SE448344B - Antikropp for behandling av reumatoid artrit samt sett att framstella denna - Google Patents

Description

j44s 344 2 hetsmekanism har kunnat fastslås (Sikes et al, 1955).

Vid studier av reumatoid artrit förbryllas dock forskarna fortfa- rande av vissa återkommande motiv, som tyder på samband mellan infektioner och ledsjukdomar. Sålunda kan t.ex. gonorré inte en- bart frambringa typisk gonorial artrit utan ibland också kronisk artrit, som kan övergå i reumatoid artrit. Det finns inga statis- tiska uppgifter över denna förekomst, varför man ej vet hur stor vikt kan man lägga vid sambandet. Tonsillit eller faryngit kan åt- följas av en polyartrit, som först uppträder som reumatisk feber men som utvecklas till reumatoid artrit. Akuta virusinfektioner, särskilt röda hund hos unga kvinnor, kan åtföljas av långvariga= polyartritider omfattande såväl små som stora leder. Dessa artri- tider uppträder vanligen under flera månader och ger därvid ledbe- svär som påminner om reumatoid artrit, varefter sjukdomen succes- sivt återgår. Även om kronisk infektion av ett okänt ämne fortfarande är en van- lig beskrivning för etiologin hos reumatoid artrit finns inga pub- licerade data som ger stöd för detta antagande, En del forskare som studerat sjukdomen misstänker, att om infektion utgör en fak- tor, kan det ej röra sig om infektion av någon specifik typ av mik- roorganism utan snarare infektion av ett stort antal banala mikro- organismer med en förändrad responsdel hos värdorganismen alstrad av infektionerna som är ansvariga för sjukdomen. Föreliggande upp- finning baserar sig på denna terori beträffande anledningen till reumatoid artrit. Även om en infektiös etiologi aldrig kunnat fast- slås, förefaller flera sentida rön att ge stöd för denna teori.

Några av dessa är.följande: 1. Patienter med reumatoid artrit.har lägre halt än normalt av IgA, dvs den klass av immunglobulin som återfinns i sekret från det gastrointestinala området. 2. Immunglobulin A alstrat till följd av immunicering via saliv-, slemhinnorna återfinns i serum colustrum och mjölk liksom 1 sali- ven. Man antar att IgA överföras till dessa olika kroppsvätskor via det gastrointestinala-området och lymfsystemet (Michelok et al, 1975). i ' i V f 448 344 3 i 3. Efter en bypass-tarmoperation till följd av obisitas utveck- las hos vissa patienter symptom; som faktiskt är identiska med »de hos reumatoid artrit. Utvecklandet av artrit åtföljs av att det i blodserum üppträder cirkulerande kryoproteiner sammansatta av IgG,_IgM, IgA, komplementkomponenter G3, G4, C5 och IgG~anti- kroppar mot E. coli och B. Fragilis; Om man avlägsnar bypass-tarm-' ledningen, försvinner_symptomen fullständigt iwoods et al, 1976). __4: Én typ av'Diplosgreptococcus agalaotiae tillhörande streptokock- gruppen B har angivits som etiologiskt ämne i reumatoid artrit (Svartz; 1§72), Denna streptokock förekommer i större delen mark- iíiaaysffsra paetöšiseàfàd injöik men ej i iifimunmjölk.

*S2 En disposition för reumatiska sjukdomar tycks kunna ärvas via =histokompabilitetsantigenerna=(HL-A). Dessa antigener bestämmer sannolikt värdorganismens reaktion på infektionsämnen. .f aMot bakgrund av dessa fakta kan man fastslå att renmatoid.artrit har ett infektiöst ursprung, varvid infektionen_sker i inälvor, 4, att ett stort antal bakteriestammar är involverade i infektionen, att infektionen sannolikt beror av ett sammanbrott i värdorganis- ,,mens immunförsvar och att det effektivaste sättet_att behandla sjukdomen är att återställa immunskyddet mot det infektiösa ämnet oi.inälv0nna,.

'~Behandlinq av infektionen ,_Det fiinns i huvudsak två metoder som kan användas för infektione- _behandling, nämligen immunbehandling som innebär antingen aktiv .eller passiv immunicering mot de infektiösa patogenerna och använd- ningen av antibiotika såsom penjnillin, tetraoyklin, ampicillin och liknande. Antibiotika har ingen specifik verkan och de dödar ett brett spektrum av såväl nyttiga som skadliga bakterier. Å and- ra sidan år-immünbehandlingen mycket specifik. Mot en specifik -stam av bakterier frambringáde, baktericida antikroppar reagerar endast med denna stam och har ingen skadlig inverkan på andra ty- per av bakterier. Dessutom är antikroppar till skillnad från anti- biotíka naturliga kroppsprodukter och har inga kända bieffekter.

Eftersom syftet med upnfinningen är att behandla infektioner av un " specifik grupp av bakterier utan att inverka.menligt på nyttiga '-bakterier i inälvornay väljs immünbehandlingstekniken. si44ses44 l l 4 Aktiv och passiv immunicering ¶ Det finns två olika metoder att uppnå immunskydd. Aktiv immunicee ring är det förfarande, där värdorganismen aktivt immuniceras med ett vaccin; som stimulerar immunsystemet ett producera skyd- dande antikroppar mot faktorer som ingår i vaccinet. Aktiv immu~ nicering sker under naturlige betingelser när värdorgenismen ute ¶ sätts för infektiösa patogener. Passiv immunicering är ett förfá~ Irende, varvid antikroppar erhållna från en individ som immuniee~ rate aktivt ges till en annan individ. vid denna teknik överföres de skyddande antikropparna från den immuna värdorganismen till mottagarens Passivt immnnskydd är temporärt och varar endast så länge som de passivt utvunna antikropperne.överlever i mottagarens system. Exempelvis kan antikroppar från hästar immunieerade mot l tetenustexin ges till människor infekterade med tetanus försett man skall uppnå temnorärt immunskydd mot det av tetanusbekterier eelstrade toxinet. ï den amerikanska petentskriften 3.626.057 befl skrives ett förfarande för framställning av tetenustoxin i mjölk.

