JPH04506931A - タンパク質マイクロスフェアを生産する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質マイクロスフェアを生産する方法発明の背景 本出願はＥｄｉｔｈ　Ｍａｔｈｉｏｖｔｔｚ、Ｈｏｗａｒｄ　Ｂｅｒｎｓｔｅｉ ｎ、Ｅｒ１ｃ　ＭｏｒｒｅｌおよびＫｉｒｓｔｅｎ　Ｓｃｈｗａｌｌｅｒにより 、１９８９年、１１月６日りこ出願された°ＭｅｔｈＯｄ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｄｖ ｃｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐａｒｔｉａｌｅｓ　ａｎｄ　Ｃｏａｔｉｎｇｓ” と題する米国特許出願第Ｎ０１０７／４３２．７８５号の一部継続出願である。

種々の用途に用いるマイクロスフェアおよびマイクロカプセルを作製するために 多くのプロセスが利用されている。多くのマイクロスフェアは、ポリ（乳酸）あ るいはポリオルトエステルのような合成ポリマーで作製され、溶媒蒸発、噴霧乾 燥、または、相分離により形成される。マイクロスフェアあるいはマイクロカプ セルが薬物送達のために使用される時は、このプロセスによって、小さく、大き さおよび薬物分配が均一な、そして制御された分解性を有する生産物が回収され るべきである。

タンパク質もまた、薬物送達のためのマイクロパーティクルまたはマイクロスフ ェアを形成するために用いられている。

Ｒ，Ｃ，Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ、　Ｐｏｌ　ｍｅｒｔｃ　Ｎａｎｏ　ａｒｔ、１ｃ ｌｅｓ　ａｎｄ　Ｍｉｅｒｏｓ　ｈｅｒｅｓ　Ｇｕｆｏｔ　ａｎｄ　Ｃｏｕｖｅ ｕｒＪｇ集、第１　ｉＥ、　ｐｐ、ｌ−２５（ＣＲＣＰｒｅｓｓ、１９８６）に は、タンパク質を用いた形成、性質、および薬物送達を総説している。大部分は グルタルアルデヒドを用いた溶液中で架橋されているか、あるいは高温で堅めら れている。残念ながら、取り込まれた物質の生物学的活性の顕著な損失および制 御された大きさの欠如および加コニ匹分解速度の問題がある。例えば、５ｕｚｕ ｋｉら、Ｃｈｅｗ、　Ｐｈａｒｔ　Ｂｕｌｌ、３７（４）、１０５１−１０５４ （１９８９）で報告されているように、薬物を含むゼイン溶液を架橋することに より化学療法剤のキャリアーとして調製されたゼイン（ｚｅｉｎ）マイクロスフ ェアは、大きさが極めて不均一で、しかも薬物の３０％より少ない取り込みしか 示さなかった。同グループは、Ｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、　３７， ７５７−７５９（ＩＪ８９）において収量と大きさの範囲は、触媒量のｄｌ−カ ンフルスル、ｆ＋　：／　酸ｃＤ　添加、ならびにポリビニルピロリドン、界面 活性剤およびバインダーの急速な添加により改善されたことを報告した。しかし ながら、薬物の取り込みはなお３５％より少なかった。Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｅ、によるＰＣＴＵＳ８７ １０２０２５では、混合アミノ酸の熱凝縮ポリマーである「プロテノイド（ｐｒ ｏｔｅｎｏｉｄｓ）　Ｊから作製されたマイクロスフェアの薬物送達のための調 製と使用を報告している。これらの物質は有用な性質を持っており、特定用途の ため、およびｐＨの作用によって標的付けした放出をするように設計されている 。

同様のプロセスで、タンパク質は、農業の用途に細菌を取り込んだ、グルタルア ルデヒドで架橋されたビーズを作るために用いられている。

タンパク質はまた、薬物送達のためのインブラント、ならびに薬剤を含む重合体 マイクロカプセルのためのコーティング剤および可塑剤を作製するために用いら れている。例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ　ＡＧのＥＰＯ１５８２７７にはペプチドｂ ｕｓｅｒｅｌｆｒ＋を制御して放出するためのインブラント可能な調製物が記載 されている。

この中でゼインをキャリアーとしτ用い、これはペプチドおよびゼインをアルコ ールに溶解し、得られた混合物を噴霧乾燥および成形することにより形成してい る。田辺製薬■によるＥＰＯ０７７９５６には、コーティングの標準手法、即ち 噴霧コーティングまたは浸漬を用いて形成される、マイクロカプセルの腸溶コー ティングのためのゼインおよび他のタンパク質の使用について述べている。住友 化学ＫＫのＪＰ８０１３７９３６号は、ゼインおよび他のタンパク質ならびに材 料のエチルセルロースおよびメチルセルロースマイクロカプセルにおける可塑剤 としての使用を概説している。

Ｗｏ　９０１０３１２３として国際公開されたＰＣＴ／ＵＳ８９１０３９９１に は、有機溶剤中で疎水性タンパク質を溶解し、次にこのタンパク質を水中で沈澱 させることにより形成されるマイクロスフェアについて述べられている。得られ るマイクロスフェアは極めて多孔性で、アイスクリームやマヨネーズなどの食品 中で脂肪の代替品として非常に有効であることが報告されている。

タンパク質薬物送達デバイスを生産するこれらの方法はいずれも、生物学的に活 性な物質（特に不安定な物質）を高い割合で、経口的に投与された時血流中を直 接に通過するのに充分な程小さいか、あるいは一定の遊離速度と大きさである均 一なマイクロスフェア中に取り込ませるためには用い得ない。他のプロセスのい ずれによっても、バインダーまたは架橋剤が存在しないような、天然タンパク質 のみからなる物質を得られない。

それ故に、本発明の目的は、制御された、あるいは標的された全身的あるいは局 所的薬物送達のために用い得る生分解性ノタンパク質マイクロスフェアであって 、特に不安定な物質および疎水性化合物の送達のためのマイクロスフェアを作製 するための方法およびその生産物を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、診断剤としてのおよび放射線画像における使用のた めの生分解性のタンパク質マイクロスフェアを提供することである。

さらに、本発明のもう一つの目的は、環境中へ薬剤を制御して遅延放出するため の送達システムを作製する方法およびその産物を提供することにある。この薬剤 には、酵素、ホルモン、農薬、および栄養分が包含される。

及豆二！ｌ タンパク質マイクロスフェアは、非溶媒中における相分離、その後の抽出または 蒸発による溶媒除去により形成される。

好適なタンパク質は、疎水性かつ生分解性のゼインのようなプロラミンであって 、生体中でペプチドおよび／またはアミノ酸に代謝され、タンパク質分解的にま たは化学的に容易に修飾され得る。例えば、架橋化されもしくは誘導体化され、 選択的な分解速度のような所望の性質が付与するされ得る。

マイクロスフェアは、タンパク質の混合物、またはタン７４り質と一つ以上のポ リ乳酸のような、生分解性の合成重合物質との混合物から、タンパク質被覆物と 同じように調製され得る。マイクロスフェアを形成する本プロセスの利点には、 通常４５℃以下の低温の使用、グルタルアルデヒドのような架橋剤の非存在が含 まれる。

化合物はマイクロスフェアに容易に取り込まれ、その後放出される。マイクロス フェアは、薬物送達ならびに農薬、栄養分、および環境浄化のための薬剤の遅延 放出を含む多くの用途用にサイズを変えて形成され得る。薬物送達は局所的にま たは全身的に達成し得る。５ミクロン以下の範囲のマイクロスフェアサイズおよ び投与方法の選択は、マイクロパーティクルを細網内皮系の細胞へ、あるいは口 もしくは宵ａｔの粘膜へ標的付けするのに使用し得る。マイクロスフェアにより 形成されるより大きなインブラントはまた、特に農業用途に使用し得る。

