KR101331136B1 - 약물의 초기 과다 방출 제어를 위한 약물전달 제형 및 이의 제조방법 - Google Patents

약물의 초기 과다 방출 제어를 위한 약물전달 제형 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 약물의 초기 방출 제어를 위한 약물전달 시스템에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 생분해성 고분자와 약물을 함유하는 과립; 및 온도감응 하이드로젤을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물전달 제형 및 이의 제조방법을 제공하며, 본 발명에 따른 약물전달 제형은 비교적 간단한 단일 공정법에 의하여 제조할 수 있으며, 초반의 약물의 과도한 방출이 없이 일정한 속도로 서서히 방출되어 혈중 약물 농도를 장시간 일정하게 유지시켜 주므로 종래의 주사형 약물전달 제형 및 서방형 과립이 지닌 과도한 초기 방출을 방지하며, 시간 경과에 따른 방출량의 지속성 등 원하는 방출 거동을 쉽게 얻을 수 있다.

Description

약물의 초기 과다 방출 제어를 위한 약물전달 제형 및 이의 제조방법 {Drug delivery formulation for release controlled initial burst and manufacturing method thereof}
본 발명은 약물의 초기 방출 제어를 위한 약물전달 시스템에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 생분해성 고분자와 약물을 함유하는 과립 및 온도감응 하이드로젤을 포함하는 약물전달 제형 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
최근, 의료용 소재에 대한 관심이 높아지면서 기능성 물질을 이용한 장기간의 약물 수송을 위한 약물 전달체 개발에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는 추세이다. 현재 가장 활발히 진행중인 의료용 소재라 할 수 있는 과립은 다양한 분야에 응용되고 있으며, 새로운 제조 방법 및 물질 개발 등의 연구가 진행되어 지고 있다.
일반적인 약물전달 시스템은 약물이 혈액 중에 최소 유효농도를 유지하고 독성에 의한 부작용을 최소화할 수 있는 시도가 계속되고 있으나 대부분의 경우에서 일정한 혈중 농도는 약리작용에 있어 내성을 유도하여 특별한 수용 부위에 이전보다 약리효과를 더 잘 나타낼 수 있는 고농도의 약물이 계속 요구되었다. 이러한 관점에서 0 차 방출과 같은 일정한 약물 방출이 항상 모든 경우에 효율적인 것은 아니며 외부제어나 자가 제어 약물전달체계 또는 지능형 약물전달체계 등의 새로운 약물전달 방식의 개발이 필요하게 되었다.
과립의 개념은 마이크로미터 단위의 크기를 가지는 캡슐을 말하며, 캡슐벽과(shell) 그 캡슐에 내재된 심물질 (core material)로 구성된다. 입자 사이즈에 있어서 기준이 있는 것은 아니나 통상 1 ~ 800 ㎛의 지름과 10 ~ 90 중량%의 코어물질을 포함하는 것을 말한다. 일반적으로 과립은 얇은 합성 또는 천연고분자 막으로 이루어진 과립 벽의 화학적 구조, 두께 및 과립의 입자 크기에 따라 기능성 심물질의 방출 속도가 조절될 수 있다. 이때 사용되는 심물질로는 용매, 향료, 의약품, 축열물질, 염료, 잉크 등을 포함하여 그 종류가 다양하며, 그 심물질의 용도에 따라 의약분야, 제초제, 멸충제, 곰팡이 방지제, 살균제로 적용되는 농약분야, 식품분야, 화장품 분야 등의 응용 및 연구가 활발히 이루어지고 있다. 그러나 과립이 의약품에 적용될 경우, 대부분 일정한 약물 방출 속도를 가지기 어렵거나 비교적 단시간 내 약물이 방출된다. 따라서 최근에는 약물의 방출 속도를 조절하여 치료 효과를 극대화 시키려는 연구가 활발히 진행되고 있으며, 특히 약물을 둘러싸고 있는 물질로부터 약물이 초기에 급격하게 방출되는 문제점을 해결하기 위한 연구가 각광받고 있다. 또한 약물의 방출을 조절하기 위한 약물전달용 담체로 사용되고 있는 합성 고분자의 독성이 문제되면서 무독성 담체에 대한 연구도 진행되고 있으며 상기 연구의 결과로 생체적합성, 생분해성 등의 특징을 가지는 고분자를 이용한 약물전달용 과립의 제조에 대한 관심이 증가하고 있다.
