SE517422C2 - Farmaceutiskt acceptabel stärkelse - Google Patents

Description

vvuvn 10 l5 20 25 30 35 ' 517 42% kommer dessa polymerer också att gå under benämningen PLGA. PLGA bryts ned via esterhydrolys till mjölksyra och glykolsyra och har visat sig besitta utmärkt biokompati- bilitet. Den ofarliga naturen hos PLGA kan dessutom ex- emplifieras av att åtskilliga parenterala beredningar för fördröjd frisättning baserade på dessa polymerer har god- känts av myndigheter, däribland US Food and Drug Admi- nistration.

Parenteralt administrerbara produkter för fördröjd frisättning på marknaden idag baserade på PLGA innefattar Decapeptylm (Ibsen Biotech), Prostap SRW (Lederle), De- capeptyl® Depot (Ferring) och Zoladex® (Zeneca). Läke- medlen i dessa beredningar är alla peptider. Med andra ord består de av aminosyror kondenserade till en polymer med relativt låg polymerisationsgrad och de uppvisar ej någon väldefinierad tredimensionell struktur. Detta möj- liggör i sin tur vanligtvis användning av förhållandevis stränga betingelser under framställningen av dessa pro- dukter. Exempelvis kan strängsprutning och efterföljande storleksreducering utnyttjas, vilka tekniker inte torde vara tillåtna i samband med proteiner, eftersom dessa allmänt sett inte klarar så stränga betingelser.

Följaktligen föreligger det också behov av bered- ningar med reglerad frisättning för proteiner. Proteiner liknar peptider därigenom att de också består av aminosy- ror, men molekylerna är större och flertalet proteiner är beroende av en väldefinierad tredimensionell struktur vad beträffar många av sina egenskaper, däribland biologisk aktivitet och immunogenicitet. Deras tredimensionella struktur kan förstöras relativt lätt, t.ex. av höga tem- peraturer, ytinducerad denaturering samt i många fall ex- ponering för organiska lösningsmedel. En mycket allvarlig nackdel i samband med användning av PLGA, som är ett ut- märkt material i sig, för fördröjd frisättning av protei- ner är därför behovet av användning av organiska lös- ningsmedel för upplösning av nämnda PLGA, med åtföljande risk för att proteinets stabilitet påverkas negativt och nnauu 10 15 20 25 30 35 517 422 3 att konformationsförändringar hos proteinet med risk för att detta leder till en immunologisk reaktion hos patien- ten, vilket kan ge bàde en förlust av den terapeutiska effekten genom bildning av hämmande antikroppar och tox- iska biverkningar. Dà det är synnerligen svårt att med säkerhet avgöra om ett komplext protein i alla delar har bibehàllit sin tredimensionella struktur, är det av stor vikt att undvika att utsätta proteinet för betingelser som kan tänkas inducera konformationsförändringar.

Trots stora ansträngningar i syfte att modifiera PLGA-teknologin för undvikande av detta inneboende pro- blem med proteininstabilitet under framställningsförfa- randet har utvecklingen inom detta omrâde gått mycket làngsamt, och huvudanledningen till detta är sannolikt att de tredimensionella strukturerna för flertalet prote- iner är alltför känsliga för att motstà de använda till- verkningsbetingelserna och den kemiskt sura miljö som bildas vid nedbrytningen av PLGA-matriser. Den vetenskap- liga litteraturen innehåller ett flertal beskrivningar av stabilitetsproblem vid tillverkningen av mikrosfärer av PLGA på grund av exponeringen för organiska lösningsme- del. Som ett exempel pà den sura miljö som bildas vid nedbrytningen av PLGA-matriser har det nyligen visats att pH-värdet i en PLGA-mikrosfär med en diameter pà cirka 40 pm visats sjunka till 1,5, vilket är fullt tillräckligt för att denaturera, eller på annat sätt skada, många te- rapeutiskt användbara proteiner (Fu et al, Visual Eviden- ce of Acidic Environment Within Degrading Poly(lactic-co- glycolic acid) (PLGA) Microspheres. Pharmaceutical Re- search, Vol. 17, No 1, 2000, 100-106). I det fall mikro- sfärerna har en större diameter kan pH-värdet förväntas sjunka ytterligare pá grund av att de sura nedbrytnings- produkterna då får svårare att diffundera bort och att den autokatalytiska reaktionen intensifieras.

Ett antal försök att lösa problem orsakade av expo- nering av det biologiskt aktiva ämnet för en kemiskt sur miljö under bionedbrytningen av mikrosfärmatrisen och or- »n-vo 10 15 20 25 30 35 517 422 4 ganiska lösningsmedel vid tillverkningsprocessen har be- skrivits. För att undvika sur miljö under nedbrytningen har man försökt att byta ut PLGA som matris för mikrosfä- rerna mot en polymer som ger kemiskt neutrala nedbryt- ningsprodukter och för att undvika att utsätta det biolo- giskt aktiva ämnet för organiska lösningsmedel har man försökt att antingen tillverka mikrosfärerna i förväg och först efter upparbetning och torkning försökt ladda dem med det biologiskt aktiva ämnet, eller försökt utesluta det organiska lösningsmedlet helt under tillverkning av mikrosfärerna.

Exempelvis har höggrenad stärkelse med relativt låg molvikt (maltodextin, medelmolekylvikt ca 5000 Da) modi- fierats kovalent med akrylgrupper för överföring av denna stärkelse i en form som kan solidifieras till mikrosfärer och den erhållna polyakrylstärkelsen har överförts till partikulär form genom radikalpolymerisation i en emulsion med toluen/kloroform (4:l) som ytterfas (Characterization of Polyacryl Starch Microparticles as Carries for Prote- ins and Drugs. Artursson et al, J Pharm Sci, 73, 1507- 1513). Proteiner kunde infångas i dessa mikrosfärer, men tillverkningsbetingelserna utsätter det biologiskt aktiva ämnet för både organiska lösningsmedel och höga skjuvk- rafter vid tillverkningen av emulsionen. De erhållna mik- rosfärerna löses upp enzymatiskt och pH kan förväntas bi- behållas neutralt. De erhållna mikrosfärerna är inte lämpliga för parenteral administration, speciellt uppre- pad sådan, av flera skäl. Allra väsentligast är den ofullständiga och mycket långsamma bionedbrytbarheten av både stärkelsematrisen (Biodegrable Microspheres IV. Fac- tors Affecting the Distribution and Degradation of Poly- acryl Starch Microparticles. Laakso et al, J Pharms Sci, 75, 962-967, 1986) och den syntetiska polymerkedja som tvärbinder stärkelsemolekylerna. (Stjärnkvist P., Laakso T. and Sjöholm I. (1989) Biodegradable microspheres. XII: Properties of the crosslinking chains in polyacryl starch microparticles. J.Pharm.Sci. 78, 52-56).. Dessutom är 10 15 20 25 30 35 ' ' 517 422 5 dessa mikrosfärer alltför små, med en diameter <2 pm, för att vara lämpliga för injektion i vävnaderna för förlängd frisättning, då vävnadsmakrofager med lätthet kan fagocy- tera dem. Försök att höja nedbrytningshastigheten och graden av nedbrytning genom att införa en potentiellt bi- onedbrytbar estergrupp för att binda akrylgrupperna till den höggrenade stärkelsen ledde inte till avsett resultat och även dessa polyakrylstärkelsemikrosfärer bionedbröts alltför långsamt och ofullständigt under rimliga tidspe- rioder (BIODEGRADABLE MICROSPHERES X: Some Properties of Polyacryl Starch Microparticles Prepared from Acrylic acid Esterified Starch. Laakso and Sjöholm.1987 (76) pp 935-939. J Pharm Sci.).

Tillverkning av stärkelsemikrosfärer med användning av icke kemiskt modifierad stärkelse med utnyttjande av en olja som ytterfas har beskrivits (US 4 713 249; Schrö- der U., Crystallized carbohydrate spheres for slow relea- se and targeting. Methods Enzymol. 1985 (112) 116-128; Schröder, U., Crystallized carbohydrate spheres as a slow release matrix for biologically actived substances. Bio- materials 5:lOO-104, 1984). Mikrosfärerna solidifieras i dessa fall genom utfällning i aceton, vilket leder både till att det biologiskt aktiva ämnet utsätts för ett or- ganiskt lösningsmedel och till att stärkelsens naturliga tendens att solidifieras genom fysikalisk tvärbindning inte utnyttjas under tillverkningsprocessen. Detta leder i sin tur till mikrosfärer med en inneboende instabilitet då stärkelsen efter resuspendering i vatten och vid expo- nering för kroppsvätskorna kommer att sträva efter att bilda sådana tvärbindningar. För att en sådan vatten-i- olja-emulsion skall erhållas krävs i många fall höga skjuvkrafter och de mikrosfärer som bildas är oftast alltför små för att vara lämpliga för parenteral förlängd frisättning.

