JP2664906B2 - 改良された哺乳類の免疫法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は抗原物質の接種による哺乳類の免疫方法に関
する。特に、本発明は通常の接種方法で達成されるより
高い抗体価［titer］及びリンフォカインレベルを達成
するようにウシ科動物に接種する改良方法に関する。 ［従来技術］ 最近の研究により、細菌抗原のスペクトルで処理され
た雌牛（cow）のようなウシ［bovid］動物からとった乳
を被験体が摂取した場合に病原性状態を緩和したり除去
するのに有用であることが見出された。乳の抗体価は又
はリンフォカインレベルが高いために、乳又は乳から誘
導された産物を摂取する被験体は、自己システムの抗体
又はリンフォカインのカウントを増大するので、所定の
免疫制御因子が有効な病理学的状態に対する抵抗性をよ
り有効にし克服することができる。 例えば米国特許4,284,623号明細書は、炎症状態を示
す宿主被検体に抗原スペクトルを接種された雌牛のよう
なウシから得られた乳又はそれから誘導された産物を摂
取することによって宿主の炎症を治療する方法を開示し
ている。この抗原は、細菌、ウイルス、又は細胞性抗原
との任意の組合せであることができ、単一本質的制限因
子は接種されたウシが免疫感受性状態を示す抗原投与に
応答し得ることである。この免疫感受性の状態は、動物
から得られる乳中の高い抗炎症性因子又は抗体因子によ
って反映される。抗炎症性因子又は免疫制御因子は、一
般にリンフォカイン［Iymphokine］としていわれる感作
リンパ球の産物である。このようにして得られた乳は、
乳又はそれから誘導した産物を摂取する被験体の炎症を
緩和することができる。 米国特許第4,324,782号明細書は、抗体を含む牛乳が
治療に有効な他の例を記載している。ストレプトコッカ
スムタンス［Streptococcus mutans］抗原の１以上の菌
株で免疫化した雌牛は、抗体含有乳を生産し、宿主が摂
取したときに口腔内のS.ムタンス菌の成長を防ぐのに有
効な抗体を宿主に生じて歯の腐食の予防を促進する。 各種の治療効果を有する乳を生産する方法の他の先行
技術が知られている。米国特許第3,128,230号明細書［H
einbach］は、α、β、γ画分のグロブリンを含む乳を
記載している。米国特許第3,376,198号及びカナダ特許
第587,849号明細書［Petersen］、米国特許出願（公
表）第628,987号明細書［Holm］及び英国特許第1,211,8
76号明細書［Tunnak et al］も抗体を含む乳を記載して
いる。 抗体を含む乳を得るための上記の方法は全て熟練した
獣医に良く知られた標準免疫方法で得られると記載され
ている。通常は、ウシ科動物は抗原含有液体の最初の注
射で免疫化され、最初の注射の後にウシの抗体価を免疫
状態に上げるために一定時間間隔で追加免疫［booste
r］注射が行われる。最初の一連の追加免疫注射後に動
物が十分な免疫状態ではない場合には、所望レベルの免
疫に達するために動物に第２のシリーズの注射によって
接種を行わなければならない。 接種の頻度及び達成できる抗体価に関して所望の目的
に十分な動物の抗体価レベルを得るウシ科動物の被験体
の接種に関連する問題の面から、所望の抗体価レベルに
達するために最小限の抗原物質の注射によってウシ科動
物の抗体及び／又はリンフォカインの高いレベルを達成
することができる方法に対する要望は依然として存在し
ている。 ［発明の開示］ 本発明の目的は、このように所定の抗原物質を従来の
免疫手順で必要とされるより少ない接種によって、哺乳
類特にウシ科動物における免疫状態を達成する方法を提
供することである。 本発明の他の目的は、乳中に抗体及びリンフォカイン
因子を生産する方法を提供することである。 簡潔に言えば、本発明のこの目的及び後に一層明らか
になる他の目的は、哺乳類に免疫応答を引出すのに十分
な量の抗原物質を投与し、抗原物質は生体適合性マトリ
ックスの成形構造体の形態で投与されることによって、
哺乳類を免疫状態にする方法によって達成することがで
きる。本方法の他の態様では、哺乳類に抗原物質を含む
成形マトリックス物質を投与すると同時に哺乳類に液体
抗原物質を接種することによって、免疫状態を一層迅速
に達成することができる。 本発明及びその利点は、添付の図面を考慮しながら次
の詳細な説明を参照することによって一層良く理解され
よう。 図面には、細菌抗原のＳ−100スペクトルに対して免
疫された牛［cattle］について時間の関数として光密度
IgG抗体価レベルをプロットしたグラフを示している。 ［発明の実施の最良の形態］ 本発明の核心は、哺乳類に少なくとも１の抗原物質を
含むものに成形された生体適合性マトリックス物質を移
植した場合には、抗原含有成形マトリックス物質の僅か
１回の処置のように少ないもので免疫応答が達成できる
ことを見出だしたことにある。 ここで見出だされたことの付加的な予期されなかった
