JP2000501380A - 持続放出性粒子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 有機溶媒を実質的に含まない水性メジウム中においてコア粒子を調製し、その中にその調製時または調製後に生物活性物質をトラップさせ、コア粒子を乾燥させ、コア粒子を空気懸濁法によって放出制御性ポリマーでコーティングし、活性物質を有害な有機溶媒に暴露することなくコア粒子上に被膜を形成させることからなる非経口投与が可能な持続放出性マイクロ粒子の製造方法。このような方法によって得られるマイクロ粒子。

Description

【発明の詳細な説明】 持続放出性粒子技術分野 本発明は、生物活性物質、特に薬物の非経口的投与のための持続放出性粒子の 分野のものである。さらに詳しくは、本発明は生物活性物質を含有するこのよう な粒子の新規製造方法ならびにその方法によっ得られる新規な持続放出性粒子に 関する。発明の背景 多くの薬物は、それらをたとえば経口的もしくは経鼻的にまたは経直腸経路に よって与えた場合には、分解するかまたは吸収が非効率的なために、注射により 投与されなければならない。非経口な使用が意図された薬物製剤は、ヒトに使用 するには、規制当局の承認を得るために多くの要求に合致しなければならない。 すなわち、それは生物適合性および生物分解性でなければならず、また使用され るすべての物質およびそれらの分解産物は非毒性でなければならない。これらに 加えて、注射が意図される粒状薬剤は注射針を通過できるように十分小さいこと が必要であり、これは好ましくは、粒子が200μmより小さくなければならないこ とを意味する。薬剤は、その製造時もしくは保存時または投与後に処方中で大量 に分解することがあってはならないし、しかも生物学的に活性な形態で、薬物動 態学的に再現性をもって放出されなければならない。 生物適合性および無害な最終産物への生物分解性に関する要求を満足する一つ のクラスのポリマーは、乳酸、グリコール酸およびそれらの混合物に基づく線状 ポリエステルである。本明細書では以下、上記ポリマーはPLGAとも呼ぶことにす る。PLGAは、エステル加水分解によって乳酸とグリコール酸に分解し、優れた生 物適合性を発揮することが示されている。 PLGAの無毒な性質は、これらのポリマーに基づく数種の非経口的持続放出製剤が 、規制当局たとえば米国食品医薬品庁の承認を得ていることからも明らかである 。 現在市場にあるPLGAに基づく非経口的に投与可能な持続放出性製品には、Deca peptyl(登録商標；Ibsen Biotech)、Prostap SR(登録商標；Lederle)、Decapept yl（登録商標）Depot(Ferring)、och Zoladex（登録商標；Zeneca）がある。こ れらの処方の薬物はすべてペプチドである。換言すれば、それらは比較的重合度 の低いポリマーに縮合したアミノ酸から構成され、それらは明確な三次元構造を 有するものではない。これは一方、上記製品の製造時において比較的過酷な条件 の使用が一般に許容されるということである。たとえば、押し出し、ついでサイ ズ減少を行うことができるが、タンパク質の場合には、それらが一般にこのよう な過酷な条件には耐えられないことから、許容されるものではない。 したがって、タンパク質の持続放出製剤にはさらに一つの要求がある。タンパ ク質は、それらがアミノ酸から構成されるという点ではペプチドに類似するが、 その分子ははるかに大きく、大部分のタンパク質は、生物活性および免疫原性を 含めてそれらの性質の多くを明確な三次元構造に依存している。それらの三次元 構造は、たとえば高温、表面誘発性の変性、そして多くの場合、有機溶媒への暴 露によって比較的壊れやすい。すなわち、それ自体は優れた材料であるPLGAのタ ンパク質の持続放出のための使用に関しては、上記PLGAを溶解するための有機溶 媒の必要性、それに伴うタンパク質の安定性を損なう危険という極めて重大な欠 点がある。 製造過程におけるタンパク質の不安定性というこの固有の問題を回避するため のPLGA技術の改良を目指した多くの努力にもかかわらず、この領域における進歩 は極めて遅く、PLGA技術に基づくタンパク質製品は未だに市 場には現れていない。その主要な理由は、したがって、多分、大部分のタンパク 質の三次元構造が用いられる製造操作および／またはPLGAマトリックス中におけ る保存に耐えるには感受性が高すぎるためであろうと思われる。 水溶性の物質たとえばタンパク質およびペプチドをトラップするために、現在 最も一般的に用いられている技術は、多重層エマルジョン系の使用である。薬物 物質は水もしくは緩衝液に溶解し、ついで溶解したポリマーを含有する水非混和 性の有機溶媒と混合する。内相として水相を有するエマルジョンが作成される。 この最初のエマルジョンの作成のためには、様々なタイプの乳化剤および激しい 攪拌がしばしば使用される。上記エマルジョンはついで攪拌下に、他のポリマー たとえばポリビニルアルコールを含有する他の液体、典型的には水に移され、三 重層のｗ／ｏ／ｗ型エマルジョンが得られる。