E.coli 0 111 : B4 fortyndedes til 1/10 med en steril saltvandsopløsning, hvorefter man fortyndede til 1/100 ved tilsætning af foetal kalveserum ("Difco") fortyndet 1/10 som kontroller og indeholdende tre udvalgte kon centrationer af Ig-koncentrat. Man injicerede 0,2 ml af den opnåede opløsning intravenøst i den kaudale vene, idet hver mus (2 mus som

C

kontroller og 2 x 3 som forsøg) fik ca. 2 x 10 bakterier, idet den

Q

oprindelige bakterieopslemning indeholdt 10 bakterier/ml. Umiddelbart efter injektionen (til tiden tO) og efter 20, 40 og 60 minutters forløb udtog man en blodprøve på 50y liter fra det ophtalmiske ve-neplexus ved hjælp af kalibrerede hepariniserede kapillarrør, og man overførte straks prøverne til 5 ml sterilsaltvandsopløsning (blod- -2 -3 -4 fortynding 10 ), og man fortyndede herefter til 10 og 10 med saltvandsopløsning. Man udførte tællingen på agarplader ("Difco") med 1 ml af hver fortynding og bestemte phagocytoseindekset K efter

Biozzi et coll. (Biozzi G., Stiffel C., Halpern B.N., Le Minor L.,

Mauton D., J. Immul., 1961, 87_, 296): log C-, - log C9 K = ---— T2 - ^ C·^ og C2 svarende til tællinger ved tiden og T2.

Man observerede således en normal nedgang i antallet af bakterier ved eliminering gennem det reticulo-endotheliale system i nærværelse af foetal kalveserum, medens tilsætningen af 10yg Ig-koncentrat i injektionsopløsningen fremkaldte en 99,6% forsvinden af bakterierne fra blodstrømmen i løbet af 20 minutter.

Resultaterne er opgjort i tabellen nedenfor:

DK 153521 B

15

Tiden Bakterier i % af det oprindelige antal tilgti- (minutter efter den 0 efter intravenøs injektion af 2 x 10° indsprøjtning E.coli 0 111:B4 af E.coli)_

Kontrol 1:10 Prøver Ig-koncentrat foetal kalve- 1000 ug 100 ug 10 ug serum 0 100 100 100 100 20 27,8 0,14 0,22 0,4 40 ------------- 15,8 -----------0,02 ......0,02·--" ------- 0,12 ' 60 10,0 0,02 0,02 0,06

Man kontrollerede opsoniseringens specificitet ved fuldstændig absorption af Ig-koncentratet med serotype 0 111:B4 E.coli, og man konstaterede, at denne absorption nssten tilintetgjorde hele aktivitetsforøgelsen af phagocytosen selv med en mængde på 1 mg Ig- koncentrat .

Tabellen herunder giver phagocytose K-værdier opnået i løbet af 20 minutter.

Kontrol 1000 g Ig- 1000 g Ig- 1:10 foetal koncentrat koncentrat kalveserum ikke-absorberet absorberet K 0,015 0,128 0,039

Forsøg med beskyttelse hos mus.

Man fremstillede logaritmiske fortyndinger (log^g) af en kultur af E.coli 0 111:B4 i næringsmiddelbouillon ("Difco") inde- 9 —4 -5 -6 holdende 10 bakterier/ml til fortyndinger på 10 ,10 , 10 og _7 10 i mucin på 5% (granulær mucin, type 1701-W til potentiering af virulensen af bakterier fra Wilson Laboratories, Chicago, Illinois).

Man blandede derefter 3 ml af hver fortynding med 0,6 ml forsøgsopløsning, henholdsvis med saltvandsopløsning, Ig-koncentrat, proteiner fra almindelig valle (ikke immuniserede køer). Idet man anvendte 5 mus til hver fortynding, indsprøjtede man 0,6 ml af den opnåede blanding i hver mus intraperitonealt. Forsøgsresultaterne i form af døde mus pr. 5 behandlede mus efter 48 timer er angivet i tabellen nedenfor.