고분자를 이용한 약물전달용 과립의 대표적 제조 방법은 주로 상분리법, 용매 추출법, 용매 증발법, 분무건조법 등이 있으며, 제조 방법에 따라 입자의 크기, 약물의 방출 특성, 약물의 봉입률 등 과립의 최종 특성에 큰 영향을 미치므로 적절한 제조 방법이 선택되어야 한다.
일반적으로 서방형 과립 제형은 약물 방출 속도가 적절히 조절되어야 하며 초기 방출 속도가 높지 않아야 한다. 그러나 상기의 일반적인 제조 방법에 의해 과립을 제조하게 되면 대부분의 경우 일정한 약물 방출 속도를 가지기 어렵거나 약물이 초기에 방출된다. 또한 제조 파라미터를 조절하여 초기 방출을 줄인 경우라도 초기에 방출이 되지 않거나 일정한 방출이 일어나지 않는 경우가 많다.
이러한 문제를 해결하기 위한 방법으로 분해속도가 서로 다른 두 가지 이상의 고분자를 일정 비율로 혼합하여 과립을 제조함으로써 약물의 초기방출과 이 후의 방출 속도를 조절하고자 하는 연구가 진행된 바 있다[Ravivarapu, H.B., Burton, K., DeLuca, P.P., Polymer and microsphere blending to alter the release of a peptide from PLGA microspheres, Eur J Pharm Biopharm, 50(2), 263-70, 2000]. 그러나 이렇게 두 가지 이상의 고분자로 하나의 과립 제형을 제조하는 경우에 하나의 과립 내에 존재하는 분해 속도가 빠른 고분자가 분해속도가 느린 고분자의 분해속도에 영향을 주어 전반적으로 과립의 분해 속도가 빨라지는 경향이 있으며, 이렇게 제조된 과립 제형만으로는 약물의 초기 방출량과 이 후의 장기간 동안의 방출 속도를 원하는 대로 조절하기가 어렵다는 단점이 있다.
이러한 한 가지 조성의 과립 제형의 단점을 극복하기 위한 방법으로 약물이 봉입된 과립을 제조한 후에 이를 중심핵으로 하여 다른 생분해성 고분자로 유동층 입자 코팅법을 이용하여 코팅하는 방법이 미국특허 제6,120,787호에 공지되어 있다. 이 방법은 약물이 봉입된 중심핵이 다른 생분해성 고분자로 코팅되기 때문에 봉입된 약물이 초기에 방출되는 비율이 낮아지게 된다. 그러나 코팅의 완성 정도에 따라 약물의 방출 시험에서 초기에는 약물이 방출되지 않고 일정한 기간이 지난 후에 약물이 방출되는 경향을 얻은 결과도 있다. 하지만 이 방법에 사용되는 장비인 유동층 입자 코팅기는 현재 상업적으로나 기술적으로 최소 필요 생산량이 수십 그램에 달하여 펩타이드 또는 단백질과 같은 고가의 약물에 적용하기에는 한계가 있고, 실제 제품화를 위한 생산 공정에서도 2단계로 과립를 제조하여야 하는 공정상의 어려움이 있다.