Enligt petentskriften'immunieeras en ko aktivt mot tetenustoxin och de av kon mot toxinet bildade entikropparna ken erhålles Erån kons mjölk och dessa antikroppar kan användas för behandling av djur infekterade med tetanusbakterier på se sätt att antikroppar- ne neutreliserer toxinet. Det utsågs att de passivt edministrerede antikrepperna nentraliserer det livsnetade torinet alstret av bak» terierne, varigenom man uppnår temporär immunitet mot toxinet§ Passiv immunicering skiljer sig från aktiv immunicering genom ett immunskyddet är temporärt den endast varar så länge som de skyd=e dande antikropparna finns närvarande. Äktiv immunicering är mere permanent, eftersom värderganismens-immunsystem fortsätter att producera skyddande antikroppar i närvaro av den stimulerande en» tigenen.* _ d d s d d Färska stndier inom termimmunologiområdet har visat förekomsten d ev en lekal immunmekenism i tarmsystemet. Dette immunsystem pree ducerar en speeiell typ av entikropp, som motverkar bekterieske= degörelse i tarmsystemets lumen. Antikreppen som benämns sekrete= riskt immunoelobulin eller IqA, frambringas av antigenen till följd av lokal aktiv immunicering av termslemninnen. Det sekretoriske immunsystemetz vid tarmsystemet fungerar så satt de skyddar inflytt= ningen och tillväxten av skadliga bekteriestemmar i denna miljö. 443 544- i Man antar att ett sammanbrott i det lokala immunsystemet i tarmen wágör det möjligt för främmande skadliga bakterier att etablera sig och att dessa bakterier förorsakar reumatoid artrit. Enligt denna teori härrör reumatoid artrit från ett sammanbrott i tarm- systemets lokala immunsystem, som skall producera och avsöndra skyddande antikroppar;mot skadliga bakterier. Oförmâgan hos värd- organismen att reagera på aktiv immunicering utesluter möjligheten att använda denna metod för att behandla reumatoid artrit.

Uppfinningen tillhandahåller en antikropp för att behandla reuma- toid artrit förorsakad av ett blandat spektrum av infektiösa bak- terier, som uppehåller sig mag-tarmområdet och med de kännetecken som framgår av kravet 1. Administrering av antigenen ger ett tem- fporärt immunskydd som är mycket specifikt för de bakteriestammar som används för att alstra antikropparna och inverkar ej menligt på de normala nyttiga bakterierna som förekommer i tarmsystemet.

'Komjölk utgör den föredragna källan för antikropprodukten enligti *uppfinningen. Den är mycket specifik genom att den definierar en unik population av antikroppar i mjölk (IgG-typ), som reagerar med ett känt spektrum av bakterier och denna reaktion nyttiggörs för behandling och förhindrande av reumatoid artrit.

Typen av immunglobulin är av vikt i samband med uppfinningen, ef- tersom det finns fem kända_klasser av immunglobuliner betecknade IgG, IgM, IgA, IgD och IgE (Nisonoff et al, 1971). Dessa typer av immunglobulin skiljer sig strukturellt från varandra (Waldman et al, 1970+.och har olika biologisk funktion i kroppen (Waldman et ¿al, 1971, och Franklin, 1964),-Dessutom finns det betydande varia- tioner i lokaliseringen av immunglobuliner i kroppen. Sålunda fö- ” religger tydliga fördelningsskillnader mellan immunglobulinklasser- na IgA och IgG; Det mest framträdande draget hos IgA är den höga koncentrationen i kroppsvätskor såsom mag-tarmvätska. Det har klart kunnat visas att det immunsystem, som bidrar med IgA till mag-tarm- vätskan, är ett annat system än det, som producerar IgG.

Hos människan förekommer IgG i första hand i vaskulära och intra- 'cellulâra områden i kroppen (Waldman et al, 1970) och mycket liten mängd IgG hamnar i mag-tarmvätskorna. En annan viktig skillnad mel- lan klasserna av immunglobuliner berör deras metaboliska tillväxt. _Nedbrytningen av varje klass av immunglobulin tycks, oavsett loka- 448 344 t 6 liseringen i kroppen, ske under separat kontroll. Den funktionella kataboliska tillväxten varierar från så lågt värde som 6,5% för IgG till så högt värde som 90% för IgE medan andra immunglobulinklas- ser hamnar däremellan (Waldman et al, 1970). De_olika immunglobu-4 linklasserna skiljer sig också i sin benägenhet att bindas till an- tigener och i sin förmåga att kombinera med komplement, som är ett av rekvisiten för avdödning av levande bakterieceller (Heremans, 1960). Det är viktigt att understryka dessa skillnader hos typer- 'na av antikroppar, eftersom immuneffekter kan variera beroende på vilken typ av antikropp man har att göra med.

Den vanligen mest hävdade teorin är att de olika klasserna av im- munglobulin har_utvecklats för att fungera i olika miljöer i krop- pen. Det är exempelvis känt att ett speciellt immunsystem existe- rar med uppgift att producera antikroppar, vilka är aktiva i tarm- systemet. Vidare anser man allmänt att immunfunktionerna i tarm- systemet regleras specifikt av IgA-antikroppar och ej IgG. Under normala betingelser är IgA därför den klass av immunglobuliner som reglerar immunkontrollen över bakterieinfektioner, som förekommer i mag-tarmområdet hos människan. Éftersom IgG, IgM, IgD och IgE nor- malt_ej förekommer i tarmsàft, är det inte logiskt att förvänta sig att någon av dessa typer av antikroppar skulle vara effektiva för behandling av infektioner i mag-tarmområdet. I Det huvudsakliga immunglobulinet i komjölk är IgG och ej IgA (Sul-' livan et al, 1969). Därför är komjölk ingen närliggande källa för antikroppar för behandling av bakterieinfektioner i tarmsystemet hos människan på grund av dess höga koncentrationer av IgG och lå-4 ga koncentrationer av IgA. " I I -Immuniceringsmetoden är en annan viktig parameter vid beaktande av de olika klasserna av immnnglobülin. Det är väl känt för fack- mannen att olika immuniceringsmetoder resulterar i prefererad pro- duktion av olika typer av antikroppar. Exempelvis stimulerar en genom exponering av sekretorisk vävnad för antigener uppnådd lokal immunicering en prefererad produktion och utsöndring av immunglo- buliner av.IgA-typ. Tekniken med intramammoperfusion såsom beskri- ves i den amerikanska patentskriften 3.376.198 är ett exempel på lokal immunicering. Denna metod stimulerar produktionen och utsönd- ringen av IgA-antikroppar och är ej någon effektiv metod för pro- lb 448 544 _duktionfav_IgGÅ Uppfinningen avser även ett sätt att framställa antikroppar, vil- ket sätt närmare framgår av kravet 3.