DK 153521 Β τ 16

Forsøgsmateriale Antallet af døde mus/5 be handlede "inus.

Koncentration af bakterier ved behandlingen 5 x 104 5 x 103 5 x 102 5 x 101

Saltvandsopløsning 5555 1°μ *

Ig-koncentrat 5553 25μ *

Ig-koncentrat 5400 100μ

Ig-koncentrat 0000 10μ proteiner fra almindelig valle (ikke immuniserede køer) 5555 25μ proteiner fra almindelig valle 5 5 5 5 100μ proteiner fra almindelig valle 5 5 5 5 udregnet som totalproteiner indeholdende 35-45% Ig-forbindelser fra mælk.

Man så, at 100 ]ig Ig-koncentrat gav fuldstændig beskyttelse over for alle koncentrationer af bakterieprøver, medens 100 ng valleproteinér isoleret fra ikke-immuniserede køer ikke gav nogen beskyttelse.

Eksempel 7 I. En første række kliniske forsøg viste, at Ig-forbindelser fra mælk modstod proteolytisk nedbrydning til inaktive dele i tarmkanalen.

11 børn (9 drenge, 2 piger) hospitalsindlagte af forskellige grunde, men ikke lidende af gastroenteriter, og hvis alder var fra 2 uger til 1 år, madedes med mælk indeholdende et Ig-koncentrat fremstillet som i eksempel 2 eller 4 i kaloriedoser svarende til 2 g/kg legemsvægt fordelt ensartet over 24 timer. De første og sidste måltider, hvor Ig-koncentrat var inkorporeret, mærkedes med 0,2 g car-minrødt. Mindst én afføringsprøve o'psamledes førend administreringen af Ig og systematisk alle de følgende afføringer i løbet af 72 timer, idet afføringen opbevaredes ved -20°C.

Man fremstillede ekstrakter af afføringerne ved tilsætning af 2 dele afføring til 1 del saltvandsopløsning bufret med phosphat til C tr- λλλ f -»- 17

DK 153S21 B

pH 7,2 og dispergerede afføringerne ved 0°C med en glasspatel. Man omrørte herefter suspensionen i 20 minutter med en miniomrører (400 omdrejninger/minut) ved stuetemperatur. Herefter afkøledes suspensionen hurtigt til 0°C, og man centrifugerede ved denne temperatur ved 3500 x g i 15 minutter. Til sidst fjernede man omhyggeligt su-pernatanten.

Tilstedeværelsen af aktive Ig-forbindelser i afføringsekstrakten bekræftedes ved dobbelt immunodiffusion (Ouchterlony's forsøg) og ved immunoelektroforese. Antisera anvendt til disse forsøg fremstilledes ved subcutan og intravenøs injektion gentaget flere gange af 1 mg mælkeantistof eller 0,1 mg Ig G ^ på kaniner. Til Ouchter-lony's forsøg dækkedes glasplader (94 x 84 mm) med et lag af en 1% agargel i en saltvandsopløsning bufret med phosphat til pH 7,2, i hvilken gel man har udskåret hulrum med 4 mm's afstand på 9,5 mm med hullemaskinen ("LKB-Produkteur AB"), idet man anvendte et anti-proteinantiserum fra colostrum valle fra -køer og et monovalent antiserum specifikt anti-Ig fra komælk.

Til immunoelektroforesen dækkedes glaspladerne (100 x 85 mm) med 12 ml 1% agargel i 0,05Ή barbiturat bufret til pH 8,3 (10,3 g natriumbarbiturat + 0,5 g citronsyre + 0,5 g oxalsyre i 1 liter vand), og den elektroforetiske adskillelse udførtes ved stuetemperatur i løbet af 90 minutter ved 4 volt/cm. Efter diffusion af antisera (24 timer) vaskedes pladen med en saltvandsopløsning, tørredes og fremkaldtes med azocarmin B.