I EP 213303 A2 beskrivs framställning av mikrosfärer av bland annat kemiskt omodifierad stärkelse i tvàfas vattensystem, med utnyttjande av stärkelsens naturliga 10 15 20 25 30 35 .nu n. 517 422 §II=§IIf °* 6 . .. . .. .. förmåga att solidifieras genom bildning av fysikaliska tvärbindningar, och immobilisering av en substans i dessa mikrosfärer i syfte att undvika att exponera den biolo- giskt aktiva ämnet för organiska lösningsmedel. Den be- skrivna metodiken, i kombination med den stärkelsekvalité som definieras, ger inte upphov till fullständigt bioned- brytbara partiklar. De erhållna partiklarna är inte hel- ler lämpliga för injektion, framför allt för upprepade injektioner under längre tid, då den beskrivna stärkelse- kvalitén innehåller alltför höga mängder av främmande växtprotein.

Att stärkelse teoretiskt är ett mycket lämpligt, kanske till och med idealiskt, matrismaterial för mikro- partiklar har varit känt under lång tid eftersom stärkel- se inte behöver lösas i organiska lösningsmedel och har en naturlig tendens att solidifiera och eftersom det finns kroppsegna enzymer som kan bryta ned stärkelse till kroppsegna och neutrala ämnen, i slutänden glukos, samt att stärkelse, förmodligen på grund av likheten med kroppseget glykogen, har visats vara icke immunogen.

Trots stora ansträngningar har emellertid stärkelse med egenskaper som möjliggör tillverkning av mikropartiklar lämpliga för parenteral användning och betingelser som möjliggör tillverkning av fullständigt bionedbrytbara mikropartiklar under milda betingelser som tillåter in- fàngning av känsliga biologiskt aktiva substanser, såsom proteiner, ej beskrivits tidigare.

Stärkelsegranuler innehåller naturligt föroreningar, såsom stärkelseproteiner, vilket gör dem olämpliga för parenteral administration. Vid oavsiktlig deponering av otillräckligt renad stärkelse, såsom kan ske vid opera- tioner då många typer av operationshandskar är pudrade med stabiliserade stärkelsegranuler, kan mycket allvarli- ga biverkningar uppkomma. Stärkelsegranuler i sig är inte heller lämpliga för upprepad parenteral administration av det skälet att de inte är fullständigt bionedbrytbara inom acceptabla tidsrymder. 10 15 20 25 30 35 '517 422 7 Stärkelsemikrosfärer tillverkade av syrahydrolyserad och upprenad stärkelse har använts för parenteral admi- nistration pà människa. Mikrosfärerna tillverkades genom kemisk tvärbindning med epiklorhydrin under starkt alka- liska betingelser. Den kemiska modifiering som då erhölls av stärkelsen leder till en sänkning av bionedbrytbarhe- ten så att mikrosfärerna kan lösas upp fullständigt av kroppsegna enzymer, såsom a-amylas, men inte omvandlas fullständigt till glukos som slutprodukt. Varken till- verkningsmetoden eller de erhållna mikrosfärerna är lämp- liga för immobilisering av känsliga proteiner och såsom framgår av kontrollförsöken är inte heller syrahydrolyse- rad stärkelse lämplig för framställning av vare sig full- ständigt biodegraderbara stärkelsemikrosfärer eller stär- kelsemikrosfärer innehållande en hög laddning av ett bio- logiskt aktivt ämne, såsom ett protein.

Hydroxietylstärkelse (HES) administreras parenteralt i höga doser till människa som en plasmaersättare. HES framställs genom att stärkelsegranuler fràn stärkelse be- stående i stort uteslutande av höggrenat amylopektin, s.k. ”waxy maize”, eller vaxartad majsstärkelse, syrahyd- rolyseras för en minskning av molvikten, och därefter hydroxietyleras under alkaliska betingelser samt syrahyd- rolyseras ytterligare en gång för att en medelmolvikt kring 200 000 Da skall uppnås. Därefter utföres filtre- ring, extraktion med aceton och spraytorkning. Hydroxie- tyleringens syfte är att förlänga effektens varaktighet, då icke modifierat amylopektin bryts ned mycket snabbt av a-amylas och dess uppehállstid i cirkulation är ca 10 mi- nuter. HES är inte lämplig för framställning av fullstän- digt bionedbrytbara mikrosfärer innehållande ett biolo- giskt aktivt ämne, eftersom den kemiska modifieringen le- der till en avsevärd sänkning i hastigheten för och full- ständigheten i bionedbrytningen och till att stärkelsens naturliga tendens att solidifieras genom bildande av icke kovalenta tvärbindningar eliminerats. Dessutom blir hög- koncentrerade lösningar av HES alltför viskösa för att »rara lO 15 20 25 30 35 vara användbara för framställning av mikropartiklar. An- vändningen av HES i dessa höga doser visar att parente- ralt användbar stärkelse kan tillverkas, även om HES inte är användbar för tillverkning av mikrosfärer utan kemisk tvärbindning eller utfällning med organiska lösningsme- del.

I WO 99/00425 beskrivs användning av värmetàliga proteolytiska enzymer med brett pH-optimum för att rena stärkelsegranuler från ytassocierade proteiner. De er- hållna granulerna är inte lämpliga för parenteral admi- nistration då de fortfarande innehåller de stärkelsepro- teiner som finns inuti granulerna och det finns risk för att rester av de tillsatta proteolytiska enzymerna finns kvar i stärkelsen. Granulerna är inte heller lämpliga för tillverkning av parenteralt administrerbara stärkelsemik- rosfärer i tvåfas-vattensystem, då de har fel molvikts- fördelning för att kunna användas i tillräckligt hög kon- centration, även efter upplösning, och i de fall mikro- sfärer kan erhållas torde de inte vara fullständigt bionedbrytbara.

Användning av skjuvning för att modifiera molvikts- fördelningen av stärkelse, i syfte att fä fram bättre stärkelse för framställning av tabletter, beskrivs i US 5,455,342. Den stärkelse som erhålls är inte lämplig för parenteral administration på grund av det höga innehållet av stärkelseproteiner, som dessutom kan föreligga i dena- turerad form efter skjuvningen, och den erhållna stärkel- sen är inte heller lämplig för framställning av bio- nedbrytbara stärkelsemikrosfärer för parenteral administ- ration eller för användning i tvàfas-vattensystem för framställning av dylika stärkelsemikrosfärer.

Ett förfarande för framställning av parenteralt ad- ministrerbara stärkelseberedningar med följande egenska- per skulle sålunda vara synnerligen önskvärt: 0 ett förfarande medelst vilket man kan framställa en i huvudsak fullständigt bionedbrytbar och biokompa- tibel stärkelse som är lämplig att administrera pa- .v 10 15 20 25 30 35 '517 422 šfäšfff 9 . . renteralt och vid vars nedbrytning kemiskt neutrala kroppsegna ämnen bildas; 0 en parenteralt acceptabel stärkelse som är lämplig för framställning av i huvudsak fullständigt bioned- brytbarbara stärkelsemikropartiklar; Dessa och andra syften uppnås medelst den nedan de- finierade uppfinningen.

BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN Enligt en första aspekt av föreliggande uppfinning tillhandahåller denna ett förfarande för framställning av en stärkelse som är farmaceutiskt acceptabel för parente- ral administration, speciellt via injektion, pà ett dägg- djur, däribland människa.

En speciellt intressant användning av en sàdan stär- kelse är för tillverkning av parenteralt administrerbara, i huvudsak fullständigt bionedbrytningsbara stärkelsemik- ropartiklar, i vilka en biologiskt aktiv substans kan in- förlivas med högt utbyte och under så milda betingelser, t.ex. i ett tvàfasvattensystem, att dess biologiska akti- vitet bibehålls. Med uttrycket parenteral administration förstås i första hand att sådana mikropartiklar måste ha en lämplig storleksfördelning, renhet och bionedbryt- ningsbarhet samt vara biokompatibla. Med högt utbyte me- nas att stärkelsen måste kunna bilda så högkoncentrerade lösningar att den biologiskt aktiva substans som skall införlivas i de bildade stärkelsemikropartiklarna inte kan diffundera ut i omgivande fas, eller i gränsytan mel- lan faserna, i nämnvärd omfattning och att använd stär- kelselösning solidifierar till mikropartiklar tillräck- ligt snabbt men pà ett kontrollerat sätt. Det har över- raskande visat sig, att förfarandet enligt föreliggande uppfinning möjliggör framställning av sådan stärkelse.