このマイクロスフェアはついで何 らかの方法で硬化される。最も一般的に用いられる方法は低沸点の有機溶媒、典 型的にはジクロロメタンの使用ついで溶媒の蒸発である。有機溶媒が水と完全に 非混和性ではない場合には、三重層エマルジョンにさらに水を添加することによ る連続抽出操作を使用することができる。この一般的操作の多くの変法も文献に 記載されている。場合により、一次エマルジョンを非水相たとえばシリコン油と 混合する。溶解された薬物ではなく固体薬物材料も使用できる。 上述の方法で調製されたマイクロスフェアからのタンパク質の放出像は多くの 場合、迅速な初期の放出とそれに続く緩徐な時期を示す。この緩徐な時期に続い て、さらに速い放出の第三の時期が存在することがある。 タンパク質を含有するPLGAマイクロスフェアはWO−Al−9013780号に開示され 、その主要な特徴は、タンパク質の高い生物活性を維持するためマ イクロスフェアの製造時に著しい低温を使用することである。カプセルに封入さ れたスーパーオキシドジスムターゼの活性が測定されているが、それは粒子から 放出された部分についてのみである。この方法は、ヒト成長ホルモンを含有する PLGAマイクロスフェアの製造にWO−Al−9412158号において、PLGA含有メチレン クロリド中にヒト成長ホルモンを分散し、得られた分散液をその上に液体窒素の 層を重ねた凍結エタノールを含有する容器中にスプレーし、液滴を凍結させてエ タノール上の窒素中に沈積させることにより使用されている。エタノールをつい で解凍すると、マイクロスフェアがエタノール中に沈み始め、そこでメチレンク ロリドがエタノールに抽出されて硬化する。このアプローチはPLGAマイクロスフ ェア中にタンパク質をトラップするための他の大部分の操作に比較して、より優 れたタンパク質の安定性を維持できるように思われる。しかしながら、これはさ らに他のタンパク質について明瞭に証明される必要がある。 しかしながら、PLGAによるカプセル封入に基づく上述の方法においては、活性 物質が有機溶媒に暴露され、これは一般的にタンパク質の安定性に有害である。 それに加えて、上述の乳化過程は複雑で、工業的規模へのスケールアップには問 題があるように思われる。さらにこれらの過程の多くに用いられる有機溶媒の多 くは環境問題を伴い、それらのPLGAポリマーとの高い親和性はその除去を困難に する。 非経口的に投与できる持続放出性製剤は、トラップされた薬物の放出を正確に 制御できるものでなければならない。PLGAに基づくシステムの多くでは、活性成 分の放出はマイクロ粒子中に導入された薬物物質の量に大部分依存し、薬物の高 負荷時におけるマイクロ粒子内のチャンネルの形成によって起こる。これはまた 、薬物の高負荷時の高い初期バーストの原因となる。 固体コアからの小分子の放出を制御する周知の方法は、コアの表面に速度制御 フィルムを生成するコーティングを適用することである。これは経口経路により 投与される薬物の放出速度を制御する一般的な方法である。同様のコートを適用 する方法の一つは空気懸濁法の使用による。しかしながら、非経口投与に使用す るための一般にサイズ200μm以下の、多くの場合さらに小さい粒子のコーティン グに関しては、一般に困難な問題に遭遇する。このような問題には、製造過程に おける粒子の凝集傾向の増大および静電気による妨害の問題がある。 このようなサイズの小さい粒子のコーティングの異なる方法の中には、コーテ ィング材料の溶液中に薬物を分散しついで噴霧乾燥する方法、および溶解したポ リマーを用いて様々な方法でコア材料をカプセル封入する多くのコアセルベーシ ョン法がある。しかしながら、これらの方法はすべて、PLGAを溶解するために用 いられる有機溶媒にタンパク質を暴露するものである。流動床をマイクロ粒子の コーティングに用いる方法が米国特許第4,568,559号に開示されている。これは 、フィルム形成ポリマーの活性成分の均一な分散液から、固体の乾燥成分混合物 を調製して、この混合物をついで粉砕し、得られた粒子を篩過して１〜150μmの サイズ分布を得る。コア粒子をついで流動床内でコーティングするが、同じまた は実質的に同じフィルム形成ポリマー材料を、成分コアの調製およびコア材料に フィルム形成ポリマーのコーティング壁の結合を施すコーティングの両者に使用 することが前提条件になる。すなわち、この方法は、フィルム形成ポリマーがPL GAであるかまたは他の水不溶性ポリマーである限り、タンパク質の有機溶媒への 暴露という問題を解消させるものではない。 したがって、感受性の物質たとえばタンパク質の、非経口的に投与可能な持続 放出製剤を製造する方法は、以下の性質であることが強く望まれる。 すなわち、 トラップされた物質の放出速度を、広範な限界内で、通常１日または数日から 少なくともほぼ１月、制御できること、 標準的な製薬用装置を用いて実施可能で、小規模の製造から大規模な生産まで 使用できる製造が可能だること、 活性成分の有機溶媒への暴露を排除または最小限にできること、および 完全に生物分解性で、生物適合性材料の表面を有すること である。