面として、この抗原含有成形マトリックス物質を使用す
ることによって、従来の接種又は注射の方法によって達
するより高い抗体価及びリンフォカインのレベルを達成
することができることがある。 任意の哺乳類が本発明の技術によって抗原物質で処置
できる。好ましい群の哺乳類には、ボス［Bos］属、好
ましくは雌牛、羊及び山羊、特に好ましくは雌牛を含む
ウシ科の乳生産員がある。 本発明の抗原含有成形マトリックス物質は、生体適合
性、好ましくは生体内分解性又は生体内腐食性［bioero
dible］である重合体物質から一般に形成することがで
きる。生体適合性［biocompatible］の語は、組織の炎
症を生じることなくかつそれ自体では免疫反応を起こさ
ないという点で、哺乳類の組織、特に哺乳類の筋肉組織
と適合しなければならないことを意味する。生体内分解
性［biodegradable］の語は、成形抗原含有物のマトリ
ックス物質が体過程「body processes」によって、身体
によって容易に処理されるか又は容易に酸化される小さ
い分子単位に容易に分解されなければならないことを意
味する。分子単位自体も、高分子マトリックス物質と同
様に、生体適合性でなければならない。マトリックス物
質が生体内分解性でない場合に、少なくとも生体内腐食
性であるか、或いは体内にカプセル化抗原物質を放出さ
せるような浸透性の多孔質でなければならない。 本発明の分配システムがマトリックス物質の固体の成
形塊であって液状媒体ではないために、成形マトリック
ス物質が一旦哺乳類に投与されるとカプセル化抗原物質
は液体ビヒクル内の抗原の場合のように体内に直ちには
放出されないが、長期間に亙って制御された態様で徐々
に抗原物質が放出される。抗原がシステムに放出される
速度は、他の因子のうちでも用いるマトリックス物質、
その多孔性、マトリックス物質が分解又は腐食される速
度に左右される。勿論、個々のマトリックス物質はそれ
ぞれ自体に特有の放出速度を示す。抗原放出速度は、身
体が免疫応答を示すのに十分速くなければならないが、
カプセル化抗原の殆ど又は全部が極めて短期間に放出さ
れる程速すぎてはならない。成形マトリックス物質から
の抗原物質の放出は、マトリックスからの試薬の拡散又
はマトリックス物質の腐食或いは両因子が組合されるこ
とによって起こり得る。 抗原物質を含む成形マトリックス物質を形成すること
ができる適当な重合体マトリックス物質には、脂肪族ポ
リエステル、ポリオルトエステル、ポリ無水物、コポリ
オキザレート、ポリペプチド、及びポリジオキサノンが
ある。好ましい重合体マトリックス物質には、ポリ乳
酸、ポリグリコール酸、ポリ（乳酸−コーグリコール
酸）、ポリカプロラクトン、コポリオキザレート等があ
る。他の適当な重合体物質には、コラーゲン等のような
蛋白質、ステアリン酸グリセロールのような脂肪酸エス
テル、セルロースアセテートブチレートのようなセルロ
ースエステルがある。 抗原含有マトリックス物質の特定の成形構造体の製造
に際して、制御された放出の速度の異なる組成物を調製
することができる。処方の適当な方法の一つは、単一の
抗原又は少なくとも２種の抗原の混合物を特定構造の単
一マトリックス物質に配合することである。この方法
は、先に用いたマトリックス物質のものとは放出特性の
速度の異なる別のマトリックス物質で１回以上繰り返さ
れる。最後に、この抗原含有成形構造体を一緒にブレン
ドして放出速度の範囲を有する抗原放出処方を調製す
る。或いは、単一抗原又は抗原混合物を２種以上の異な
るマトリックス物質のブレンドに配合し、各成形構造体
を調製に用いたマトリックス物質のブレンドからなる製
品とすることによって抗原含有成形構造体が調製され
る。 本発明の好ましい態様においては、成形抗原含有マト
リックス物質は、微粒子のマトリックス物質の全体に亙
って配合された抗原物質を含む複数の微粒子［micropar
ticles］である。微粒子は任意の形状であり得る。形状
は混入した抗原物質の放出に関連する臨界的な因子では
ないからである。然しながら、一般には微粒子の形状は
球［spherical］である。好ましい製造方法では球状成
形微粒子が製造され、微小球［microspheres］の直径は
１〜500ミクロン、好ましくは10〜200ミクロンの間にあ
る。微粒子からの抗原の放出速度は、処方によっては大
きさに関連する。 微粒子を投与できる形態にするには、少量の界面活性
剤を含む食塩水のような身体への注射用の適当な液体ビ
ヒクル内に入れる。 選択される特定のマトリックス物質の分子量は、本発
明の成形抗原含有マトリックス物質の製造及び使用にお
いては臨界的因子ではない。重合体の分子量が増大する
と、マトリックス物質からの抗原物質の放出速度を徐々
に遅らせるけれども、インビボ又はインビトロの測定に
よってマトリックス物質からの抗原物質の放出速度を決
定し、それにより放出測定で得た結果に基づいて投与す
る成形抗原含有マトリックス物質及び微粒子の大きさ及
び抗原の重量のような他の設計因子を調節することによ
