NL1033696C2 - Aan melk ontleende antigeen-specifieke antilichamen, werkwijzen voor het bereiden en gebruik ervan. - Google Patents

Description

Titel: Aan melk ontleende antigeen-specifieke antilichamen, werkwijzen voor het bereiden en gebruik ervan.

De uitvinding is gerelateerd aan het gebied van antilichamen. In 5 het bijzonder is de uitvinding gerelateerd aan melk ontleende antigeen-specifieke antilichamen, werkwijzen voor het bereiden en gebruik ervan. Dergelijke gebruiken omvatten bij voorbeeld, in kindervoeding, in diagnostisch en medische gebruiken.

10 Er zijn verschillende manieren om the menselijke immuniteit te verhogen door het verschaffen van zuivelvoeding. Moedermelk en koemelk bevatten antilichamen die specifiek zijn voor een grote collectie van mogelijke pathogene micro-organismen, virussen en andere antigenen.

Deze antilichamen beschermen het kind, wat nog niet in staat is om een 15 effectieve reactie immuun op te wekken tegen infectieuze agentia waar de moeder al aan blootgesteld is. IgA is het meest voorkomende antilichaam isotype in menselijke melk, maar IgGl is het meest voorkomende isotype in koemelk. Het IgA in humane melk is algemeen bekend om het toebrengen van een effect in het darmkanaal, terwijl de 20 moeders IgG doorgeven aan de baby via de placenta voor de geboorte. De meeste herkauwers, varkens en knaagdieren transporteren actief een gedeelte van het IgG wat aanwezig is in de melk over het epitheel van het darmkanaal naar het bloed. Deze dieren hebben dus ook, net zoals mensen, antilichamen in de melk van lacterende vrouwen, in het bijzonder in de 25 eerste melk na de geboorte (colostrum), hoewel de feitelijke functie van deze antilichamen in de pasgeborene meerdere eigenschappen heeft vergeleken met antilichamen in de melk van mensen.

Omdat herkauwers melk produceren die antilichamen bevat, 30 worden de melk of daarvan afgeleidde antilichaam preparaten beschouwd als aanvullend of vervangend voor de functie van moedermelk bij mensen. Om het verzamelen van antigeen-specifieke antilichamen in de melk \ ft % % fit 9 0 - 2 - mogelijk te maken, worden herkauwers doorgaans specifiek geïmmuniseerd met het specifieke antigeen waartegen antilichamen gewenst zijn. Het antigeen is typisch een humaan pathogeen, bij voorbeeld een darmbacterie of virus en de antilichamen in de melk van deze 5 geïmmuniseerde dieren worden verzameld. De verzamelde antilichamen zijn bedoeld om te binden aan en het neutraliseren of anderszins onschadelijk maken van de humane pathogeen in het darmkanaal van individuen die de antilichamen innemen.

10 Naast melk, is colostrum een andere bron voor het isoleren van koeien antilichamen. Het colostrum van koeien is de eerste melk die geproduceerd wordt door een koe, juist voorafgaand aan en kort na de geboorte van een kalf. Colostrum bevat zeer hoge concentraties aan koeien antilichamen, tot aan 50-100 mg/ml (vergeleken met ongeveer 1 mg/ml 15 voor gewone melk). IgGl is het meest voorkomende antilichaam isotype in koeien colostrum en in melk. Zoals hierboven aangegeven, worden de immunoglubulines in colostrum door de kalveren opgenomen in het bloed om ze te beschermen tegen infecties. De antilichaam concentraties in colostrums zijn ongeveer 50-100 keer hoger dan in gewone melk. Om deze 20 reden wordt colostrum van hyper-geimmunizeerde koeien vaak gebruikt als een bron voor koeien antilichamen om diarree te behandelen en te voorkomen, waarbij in een aantal studies significante effecten gevonden zijn aangaande symptomen van diarree (Clin infect dis 1998 26: 1324-9 volwassenen; Acta pediatr. 1995 84:996-1001 kinderen; Acta paediatr.

25 2001 90 1373-8 kinderen 1-12 j; J.Pediatr.Gastroenterol Nutr 1999 29:452- 6). Sommige van deze studies zijn besproken in Indian J. Pediatr. 2005 72:849-52.

In aanvulling op het gebruik bij het voorkomen/behandelen van diarree, wordt colostrum ook gebruikt als aanvulling door atleten 30 (eur.J.Nutrition 2003 42:228-332 en Int.J.Sport Ntr.Excerc Metab 2006 16: 47-64. J. Appl Physiol 2006 93: 732-39).

-3-

In een andere studie (JT van Dissel et al J.Med.Microbiol 2005 54-197-205) wordt een 40% wei eiwit concentraat van koeien die geïmmuniseerd zijn met Clsotridium difficile gebruikt om het opnieuw voorkomen van C. difficile diarree te verhinderen - De resultaten zijn 5 voorlopig, maar er werden geen nadelige gevolgen geconstateerd die te wijten zijn aan MucoMilk (Scand J.Gasteroenterol 2000 35:711-8; N.Engl J Med 1988 318:1240-3.

Deze data laten zien dat colostrum van koeien hoge antilichaam 10 concentraties bevat en dat orale toediening van deze antilichamen in volwassenen en kinderen zonder nadelige gevolgen is, wat aangeeft dat het gebruik van koeien antilichamen in voedsel veilig is.

Voorbeeld 4 en voorbeeld 5 van EP0152270B1 geven aan dat er geen 15 serumziekte ontstaat na het innemen van koeienmelk en injectie van gezuiverd IgG in mensen. Konijnen die melk dronken voorafgaand aan de injectie met IgG produceerden geen anti-koeien IgG antilichamen. Deze voorbeelden geven nog een keer de veiligheid en inductie van orale tolerantie voor koeien IgG aan.

20

In de onderhavige uitvinding is gevonden dat antilichamen afkomstig van de melk van herkauwers de slijmvliesbarriere in het menselijke darmkanaal passeren en kunnen binden en ageren tegen een antigen dat aanwezig is aan de bloedstroomzijde ervan.

25 Zonder gebonden te worden door een theorie gelooft men dat antilichamen afkomstig van de melk van een herkauwer binden aan een Ig-receptor op de menselijke darmkanaalcellen en getransporteerd worden van de darmkanaalzijde naar de bloedstroomzijde van de slijmvliesbekleding van het darmkanaal. De meeste herkauwers, varkens en knaagdieren hebben 30 een specifieke neonatale receptor om IgG over het intestinale epitheel te transporteren. Deze receptor wordt FcRN genoemd, de Fc receptor in pasgeborenen die tot expressie komt vlak na de geboorte en ten tijde van - 4 - verspenen naar beneden gereguleerd wordt. Mensen brengen de FcrN constitutief tot expressie op het epitheel van het darmkanaal (Immunology 92: 69-74) en bidirectioneel FcRN-afhankelijk transport van human IgG over de epitheelcellen is aangetoond in mensen (j. Clin Invest 1999 5 104:903-911). FcRN komt ook tot expressie op myeloide cellen in mensen (J.Immunol. 2001 166: 3266-76).

plgR is de polymere Ig receptor. Deze receptor bindt aan de j-keten die nodig is om het dimere IgA en het pentamere IgM te vormen. Men denkt dat deze receptor daarom zowel IgA als IgM transporteert. Een 10 recente publicatie geeft aan dat transport van antigeen gecomplexeerd IgA vanuit de darmkanaalholte naar weefsels ook kan plaatsvinden (J.Gen Virol 2005 86: 2747-51). CD23, de laag affiene IgE receptor komt ook tot expressie op het epitheel van het darmkanaal, en is aangetoond een rol te spelen in de opname van voedselallergenen bij dier modellen 15 (gastroenterology 2006 131: 47-58; J.Clin Invest. 2000: 106:879-886).