発明の説明 本発明によれば、上述の特性を有する非経口的投与が可能な持続放出性製剤を 調製できることが見出された。すなわち、本出願により請求される新規な方法は 、PLGAの優れた生物適合性と放出制御性を利用し、しかもたとえば製剤化される タンパク質の有機溶媒への暴露を回避または最小限にすることを可能にする。し かしながら、本発明は、コーティング材料としてのPLGAのみの使用または活性成 分としてのタンパク質のみの使用に限定されるものではない。むしろ本発明は、 フィルム形成性、生物分解性および放出制御性を有する任意のポリマー、特にこ れまで有機溶媒が利用されてきたポリマーの使用に適用が可能である。ポリマー についての他の前提要件はもちろん医薬的に許容されることであり、この前提要 件は製剤中に用いられる他のすべての材料または成分にも適用される。さらに、 本発明は、非経口投与に用いられるすべての活性物質に有用である。しかしなが ら主として、本発明は、有機溶媒に感受性であるかまたは有機溶媒中で不安定な 活性物質における上述の問題の解決を提供するものである。 略述すれば、本発明は、マイクロ粒子中への有機溶媒を使用しない活性成分の トラッピング、マイクロ粒子の乾燥状態での処理、ついでマイクロ 粒子の空気懸濁法を用いる生物分解性ポリマーでのコーティングにより、ポリマ ーコーティングに使用した有機溶媒の極めて迅速な除去での活性物質の有機溶媒 への実質的な暴露を回避する考え方に基づくものである。 さらに特定すると、本発明の第一の態様によれば、非経口的に好ましくは注射 によって投与可能な生物活性物質、特に有機溶媒の存在下には不安定な物質を含 有する持続放出性マイクロ粒子の製造方法において、実質的に有機溶媒を含まな い水性メジウム中で生物分解性材料からコア粒子を調製し、その調製時または調 製後にその中に生物活性物質をトラップさせ、上記活性物質を含有するコア粒子 を所望により過剰の活性物質があればそれを除去する洗浄工程後に乾燥し、コア 粒子を空気懸濁法によりフィルム形成性、生物分解性、放出制御性ポリマーでコ ーティングして、活性物質を有害な有機溶媒に暴露することなくコア粒子上に上 記ポリマーの被膜を形成させることからなる方法が提供される。 この方法は、注射による投与に適合したマイクロ粒子の製剤を主として意図す るものであるから、マイクロ粒子は好ましくは１０〜100μm、さらに好ましくは ２０〜100μmの範囲の平均直径を有し、特に好ましくは６０μm未満、たとえば １０〜６０μmまたは４０〜６０μmである。 好ましいコア粒子の材料は、デンプンまたは化学的もしくは物理的に修飾され たデンプンである。このような材料は、本技術分野においてそれ自体周知であり 、したがって、このようなデンプンについての詳細に関する先行技術を参照する ことができる。しかしながら、デンプンから調製されるマイクロ粒子は血清およ び細胞外液中に存在する酵素、α−アミラーゼによって溶解されるように設計す ることが可能で、最終分解産物はグルコースであるので、デンプンマイクロ粒子 は生物分解性の要求を満たすことができる。 被膜のために好ましいポリマーは、α−ヒドロキシ酸またはα−ヒドロキシ酸 の環状ダイマーからの脂肪族ポリエステル(たとえばホモポリマー)またはコポリ マーである。 上記α−ヒドロキシ酸は好ましくは乳酸およびグリコール酸からなる群より選 択される。換言すれば、好ましいホモポリマーはたとえばポリ酢酸またはポリグ リコール酸であり、一方好ましいコポリマーは乳酸／グリコール酸コポリマーで ある。 環状ダイマーは、好ましくはグリコリドおよびラクチドからなる群より選択さ れる。 しかしながら、上述のように、他の生物分解性ポリマーも、そのポリマーが機 械的安定性および放出制御性、たとえば活性成分に対す透過性および孔部形成の ような望ましい性質をもつフィルムを形成できる限り、使用することができる。 これらの性質はポリマーそれ自体またはコーティング中に他の物質を包含させる ことによって達成することができる。用いられるコーティング材料はもちろん、 上述のポリマーの２種またはそれ以上の混合物とすることもできる。さらに上述 のポリマーはそれらの塩の形態で使用することもできる。 生物活性物質は、有機溶媒を用いないで、数種の方法によりマイクロ粒子中に トラップさせることができる。特に好ましい方法にはそれ自体既知のいわゆる水 二相系技術の使用がある。この方法は米国特許第4,822,535号に開示されている 。これは、上記方法についての詳細をそれに見出すことができることを意味する 。他の方法には、別個の工程で水を吸収できるコアマイクロ粒子を調製し、用い た有機溶媒があれば除去し、得られた乾燥マイクロ粒子を上記活性物質の溶液に 暴露してその溶液をマイクロ粒子に吸収させることにより活性物質をマイクロ粒 子に負荷し、ついでそれを 乾燥することを包含する。 コア粒子の乾燥は任意の適当な手段で、たとえば噴霧乾燥、凍結乾燥または真 空乾燥によって達成できる。過剰の活性物質を除去するためには、マイクロ粒子 またはコアを乾燥工程に先立って洗浄することができる。 