って、これらの因子を容易に補償することができる。 抗原含有微粒子の製造に際しては微粒子形成の通常の
方法を用いることができる。特定の方法の選択は、主と
してマトリックス物質の技術的要件及び微粒子を用いよ
うとする特定の態様に左右される。 一般に、マイクロカプセル化方法は、次の３の主なタ
イプに分けられる。即ち、（１）水性相と有機相との分
離過程、融解分散及び噴霧乾燥を含む相分離法、（２）
界面重合、その場での［in situ］重合及び化学蒸着を
含む界面反応、及び（３）流動床噴霧被覆、多−及び単
−オリフィス遠心被覆、静電被覆及び物理的蒸着を含む
物理的方法がある。 相分離法は、この語が暗示するように、異なる溶解特
性を利用して、壁−又は殻−形成マトリックス物質を溶
液又は懸濁液から分離させてカプセル化する抗原物質の
粒子又は小滴の回りに沈着させるものである。この分離
自体は、非溶媒の添加又は温度の変化のような物理的
に、或いはpHの変化のような化学的にもたらされるもの
である。 有機相を分離する工程には、通常は高分子量重合体の
有機溶媒溶液中の抗原物質の懸濁液又は乳濁液を用い
る。この混合物に非溶媒又は液体重合体を添加して高分
子量重合体を溶液から分離させ、懸濁した治療剤の回り
の殻［shell］として回収する。この殻は、溶媒で膨潤
したままであり、非溶媒を更に添加するか又は殻を強化
し障壁特性を改良する他の方法によって硬化させる。 典型的には、疎水性抗原の水溶液又は懸濁液を、適当
なマトリックス物質の非水性溶液に添加し、混合物を撹
拌して油中水乳濁液を形成させる。水への溶解度に応じ
て、この剤は水性相に５〜50％の濃度で存在することが
でき、これは混合物全体の５〜20重量％である。外部有
機相は５〜10％のマトリックス重合体を含むことができ
る。然しながら、内部相（水性の溶液又は懸濁液）内の
剤と重合体との比は通常は2:1〜1:4である。重合体は良
好なフィルム形成剤でなければならない。即ち、適当な
強さと堅さとを有していなければならない。 水性相を分離する工程には、重合体の水性溶液又は懸
濁液中の水不溶性抗原物質の懸濁液又は乳濁液を用い
る。重合体はゲル粒子として分離させる。これは、治療
剤の周囲に集まって殻を形成し、殻は硬化して微粒子が
単離される。最も一般的な水性相分離方法であるコアセ
ルベーション法においては、小滴の形態であり得る水不
溶性治療剤は水中でイオン化する親水性コロイドの水性
ゾル中に通常は分散し、混合物は水による希釈、塩の添
加、pHの調整又は温度変化、又はこれらの組合せでゲル
を生じる。コアセルベーションの適当な条件は通常は実
験的に定められる。使用可能な各種重合体は、その単離
又は製造の源又は方法によって物理的及び化学的にかな
り異なるからである。コアセルベーション領域は、種々
の濃度、温度及びpHレベルでの２種の重合体の溶液又は
ゾルを合わせることによってゲル化に必要な条件を観察
して決定する。これらの決定から、所定温度及びpHにお
ける適合性領域及びコアセルベーション領域を示す三元
ダイアグラムを作ることができる。それによって、ゲル
化をもたらす濃度、温度又はpHの変更が明らかになる。 微粒子のそれぞれの調製には、条件を注意深く制御す
ることが必要で、カプセル化する種々の物質のにより若
干異なる条件が必要となる。例えば、撹拌の程度は乳濁
液小滴の大きさに影響し、小滴の表面特性は小滴へのマ
トリックス物質の沈殿を確保しマイクロカプセル化に関
与しない粒子の形成を最小限にするために手順の変更を
必要とすることがある。希釈工程で添加する水の容量は
臨界的ではないが、一般には大きい小滴をカプセル化す
るときは安定な乳濁液を維持するには大容量が必要とな
る。 上記の相分離は、物質の安定な乳濁液又は懸濁液を形
成する第１工程がマトリックス物質の溶液へ剤を分散さ
せることによって行われる代替技術に適合させることが
できる。その後、乳濁液を非溶媒に撹拌しながら滴加し
て重合体被覆物質を沈殿させてマイクロカプセルを形成
する。 他のタイプの相分離技術は融解分散マイクロカプセル
化技術である。この方法は広範囲の物質に用いてカプセ
ル化できる。通常は、熱液化性ワックス状被覆物質、好
ましくはグリセロールジステアレートのような低融点ワ
ックスを、ワックスもカプセル化する物質も認識できる
ほどには溶解しないシリコンオイル又はフロロカーボン
のような不活性液体中に懸濁させる。この混合物を加熱
し、激しく撹拌してワックスを融解し乳化する。粉末化
し所望のサイズ範囲にふるい分けた治療剤及びワックス
状被覆物質を高剪断撹拌で分散させ、液状ワックス被覆
で治療剤を被覆してワックス状液体で被覆した微粒子を
形成する。その後、粒子を冷却させる連続撹拌によって
形成微粒子を固化させる。次いで微粒子を濾過し、上述
のように乾燥する。 第２の主要な微粒子形成法は、界面マイクロカプセル
化によるもので、反応体、通常は単量体のポリ縮合が起
こって薄い不溶性の重合体膜を形成する反応界面におい
て２種の反応体を一緒にすることを包含する方法であ
る。カプセル化方法の界面を確立する一つの技術は、第