De uitvinding voorziet daarom in een werkwijze voor de aflevering van een antigeen-specifiek antilichaam van een herkauwer aan de slijmvlieszijde van het darmkanaal van een individu, omvattende het 20 voorzien in een preparaat voor orale toediening omvattende genoemd antigeen-specifiek antilichaam van een herkauwer en het oraal toedienen van genoemd preparaat aan genoemd individu. Het antilichaam van herkauwers passeert het epitheel van het darmkanaal en is in staat om de slijmvliesbekleding van het darmkanaal en de bloedstroom binnen te gaan 25 en te interacteren met het antigeen waarvoor het specificiteit bezit.

Een antilichaam van herkauwers voor gebruik in het passeren van het epitheel van het darmkanaal kan afkomstig zijn van een herkauwer die daarvoor niet geïmmuniseerd is geweest voor het antigeen waarvoor 30 het antilichaam specificiteit bezit. Als alternatief kan het antilichaam van herkauwers afkomstig zijn van een herkauwer die daarvoor geïmmuniseerd is geweest voor het antigeen waarvoor het antilichaam - 5- specificiteit bezit. Hoewel antilichamen van herkauwers relatief resistent zijn tegen afbraak in het menselijke maag-darmkanaal, heeft het de voorkeur dat genoemd preparaat voor orale toediening een afgifte middel omvat, omvattende genoemd antigeen-specifiek antilichaam, waarbij 5 genoemd afgifte middel gerichte afgifte van het antilichaam vanuit het middel in het darmkanaal mogelijk maakt. Verschillende afgifte middelen zijn bekend in de stand van de techniek die specifieke afgifte van omsloten of ingesloten substanties in het maag-darmkanaal toestaan. Het heeft de voorkeur dat genoemd preparaat verder een buffer omvat voor het in 10 stand houden of bereiken van een lokale pH in het maag-darmkanaal die gunstig is voor de opname of het functioneren van het antilichaam. Bij voorkeur is genoemde buffer in staat om een pH tussen ongeveer 6-8 in de dunne darm te bereiken. In een preferentiële uitvoeringsvorm is genoemd antilichaam verkregen van de melk van een melk-afscheidende herkauwer. 15 De melk van genoemde herkauwer bevat, vergeleken bij voorbeeld met serum, een groot gehalte aan IgGl. IgGl is een van de antilichaam subtypes van herkauwers die getransporteerd worden over de menselijke slijmvliesbekleding van het darmkanaal. Omdat de antilichamen de slijmvliesbekleding passeren kunnen ze acteren voorbij de binnenkant van 20 het maag-darmkanaal. In een uitvoeringsvorm is een antilichaam van herkauwers specifiek voor een allergie antigeen. Op deze manier wordt het allergeen, tijdens de opname door het darmkanaal, gebonden in en bij voorkeur aan de bloedstroomzijde van de slijmvliesbekleding van het maag-darmkanaal, daarbij ten minste wedijverend voor binding aan 25 genoemd antigeen met humaan IgE wat specifiek is voor genoemd antigeen. In een verdere preferentiële uitvoeringsvorm is genoemd antigeen-specifiek antilichaam specifiek voor een aan voedselallergie-geassocieerd antigeen, bij voorkeur een voedselallergie-geassocieerd antigeen van soja, hazelnoot, ei, of appel. In een bijzonder preferentiële 30 uitvoeringsvorm is genoemd allergie-geassocieerd antigeen een allergie-geassocieerd pinda antigeen. In een andere uitvoeringsvorm is genoemd allergeen een inhalerings allergeen of een vergif allergeen geselecteerd uit, -6- maar niet beperkt tot, de groep van gras pollen allergenen, boom pollen allergenen, huis stofmijt allergenen, kat allergenen, schimmel of paddestoel allergenen, of vergiften van stekende insecten. Genoemde inhalerings of vergif allergenen kunnen het menselijk lichaam 5 binnenkomen via de ademhalingswegen of via een steek van een insect zoals een bij of een wesp.

In een andere preferentiële uitvoeringsvorm lijdt genoemd individu aan een autoimmuun ziekte of aan een anderszins overactief immuun systeem. In deze uitvoeringsvorm verdient het de voorkeur dat genoemd 10 antigeen-specifiek antilichaam van de herkauwer specifiek is voor een proinflammatoire cytokine of een stimulatoire signaal factor die gemaakt word door immuuncellen van het individu en die bijdragen aan het in stand houden en/of zwaarte van een symptoom van de autoimmuun ziekte of anderszins overactief immuun systeem. Dus bij voorkeur is een 15 antilichaam volgens de uitvinding specifiek voor een factor die uitgescheiden wordt door immuuncellen. In een bijzonder preferentiële uitvoeringsvorm is een antilichaam van herkauwers volgens de uitvinding specifiek voor humaan TNF-alpha of humaan IL23 antilichaam. In een preferentiële uitvoeringsvorm lijdt het genoemde individu aan een 20 chronische darmontsteking. In een verder preferentiële uitvoeringsvorm is genoemd antilichaam van herkauwers specifiek voor een antigeen van een microbe die geassocieerd is met genoemde autoimmuunziekte.

De mens mag van alle leeftijden zijn. Echter, het heeft de voorkeur dat genoemd menselijk individu minstens een jaar oud is. Bij voorkeur is 25 genoemd individu minstens twee jaar oud is. Bij voorkeur is genoemd individu minstens zes jaar oud is. In een andere preferentiële uitvoeringsvorm is genoemd individu minstens zestien jaar oud. In een verder aspect van de uitvinding is genoemd individu tussen de 6 en 24 maanden oud (typisch wanneer van vast voedsel wordt toegevoegd aan het 30 dieet). In een preferentiële uitvoeringsvorm is genoemd antilichaam van het type IgGl, IgA of een combinatie daarvan. Bij voorkeur is genoemd antilichaam van het IgGl type, of een samenstelling omvattende zowel - 7 -

IgGl en IgA die specifiek zijn voor genoemd antigeen. Een werkwijze volgens de uitvinding wordt bij voorkeur gebruikt om genoemd antilichaam toe te dienen aan de bloedstroom via het maag-darmkanaal van genoemd individu. In een bijzonder preferentiële uitvoeringsvorm 5 wordt het toedienen aan de bloedstroom gebruikt om het antilichaam aan de long toe te dienen. In deze uitvoeringsvorm heeft het de voorkeur dat het antilichaam specifiek is voor een antigeen van een viraal of bacterieel pathogeen of een antigeen van een allergie. In deze uitvoeringsvorm heeft het de voorkeur dat genoemd antilichaam specifiek is voor een allergie-10 geassocieerd gras- of boom-pollen antigeen, of elk ander antigeen wat allergische reacties veroorzaakt in mensen.

De uitvinding voorziet dus in het gebruik van een antigeen-specifiek antilichaam van een herkauwer voor de bereiding van een medicijn voor systemische behandeling van een ziekte in een niet-herkauwer. Bij 15 voorkeur is genoemde niet-herkauwer een mens. Bij voorkeur is genoemd medicijn voor orale toediening.

Een bijzonder voordeel van een antilichaam volgens de uitvinding is dat het een polyclonaal antilichaam is. Dit laat een meer robuuste 20 antigeen binding toe. Het laat verder een beperktere variatie toe tussen individuen die voorzien worden van een antilichaam volgens de uitvinding.