活性物質を含有するコア粒子はついで、活性物質を有機溶媒への実質的なまた は有害な暴露に付すことなくコア粒子上にポリマーの被膜の創成を可能にする、 空気懸濁法（air suspension technique）によってコーティングする。この空気 懸濁法は空気懸濁法として分類され、満足できるコーティングを適用できる任意 の方法とすることができる。このような方法の好ましい例には流動床もしくはい わゆる噴出床（spouted bed）を利用する方法、またはいわゆるWurster法がある 。これらの方法はそれ自体すべて既知であって、ここで詳細を説明する必要はな いものと考える。すなわち、本明細書で用いられる「空気懸濁法」の語は、固体 粒子が上方に移動する気体流中に懸濁される任意の方法を意味する。この場合の 気体は、用いられた溶媒を蒸発させることが可能で、「空気懸濁法」の語にもか かわらず必ずしも空気である必要はない。 しかしながら、空気懸濁法に関しては、感受性の活性物質およびそれらの有機 溶媒への暴露の問題は消失または実質的に低減し、一方高流速の空気または気体 の好ましい使用は所望の結果の達成に十分である。 請求される方法の好ましい実施態様によればポリマーはそれらの溶液、擬ラテ ックス（pseudolatex）またはエマルジョンからコア粒子上に適用される。この 場合、本発明に従う新規方法によれば、このような溶媒の存在は活性物質に何ら 実質的な程度の影響を与えないことが全く予期できずに見出され、有機溶媒をポ リマーの溶媒として使用できることに留意すべきである。 しかしながら、本発明の他の好ましい実施態様は、上記コーティング溶液が水 を含有し、上記擬ラテックスは水中におけるポリマーの擬ラテックスであり、ま た上記エマルジョンは相の一つが水相のエマルジョンである場合によって表され る。異なるポリマーの混合物の場合には、それらはエマルジョンの異なる相中に 存在させることができる。すなわち、水の存在は、コーティング操作時の静電気 の発生を消失または実質的に低減できることが見出され、この点で特に好ましい 実施態様は、一つの相はポリマーのそのポリマーの溶媒中における液体であり、 他の相は水であるエマルジョンの使用である。最後に述べたエマルジョンは以下 に詳細に説明するように、より一般的な態様においてさらに有用であり、これは また本発明の他の態様を提供する。 本発明の他の好ましい実施態様は、粒子中に、その製造時１種または２種以上 の安定化剤を導入する場合によって表される。このような安定化剤の性質はもち ろん、安定化される特定の活性物質に依存し、この安定化剤は既知の原理に従い 選択される。 放出制御ポリマー被膜にはその適用時に添加物を導入することもできる。 このような添加物の例には、フィルム性修飾剤および放出制御剤がある。第一の カテゴリーについての例は、可塑剤たとえばクエン酸トリエチルエステル、トリ アセチン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド等であり、一方、放 出制御剤はたとえば無機塩基（たとえば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、 炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等）、有機塩基（たとえば、エタノールアミン、 ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、リドカイン、テトラカイン等）、 無機酸（たとえば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等）、有機酸（たとえ ば、クエン酸、乳酸、グリコール酸、アスコルビン酸等）および放出に際してコ ーティング中に孔部 を形成する固体可溶性物質（たとえば、塩化ナトリウム、グルコース、マンニト ール、スクロース等の結晶）とすることができる。 エマルジョンまたは擬ラテックスが形成される場合に包含される添加物はたと えば乳化剤である。 コーティング材料の所要量は、たとえばマイクロカプセルのサイズ、コーティ ングの組成および所望の放出特性に依存する。しかしながら、通常の量はコアの 重量に基づいて１〜200重量％、好ましくは５〜100重量％である。 トラップされた活性物質の放出を制御するコーティングの適用後、マイクロ粒 子にその性質をさらに改良するためまたはその処理を容易にするために、付加的 な材料をたとえばスプレーして適用することもできる。このような材料の例は、 マンニトール、スクロースおよび食塩である。 既に上述したように、本発明は特に、有機溶媒に感受性であるかまたは有機溶 媒の存在下に不安定なタンパク質、ペプチドおよびポリペプチドまたは他の薬物 もしくは生物活性物質に関連して興味がある。しかしながら一般的に、本発明の 概念は非経口的に使用できる任意の生物活性物質に適用可能であるから、本発明 は上述のような物質のみの存在に限定されるものではない。すなわち、感受性ま たは不安定性の問題に加えて、本発明は他の理由で溶媒の除去が困難な場合また は毒性もしくは他の環境問題が起こる可能性のある場合にも同様に特に興味があ る。 