図面の簡単な説明 図ＩＡおよび図ＩＢは、ナノメーター範囲（図ＩＡ）およびマイクロメーター範 囲（図ＩＢ）の直径を持つ粒子の百分率サイズ分布である。

図２Ａおよび図２Ｂは、マイクロスフェアでのインシュリンのＰＢＳへの％累積 放出の時間（ｈｒ）に対するグラフである；図２Ａ：ゼイン（１７％Ｗ／Ｗイン シュリン）（［−］）；Ｚ−Ｃ６（塗すツぶし［コ）；Ｚ−Ｃ８（［］）；ｚ− ＣＩＯ（塗りつぶし△）；Ｚ−Ｃ１２（△）；図２８：脱アミデートゼイン（［ −］）；脱アミデートゼイン（ＤＡ−Ｚ）−０６（塗りつぶしく＞）；　ＤＡ− Ｚ−Ｃ８（塗りつぶし［］）：　］ＤＡ−Ｚ−ＣＩＯ（＜＞）；　ＤＡ−Ｚ−Ｃ １２（塗りつぶし［コ）。

図３は、ゼインおよび脱アミデートしたゼインのブレンド（５０：５０）から形 成されたマイクロスフェアからのインシュリンの％累積放出の時間（ｈｒ）に対 するグラフである。

１豆ユ１皿呈豆豆 本明細書の用語「マイクロ」は、ナノメーターからマイクロメーターの直径を持 つ粒子のことをいう。マイクロスフェアは固体の球状の粒子である一マイクロパ ーティクルは不規則なまたは非球状形の粒子をいう。マイクロスフェアはマイク ロスフェアを形成するために使用したもとの物質とは異なる組成の外膜を持ち得 る。別に特記しなければ、用語マイクロスフェアは、マイクロカプセルを包含す るように用いられ得、そして用語マイクロパーティクルは、マイクロパーティク ル、マイクロスフェア、およびマイクロカプセルを包含するように用いられ得る 。「コンポジットマイクロスフェア」は、タンパク質およびポリマーまたは２種 のタンパク質のいずれかの、少なくとも２［の異なる物質から形成されたマイク ロスフェアである。「コンポジット」は、本明細書では、作製されたマイクロス フェアが、この目的のために当業者に知られた物質と結合している集合体をいう 。

本明細書に述べられている方法を用いて、タンパク質マイクロスフェアは相分離 、溶媒除去プロセスにより調製される。

マイクロスフェアの形成は、水と混和し得る有機溶媒、塩溶液、あるいは酸もし くはアルカリ溶液中のタンパク質の溶解度を非極性有機溶媒あるいはオイルのよ うな非混和相中の溶解度と比べた時の差に依存する。大部分のタンパク質はオイ ルに溶けない。従って、タンパク質は、水と混和し得る有機、有機／水系、また は二元性有機溶媒、酸、塩基または塩溶液（被包相）である第一溶媒に溶ける。

懸濁液、エマルジョン、溶液あるいは粒子の形態の、取り込まれる化合物は、タ ンパク質溶液に添加される。次にこの混合物は、タンパク質を溶解せずかつ第一 溶媒との混和性が制限されている第二液相（連続相）と接触される。この連続相 は好ましくは植物油、シリコンオイルまたは鉱油のようなオイルである。激しく 攪拌され、そして第一溶媒は、通常蒸発あるいは抽出により、マイクロスフェア を形成するのに十分な条件下で除去される。

コーティングはまた、タンパク質または非タンパク質ポリマーから作られるマイ クロパーティクルの上に作製され得る。

コーティングを作るために、（１）タンパク質はまず溶媒に溶解される；　（２ ）被覆される粒子またはマイクロパーティクルがその溶液に添加される；　（３ ）タンパク質コーティングのためにタンパク質／マイクロパーティクル混合物が 、第一溶媒と混和しないそして非溶剤である第二液相に添加される；　（４）混 合物は攪拌される；そして（５）粒子またはマイクロパーティクルがタンパク質 コーティングで被覆されるのに十分な条件下で、第一溶媒が除去される（通常蒸 発によりまたは抽出により）。

本明細書で述べるプロセスによって、ナノメーターとマイクロメーターの間の直 径（平均直径がＯ，ＯＸミクロンから約１００ミクロンより小さい）を持ち、そ の中に所望の時間でおよび／′または部位に送達または放出される化合物を取り 込んでいるタンパク質マイクロスフェアが得られる。好適な方法においては、マ イクロスフェアは長期間に渡って取り込まれた化合物の安定性を高めるために凍 結される。

タンパク質マイクロスフェアを含む組成物は、分解性あるいは非分解性でも、天 然あるいは合成でも、ポリマー中にタンパク質マイクロスフェアを被包する標準 手法を用いて形成され得る。これらの物質は当業者によく知られている。タンパ ク質マイクロスフェアはまた、当業者に知られた他の技術により圧縮または成形 される。

〔マイクロスフェアを形成するために有用なタンパク質コ好適な実施態様におい て、タンパク質はプロラミン、好ましくはゼインのような、疎水性のタンパク質 である。本明細書で使用される場合、タンノくり質は、単一種のタンｌ〈り質、 タンパク質の組合わせ、またはタンパク質とポリマーの組み合わせであり得る。

タンパク質は天然であり、性質が多種多様であり、そして江−±飄で無害のアミ ノ酸または小ペプチドに分解されるので、マイクロスフェアを作製するのに用い られる。疎水性タンパク質は水中における溶解度が制限されており、有機溶媒、 有機溶媒の水系混合物、および有機溶媒の二元性混合物に可溶性である。プロラ ミン以外の他の１１なタンパク質の例としてはコラーゲン、カゼイン、ケラチン がある。

プロラミンは、グルタミン、アスパラギンおよびプロリンなどの疎水性アミノ酸 を多く持つことによって特徴づけられる。プロラミンは水に不溶性であるが、多 くの有機溶媒、特に、少なくとも１％、しかし６０％を越えない水を含むアルコ ール類、または極性有機溶媒に溶ける。

プロラミンは、例えば穀類加工の副産物として得られ、容易に利用でき、安価で ある。代表的なプロラミンには、グリアジン、カフィリン、ゼインおよびホルデ インが包含される。

マイクロスフェアを作る用途に好適なプロラミンは、ゼインである。市販の等級 および精製された形態のゼインの両方が使用され得る。ゼインの性質は詳細にり 、　Ｃ，５Ｗａｌ　ｔｅｎの”Ｚｅｉｎ−Ａ　Ｎｅｗ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　 Ｐｒｏｔｅｉｎ”、Ｉｎｄ、　ａｎｄ　Ｅｎ　、　Ｃｈｅｍ、、３３：３９４− ３９８　（１９４１）中に記載されている。

［マイクロスフェアの作製に使用するタンパク質のための溶媒〕 タンパク質は適切な溶媒に溶解される。タンパク質は、０゜５％（Ｗ／Ｖ）を超 えて溶媒に溶け、室温（約２０−２５℃）で可視的に透明な溶液となれば「可溶 性」である。プロラミンは、例えば、それぞれ５％と６０％との間の水を含むア ルコール（エタノール）、幾つかのケトン類（例えばメチルエチルケトン、アセ トン）およびアミド溶媒（例えば、アセトアミド）；極端に高い（例えばｐＨ１ ０以上）または極端に低い（ｐＨ２以下）ｐ［１溶液；および約１．０から約６ Ｎ無機塩（例えば、ＮａＣ１、ＫＢｒ）の水溶液に可溶性である。ゼインのため の多くの二元性溶媒系が知られており、主成分は特に低級脂肪族アルコール、ケ トン、またはグリコールなどポリオールであり、副成分は、水、芳香族炭化水素 、ノ・ロゲン化炭化水素、特に塩素化炭化水素、ニトロパラフィン、アルデヒド および環状エステルである。特殊な例には、アルコールおよびハロゲン化炭化水 素の混合物ならびにアルコールおよびエチレンゲルコールおよびプロピレンゲル コールの混合物が含まれる。ゼインのようなプロラミンに対する二元溶媒系は、 ＭａｎｌｅｙおよびＥｖａｎｓ、Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｅｎ　１ｎｓ ｅｒｉｎ　Ｃｈｅ１区■３６．６６１−６６５（１９４３）に報告されている。