Enligt uppfinningen användes intramuskulär injektion för att pro- ducera en produkt användbar enligt uppfinningen, eftersom IgG är det huvudsakliga immunglobulinet i komjölk och ej IgA och eftersom hos kor systemimmunicering är den föredragna metoden att frambrin- ga antikroppar av IgG-typ i mjölk. Denna skillnad mellan immunglo- bulin av IgG-typ och IgA-typ är-viktig, eftersom man därav kan lä- ra att systemimmunicering och ej lokal immunicering är den föredrag- na metoden för att erhålla mjölkantikroppar med hög titer. Av den- na distinktion kan man också lära att immunprodukterna alstrade genom mammoperfusion av ett vaccin klart skiljer sig från immun- produkten bildad genom intramuskulär injektion av samma vaccin.

Den enligt uppfinningen framställda produkten (IgG-antikroppar)- skiljer sig sålunda klart från produkten framställd enligt den ame- rikanska patentskriften 3.376.198. ' Immunprodukten framställd enligt föreliggande uppfinning innebär en förbättring i förhållande till.produkten framställd enligt den , amerikanska patentskriften 3.376.198 genom att koncentrationen av antikroppar av IgG-typ är avsevärt högre än koncentrationen av an- tikroppar av IgA-typ; Det finns inget stöd i litteraturen för upp- fattningen att IgG-antikroppar kan bildas genom intramammoperfu- sion av antigener. Eftersom vidare mängden IgG-immunglobuliner i komjölk är antingen noll eller extremt låg, har nämnda patentskrift ingenting att göra med föreliggande uppfinning. Tvärtom leder in- nehâllet i nämnda patentskrift bort från föreliggande uppfinning, eftersom det i patentskriften hävdas att IgA är en biologiskt ak- tiv faktor i komjölk, som har potentiell terapeutisk applikation.

Enligt föreliggande uppfinning beredes en unik kombination av bak- 'fterier till ett vaccin, som administreras på friska mjölkkor. De IgG-antikroppar, som erhålls från mjölken av immunicerade kor, ut- gör den enligt uppfinningen framtagna produkten. Metoden enligt uppfinningen innebär en passiv immunicering av patenten genom oral _injektion av IgG-immunglobulin, som immunicerar passivt mot ett blandat spektrum av infektiösa bakterier, som uppträder i mag~tarm- 14484344 8 området. Denna behandling eliminerar betingelser i mag-tarm-om- rådet. som är ansvariga för reumatoid artrit.

Fig} 1 visar ett exempel på ett frågeformulär, till vilket hänvi- sas i efterföljande beskrivning. Fig. 1a är en fortsättning på frågeformuläret i fig. 1. Fig. 2 anger grafiskt resultaten av för- sök utförda under en 12-månaders period med 6 månader på immunmjölk och 6 månader på ett kontrollprov, varvid RF-titern är uppförd som funktion av tiden angiven i månader.

Den enligt uppfinningen framställda produkten är en torrmjölk med låg fetthalt som innehåller en population av naturliga antikroppar av3IgG-typ, som reagerar med de i nedanstående tabell 1 angivna bakterierna.

TabeIl~1 §ateriel1a.antigener Qäeafriåfß 1 3 *èfllëggflr- i Staphylococcus aureus '3 7 I 7 11631 Staphylococcus epidermidis _ 7 155 Streptococcus pyogenes, A, typ 1 I 8671 1 " 1 " 3 _3 10339 " 23 _ _".5 2 2 12347 '* V1 2 " s 12349 " 2 1 " 12 1 11434 P' " 14 12972 'f - 2 1 _ *' 18 1 ._ 12357 F' 1 3 1 " 22 of 10403 Aerobacter aerogenes - ' 884 Escherichia coli 3 " 3 26 Salmonella enteritidis *,*'p 7 7 3 13076 Pseudomonas aeruginosa 7 7 7700 Klebsiella pneumoniae 2 3 d 9590 Salmonella typhimurium ' 1 3 13311 Haemophilus influenzae 3 _f 9333 Streptococcus viridansp I de 1 6249 Proteus vulgaris 3 3 13315 Shigella dysenteriae * W 3 11635 Streptococcus,_grupp B_ 1 448 544 *Tabell 1, forts.

Diplococcus pneumoniae D Streptococcus mutans eCorvnebacterium, Acne) typ 1&2 *American Type Cultnre Collection 12301 Parklawn Dr.; R0ckVille,'Md. 20852 Den antibakteriella mjölken innehåller samtliga substanser som normalt återfinns i torrmjölk med låg fetthalt. De huvudsakliga beståndsdelar som återfinns i antibakteriell mjölk är angivna i _nedanstående tabell 2.

Tabell 2 Kvantitativ ooh kvalitativ analys av antibakteriell mjölk Proteinerr _ ' k k ' . V' 35,6% Fett ¿ -D - 1,o% Kolhydrater D I _ 4 52% Mineralämnen " 7 J 7 Ü 7,8%- Fukt ~ , ' ' i - 3,54% Varje i vätskeform återföra liter av 85-113 g fettfri torrmjölk innehåller ca . 1200 mg kalcium ' _ e * l 157% 935 mg fosfor V I - 125% 0,3 mg tiamin 7 32% 1,78 mg riboflavin ~.- _ 140% _1,04 mg niacin " _ 10% 324 kalorier Antibekterieli mjölk och normal xemjölk innehåller ungefär sem- ma viktprocent koncentrationer av ingredienser. Dessutom är kon- çentrationen av immunglobulin av typen IgG i antibakteriell mjölk och normal mjölk densamma. Det är därför endast när det gäller eden speoifika sammansättningen av antikroppar som den antibakte- riella mjölken skiljer sig från normal mjölk. Med specifik samman- sättning menas här det spektrum av bakteriearter som_antikroppar~ na reagerar med, D d44sís44id Äntibakteriell mjölk innehåller inga tillsatser av mediciner el- ler andra komponenter, som ej utgör naturliga produkter från kon.