本発明の第二の態様によれば、ａ）実質的に有機溶媒を含まない水性メジウム 中で調製され、活性物質がトラップされた生物分解性材料のコア粒子、ならびに ｂ）空気懸濁法によって上記コア粒子上に適用された、フィルム形成性、生物分 解性、放出制御ポリマーの被膜から構成される非経口的に投与できる持続放出性 マイクロ粒子自体が提供される。 好ましい実施態様およびそれに関連して使用される材料および方法の例は、上 に特定したすべての実施態様および実施例が参照されるので、それらをもう一度 繰り返すことはしない。 本発明の第三の態様によれば、一般的にコーティングされた小粒子、好ましく は上に定義されたマイクロ粒子の空気懸濁法による製造方法も提供される。この 方法は上記粒子上に、一つの相はポリマーの溶媒中における液体であり、他の相 は水であるコーティング材料のコーティングエマルジョンを空気懸濁法によって 適用することからなる。 すなわち、このような方法により、小粒子の空気懸濁法における静電気に伴う 問題が消失または軽減できることが見出された。 本発明のこの態様の背景は以下の通りである。錠剤、顆粒および小粒子の空気 懸濁コーティング法は周知である。コーティングを有機溶媒中コーティング材料 で行う場合には、静電気が問題になることがある。この問題は小粒子をコーティ ングする場合にさらに顕著である。すなわち、小粒子はコーティングチャンバー の壁部にまたは互いに接着する傾向を有し、望ましくない凝集による問題がさら にひどくなる。コーティング装置の壁への粒子の粘着はバッチ内の不均一なコー ティング、収率の低下および方法の制御可能性の低下を生じることがある。 一部のコーティングポリマーでは、ラテックスまたは擬ラテックスの水性分散 液の使用が静電気に伴う問題を消失または減弱させる。すべてのコーティングポ リマーについてラテックス分散液を使用して、有機溶媒ベースのシステムから同 一の性質のフィルムを得ることは不可能であった。本発明のこの態様は、この問 題を回避することを可能にする。 この関連では、本発明における粒子は、サイズまたは組成に関して特定の限定 があるものではないことを付加しなければならない。すなわち、そ れは薬物物質または薬物物質含有粒子、肥料等とすることができる。 コーティング材料は任意のコーティング材料、たとえば空気懸濁コーティング で使用可能で、完全に水混和性ではない溶媒中に溶解するフィルム形成ポリマー である。コーティング材料の例には上に特に挙げたポリマーがある。適当な溶媒 の例は高級アルコール、エステル、エーテル、ケトン、塩素化炭化水素、脂肪族 炭化水素および芳香族炭化水素である。 コーティングエマルジョンは水相を有機相と混合して作成される。コーティン グ材料は有機相に溶解する。乳化工程は任意の慣用の分散操作、たとえば間欠的 攪拌、プロペラ式もしくはタービン型ミキサーまたは磁性ミキサーによる混合、 コロイドミル法、ホモジネーション法または超音波法によって実施することがで きる。有機相は内相、外相のいずれであってもよい。 エマルジョンの安定化には乳化剤を添加することができる。その好ましい例に は陰イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤がある。これらの乳化剤は 単独でまたは配合して使用することができる。 本発明のこの態様によりおよび本発明の第一の態様の関連において用いられる コーティング装置は、粒子とくに小粒子のコーティングが可能な任意の型の空気 懸濁装置とすることができる。実施例 本発明を次に以下の非限定的実施例によって例示する。実施例では、そのよく 知られた性質およびほどほどの経費によりこのようなシステムのモデルタンパク 質に最も広範に使用されるＢＳＡ含有マイクロ粒子をポリ（ラクチド−コーグリ コリド）からなる層でコーティングする。さらに、インスリンは感受性のタンパ ク質であることが知られていて、最終製剤の生物活性がインビボで容易にアッセ イできることから、ヒトインスリンを 含有するマイクロ粒子をコーティングする。マイクロ粒子はたとえば、米国特許 第4,822,535号に開示された技術に従って調製される。コーティングは市販品を 入手できる装置で適用され、実施例においてセットされたパラメーターは、コー ティングのための至適条件を得るためには、多くの場合調整が必要なことから、 単に指針として考えるべきである。コア粒子の製造操作 実施例 １ 米国特許第4,822,535号にによる２相固定化 １．８０ｇのデンプン（Amioca 50，National Starch）を秤量し、320ｇの５０m M重炭酸ナトリウム緩衝液pH 9.8に懸濁する。 ２．懸濁液をデンプンが完全に溶解するまで加熱する。 ３．溶液を50℃に冷却する。 ４．５０mM重炭酸ナトリウム緩衝液pH 9.8中9.26％のＢＳＡ溶液（室温）９６ml を加え、１０秒間攪拌する。 ５．デンプン−タンパク質溶液を50ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液pH9.8中２０％ （w/w）のポリエチレングリコール溶液(室温、平均分子量20000)800mlに連続的 に攪拌しながら加える。 ６．２分後、５０mM重炭酸ナトリウム緩衝液pH 9.8中４０％（w/w）のポリエチ レングリコール溶液（室温、平均分子量20000）3200mlを連続的に攪拌しながら 加える。 ７．２４時間攪拌する。 ８．得られたマイクロ粒子を洗浄し、真空乾燥する。 ９．乾燥したマイクロ粒子を160μmメッシュの篩を通して篩過する。実施例 ２ １．８０ｇのデンプン（Amioca 50，National Starch）を秤量し、420ｇ の水に懸濁する。 ２．懸濁液をデンプンが完全に溶解するまで加熱する。 ３．溶液を５０℃に冷却する。 ４．デンプン溶液を水中２０％（w/w）ポリエチレングリコール溶液（室温、平 均分子量20000Ｄ）800mlに連続的に攪拌しながら加える。 ５．２分後、水中４０％（w/w）ポリエチレングリコール溶液（室温、平均分子 量20000Ｄ）3200mlを連続的に攪拌しながら加える。 ６．２４時間攪拌する。 ７．得られたマイクロ粒子を洗浄し、真空乾燥する。 ８．乾燥したマイクロ粒子を水中５％（w/w）ＢＳＡ溶液に浸漬する。等重量の 粒子およびＢＳＡ溶液を使用する。 ９．３時間後に粒子を凍結乾燥する。 10．乾燥したマイクロ粒子を160μmメッシュの篩を通して篩過する。コア粒子の製造操作 実施例 ３ １．８０ｇのデンプン（Amioca 50，National Starch）を秤量し、320ｇの５０m M重炭酸ナトリウム緩衝液pH 9.8に懸濁する。 ２．懸濁液をデンプンが完全に溶解するまで加熱する。 ３．溶液を５０℃に冷却する。 ４．8.89ｇのインスリンに相当するNovo NordiskからのMonotard（登録商標）25 11mlを遠心分離する。0.15mM NaCl、1mM ZnCl₂および１０mM酢酸ナトリウムを含 有する緩衝液pH 7.3の500mlで１回インスリンを洗浄し、再遠心分離する。イン スリンをデンプン溶液と混合し１０秒間攪拌する。 ５．デンプン−タンパク質溶液を５０mM重炭酸ナトリウム緩衝液pH9.8中 ２０％（w/w）のポリエチレングリコール溶液(室温、平均分子量20000)800mlに 連続的に攪拌しながら加える。 ６．２分後、５０mM重炭酸ナトリウム緩衝液pH 9.8中４０％（w/w）のポリエチ レングリコール溶液（室温、平均分子量20000）3200mlを連続的に攪拌しながら 加える。 ７．２４時間攪拌する。 ８．得られたマイクロ粒子を洗浄し、真空乾燥する。被膜の製造操作 実施例 ４ コーティング溶液の調製操作 １．200ｇのポリ（ラクチド―コ―グリコリド７５／２５）、Boeringer Ingelhe imからのResomer RG756を秤量する。 ２．トリアセチン１０ｇを加える。 ３．それをアセトン3123ｇ中に溶解する。 コーティングを施す操作 １．３．５％ＢＳＡ含有デンプンマイクロ粒子500ｇをGlatt GPCG 6″Wursterに 装荷する。 ２．以下の条件にWursterをセットする。 噴霧圧 ３bar 噴霧ノズル ０.８mm 入口温度 ３８〜４０℃ 出口温度 ３３〜３７℃ 生成物温度 ３４〜３８℃ 気速度 ３.２〜３.４m／s コーティング溶液流速 ４.４ml／分 ３．コーティングされた生成物を回収する。実施例 ５ コーティング溶液の調製操作 １．200ｇのポリ（ラクチド−コ―グリコリド５０／５０）（Boeringer Ingelhe imからのResomer RG504H）を秤量する。 ２．それをアセトン3133ｇに溶解する。 コーティングを施す操作 １．３.５％ＢＳＡ含有デンプンマイクロ粒子500ｇをGlatt GPCG 6″Wursterに 装荷する。 ２．以下の条件にWursterをセットする。 噴霧圧 ３bar 噴霧ノズル ０.８mm 入口温度 ３８〜４０℃ 出口温度 ３３〜３７℃ 生成物温度 ３４〜３８℃ 空気速度 ３.０〜３.２m／s コーティング溶液流速 ４.４ml／分 ３．コーティングされた生成物を回収する。実施例 ６ コーティング溶液の調製操作 １．４０ｇのポリ（Ｄ，Ｌラクチド）（Boeringer IngelheimからのResomer Ｒ1 04）および４０ｇのをポリ（ラクチド−コ―グリコリド 75／25） Resomer RG75 7）を秤量する。 ２．それを酢酸エチル1252ｇに溶解する。 ３．水2504ｇを１.６ｇのTween 80と混合する。 ４．ポリマー溶液と水溶液をYstral turraxミキサーを用いて混合する。 コーティングを施す操作 １．２．７％ＢＳＡを含むデンプンマイクロ粒子１００ｇを・Ｈｕｔｔｌｉｎ K uge1coater HKC005に装荷する。 ２．以下の条件にKugelcoaterをセットする。 噴霧圧 ０.８bar マイクロクライメート圧 ０.４bar 噴霧ノズル ０.６mm 入口温度 ２５〜２７℃ 出口温度 ２０〜２４℃ コーティング溶液流速 ５〜７ｇ／分 ３．PLGAでコーティング後１０％（w/w）のマンニトールおよび０．４％（w/w） のTween 80を含む水溶液200ｇを粒子上に３.