Man konstaterede tilstedeværelsen af mælke Ig-forbindelser i afføringerne, skønt betydelige forskelle i, hvornår de viste sig, og i varigheden af udskillelsen af Ig, ligesom en god overensstemmelse mellem, at den røde carminfarve og Ig-forbindelsen kom til syne og forsvandt.

For at bekræfte aktiviteten af Ig-mælkeforbindelserne udførte man en prøve in vivo på serobeskyttelse hos mus (som beskrevet i eksempel 6), idet man anvendte 6 afføringsekstrakter i hver række, og hvis resultater er anført i følgende tabel: 18

DK 153521 B

Ekstrakt af Intensitet af Ig Antal døde mus/ afføringer i afføringseks- 5 behandlede mus trakt efter im- Antal bakterier anvendt munoelektrofore- ved behanalingen tisk undersøgelse . , ~ ·, 5x10 5x10 5x10^ 5xlOx

Barn M.D. I 5 5 5 5 (2 uger) II 5 5 5 5 IV + + + + 2 1 0 0 V + + + + 0 0 0 0 VI + + + 1 1 0 0 IX -;- 5 5 3 4

Barn S.G. I -:- 5 5 5 5 (1 måned) III 4 5 5 5 IV + + + + 0 0 0 0 VI + + + + 0 0 0 0 X + + 3 0 10 XI + 5 2 0 0

Man konstaterede klart en korrelation mellem de positive resultater ved immunoelektroforese og beskyttelsesevnen fra det materiale, der var indeholdt i ekstrakterne fra afføringen. Specielt bestemte man koncentrationen af Ig-mælkeforbindelser fra ekstrakterne V (barn M.D.) og IV og VI (barn S G.) svarende til mindst 1 mg Ig-koncentrat.

II. I en anden.rakke kliniske forsøg undersøgte man de terapeutiske og profylaktiske egenskaber af Ig-koncentrater fremstillet som beskrevet i eksempel 2 eller 4.

Terapeutiske egenskaber.

Denne undersøgelse udførtes med børn på indtil 5 måneder, der led af godartede til heftige gastroenteriter fremkaldt af E.coli. I forskellige forsøgsrækker administrerede man i alt til 152 patienter dels 2 g koncentrat Ig/kg/dag i 5 dage, dels 1 g/kg/dag i løbet af 10 dage til deres mad. Patienterne modtog ingen medikamenter som sulfamider eller antibiotika hverken oralt eller parenteralt.

Man foretog dyrkning fra fæces dagen efter administreringen, og den sidste mellem 36 og 48 timer efter den sidste administrering af Ig-koncentrat. 43 Patienter behandledes på samme måde, men idet man erstattede Ig-koncentratet med proteiner fra valle, der kom fra ikke immuniserede køer.

Man opnåede negative dyrkninger fra fæces for 90 børn (57,7%) under behandlingen.I kontrolrækken viste kun 14 børn (27,7%) en spon-

SΛΛΛ f. IS

DK 153521 B

19 tan forsvinden af E.coli fra dyrkningen af facesprøverne. Man må hu~ ske, at naturlige proteiner,' der stammer fra valle af ikke immuniserede køer, in= deholder en ringe maigde Ig anti-E.coli. Man observerede ligeledes, at udeblivelse af heldicrt udfald -af behandlingen sås oftere i de tilfælde, hvor man anvendte høje doser i løbet af en meget kort tid.

Man undersøgte konsistensen af fæces i hvert tilfælde. Man konstaterede, at diarréen forsvandt og en følelig klinisk forbedring i et stort antal tilfælde også selv om dyrkning fra fæcesprøver forblev positive. I det tilfælde, hvor dyrkningen fra fæcesprøverne blev negative, forbedredes konsistensen fra afføringen sig hurtigere, dersom Ig-koncentratet administreredes i et mælkepulver fattig på lactose.

Profylaktiske egenskaber.

De· for tidligt fødte børn udgør en gruppe, der er ekstremt følsomme over for gastroenteriter af E.coli,og derfor valgtes denne gruppe til et klinisk profylakseforsøg.