Immunmjölken framställd enligt uppfinningen kan också användas för att bekämpa autoimmuna sjukdomar; t.ex. lupus erythematosus och liknande, som förorsakas av eller försvåras av bakteriella angrepp i mag-tarmområdet.

' Den polyvalenta antigen, som användes för induktionen av antibak- terieu mjölk, »framställes eniigceföijande.

Framställning av vaccin_ De i ovanstående tabell 1 angivna bakteriestammarna erhölls från' the American Type Culture Collection, vilket garanterar autentis- ka bakteriestammar och högsta kvalitet beträffande renhet. Efter mottagandet fick varje enskild bakteriestam tillväxa på blodagar- plattor för att fästa kulturens livskraft och bestämma om till- växtmönstret var tvpiskt eller icke typiskt för bakterien ifråga.¿ En enda koloni togs för var och en av de testade kulturerna för histologisk undersökning för att ytterligare konstatera att kultu- ren var autentisk och ren. En enda koloni av varje kultur användes _ för att ympa 500 ml av ett standardiserat odlingssubstrat. Av- the American Type Culture Collection rekommenderade substrat använ- des för odling av var och en av de i tabell 1 angivna specifika bakterierna. ' Samtliga organismer inkuberades som statiska kulturer med undantag av 12, 13, 14 och 60, vilka inkuberades i en skakapparat för omrö-d A ring. Identifieringen av bakteriestammarna och katalognumren en- ligt the American Type Culture Collection är angivna i tabell 1.

Varje kultur odlades under.48 timmar vid 37°C. Efter inkubation avdödades kulturerna genom upphettning vid_60°C under tvâ timmar.

Prover av de avdödade bakterierna användes för att ympa färskt od- lingssubstrat, som därefter inkuberades under 24 timmar vid 37°C för att avgöra om avdödningsprocessen varit effektiv och fullstän- dig. Endast kulturer som visade sig vara sterila vid denna under- sökning användes i det fortsatta arbetet. Sterila kulturer tvätta- des sedan fem gånger i destillerat vatten och cellerna utvanns ge- nom centrifugering. Cellerna frystes ned genom nedsänkning i fly- tande kväve och frystorkades genom lyofilisering. De lyofiliserade cellerna förvarades på sterila flaskor tills de användes för pro- f: Q. aKorna injicerades med 5 ml.polyvalent antigen innehållande 20 x 10 p 448 544 11 fduktion"av det'polyvalenta vaccinet- Det polyvalenta vaccinet framställes genom att'väga upp 1 g av var och en av bakteriestam- marna. De torra cellerna blandades samman och denna blandning” suspenderades i steril fysiologisk koksaltlösning (20 g bakterier 'per 500 ml koksaltiösning).

Ett prov av den koncentrerade lösningen späddes i serie med kok- saltlösning för att bestämma den utspädning som var en koncentra- 'tion av 4 x 108 celler per cm3. Det förvarade, koncentrerade poly- valenta vaccinet dispergerades i multipla behållare och förvarades fruset, Koncentrerad antigen ingick i varje enskild behållare i en~ mängd tillräcklig för att immunicera 50 kor. Den slutliga utspäd- ningen av koncentratet gjordes strax före-immuniceringen. Ett fö- redraget tillvägagângssätt.bestod i att ta ut ett tillräckligt an- '_tal'flaskor tillräckliga för att immunicera antalet kor som skulle behandlas. Exempelvis togs flaskorna ut 24 timmar före den planera- 'de immuniceringen och ett prov av koncentratet späddes sedan i en steril_behå1lare till en slutlig koncentration av 4 x 108 celler per ml. Den maximala reaktionen hos kor uppnåddes genom injicering av 20 x¿108 bakterieceller eller 5 cm3 av det sterila preparatet, som höll 4 x 108 celler per ml enligt nedan beskrivna injicerings- metod; Föredragen metod för immunicering av kor Den slutliga antikropprodukten framställdes genom att immunicera kor med den polyvalenta antigenen framställd på ovan beskrivet sätš.. bakterieceller. Injektionen gjordes intramuskulärt i glutealmusku- laturen i bakbenet. Denna procedur upprepades med en veckas inter- vall under fyra på varandra följande veckor med början 2-3 veckor före en förväntad kalvning. Efter den primära immuniceringen gavs ' var 14:e dag buffertinjektioner med användning av samma koncentra- 'tion av antigen. Denna immuniceringsmetod gav den maximala anti- kroppstiternl Uppsamling, hantering och vidarebearbetning av mjölk I Mjölkcniuppsamlades från immunicernde kor j ett modernt mjölkrum.

Ett helt automatiserat mjölkningssystem samlade upp och förvarade -mjölken under helt sanitära förhållanden. Mjölkningssystemet bestod av automatmaskiner direkt anslutna till under kylning satta förva- i 12 ringsbehâllare genom ett slutet rörsystem. Detkompletta systemet renades och steriliserades efter varje mjölkning för att säker- ställa maximala sanitära betingelser. Det är viktigt att Vidtà al- ._la försiktighetsåtgärder för att förhindra tillväxten av bakteri- er i immunmjölk under upparbetningen, eftersom sådana bakterier kan sänka titern av antikroppar i mjölken.