５ｇ／分の流速で噴霧する。 ４．コーティングされた生成物を回収する。インビトロ放出方法 ポリエチレン製エッペンドルフチューブにコーティングされた生成物７０ｇを 秤量し、緩衝液１.５mlを加えてインビトロ放出をモニターする。放出緩衝液の 組成は食塩，塩化カルシウム１mM、α−アミラーゼ７２Ｕ／l、およびナトリウ ムアジド０．０２％を含むリン酸ナトリウム３０mM、pH 7.4、Ｉ−0.154とする 。適当な間隔で緩衝液１mlを採取し、サンプルに新鮮な緩衝液を加え正しいｐＨ に維持する。チューブは３７℃で穏やかに振盪する。タンパク質およびデンプン 濃度をｐＨとともに測定する。インビボ放出方法 １０匹のＳＰＦ雌性ラット（９〜10週、170〜180ｇ）をコーティングされたマ イクロスフェアからのＢＳＡのインビボ放出の試験に用いた。実施例６に従って 調製したマイクロ粒子163mg／mlを含有する懸濁液200μlを頸部の皮下に注射し た。注射用のビヒクルは懸濁剤として３％カルボキシメチルセルロースナトリウ ムを含有する生理食塩水とした。注射は21Ｇの注射針を用いて行った。 対照群としては、非コーティングマイクロスフェアを、比較のために、８匹の 動物に与えた。ＢＳＡの用量はコーティングされた製剤の方が非コーティング製 剤より４倍高くした。 ＢＳＡ測定用の血液サンプルは日０の投与前および午後ならびに１、２、３、 ４、５、６および７日の同時刻に眼窩静脈叢から採取した。500μlの血液を採取 して、血清中のＢＳＡを分析した。血清中のＢＳＡ濃度はウシアルブミンとは反 応するがラットアルブミンとは反応しない市販品を入手できる抗体（Dakopatts ）に基づくELISA法を用いて分析した。実施例 ７ コーティング溶液の製造操作は実施例６の場合と同様とした。 コーティングを施す操作 ９.３％のインスリン［Novo NordiskからのMonotard（登録商標）］ 負荷する。 その他のコーティング操作は実施例６の場合と同様である。インビボ放出方法 １０匹のＳＰＦ雌性ラット（９〜10週、170〜180ｇ）を実施例７の製剤の生物 学的作用の試験に用いた。試験物質の注射前３日に、ラットをストレプトゾトシ ン６５mg／kgで処置して糖尿病を誘発した。ストレプトゾト シンは１％クエン酸緩衝液、pH 4.5に注射前最大２分に溶解した。 注射の日に実施例７からのマイクロ粒子５１mg／mlを含有する懸濁液200μlを 頸部の皮下に注射した。注射用のビヒクルは懸濁剤として３％カルボキシメチル セルロースナトリウムを含有する生理食塩水とした。注射は21Ｇの注射針を用い て行った。対照群としては、非コーティングマイクロスフェアを比較のために８ 匹の動物に与えた。インスリンの用量はコーティングマイクロスフェアよりも非 コーティングマイクロスフェアの方が２．５倍高くした。 血中グルコース測定用の血液サンプルは０日のインスリン投与前および午後、 ならびに１、２、３、４、５、６および７日の同時刻と、９日の午後、またコー ティングされたマイクロスフェアを投与した動物については、１１日の午後にも 、眼窩静脈叢から採取した。血中グルコースの分析はRocheからの市販キットC0B AS MIRAを用いて実施した。図面の説明 インビトロ試験からのタンパク質の放出、ならびに２つのインビボ試験からの ＢＳＡ濃度および血中グルコースレベルを添付の図面に示す。 図１は、実施例４のコーティングされた粒子からの放出を示す。 図２は、実施例５のコーティングされた粒子からの放出を示す。 図３は、実施例６のコーティングされた粒子からの放出を示す。 図４は、実施例６のコーティング粒子および非コーティングＢＳＡ粒子のイン ビボ放出からの血清中平均ＢＳＡ濃度を示す。 図５は、実施例７の粒子および非コーティングインスリン粒子からのインスリ ンのインビボ放出による血中平均グルコースレベルを示す。 さらに詳しくは、図面から以下のことがわかる。 図１では実施例４におけるコーティングされた粒子からの累積タンパク 質放出が明らかである。曲線は図面の説明に指示したように異なるコーティング レベル（コアの重量に基づいた添加コーティングポリマーの重量％）を表す。コ アは迅速に分解し、大部分のタンパク質は極めて短時間に放出される。バースト はすべてのコーティングレベルで観察できるが次第に低下する。コーティングポ リマーは徐々に分解し、したがって、バースト相ののちには見るべき量のタンパ ク質は放出されない。 図２では、実施例５に上述したように、４０％のコーティングレベルのコーテ ィング粒子からのタンパク質の放出を示す。ポリマーは容易には分解せず、最初 に実施例４に類似の限られたバーストを与えるが、ついで約２週間後に残りのタ ンパク質がコーティングされたマイクロ粒子から放出を始める。 図３では、実施例６のコーティング粒子（上述のようにコーティングレベル80 ％）からのタンパク質の放出が観察できる。この場合、タンパク質は実施例４お よび５からの場合よりさらに連続的に放出される。 図４では、インビボ放出からの平均ＢＳＡ濃度が観察できる。全試験期間を通 じ非コーティングマイクロスフェアに比べ一定したＢＳＡの放出が見られる。 