２反応体を含む連続相の中にある縮合重合体を形成する
反応体の１種で抗原物質を分散又は乳化することであ
る。 第３の主要なカプセル化技術で各種の医薬又は治療及
び被覆物質に特に適用されるのは物理的マイクロカプセ
ル化である。物理的マイクロカプセル化技術の特徴は、
同軸又は順次配置オリフィスを備えた装置において被覆
物質の融解物又は溶液としての流動膜に物質の粒子又は
小滴を連続的に包むことである。 マイクロカプセル化の物理的方法には、液体又は固体
のコア物質を液状マトリックス物質の中を通過させるこ
とを包含するものがある。この流は、液体被覆した小滴
又は粒子の形成を生じさせる手段によって分断され、生
成する粒子は冷却するか或いは別の処理によって殻物質
を固体化する。例えば、カプセル化する物質の水溶液を
迅速に流れる融解グリセロールジステアレート流の中に
吸引し、混合物を微細ノズルを通して噴出させる。ノズ
ルから出るときに、液体流は小滴に分裂して、それぞれ
が液体ワックスに囲まれた水性コアからなる。これらが
空気中を落下するにつれて、殻は冷却固体化して微粒子
を形成する。この方法の他の態様では、推進力を回転体
によって供給して、コア物質を殻形成液体を通過して遠
心的に噴出させる。 マイクロカプセル化方法のこれらの方法や他の方法の
変形は多数ある。当業者には明らかなように、一の方法
又は条件の単一のセットが全ての物質に適用されるもの
ではないが、有用な方法が選択され、特定の剤で所望の
結果を達成するように最適化される。 抗原物質を含む微粒子を調製する好ましい方法では、
相分離技術が用いられ、重合体マトリックス物質の適当
な有機溶媒溶液を調製する。この溶液に、抗原物質を水
に懸濁又は溶解して又は微細粒子単独で添加する。撹拌
した分散液に重合体マトリックス物質の非溶媒を徐々に
添加し、重合体物質を抗原物質の周囲に徐々に沈殿させ
て微粒子を形成する。重合体マトリックス物質の第２の
非溶媒を添加して微粒子を更に硬化させる。次いで微粒
子を濾過して単離し乾燥する。 本発明の他の態様においては、マトリックス物質を含
有する成形した抗原物質は、ロッド、ウエファ、長方形
の膜又はブロックのような微粒子以外の形態であること
もできる。それぞれの場合において、抗原物質はマトリ
ックス物質の全体に亙って分散される。マトリックスの
中に分散される抗原物質の量は、移植したマトリックス
物質によって長期間に亙り混入された［entrapped］抗
原物質が放出されて免疫応答を引き出すのに十分の量で
ある。これらの成形物は免疫化が望まれる哺乳類の皮下
移植に特に適している。 米国特許第3,887,699号明細書［Yoles］には、被験体
への皮下移植用の各種の形状及び大きさの医薬含有成形
重合体物品が開示されている。この特許明細書の記載
は、物品が皮下移植に特に適した生体適合性及び生体内
分解性重合体マトリックス物質からの各種成形物の調製
に関する限り、かつ各種形状の生体適合性及び生体内分
解性重合体マトリックス物質の調製に関する限り、引用
して本明細書に挿入する。 成形した抗原物質含有マトリックス物質は種々の方法
で投与できる。成形マトリックスが微粒子の形態である
場合、最も便宜な投与方法は筋肉内注射であるが、微粒
子を皮下移植することもできる。マトリックス物質がロ
ッド、ウエファ、膜等の物品に成形された場合には、最
も一般的で便宜な方法は皮下移植である。 本発明の所望の目的は、哺乳類を高度免疫［hyperimm
une］状態にすると共に、乳に抗体及びリンフォカイン
因子を産生させることである。通常の投与方法による
と、この状態は液状ビヒクル中の抗体又は抗体混合物を
哺乳類に初期接種した後、高度免疫状態に達するのに必
要な十分に高い量の抗原又は抗原混合物を数回追加免疫
注射することで達成されるのが通常である。普通は、追
加免疫注射は２週間間隔で用いると哺乳類の体液は高い
抗体価レベルに達する。哺乳類の体液が充分に高い抗体
価レベルを含むことになるのは哺乳類が高度免疫状態に
ある場合のみである。雌牛のようなウシ科動物の場合、
高度免疫雌牛の乳は免疫制御因子を高いレベルで有し、
乳を各種の異なる用途に有用にする。 本発明の利点は、成形抗原物質含有マトリックス物質
の単一移植によって高度免疫状態に達するのに追加免疫
注射を必要としないばかりでなく、通常の接種法に比較
して哺乳類及び雌牛の乳中に抗体及びリンフォカインを
含む免疫制御因子の高い水準を得ることができることは
全く予想外で重要なことである。本発明の技術において
は抗原物質はマトリックス物質の全体に亙って分布する
ために、マトリックス物質から徐々に放出されて処置動
物に抗原物質の持続的連続的な放出がもたらされる。抗
原物質のこの投与法は、所定量の抗原物質が瞬間的に投
与された後は、次に抗原物質が接種されるまで哺乳類の
体内の抗原物質の水準が減少していく抗原物質接種とは
極めて異なるものである。そのため、本発明方法で免疫
化される哺乳類にどの程度の抗原物質を投与するかを述
べることは極めて困難である。多分一定の哺乳類には0.