Stärkelse innehåller naturligt en del föroreningar som inte är acceptabla för parenteral administration på människa, framför allt olika partikelformiga material, proteiner och endotoxin. Förfarandet enligt föreliggande 10 15 20 25 30 35 517 422 lO uppfinning gör det möjligt att rena stärkelsen från dessa för parenteralt bruk oacceptabla komponenter. Svårigheten med ett sådant förfarande är att dessa komponenter är många, att deras halter kan variera beroende på naturliga säsongsvariationer och att de har vitt skilda egenskaper, såsom löslighet, fysikalisk form, lokalisering, etc. Att ta fram ett sådant förfarande för framställning av en stärkelse som dessutom är lämplig för tillverkning av mikropartiklar i tvàfas-vattensystem och som är accepta- bel för registreringsmyndigheterna är ännu mera komplext.

Genom en kombination av val av utgångsstärkelse och vissa specifika reningssteg har det emellertid enligt förelig- gande uppfinning överraskande visat sig vara möjligt att framställa en sådan stärkelse.

Förfarandet enligt uppfinningen består kortfattat i att man utgår från stärkelse med högt amylopektininne- håll, tvättar denna för eliminering av ytlokaliserade proteiner, lipider och endotoxiner, reducerar molekylvik- ten för stärkelsen genom skjuvning och eliminerar kvarva- rande, från början icke-ytlokaliserade proteiner genom jonbyteskromatografi.

Närmare bestämt innefattar förfarandet enligt före- liggande uppfinning att man a) utgår från stärkelse i fast form, speciellt partiklar, t.ex. granuler, och med ett amylopektininnehåll över- stigande 85 vikt-%, b) utsätter denna fasta stärkelse för tvättning(ar) under sådana betingelser att på stärkelsen ytlokaliserade proteiner, lipider och endotoxiner löses upp under det att stärkelsen förblir oupplöst, och separerar stär- kelsen från det upplösta materialet, c) bringar den från steg b)erhållna tvättade stärkelsen att lösa sig i vattenbaserat medium, och d) utsätter stärkelselösningen för molekylviktsreducering genom skjuvning så att man erhåller en molekylvikts- O fördelning där minst 80 6 av materialet ligger inom u. 10 15 20 25 30 35 'S17 422 11 intervallet 10-10 000 kDa.

Företrädesvis innefattar förfarandet dessutom att man e) utsätter stärkelselösningen för jonbyteskromatografi för avlägsnande av kvarvarande vattenlösliga proteiner från densamma.

Den stärkelse som används som utgångsmaterial vid förfarandet enligt föreliggande uppfinning skall sålunda till största delen vara baserad på amylopektin, dvs ande- len amylos skall vara liten. Ett speciellt föredraget amylopektininnehåll är härvid minst 95 vikt-%, ännu hell- re minst 98 vikt-%, där procenthalterna hela tiden är ut- tryckta som torrvikt stärkelse. En sådan stärkelse kan erhållas kommersiellt från ett flertal leverantörer eller kan framställas med hjälp av inom detta teknikomràde väl kända processer. En speciellt föredragen stärkelse är en s.k. vaxartad majsstärkelse ("waxy maize-starch"), speci- ellt en nativ eller syrahydrolyserad sådan. Sådan stär- kelse upparbetas kommersiellt i stor skala för ett fler- tal applikationer genom användning av välkända processer.

Exempel på en användbar nativ vaxartad majsstärkelse är Cerestar 04201 och ett exempel på en syrahydrolyserad så- dan är Cerestar C* Gel 06090. Dessa stärkelsesorter är inte lämpliga för parenteral administration som sådana eller för tillverkning av stärkelsemikropartiklar för pa- renteral administration, bl.a. på grund av bristande ren- het och bristande bionedbrytbarhet, men behandlas sålunda i enlighet med föreliggande uppfinning för bearbetning till farmaceutiskt acceptabel stärkelse.

Som utgångsstärkelse vid förfarandet enligt förelig- gande uppfinning utnyttjas företrädesvis stärkelsepartik- lar, eller stärkelsegranuler, med en medeldiameter inom intervallet 5-25 pm, baserat på viktfördelning.

Innan man utsätter stärkelseutgångsmaterialet för tvättningen eller tvättningarna i steg b) avlägsnar man företrädesvis icke-stärkelsematerial från densamma. Detta kan lämpligen ske genom siktning och/eller sedimentation.

Material som är större än stärkelsepartiklarna kan härvid f~,.| 10 15 20 25 30 35 ' 517 422 12 _. . .. .. exempelvis avlägsnas genom våtsiktning, under det att ma- terial som är mindre än stärkelsepartiklarna avlägsnas t.ex. genom sedimentation. Detta kan lämpligen innebära att man avlägsnar icke-stärkelsematerial som är större än 40 pm och företrädesvis även sådant som är mindre än 5 um.

Om man nämligen studerar råstärkelse i ljusmikro- skop, kan man normalt observera mindre mängder av fiber- baserat material, och stärkelseråvaran kan dessutom tän- kas innehålla växtrester, grus och andra partiklar av odefinierad karaktär. Partiklar som sedimenterar långsam- mare än stärkelsegranuler kan exempelvis avlägsnas genom upprepad sedimentation, t.ex. mikroorganismer och rester av dessa. Det är fördelaktigt att på detta sätt erhålla en homogen population av stärkelsepartiklar som utgångs- material för de fortsatta reningsstegen, samtidigt som man eliminerar risken för oavsiktligt införande av diver- se partikelformigt material med en storlek överstigande partikelstorleken för ifrågavarande stärkelse. Den inle- dande behandlingen resulterar också i förbättrad filtrer- barhet i senare steg.

Då utgàngsstärkelsen är ett förhållandevis billigt material, kan man tillåta sig förluster i detta inledande steg, så att man därigenom uppnår hög renhetsgrad och ett tillförlitligt reningsförfarande. Då de inledande stegen för avlägsnande av icke-stärkelsematerial dessutom är tidskrävande och det material som skall renas är ett bra substrat för bakterietillväxt, är det också viktigt att ifrågavarande processer utförs under betingelser som inte tillåter tillväxt av mikroorganismer, samtidigt som dessa betingelser skall vara acceptabla för tillverkning av ett injicerbart material. Det finns inom detta teknikområde ett stort antal välkända lösningar på just detta problem, såsom användning av bakteriostatiska ämnen, temperaturer som inte tillåter tillväxt av mikroorganismer eller andra betingelser som inhiberar tillväxt av mikroorganismer. En lO 15 20 25 30 35 nu. .n '517 422 13 mycket enkel åtgärd är justering av pH-värdet, t.ex. till en nivå på approximativt 11.

Tvättningen i steg b) utföres generellt under alka- liska betingelser, företrädesvis vid ett pH inom inter- vallet ca ll-14 och i ett eller flera steg. Som alkali väljes företrädesvis en alkalimetallhydroxid, helst na- triumhydroxid. Företrädesvis utnyttjas minst ett steg för upplösning av vattenlösliga proteiner, lipider och endo- toxiner och minst ett steg med lösningsmedel för upplös- ning av mera svårlösliga material, speciellt proteiner, dvs sådana som inte är lösliga i enbart vatten. Ett mate- rial av detta slag är proteinet zein. Alla olika varian- ter av zein är i sitt nativa tillstånd olösliga i vatten och utspädda saltlösningar, vilket är en egenskap som de- finierar prolaminer i allmänhet, och då utgångsstärkelsen oftast innehåller zeiner i betydande andel (ungefär hälf- ten av proteininnehàllet i majs), är det väsentligt att de i sådana fall elimineras.

Primärt är det sålunda fråga om att använda ett vat- tenhaltigt lösningsmedel med förmåga att lösa upp zein, varigenom mera svårlösliga proteiner kan avlägsnas. Lös- ningsmedlet skall givetvis dessutom vara acceptabelt för framställning av parenteralt administrerbar stärkelse.

Nämnda lösningsmedel med förmåga att lösa upp zein väljs företrädesvis bland vattenlösningar av en- eller tvåvärda alkoholer och ketoner, företrädesvis alkanoler eller alkylenglykoler innehållande totalt högst 4 kolato- mer respektive dialkyketoner med totalt högst upp till 5 kolatomer.

Lämpliga alkanoler är etanol och isopropanol, speci- ellt etanol, och lämpliga alkylenglykoler är etylenglykol och propylenglykol. En lämplig dialkylketon är aceton.