し連続相に好適な物質〕 取り込まれるべき化合物がタンパク質溶液に添加される。

化合物は懸濁液、溶液（オイル、有機溶媒または水）、エマルジョン、または粒 子の形態であり得る。次に化合物／タンパク質混合物は、次のような性質を持つ 第二液相に導入される＝　（１）タンパク質溶媒と混和しない、または混和しに くい、および（２）タンパク質を溶解しない。溶媒は、もしそれらが混合なしで 、作用温度で安定な均一溶液を形成するように互いに混合しない場合、「非混和 性」である。非混和相は、これらの条件下では分離相を形成する傾向にある。鉱 油、シリコンオイル、または植物性部などのオイルは有用な非混合相である。ヘ キサン、ヘプタン、ドデカン、および高沸点の石油エーテルなども含まれる。

一種またはそれ以上の界面活性剤が、タンパク質／第一溶媒混合物、または連続 相に加えられ得、タンパク質マイクロスフェアの大きさを減少させ得る。適切な 界面活性剤、およびその使用法は当業者に自明である。

［マイクロスフェアを形成するプロセス］タンパク質溶液は連続相に添加され、 混合物は激しく攪拌され、そして第一溶媒は、例えば、好ましくは蒸発によりま たは溶媒抽出により、マイクロスフェアを形成する条件下で除去される。効果的 な混合は、ホモジナイザーを用いた急速な機械的攪拌によりおよび／または層流 を妨げる邪魔板反応器を用いることによって達成され得る。もＩ、７必要なら、 混合物は約１５分と４５分の間の時間、２２℃と約４５℃の間の温度に加熱され 得る。加熱された場合、混合物は最初室温まで冷却され、次に化合物を取り込ん だマイクロスフェアは洗浄され、混合物から分離され、そして乾燥される。もし 取り込まれた親水性薬剤が水系溶媒で不安定なら、マイクロスフェアは凍結乾燥 され得る。

親水性化合物がマイクロパーティクル以外のマイクロスフェアに取り込まれる場 合の別の実施態様においては、二重エマルジョン手法が用いられる。例えば、取 り込まれる化合物は最初に水溶液に溶解される。ゼインは適切な低い水混和性の 二元性有機混合物に溶解される。ゼイン用の多くの二元性有機溶剤が知られてお り、例えば、メタノール、エタノールまたはインプロパツールのようなアルコー ルとハロゲン化炭化水素の混合物でハロゲン化炭化水素を主要成分とする混合物 がある。水溶液がゼインの有機溶液に添加され、油中水エマルジョンが作製され る。次にこのエマルジョンは、連続相である、第二の有機液体相であって、オイ ルのようなぜイン用の有機溶媒と非混和性または混和しにくい有機液体相に添加 され、二重の油中水エマルジョンを形成させる。次にこの溶媒は上記で述べたよ うに除去され、マイクロスフェアが形成される。

［マイクロスフェアの改変］ マイクロスフェアの性質は所与の用途のために改変され得る。例えば、マイクロ スフェアを形成する前に化学的におよび／または酵素的に出発タンパク質は改変 される。そのような改変によって、熱安定性、表面反応性、脂溶性、分子量、荷 電、せん断安定性およびプロテアーゼ耐性が高められたり、あるいは変えられた りしたタンパク質が生産され得る。

〔タンパク質の酵素的改変コ タンパク質の機能性、表面特性、および分子量の分布は、酵素処理によって改変 され得る。例えば、約３８，０００ダルトンの分子量をもつ二重体のゼインの酵 素的加水分解が、９０％エタノール中でパパインまたはキモトリプシンなどのプ ロテアーゼを用いて行われた場合、完全なタンパク質に特徴的な溶解性を保持し ている、約ｉ、ｏｏｏダルトンの分子量を持つポリペプチドが得られる。すなわ ち、ポリペプチドはなお水に不溶であるが、９０％；、タノールに溶ける。加水 分解の程度は、使用酵素の量またはタンパク質が酵素に接する反応時間を変える ことにより制御され得る。

タンパク質の安定性は、相分離プロセス中の使用に先立ってタンパク質を架橋す ることにより高められる。このことは、トランスグルタミナーゼ、またはタンパ ク質ジスルフィドイソメラーゼのようなタンパク質の分子内および／または分子 間の架橋を触媒する酵素の添加によりなされる。トランスグルタミナーゼ、およ びタンパク質ジスルフィドイソメラーゼは、それぞれ、アミノ酸グルタミンおよ びシスティンを介してタンパク質の分子内および分子間架橋を引き起こす。トラ ンスグルタミナーゼは、アミノ酸グルタミンのアミド基がアシル供与体である、 アシル転移反応を触媒する。マイクロスフェアの形成前後でタンパク質の性質を 変える、他の酵素的プロセスが知られている。

［タンパク質の化学的改変］ マイクロスフェアの性質はまた、その調製で用いられるタンパク質の化学的改変 により、マイクロスフェアの形成の前か後のいずれかで改変され得る。このよう な改変には、タンパク質を、ひとつまたはそれ以上のアミノ酸側鎖の構造を変え 、そのことによりタンパク質の性質を変える。酸、塩基、あるいは他の物質で処 理することが含まれ得る。例えば、プロラミン、特にゼインの高グルタミンおよ びアスパラギン含量によって、脱アミデーシコンによりタンパク質の荷電性、そ してそれ故、疎水性を操作する手段が提供される。好適な脱アミデージョン法に は、上昇温度（２５℃および６５℃の間）で、所望の程度の脱アミデージ３ンが 成されるのに十分な時間、温和な酸に触媒された脱アミデージ璽ン（約ｐＨ１で ）を行うことが含まれる。脱アミデージョンプロセスの後にアンモニア電極でア ンモニアの放出を測定し得る。脱アミデージョンは炭酸アンモニウムまたはその 他の塩基の添加により停止され得る。

化学的改変の他の例には、タンパク質生産物の酸（または塩基）ｇ受性を変え得 る高級アルコールによるタンパク質のエステル化、または脂肪族無水物によるタ ンパク質のアシル化が含まれる。例えば、ゼインまたはゼインペプチドは上記の ように脱アミデートされ得、次に脱アミデートされたゼインはタンパク質の脂肪 酸エステルを形成するために脂肪酸と反応され得る。脱アミデートされないまた は脱アミデートされたゼインペプチドはまた、高級アルコールと反応し、脂肪族 エステルゼインまたはゼインペプチドが形成され得る。次にこれらの脂肪酸で改 変したタンパク質またはペプチドは、マイクロスフェアを形成する出発物質とし て使用し得る。

タンパク質の電荷はまた、グルタルアルデヒドまたはカルボジイミドを用いてタ ンパク質にアミノ酸またはポリアミノ酸を架橋することにより改変され得る。

タンパク質はマイクロスフェアの形成前あるいは後で改変され得る。しかし、相 分離プロセスの有利な点は、マイクロスフェアの形成後のタンパク質の苛酷な化 学物質処理または熱処理が要求されない点である。従って、グルタルアルデヒド のような架橋のための物質を使用してタンパク質を改変することが望ましい場合 、タンパク質は送達されるべき化合物の取り込みおよびマイクロスフェアの形成 の前に処理される。

［タンパク質−ポリマーマイクロスフェアの形成コタンパク質は非タンパク質ポ リマーと結合し、コンポジットマイクロスフェアを形成し得る。生侵食性の合成 または天然ポリマーが好適である。本明細書の用語［生侵食性（ｂｆｏｅｒｏｄ ｉｂｌｅ）Ｊ　、または「生分解性（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ）　Ｊは、酵 素的または化学的にｉｎ　ｖｔｖｏでより単純な化学物質に分解される物質をい う。天然ポリマーの例には、多糖類である。ｉｎ　ｖｉｖｏで無害な産物に分解 する合成ポリマーは、ポリ（乳酸）　（Ｉ’ＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（Ｐ ＧＡ）およびＰＬＡとＰＧＡのコポリマー、ポリオルトエステル、ポリ無水物、 ポリホスファゼン、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブチレ−１・、および その混合物、共重合体が包含される。

ＰＬＡ、ＰＧＡ、およびＰＬＡ／ＰＧＡ共重合体は、プロラミンコンポジットマ イクロスフェアを形成するのに特に有用である。ＰＬＡポリマーは、通常乳酸の 環状エステルから調製される。Ｌ（＋）およびＤ　（−）　皇の乳酸の両方およ びＤ（−）およびＬ（＋）乳酸の混合物である光学不活性ＤＬ−乳酸混合物が、 ＰＬＡポリマーを調製するのに使用し得る。