Mjölken transporterades varje dag från de nedkylda förvaringsbehål- larna till en mjölkhanteringsanläggning med hjälp av särskilda' mjölktransportbilar. I mjölkhanteringsanläggningen utsattes den antibakteriella mjölken för kortvarig högtemperaturbehandling för* pastöriseringl Med hjälp av speciella mejerimaskiner företogs upp- rhettning under kontinuerlig strömning av mjölk till 68°C under en Aperiod av högst 15 sekunder. Temperaturen och tiden var kritisk, eftersom antikroppar bryts ned i värme. Antikropparna i mjölken förstörs vid temperaturer över 73°C, om de hålls vid denna tempera- tur under längre period än 1 minut. Efter pastöriseringen kyldes all mjölk omedelbart och fettet avlägsnades genom centrifugering- ooh den sålunda erhållna antibakteriella skummjölken överfördes i pulverform genom spraytorkning. Spraytorkningen ägde rum i en stor torkkammare, i vilken varm luft (177°C) blåstes in med hög hastig- het. Skummjölken atomiserades i kammaren, där de finfördelade mjölk- partiklarna under det att de föll mot botten av behållaren torka- des. Torrmjölken togs ut automatiskt med hjälp av mekaniska anord- ningar och mjölkpulvret förpackades under saniñära betingelserlxw Före atomiseringen kondenserades skummjölken genom kokning i en kammare under vakuum (38-43oC). I varje steg var det viktigt att hälla bakterier borta från mjölken, eftersom dessa kunde minska antikroppstitern. i Testmetoderu ,g Immunmjölken framställdes med användning av kor av Holstein-ras..

Korna immunioerades genom_intramuskulär injektion av en blandning av bakterieantigenerna angivna i ovanstående tabell 1. vaccinet framställdes på ovan beskrivet sätt. Den'immunologiska reaktionen hos korna r förstärktes genom injektioner två gånger i veckan av vaccinet. Mjölken från dessa kor uppsamlades, fettet avlägsna- des och den fettfria mjölken pastöriserades vid 71°C under 16 se- kunder, varefter företogs spraytorkning, under vilken mjölkens tem- peratur ej överskred 2900. Mjölken förpackades därefter i ca 1 Ii- du .p 448 344 1st ters förpackningar av polyeten. Kontrollmjölkprover utfördes av 'fettfri torrmjölk inköpt från en lokal producent.

Erytrocytsedimentaticnshastigheten bestämdes på nytagna blodprover medelst Westergrens metod och korrigerades för hematokrit enligt metoden beskriven av Wintrode & Langsberg (1935). Reumatoidfaktor- titrar bestämdes enligt Singer-Flotz (1966) makroskopiska metod med provrör.

Patienter togs emot för studier på basis av en förhöjd erytrocytsef dimentationshastighet och en positiv reumatoid faktortiter. Nio- patienter studerades under 12 månader och 11 patienter studerades under 18 månader. Patientgruppen var sammansatt av 13 kaukasiska kvinnor_i åldrar mellan 32 och 69 år med en medelålder av 50,4 åræ och 7 kaukasiska män i'en ålder mellan 43 och 70 år med en medel* ålder av 58,1 år. Den genomsnittliga tid som patienterna lidit av artrit var 10,8 år för kvinnorna och 11.0 år för männen. Patien- ter placerades godtyckligt i grupper för behandling med immunmjölk eller icke immunmjölk (en kommersiell produkt inköpt i Dayton~distf riktet och fungerande som kontrollvätska). Båda mjölkprodukterna var förpackade i likadana förpackningar och identififerades som im- munmjölk eller kontrollprov med en blå eller röd, tryckkänslig etikett; som fästs på varje förpackning vid påfyllningstillfället.“ Etiketterna avlägsnades strax innan patienterna fick dricka av mjöl- ken. Inte vid något tillfälle kunde sålunda patienterna veta om de drack immunmjölk eller kontrollmjölk. Patienter valdes godtyckligt ut (genom att kasta mynt) för att dricka av antingen immunmjölkAel~ ler av kontrollmjölken under den första sexmånadersperiodenl Efter_ aenna~t1a fick de, som tidigare fått immunmjöik, kontrølimjöik och. de; som tidigare erhållit kontrollmjölk, fick nu immunmjölk under I den andra sexmånadersperioden. 7Vid slutet av den andra sexmånadersperioden stannade 11 patienter frivilligt kvar för studier under ytterligare en sexmånadersperiod.

Typen av mjölk (immun: eller kontrollmjölk) ändrades återigen vid y detta tillfälle och observationerna fortsatte. Studiet omfattade sålunda tre sexmånadersperioder, varvid 11 av patienterna deltog under tre perioder och nio deltog under två perioder. I Patienterna fick komma en gång i månaden, varvid torrmjölk som . gvärden i förhållande till "Aspirin 'ta med nämnda "Aspirin 448 544 14 skulle räcka en månad aaiaaes ut och ett frågaformaiar fylldes 1 samt blodprover uppsamlades för bestämning av reumatoid faktor- titer, erytfimndsedimentationshastighet och hematokrit.

Patienterna instrnerades att inta en kvantitet torrmjölk ekviva- lent med T,1 l färdigmjölk två gånger dagligen. Torrmjölken löstes upp i färskt tillstånd i 0,55 l kallt kranvatten omedelbart före intaget och kort efter uppvaknandet på morgonen och strax före säng- gâendet på kvällen; De ombads att besöka sin läkare som vanligt och att följa av honom föreslagna behandlingsföreskrifter. Medicinej ringen skulle tas ad libitum eller såsom föreskrivits av deras van- liga läkare. Enda kravet var att de-rapporterade den mängd medicin som de intog.

Ett frågeformulär ifylldes av¿varje patient varje månad. Det var uppdelat i sex avdelningar och berörde följande frågor: 1) Morgonstelhetens varaktighet, l_ 2) bedömning av värken iakttagen i var och en av åtta ledpartier, 3) typ och kvantitet av medicin med korttidsverkan som intagits, 4) typ och kvantitet av medicin med långtidsverkan som intagits, ) förmåga hos patienten att utföra sina normala aktiviteter och 6) bedömning av sjnkdomssymptomens svårighetsgrad.

“De i anslütning till frågorna angivna siffervärdena anger de poäng, som åsatts varje svar för utvärdering av frågeformuläret. Vid be- dömning av frågorna avseende medicinering gjordes ett försök att återspegla den relativa antiinflammatoriska och analgetiska verkan' hos olika använda mediciner. En 324 mg “Aspirin~E)-tablett" åsat~ tes vät 1. Alla .övriga mediciner (med undantag av guld, “Pla- guenil “ och kortisonsprutor, vil a bedömdes separat) åsattes “. Alla övriga salicylatpref_ parat, såsom “Tylenol", "Darvon“ och "Mortrin“ bedömdes ekvivalen- "-tablett och åsattes också värdet 1.