En lämplig process för de inledande stegen av förfa- randet enligt uppfinningen är följande. Stärkelse suspen- deras i en vattenlösning, företrädesvis vatten för injek- tion, och en typisk användbar koncentration är ca 10 kg stärkelse per 80 kg vatten. Vattenlösningen år justerad vana: 10 15 20 25 30 35 “517 422 14 till lämpligt pH, dvs för upplösning av de ämnen man öns- kar avlägsna samtidigt som man vill undvika upplösning av stärkelse, vilket exempelvis kan vara ca ll. Vidare an- vänds företrädesvis en relativt làgkoncentrerad natrium- hydroxidlösning, sä att nämnda pH erhålles. Det är härvid fördelaktigt också med intensiv omrörning och långsam tillsats. Enligt en speciellt föredragen utföringsform pumpas suspensionen, t.ex. med en peristaltisk pump, till ett vibrerande siktnät med en nominell porstorlek på t.ex. 40 um för ovan omtalad filtrering.

Stärkelsepartiklarna resuspenderas till en homogen suspension, t.ex. med en stor paddel, och tilläts normalt sedimentera under l-24 timmar, företrädesvis 3-14 timmar, helst i rumstemperatur, och supernatanten dekanteras el- ler sugs av försiktigt. Detta bör upprepas ett antal gånger, t.ex. minst tre. Partiklarna kan dessutom också lämpligen tillåtas stà i den sista alkalilösningen under omrörning under längre tid, t.ex. minst ett dygn, så att man därigenom ytterligare säkerställer eliminering av al- kalilösliga proteiner.

Därefter sker själva tvättningen av stärkelsepartik- larna under alkaliska betingelser, som också detoxifierar endotoxin. Under denna process kan olika baser, t.ex. na- triumhydroxid, kaliumhydroxid och tioglykolat, användas, ensamma eller i kombination. Betingelserna väljs gene- rellt sà, att de proteiner som skall avlägsnas, blir lös- liga, under det att stärkelsepartiklarna förblir olösli- ga, varefter tvättlösningen kan avskiljas pà lämpligt sätt, t.ex. genom sedimentering eller filtrering, före- trädesvis under accelererade betingelser. Denna tvättpro- cedur kan sedan upprepas till dess att avsett resultat har uppnåtts. Kontakttiden för stärkelsepartiklarna i den alkaliska lösningen är lämpligen minst 2 timmar, ännu hellre minst 4 timmar. De tvättade granulerna separeras härvid varje gäng fràn tvättvätskan, t.ex. medelst fil- trering eller centrifugering i en korgcentrifug. Alkali- koncentrationen väljs sà att en effektiv koncentration ~ .-. ao 10 15 20 25 30 35 ' 517 422 15 . .. _ .. erhàlles utan att stärkelsepartiklarna löser upp sig. Fö- reträdesvis är det frága om ett pH inom intervallet 11,5- 13. En typisk koncentration är 0,0l25 M vid användning av natriumhydroxid, vilket ger ett pH-värde pà ca 12. Enligt den mest föredragna utföringsformen används en korgcent- rifug och en alkalihydroxidkoncentration pà ca 0,0l25 M.

Företrädesvis utförs den första tvättningen i själva korgcentrifugen, sä att man därigenom exempelvis reduce- rar koncentrationen av ämnen som använts i tidigare steg.

I efterföljande steg resuspenderas därefter partiklarna i tvättvätskan, som sedan införs i korgcentrifugen för se- paration. Ett typiskt förhållande tvättvätskazstärkelse är ca 5:1, t.ex. 50 l tvättvätska per 10 kg stärkelse.

Normalt är tre tvättar tillräckliga.

Om man så önskar, kan man avläsa effektiviteten av tvättningen kvalitativt medelst gelelektrofores, t.ex. under denaturerande betingelser, eller kvantitativt, t.ex. genom aminosyraanalys av stärkelsen.

Om den stärkelse från vilken man utgàr innehåller material av typ proteiner, lipider och endotoxiner, etc, vilket inte löser sig i enbart alkalisk vattenlösning, avlägsnas detta material därigenom att man utsätter stär- kelsen för tvättning med nämnda lösningsmedel med förmåga att lösa zein. Lösningens sammansättning väljs härvid så att ifrågavarande material löses upp utan att stärkelsen för den skull går i lösning. Vanligtvis är det fråga om betingelser där det ingående pH-värdet i vattenfasen lig- ger inom intervallet 12,5-l3,5. En speciellt föredragen sammansättning är en ekvimolär blandning av etanol och vattenbaserad alkalilösning, t.ex. vatten för injektion med tillsats av 0,1 M natriumhydroxid. Den bildade sus- pensionen av stärkelse och använd tvättlösning omröres lämpligen under en tidsperiod av mellan 4 timmar och 12 timmar, t.ex. vid rumstemperatur. Den kan därefter tvät- tas i exempelvis en korgcentrifug utrustad med ett för- delningsmunstycke för att avslutningsvis tvättas med vat- ten för injektion. .nare lO 15 20 25 30 35 “517 422 16 Efter ovannämnda tvättningssteg kan de renade stär- kelsepartiklarna antingen utsättas direkt för de efter- följande stegen av förfarandet enligt uppfinningen eller lagras i form av en mellanprodukt, innan de sista stegen utförs. Lagringen kan exempelvis ske i nedfryst eller torr form. Torkningen kan utföras pà lämpligt sätt, före- trädesvis efter tvättning med etanol. Alternativt kan den renade stärkelsen lagras i amorf, icke-granulär form, till vilken den kan överföras genom upplösning under upp- värmning, antingen nedfryst eller i torr form.

Med de specifikationer och analysmetoder som för närvarande gäller är ovannämnda tvättningar med alkalime- tallhydroxid för stärkelsepartiklarna helt tillfyllest.

Om emellertid kraven höjs i framtiden, t.ex. genom att ännu känsligare analysmetoder utvecklas, kan tvättningen enligt steg b) kompletteras med tvättning med en tiogly- kolatlösning för avlägsnande av extra svàrlösliga protei ner. Tioglykolat har sålunda visat sig vara effektivt dà det gäller att avlägsna svàrlösliga proteiner, t.ex. ke- ratiner, fràn ett stärkelseutgàngsmaterial av ovan angi- vet slag. Tioglykolat är dessutom acceptabelt för paren- teralt bruk och kan tvättas bort fràn partiklarna. För- siktighet måste dock iakttas vid användning av tioglyko- lat, då detta irriterar ögon och hud samt lukar illa, men dessa faktorer är fullt hanterbara.

Innan den upplösta stärkelsen utsättes för skjuvning och eventuellt jonbyteskromatografi avlägsnar man före- trädesvis eventuellt kvarvarande partikelformigt icke- stärkelsematerial genom filtrering av lösningen. Detta kan exempelvis ske genom kombination av ett förfilter med en porstorlek pà ca 20 pm eller mindre följt av ett fil- ter med en porstorlek pà 0,5 um eller 0,45 um, i serie.

För upplösning av stärkelsen utnyttjas företrädesvis vat- ten som är acceptabelt för framställning av stärkelse för parenteralt bruk, helst vatten för injektion. Upplösning- en sker generellt vid förhöjd temperatur, t.ex. en tempe- ratur pä minst 80°C, och en typisk koncentration är 1- lO 15 20 25 30 35 517 422 17 25%, t.ex. ca 10%. Pumpningen genom ifrågavarande filter kan ske på lämpligt sätt. Pumpningen sker allra helst vid ett övertryck, som byggs upp stegvis och som understiger 3 bar, vilket begränsas av filtrets mekaniska hàllfast- het. Exempel på användbart filter är Ultipor GF 2+20pm (Pall) och Fluorodyne II (Pall). En lämplig dimension är 20 tum och patronfilter är att föredra. Filtreringen ut- föres vid förhöjd temperatur för undvikande av utfällning av stärkelse, men temperaturen får samtidigt naturligtvis inte överstiga vad filtermaterialet tål. Vid eventuell igensättning av något filter, kan processen fortsättas efter byte till nytt filter.

Därefter reduceras molekylviktsfördelningen av stär- kelsen genom skjuvning, vilken företrädesvis utföres i en högtryckshomogenisator. Reduceringen av molekylvikten och den molekylviktsfördelning som uppnås är en funktion framför allt av det använda trycket och antalet passager genom homogenisatorn. Vilka nivåer av dessa faktorer som bör användas i varje enskilt fall kan enkelt bestämmas av fackmannen på omrâdet via experiment vid en viss stärkel- sekoncentration. Vid genomförande av skjuvningen kan stärkelsens molekylviktsfördelning bestämmas, på det ned- an beskrivna sättet, efter varje passage genom homogeni- satorn, så att man därigenom säkerställer att önskad mo- lekylviktsfördelning uppnås. Medelst förfarandet enligt uppfinningen är det möjligt att erhålla önskad molekyl- viktsfördelning utan att stor andel lågmolekylärt, icke önskvärt material bildas. Dessutom kan en betydligt snä- vare molekylviktsfördelning erhållas än med hjälp av andra metoder. Då skjuvningsprocessen kan leda till frag- mentering och eventuellt delvis upplösning av icke önsk- värt partikelformigt material, är det föredraget att av- lägsna sådant icke önskvärt partikelformigt material, t.ex. bakterierester, före skjuvningen, såsom omtalats ovan.

