FI110752B - Menetelmä ternimaidon käsittelemiseksi - Google Patents

Description

110752

Menetelmä ternimaidon käsittelemiseksi

Keksinnön ala

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää ternimaidon bioaktiivisten 5 ainesosien ottamiseksi talteen. Tarkemmin määriteltynä esillä oleva keksintö koskee menetelmää ternimaidon käsittelemiseksi, niin että pienennetään ternimaidon biologista kuormitusta säilyttäen samalla suuri aktiivisen proteiinin pitoisuus, jolloin ternimaito kerätään, siitä poistetaan rasva, se mikrosuodate-taan ja suodos otetaan talteen. Keksintö koskee myös mainitulla menetelmällä 10 käsiteltyä ternimaitoa ja sen käyttöä.

Keksinnön tausta

Heti poikimisen jälkeen erittyvää maitoa kutsutaan ternimaidoksi. Tämä nimenomainen maito sisältää noin 20 kertaa enemmän proteiinia kuin myöhemmin erittyvä maito. Ternimaito on siksi monien arvokkaiden proteiini-15 en, kuten biologisesti aktiivisten proteiinien, kuten kasvutekijöiden ja erityisesti immunoglobuliinien, erinomainen lähde. Ternimaitoa voidaan siksi käyttää mainittujen arvokkaiden proteiinien lähteenä esimerkiksi elintarvike- tai kliinisissä valmisteissa. Ternimaito on kuitenkin usein kontaminoitunut suurella määrällä bakteereja tai muuta solumateriaalia, mikä ei ole sallittua elintarvike-. ,·. 20 tai kliinistä tuotetta koskevat vaatimukset täyttävässä tuotteessa.

Perinteinen tapa pienentää maidon biologista kuormitusta on pastö-' \ rointi ja iskukuumennus, ts. maitoa käsitellään lämmöllä lyhyt aika. Lämpökä sittely ei kuitenkaan pelkästään tuhoa maidossa olevia mikro-organismeja vaan myös denaturoi arvokkaita biologisesti aktiivisia proteiineja. Ternimaito v : 25 on erityisen huonosti lämpökäsittelyyn soveltuvaa, koska suuri proteiinipitoi- suus saa sen koaguloitumaan korotetuissa lämpötiloissa. Menetelmää ternimaidon biologisen kuormituksen pienentämiseksi sentrifugoimalla on kuvattu julkaisussa W097/16 977. Bakteerien tehokas vähentäminen vaatii kuitenkin niin suurta gravitaatiovoimaa, että proteiinit saattaisivat saostua runsasprote-.·. · 30 iinisessa liuoksessa läsnä olevien muiden hiukkasten mukana.

.··· Muita menetelmiä maidon mikrobikontaminanttien vähentämiseksi

7 . ovat gammasäteily (US 4 784 850) ja käsittely β-propiolaktonilla (US

3 911 108). Myös näillä menetelmillä on taipumus denaturoida proteiineja jos-sakin määrin. Steriilisuodatus on vielä yksi menetelmä mikrobien poistamiseksi .·.*· 35 maidosta [US 5 256 437; US 5 683 733; Pedersen, P. J., IDF Special issue no 9201. Microfiltration for the Reduction of Bacteria in Milk and Brine, julkaisussa 2 110752

New Applications of Membrane Processes (1991) 33 - 50; Osterland, N., New Developments in Membrane Processing, IDF 25th International Dairy Congress 21-24. syyskuuta 1998, Arhus, Tanska; Rosenberg, M., Trends in Food Science & Technology 6 (1995) 12 - 19]. Suodatusta on käytetty myös maidon eri 5 ainesosien, kuten rasvattoman maidon ja runsaskermaisten fraktioiden (US

4 140 806) ja maidon liuenneiden ja liukenemattomien aineosien (US

5 028 436), erottamiseen. Suodatuksella ei tavallisesti ole olennaista haittavaikutusta proteiineihin, mutta suodattimet saastuvat nopeasti. Tämä on erityisesti ongelma runsasproteiinisen ternimaidon yhteydessä, jonka kaseiini tukkii 10 helposti suodattimet.