Antalet gram kortison multiplicerades med fyra och antalet indocin- å (vikranhat = o,o64s "-tab- kapslar multipiícaraaas med 2,5. Antalet grain g) kodein multiplicerades med 2 och antalet "Butazoladin letter multiplicerades med 7.: I Medelpoängen för varje kategori framräknades för varje sexmânaders- period. Differenserna för medelvärden beräknades därefter genom att _ å! 448 344 subtrahera medelvärdena under administrering av immunmjölk från medelvärdena under administrering av kontrollmjölken. När resulta- ten framräknades på detta sätt, indikerades en förbättring i pá- tientens tillstånd under den period han erhöll immunmjölk med ne- gativa värden för proverna 1 och 6 och med positiva värden för al- r la övriga frågor. Medelvärdeskorrigerade värden för erytrocytsedi~ ementationshastigheten (ESR) och reumatoidfaktortitern (RF) visades på samma sätt. Dessa framräknades på sådant sätt att positiva vär- den återspeglar en lägre erytrocytsedimentationshastighet eller reumatoidfaktortiter under administrering av immunmjölk. värdena fframtogs statistiskt med användning av det statistiska analyssys- temet enligt Goodnight et al. (SAS Institute, Raleigh, N.C.).

Beräkningarna utfördes med hjälp av en dator IBM modell 370/155.

Resultat' 7 Immunmjölken tolererades väl av samtliga patienter med undantag av en, som led av periciös anemi. Denna patient klagade över diar- .rê och studiet av denne patient avbröts. Några patienter rapporte- rade en viktökning under behandlingens gäng. Denna kan ha berott på det ökade kaloriintaget från mjölken eller återspeglar eventuellt en allmän förbättring i deras fysiska välbefinnande. 16 448 344 :mw.w .#Q®fi0HHMmoMmflowvmwHm># ¶ Høxmwflflfiuflmnøm W Hfimndë mm@@,o ¶fl@m«1o| _ß.«: m.m« w@w,w íám ßm mm .w. @ßßß.o «ßm.o+ . ~.wm NN@.mm_ ß.mm mm~.wm mm mw mmm .ß mmvoo.o mmv.ø|¶ m.m« ßvv.N m.ß« «mm.v Å vmí ßw @«uHHø>m .U @~oo.o ww~,o1 :.~« åmN.~ w.wv mw@.« :N ßm »mnH@pm..p ¶m#oo»o¶ ::m.o« f.#«. ß:«.~ w.«N mo@.« àw mm Muw> .w ¶ ¶ ¶ main ¶ ¶ ¶ , ¶ nwfiwnww wflflpmnma .w mwøo.o omm,o+ vfam «ßæ.« v.@ß ¶ :Nm.N .àw ßw ¶ ¶ ¶ nnw .m wßmo.ø _«wo.o+ w.mßv ::m.o ¶ß,o:« mNm.o :N ßm ¶ qøfiwøxflflwa qmfln< .w mo#o.o m#«.:+ m.«o« m«m.m« «.:o« mwwfom àm um nwflfifim 1m¶ ovoo.o ¶mfm.o+ m.om mNß.ø @ ¶ß.m@¶ ¶ w:@,o ímm mm nwppmw .n ß~«o,o «w@«.o+ ß.m@ @m@.o mfww. v«wß.o, Nmí ww Hwfimqm .w mvoø,o «-»o+ o.mm mw@.o «.:ß #om.o ám ßm qmmx ,w møoo.ø woß.o+ o.mmv ßwm.ø m.o@ mmm,o íí àw mm ¶Hw»wwn .m v«Qo.o ¶,¶. m#m~o+ ¶ ¶ m.wm w~w.o ß.@m .mßolv dw mm Hwøqwn .w _o«oo.ø¶¶ ¶mwN.o+ ¶ ¶. w.:ß mmm.ø¶ w.mw :mw.o. :m ¶ ßw_¶ Hmwmfiwqmn .°. ¶ v«mo.o_ mm«.o+ ¶ m,m@¶ mf@.o_ ß.mw ¶mmw«o :N ¶ ßm flmflmwpanm .Q o~#o,o wmm.o+¶ m,o@ @«ß,o .«,ß@ ¶ :m@.o ¶¶«m_ ßw pmfiwm .~_ ¶ . ¶ ¶ . ¶ Mnw>@wm .N voøo,o ß:m.o| @.mß @ßw1o¶ ß,m@ ¶H¶Nßm.o :N »N pumflmpmnownos .« m mnønwwwflfl * > o _|Mwmmm ¶ # > o nflwwmm _ asaw ¶ Hfionpnom @øHw>H@@wz¶ mfiwfiamøaaw Mamflafiflønpqom nwøoflnmm nmfloflpd>nwmßo ~ ~......_-............._,......._......;,......_...... 448 544 _17 Såsom framgår av tabell 3 observerades patienterna under totalt, 27 kontrollperioder (sekmånadersperioder, under vilka de erhöll kontrollmjölk) och 24 testperioder (sexmånadersperioder under vilka de erhöll immunmjölk). En patient hade blivit utsatt för en_fysisk skada i en av anklarna och ena foten. Smärtan i dessa leder utvärderades ej, vilket är anledningen till det lägre anta- let perioder vad gäller utvärdering av dessa leder. Erytrocytsedi- mentationshastigheten för en patient var så extremt onormal (mer än tvâ_standardavvikelser från medelvärdena för övriga patienter) att de ej upptecknades. Detta är anledningen till det lägre anta- let observationer avseende denna variabel.

Medelvärdena och variationskoefficienterna (C.V;) är angivna i ta- bellen för varje variabel. Differenserna mellan medelvärdena fram- räknades genom att subtrahera medelvärdet erhållet under de perio- der patienterna mottog immunmjölk från de medelvärden som erhölls under perioder då de erhöll kontrollmjölk. En gynnsam reaktion på immunmjölken är indikerad med negativa värden för morgonstelhet (fråga 1) och månatlig förändring (frågorna 6a, b och c) och med positiva värden för övriga variabler. En effektiv reaktion på im- munmjölk erhölls för samtliga data ur frågeformulären. Sannolikhe- ten (P) indikerar en.hög grad av statistisk signifikans i varje försök. De små differensvärdena erhållna för erytrocytsedimenta- tionshastigheten och reumatoidfaktortitern var ej signifikanta.