En lämplig homogenisator för användning vid förfa- randet enligt uppfinningen är Rannie modell l2.56H (APV ø-.suo lO 15 20 25 30 35 ^ 517 422 18 . ._ ._ Danmark). Vilken homogenisator som ska användas baseras både på dess förmåga att reducera molekylviktsfördelning- en för stärkelsen och dess lämplighet, t.ex. ur rengö- ringssynpunkt, då det gäller att verka i en process för tillverkning av ett parenteralt administrerbart material.

Den vid skjuvningen erhållna molekylviktsfördelning- en är företrädesvis sådan att minst 80% av materialet ligger inom intervallet 100-4000 kDa, ännu hellre 200- 1000 kDa och allra helst 300-600 kDa.

Molekylviktsfördelningen kan bestämmas med hjälp av ett flertal olika, i och för sig kända metoder. Den mest föredragna är baserad på gelfiltrering med detektering på basis av brytningsindex och detektering medelst flervin- kel-laserljus (s.k. Multiple Angle Laser Light Scatte- ring, MALLS). En lämplig utrustning är DAWN-F Multi Angle Laser Light Scattering detektor, och ett lämpligt program för uppsamling av data och bestämning av medelmolekylvikt och polydispersitet är ASTRA 2.1la, och ett lämpligt da- torprogram för utvärdering av molekylviktsintervallet är EASI 6.00 (samtliga från Wyatt Technology Corporation).

Skjuvningen utföres företrädesvis vid ett tryck överstigande 1200 bar, t.ex. inom intervallet 1200-1500 bar, men bör bestämmas specifikt för varje typ av homoge- nisator då apparatens speciella utformning också har be- tydelse. För ovan angiven apparat utnyttjas lämpligen det maximala trycket för densamma, vilket är lika med 1500 bar, och i realiteten är det generellt den använda appa- ratens maximala tryck som sätter den övre gränsen. Det är möjligt att erhålla samma molekylviktsfördelning vare sig homogeniseringen utförs i form av diskreta passager eller med recirkulering. En typisk stärkelsekoncentration vid homogeniseringen är ca 10%, och ett lämpligt medium är, såsom har omtalats ovan, vatten för injektion.

För framställning av en stärkelse med ännu större säkerhetsmarginal vid parenteral administration avlägsnar man dessutom från den upplösta stärkelsen i lösning vat- tenlösliga proteiner genom jonbyteskromatografi. Enligt nu anno »av nu 10 l5 20 25 30 35 u. ou '517 422 19 _ .. . .. ._ .. den mest föredragna utföringsformen används anjonbytes- kromatografi för eliminering av negativt laddade vatten- lösliga proteiner. Till skillnad från de proteiner och andra kontaminanter som avlägsnades i steg b) och som primärt utgjordes av på ytan av stàrkelsepartiklarna fö- rekommande material är det vid jonbyteskromatografin frá- ga om att primärt avlägsna proteiner som ursprungligen var lokaliserade inuti stàrkelsepartiklarna och därmed till största delen oàtkomliga vid den inledande reningen.

Den mängd jonbytesmaterial som behövs för denna rening kan vid behov enkelt titreras ut experimentellt. Gene- rellt gäller dock att det har visat sig att man företrä- desvis bör utnyttja större mängd jonbytesmaterial än vad som konventionellt har varit brukligt. Vid användning av mera jonbytesmaterial än vad som tidigare har varit bruk- ligt kan eluering av de olika komponenterna fràn jonby- tesmaterialet resultera i högre koncentration av dessa komponenter i stärkelsen än i normalfallet. Man bör där- för i sàdant fall välja ett jonbytesmaterial som endast leder till eluering av komponenter vilka är acceptabla för parenteral användning. Ett exempel pà ett lämpligt jonbytesmaterial är Q-Sepharose (Pharmacia Amersham).

Förfarandet kan genomföras såväl under utnyttjande av en kolonn som via ett satsvis förfarande. I det sistnämnda fallet suspenderas jonbytesmaterialet i stärkelselösning- en, som sedan avskiljs pà lämpligt sätt, t.ex. genom fil- trering.

Lämpliga betingelser för jonbyteskromatografin finns normalt i de instruktioner som ges ut av tillverkaren och i den vetenskapliga litteraturen. Det är generellt möj- ligt att erhålla samma resultat under användning av rim- liga skillnader i processparametrar för denna teknik, och dessa betingelser kommer därför enbart att exemplifieras i form av typiska, icke begränsande exempel. Lämpliga be- tingelser vid användning av Q-Sepharose är t.ex. en 10 mM natriumkarbonatbuffert, pH 9,8, vid ca 45°C. Vid behov kan en starkare buffert användas, men i ett sådant fall 10 l5 20 25 30 35 bör ett avsaltningssteg införas efter kromatografin.

Mängden jonbytesmaterial bör vara minst 0,4 ml, företrä- desvis minst 0,8 ml, sedimenterad bäddvolym jonbytesmate- rial per g stärkelse, t.ex. av storleksordningen 0,4-l l, räknat som uppsvälld volym i ifrågavarande buffert, vid rumstemperatur, per kg torrvikt stärkelse. Jonbytesmate- rialet bör tvättas eller regenereras pà i och för sig konventionellt sätt. Ett lämpligt förfarande är dock be- handling med l M natriumhydroxid i exempelvis 1 timme vid rumstemperatur och därefter sköljning med tvà bäddvolymer vatten för injektion och sköljning med totalt tvâ bäddvo- lymer av 2 M natriumklorid, t.ex. fördelat pà fyra till- satser. Denna procedur kan därefter upprepas en gäng.

Sköljning utföres därefter med vatten för injektion till dess att konduktiviteten understiger 2 mS/cm och ekvilib- rering utföres därefter tvà gånger med en bäddvolym av 100 mM natriumkarbonatbuffert, pH 9,8, och därefter med 10 mM natriumkarbonatbuffert, pH 9,8, till dess att sàväl pH som konduktivitet har stabiliserats. Jonbytet kan ex- empelvis utföras genom ett satsvis förfarande, som varar minst 4 och högst 48 timmar vid 45°C. Av praktiska skäl väljer man ofta att utföra jonbytet över en natt. Jonby- tet utföres lämpligen vid svag omrörning, så att jonby- tesmaterialets integritet bevaras. Jonbytesmassan separe- ras därefter från stärkelselösningen pä lämpligt sätt, t.ex. därigenom att suspensionen införs i en kromatogra- fikolonn med lämpligt utflödesfilter. Stärkelselösningens pH neutraliseras därefter. I det fall dä flyktiga eller instabila buffertämnen utnyttjas, bör pH-värdet sänkas några pH-enheter under neutralitet, sä att man därigenom undviker att alltför alkaliska betingelser uppkommer un- der exempelvis en efterföljande spraytorkning, där buf- fertsubstansen kan sönderdelas eller övergå i gasfas.

Efter jonbyteskromatografin i steg e) utföres före- trädesvis filtrering för avlägsnande av eventuell parti- kelformig kontamination genererad under ifrågavarande an- jonbyteskromatografi. Ett stort antal lämpliga filter 10 15 20 25 30 35 “ 517 422 21 finns härvid kommersiellt tillgängliga. En lämplig konfi- guration är ett 5 pm förfilter och ett 0,5 um slutfilter.

Lämpliga dimensioner är 20 tum för förfilter och 10 tum för slutfilter. Lämpliga filter är exempelvis Profile Star (Pall) och Star Clear (Pall), som är positivt ladd- at.

Den renade stärkelsen utsättes slutligen lämpligen för ett avslutande torkningssteg, innan den lagras. En speciellt föredragen torkning i detta avseende är spray- torkning, men även andra i och för sig kända metoder är lämpliga, t.ex. frystorkning eller vacuumtorkning. Vid spraytorkning bör betingelserna väljas så att materialet blir tillräckligt torrt utan att oönskade bireaktioner på grund av för hög temperatur och/eller alltför alkaliskt pH-värde uppkommer. Typiska temperaturer för användning i dessa sammanhang är ca 200°C som inloppstemperatur och ca l20°C som utloppstemperatur. Utloppstemperaturen kan sty- ras pà ett enkelt sätt medelst pumpningshastigheten för stärkelselösningen.

Stärkelsen är hållbar under lång tid, om den lagras torrt och mörkt vid en temperatur som inte överstiger normal rumstemperatur. Innan stärkelsen används för till- verkning av mikrosfärer avsedda för parenteralt bruk, lö- ses den upp, t.ex. i vatten för injektion, och sterilise- ras. Den föredragna metoden för sterilisering är autokla- vering. Andra steriliseringsmetoder, såsom sterilfiltre- ring, är också möjliga.