In een verder aspect van de uitvinding werd gevonden dat melk van een niet-menselijk zoogdier dat niet daarvoor geïmmuniseerd was voor een 25 antigeen specifiek kan reageren met genoemd antigeen. Dit gaf voor ons aan dat de melk antilichamen bevat die specifiek bonden aan het antigeen ondanks het feit dat het niet-menselijk zoogdier niet geïmmuniseerd was geweest voor genoemd antigeen. In de onderhavige uitvinding wordt dit aspect geëxploiteerd in een industriële omgeving waar grote volumes melk 30 verwerkt worden. In dit aspect voorziet de uitvinding dus in een werkwijze voor het verkrijgen van een antigeen specifiek antilichaam uit melk met het kenmerk dat de melk afkomstig is van een zoogdier dat niet - 8 - geïmmuniseerd is met genoemd antigen voorafgaand aan het verzamelen van genoemde melk. Met immunisatie voor een antigeen wordt bedoeld het toedienen van een samenstelling omvattende het antigeen en typisch een adjuvans aan een zoogdier met de bedoeling om een immuun-reactie 5 tegen genoemd antigeen, genoemd adjuvans of combinatie daarvan te verkrijgen in genoemd zoogdier. De toediening heeft betrekking op het mogelijk maken van een intensief contact tussen de componenten van de samenstelling en de immuun cellen van het zoogdier. Dergelijke toedieningen deponeren normaal gesproken de compositie binnen in het 10 zoogdier door het doorbreken van de huid barrière. Andere middelen voor het toedienen bestaan en kunnen gebruikt worden. Orale toediening van antigeen zoals, bij voorbeeld (als deel van) het voedsel van genoemd zoogdier, wordt vaak geassocieerd met het induceren van tolerantie in het zoogdier voor genoemd antigeen en wordt daarom niet beschouwd als een 15 immunisatie in de huidige uitvinding. In een preferentiële uitvoeringsvorm omvat genoemde werkwijze het verzamelen van melk van een melk-afscheidend zoogdier en het verzamelen van genoemd antilichaam uit genoemde melk. Bij voorkeur wordt melk van minstens twee afzonderlijke zoogdieren van dezelfde soort samengevoegd 20 voorafgaand aan het verzamelen van genoemd antilichaam. Op deze manier kunnen ook niet rijkelijk aanwezige antilichamen in voldoende hoeveelheden verzameld worden. Voor dit doel heeft het de voorkeur om antilichamen te verzamelen van melk van tenminste 10 en bij voorkeur tenminste 100 afzonderlijke zoogdieren van dezelfde soort. In een 25 preferentiële uitvoeringsvorm is genoemd zoogdier een herkauwer. Bij voorkeur is genoemde herkauwer een koe, bij voorkeur een lid van het genus Bos. Van het genus Bos worden de commercieel geëxploiteerde soorten geprefereerd. Bij voorkeur is genoemde herkauwer van de soort Gayal, Bos frontalis (gedomesticeerde gaur), Bos mutus (Yak) of Bos 30 taurus (gedomesticeerd rundvee). In een andere preferentiële uitvoeringsvorm is genoemde herkauwer een geit of een schaap, bij voorkeur een lid van de subfamilie Caprinae. Van deze subfamilie worden -9- de leden van de genera Ovis of Capri geprefereerd. Van het genus Ovis wordt de species Ovis aries (gedomesticeerd schaap) geprefereerd. Van het genus Capra wordt de species Cappra aegagrus hircus ( de gedomesticeerde geit) geprefereerd. In een andere preferentiële 5 uitvoeringsvorm is genoemde herkauwer een kameel, een ezel, een buffel, een paard of een lama.

Omdat melk verschillende componenten bevat, met name vetten, oliën niet-antilichaam eiwit en koolhydraten heeft het de voorkeur om de 10 melk te onderwerpen aan een aan een bewerkingsstap voorafgaand aan het verzamelen van genoemd antilichaam. In een preferentiële uitvoeringsvorm omvat de melk bewerkingstap een scheidingsstap. Bij voorkeur omvat genoemde scheidingsstap het scheiden van de melk in minstens twee delen, en waarvan minstens een deel een eiwit-rijk deel is. 15 Het verzamelen van antilichaam uit batchverwerkte melk is mogelijk, echter verdient het de voorkeur dat genoemde bewerkingsstap deel uitmaakt van een (semi)-continu bewerkingsproces. In een bijzonder geprefereerde uitvoeringsvorm wordt een wei fractie gemaakt van genoemde melk, en wordt genoemd antilichaam verzameld van genoemde 20 wei. Het zoogdier is als vermeld geselecteerd aan de hand van het criterium dat het niet daarvoor geïmmuniseerd is met genoemd antigeen. In een geprefereerde uitvoeringsvorm wordt genoemd zoogdier geselecteerd op een nader criterium voor het verzamelen van genoemde melk. Dit nader criterium kan elk criterium zijn, bij voorbeeld, tijd in de 25 melkafscheidingscyclus. In een geprefereerde uitvoeringsvorm wordt genoemd zoogdier geselecteerd op grond van het produceren van normale melk, id est niet de melk, ook wel colostrum genoemd, meteen na de geboorte. In een verder geprefereerde uitvoeringsvorm omvat genoemd nader criterium het antilichaamgehalte van de melk, antilichaam 30 specificiteit in de verzamelde melk, voedsel of voedingssupplement opname door genoemd zoogdier, vaccinatie tegen een antigeen of een - 10- pathogeen van genoemd zoogdier, of een combinatie van twee of meer van genoemde criteria.

In een geprefereerde uitvoeringsvorm is genoemd antilichaam een IgGl, IgA, IgG2 of een IgM antilichaam. Bij voorkeur wordt genoemd 5 antilichaam verzameld uit een voor antilichamen-verreikte fractie verkregen van genoemde melk. Bij voorkeur omvat genoemde werkwijze verder een stap voor het verhogen van het gehalte aan IgGl, IgA of een combinatie daarvan vergeleken met andere eiwitten die aanwezig zijn in de voor antilichamen-verreikte fractie. Bij voorkeur is de hoeveelheid B 10 β-lactoglobuline verlaagd met tenminste 50%. Dit kan bereikt worden bij voorbeeld door een specifieke hydrolyse van B-lactoglobuline, of door het verwijderen van B-lactoglobuline door scheiding op grootte of door het verwijderen door gebruik te maken van een antilichaam specifiek voor B-lactoglobuline. Dus bij voorkeur omvat een werkwijze voor het verzamelen 15 van een antilichaam volgens de uitvinding verder een stap om de hoeveelheid B-lactoglobuline te verminderen in de voor antilichamen-verreikte fractie. Een werkwijze volgens de uitvinding omvat verder bij voorkeur een affiniteitszuiveringsstap om een antilichaamfractie te verkrijgen die verreikt is voor genoemd antigeen-specifiek antilichaam. Nu 20 de mogelijkheid er is om een antigeen specifiek antilichaam te verzamelen van een grote collectie van verschillende zoogdieren van dezelfde soort, maakt dit de affiniteitszuivering van significante hoeveelheden affiniteit-gezuiverd antigeen specifiek antilichaam mogelijk, ondanks een mogelijk laag voorkomen van genoemd antilichaam in elk individueel melk monster. 25

Verder wordt voorzien in een antigeen specifiek antilichaam verkrijgbaar door een werkwijze voor het verzamelen van een antigeen specifiek antilichaam volgens de uitvinding. Bij voorkeur is genoemd antilichaam een polyclonaal antilichaam. In deze uitvoeringsvorm kan 30 genoemd antigeen specifiek antilichaam afkomstig zijn van een geïmmuniseerd niet-menselijk zoogdier of van een niet-geimmuniseerd niet-menselijk zoogdier. In een verder preferentiële uitvoeringsvorm is - 11 - genoemd antigeen een allergie antigeen, een viraal antigeen, een bacterieel antigeen of een combinatie hiervan.