Tukkeutuneita suodattimia koskeva ongelma on aiemmin ratkaistu | poistamalla kaseiini osittain tai kokonaan ternimaidosta ja/tai laimentamalla | ternimaito ennen suodatusta. Kaseiini voidaan poistaa joko happo- tai entsyy-

j misaostuksella ja sentrifugoinnilla, jolloin saadaan heraa (US 4 644 056 ja GB

I 15 1 573 995). Julkaisussa US 5 670 196 esitetään menetelmä ternimaidon mik- | rosuodattamiseksi, jossa ternimaito, josta on poistettu rasva, tehdään ensin | happamaksi kaseiinin saostamiseksi, joka poistetaan sentrifugoimalla, ja suo datetaan hera sitten varautuneen syvyyssuodattimen läpi mikro-organismipitoisuuden pienentämiseksi. Julkaisu US 5 707 678 koskee saman-, ·. 20 kaltaista menetelmää, jossa poistetaan kaseiini, minkä jälkeen happamaksi _ 7! tehty hera ensin ultrasuodatetaan ja sitten mikrosuodatetaan. Näiden mene- ’ telmien päähaittana on, että suuria määriä arvokkaita vasta-aineita ja muita proteiineja pyrkii saostumaan kaseiinin ohella. Lisäksi kaseiinin poistaminen on työläs, aikaavievä ja kallis prosessi.

: 25 Julkaisussa US 5 147 548 esitetään menetelmä ternimaidon steriili - suodatuksen tekemiseksi poistamatta kaseiinia ennalta. Ternimaito, josta on mahdollisesti poistettu rasva, tehdään happamaksi alentaen pH arvon 3,5 alapuolelle. Kaseiini saostuu pH:n ollessa 5-4, mutta se liukenee takaisin pH:n laskun jatkuessa. Happaman liuoksen havaittiin eroavan niin suuresti alkupe-.·. · 30 Täisestä ternimaidosta, että sille pystyttiin tekemään steriilisuodatus joko sel laisenaan tai sen jälkeen, kun se oli neutraloitu takaisin alkuperäiseen pH-” . arvoonsa. Käytetty suodatin on syvyyssuodatin tai kalvosuodatin. Yhdessä edullisessa suoritusmuodossa ternimaito laimennetaan natriumkloridiliuoksella ennen happamaksi tekemistä. Tälläkin menetelmällä on kuitenkin haittapuolia.

35 Immunogluboliinit inaktivoituvat helposti pH:n ollessa alhainen. Kaseiinin saos-! . tuminen ei lisäksi ole täysiin reversiibeli, mikä johtaa myös proteiinihäviöön, 3 110752 ja ternimaidon laimentaminen pidentää prosessin kestoa ja suurentaa kustan-: nuksia.

Tämän keksinnön tavoitteena on tarjota yksinkertainen, tehokas ja taloudellinen menetelmä ternimaidon biologisen kuormituksen pienentämiseksi 5 vaikuttamatta olennaisesti haitallisesti sen sisältämiin proteiineihin. Menetelmällä saadaan aikaan mikrobikontaminanttien eliminointi hävittämättä olennaisesti suurta ja monipuolista biologisesti aktiivista proteiinisisältöä ja/tai sen aktiivisuutta. Menetelmä mahdollistaa siten biologisen kuormituksen tehokkaan vähentämisen säilyttäen samalla maksimaalinen immunoglobuliini-, erityisesti 10 IgG-aktiivisuus. Ennalta tehtävää kaseiinin saostusta, laimennusta tai suolo-jen/happojen/emästen tai muiden kemikaalien lisäämistä ei tarvita, eikä läsnä olevien vasta-aineiden lämpötiladenaturoitumista tapahdu.

Keksinnön yhtenä muuna tavoitteena on saada aikaan korkeat hygieniavaatimukset täyttävä ternimaitovalmiste, joka kelpaa elintarvike- tai kliini-15 seksi tuotteeksi. Tätä ternimaitovalmistetta voidaan käyttää juoman tai ruuan muodossa tai kuivassa muodossa terveyden edistämiseen tai sellaisten häiriöiden hoitamiseen tai ehkäisemiseen, joita voidaan hoitaa immunoglobuliineil-la tai ternimaidon muilla proteiineilla.