01〜1.0mg/日の割合で抗原物質が投与される。本発明の
方法によって達成される予想外に高い免疫制御因子レベ
ルは、抗原物質のレベルが処置される哺乳類の体組織内
に長期間に亙って比較的一定のレベルで維持されること
によるものであろう。本発明の抗原物質含有マトリック
ス物質がどの特定の態様で投与されても、分配システム
は高度免疫状態に達するのに充分の時間に亙って抗原物
質のレベルを連続して維持するに充分な抗原物質を含ま
なければならないことは明らかであろう。例えば注射当
たり通常の投与量において約10⁹死滅細菌細胞を用いる
ことができるが、この数は使用する抗原のタイプによっ
て当然に変り得る。 本発明の他の態様によると、成形抗原物質含有マトリ
ックス物質の移植と同時に被験体哺乳類にカプセル化抗
原物質を投与する本発明の移植の変形法によって一層高
い抗体価を得ることができる。換言すると、被験体哺乳
類は移植時にカプセル化されていない抗原物質を接種
し、それにより被験体哺乳類は即時に高い抗原レベルに
おくことができる。この方法は、基礎的移植技術だけで
高い抗体価レベルに達することができる速度より迅速に
被験動物に高い抗体価をもたらす望ましい効果を奏す
る。微粒子を皮下又は筋肉内注射する本発明の態様にお
いては、液体ビヒクル内の抗原物質が微粒子と共に又は
他の位置で被験体哺乳類に接種することができる。成形
マトリックス物質を被験動物に移植する場合、非カプセ
ル化抗原物質は成形抗原物質含有マトリックス物質で移
植するか、又は別の位置で被験動物に接触することがで
きる。 接種哺乳類が抗原物質に感受性になるかどうかを測定
する必要がある。感受性についての免疫試験には当業者
に既知の多くの方法がある［Methods in Immunology an
d ImmunoChemistry,William,C.A.,Chase,W.M.,Academic
Press,N.Y.,London,Vol.1−5,1977］。この試験の例に
は、皮膚感受性試験、抗原を刺激する抗体の存在のため
の血清試験、抗原に応答する被験体からの免疫細胞の能
力を評価する試験がある。利用する試験のタイプは用い
る抗原物質の特性に左右されるところが大きい。好まし
い方法は、抗原物質として多重細菌種からなる多価ワク
チンを使用すること及びワクチンで免疫性の試験をする
前後の哺乳類血清中の凝集抗体の存在を試験することで
ある。ウシ科の場合、ワクチンによる免疫の後の乳抗体
の外観は感受性の指標であり、ウシ科の生産する抗体含
有乳は所望の目的に用いることができる。 被験体哺乳類に成形マトリックス物質を導入するため
及び後の移植のための抗原物質としては任意の抗原又は
抗原混合物を用いることができる。抗原は細菌性、ウイ
ルス性、細胞性又は哺乳類の免疫システムが応答する他
の物質でもよい。抗原又は抗原混合物は細菌性又はウイ
ルス性であることが好ましいが、多価抗原も好ましい。
適当な細菌性抗原には、ネイセリア ゴノレア［Neisse
ria qonorrhea］、ミコバクテリウム ツベルクロシス
［Mycobacterium tuberculosis］、ヘモフィラス バジ
ナリス［Haemophilus vaginalis］、群ｂストレプトコ
ッカス エコリ［Group b Streptococcus ecoli］、ミ
クロプラスマ ホミニス［Microplasma hominis］、ス
タフィロコッカス アウレウス［Staphylococcus aureu
s］、スタフィロコッカス エピデルミヂス［Staphyloc
occus epidermidis］、ストレプトコッカス ピロゲネ
ス［Streptococcus pyrogenes］、ストレプトコッカス
ムタンス［Streptococcus mutans］、アエロバクテル
アエロゲネス［Aerobacter aerogenes］、エシェリキ
ア コリ［Escherichia coli］、サルネモラ エンテリ
チディス［Salmonella enteritidis］、プソイドモナス
アエルギノサ［Pseudomonas aeruginosa］、クレブシ
ェラ ニュウモニアエ［Klebsiella pneumoniae］、サ
ルモネラ チフィムリウム［Salmonella typhimuriu
m］、ヘモフィラス インフルエンザエ［Haemophilus i
nfluenzae］、ストレプトコッカス ピリダンス［Strep
tococcus viridans］、プロテウス ブルガリス［Prote
us vulgaris］、シゲラ ジセンテリアエ［Shigella d
ysenteriae］、ストレプトコッカス群Ｂ［Streptococcu
s GroupB］、ヂプロコッカス ニュウモニアエ［Diploc
occus pneumoniae］、コリネバクテリウム アクネ［Co
rynebacterium Acne］タイプ１及び２、ヘモフィラス
ヅクレイイ［Hemophilus ducreyi］、グラヌロマ イン
グイナル［Granuloma inguinale］、リンフォパシア
ベネレウム［Lymphopathia venereum］、トレポネマ