Renheten av stärkelsen kan bestämmas med hjälp av i och för sig välkända metoder. För att man skall få en kvalitativ överblick använder man sig företrädesvis av gelelektrofores under denaturerande betingelser med ef- terföljande färgningar. För erhållande av mera kvantita- tiva data kan innehållet av kväve bestämmas, t.ex. genom aminosyraanalys, elementaranalys eller medelst kvävese- lektiva detektorer. Aminosyraanalys är föredragen, efter- som denna ger kvantitativa data relaterade till protein- innehållet i stärkelsen och detta är den viktigaste fak- a|»z| 10 15 20 25 30 35 ' 517 422 12*- 22 torn för stärkelsens användbarhet. Förfarandet kan redu- cera innehållet av aminosyrakväve till 50 ppm, lämpligen under 20 ppm, företrädesvis till under 10 ppm, ännu hell- re till under 5 ppm, eller t o m under 2 ppm, vilket ger en god säkerhetsfaktor, speciellt vid upprepad parenteral administration, och vilket är i paritet med eller lägre än innehållet av aminosyrakväve i hydroxietylstärkelse, som används parenteralt som plasmaexpander och som i dag- lig dos kan överstiga den maximalt avsedda för stärkelse- partiklar med minst 100 gånger, baserat på kg kroppsvikt.

Efter framställning av antikroppar mot de ingående prote- inkomponenterna, vilket i och för sig finns tidigare be- skrivet i den vetenskapliga litteraturen, är det möjligt att utnyttja känsliga immunologiska metoder för kvantifi- ering av dessa komponenter.

Enligt en andra aspekt av föreliggande uppfinning tillhandahåller denna även en ny farmaceutiskt acceptabel stärkelse som sådan. Utmärkande för denna är att den a) har ett innehåll av amylopektin överstigande 85 vikt- %, där molekylvikten för nämnda amylopektin är reduce- rad, företrädesvis genom skjuvning, så att minst 80 vikt-% av materialet ligger inom intervallet 10-10 000 kDa, b) har en renhet av högst 50 pg aminosyrakväve per gram torrvikt stärkelse, företrädesvis högst 20 pg, ännu hellre högst 10 pg och helst högst 5 pg, aminosyrakvä- ve per gram torrvikt stärkelse, c) kan lösas i en koncentration överstigande 25 vikt-% i vatten.

Med uttrycket "kan lösas i vatten" menas upplösning på för stärkelse konventionellt sätt, vilket generellt innefattar uppvärmning, t.ex. till minst 80°C, samt också upplösning i buffrad vattenlösning.

Enligt en annan aspekt av föreliggande uppfinning tillhandahåller denna en farmaceutiskt acceptabel stär- kelse, vilken ~o nu un. 10 15 20 25 30 35 a) har ett innehåll av amylopektin överstigande 85 vikt-%, där molekylvikten för nämnda amylopektin är reducerad, företrädesvis genom skjuvning, så att minst 80 vikt-% av materialet ligger inom in- tervallet 10-10 000 kDa, b)har en renhet av högst 50 pg aminosyrakväve per gram torrvikt stärkelse, företrädesvis högst 20 pg, ännu hellre högst 10 pg och helst högst 5 pg, aminosyrakväve per gram torrvikt stärkelse, c) saknar kovalent bundna extra kemiska grupper av det slag som förekommer i hydroxietylstärkelse.

Med "saknar kovalent bundna extra kemiska grupper av det slag som förekommer i hydroxietylstärkelse" menas ge- nerellt att stärkelsen enbart innehåller sådana grupper som finns i naturlig stärkelse och inte har modifierats såsom i exempelvis hydroxietylstärkelse.

Företrädesvis uppvisar stärkelsen enligt någon av ovanstående aspekter dessutom förmåga att gela naturligt in vitro.

Enligt en annan utföringsform uppvisar ovannämnda stärkelse förmåga att bilda mikropartiklar i ett emul- sionssystem, speciellt ett tvåfas-vattensystem.

En annan utföringsform hänför sig till stärkelse med ett endotoxininnehåll understigande 25 EU/g och ytterli- gare en utföringsform avser stärkelse innehållande mindre än 100 mikroorganismer per g, ännu hellre mindre än 10 mikroorganismer per g.

För andra speciellt föredragna utföringsformer av denna stärkelse hänvisas till de utföringsformer som har beskrivits ovan i samband med förfarande enligt uppfin- ningen, varför dessa inte behöver upprepas här.

Den nya stärkelsens främsta användningsområde är för framställning av i huvudsak fullständigt bionedbrytbara mikropartiklar. Den kan emellertid naturligtvis också an- vändas i andra sammanhang där farmaceutiskt acceptabel stärkelse kan komma ifråga, t.ex. för framställning av HES (hydroxietylstärkelse). vvyu» u. u 10 15 20 25 30 35 Enligt en tredje aspekt av föreliggande uppfinning tillhandahåller denna emellertid också mikropartiklar ba- serade på stärkelse som bärare för en biologiskt aktiv substans, speciellt för parenteral administration, före- trädesvis via injektion, på ett däggdjur, däribland män- niska, där nämnda stärkelse är den stärkelse som har de- finierats ovan.

För sådana mikropartiklar gäller företrädesvis att de har en medelpartikeldiameter inom intervallet 10-200 pm, företrädesvis 20-100 pm, speciellt 20-80 pm. Mikro- partiklar används sålunda som generell benämning för par- tiklar av viss storlek i enlighet med i och för sig känd teknik. En typ av mikropartiklar är sålunda mikrosfärer, vilka har i huvudsak sfärisk form, medan begreppet mikro- partikel kan innefatta avvikelse från sådan ideal sfärisk form. Även det kända begreppet mikrokapsel faller inom uttrycket mikropartikel i enlighet med känd teknik.

En föredragen utföringsform av sådana mikropartiklar representeras av sådana som uppvisar förmåga att lösas upp enzymatiskt in vitro eller att elimineras från biolo- gisk vävnad in vivo.

Av ovanstående framgår att en speciellt intressant biologiskt aktiv substans är ett protein, men uppfinning- en är naturligtvis tillämpbar på i princip vilken som helst aktiv substans som kan användas för parenteral ad- ministration, t.ex. (poly)peptider, (poly)nukleotider, plasmider och DNA. Uppfinningen är dock speciellt intres- sant i sådana fall där känslighets- eller instabilitets- problem föreligger.

Exempel på biologiskt aktiva substanser av ovan an- givet slag är tillväxthormon, erytropoietin, interferon (a,ß,y-typ), vaccin, epidermalt tillväxthormon, Faktor VIII, LHRH-analog, insulin, makrofagkolonistimulerande faktor, granulocytkolonistimulerande faktor och interleu- kin.

Användbara biologiskt aktiva substanser av typ icke- proteinläkemedel kan väljas ur följande grupper: 10 15 20 25 30 35 ' 517 422 25 antitumörmedel, antibiotika, antiinflammatoriska me- del, antihistaminer, sedativa medel, muskelavslappnande medel, antiepileptiska medel, antidepressionsmedel, anti- allergiska medel, bronkodilatatorer, kardiotoniska medel, antiarytmimedel, vasodilatatorer, antidiabetiska medel, antikoagulerande medel, hemostatiska medel, narkotiska medel och steroider.

Vad beträffar uppbyggnaden av mikrosfärer, mikro- kapslar eller mikropartiklar generellt samt de olika framställningsmetoder som existerar för dessa hänvisas till den kända litteraturen. Stärkelsen enligt uppfin- ningen har emellertid visat sig vara speciellt lämplig för framställning av mikropartiklar av det slag som be- skrivs i den samtidigt med föreliggande patentansökan in- lämnade svenska patentansökningen med titeln Mikropartik- lar. För detaljer i detta avseende hänvisas sålunda till nämnda patentansökan.

Uppfinningen kommer nu att belysas ytterligare genom följande, icke begränsande exempel. För dessa liksom för texten i övrigt gäller att angivna procenthalter avser vikt-%, om inget annat anges.

EXEMPEL Exempel 1 Framställning av ren höggrenad stärkelse med låg mo- lekylvikt.