ポリラクチドを調製する方法は特許文献に良く記載されている。以下の米国特許 の教示は、本明細書に参考として援用され、適切なポリラクチド、それらの性質 および調製を詳細に記載している：　Ｄｏｒｏｕｇｈの第１．９９５．　’１７ ０号、５ｅｈｎｅｉｄｅｒの第２．７０３、３１６号、Ｓａｌｚｂｅｒｇの第２ ．７５８．９８７号、Ｚｅｉｌｅの策２．９５１．８２８号、Ｈｉｇｇｉｎｓの 第２．６７６、９４５号；およびＴｒｅｈｕの第２．６８３．１３６号；第３、 ５３１．５６１号。

ＰＧＡはグリコール酸くヒドロキシ酢酸）のホモポリマーである。グリコール酸 のポリ（グリフール酸）への転換において、。グリコール酸は最初はそれ０身で 反応し環状エステルグリコリドを生じ、加熱および触媒の存在下で、高分子量の 直鎖状のポリマーに転換される。ＰＧＡポリマーおよびその性質は、＋Ｃｙａｎ ａｍｉｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｄｅｖｅｌｏｐｓ　Ｗｏｒｌｄ’ｓ　Ｆｔｒｓｔ 　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ　Ｓｕｔ、ｕｒｅ”、　Ｃｈｅｎ ＋ｉｕ■」匡ユニ社旦り、　９０５　（１９７０）に、より詳細に記載されてい る。

取り込まれた化合物の放出およびマトリックスの生分解の両者はＰＬＡ、ＰＧＡ またはＰＬＡ／ＰＧＡの分子量に関係する。分子量が大きいほど（重量平均分子 量が９０，０００以上）、より長い期間、構造保全を保持するポリマーマトリッ クスが得られる；一方、より低い分子量（重量平均分子量が３０，０００以下） では、より遅い放出およびより短いマトリックス寿命となる。

タンパク質混合物、またはプロラミン／ＰＬＡ、プロラミン／ＰＧＡあるいはプ ロラミン／ＰＬＡ−ＰＧＡのようなタンパク質−ポリマー混合物から作られるマ トリックスは、種々の分解速度および拡散速度に設計され得る。一般的に、分解 はタンパク質およびポリマー組成の関数である。拡散はマトリックス組成、形、 および取り込まれる物質の性質の関数である。マトリックスは取り込まれる化合 物の放出期間より短い、等しい、あるいはより長い期間にわたって分解されるよ うに合成され得る。化合物は拡散により、マトリックスの分解により、またはマ トリ・１クスを介する拡散とマトリックス分解としての放出との組み合わせによ り放出され得る。

これらのコンポジットマトリックスはいくつかの形態のうちのいずれかをとり得 る：ポリマーコーティングされたタンパク質マイクロスフェア；タンパク質によ り被包されたポリマーマイクロパーティクルまたはマイクロカプセル；ポリマー により被包された生物活性の化合物およびタンパク質マイクロスフェア；または 取り込まれた生物活性の化合物および生物活性化合物の存在あるいは非存在下で の、ポリマーで被包されたタンパク質マイクロスフェア。

〔取り込まれ得る化合物］ 疎水性および親水性化合物の両者がマイクロスフェアに取り込まれ得る。疎水性 化合物は、通常タンパク質と共に水／有機相溶液中で共溶解される。親水性化合 物は、通常粒子状物質としてタンパク質中に分散されるが、上記の二重エマルジ ョンプロセスまたは二元溶媒系も化合物を溶解するために使用し得る。粒子状物 質の使用によって初期に放出される化合物が、タンパク質溶液中に溶解している 時に比べて、より多くバーストする。

薬物送達のため、治療、予防、または診断活性を持つ生物学的に活性な物質が送 達され得る。・これらは有機または無機化合物、タンパク質、またはビタミン、 ミネラル、アミノ酸および脂肪などの栄養物を含む広汎な種類の他の化合物であ り得る。物質の例には、ホルモン、抗原、抗体、ステロイド、うっ血除去薬、神 経活性剤および麻酔薬もしくは鎮静剤が包含される。作用物質は、非荷電分子、 分子複合体の成分、または薬学的に受容可能な塩化水素−２臭化水素、硫酸塩、 リン酸塩、硝酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩（ｍａｌｅａｔｅ）　、、 酒石酸塩およびサリチル酸塩等の塩類など種々の形態であり得る。酸性薬剤には 、金属塩、アミンまたは有機カチオン（例えば第四アンモニウム）が使用し得る 。薬剤の単純誘導体くエーテル、エステル、およびアミド等）であって、所望の 保持および放出特性をもつものもまた、使用し得る。

金属、放射性同位体、バリウム等放射線不透過性の作用物質を含む造影剤、およ び空気を包含する放射線透過性の作用物質もまた取り込まれ得る。空気はマイク ロスフェア作製前にタンパク質溶液を超音波処理または攪拌することにより被包 され得る。空気で満たされたボイドを含むマイクロスフェアは放射線像で非常に 有用である。

色素、香料、芳香剤など種々の他の生物学的に活性でない作用物質もまた、単独 または生物学的に活性な作用物質との組み合わせで取り込まれ得る。

取り込まれる他の化合物には、農薬、栄養分、フェロモン、および環境浄化に使 用される作用物質（細菌、キレート剤、およびリパーゼおよびプロテアーゼなど の酵素）が含まれ得る。

送達デバイスに取り込まれる化合物の量は、広く多様であって、特定の作用物質 、所望の効果および７トリ、２クスが化合物を放出するのにかかる時間に依存す る。デバイスに取り込まれる化合物の量に関する上限および下限は、ある範囲の 化合物を包むマイクロスフェアと比較することにより、経験的に決定され得る。

［本性により生産されるマイクロスフェアの大きさ］マイクロスフェアは、ナノ メーターサイズのマイクロパーティクルから約１００ミクロンの平均粒子サイズ までに渡り、種々の大きさで生産され得る。約５０〜１１００ｎから約２０ミク ロンの平均粒子サイズを持つマイクロスフェアが好ましい。約１００　ｎｒｎか ら約５ミクロンの平均粒子サイズを持つマイクロスフェアが、薬物送達の用途に は特に好適である。

なぜならば、このサイズ範囲のマイクロスフェアは、血流および／またはリンパ 系に吸収され、または食作用を受け得るからである。

マイクロスフェアの大きさおよび他の特性は、走査電子顕微鏡、（ＳＥＭ）、光 散乱および差動走査熱量計（ＤＳＣ）を用いて決定し得る。本発明の方法により 生産されるマイクロスフェアのサイズ範囲は図ＩＡおよび図ＩＢに示される。

［タンパク質コーティングの調製］ タンパク質コーティングは、マイクロスフェアを作る方法の変法を用いて作られ る。被覆される粒子（一様の形態でない粒子、マイクロスフェアおよびマイクロ カプセルを含む）は任意の重合体物質、通常、非タンパク質性物質もしくは修飾 タンパク質、または単に放出されるべき物質から作られ得る。コーティングを形 成するため、タンパク質は溶解され、コートされる粒子が添加され、そしてタン パク質／マイクロパーティクル混合物が連続相に添加され、混合物は攪拌され、 そして溶媒が好ましくは蒸発により、または溶媒抽出によりタンパク質コーティ ングで被覆される粒子を生ずる条件下で除去される。

［マイクロスフェアのコンポジットの調製］マイクロスフェアは、もっばらタン パク質で形成されるか、あるいは、ポリマーとの組み合わせで形成され、または タンパク質で被覆され、単独または生物活性な作用物質との組み合わせで、当業 者に知られた技術を用いてコンポジ・ノドに成形され得る。好適な方法では、マ イクロスフェアを鋳型中で圧縮する。結合剤または界面活性剤がコンポジ・ノド の形成を容易にするために添加され得る。マイクロスフェアはまた、溶媒の除去 または温度低下により固化するポリマー溶液中に投入され得る。