När emellertid erytrocytsedimentationshastigheten bedömdes på in- dividuell basis, uppvisade fyra av de tjugo patienterna statistiskt g signifikanta sänkningar vid behandling med immunmjölk. Även om immunmjölk inte hade någon signifikant inverkan på-medel- värdena för reumatoidfaktortitern, fick man vid undersökning av enskilda patienter fram en del intressanta svar. Sju av de tjugo studerade patienterna hade negativ reumatoidfaktortiter vid minst ett tillfälle under den periody som de mottog immunmjölk. Fyra av dem blev negativa under den period de mottog immunmjölk och deras titer blev ej positiv under efterföljande sexmånadersperiod när ao mottog kontrollmjölk, såsom är visat 1 fig. 2) En fortsatt stu- .die efter denna rapportperiod visade att tretton av tjugofem pati- ontoähado förlorat roumatoidfaktorn 1 sitt blod. 448544 Z i 1sf Diskussion d j _ j.

Den vetenskapsman, som var ansvarig för dessa studier, intervjua- de personligen varje patient i månadsintervall och antecknade.de- ras svar på frågorna. Alla ansträngningar gjordes för att inte på- verka patientens svar. Patienterna informerades från början om och påmindes då och då om att de under vissa perioder av behand- lingen skulle få ett kontrollprov, Man förutsatte att patienten med denna vetskap skulle besvara frågorna mera objektivt och utan förutfattad mening. Inte vid något tillfälle informerades patien- terna om att de erhöll immunmjölk eller kontrollmjölk. I Frågan beträffande medicinering "igår" (fråga 3) och frågan avseen- de långtidsmedioinering (fråga 4) är objektiva och är av primär be- tydelse vid beaktande av svaren som ges på övriga frågor. Dessa 7 frågor är viktiga av två skäl: I I I ' Ti Om immunmjölken är effektiv, när det gäller att lindra symptom., av sjukdomen, skulle patienten förväntas ta mindre mediciner än vad som var tillåtet ad-libitum; Patienterna rapp rterade att de i medeltal intog fyra tabletter mindre av äÅspirin " eller därmed' ekvivalenta tabletter per dag under de perioder, som de erhöll im- munmjölk. De rapporterade också att de fick mindre mängd långtids- 'verkande medicin under dessa perioder och 2) om patienterna tog mindre mängder analgetika och andra mediçi- ner användbara för behandling av reumatoid artrit, Skulle man för- vänta sig att de skulle rapportera ett försämrat välbefinnande oav- sett immunmjölken påverkade sjukdomen gynnsamt. ” Såsom framgår av fig.'2 rapporterades signifikant mindre antal led- besvär under perioder då patienterna fick immunmjölk även om de intog mindre mängd mediciner för sin artrit.: Studiet av patienterna startade med månadsintervall under en ett- årsperiod ooh tilldelningen av typ av mjölkprodukt (immunmjölk el- ler kontrollmjölk) skedde slumpvis. Iakttagelsen att positiva svar eller förbättringar uppnåddes för samtliga parametrar i frågefor- muläret och att dessa medelvärden var statistiskt signifikanta är en stark indikation om att immunmjölken hade en gynnsam inverkan på patienterna, Denna slutsats förstärks av iakttagelsen att 20% av patienterna förnam en statistiskt signifikant (p < 0,05) sänk- m; är .h 448 544 19 'ning i erytrocytsedimentationshastigheten vid behandling med im- munmjölk. f_Resultaten av värdena för reumatoidfaktortitern är svåra att ut- värdera. Detta beror åtminstone_till en del på det faktum att reu- matoidfaktorns ursprung och roll i etiologin och prognosen för~. reumatoid artrit ej är kända. Rose et al (1948) har visat att rö- da blodcailer' nos får, sam senaibilniaerats maa antikroppar fràaka- nin, undergick agglutinering i närvaro av blodserum från patienter med reumatoid artrit. Resultatet beror av den specifika reaktionen mellan normal immunglobulin (lgG från antingen kanin eller männis- ka) med reumatoidfaktorer. Beteendet hos reumatoidfaktorn överens- stämmer väl med vad man kan förvänta sig hos antikroppar gentemot lgG (Epstein et al, 1956). Närvaron av reumatoidfaktorer har satts i samband med sjukdomens svårighetsgrad, när det gäller reumatoid. artrit och kan identifieras genom att iaktta ntfällda proteiner if vävnader hos patienter med reumatoid artrit. Även om en liten pro- centandel patienter med reumatoid artrit ej har positiv reumatoid- faktortiter anser de flesta reumatologer att positiva agglutine- _ ringsreaktioner ej övergår till negativa, även när sjukdomen är på återgång. De Forest et al (1958) har emellertid beskrivit ett litet antal patienter, som hade positiv reumatoidfaktortiter och som övergick till negativt efter sjukdomens återgång. När sjukdo- men bröt ut på nytt igen, blev provet ånyo positivt. Aho et al (1959) har emellertid noterat att de flesta patienter, vars sjuk- I domer blivit inaktiva, förblev serologiskt positivaa Det faktum att negativa titervärden iakttogs hos 60% av de i föreliggande un- _ dersökning undersökta patienterna och att hos hälften av dessa ti- tern förblev negativ under sex månader, visar att immunmjölk påver- kar en primär etiologisk faktor ansvarig för reumatoid artrit.

Immunmjölkens verkan när det gäller att undanröja symptomen av reumatoid artrit är särskilt relevant vid beaktande av den nyligen beskrivna relationen mellan histokompabilitetsantigenerna (HL-A) och mottagligheten för reumatisk sjukdom (Brewerton, 1976). Histo- kompabilitetsantigener är genetiskt fast1agda'antigener som åter- finns i alla människooeller. De gener, som bestämmer dessa anti- gener benämnas histokompabilitetsgener. Man känner för närvarande till över fyrtio av dessa genetiskt bestämda antigener. De är ana svariga för avvisningen av.överförd vävnad mellan andra individer 44s;344 V 1 20 än identiska tvillingar. I stort liknar histokompabilitetsantige- nerna ABO-blodgrupper genom att de ärvs under livstid. Deras funk- tioner är ännu ej kända.med undantag av i den mycket artificiella situationen vid transplantation. Det är emellertid känt att histo- ' kompabilitetsgenerna har nära förbindelse med immunsvargenerna_på ' den sjätte kromosomen; I detta sammanhang kan de vara bestämmande över immunsvaret hos en individ mot en främmande inbrytare, såsom den bakterie.