Stärkelse (waxy maize. National starch) i granulär form suspenderades i vatten, framställt med omvänd osmos, i en koncentration av 5 kg per 50 liter vatten. Natrium- hydroxid tillsattes tills pH blev ll. Suspensionen rördes om under en halvtimme och vätskan separerades från granu- lerna genom centrifugering i en korgcentrifug. Detta upp- repades två gånger. Granulerna tvättades med vatten och förvarades i 5 liter etanol över helgen. Därefter tvätta- des granulerna två gånger med 10 liter 70 % etanol och sedan med vatten. Materialet suspenderades sedan i 60°C vatten och hälldes sedan ned i 40 liter vatten och löstes nnnru lO 15 20 25 30 35 '517 422 26 : ::-s nun: .uns upp, delvis med hjälp av en jetstràlemixer under omrör- ning, varvid lösningen bildade skum, som lade sig pà ytan. Därefter reducerades molekylviktsfördelningen genom skjuvning (Microfluidizer 110 T, Microfluids Corp.) vid 1500 bar, totalt med 15 passager. Stärkelselösningen värmdes upp till 70°C och filtrerades genom ett förfilter (Pall profile II 20pm, 10 tum i diameter och Pall Starc- lear 0,5pm, positivt laddat, 10 tum i diameter), samt spraytorkades (200°C ingàngstemperatur, cirka 122-127°C uttemperatur). Totalt erhölls cirka 3 kg stärkelse med en medelmolvikt på 1 930 kDa.

Stärkelseràvaran innehöll cirka 0,052 % kväve, be- stämt medelst elementaranalys, och den erhållna stärkel- sen innehöll cirka 0,022% kväve. Både stärkelseràvaran och den upprenade stärkelsen innehöll <10 mikroorganis- mer/gram. Dock àterfanns 30 mikroorganismer/gram i ett intermediärt steg, vilket visar behovet av betingelser som hindrar mikroorganismer fràn att föröka sig under hela processen. Värdet pà aminosyrakväve var 56,53 pg/g stärkelse (torrvikt) och stärkelsen passerade testet för pyrogener enligt Ph. Eur. 2” Ed efter parenteral admi- nistration i kanin. Efter upprepad administration av stärkelsen parenteralt i marsvin intraperitonealt för att möjliggöra induktion av ett immunsvar, följt av intrave- nös administration av stärkelsen för att detektera even- tuella anafylaktiska reaktioner, befanns stärkelsen sakna förmåga att inducera en anafylaktisk reaktion. Den er- hållna stärkelsen uppfyller sålunda kraven för en råvara för framställning av en parenteral beredning.

Exempel 2 Framställninq av parenteralt användbar stärkelse.

En stärkelsesuspension (waxy maize starch, Cerestar C* gel 06090) med en koncentration av 10 kg i 75 liter vatten för injektion bereddes under omrörning. Efter att en homogen suspension hade bildats tillsattes 0,25 M na- triumhydroxidlösning tills ett pH pà 11,0 i 0,2 erhölls w-;>~ 10 15 20 25 30 35 ' 517 422 27 och därefter fylldes på med ytterligare vatten för injek- tion till en total volym pà 80 liter. Suspensionen pumpa- des genom en vàtsikt med ett flöde på cirka 520 ml/min.

Stärkelsesuspensionen lämnades att sedimentera i Müller- fat över natten och nästa dag dekanterades ovanlösningen med hjälp av en hävert tills 18 liter av suspensionen återstod. Därefter fylldes på med 72 liter vatten för in- jektion och pH konstaterades fortfarande vara minst 10,5 varför ingen ytterligare natriumhydroxidlösning behövdes tillsättas. Suspensionen tilläts stå i 12 timmar varefter ovanvätskan dekanterades. Detta upprepades ytterligare en gång med sedimentation över natten. Därefter tvättades stärkelsegranulerna med en 0,0l25 M natriumhydroxidlös- ning i vatten för injektion, först genom sköljning av filterkakan i korgcentrifugen med 45 liter av lösningen och därefter genom uppsuspendering i lösningen och elimi- nation av lösningen genom centrifugering i korgcentrifu- gen. Det sistnämnda steget upprepades ytterligare en gång. Stärkelsegranulerna lakades därefter i fyra timmar med en ekvimolär lösning av 0,1 M natriumhydroxid och etanol, varefter lösningen separerades ifrån med hjälp av korgcentrifugering. Denna lakning upprepades en gång, varefter stärkelsegranulerna tvättades två gånger med 40 liter vatten för injektion. Stärkelsesuspensionens pH ställdes till 6,4 i 1 med 1 M saltsyra och tvättades med 50 liter vatten för injektion i korgcentrifugen. Stärkel- sen överfördes till en frys för lagring. Erhållen mängd bestämdes till 7,32 kg torr stärkelse.

Av de erhållna stärkelsegranulerna togs 3,7 kg och uppsuspenderades i 1,76 kg vatten för injektion och över- fördes sedan till 27,62 kg vatten för injektion, som för- värmts till 100°C. Efter omrörning bedömdes stärkelsen visuellt vara upplöst. Stärkelsen filtrerades genom ett 20 tums förfilter med porstorlekarna 20 och 2 pm och ett 0,45 pm filter tills flödet ansågs vara för lågt. Då återstod <5% av stärkelselösningen. Stärkelsen molvikts- fördelningen justerades genom skjuvning vid ett inställt v avec n n ylm. lO 15 20 25 30 35 ' '517 422 28 tryck på l 500 bar enligt tillverkarens instruktioner.

Flödet vid detta tryck var 2,25 liter/minut. Målsättning- en var att låta lösningen passera homogenisatorn till- räckligt många gånger för att medelmolekylvikten ska bli 350 kDa - 500 kDa. Totalt genomfördes 9 passager. Däref- ter justerades pH i stärkelselösningen genom tillsats av natriumvätekarbonat till en slutlig koncentration av 10 mM och justering av pH till 9,8 med 0,5. Därefter elimi- nerades kvarvarande proteiner genom jonbyteskromatografi på en Q-Sepharose FF (Pharmacia) med utnyttjande av en total bäddvolym på 3,7 liter. Jonbytesmaterialet hade dessförinnan tillåtits svälla och tvättas med en bäddvo- lym 1 M natriumhydroxid, därefter med två bäddvolymer vatten för injektion, och därefter under flöde med 3 gånger halva bäddvolymen med 2 M natriumkloridlösning.

Hela denna sekvens upprepades ännu en gång, varefter jon- bytesmassan sköljdes med vatten för injektion tills kon- duktiviteten låg under 2mS/cm. Ekvilibrering med två båddvolymer 100 mM natriumkarbonat, pH 9,8, och därefter med 10 mM natriumvätekarbonat utfördes tills både pH och konduktivitet hade stabiliserats. Jonbytesmaterialet och stärkelsen blandades och hölls vid 45°C under långsam om- rörning med en toppmonterad ankaromrörare i cirka 15 tim- mar och jonbytesmassan separerades därefter genom uppsam- ling i en kromatografikolonn, varvid bäddvolymen hölls vid ungefär 1,5 gånger sedimenterbar bäddvolym för upp- rätthållande av trycket under 3 bar. Efter justering av pH till 6,4 filtrerades den jonbytta stärkelsen genom ett förfilter (PALL filterpatron Profile star 5pm, 20 tums diameter) och ett slutfilter (PALL filterpatron Starclear 0,5pm, 10 tums diameter) efter att dessa förvärmts genom pumpning av varmt vatten för injektion dessförinnan.

Slutligen spraytorkades stärkelselösningen med en ingàngstemperatur på 200°C och en utgångstemperatur på 120-l25°C.

Innehållet av protein i stärkelsen bestämdes med aminosyraanalys. Stärkelseråvaran innehöll cirka 137 ppm 10 15 ' 517 422 29 aminosyrakväve, efter vàtsiktningen innehöll den cirka 124 ppm, efter sedimenteringen 61 ppm aminosyrakväve, ef- ter behandling i pH 10,5 64 ppm aminosyrakväve, efter tredje tvätten med 0,0l25 M natriumhydroxidlösning 54 ppm aminosyrakväve, efter tvätt med lut/etanoltvätt 52 ppm aminosyrakväve och efter tvätt med vatten för injektion 50 ppm aminosyrakväve. Efter jonbyteskromatografin er- hölls vid uttag av trippelprov följande värden för amino- syrakväve: 1,8, 3,0 och 0,4 pg/g torrvikt stärkelse.

Medelmolekylvikten bestämdes med gelfiltrering kom- binerat med brytningsindex och MALLS detektion och be- fanns efter 3 passager vara 584 kDa, efter 6 passager 508 kDa och efter 9 passager 434 kDa. Endotoxininnehàllet be- stämdes till <25 EU/g med en Limbulus amebocyte lysate- turbidimetrisk metod Validerad för stärkelse (Associates of Cape Cod Int Inc).