Yhteenveto keksinnöstä 20 Yllättävästi on havaittu, että yksinkertainen suodatusjärjestelmä ! mahdollistaa ternimaidon biologisen kuormituksen pienentämisen ilman moni vaiheista esikäsittelyä ja proteiiniaktiivisuushäviötä. Esillä olevan keksinnön tavoitteet voidaan siten saavuttaa menetelmällä ternimaidon käsittelemiseksi, 11·« jolle menetelmälle on tunnusomaista, että ternimaidolle, josta rasva on poistet- v 25 tu, suoritetaan poikittaisvirtausmikrosuodatus (CFMF) käyttäen tangentiaalivir-

• I

v taussuodatus (TFF) -laitetta, jossa on avoimet kanavat, ja suodatinta, jonka huokoskoko on 0,1 - 0,5 μίτι.

Esillä olevan keksinnön mukaiselle ternimaidolle on tunnusomaista se, että se on käsitelty keksinnön mukaisella menetelmällä.

,·. 30 Keksintö koskee lisäksi käsitellyn ternimaidon käyttöä mainittua ter nimaitoa käsittävien kliinisten ravintovalmisteiden, funktionaalisten elintarvik- '! . keiden tai elintarvikelisien valmistukseen.

»* t 4 110752

Keksinnön yksityiskohtainen selostus

Keksinnön mukaisessa menetelmässä ternimaito kerätään nisäkkäästä, joka voi olla mikä tahansa nisäkäs, esimerkiksi vuohi tai lammas, mutta on edullisesti lehmä. Nisäkäs on edullisesti immunisoitu tai hyperimmu-5 nisoitu edeltä käsin jotakin patogeeniä vastaan, jolloin voidaan saada ternimaitoa, joka on käyttökelpoista kyseisen patogeenin aiheuttaman sairauden hoitoon tai ehkäisyyn. Ternimaito kerätään pian poikimisen jälkeen, kun IgG-pitoisuus on suurimmillaan, tavallisesti kolmen vuorokauden ja edullisesti 48 tunnin sisällä poikimisesta. Normaalisti, muttei välttämättä, ternimaito pakas-10 tetaan ja sulatetaan sitten varovasti ennen käsittelyä, missä yhteydessä tulisi välttää korkeita lämpötiloja. Rasva erotetaan ternimaidosta millä tahansa tavanomaisella tavalla, yleensä sentrifugoimalla. Saatu rasvaton maito selkeytetään sitten edullisesti, esimerkiksi esisuodattamalla syvyys- tai kalvosuodat-timen läpi, mahdollisten kokkareiden poistamiseksi ennen poikittaisvirtausmik-15 rosuodatusvaihetta. Sopivia suodatusväliaineita ovat esimerkiksi polypropeeni, regeneroitu selluloosa tai polyeetterisulfoni, joiden huokoskoko on 0,1 -150 μιτι, normaalisti noin 0,5 - 50 pm.

Mikrosuodatus (MF) on paineen avulla toteutettava erotusprosessi, jossa käytetään huokoskooltaan määrätynlaisia kalvoja liuoksessa tai suspen-20 siossa olevien ainesosien erottamiseen niiden kokoeron perusteella. Vaikka suurempia hiukkasia voidaan poistaa käyttämällä kalvotonta tai syvyyssuoda- * « ' * tinta, vain kalvosuodatin, jonka huokoskoko on tarkkaan määritelty, pystyy ta kaamaan kvantitatiivisen pidättymisen. Tavanomainen MF on kertaprosessi, • · · * jossa liuosta johdetaan pystysuoraan kalvon läpi. Hiukkaset, jotka ovat liian v 25 suuria läpäistäkseen huokoset, pidättyvät kalvon pinnalle, minkä vuoksi suo- * » datin tukkeutuu nopeasti. MF:n yksi kehitelmä on poikittaisvirtausmikrosuoda-tus (CFMF = ’’cross flow microfiltration”), jossa pidättynyt liuos kiertää tangen-tiaalisesti kalvon pinnan poikki. Poikittaisvirtaus on nopeus, jolla materiaali virtaa kalvon pinnan poikki, ja se on tärkeä, koska se kehittää joukon voimia, 30 joilla on taipumus poistaa laskeutuneita kerroksia kalvon pinnalta, ja auttaa siten pitämään kalvon puhtaana.