Personer med HLA-B27 tycks vara särskilt mottagliga mot en rad! reumatiska sjukdomar. Man har kunnat fastslå att denna histokomt -pabilitetsantigen dikterar en typ-av immunsvar, som i närvaro av -andra disponerande faktorer leder till renmatoid artrit. Efter en tarminfektion med Yersinia enterooolitica¿ utvecklar en del pati- ienter en akut perifer artrit (Ahovenen et al, 1969). På samma sätt utvecklar efter salmonellainfektion ca 2% av patienterna akut per- fer artrit (Warren, 1970). HLA-B27 återfanns hos fyrtiotre av fyrtionio patienter med yersinia arthritis och hos femton av sex- * ton patienter med salmonellaartrit (Aho, 1974). Det är ett intres- _sant konstaterande att infektionsämnen kan trivas.i tarmområdet utan att ge upphov till lokala symptom. Hos patienter med HLA-B27 'etableras_en reaktion som resulterar i artrit. Det är sålunda in- te nödvändigt att infektionsämnet vinner tillträde till lederna.

Immunmjölk är till gagn för patienter med reumatoid artrit, efter- som den innehåller antikroppar som effektivt inaktiverar_eller neutraliserar skadliga bakterier och/eller metaboliska produkter därav. ' 7 I *

Claims (4)

z 11fL' E! Zl “448 344 Patentkrav

1. Åntikropp för behandling_av reumatoid artrit förorsakad av ett . blandat spektrum av infektiösa bakterier som uppehåller sig i mag- tarmområdet, klä n n e t e c k n a t av att den erhållits genom att först bereda ett vaccin av avdödade bakterier från bakteriel- la antigener från the American Type Culture Collection inklude- rande:j Staphylococcus Aureus 2 11531 Staphylococcus epidermidis 155 Streptococcus pyogenes, A, typ 1 'e 3671

2." " " 3 1 10389 " 7 "c _ 2 “ 5 '12341 J “ . " “ s 12349 ,f " -_ " " 12 11434 * " 3 “Å - - “ 14 12972 " - 2" “ 18 12357 " 7 " “ 22 10403 _dAerobacter aerogehesl 1 - 1 534 '”Escherichia coli - _ 26 fsalmonella enteritidis 3 13076 Pseudomonas aeruginosa 7700 dxiebsieila pneumoniae 3 9590 _Salmonel1a typhimurium 13311 Haemophilus influenzae A 3 9333 I Streptococcus viridanse 6249 V Proteus vulgaris _ ~ _ 13315 Shigella dysenteriae I 11835 Streptococcus, grupp B Diplococcus pneumoniae Streptococcus mutans Corynebacterium, Acne, Typ 1 & 2 injicera detta vaccin intramuskulärt på friska kor en gång i veckan under fyra på varandra följande veckor och två gånger varje månad därefter, varvid varje injektion omfattar 20 x 108 bakterieceller; uppsamla mjölken innehållande antikroppen från de immunicerade korna med början den fjärde veckan och testar med avseende på titer för att säkerställa att minimititern mot var och en av bakterierna är 1-500, bestämd medelst makro- skoplskdagglutinatiøn71'provrör för kontroll av antikroppstltern. '^a' 448 344 '22 12. Produkt enligt krav 1, k ä n n e t e cak n a d av att anti- kropprodukten typ IgG är ren immunglobulin erhållen ur mjölk.

3. Sätt att framställa antikropp enligt krav 1, k ä n n e ~. t e c k n ajt av att man bereder ett vaccin av avdödade bakte- rierafrån bakteriella antigener från the American I lype Culture Collection inkluderande: 7 _ Staphylococcns aureus. f_f a11631 Staphylococcus epidermidis 11 ' 155 ištreptococcus pyogenes, A, typ 1 8671 " “ i a a " 3 - 10389 - i" 'v s 212347 -a " l - f " s a a y 12349 "a "12 ' a 11434 l :a " 2 " 14- i a 12972 - 'P18 'Å 12357 I" a ' f i *- z2 a 1o4o3 Aerobactër-aerogenesl 3 d _ ÉB4 Escherichia coli _ _ a I 2 2 26 "salmonella enterltldls a i 2 " 13016 Pseudomonas aeruginosa _ 7700 Klebsiella pneumoniae 2 _ ' a 1 1 9590 a Salmonella typhimuríum 13311 Haemophilus influenzae . _. ja 9333 Streptococcus viridans - 6249 Proteus vulgaris _ a " Z , 13315 Shigella dysenteriaeí" 11835 Streptococous, grupp B Diplococous pneumoniaea Streptococcus mutans 3 Corynebacterium; Acne, typ 1 & 2 _ Injioera detta vaccin intramuskulärt på friska kor och varje I vecka under fvra på varandra följande veckor och två gånger varje månad därefter; varvid varje injektion omfattar 20 x 108 ibakterieceller, uppsamlar mjölken innehållande antikroppen från de immünicerade korna med början den fjärde veckan och testar titern för att säkerställa att minimititern för anti~a kroppen mot var och en av bakterierna är 1~500, bestämd medelst makroskopisk agglutination i provrör för undersökning av antie (fr) k! 448 344 234 krøppstiter¿--

4. Sätt enligt kran 3 för firamställning av ett vaccin för inji- ~ cering på kor för framställningi.hmflæß mjölksystem av en anti- -kropp, k å n n e t erc k n a t av att man bereder kulturer av bakteriestammarna i lämpliga buffertar, avdödar bakterierna "genom upphettningy nppsamlar de avdödade bakterierna genom 4_centrifugering, tvättar bakteriestammarna, underkastar de tvättade bakteriestammarna lyofilisering; blandar de enskilda bakterietyperna på lika viktbasis och suspenderar de blandade 'bakteriestammarna i en lämplig bärare för injicering.