De term antigeen in de context van de onderhavige uitvinding is een 5 antigeen van een mens, een pathogeen die kan infecteren en ziektes kan veroorzaken in een mens, een allergeen waartegen een mens allergisch kan worden of een combinatie hiervan. Immunisatie van een zoogdier in de context van de onderhavige uitvinding betekent dus immunisatie van genoemd zoogdier met een antigeen van een mens, een pathogeen die kan 10 infecteren en ziektes kan veroorzaken in een mens, een allergeen waartegen een mens allergisch kan worden of een combinatie hiervan. Vaccinatie van genoemd zoogdier voor een antigeen of een pathogeen van genoemd zoogdier ter behandeling van of het voorkomen van een ziekte in genoemd zoogdier wordt daarom niet beschouwd als een immunisatie in de 15 context van de onderhavige uitvinding.

De uitvinding voorziet verder in een samenstelling omvattende een antigeen specifiek antilichaam van een niet menselijk zoogdier volgens de uitvinding. Bij voorkeur omvat genoemd antigeen specifiek antilichaam 20 minder dan 1% van het totale antilichaam gehalte in genoemde samenstelling. Meer geprefereerd omvat genoemd antigeen-specifiek antilichaam minder dan 0,1% van het totale antilichaamgehalte in genoemde samenstelling. In een geprefereerde uitvoeringsvorm zijn minstens 15% van de antilichamen, meer geprefereerd minstens 25% en 25 meer geprefereerd minstens 35% en meer geprefereerd minstens 50% en meer geprefereerd minstens 60% en meer geprefereerd minstens 75% en zelfs meer geprefereerd minstens 80% van de antilichamen IgGl, IgA, of een combinatie hiervan. Bij voorkeur is genoemde samenstelling verreikt voor IgGl ten opzichte van IgA. In een ander geprefereerde 30 uitvoeringsvorm is de samenstelling verreikt voor IgA ten opzichte van IgGl.

- 12-

De uitvinding voorziet verder in een farmaceutische samenstelling omvattende een antigeen-specifiek antilichaam van een niet-menselijk zoogdier volgens de uitvinding, of een samenstelling volgens de uitvinding. Nog verder wordt voorzien in het gebruik van een antigeen-specifiek 5 antilichaam van een niet-menselijk zoogdier volgens de uitvinding, of een samenstelling volgens de uitvinding, voor de vervaardiging van een medicijn. In een geprefereerde uitvoeringsvorm wordt voorzien in het gebruik van een antigeen-specifiek antilichaam van een niet-menselijk zoogdier volgens de uitvinding, of een samenstelling volgens de uitvinding 10 voor de vervaardiging van een medicijn voor orale toediening.

In een verder aspect voorziet de utivinding in een preparaat voor orale toediening omvattende een antigeen-specifiek antilichaam van een niet-menselijk zoogdier volgens de uitvinding of een samenstelling volgens 15 de uitvinding. In een geprefereerde uitvoeringsvorm omvat het preparaat een afgifte middel omvattende genoemd antilichaam of samenstelling. Bij voorkeur maakt genoemd afgifte middel gerichte afgifte van genoemd antilichaam vanuit het middel in het darmkanaal mogelijk.

20 In nog een ander aspect voorziet de uitvinding in zuigelingenvoeding of kindervoeding omvattende een preparaat volgens een de uitvinding als hierboven genoemd. Ook wordt voorzien in zuigelingenvoeding of kindervoeding omvattende een antigeen-specifiek antilichaam van een niet-menselijk zoogdier volgens de uitvinding of een 25 samenstelling volgens de uitvinding. Ook wordt voorzien in zuigelingenvoeding of kindervoeding, waarbij minstens 0.1, meer geprefereerd minstens 1, meer geprefereerd minstens 2, meer geprefereerd minstens 5 en meer geprefereerd minstens 10 % van het eiwit gehalte van genoemde voeding antilichaam eiwit is. Bij voorkeur is tussen 5-10% van 30 het eiwit gehalte van genoemde voeding antiüchaam eiwit.

- 13-

In nog een andere uitvoeringsvorm wordt voorzien in zuigelingenvoeding of kindervoeding als hierboven weergegeven, waarbij minstens 0.001, meer geprefereerd minstens 0.01, meer geprefereerd minstens 0.1, meer geprefereerd minstens 1, meer geprefereerd minstens 5 2, meer geprefereerd minstens 5 % van het eiwit gehalte van genoemde voeding antigeen-specifiek antilichaam eiwit is. Bij voorkeur is tussen 0.01-5% van het eiwit gehalte van genoemde voeding antigeen-specifiek antilichaam eiwit van een niet-menselijk zoogdier volgens de uitvinding. Dus bij voorkeur bestaat tussen 0,0001-5% van het eiwit gehalte van 10 genoemde voeding uit een antigeen-specifiek antilichaam volgens de uitvinding, of een samenstelling volgens de uitvinding.

De uitvinding voorziet verder in een voedingssupplement of voedsel voor een niet-menselijk dier of een mens omvattende een antilichaam 15 volgens de uitvinding en/of een samenstelling volgens de uitvinding. In deze uitvoeringsvorm kan genoemd antigeen-specifiek antilichaam afkomstig zijn van een geïmmuniseerd niet-menselijk zoogdier of van een niet-geimmuniseerd niet-menselijk zoogdier.

Een antilichaam van een geïmmuniseerd of niet-geimmuniseerd 20 niet-menselijk zoogdier is bij voorkeur specifiek voor een allergeen antigen, een menselijke groeifactor, een menselijk antigeen, een virus van de luchtwegen, een bacterium van de luchtwegen, een parasiet, of een ander relevant aan ziektes-gerelateerd antigeen. In een geprefereerde uitvoeringsvorm is genoemd antilichaam afkomstig van een 25 geïmmuniseerd niet-menselijk zoogdier.

Een koeien en/of een niet-menselijk zoogdieren antilichaam volgens de uitvinding kan oraal toegediend worden als een voedsel product of neutraceutical, een drank, een capsule, of een ingesloten antilichaam-bevattend preparaat. Een koeien en/of een niet-menselijk zoogdieren 30 antilichaam van een niet-geimmuniseerde of van een geïmmuniseerde koe en/of niet-menselijk zoogdier kan ook toegediend worden via andere routes - 14- zoals intramusculaire injectie, intraveneuze toediening, of via de rectum of vagina.

Een oraal toegediend koeien en/of een niet-menselijk zoogdieren 5 antilichaam preparaat kan als een vloeistof samengesteld worden zoals een waterige oplossing, melk, yoghurt, of als een gevriesdroogd eiwit preparaat, of ingesloten om het antilichaam te beschermen in de maag. Bij voorkeur wordt een dergelijk antilichaam toegevoegd aan een kindervoeding of een melkproduct wat bedoeld is voor menselijke 10 consumptie. In een andere geprefereerde uitvoeringsvorm van de uitvinding is genoemd antilichaam ingesloten, gecombineerd met een drager, met een probiotische bacterie, of met een prebiotische (b.v. galactooligosaccharides).

15 Verder wordt voorzien in een nutraceutical bevattende een antigeen-specifiek antilichaam van een niet-menselijk zoogdier volgens de uitvinding, of een samenstelling volgens de uitvinding. Genoemde nutraceutical kan elke vorm aannemen die geschikt is voor orale consumptie. Bij voorkeur is genoemde nutraceutical een capsule, 20 ingesloten eiwit, of vloeibare oplossing. De nutraceutical is bedoeld om symptomen van een actieve ziekte te voorkomen, behandelen, of minstens deels te verlichten. Bij voorkeur is genoemde ziekte voedselallergie (voedsel allergeen-specifieke antilichamen; pinda, soja, hazelnoot, ei, appel, etc), chronische darmontsteking (TNF-alpha of IL-23 specifieke 25 antilichamen) pollen allergie (gras- en bomen pollen-specifieke antilichamen), andere inhalerings allergien (huisstof mijt, kat, schimmel etc) of vergif allergien.

30 - 15 -

Voorbeelden:

Voorbeeld 1.