Claims (35)

rm»- 10 15 20 25 30 35 i ' 517 422 30 PATENTKRAV

1. l. Förfarande för framställning av en stärkelse som är farmaceutiskt acceptabel, speciellt för parenteral ad- ministration, t ex via injektion, på ett däggdjur, i syn- nerhet människa, vilket innefattar att man j a) utgår från stärkelse i fast form, speciellt partiklar, t.ex. granuler, och med ett amylopektininnehåll över- stigande 85 vikt-%, uttryckt som torrvikt stärkelse, b) utsätter denna fasta stärkelse för tvättning(ar) under sådana betingelser att på stärkelsen ytlokaliserade proteiner, lipider och endotoxiner löses upp under det att stärkelsen förblir oupplöst, och separerar stär- kelsen från det upplösta materialet, C) bringar den från steg b)erhàllna tvättade stärkelsen att lösa sig i vattenbaserat medium, och d) utsätter stärkelselösningen för molekylviktsreducering genom skjuvning så att man erhåller en molekylvikts- fördelning där minst 80 vikt-% av materialet ligger inom intervallet 10-10 000 kDa.

2. Förfarande enligt krav l, vilket innefattar att man utsätter stärkelselösningen för jonbyteskromatografi, företrädesvis anjonbyteskromatografi, för avlägsnande av kvarvarande vattenlösliga proteiner från densamma.

3. Förfarande enligt krav 1 eller 2, vari man i steg a) utgår från stärkelse med ett amylopektininnehåll över- stigande 95 vikt-%, företrädesvis överstigande 98 vikt-%, uttryckt som torrvikt stärkelse.

4. Förfarande enligt krav 3, vari nämnda stärkelse är vaxartad majsstärkelse, företrädesvis nativ eller sy- rahydrolyserad sådan.

5. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari man i steg a) utgår från stärkelsepartiklar med en medeldiameter inom intervallet 5-25um, baserat på vikt- fördelning. =~>av 10 15 20 25 30 35 ' à517 422 31 nun en

6. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari tvättningen i steg b) utföres under alkaliska be- tingelser, företrädesvis med natriumhydroxid som alkali, och i ett eller flera steg.

7. Förfarande enligt krav 6, vari tvättningen eller tvättningarna i steg b) utföres vid ett pH inom interval- let ll-14, företrädesvis i två steg med ett första steg med vattenbaserad alkalilösning vid pH 11,5-13 och ett andra steg som utföres under betingelser där det ingående pH-värdet i vattenfasen ligger inom intervallet 12,5- 13,5.

8. Förfarande enligt krav 6 eller 7, vari tvättning- en innefattar ett steg med vattenbaserad alkalilösning för upplösning av vattenlösliga proteiner, lipider och endotoxiner och ett steg med ett vattenhaltigt lösnings- medel med förmåga att lösa upp zein för upplösning av mera svårlösliga proteiner.

9. Förfarande enligt krav 8, vari lösningsmedlet med förmåga att lösa upp zein väljs bland vattenhaltiga lös- ningar av en- eller tvàvärda alkoholer och ketoner, före- trädesvis alkanoler eller alkylenglykoler innehållande totalt högst 4 kolatomer respektive dialkylketoner med totalt högst upp till 5 kolatomer.

10. Förfarande enligt krav 9, vari lösningsmedlet väljs bland vattenhaltiga lösningar av etanol, isopropa- nol, etylenglykol, propylenglykol och aceton.

11. ll. Förfarande enligt krav 10, vari lösningsmedlet är en vattenhaltig etanollösning.

12. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari man i steg c) utför upplösningen så att en stärkel- O o\ selösning med en koncentration inom intervallet 1-25 erhålles.

13. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari man i steg c) utför upplösningen i vatten accepta- belt för framställning av stärkelse för parenteralt bruk, företrädesvis vatten för injektion. av ..._ _ _ _ _ .vn nova n v 1 un; o»» »av .- ~ ..u -. 10 15 20 25 30 35 " ' ' 517 422 32

14. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari man i steg d) utför skjuvningen så att man erhåller en molekylviktsfördelning där minst 80 % av materialet ligger inom intervallet 100-4 000 kDa, företrädesvis 200- 1 00OkDa, speciellt 300-600 kDa.

15. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari man utför skjuvningen i steg d) i en högtryckshomo- genisator.

16. Förfarande enligt krav 15, vari skjuvningen ut- föres vid ett tryck överstigande 1 200 bar, företrädesvis inom intervallet 1 200-1 500 bar.

17. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari man före tvättningarna i steg b) avlägsnar icke- stärkelsematerial från utgångsstärkelsen, företrädesvis genom siktning och/eller sedimentation.

18. Förfarande enligt krav 17, vari man avlägsnar material som är större än stärkelsepartiklarna genom våt- siktning och material som är mindre än stärkelsepartik- larna genom sedimentation.

19. Förfarande enligt något av kraven 17 och 18, vari man avlägsnar icke-stärkelsematerial som är större än 40um och företrädesvis också avlägsnar icke- stärkelsematerial som är mindre än Sum.

20. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari man före skjuvningen i steg d) avlägsnar eventuellt kvarvarande partikelformigt icke-stärkelsematerial genom filtrering av lösningen, företrädesvis genom ett 20um filter och eventuellt därefter genom ett O,5um filter.

21. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari man utsätter den från skjuvningen i steg d) erhållna lösningen för filtrering för avlägsnande av eventuell partikulär kontamination genererad under skjuvningen, varvid filtreringen företrädesvis utföres med ett Sum filter.

22. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari man efter anjonbyteskromatografin i steg e) utför filtrering, företrädesvis genom ett Spm förfilter och ett 1-»1- 10 15 20 25 30 35 ' i '517 422 33 0,5pm filter, för avlägsnande av eventuell partikulär kontamination genererad under nämnda anjonbyteskromato- grafi.

23. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari man i steg e) använder minst 0,4, företrädesvis minst 0,8, ml sedimenterad bäddvolym jonbytesmaterial per gram stärkelse.

24. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari man utsätter den renade stärkelsen för ett avslutan- de torkningssteg, företrädesvis medelst spraytorkning.

25. Förfarande enligt något av de föregående kraven, vari tvättningen i steg b) innefattar tvättning med en tioglykolatlösning för avlägsnande av svårlösliga protei- ner.

26. Farmaceutiskt acceptabel stärkelse, speciellt för parenteral administration, företrädesvis via injek- tion, på ett däggdjur, speciellt människa, vilken a)har ett innehåll av amylopektin överstigande 85 vikt-%, där molekylvikten för nämnda amylopektin är reducerad, företrädesvis genom skjuvning, så att minst 80 vikt-% av materialet ligger inom intervallet 10-10 000 kDa, b)har en renhet av högst 50pg aminosyrakväve per gram torrvikt stärkelse, företrädesvis högst 20 pg, ännu' hellre högst 10 pg och helst högst 5 pg aminosyrakväve per gram torrvikt stärkelse, c)kan lösas i en koncentration överstigande 25 vikt-% i vatten.

27. Farmaceutiskt acceptabel stärkelse, speciellt för parenteral administration, företrädesvis via injek- tion, på ett däggdjur, speciellt människa, vilken a) har ett innehåll av amylopektin överstigande 85 vikt- %, där molekylvikten för nämnda amylopektin är reduce- rad, företrädesvis genom skjuvning, så att minst 80 vikt-% av materialet ligger inom intervallet 10-10 000 kDa, b) har en renhet av högst 20pg aminosyrakväve per gram torrvikt stärkelse, företrädesvis högst 10 pg aminosy- 10 15 20 25 ' f* ' 517 422 rakväve och helst högst 5 pg aminosyrakväve per gram torrvikt stärkelse, c) saknar kovalent bundna extra kemiska grupper av det slag som förekommer i hydroxietylstärkelse.

28. Stärkelse enligt något av kraven 26 och 27, vil- ken uppvisar förmåga att gela in vitro.

29. Stärkelse enligt något av kraven 26-28, vilken uppvisar förmåga att bilda mikropartiklar i ett emul- sionssystem, speciellt ett tvåfas-vattensystem.

30. Stärkelse enligt något av kraven 26-29, vilken har ett endotoxininnehåll understigande 25 EU/g och inne- håller mindre än 100 mikroorganismer per gram.

31. Stärkelse enligt något av kraven 26-30, vilken är framställningsbar medelst ett förfarande enligt något av kraven 1-25.

32. Mikropartiklar baserade pà stärkelse som bärare för en biologiskt aktiv substans, speciellt för parente- ral administration, företrädesvis via injektion, på ett däggdjur, speciellt människa, i vilka nämnda stärkelse är den stärkelse som definieras i något av kraven 26-31.

33. Mikropartiklar enligt krav 32, vilka har en me- delpartikeldiameter inom intervallet 10-200um, företrä- desvis 20-lO0pm, speciellt 20-80pm.

34. Mikropartiklar enligt något av kraven 32 och 33, vilka uppvisar förmåga att lösas upp enzymatiskt in vitro eller elimineras från biologisk vävnad in vivo.

35. Mikropartiklar enligt något av kraven 31-34, vari den biologiskt aktiva substansen är ett protein.