パリデウム［Treponema pallidum］、ブルセラ アボル
タス［Brucella abortus］、ブルセラ メリテンシス
［Brucella melitensis］、ブルセラ スイス［Brucell
a suis］、ブルセラ カニス［Brucella canis］、カン
ピロバクタ フェツス［Campylobacter fetus］、カン
ピロバクタ フェツス インテスチナリス［Campylobac
ter fetus intestinalis］、レプトスピラ ポモナ［le
ptospira pomona］、リステリア モノシトゲネス［Lis
teria monocytogenes］、ブルセラ オビス［Brucella
ovis］、クラミヂア プシタッチ［Chlamydia psitacc
i］、エシェリキア コリ［Eucherichia coli］、アク
チノバシラス エクリ［Actinobacillus equuli］、サ
ルモネラ アボルタス オビス［Salmonella abortus o
vis］、サルネモラ アボルタス エキ［Salmonella ab
ortus equi］、コルネバクテリウム エキ［Corynebact
erium equi］、コルネバクテリウム ピオゲネス［Cory
nebacterium pyogenes］、アクチノバシラス セミニス
［Actinobaccilus seminis］、ミコプラスマ ボビニタ
リウム［Mycoplasma Bovigenitalium］、クロストリジ
ウム テタニ［Clostridium tetani］、プソイドモナス
マルトフィア［Pseudomonas maltophiia］、ストレプ
トコッカス エキシミリ［Streptococcus equisimil
i］、ストレプトコッカス ジスガラクチアエ［Strepto
coccus dysgalactiae］、ストレプトコッカス ウベリ
ス［Streptococcus uberis］、ストレプトコッカス ボ
ビス［Streptococcus bovis］、パスツレラ ムルトシ
ダ［Pasteurella multocida］、パスツレラ ヘモリチ
カ［Pasteurella hamemolytica］、モラキセラ ボビス
［Moraxella bovis］、アクチノバシラス リグニエレ
シ［Actinobacillus lignieresi］、コリネバクテリウ
ム レナレ［Corynebacterium renale］、フソバクテリ
ウム ネクロフォルム［Fusobacterium necrophoru
m］、バシラス セレウス［Bacillus cereus］、サルモ
ネラ ダブリン［Salmonella dublin］、サルモネラ
ハイデルベルグ［Salmonella heidelberg］、サルモネ
ラ パラチフィ［Salmonella paratyphi］及びイエルシ
ニア エテロコリチカ［Yersinia enterocolitica］が
ある。好ましいウイルス性抗原にはエキネヘルペス ウ
イルス［Equine herpes virus］、エキネ アルテリチ
ス ウイルス［Equine arteritis virus］、IBR−IBPウ
イルス、BVD−MDウイルス、ヘルペスウイルス（フモニ
スタイプ［humonis type］１及び２）がある。 本発明の方法は、哺乳類に高いレベルの免疫を生じさ
せるのに用いることができる。従って、乳生産ウシ科動
物は、抗体及びリンフォカイン含有乳を生産する本技術
によって高度免疫化することができる。リンフォカイン
因子は、米国特許第4,284,623号明細書に記載されてい
るように炎症に対して有効であり、また1983年10月27日
に出願された米国特許出願第546,162号明細書に記載さ
れているように心臓血管及び肺動脈状態を弱らせる他の
条件に対して有効である。本発明の方法は、米国特許第
4,324,782号明細書に記載されているように虫歯、プラ
ーク形成及び歯肉炎を促進する細菌に対して有効な特異
抗原含有乳の生産、及び1982年４月20日及び1982年７月
18日にそれぞれ出願された米国特許出願第370,139号及
び第399,266号明細書に記載されているように臭及び疾
患を起こす皮膚細菌に対して有効な抗体含有乳の生産に
用いることもできる。或いは、本発明の方法は、哺乳類
を免疫化できる疾病に対して全ての哺乳類を免疫化する
一般技術として用いることができる。この哺乳類にはヒ
トも含まれる。 Ｓ−100ワクチンの調製 アメリカン タイプ カルチャー コレクション（AT
CC）から得られた次の表１に示す細菌スペクトルを含む
細菌培養を15mlの培地で再構成して37℃で一夜培養し
た。良好な成長が得られた後、約半分の細菌懸濁体を接
種に用い、接種物を含むブロス１リットルを37℃で培養
した。残りの懸濁体は殺菌グリコールチューブに移し、
−20℃で６か月まで貯蔵した。 良好な成長がリットル培養で見えるようになった後、
懸濁体を20分間遠心分離して培地を除くことによって細
菌細胞を収得した。得られる細菌ペレットを細菌食塩水
に再懸濁し、細菌試料を３回遠心分離して細胞から培地