5 Effect van uit melk-afkomstige antilichamen van niet· geïmmuniseerde koeien op de aanhechting van bacteriën aan menselijk epitheel. De menselijke dunne darm-epitheliale cellijn Caco-2 als ook de menselijke mucine-producerende dikke darm epitheliale cellijn (HT29-MTX) werd gekweekt in Transwell platen en toegestaan om te 10 differentiëren naar één-cellagen gedurende een kweekperiode van 15-21 dagen. De integriteit van de één-cellaag werd elke week gemeten door het meten van de trans-epitheliale electrische weerstand (TEER) voorafgaand aan het gebruik in aanhechtings proeven. Radioactief gemarkeerde bacteriën (twee pathogene bacteriën: enteropathogen Escherichia coli en 15 Salmonella typhimurium, als mede Lacotobacillus casei als een probiotische stam) werden geincubeerd met de epitheliale cellen in een van te voren bepaalde hoeveelheid van microorganismes ten opzichte van epitheliale cellen (b.v. 10:1, 100:1, en 500:1) voor een bepaalde tijdsperiode en de niet-gebonden microorganismes worden weggewassen.

20 Aanhechtende bacteria worden gekwantificeerd door d.p.m. (desintegraties per minuut) telling. Het experiment wordt uitgevoerd in de aanwezigheid en afwezigheid van een koeien antilichaam preparaat bij (overeenkomstig met 464 ug/ml en 46,4 ug/ml IgGl). De aanhechting van de bacteriën aan Caco-2 en HT29-MTX is verminderd door het antilichaam preparaat.

25

Voorbeeld 2.

Pathogeen-specifieke antilichaam hoeveelheden aanwezig in van melk-afkomstige antilichaam preparaten.

Sandwich ELISAs om de E.coli-specifieke, Salmonella-specifieke, en 30 Clostridium-specifieke antilichamen te bepalen worden gebruikt om de hoeveelheden bacterie-specifieke IgGl, IgM, en IgA te bepalen in een preparaat bevattende koeien antilichamen. 96 wells ELISA platen worden - 16- afgedekt met 100 μ L door hitte afgedode bacteriën (E.coli, Salmonella, Clostridium) in PBS. De platen worden overnacht geincubeerd bij 4 °C in een vochtige omgeving. De platen worden drie keer gewassen met 200 ul wasbuffer per well (PBS+0.05% Tween-20) en geblokkeerd voor 1 uur bij 5 37 °C in een vochtige omgeving met 200 μ L blokkeringsbuffer per well (= wasbuffer + 1% gelatine). Na deze incubatie worden de platen drie keer gewassen met 200 ul wasbuffer per well (PBS+0.05% Tween-20) en wordt 100 μ L/well koeien antilichaam bevattend monster toegevoegd wat verdund is in blokkeringsbuffer.

10 Na een 1-urige incubatie bij 37 °C in een vochtige omgeving, worden de platen drie keer gewassen met 200 ul wasbuffer per well, en wordt 100 μ L anti-bovine IgGl-HRP (AbD Serotec, cat#AAI21P) 1:50.000 verdund in blokkeringsbuffer toegevoegd per well om bacterie-specifïeke IgGl te detecteren. Voor detectie van IgA wordt 100 μ L anti-bovine IgA-HRP 15 (AbD Serotec, cat#AAI20P) 1:50.000 verdund in blokkeringsbuffer, en voor detectie van koeien IgM wordt 100 μ L anti-bovine IgM-HRP (AbD Serotec, cat#AAI19P) 1:50.000 verdund in blokkeringsbuffer gebruikt.

De platen worden 1 uur bij 37 ‘C in een vochtige omgeving geincubeerd, drie keer gewassen met 200 ul wasbuffer per well, gevolgd 20 door een vierde was met PBS, en 100 μ 1TMB substraat wordt toegevoegd aan elk van de wells (100 μ L TMB in 10 mL substraat buffer beide van Biosource Int. Cat# 45.011.03 en 45.014.01).

De kleurreactie wordt gestopt door het toevoegen van 100 μ L/well van 1 M H2S04, en de platen worden uitgelezen bij een golflengte van 450 25 nm. Deze data demonstreren de aanwezigheid van bacterie-specifieke antilichamen in een preparaat van koeien antilichamen van niet geïmmuniseerde.

Voorbeeld 3.

30 Allergeen-specifieke IgGl, IgA, or IgM antilichamen in van melk- afkomstige antilichaam preparaten.

- 17 -

Sandwich ELISAs om de gras allergeen-specifieke antilichamen te bepalen worden gebruikt om de hoeveelheden gras allergeen-specifieke IgGl, IgM, en IgA te quantificeren in een preparaat bevattende koeien antilichamen. 96 wells ELISA platen worden afgedekt met 100 μ L gras 5 pollen allergeen extract (een mengsel van verschillende grassen afkomstig uit gematigde luchtsteken, ALK-Abello, Horsholm, Denemarken) in PBS. De platen worden overnacht geincubeerd bij 4 °C in een vochtige omgeving. De platen worden drie keer gewassen met 200 ul wasbuffer per well (PBS+0.05% Tween-20) en geblokkeerd voor 1 uur bij 37 °C in een vochtige 10 omgeving met 200 μ L blokkeringsbuffer per well (= wasbuffer + 1% gelatine). Na deze incubatie worden de platen drie keer gewassen met 200 ul wasbuffer per well (PBS+0.05% Tween-20) en wordt 100 μ L/well koeien antilichaam bevattend monster toegevoegd wat verdund is in blokkeringsbuffer.

15 Na een 1-urige incubatie bij 37 °C in een vochtige omgeving, worden de platen drie keer gewassen met 200 ul wasbuffer per well, en wordt 100 μ L anti-bovine IgGl-HRP (AbD Serotec, cat#AAl21P) 1:50.000 verdund in blokkeringsbuffer toegevoegd per well om bacterie-specifieke IgGl te detecteren. Voor detectie van IgA wordt 100 μ L anti-bovine IgA-HRP 20 (AbD Serotec, cat#AAI20P) 1:50.000 verdund in blokkeringsbuffer, en voor detectie van koeien IgM wordt 100 μ L anti-bovine IgM-HRP (AbD Serotec, cat#AAI19P) 1:50.000 verdund in blokkeringsbuffer gebruikt.

De platen worden 1 uur bij 37 °C in een vochtige omgeving geincubeerd, drie keer gewassen met 200 ul wasbuffer per well, gevolgd 25 door een vierde was met PBS, en 100 μ 1TMB substraat wordt toegevoegd aan elk van de wells (100 μ L TMB in 10 mL substraat buffer beide van Biosource Int. Cat# 45.011.03 en 45.014.01).

De kleurreactie wordt gestopt door het toevoegen van 100 μ L/well van 1 M H2S04, en de platen worden uitgelezen bij een golflengte van 450 30 nm. De aanwezigheid van gras allergeen-specifieke koeien IgGl, IgA, en IgM is dus aangetoond in een preparaat van koeien antilichamen van niet-geimmuniseerde koeien, wat suggereert dat het eten van gras een - 18- allergeen-specifieke antilichaam reactie induceert in herkauwers. Dit geeft aan dat het voeren van mogelijke voedselallergenen aan herkauwers een mogelijke manier is om (voedsel)allergeen-specifieke antilichaam reacties in melk te induceren zonder de noodzaak om genoemde herkauwers te 5 vaccineren.

Voorbeeld 4.