本発明の方法は、特に薬物送達用途のためのユニークなタンパク質マイクロスフ ェアおよびタンパク質コーティングを提供する。この方法は、再現性良くそして 効果的に、均一なの大きさまたは直径範囲のタンパク質マイクロスフェアを生産 する。この方法は、所望の直径またはサイズ分布、放出速度または分解速度など 所望の特性を持つマイクロスフェアを生産することにおいてかなりの柔軟性を持 つ。さらに、この方法では、生物学的に活性な化合物を効率的に取り込む（例え ば、多くの場合９０％より多く取り込む）、安定なマイクロスフェアが生産され る。マイクロスフェアおよびコーティングは安全で、毒性がなく、モしてｆｎ　 ｖｉｖｏでアミノ酸または小ペプチドに分解される。この方法はまた、基質上に 保護的な毒性のないタンパク質コーティングを提供するのに使用し得る。この方 法およびその生産物は、さらに特定の限定しない実施態様に沿って記載される。

［実施例１：タンパク質インシュリンの粒子を含むプロラミンマイクロスフェア の調製コ 本発明の好適な実施態様において、プロラミンマイクロスフェアの懸濁液は、プ ロラミンを第一溶媒である９０％エタノールに溶解して、被包相を形成し、取り 込まれる化合物を添加し、そして混合物を攪拌させてプロラミン溶液を非混和連 続相であるコーンオイルに分散させることにより生産される。次に第一溶媒は好 適な温度範囲２０°Ｃと６５℃との間で蒸発により除去される。プロラミンは非 混和相に不溶性であり、そして第一溶媒の蒸発後に沈澱し、マイクロスフェアの 懸濁液を形成する。混合物は室温まで冷却され、オイルを除去するために石油エ ーテルなどのような溶媒で洗浄され、濾過される。洗浄および濾過工程はオイル を除去するために必要なだけ繰り返される。一般的には約３〜５回の洗浄が必要 である。次に洗浄されたマイクロスフェアは、通常、減圧下または凍結乾燥によ り乾燥される。この方法は、固体の亜鉛インシュリンを、２種の異なった含有量 （４，８％および９％（Ｗ／Ｗ））で取り込んでいるゼインマイクロスフェアを 作るのに使用された。０．４ｇのゼインを９０％エタノール（Ｐｈａｒ＋ａｃｏ 　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）の８．０ｍｌ中に 溶かし、５％（Ｗ／Ｖ）ゼイン（Ｔｙｐｅ　Ｆ−５０００，Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｔ ｎｄ、。

Ｔｕｃｋａｈｏｅ、　ＮＹ）溶液を作成した。０．０２ｇのインシュリン（Ｃａ ｌｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｉｎｃ、、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）を８．０ｍｌゼ イン溶液に添加し４．８％含有量のマイクロスフェアを作成した。０゜０４ｇの インシュリンを８．０ｍｌのゼイン溶液に溶かし、９％含有量のマイクロスフェ アを作成した。インシュリンは、９０％エタノールに溶けないので小さな粒子と して添加された。このインシュリン粒子の平均直径は３．２ミクロンであった。

ゼイン／アルコール／インシュリン混合物は１５０ｍ１の冷コーンオイル（Ｍａ ｚｏｌａ　Ｃｏｒｎ　０ｉｌ）に導入され、そして約１．５分間ホモジナイズ（ Ｖｉｒｔｉｓ　Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ、　Ｖｉｒｔｉｓ　Ｃｏｒｐ、）され、 次に２００ｍ１の冷コーンオイルを入れた大きいビーカーに移され、ライトニン グミキサー（Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ　Ｍｉｘｅｒ）で８０Ｏｒｐｍで混合された。

混合物は約４５分間４５℃に加熱され、次に室温にまで冷却された。得られたマ イクロスフェアは繰り返し石油エーテルでオイルを除去するために洗浄され、濾 過された。次にマイクロスフェアは、−晩、室温で減圧上乾燥された。

ＳＥＭ研究によって、この方法で生産されたゼインマイクロスフェアは半身孔性 の構造を持つことが示される。それらは通常形態が球状で、表面に小孔を持つ。

断面図により、内部が多孔性構造であることが示される。マイクロスフェアは１ ミクロンと２０ミクロンの間の直径を持っている。ＤＳＣ研究によって、被包化 のプロセスはゼインの変性を引き起こさないことが示される。しかし、連続相と して使用されるオイルの型は９５°Ｃ付近で起こる融合（変性）の熱に影響を与 え得る。

［実施例２：ゼイン溶液に溶ける小さな有機分子のローダミンＢを含むゼインマ イクロスフェアの調製コ蛍光色素ローダミンＢを取り込んだゼインマイクロスフ ェアは、０．００８ｇのローダミンＢ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ＊１ｃａｌ　Ｃｏ 、）をインシュリンの代わりに用いたことを除いて、実施例１に記載の手法に従 って調製された。ローダミンＢは、ゼイン溶液に可溶性である。

［実施例３：可溶性インシュリンを含むゼインマイクロスフェアの調製コ インシュリンを含むゼインマイクロパーティクルは、取り込まれるインシュリン の最終量が１７％、３０％または４２％（Ｗ／Ｗ）で、そしてインシュリンが５ ％ゼイン（Ｗ／Ｖ）を含む９０％エタノール−１０％水、ｐＨ２，５−３，０（ Ｉ　Ｎ　ＨＣ１で調整）であることを除いて、実施例１で説明した手法に従って 調製された。このｐＨでは、インシュリンはゼインと共に溶液中に残る。次にこ の混合液は実施例１に記載されたように、コーンオイル混合物に添加され、イン シュリンを含むゼインマイクロスフェアが作製された。ＳＥＭによってマイクロ スフェアが密な構造を持つことが示された。

［実施例４：ローダミンＢを含む、ゼインで被包されたＰＬＡマイクロスフェア の調製］ ＰＬＡマイクロスフェアは、以下のように調製された：ＰＬＡのＩｇをメチレン クロライドの１０ｍ１中に溶かし、そして０．０２ｇのローダミンＢを溶液に添 加した。ＰＬＡｌｏ　−ｆ　ミンＢ溶液は、１％ポリビニルアルコール（ＤｕＰ ｏｎｔ；　Ｗｉ！ｍｉｎｇｔｏｎ、　ＤＥ）を含む４００ｍ１の水溶液に、Ｖｉ ｒｔｉｓ　２３高剪断ミキサー（Ｔｈｅ　Ｖｉｒｔｉｓ　Ｃｏ、、　Ｃａｒｄｉ ｎｅｒ、　ＮＹ）を用いて分散された。分散は、ライトニングミキサーを１００ 　Ｏｒｐｍで用い、すべてのメチレンクロライドが蒸発してマイクロスフェアが 形成されるまで一晩中攪拌した。得られたマイクロスフェアは水で洗浄され、濾 過されそして減圧オーブンで乾燥された。

約１ミクロンから約１０ミクロンの範囲の直径を持つローダミンマイクロパーテ ィクルを含むＰＬＡマイクロスフェアは、この方法によって形成された。

ＰＬＡ／ローダミンマイクロスフェアは、次の手法でコートされた：ｏ、４ｇの ＰＬＡ／ローダミンマイクロスフェアを９０％エタノール（エタノール：水の比 は９０：１０）の１０ｍＪ中に溶かした０、５ｇのゼインを含む、ゼイ７溶Ｍｘ ｏｍｌに添加した。そして高剪断ミキサーで分散体を作るように攪拌された。分 散体は高剪断攪拌でコーンオイル中に導入され、そしてコーンオイルは実施例１ で概略を記載した手順に従って、加熱された。得られたマイクロスフェアは冷却 され、石油エーテルで洗浄され、そして実施例１に記載されたように乾燥させた 。このマイクロスフェアを蛍光顕微鏡で観察した時、ゼインコーティングされた ＰＬＡマイクロスフェアが観察された。ある例では、いくつかのＰＬＡ　ミクロ スフェアがそれぞれのゼインマイクロスフェアの内側に観察された。