- > Poikittaisvirtausmikrosuodatuksessa permeaatti eli suodos on liuos, joka on kulkenut kalvon läpi, retentaatti on kalvon pidättämä liuos tai suspen- ': ‘ sio ja vuo on suodoksen virtaus kalvon läpi.

,*·· 35 Esillä olevan keksinnön mukainen rasvanpoistokäsitellyn ternimai- don mikrosuodatus suoritetaan poikittaisvirtausmikrosuodatuksella (CFMF) 5 110752 käyttäen tangentiaalivirtaussuodatus (TFF) -laitetta. TFF-kalvolaitteet voivat olla lineaarisia tai turbulenssia edistäviä riippuen materiaalivirralle tarkoitetun tangentiaalisen virtauskanavan mallista. Niin kutsutuissa avokanavalaitteissa on suorat, avoimet syötevirtauskanavat, jotka mahdollistavat laminaarisen vir-5 tauksen kanavissa, kun taas turbulenssia edistävissä niin kutsutuissa ohutka-navalaitteissa on syötevirtauskanavat, jotka sisältävät esimerkiksi verkon, joka edistää turbulenssia. Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä tulisi käyttää avokanavalaitteita. TFF-avokanavalaitteita myy esimerkiksi Millipore Corp., Bedford, MA USA (Prostak™).

10 Avokanavalaitteessa käytettävä kalvo on litteä arkkikalvo, jonka huokoskoko on sellainen, että se estää bakteerien ja muiden mikro-organismien kulkeutumisen suodokseen mutta päästää läpi toivotut proteiinit, esimerkiksi lgG:n. Tähän tarkoitukseen sopiva huokoskoko on normaalisti alueella 0,1 - 0,5 pm, edullisesti 0,2 - 0,45 pm, erityisesti noin 0,2 pm. Suodatti-! 15 met voivat olla esimerkiksi polysulfoni-, selluloosa- tai erityisesti fluorihiilivety- polymeeripohjaisia kalvoja. Polyvinylideenifluoridi (PVDF) -kalvot ovat erityisen sopivia ternimaidon CFMF.ään, ja edullisimpia ovat hydrofilisoidut PVDF-kalvot.

Suodattimen pinta-alan suurentamiseksi ja suodosvuon nopeutta-20 miseksi voidaan yhdistää useita suodinlaitemoduuleja. Normaalisti 100 -200 litraa ternimaitoa suodatetaan kapasiteetilla 10-50 l/m2h, edullisesti 20 -40 l/m2h ja erityisesti noin 25 l/m2h paineen ollessa noin 0,5 - 3 bar, edullisesti 0,8 - 2 bar ja erityisesti 1 bar. Suodos, joka sisältää aktiiviset proteiinit, mutta joka ei olennaisesti sisällä bakteeri- tai muita mikrobikontaminantteja, otetaan 25 talteen. Poikittaisvirtausmikrosuodatettu ternimaito steriilisuodatetaan mahdol-: Y lisesti lopuksi tekemällä tavanomainen mikrosuodatus 0,2 - 0,45 pm:n kalvon läpi steriilin lopputuotteen takaamiseksi.

On usein toivottavaa väkevöidä suodatettu ternimaito kyseessä olevien proteiinien rikastamiseksi ja mahdollisesti suolojen poistamiseksi. Tämä : 30 voidaan tehdä sinänsä tunnetulla tavalla, esimerkiksi ultrasuodatuksella tai käänteisosmoosilla proteiinin luonteen mukaan. Lopuksi on mahdollista kui-; . vata suodatettu ternimaito käyttämällä esimerkiksi kylmäkuivausta. Ternimaito voidaan vaihtoehtoisesti suihkukuivata säädellyssä lämpötilassa, niin että väl-·:··.’ tetään proteiinien denaturoituminen. Kuivattu ternimaito voidaan joko esimer- 35 kiksi kapseloida ja käyttää sellaisenaan tai liuottaa vesiliuokseen ennen käyt-. töä.