Koeien melk-afkomstige IgGl antilichamen specifiek voor gras 10 aller genen verhinderen de binding van IgE-allergeen complexen aan CD23, de laag affiene IgE receptor en verhinderen histamine afgifte door basofielen. Als allergeen extracten vooraf gecomplexeerd worden met menselijke IgE antilichamen die specifiek zijn voor deze allergenen kunnen deze complexen binden aan de laag affiene IgE receptor CD23 (die 15 tot expressie komt op B cellen, monocyten en dentritische cellen) en aan de hoog affiene IgE receptor die aanwezig is op basofielen en mestcellen. Dit leidt vervolgens tot een zeer efficiënte allergeen presentatie aan Th2 cellen wat leidt tot een verlengde allergene reactie als ook tot degranulatie van basofielen en mestcellen. Het is mogelijk om deze antigeen presentatie te 20 verhinderen als ook de afgifte van inflammatoire intermediairen door de basofielen en mestcellen door het introduceren van een allergeen-specifiek blokkerend antilichaam van een klasse die verschilt van IgE, bij voorkeur een IgG antilichaam.

De binding van gras pollen allergeen-IgE complex aan CD23 wordt 25 onderzocht op de volgende manier. Een seriele verdunning van gras pollen allergeen extract (een mengsel van verschillende grassen afkomstig uit gematigde luchtsteken, ALK-Abello, Horsholm, Denemarken) wordt gemaakt in de afwezigheid of aanwezigheid van een koeien antiüchaam preparaat wat gras pollen allergeen-specifieke IgGl antilichamen bevat in 30 een volume van 20 ul FACS buffer (PBS, 0,1% BSA, 0,05% NaN3) in 4 ml FACS buizen. Na een incubatie van 30 minuten bij 37 °C, wordt 30 uL patiënten serum bevattende gras pollen allergeen-specifieke IgE

- 19- toegevoegd en het serum en het allergeen wordt toegestaan om allergeen-IgE complexen te vormen voor 1 uur bij 37 °C in een vochtige omgeving.

Na deze incubatie worden 50.000 EBV-getransformeerde B cellen toegevoegd die grote hoeveelheden van CD23, de laag affiene IgE receptor 5 tot expressie brengen en de cellen worden 1 uur geincubeerd bij 4 °C, waarbij de IgE-allergeen complexen toegestaan worden te binden aan CD23. Na deze incubatie periode worden de cellen gewassen met 4 ml FACS buffer en gecentrifugeerd voor 5 minuten bij 1500 RPM. Na het wassen wordt 50 uL van met FITC-geconjugeerd antilichaam tegen IgE 10 (een geit anti-humaan polyklonaal antilichaam; Kirkegaard & Perry

Laboratories) toegevoegd aan de cellen in aanwezigheid van 5% normaal geiten serum om niet-specifieke binding van het FITC gelabelde anti-IgE antiserum te verhinderen. De buizen worden voor een half uur geincubeerd bij 4 °C, cellen worden gewassen met 4 mL FACS buffer en 15 gecentrifugeerd voor 5 minuten bij 1500 RPM. 200 μ L FACS buffer wordt toegevoegd per buis en de buizen worden direct gemeten met een FACSCalibur flowcytometer. 10.000 gebeurtenissen worden geregistreerd.

De binding van gras pollen allergeen-specifiek IgE aan CD23 wat op een EBV-getransformeerde B cellijn tot expressie komt wordt dus 20 aangetoond in de aanwezigheid van beperkte hoeveelheden gras allergeen. Deze binding wordt verminderd door het toevoegen van een uit koeien melk-afkomstig preparaat wat gras pollen allergeen-specifieke IgGl antilichamen bevat.

25 Op een zelfde wijze werd in een histamine afgifte experiment met menselijke basofielen uit perifeer bloed van gras pollen allergie patiënten aangetoond dat histamine afgifte door de basofielen verhinderd is in de aanwezigheid van een koeien melk-afkomstig preparaat wat gras pollen allergeen-specifieke IgGl antilichamen bevat. In dit experiment worden 30 menselijke mononucleaire cellen uit perifeer bloed (PBMC) geïsoleerd uit gehepariniseerd bloed van een gras pollen allergie patient door dichtheidscentrifugatie. De PBMC worden verzameld en geincubeerd met - 20- een seriele verdunning van gras pollen allergenen die voor-geincubeerd werden gedurende 30 minuten bij 37 °C met of zonder een koeien melk-afkomstig preparaat wat gras pollen allergeen-specifieke IgGl antilichamen bevat. De PBMC worden 30 minuten bij 37 °C geincubeerd, 5 waarna de bovenstaande vloeistof verwijderd wordt om te hoeveelheid histamine die afgegeven is te bepalen met een commerciële histamine bepalings kit. Op deze manier wordt aangetoond dat de afgifte van histamine door menselijke basofielen verminderd is door de aanwezigheid van koeien gras pollen allergeen-specifieke IgGl antilichamen.

10

Voorbeeld 5.

Transport van koeien IgGl (en IgM, IgA) over één-cellagen van de dunne darm-epitheliale cellijn Caco-2. De humane dunne darm-epitheliale 15 cellijn Caco-2 werd gekweekt in Transwell platen en toegestaan om te differentiëren naar één-cellagen gedurende een kweekperiode van 15-21 dagen. De integriteit van de één-cellaag werd elke week gemeten door het meten van de trans-epitheliale electrische weerstand (TEER) voorafgaand aan het gebruik in transport proeven. Om transport van koeien 20 antilichamen te meten, werd een preparaat bevattende koeien antilichamen (zie voorbeeld 1) toegevoegd aan de Caco-2 één-cellagen en monsters werden genomen op verschillende tijdspunten om het transport van de koeien antilichamen te meten. Dit experiment werd uitgevoerd in de afwezigheid en aanwezigheid van een induceerder van paracellulair 25 transport (natrium caprate) of een remmer van transcellulair transport (een 8 urige voorbehandeling van de cellen met actinomycine D). Daarbovenop wordt een FITC-gelabeld dextraan gebruikt als een additionele controle in alle wells om het paracellulaire transport van kleine moleculen te visualiseren. De antilichaam hoeveelheden die 30 getransporteerd worden over de Caco-2 één-cellaag wordt gemeten met een sandwich ELISA die ontwikkeld is voor het meten van het totaal aan IgGl, IgM, en IgA antilichamen gelijk aan de ELISAs die beschreven zijn - 21- in de vorige voorbeelden. In het kort, 96 wells ELISA platen worden afgedekt met 100 μ L schapen anti-koeien IgG 1:800 verdund in PBS (als IgG vanger antilichaam-Bethyl Cat # A10-118A-8) in PBS, 100 μ L schapen anti-koeien IgA verdund in PBS per well (IgA vanger 5 antilichaam-Bethyl Cat # A10-121A-8), of 100 μ L schapen anti-koeien IgM verdund in PBS (IgM vanger antilichaam-Bethyl Cat# A10-101A-8). De platen worden overnacht geincubeerd bij 4 °C in een vochtige omgeving. Volgend op deze incubatie worden de platen drie keer gewassen met 200 ul wasbuffer per well (PBS+0.05% Tween-20) en geblokkeerd voor 1 uur bij 10 37 °C in een vochtige omgeving met 200 μ L blokkeringsbuffer per well (= wasbuffer + 1% gelatine). De platen worden drie keer gewassen met 200 ul wasbuffer per well (PBS+0.05% Tween-20) en 100 μ L/well koeien antilichaam bevattend monster verdund in blokkeringsbuffer wordt toegevoegd.

15 Na een 1-urige incubatie bij 37 °C in een vochtige omgeving, worden de platen drie keer gewassen met 200 ul wasbuffer per well, en wordt 100 μ L anti-bovine IgGl-HRP (AbD Serotec, cat#AAI2lP) 1:50.000 verdund in blokkeringsbuffer toegevoegd per well om bovine-specifieke IgGl te detecteren. Voor detectie van IgA wordt 100 μ L anti-bovine IgA-HRP 20 (AbD Serotec, cat#AAl20P) 1:50.000 verdund in blokkeringsbuffer, en voor detectie van koeien IgM wordt 100 μ L anti-bovine IgM-HRP (AbD Serotec, cat#AAI19P) 1:50.000 verdund in blokkeringsbuffer gebruikt.