図５には、実施例７の粒子および非コーティング粒子からのインスリンのイン ビボ放出による平均血中グルコースレベルを示す。いずれの製剤においても、６ 時間後には血中グルコースレベルの急速な正常化が見られる。１日後、レベルは 糖尿病レベルに戻るが、コーティング製剤の場合には、レベルは再び低下し始め て７日後に血中グルコースレベルの最大低下を示す。１１日には、血中グルコー スレベルは再び糖尿病状態に戻る。すなわち、インスリンはその過程を通じて注 射後少なくとも９日間その生物活性を維持した。非コーティング粒子では遅延効 果は観察されなかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 フユール，ペーテル スウエーデン国 エス−237 32 ビヤー レド．ロイトナンツヴエーゲン ９ (72)発明者 ヨンソン，モニカ スウエーデン国 エス−230 40 バーラ. シグヴアルドグルツ ベスガータ １

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．非経口的に好ましくは注射によって投与可能な、生物活性物質を含有する持 続放出性マイクロ粒子の製造方法において、活性物質に対して有害な有機溶媒を 実質的に含まない水性メジウム中において生物分解性材料からコア粒子を調製し 、その調製時または調製後にその中に生物活性物質をトラップさせ、上記活性物 質を含有するコア粒子を所望により洗浄工程に付したのちに乾燥し、コア粒子を 空気懸濁法によってフィルム形成性、生物分解性、放出制御性ポリマーでコーテ ィングして、活性物質を有害な有機溶媒に暴露することなくコア粒子上に上記ポ リマーの被膜を形成させることからなる方法。 ２．平均直径が１０〜200μm、好ましくは２０〜100μmの範囲のマイクロ粒子を 調製する請求項１記載の方法。 ３．コア粒子の材料はデンプンおよび化学的もしくは物理的に修飾されたデンプ ンからなる群より選ばれる請求項１または２に記載の方法。 ４．ポリマーはα−ヒドロキシ酸および／またはα−ヒドロキシ酸環状ダイマー から調製されるホモまたはコポリマーからなる群より選ばれる請求項１〜３のい ずれかに記載の方法。 ５．α−ヒドロキシ酸は乳酸およびグリコール酸からなる群より選ばれる請求項 ４記載の方法。 ６．環状ダイマーはグリコリドおよびラクチドからなる群より選ばれる請求項４ 記載の方法。 ７．コア粒子は水性２相系技術を用いて調製される請求項１〜６のいずれかに記 載の方法。 ８．ポリマーは溶液、擬ラテックスまたはエマルジョンからコア粒子上に適用さ れる請求項１〜７のいずれかに記載の方法。 ９．コーティング溶液は水を含有し、擬ラテックスは水中におけるポリマーの擬 ラテックスであり、またエマルジョンは相の一つが水相のエマルジョンである請 求項８記載の方法。 10．エマルジョンは一つの相はポリマーのその溶媒中における液体であり他の相 は水のエマルジョンである請求項９記載の方法。 11．空気懸濁法は、真空流動床を含む流動床、噴出床、およびWurster法技術か らなる群より選ばれる請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。 12．コア粒子中にその製造時に、活性物質の安定化剤（単数または複数）を導入 する請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。 13．放出制御ポリマー被膜中にその適用時に１種または２種以上の添加物を導入 し、これらの添加物は、フィルム性改良剤たとえば可塑剤および界面活性剤、な らびに放出制御剤からなる群より選ばれる請求項１〜１２のいずれかに記載の方 法。 14．ポリマー被膜材料の量はコアの重量に基づいて１〜200重量％、好ましくは ５〜100重量％の範囲とする請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。 15．生物活性物質は有機溶媒への暴露に感受性の物質である請求項１〜１４のい ずれかに記載の方法。 16．活性物質はペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質からなる群より選ばれ る請求項１５記載の方法。 17．小粒子、好ましくはマイクロ粒子を空気懸濁法によってコーティング材料の コーティングエマルジョンを適用することによってコーティングする方法におい て、コーティングエマルジョンの一つの相は溶媒中のコーティング材料の液体で あり、他相は水である方法。 18．生物活性物質を含有し、非経口的投与、好ましくは注射により投与で きる持続放出性マイクロ粒子であって、ａ）活性物質に有害な有機溶媒を実質的 に含まない水性メジウム中で調製され、その中に活性物質がトラップされた生物 分解性材料のコア粒子、ならびにｂ）空気懸濁法によって上記コア粒子上に適用 された、フィルム形成性、生物分解性、放出制御ポリマーの被膜から構成される マイクロ粒子。 19．請求項２〜１６のいずれかに記載のようにして調製された請求項１８記載の マイクロ粒子。