. 110752 6

Mikrobimäärän pitämiseksi pienenä prosessi tulisi toteuttaa matalassa lämpötilassa. Rasvan erotuksen yhteydessä lämpötila noin 40 °C on käytännöllinen, mutta loppuosa prosessista toteutetaan matalammissa lämpötiloissa, edullisesti korkeintaan lämpötilassa 15 °C ja pääasiassa lämpötilassa 5 2 -10 °C. Jopa CFMF:n aikana tehtävässä pumppauksessa lämpötila voidaan pitää matalana, antamatta sen koskaan kohota 40 °C:n yläpuolelle.

Esillä olevan keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää erilaisiin tarkoituksiin, joissa päämääränä on saada mikrobitonta ternimaitoa ilman olennaista arvokkaiden aktiivisten proteiiniainesosien häviötä. Ternimaito 10 sisältää runsaasti biologisesti aktiivisia proteiineja, kuten hormoneja, kasvutekijöitä, laktoferriiniä, bakterisidisia proteiineja ja erityisesti vasta-aineita, ts. luokkien IgG, IgAja IgM immunoglobuliineja.

Esillä olevan keksinnön mukaista ternimaitoa voidaan käyttää kuivassa muodossa tai juoman tai ruuan muodossa. Se soveltuu erityisesti käsi-15 teltyä ternimaitoa käsittävien kliinisten ravintovalmisteiden, funktionaalisten elintarvikkeiden tai elintarvikelisien valmistukseen. Kliininen ravintovalmiste on tuote, joka soveltuu henkilölle, jolla on erityisiä lääketieteellisiä tarpeita saada sen aktiivisia aineosia. Funktionaaliset elintarvikkeet ovat elintarvikkeita, joilla on terveyttä edistävä vaikutus, ja elintarvikelisä on elintarvikelisäaine, jota li-20 sätään antamaan elintarvikkeelle toivottavia ominaisuuksia. Näitä tuotteita voi-daan kätevästi antaa suun kautta niiden tarpeessa oleville. Esimerkiksi IgG on käyttökelpoinen limakalvojen suojaamisessa patogeenien asettumiselta niille ja tunkeutumiselta niihin ja erityisen sopiva enteropatogeeni-infektioiden hoi-toon tai ehkäisyyn. Esillä olevan keksinnön mukaista runsaasti lgG:tä sisältä-25 vää, mikrobitonta ternimaitoa voidaan antaa esimerkiksi immuunisuppressioti-:.: lassa oleville potilaille.

Esimerkki 1

Lypsylehmiä immunisoitiin formaliinilla inaktivoiduilla Clostridium difficile -soluvalmisteilla. Organismien suspensio 0,5 ml:ssa fysiologista suola-30 liuosta emulgoitiin 5 ml:n kanssa alumiinihydroksidiadjuvanttia. Tuloksena olevaa rokotetta annettiin lihaksensisäisesti kaulan tai lavan kummallekin puolelle viidesti tiineyden 8 viimeisen viikon aikana seuraavasti: ensimmäinen injektio: 2 x 4 ml, sisälsi 109 bakteerisolua/ml rokotetta; 1. ja 2. tehosteannos: 2 x 2 ml, ·:··. sisälsivät 109 bakteerisolua/ml rokotetta; 3. tehosteannos: 2x 2 ml, sisälsi .-j*‘ 35 5x108 bakteerisolua/ml rokotetta; 4. tehosteannos: 2 x 2 ml, sisälsi 2x108 bak- . teerisolua/ml rokotetta.

7 110752

Ternimaitoa kerättiin kahden ensimmäisen maidonerityspäivän aikana. Ternimaito jäähdytettiin lämpötilaan -20 °C välittömästi keräämisen jälkeen.

Esimerkki 2 5 (a) Pakastetun ternimaidon sulatus

Laitettiin 651 immunisoitujen lehmien pakastettua ternimaitoa se-koittimella ja vaipalla varustettuun sulatusastiaan. Ternimaito kuumennettiin separointilämpötilaan 40 °C.

(b) Rasvan erotus 10 Rasva poistettiin vaiheessa a saadusta ternimaidosta separaattoril la, jolloin tuloksena oli 551 rasvatonta maitoa. Lisättiin 50 ml laktaasia (BioFincon, GODO YNL) rasvattomassa maidossa läsnä olevan laktoosin hyd-rolysoimiseksi. Laktaasientsyymiä ei poistettu missään vaiheessa prosessin aikana.