「コンポジット」マイクロスフェアの直径は、１０ミクロンから５０ミクロンの 間である。

［実施例５：ゼイン／インシュリンマイクロスフェアノｔｎｖ匡放出力イネティ クスコ ２つの異なるインシュリンの含有量（４，８％および９％（重量で））をもつマ イクロスフェアは、実施例１に記載されたように粒子状インシュリンを用いて生 産され、そして３つの異なる含有量（１７％、３０％、および４２％）をもつマ イクロスフェアは実施例３に記載されたように可溶性のインシュリンを用いて生 産された。

ｉｎ　ｖｆｔｒｏの放出力イネティクスは、ゼイン／インシュリンマイクロスフ ェア１０〜２０ｍｇを、２．０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁し 、懸濁液を３７℃でインキュベートシて測定された。種々の時間間隔で、ＰＢＳ の１．　ｍ　１をデカントし、１．　ｍ　ｌの新鮮なＰＢＳで置き換えた。イン シュリン濃度は、逆相ＨＰＬＣによりＣ１８Ｒａｄｉａｌ　ｐａｋ　ｅｏｌｕｍ ｎ（Ｗａｔｅｒｓ、　ＭＮｆｏｒｄ、　ＭＡ＞を用いて水アセトニトリル勾配で 測定された。

９％粒粒子状インユニリン含有量マイクロスフェアは、約１０時間の間に薬物の ２０％を初期放出し、引き続き４０時間に渡り直線的な放出を続けた。４．８％ ％子状インシュリン含有量のマイクロスフェアは、薬物の約５％の初期放出そし て引き続き５０時間に渡る直線的な放出を示した。

１７％可溶性インシュリンのマイクロスフェアは、初期に約５％の放出を起こし 、放出は２４時間後７％に上昇し、凰ＶｉｔｒＯでは少なくとも続（９０時間の 間はさらなる放出はなかった。３０％可溶性インシュリンを含むマイクロスフェ アは、最初の１時間の間約８％放出を、そして次の２０時間に約１５％まで直線 的な放出を示し、放出は少なくとも次の７０時間続いた。４２％可溶性インシュ リンを含むマイクロスフェアは、初期に約１０％放出を示し、続く９０時間に渡 り直線的な放出が続いた。

種々の時間に集められた試料は、インシュリンの分解を調べるためＳ　Ｄ　Ｓ　 −Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ上で泳動した。分解は観察されなかった。

［実施例６　：　ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるゼイン／インシュリンマイクロスフェ アの生物活性〕 インシュリン放出の再現性あるバイオアッセイは、マイクロスフェアの皮下注射 後に糖尿病ラットの血中グルコースを測定することである。雌のＳｐｒａｇｕｅ −Ｄａｗｌｅｙラット（Ｔａｅｏｎｉｃ　Ｆａｒｍｓ、　ＮＹ）は、ａｓｍｇ／ ｋｇのストレプトシトシン（υｐｊｏｈｎ　Ｃｏ、Ｊａｌａ、ｍａｚｏｏ、　Ｍ ｌ）　（０，１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ４，５中）を静脈注射されることにより 糖尿病を誘発される。

１７％（Ｗ／Ｗ）ｉ有ｆｆｉゼイン／インシニリンマイクロスフェア１２．０ｍ ｇが、実施例３に記載のように、１ｍ１通常生理食塩水中に調製され、ラットに 投与された。可溶性（被包されていない）インシュリンの等量投与量が、対照と して他のラットに注射された。この実験の結果から、皮下注射されたゼイン／イ ンシュリンマイクロスフェアと可溶性インシュリンの間で、生物学的活性の長さ において、いくらかの違いがあることが示された。マイクロスフェアは、より長 期間に渡りインシュリンを放出した。したがって、可溶性インシュリンに比べ、 より長期間に渡る生物活性を示した。

［実施例７：脂肪酸修飾ゼインマイクロスフェアの調製およヒｆｎ　ｖｉｔｒｏ 放出力イネティクスコゼインは無水へキサン酸（Ｃ６）、無水オクタン酸（Ｃ８ ）、無水デカン酸（ＣＩＯ）、または無水ドデカン酸（Ｃ１２）のいずれかで修 飾された。ゼインおよび特定の無水物は、８０％エタノールおよび２０％ホウ酸 ナトリウム（２０ｍＭ　ｐＨ９，０）から成る媒体に添加され、３７℃で２時間 、無水物が５倍モル過剰の状態で攪拌することで反応させた。ｐＨは反応中、水 酸化ナトリウムをゆっくり添加することにより維持された。

２時間後、溶液は３７％ＨＣＩの添加によりｐＨ３，０に酸性化され、次に数倍 量の石油エーテルで５回抽出し、遊離の脂肪酸を除いた。この物質は、２Ｘ１５ Ｌの蒸留水に対して一晩透析し、−８０°Ｃに凍結され凍結乾燥された。

インシュリンを含む修飾ゼインマイクロスフェアは、実施例３に記載された手順 で調製された。取り込まれたインシュリンの総量は１７％（Ｗ／′Ｗ）であった 。修飾ゼインは９０％エタノール、１０％水、ｐＨ２，５−３，０中に最終濃度 ５％に溶解した。

ゼイン−０６、ゼイン−Ｃ８，ゼイン−Ｃ１Ｏおよびゼイン−Ｃ１２マイクロス フェアからのインシュリンのｉｎ　ｖｊｔｒ。

放出力イネティクスが測定された。実施例５に記載されたように放出力イ不ティ クスが測定され、図２Ａに示されている。

［実施例９：脱アミデートされたゼインおよび脂肪酸で修飾された脱アミデート ゼインのマイクロスフェア溶１＆ｇ合物の調製およびｉｎ　ｖｉｔｒｏでの放出 ］脱アミデートゼインは、以下のように調製されたニア０％エタノール水溶液中 の５％（Ｗ／Ｖ）ゼイン（Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｉｎｄｌ、　Ｉｎｃ、）混合物は、 ３７％ＨＣＩ（最終ＨＣＩ濃度は約０゜１２Ｎ）でｐＨ１，ｏに滴定され、３７ ℃で９６時間インキコベートされた。反応はアンモニア電極でモニターされ、そ して脱アミデージョンの程度が測定された。９６時間後、反応混合物は１Ｍ炭酸 アンモニウムで中和し脱アミデージョンを停止した。脱アミデートゼインは、分 子量６０００でカットオフする透析チューブ（ｓｐｅｃｔｒｕｍ）中で、水に対 して透析することにより回収ｌまた。脱アミデートゼインは透析中に沈澱した。

この物質は、−８０″Ｃで凍結され、そして棚型凍結乾燥機（Ｔｈｅ　Ｖｉｒｔ ｉｓ、　Ｃｏ、　、　Ｇａｒｄｉｎｅｒ、　Ｎ、　Ｙ、　）で凍結乾燥した。

脱アミデートゼインは、無水へ牛サン酸（Ｃ６）、無水オクタン酸（Ｃ８）、無 水デカン酸（ＣＩＯ）、または無水ドデカン酸（Ｃ１２）のいずれかで修飾され た。脱アミデートゼインおよび特定の無水物は、８０％エタノールおよび２０％ ホウ酸ナトリウム（２０ｍＭ　ｐ）ｉ９．ｏ）から成る媒体に添加され、無水物 ５倍モル過剰で３７℃で２時間、攪拌して反応させた。

ｐＨは反応中水酸化ナトリウムをゆっくり添加することにより維持された。２時 間後、溶液は３７％ＨＣＩの添加によりｐＨ３，０に酸性化し、そして次に数倍 量の石油エーテルで５回、遊離の脂肪酸を除（ために抽出した。この物質は２　 Ｘ　］、　５　Ｌの蒸留水に対して一晩透析し、−８０’Ｃに凍結され凍結乾燥 された。

インシュリンを含む脱アミデートゼインおよび脂肪酸修飾脱アミデートゼイン” マイクロスフェアは、実施例３に記載された手順で調製された。取り込まれたイ ンシュリンの量は１７％（Ｗ／Ｗ）であった。脱アミデートゼインおよび脂肪酸 修飾脱アミデートゼインは、９０％エタノール水溶液に最終濃度５％（Ｗ／Ｗ） に溶解した。インシュリンが加えられ、ｐＨは２、Ｓ−３，０に調整した。