を洗い流した。第３回殺菌食塩水洗浄の後、遠心分離で
得られた細菌ペレットを少量の二重蒸留水に再懸濁し
た。 懸濁体を80℃の湯浴中のガラスフラスコ中に一夜おく
ことによって、培地を含まない細菌懸濁体を熱死滅させ
た。少量の熱死滅細菌をブロス培養に接種して試料中の
細菌の生存度を測定した。ブロスは37℃で５日間培養
し、成長を毎日チェックした。ワクチンに用いるために
は細菌は死滅させなければならないからである。 熱死滅細菌は凍結乾燥した。次いで乾燥細菌は殺菌食
塩水と混合して2.2×10⁸細菌細胞/ml塩水（660nmにおけ
る光学密度読みは1.0）の濃度とした。 例１ 次の表２に示す番号を付した８の雌牛に多価液体ワク
チンの5ml試料を毎日注射した。注射した牛について抗
体［IgG］の抗体価レベルを定期的に測定した。抗体［I
gG］の抗体価レベルは、酵素結合免疫検定［ELISA］シ
ステムを用いて測定し、終点は雌牛の乳から得られる抗
体含有液体試料の410nmにおける光学密度読みであり、
各雌牛から得られた個々の読みは次の表に示す。表に
は、得られた個々の光学密度読み値から定められる平均
光学密度読みを示す。各測定期間における平均光学密度
から定められる平均IgG抗体価レベルも表２に示した。
図は表２の結果をグラフに示したものである。 例２ 熱死滅細菌を上述の方法で調製した。得られた多価抗
原試料［Ｓ−100］を通常の相分離法でマイクロカプセ
ル化して多価抗原含有微粒子製品を調製した。用いた重
合体マトリックス物質は生体内分解性ポリ（ラクチド−
コグリコライド）であった。微粒子の直径は250ミクロ
ン未満であった。次いで、22％［16.5mg］の多価抗原含
有微粒子の約750mgを約3ccのビヒクル［水中に１重量％
のTween及び２重量％のカルボキシメチルセルロース］
に懸濁させた。 牛の大群から牛の小グループを選定した。このように
ランダムに選んだ５の牛を対照として選定した。次の表
３で、398、408、414及び400の番号を付した４の牛に上
述のようにして調製した微粒子含有溶液の注射で処置し
た。 この４の雌牛に多価抗原含有微粒子を1982年４月23日
に筋肉内注射をした。微粒子試料B022−41−１及びB022
−41−２は2.0mラドのガンマ線照射で殺菌したが、試料
B022−41−３及びB022−41−４は殺菌しなかった。接種
雌牛及び対照雌牛から得られる牛乳の試料から抗体［Ig
G］抗体価レベルを定期的に測定した。得られたデータ
を表３に示す。 例１及び２から得られる結果は、動物、特にウシ科動
物に抗原含有微粒子の少量の接種で免疫状態を達成する
本発明の技術が動物に抗原含有注射溶液を接種する従来
の方法より優れていることを示すものである。 これまで本発明を十分に説明したが、本発明の範囲及
び精神を逸脱することなく多くの変更及び変形は当業者
に明らかであろう。

【図面の簡単な説明】 図は、表２の結果を示したグラフである。

フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭54−113425（ＪＰ，Ａ) 特開 昭49−86525（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−118512（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−100516（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−190833（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−55114（ＪＰ，Ａ) 米国特許3887699（ＵＳ，Ａ) 欧州公開7895（ＥＰ，Ａ１) 欧州公開64103（ＥＰ，Ａ２)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．高度免疫応答を引出すのに有効な量の抗原物質をウ
   シ科哺乳類の筋肉内又は皮下に移植し、該抗原物質は熱
   死滅細菌でありかつその制御された放出を生じる生体適
   合性であって生体内劣化性の重合体マトリックス物質
   の、大きさが１〜500ミクロンの成形微粒子内に導入さ
   れていることによって該ウシ科哺乳類内の抗原活性を延
   長するものであり、かつ通常より高められた高抗体価を
   有する乳を回収することを包含する高められたIgG抗体
   レベルを有する乳を提供する方法。 ２．該重合体物質が、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポ
   リ（乳酸−コーグリコール酸）、ポリカプロラクトン、
   ポリしゅう酸、ポリジオキサノン、ポリオルトエステル
   又はこれらの重合体の塩形態である特許請求の範囲第１
   項に記載の方法。 ３．該抗原物質が少なくとも２の複数の熱死滅細菌であ
   る特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ４．成形構造体内の該熱死滅細菌又は少なくとも２の複