15 (c) Selkeytys

Rasvaton maito esisuodatettiin polypropeeniväliaineesta valmistetun syvyyssuodattimen (Millipore, Polygard 0,5 pm) läpi mahdollisten suurten | hiukkasten poistamiseksi rasvattomasta maidosta. Tämän toimenpiteen odo tettiin parantavan varsinaisen CFMF:n tehoa. Esisuodatettu rasvaton maito 20 siirrettiin sekoittimella ja vaipalla varustettuun sulatusastiaan ja jäähdytettiin !': CFMF-lämpötilaan 7 - 9 °C.

(d) Poikittaisvirtausmikrosuodatus (CFMF) Jäähdytetylle rasvattomalle maidolle tehtiin poikittaisvirtausmik-’ rosuodatus avokanavasuodatusmoduulien läpi, joissa oli hydrofiiliset Durapo- v 25 re-PVDF-kalvot polysulfonilevyillä; kalvon huokoskoko oli 0,22 pm ja kanavan korkeus noin 0,5 mm (Millipore, Prostak™, GVPP). Rasvaton maito pumpattiin avokanavamoduuliin paineella 1 bar. Keskipakopumpun pumppauskapasiteetti oli 100 l/min. Poikittaisvirtausmikrosuodatuksen aikana ei havaittu vuon merkittävää alkuhäviötä. Otettiin talteen 52,51 suodosta, ja loppulämpötila oli 30 15 °C. Vertailun vuoksi käytettiin samoilla kalvoilla varustettuja turbulenssia .’·· edistäviä ohutkanavasuodatinmoduuleja (Millipore, Pellicon™, GVPP).

(e) Tulokset Käytettiin yksinkertaista kompetitiivista ELISA (enzyme linked im-‘: *' munosorbent assay) -menetelmää prosessissa saatujen fraktioiden sisältämän .·*·’ 35 immunoglobuliini G:n (IgG.n) detektoimiseksi. IgG-saanto oli avokanava- I * 8 110752 CFMF-prosessissa 95 %, kun taas ohutkanava-CFMF-prosessissa saanto oli vain 30 %.

Vasta-ainetiitteri, ts. biologisesti aktiivisen rokotespesifisen immu-noglobuliinin suhteellinen määrä prosessissa saaduissa fraktioissa, analysoi-5 tiin käyttämällä immobilisoituja C. difficile -soluja kiinteänä faasina ELISAssa. Korkea tiitteri (1:432 000) säilyi vakiona prosessin aikana, mikä korreloi hyvin kokonais-IgG-saannon 95 % kanssa.

Kokonaismäärän laskenta maljalta tehtiin ennen avokanava-CFMF-toimenpidettä ja sen jälkeen. Kokonaismäärä maljalla pieneni arvosta 10 1,2x106 pmy/ml pienemmäksi kuin 1,0x101 pmy/ml eli 5,1 kertaluvun verran.

Esimerkki 3

Poistettiin rasva 65 l.sta immunisoimattomien lehmien pakastettua ternimaitoa ja käsiteltiin maito esimerkissä 2 kuvatun menetelmän mukaisesti käyttämällä ohutkanavalaitteita (mitä kutsutaan tässä myös ternimaitoproses-15 siksi). Saatiin 45 I suodosta. IgG-pitoisuus määritettiin edellä kuvatulla tavalla. Tulokset esitetään taulukossa 1.