脱アミデートゼイン、脱アミデートゼイン−０６、脱アミデートゼイン−Ｃ８、 脱アミデートゼイン−ＣＩＯ１および脱了ミデートゼイン−Ｃ１２からのインシ ュリンのｔｎ　ｖｉｔｒ。

放出力イネティクスが、測定された。放出力イネティタスは、実施例５のように モニターされ、そして図２Ｂに示される。

Ｕ実施例１０：ゼイン−Ｃ６および脱アミデートゼインインシュリンマイクロス フェアのｉｎ　ｖｉｖｏ活性］活性側実施例８９で調製されたゼイン−０６およ び脱アミデートゼインから形成されたインシュリンを含むマイクロスフェアは、 実施例６に記載のように生物学的活性を試験された。皮下注射されたラットの血 中グルコースレベルは、放出が延長された期間に渡って起こり、血中グルコース レベルを減少させることを示した。

［実施例１１　：　ＰＬＡ／ゼインコンポジットマイクロスフェアの調製］ 蛍光色素ローダミンＢを取り込んだゼインマイクロスフェアは、実施例２に記載 されたように調製された。マイクロスフェアは１ミクロンから１２ミクロンの間 の範囲の直径を持っていた。これらのマイクロスフェアは、ＰＬＡマイクロスフ ェアに以下のように取り込まれた：　０．５ｇＰＬＡ　（Ｌ−１０４、Ｂｏｅｒ ｈｉｎｇｅｒ　ｌｎｇｅｌｈｅｉｔ　ＦＲＧ）が１０ｍ１のメチレンクロライド に溶解された。５２　ｍ　ｇのローダミンＢゼインマイクロスフェアがそのポリ マー溶液に添加された。ゼインは純粋メチレンクロライドには不溶性である。こ の混合物を水上でＶｔｒｓｏｎｉｃ　３００　Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｐｒｏｂ ｅ　（Ｖｔｒｔｉｓ　Ｉｎｃ、、Ｃａｒｄｊ、ｎｅｒ、　ＮＹ）を用いて１分間 超音波処理した。次に懸濁液を１０ｍ１のガス密閉シリンジに移した。１００ｍ １の１００％エタノールは、円形容器（８Ｏｍ　ｘ　６ｃｍ＋）に添加され、液 体窒素浴中で凍結された。次に凍結エタノールを液体窒素の層によって覆った。

ポリマー懸濁液は、シリンジからシリンジポンプを経由して２ｍ１／分の速度で 、液体窒素／凍結エタノール溶液の８ｃｍ上に置かれた超音波ノズル（Ｍｏｄｅ ｌ　＆７００−４８Ｍ５．５ｏｎｏｔｅｋ　Ｃａｒｐ、、　Ｐｏｕｇｂｋｅｅｐ ｓｊｅ、ＮＹ）に押し出される。このノズルは、懸濁液を、霧状にして、液体窒 素に接触するやいなや直ちに凍結するように粒状にする。

その後、容器は液体窒素を蒸発させそして凍結エタノールを溶かすために、−８ ０°Ｃのフリーザーに移された。メチレンクロライドは、マイクロスフェアを固 化しながら冷エタノール中に抽出された。２４時間後、あらかじめ−８０℃に冷 却された２００ｍ１のへキサンが、メチレンクロライドをさらに抽出するために 容器に添加された。マイクロスフェアは、さらに２４時間フリーザーの中に保持 され、その後濾過され１００　ｍ　ｌの冷へキサンで洗浄された。次にマイクロ スフェアは、室温で２４時間減圧乾燥された。

光学顕微鏡の下、スフェアは丸く、そして３０−３５　ミクロンの範囲の直径で あった。マイクロスフェアは０１ｙｖｐｕｓ　（Ｌａｋｅ　５ｕｃｃｅｓｓ、Ｎ Ｙ）　ＢＨ２顕微鏡で観察された。この顕微鏡は、ローダミンＢを可視化するた めに、適切なフィルターを持っ１０ＱＷ高圧水銀ランプ付きのエビーイルミネー 、ジョン蛍光マイクロスコピーが装備されている。

粒子は、背景より強く蛍光を発した。個々のＰＬＡマイクロスフェアの内部で明 確な蛍光粒子を検出することが可能であった。次にＰＬＡマイクロスフェアは、 メチレンクコライドに再溶解され、そしてこの溶液の試料が試験された。明確な ゼインローダミンＢマイクロスフェアが観察され、ＰＬＡマイクロスフェア中の 蛍光は、完全なゼインローダミンＢマイクロスフェアによるものであり、調製手 順の間にゼインからＰＬＡ中に漏れたローダミンＢによるものでないことが示さ れた。

［実施例１２：インシュリンを含むゼインおよび脱アミデートゼイン５０：５０ 混合物のマイクロスフェアの調製］インシュリンを含むマイクロスフェアは、０ ．２ｇのゼインおよび０．２ｇの脱アミデーＦゼインが８．０ｍｌの９０％エタ ノール−１０％水中（＋、、ｏｓのＨＣ，ｌでｐＨ２，５−３，０に調整された ）に溶かされたことを除いて、実施例３に記載のように調製された。取り込まれ たインシュリンの量は１７％（Ｗ／′Ｗ）であった。

図３に示されたｉｎ　ｖｉｔｒｏの放出力イ不テイクスは、インシュリンの約１ ０％が最初の１０時間で、そして次の６０時間でさらに５％が放出されたことを 示している。

［実施例１３：水中の沈澱により作られたマイクロスフェアと相分離および溶媒 蒸発により作られたマイクロスフェアの比較］ マイクロスフェアは、ＰＣＴ／ＵＳａ９１０３９９１の実施ｆＰＩｘｘおよび１ ２に記載されたように調製された。この出願は、脂質置換物の調製について記載 しているが、これらの例は、他の高分子のフィクロスフェアへの被包を開示して いるようである。

次の実験は、高分子がこの方法で効率的に被包されるかどうか、および得られた マイクロスフェアが本明細書に記載の相分離、溶媒蒸発プロセスにより作られた マイクロスフェアと違っているかどうかを測定するために行われた。

ゼイン（６ｇ）は９０％エタノール（９４ｇ）中に溶がされた。１１００ｒｎの インシュリンナトリウムが、０．９ｇのＮａＣｌと０．１２ｇのト１，１ズ７Ｔ ″ヘースを含む水１００　ｍｌに溶解された。ｐ旧よ塩酸で７．４に調整された 。３３ｒｙ目のゼイン溶液を３ｍｌ／分の速度で水溶液に添加し、急速に攪拌し た。

ゼインの大部分が凝集体を形成した。いくらかのマイクロスフェアが形成された 。被包されたインシュリンの量はＨＰＬＣを用いて水溶液中に残存するインシュ リンの量を測定することにより決定された。水溶液中に残った遊離のインシュリ ンの総量を測定した結果１．インシュリンの明白な被包はなかった。

走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）により、このプロセスでつくられたわずかのマイクロ スフェアが、本明細書に記載の相分離、溶媒蒸発手法で作られたマイクロスフェ アと比較された。水沈澱により形成されたスフェアの方がより多孔性であり、そ してそれ故より密度が小さかった。

結局、このプロセスは高分子の効率的な被包に宵月でなく、得られたマイクロス フェアは、本明細書に記載の相分離、溶媒蒸発法により形成されたマイクロスフ ェアと同じ外観または特性を持たない。インシュリンが被包されなかったので放 出特性を測定することは不可能であったが、これらの特性はまた、水沈澱により 作られたマイクロスフェアがかなり多孔性であるので、かなり異なるものと推定 される。

本発明の改良および変法は、前述の詳細記載から当業者にとって明かである。そ のような改良および変法は請求の範囲の技術範囲に含まれることとする。

Ｆ／ＧＵＥＥ　Ｉａ 崎間Ｉ　ＨＯＵＲ５Ｉ ＦＩＧＵＲＥ　２σ 時藺（ＨＯＵＦ？Ｓ　Ｉ Ｆ、’ＧＵＥＥ　２ｂ 崎寸＾（ＨＯＩＪＲ９） ＦＩＧＵＲＥ　３ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成４年５月６日