De platen worden 1 uur bij 37 °C in een vochtige omgeving geincubeerd, drie keer gewassen met 200 ul wasbuffer per well, gevolgd 25 door een vierde was met PBS, en 100 μ 1TMB substraat wordt toegevoegd aan elk van de wells (100 μ L TMB in 10 mL substraat buffer beide van Biosource Int. Cat# 45.011.03 en 45.014.01). De totale hoeveelheden aan koeien antilichamen die aanwezig is in de monsters wordt gekwantificeerd tegen een standaard curve van een standaard koeien serum bevattende 30 koeien IgGl, IgA, en IgM (Bethyl Cat # RS10-103).

Het transport van koeien antilichamen over de Caco-2 één-cellaag is dus aangetoond. Daarbovenop, vermindering van het transport door - 22- voorbehandeling met actinomycine-D , en versterking van het transport door het toevoegen van natrium capraat, een induceerder van paracellulair transport, geven aan dat koeien antilichamen actief over het menselijke dunne darm epitheel getransporteerd worden.

5

Voorbeeld 6.

Opname van koeien IgGl (en IgA) antilichamen in het menselijk bloed.

Een groep van zes gezonde menselijke volwassen vrijwilligers werd 10 geselecteerd die een hoeveelheid van 100 ml/dag ontvangen van een commercieel verkrijgbaar preparaat van koeien colostrum voor drie opeenvolgende dagen. Koeien colostrums bevatten bij benadering 50 mg/ml aan koeien antilichamen, en een portie van 100 ml bevat dus ongeveer 5 gram aan koeien antilichaam. Een bloedmonster wordt 15 genomen voor de eerste inname van colostrums, en aan het einde van de studie periode. In deze bloedmonsters wordt de hoeveelheid koeien antilichamen gemeten gebruik makend van ELISAs die de aanwezigheid van koeien IgGl, IgM, of IgA antilichamen bepalen.

96 wells ELISA platen worden afgedekt met 100 μ L schapen anti-20 koeien IgG 1:800 verdund in PBS (als IgG vanger antilichaam-Bethyl Cat # A10-118A-8) in PBS, 100 μ L schapen anti-koeien IgA verdund in PBS per well (IgA vanger antilichaam-Bethyl Cat # A10-121A-8), of 100 μ L schapen anti-koeien IgM verdund in PBS (IgM vanger antilichaam-Bethyl Cat # A10-101A-8). De platen worden overnacht geincubeerd bij 4 °C in 25 een vochtige omgeving. Volgend op deze incubatie worden de platen drie keer gewassen met 200 ul wasbuffer per well (PBS+0.05% Tween-20) en geblokkeerd voor 1 uur bij 37 °C in een vochtige omgeving met 200 μ L blokkeringsbuffer per well (= wasbuffer + 1% gelatine). De platen worden drie keer gewassen met 200 ul wasbuffer per well (PBS+0.05% Tween-20) 30 en 100 μ L/well koeien antilichaam bevattend monster verdund in blokkeringsbuffer wordt toegevoegd.

- 23-

Na een 1-urige incubatie bij 37 °C in een vochtige omgeving, worden de platen drie keer gewassen met 200 ul wasbuffer per well, en wordt 100 μ L anti-bovine IgGl-HRP (AbD Serotec, cat#AAI21P) 1:50.000 verdund in blokkeringsbuffer toegevoegd per well om bovine-specifieke IgGl te 5 detecteren. Voor detectie van IgA wordt 100 μ L anti-bovine IgA-HRP

(AbD Serotec, cat#AAI20P) 1:50.000 verdund in blokkeringsbuffer, en voor detectie van koeien IgM wordt 100 μ L anti-bovine IgM-HRP (AbD Serotec, cat#AAI19P) 1:50.000 verdund in blokkeringsbuffer gebruikt.

De platen worden 1 uur bij 37 °C in een vochtige omgeving 10 geincubeerd, drie keer gewassen met 200 ul wasbuffer per well, gevolgd door een vierde was met PBS, en 100 μ 1TMB substraat wordt toegevoegd aan elk van de wells (100 μ L TMB in 10 mL substraat buffer beide van Biosource Int. Cat# 45.011.03 en 45.014.01). De totale hoeveelheden aan koeien antilichamen die aanwezig is in de monsters wordt gekwantificeerd 15 tegen een standaard curve van een standaard koeien serum bevattende koeien IgGl, IgA, en IgM (Bethyl Cat # RS10-103).

In dit experiment wordt getoond dat koeien antilichamen inderdaad gedetecteerd kunnen worden in het perifere bloed van vrijwilligers die koeien colostrum ingenomen hebben, wat aantoont dat koeien 20 antilichamen de menselijke bloedstroom kunnen binnen gaan.

Voorbeeld 7.

Voedsel aller geen-specifieke koeien IgG antilichamen kunnen allergische reacties voorkomen bij inname van voedsel allegenen.

25 Koeien worden geïmmuniseerd meteen pinda eiwit extract totdat voldoende hoge gehaltes aan pinda-specifieke anitlichamen gedetecteerd worden in de melk van de koeien. De melk wordt verzameld, antilichamen worden geïsoleerd en gezuiverd ofwel van de wei na het bereiden van kaas of direct van de melk - indien mogelijk zonder verhitting van de melk.

30 Pinda allergie patiënten worden geselecteerd en verdeeld in twee groepen. Beide groepen ondergaan een dubbel blind, placebo gecontroleerde voedsel test om een drempelwaarde voor de pinda -24- gevoeligheid te bepalen. Deze drempel wordt gedefinieerd als de hoeveelheid ingenomen pinda die allergische symptomen induceert in de patient. Volgend op deze test wordt een groep op een dieet geplaatst bevattende een antilichaam preparaat van met pinda geïmmuniseerde 5 koeien, en aan de andere controle groep wordt een dieet gegeven bevattende een controle antilichaam preparaat (niet-geïmmuniseerde koeien). Na een periode van drie weken tot drie maanden op het dieet ondergaan alle patiënten een dubbel blind, placebo gecontroleerde voedsel test om hun pinda drempel te bepalen.

10 Op beide tijdspunten worden bloedmonsters verzameld om de hoeveelheid aan koeien antilichamen te bepalen (zowel pinda-specifiek als totale koeien antilichaam gehaltes). Deze antilichaam gehaltes worden gedetecteerd gebruik makend van de ELISAs beschreven in voorbeeld 6 (voor totale antilichaam gehaltes) en de ELISAs beschreven in voorbeeld 3, 15 met de verandering dat de in plaats van met gras pollen allergeen extract een pinda allergeen extract gebruikt wordt om de oppervlakte van de ELISA platen af te dekken.

De resultaten van deze studie geven aan dat de inname van pinda allergeen-specifieke koeien antilichamen de hoeveelheid pinda allergeen 20 doet verhogen die een patient kan verdragen, en suggereert dat orale toediening van koeien allergeen-specifieke antilichamen een goede manier kan zijn om allergen reacties in allergische patiënten te verminderen.

Daar bovenop laat de studie zien dat antigeen-specifieke koeien antilichamen (pinda-specifieke antilichamen in dit geval) op genomen 25 worden in het bloed van voedsel allergie patiënten, wat suggereert dat het mogelijk is een koeien, antigeen-specifiek antilichaam systemisch af te geven aan een menselijk individu.