Laitettiin 69 I immunisoimattomien lehmien pakastettua ternimaitoa sekoittimella ja vaipalla varustettuun sulatusastiaan. Ternimaito kuumennettiin separointilämpötilaan 40 °C. Rasva poistettiin ternimaidosta separaattorilla, 20 jolloin tuloksena oli 61 I rasvatonta maitoa. Lisättiin 50 ml laktaasia (BioFincon, GODO YNL) rasvattomassa maidossa läsnä olevan laktoosin hydrolysoimi-seksi. Laktaasientsyymiä ei poistettu missään vaiheessa prosessin aikana. Lisättiin juoksutetta (Renco Rennet; Biofincon; 1:50 000) rasvattomaan maitoon lämpötilassa 32 °C ja juusto leikattiin 30 min:n kuluttua. Saatu juustohera (52 I) 25 esisuodatettiin syvyyssuodattimen (Millipore, Polygard 0,5 pm) läpi mahdollisten suurten hiukkasten poistamiseksi juustoherasta. Esisuodatus oli tarkoitettu parantamaan varsinaisen CFMF-toimenpiteen tehoa. Esisuodatettu hera siirrettiin sekoittimella ja vaipalla varustettuun sulatusastiaan ja jäähdytettiin CFMF-lämpötilaan 7 - 9 °C. Jäähdytetylle juustoheralle tehtiin poikittaisvir-30 tausmikrosuodatus avokanavasuodatusmoduulien läpi (Millipore, Prostak™, GVPP). Hera pumpattiin avokanavamoduuliin paineella 1 bar käyttämällä keskipakopumppua. Pumpun kapasiteetti oli 1001/min. Otettiin talteen 451 suodosta, ja loppulämpötila oli 15 °C. Määritettiin IgG-pitoisuus. Tulokset esite-tään taulukossa 1.

9 110752

Taulukko 1. Ternimaito-ja juustoheraprosessien tulosten vertailu Käsitel- Raakaternimaito Hera Suodos tävä (immunisoi- ma- maton) teriaali_______ V [I] IgG [g/l] V [I] IgG [g/l] V [I] IgG [g/l] Kokonais- ________igG [g]

Terni- 65 25,5 - - 45 24,3 1093 maito

Juusto- 69 26,1 52 21,4 45 17,2 774 hera________

Juustoheraprosessissa talteen otettu immunoglobuliini G -määrä oli 5 30 % pienempi kuin ternimaitoprosessissa.

Esimerkki 4

IgG-saannon samoin kuin CFMF:n tehon vertaamiseksi tehtiin labo-ratoriomitassa kokeita käyttämällä ternimaitoa, happoheraa ja juustoheraa. Poistettiin ensin rasva 1000 l:sta ternimaitoa, laitettiin maito pienempiin säiliöi-10 hin ja jäähdytettiin se lämpötilaan -20 °C. Pakastettu rasvaton ternimaito sulatettiin nopeasti nostaen lämpötila arvoon 10 °C. Happohera valmistettiin li-säämällä HCI:a rasvattomaan ternimaitoon, niin että pH laski arvoon 4,5, ja poistettiin happohera sentrifugoimalla. Lisättiin juoksutetta kuumennettuun rasvattomaan ternimaitoon lämpötilassa 32 °C, minkä jälkeen juustohera otet-15 tiin talteen juuston leikkaamisen jälkeen.

. :· Rasvaton ternimaito ja siitä valmistetut happohera ja juustohera , ,· esisuodatettiin erillisten syvyyssuodattimien läpi ja tuloksena oleva liuos joko käsiteltiin sellaisenaan tai laimennettiin ionisoidulla vedellä suhteessa 1:5 ennen Millipore Prostak™ GVPP -suodatinlaitteilla tehtyä CFMF:ää. Mainituissa 20 suodatuksissa käytettiin pyörivää lohkopumppua (Amicon). Syötteen tilavuus oli 101 kussakin yksittäisessä kokeessa, ja paine oli syötepuolella 0,9 bar.

:· Tulokset esitetään taulukossa 2.

10 110752

Taulukko 2. Ternimaito-, happohera- ja juustoheraprosessien tu- losten vertailu______ Käsiteltävä Laimennus Vuo lgGsyöte IgGpemwaatti IgGrMenuatu Läpäisevyys materiaali___[l/m2h] [g/l]__[g/l]__[g/lj (cjc,)%*

Ternimaito Ei__29A__26J5__252__27J__95

Ternimaito__1^5__72,3__5^4__5J__5J__95

Happohera Ei__28^2__21J5__16J__262__75

Happohera 1:5__69J5__4J__4j2__52__90

Juustohera Ei__22^__19J__15J__23J3__80

Juustohera 1:5 57,8 4,1 3,1 5,1 75 * Pitoisuus permeaatissa 5 -x 100 %

Pitoisuus syötteessä

Todelliset permeaattivuot olivat molemmissa heraprosesseissa heikommat kuin temimaitoprosesseissa, samoin IgG-läpäisevyys. Ternimaidon 10 laimentaminen paransi permeaattivuota kalvojen läpi kertoimella 2,5, samalla kun lgG:n laimennuskerroin oli 5. Laimennetut IgG-fraktiot täytyy väkevöidä jälkeenpäin, mikä suurentaa prosessin kustannuksia ja pidentää siihen kuluvaa aikaa, ja lisäksi ovat olemassa jälkikontaminaatiomahdollisuudet.