   数の熱死滅細菌が、少なくとも２の異なる生体劣化性で
   あって生体適合性の重合体の混合物内に該熱死滅細菌又
   は少なくとも２の熱死滅細菌を導入することによって調
   製され、該重合体はそれぞれの生体内劣化速度が異なる
   ものであり、それによって重合体マトリックス物質の混
   合物で構成される個々の微粒子が形成される特許請求の
   範囲第１項又は第３項に記載の方法。 ５．成形構造体内の該熱死滅細菌又は少なくとも２の複
   数の熱死滅細菌が、（ａ）該熱死滅細菌又は少なくとも
   ２の熱死滅細菌を単一の重合体マトリックス物質に導入
   し、（ｂ）工程（ａ）のマトリックス物質に用いた最初
   のものとは異なる生体内劣化速度を有する異なる重合体
   マトリックス物質で少なくとも１回工程（ａ）の方法を
   別個に繰り返し、次いで（ｃ）別個に調製した熱死滅細
   菌含有微粒子バッチをブレンドして微粒子形成の調製を
   完了することによって調製される特許請求の範囲第１項
   又は第３項に記載の方法。 ６．少なくとも２の異なる生体内劣化性であって生体適
   合性の重合体が、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ
   （乳酸−コーグリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポ
   リしゅう酸、ポリジオキサノン、ポリオルトエステル及
   びこれらの重合体の塩形態からなる群から選ばれる特許
   請求の範囲第４項に記載の方法。 ７．該別個の微粒子調製工程に用いられる重合体物質
   が、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（乳酸−コーグ
   リコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリしゅう酸、ポ
   リジオキサノン、ポリオルトエステル及びこれらの重合
   体の塩形態からなる群から選ばれる特許請求の範囲第５
   項に記載の方法。 ８．該抗原物質が単一熱死滅細菌又は少なくとも２の熱
   死滅細菌である特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ９．該抗原物質が、ネイセリア ゴノレア、ミコバクテ
   リウム ツベルクロシス、ヘモフィラス バジナリス、
   群ｂ ストレプトコッカス エコリ、ミコプラスマ ホ
   ミニス、スタフィロコッカス オウレウス、スタフィロ
   コッカス エピデルミヂス、ストレプトコッカス ピロ
   ゲネス、ストレプトコッカス ムタンス、アエロバクテ
   ル アエロゲネス、エシェリキア コリ、サルモネラ
   エテリチヂス、プソイドモナス アエルギノサ、クレブ
   シエラ ニューモニア、サルモネラ チフィムリウム、
   ヘモフィラス インフルエンザ、ストレプトコッカス
   ビリダンス、プロテウス ブルガリス、シゲラ ヂセン
   テリアエ、ストレプトコッカス 群Ｂ、ヂプロコッカス
   ニューモニアエ、コリネバクテリウム アクネ タイ
   プ １及び２、ヘモフィラス ヅクレイイ、グラヌロマ
   イングイナル、リンフォパシア ベネレウム トレポ
   ネマ パリヅム、ブルセラ アボルタス、ブルセラ メ
   リテンシス、ブルセラ スイス、ブルセラ カニス、カ
   ンピロバクテル フェタス、カンピロバクテル フェタ
   ス インテスチナリス、レプトスピラ ポモナ、リステ
   リア モノシトゲネス、ブルセラ オビス、クラミジア
   プシタッチ、アクチノバシラス エクウリ、サルモネ
   ラ アボルタス オビス、サルモネラ アボルタス エ
   クイ、コリネバクテリウム エクイ、コリネバクテリウ
   ム ピオゲネス、アクチノバシラス セミニス、ミコプ
   ラスマ ボビゲニタリウム、クロストリヂウム テナ
   ニ、プソイドモナス マルトフィア、ストレプトコッカ
   ス エキシミリ、ストレプトコッカス、ヂスガラクチア
   エ、ストレプトコッカス ウベリス、ストレプトコッカ
   ス ボビス、パステウレラ ムルトシダエ、パステウレ
   ラ ヘモリチカ、モラクセラ ボビス、アクチノバシラ
   ス リグニエレシ、コリネバクテリウム レナレ、フソ
   バクテリウム、ネクロフォラム、バシラス セレウス、
   サルモネラ ダブリン、サルモネラ ハイデルベルグ、
   サルモネラ パラチフィ、及びイェルシナ エンテロコ
   リチカからなる群から選ばれる少なくとも１の熱死滅細
   菌である特許請求の範囲第８項に記載の方法。 １０．該ウシ科が雌牛である特許請求の範囲第１項に記
   載の方法。 １１．該熱死滅細菌含有成形マトリックス物質がマイク
   ロフェア、ロッド、ウエファ又はフィルムの形態である
   特許請求の範囲第１項に記載の方法。 １２．該熱死滅細菌物質含有成形マトリックス物質の該
   哺乳類へ移植及び該熱死滅細菌物質含有液体の該哺乳類
   への接種を同時に行うことによって、該免疫状態が達成
   される特許請求の範囲第１項に記載の方法。