Undersøgelsen udførtes i løbet af 6 måneder på 2 stuer med 8 kuvøser på hver stue. Man foretog fordeling af forsøg og kontroller på hver stue, således at alle patienter var udsat for samme betingelser, idet 4 kuvøser tjente som forsøg og 4 som kontrol. Hvert tilfælde varede i gennemsnit 41 dage, idet et barn fjernedes efter helbredelse og erstattedes af et andet afhængig af tilhørsforholdet (forsøg eller kontrol). Man fulgte 70 tilfælde, 36 som kontrol og 34 som forsøgsgruppe.

Forsøgsgruppen modtog Ig-koncentrat ved hver madning med mælk fordelt over 24 timer med 0,25 g/kg/dag. Man undersøgte fæcesprøver fra begyndelsen af forsøget og undersøgte fscesprøver ved dyrkning hver femte dag. Af i alt 666 dyrkede fæcesprøver udgjorde 339 kontroller og 327 forsøgsprøver. Blandt de sidstnævnte udviste 33 tilstedeværelsen af E.coli (10,1%), medens 96 ud af 339 kontrolkulturer var positive (28,3%). Dersom man kun undersøger serotype E.coli 0 119:B14 finder man den ofte forbundet med kraftige .former af gastroenteriter, og frekvensen af positive fæcesdyrkninger var 5,5% i forsøgsgruppen imod 23,3% i kontrolgruppen.

Man kan konkludere, at inkorporeringen af proteinkoncentrater indeholdende mælkespecifikke anti-E.coli Ig.til· mælken til for tidligt fødte formindsker infektionsgraden kraftigt med E.coli hos denne særligt følsomme gruppe nyfødte.

Claims (9)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af proteinkoncentrater indeholdende immunologiske faktorer fra mælk, specielt aktive ikke-denaturerede immunoglobuliner, kendetegnet ved, at man: a) opsamler nrallcen fra mælkeproducerende drøvtyggere, især køer, der er hyperimnuniserede ved vaccination, idet der successivt administreres antigener parenteralt og lokalt ca. 8 til 1-2 uger før kælvningen og peroralt i de ca. 2 uger før kælvningen og, eventuelt, en serie successive administreringer af antigen fra ca. 2\ måed før det antagne ophør af mælkesekretionen med skift mellem parenteral, lokal og peroral administrering; ovennævnte mælk består af colostrum fra 1 og 2 timer efter kælvningen, overgangsmælk fra 3-8 dage efter kælvningen og, eventuelt, mælk fra de sidste 60 dage af lactationsperioden; b) fraskiller fløden og urenhederne; c) koagulerer den-klarede og skummede mælk; d) fraskiller caseinet, filtrerer, ultrafiltrerer og steriliserer proteinet fra vallen ved filtrering; og e) inddamper og tørrer produktet under sådanne betingelser, at man ikke denaturerer immunoglobulinerne og bevarer steriliteten..

2. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at vaccinen er på basis af Escherichia coli antigener, der forårsager gastroenteriter hos nyfødte.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at koaguleringen udføres ved tilsætning af saltsyre indtil pH ca. 4,6 og opvarmning indtil 40°C.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man, for at undgå følgende tilstopning af filtre og ultrafiltre, udfører skumningen i to etaper først koldt og derefter varmt, og at skumningen og adskillelsen af caseinet følges af en tvungen klaring.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at ultrafiltreringen af vallen udføres med vask af retentatet og re-cyclisering af det vaskede retentat, således at dettes indhold af proteiner forøges.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den prekoncentrerede valle underkastes en prefiltrering efterfulgt af sterilfiltrering. DK 153521 B

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at inddampningen af den prekoncentrerede og steriliserede valle finder sted i et lukket system under sterile betingelser.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det koncentrerede produkt tørres ved frysning efterfulgt af lyo-filisering og steril konditionering.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man for at genvinde de immunoglobuliner, der er fjernet under trin b) og d), ekstraherer fløden og tykmælken med vand og forener vaskevandet med henholdsvis den skummede mælk og vallen.