Esimerkki 5 15 Tehtiin 20 l:lle esimerkin 2 poikittaisvirtausmikrosuodatettua terni maitoa kertasuodatus käyttämällä 10cm:n (4”) Millipore Opticap -suodatinta, :* joka oli varustettu Durapore™-PVDF-väliaineella, jonka huokoskoko oli 0,22 μιτι, laminaarivirtauskaapissa ja pullotettiin se aseptisesti 500 ml:n pulloihin. Pullotettu tuote oli ehdottoman steriili. Ternimaidon kertasuodatus steriilik-20 si oli mahdollista vasta sen jälkeen, kun sille oli tehty poikittaisvirtausmik-rosuodatus huokoskooltaan samanlaisen kalvon läpi. Vaihtoehtoisesti käytettiin 10cm:n (4”) Millipore Opticap -suodatinta, joka oli varustettu Milligard™-;* väliaineella (selluloosasekaestereitä), jonka huokoskoko oli 0,22 pm, ennen pullotusta.

25 Esimerkki 6

Kylmäkuivattiin 101 esimerkin 2 poikittaisvirtausmikrosuodatettua > · ternimaitoa menestyksellisesti ilman lisäväkevöinnin tarvetta, niin että saatiin v ternimaitojauhetta. Jauhe liuotettiin myöhemmin veteen tai fosfaattipuskuroi- : Λ tuun fysiologiseen suolaliuokseen (0,1 mol/l, pH 7,0).

Claims (12)

11 110752 I. Menetelmä ternimaidon käsittelemiseksi niin, että pienennetään ternimaidon biologista kuormitusta säilyttäen samalla suuri aktiivisen proteiinin 5 pitoisuus, jolloin ternimaito kerätään, siitä poistetaan rasva, se mikrosuodate-taan ja suodos otetaan talteen, tunnettu siitä, että ternimaidolle, josta rasva on poistettu, suoritetaan poikittaisvirtausmikrosuodatus (CFMF) käyttäen tangentiaalivirtaussuodatus (TFF) -laitetta, jossa on avoimet kanavat ja suodatinta, jonka huokoskoko on 0,1 - 0,5 pm.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että CFMF suoritetaan käyttäen suodatinta, jonka huokoskoko on noin 0,2 pm.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että CFMF suoritetaan käyttämällä hydrofilisoidun polyvinylideenifluoridi (PVDF) -kalvon käsittävää suodatinta.

4. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että ternimaito kerätään lehmästä 48 tunnin kuluessa poikimisesta.

5. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että lisäksi ternimaito selkeytetään ennen 20 CFMF:ää. I I !’! 6. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mukainen mene- t · telmä, tunnettu siitä, että CFMF:n jälkeen suoritetaan steriilisuodatus • * · * suodattimen läpi, jonka huokoskoko on 0,2 - 0,45 pm. : 7. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mukainen mene- v 25 telmä, tunnettu siitä, että lisäksi talteen otettu suodos kuivataan.

8. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ternimaito kerätään nisäkkäästä, joka on immunisoitu.

9. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mukainen mene-30 telmä, tunnettu siitä, että CFMF-vaihe suoritetaan korkeintaan lämpöti- Iässä 40 °C. ’ ‘. 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että CFMF-vaihe suoritetaan korkeintaan lämpötilassa 15 °C. II. Ternimaito, tunnettu siitä, että se on käsitelty minkä ta-35 hansa patenttivaaatimuksista 1-10 mukaisella menetelmällä. 12 110752

12. Patenttivaatimuksen 11 mukaisen ternimaidon käyttö mainittua ternimaitoa käsittävien kliinisten ravintovalmisteiden, funktionaalisten elintarvikkeiden tai elintarvikelisien valmistukseen. j 13 Patentkrav 110/52