Claims (46)

【特許請求の範囲】
1. １．以下の工程を包含する、タンパク質マイクロスフェアを生産するための方法 ： ａ）少なくとも１種類のタンパク質を含むタンパク質溶液を第二の液体と接触さ せる工程であって、該第二の液体がタンパク質溶媒と制限された混和性であり、 そしてタンパク質を溶解しない液体である、タンパク質−非−溶媒混合物を形成 するための工程； ｂ）該タンパク質−非−溶媒混合物を、第二の液体中にタンパク質溶液の分散を 形成するために撹拌する工程；および ｃ）タンパク質マイクロスフェアを形成するために、タンパク質溶媒を除去する 工程。
2. ２．前記タンパク質が、疎水性タンパク質である、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記疎水性タンパク質が、プロラミン、コラーゲン、カゼイン、およびケラ チンからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
4. ４．前記タンパク質が、ゼイン、グリアジン、ホルデイン、およびカフィリンか らなる群から選択されるプロラミンである、請求項３に記載の方法。
5. ５．前記タンパク質を修飾することをさらに包含する、請求項１に記載の方法。
6. ６．前記タンパク質が、化学的に修飾される、請求項５に記載の方法。
7. ７．前記タンパク質が、酸で脱アミデートされる、請求項６に記載の方法。
8. ８．前記タンパク質が、脂肪族アルコールでエステル化されることで化学的に修 飾される、請求項６に記載の方法。
9. ９．前記タンパク質が、脂肪酸無水物でアシル化されることで化学的に修飾され る、請求項６に記載の方法。
10. １０．前記タンパク質が、前記タンパク質に対してアミノ酸、ペプチド、または タンパク質がカップリングすることで化学的に修飾される、請求項６に記載の方 法。
11. １１．前記タンパク質が、より小さな分子量フラグメントに酵素的に切断される 、請求項５に記載の方法。
12. １２．前記タンパク質溶媒が、アルコール、ケトン、ならびにアミド溶媒、６０ ％を越えない水を含むアルコール、ケトン、およびアミド溶媒の水溶性混合液、 ｐＨ１０以上の溶液、ｐＨ２以下の溶液、約１．０から約６Ｎ濃度の無機塩の水 溶液、および二元性のアルコールとハロゲン化炭化水素、または二元性のアルコ ールとポリオールからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
13. １３．前記第二液体が、オイル、ヘキサン、ヘプタン、ドデカン、および高沸点 石油エーテルからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
14. １４．界面活性剤およびバインダーからなる群から選択される化合物をさらに含 む、請求項１に記載の方法。
15. １５．非タンパク質ポリマーを溶液中のタンパク質と混合し、コンポジットのポ リマー−タンパク質マイクロフェアを形成することをさらに包含する、請求項１ に記載の方法。
16. １６．前記ポリマーが、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリアンハイド ライド、ポリオルトエステル、ポリカプロラクトン、ポリホスファゼン、ポリヒ ドロキシブチレート、ポリアミド、それらの混合物およびそれらの共重合物から なる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
17. １７．タンパク質溶液に溶けない粒子を添加してタンパク質でコートされた粒子 を形成することをさらに包含する、請求項１に記載の方法。
18. １８．前記粒子が、マイクロスフェアおよびマイクロカプセルからなる群から選 択される、請求項１７に記載の方法。
19. １９．前記粒子が、タンパク質、無機塩、多糖類、金属および非タンパク質ポリ マーからなる群から選択される物質から形成される、請求項１７に記載の方法。
20. ２０．前記タンパク質溶液に、マイクロスフェアに取り込まれる化合物を添加す ることをさらに包含する、請求項１に記載の方法。
21. ２１．前記化合物が、薬剤、農薬、栄養分、造影剤、およびキレート剤からなる 生物学的に活性な化合物の群から選択される、請求項２０に記載の方法。
22. ２２．前記化合物が、タンパク質溶液に可溶性である、請求項２０に記載の方法 。
23. ２３．前記化合物が、タンパク質溶液に不溶性である、請求項２０に記載の方法 。
24. ２４．以下の方法により生産されるタンパク質マイクロスフェア： ａ）少なくとも１種類のタンパク質を含むタンパク質溶液を、第二の液体に接触 させてタンパク質−非−溶媒混合物を形成する工程であって、該第二の液体は、 タンパク質溶媒と制限された混和性でありそしてタンパク質を溶解しない液体で ある、工程； ｂ）該タンパク質−非−溶媒混合物を、第二の液体中にタンパク質溶液の分散を 形成するために撹拌する工程；および ｃ）タンパク質マイクロスフェアを形成するために、タンパク質溶媒を除去する 工程、 ここで、該タンパク質マイクロスフェアは、５０ｎｍと１００ミクロンとの間の 直径を持ち、該マイクロスフェアはアミド結合によりまたはタンパク質の熱変性 により形成されない。
25. ２５．前記タンパク質が、疎水性タンパク質である、請求項２４に記載のマイク ロスフェア。
26. ２６．前記疎水性タンパク質が、プロラミン、コラーゲン、カゼインおよびケラ チンからなる群から選択される、請求項２５に記載のマイクロスフェア。
27. ２７．前記タンパク質が、ゼイン、グリアジン、ホルデインおよびカフィリンか らなる群から選択されるプロラミンである、請求項２５に記載のマイクロスフェ ア。
28. ２８．前記タンパク質が改変されている、請求項２４に記載のマイクロスフェア 。
29. ２９．前記タンパク質が、化学的に修飾されている、請求項２８に記載のマイク ロスフェア。
30. ３０．前記タンパク質が、酸で脱アミデートされている、請求項２９に記載のマ イクロスフェア。
31. ３１．前記タンパク質が、脂肪族アルコールでエステル化されることで化学的に 修飾されている、請求項２９に記載のマイクロスフェア。
32. ３２．前記タンパク質が、脂肪族無水物でエステル化されることで化学的に修飾 されている、請求項２９に記載のマイクロスフェア。
33. ３３．前記タンパク質が、前記タンパク質に対してアミノ酸、ペプチド、または タンパク質がカップリングすることで化学的に修飾されている、請求項２９に記 載のマイクロスフェア。
34. ３４．前記タンパク質が、より小さな分子量のフラグメントに酵素的に切断され る、請求項２８に記載のマイクロスフェア。
35. ３５．タンパク質とともに、さらに非タンパク質ポリマーを含む、請求項２４に 記載のマイクロスフェア。
36. ３６．前記ポリマーが、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリアンハイド ライド、ポリオルトエステル、ポリカプロラクトン、ポリホスファゼン、ポリヒ ドロキシブチレート、ポリアミド、それらの混合物およびそれらの共重合物から なる群から選択される、請求項３５に記載のマイクロスフェア。
37. ３７．少なくとも１つのタンパク質マイクロスフェアが、非タンパク質ポリマー で被包される、請求項３５に記載のマイクロスフェア。
38. ３８．前記タンパク質溶液に溶けない粒子をさらに含む、請求項２４に記載のマ イクロスフェア。
39. ３９．１つより多い粒子が、タンパク質マイクロスフェア中に含まれる、請求項 ３８に記載のマイクロスフェア。
40. ４０．前記粒子が、マイクロスフェアおよびマイクロカプセルからなる群から選 択される、請求項３８に記載の方法。
41. ４１．前記粒子が、タンパク質、無機塩、多糖類、金属および非タンパク質ポリ マーからなる群から選択される物質で形成される、請求項３８に記載のマイクロ スフェア。
42. ４２．さらに、取り込まれた化合物を含む、請求項２４に記載のマイクロスフェ ア。
43. ４３．前記化合物が、薬剤、農薬、栄養分、造影剤、およびキレート剤からなる 生物学的に活性な化合物の群から選択される、請求項４２に記載のマイクロスフ ェア。
44. ４４．前記化合物が、タンパク質溶液に可溶性である、請求項４２に記載のマイ クロスフェア。
45. ４５．前記化合物が、タンパク質溶液に不溶性である、請求項４２に記載のマイ クロスフェア。
46. ４６．さらに気泡を含む、請求項２４に記載のマイクロスフェア。