105 36 96

Claims (48)

1. Werkwijze voor het verkrijgen van een antigeen-specifiek antilichaam uit melk, met het kenmerk dat de melk afkomstig is 5 van een zoogdier niet zijnde een mens, dat niet geïmmuniseerd is met genoemd antigeen voorafgaand aan het verzamelen van genoemde melk.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, omvattende het verzamelen van melk van een melk-afscheidend zoogdier en het verzamelen van 10 genoemd antilichaam uit genoemde melk.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of conclusie 2, waarbij melk van minstens twee afzonderlijke zoogdieren van dezelfde soort samengevoegd wordt voorafgaand aan het verzamelen van genoemd antilichaam.

4. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-3, waarbij genoemde melk onderworpen wordt aan een bewerkingsstap voorafgaand aan het verzamelen van genoemd antilichaam.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, waarbij de melk bewerkingstap een scheidingsstap omvat.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, waarbij genoemde scheidingsstap het scheiden van de melk in minstens twee delen omvat, en waarvan minstens een deel een eiwit-rijk deel is.

7. Werkwijze volgens een van de conclusies 4-6, waarbij genoemde bewerkingsstap deel uitmaakt van een (semi)-continu 25 bewerkingsproces.

8. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-7, waarbij een wei fractie gemaakt wordt van genoemde melk, en genoemd antilichaam verzameld wordt van genoemde wei.

9. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-8, waarbij genoemd 30 zoogdier geselecteerd is op een nader criterium voor het verzamelen van genoemde melk. 1 033696 - 26-

10. Werkwijze volgens conclusie 9, waarbij genoemd nader criterium het antilichaamgehalte van de melk, antilichaam specificiteit in de verzamelde melk, voedsel of voedingssupplement opname door genoemd zoogdier, vaccinatie tegen een antigen of een 5 pathogeen van genoemd zoogdier omvat, of een combinatie van twee of meer van genoemde criteria.

11. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-10, waarbij genoemd zoogdier een herkauwer is.

12. Werkwijze volgens conclusie 11, waarbij genoemde herkauwer 10 een koe, een geit of een schaap is.

13. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-12, waarbij genoemd antilichaam een IgGl, IgA, IgG2 of een IgM antilichaam is.

14. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-13, waarbij genoemd antigeen een allergie antigeen, een viraal antigeen, een 15 bacterieel antigeen, of een combinatie hiervan is.

15. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-14, waarbij een voor antilichamen verreikte fractie verzameld wordt van genoemde melk.

16. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-15, verder 20 omvattende een stap voor het specifiek verzamelen van IgGl, IgA of een combinatie hiervan.

17. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-16, verder omvattende een affiniteitszuiveringsstap om een antilichaamfractie te verkrijgen die verreikt is voor genoemd 25 antigeen-specifiek antilichaam.

18. Een antigeen-specifiek antilichaam verkrijgbaar met een werkwijze volgens een van de conclusies 1-17, bij voorkeur een polyclonaal antigeen-specifiek antilichaam.

19. Een samenstelling omvattende een antilichaam volgens 30 conclusie 18, waarbij genoemd antigeen-specifiek antilichaam minder dan 0,1% van het totale antilichaamgehalte in genoemde samenstelling omvat. 1 03 3 6 96 - 27-

20. Een samenstelling volgens conclusie 16, waarbij minstens 15% van de antilichamen IgGl, IgA, of een combinatie hiervan zijn.

21. Een samenstelling volgens conclusie 19 of conclusie 20, welke verreikt is voor IgGl.

22. Een farmaceutische samenstelling omvattende een antilichaam volgens conclusie 18, of een samenstelling volgens een van de conclusies 19-21.

23. Het gebruik van een antilichaam volgens conclusie 18 of een samenstelling volgens een van de conclusies 19-21 voor de 10 vervaardiging van een medicijn.

24. Het gebruik van een antilichaam volgens conclusie 18 of een samenstelling volgens een van de conclusies 19-21 voor de vervaardiging van een medicijn voor orale toediening.

25. Een preparaat voor orale toediening omvattende een antilichaam 15 volgens conclusie 18 of een samenstelling volgens een van de conclusies 19-21.

26. Een preparaat volgens conclusie 25, omvattende een afgifte middel omvattende genoemd antilichaam of samenstelling.

27. Een preparaat volgens conclusie 26, waarbij genoemd afgifte 20 middel gerichte afgifte van het antilichaam vanuit het middel in het darmkanaal mogelijk maakt.

28. Zuigelingenvoeding of kindervoeding omvattende een preparaat volgens een van de conclusies 25-27.

29. Zuigelingenvoeding of kindervoeding omvattende een 25 antilichaam volgens conclusie 18 of een samenstelling volgens een van de conclusies 19-21.

30. Zuigelingenvoeding of kindervoeding, waarbij minstens 0,1% van het totale eiwit in genoemde voeding bestaat uit antilichaam eiwit.

31. Zuigelingenvoeding of kindervoeding volgens conclusie 30, waarbij minstens 0,1% van het totale eiwitgehalte in genoemde 1 033 6 96 -28- voeding bestaat uit een antilichaam volgens conclusie 18 of een samenstelling volgens een van de conclusies 19-21.

32. Werkwijze voor het afgeven van een antigeen-specifiek antilichaam afkomstig van een herkauwer aan de slijmvlieszijde 5 van het darmkanaal van een individu, omvattende het voorzien in een preparaat voor orale toediening omvattende genoemd antigeen-specifiek antilichaam afkomstig van een herkauwer, en het oraal toedienen van genoemd preparaat aan genoemd individu.

33. Werkwijze volgens conclusie 32, waarbij genoemd preparaat voor orale toediening een afgifte middel omvat, omvattende genoemd antigeen-specifiek antilichaam, waarbij genoemd afgifte middel gerichte afgifte van het antilichaam vanuit genoemd middel in het darmkanaal mogelijk maakt.

34. Werkwijze volgens conclusie 32 of conclusie 33, waarbij genoemd antilichaam verkregen is uit de melk van een melk-afscheidende herkauwer.

35. Werkwijze volgens een van de conclusies 32-34, waarbij genoemd antilichaam specifiek is voor een allergie antigeen.

36. Werkwijze volgens een van de conclusies 32-35, waarbij genoemd individu lijdt aan een autoimmuun ziekte of aan een anderszins overactief immuun systeem.

37. Werkwijze volgens een van de conclusies 32-36, waarbij genoemd individu lijdt aan een chronische darmontsteking.

38. Werkwijze volgens conclusie 36, waarbij genoemd antilichaam specifiek is voor een antigeen van een microbe die geassocieerd is met genoemde autoimmuun ziekte.

39. Werkwijze volgens conclusie 36, waarbij genoemd antilichaam specifiek is voor een factor die uitgescheiden wordt door 30 immuuncellen.

40. Werkwijze volgens conclusie 39, waarbij genoemd antilichaam een anti-TNF-alpha of een anti IL23 antilichaam is. 1033696 - 29-

41. Werkwijze volgens een van de conclusies 32-40, waarbij genoemd individu minstens een jaar oud is.

42. Werkwijze volgens conclusie 41, waarbij genoemd individu minstens twee jaar oud is.

43. Werkwijze volgens een van de conclusies 32-42, waarbij genoemd antilichaam van het type IgGl, IgA of een combinatie hiervan is.

44. Werkwijze volgens een van de conclusies 32-43, waarbij genoemd antilichaam toegediend wordt aan de bloedstroom via het maag-darmkanaal.

45. Werkwijze volgens een van de conclusies 32-36, 38-44, voor het toedienen van genoemd antilichaam aan de long.

46. Gebruik van een antigeen-specifiek antilichaam van een herkauwer voor de bereiding van een medicijn voor systemische behandeling van een ziekte in een niet-herkauwer.

47. Gebruik volgens conclusie 46, waarbij genoemde niet-herkauwer een mens is.

48. Gebruik volgens conclusie 46 of conclusie 47, waarbij genoemd medicijn voor orale toediening is. 1 033696