따라서 약물의 과도한 초기 방출을 억제하고 지속적인 약물 방출 및 약물의 방출 속도를 원하는 대로 조절할 수 있으며, 제조공정이 단순하고 경제적인 새로운 제형의 개발이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 연구, 노력한 결과, 약물이 봉입된 과립을 온도감응 하이드로젤과 혼합하여 사용함으로써, 과립으로부터 초반에 과량 방출되던 약물을 온도감응 하이드로젤에 의해 단계적으로 제어하게 됨으로써, 초반 혈중에 대한 약물 과다 방출을 억제하고, 일정한 속도로 약물 방출을 조절하여 혈중 약물 농도를 장시간 일정하게 유지시켜 치료 효과를 극대화할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명은 생분해성 고분자와 약물을 함유하는 과립 및 온도감응 하이드로젤을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물전달 제형 및 이의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 생분해성 고분자와 약물을 함유하는 과립; 및 온도감응 하이드로젤을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물전달 제형을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 분자량 10,000 ~ 200,000 g/mol인 생분해성 고분자에 약물을 혼입시켜 약물 봉입 과립을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 과립을 온도감응 하이드로젤과 혼합시켜 약물 전달체를 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물전달 제형의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 약물전달 제형은 단일축 초음파 분무법 등을 이용하여 생분해성 고분자로 이루어진 과립에 약물이 봉입된 서방형 과립을 제조하고, 이에 생분해성 및 생체적합성 고분자로 제조된 온도감응 하이드로젤을 혼입하여 제조되는 것으로, 기존에 비해 비교적 간단한 단일 공정법에 의하여 제조할 수 있다는 장점이 있다. 또한 상기 방법으로 제조된 단계적 약물 방출 제형은 초반의 약물의 과도한 방출이 없이 일정한 속도로 서서히 방출되어 혈중 약물 농도를 장시간 일정하게 유지하게 되므로 종래의 주사형 약물전달 제형 및 서방형 과립이 지닌 과도한 초기 방출을 방지하며, 시간 경과에 따른 방출량의 지속성 등 원하는 방출 거동을 쉽게 얻을 수 있다는 장점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 과립 및 온도감응 하이드로젤을 나타낸 모식도(위) 및 이를 통한 1차적 및 2차적 약물 방출 제어(아래)를 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명에 따른 고분자 과립의 제조방법을 간단하게 나타낸 모식도이다.
도 3은 제조예 1에서 제조된 과립의 형광 현미경 및 SEM 이미지이다.
도 4는 제조예 2의 고분자 과립의 제조방법을 간단하게 나타낸 모식도와, 약물이 함유된 과립의 형광 현미경 이미지이다.
도 5는 실험예 1 ~ 3을 실시한 후, 이를 시간 별 혈중 약물 농도로 계산하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 실험예 4 ~ 7을 실시한 후, 이를 시간 별 혈중 약물 농도로 계산하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 비교예 2 및 실시예 1 ~ 5의 하이드로젤 수용액을 쥐의 피하에 주입한 뒤 1일 경과 후 젤을 적출하고 이를 SEM으로 관찰한 이미지이다.
도 8은 비교예 2 및 실시예 1 ~ 5의 하이드로젤 수용액을 쥐의 피하에 주입한 뒤 시간의 경과에 따른 젤의 크기를 비교하고, 이를 형광분광장치를 이용하여 형광 발현을 촬영한 이미지이다.
도 9은 비교예 2 및 실시예 1 ~ 5의 하이드로젤 수용액을 쥐의 피하에 주입한 뒤 일정 시간 경과 후 젤을 적출하고 이를 현미경으로 촬영한 이미지이다.
도 10은 비교예 2 및 실시예 1 ~ 5의 하이드로젤 수용액을 쥐의 피하에 주입한 뒤 시간의 경과에 따라 젤을 적출하고 이를 H&E 염색한 이미지이다.
도 11은 비교예 2 및 실시예 1 ~ 5의 하이드로젤 수용액을 쥐의 피하에 주입한 뒤 시간의 경과에 따라 젤을 적출하고 이를 ED1 면역 형광 염색한 사진으로, 파란색 부분과 빨간색 부분은 각각 DAPI 와 ED1 염색을, 초록색 부분은 형광물질인 FITC가 발현되어 염색된 이미지이다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 약물의 초기 방출 제어 및 단계적 방출을 위한 약물전달 시스템에 관한 것으로서, 과도한 초기 방출 또는 시간 경과에 따른 방출량의 급격한 감소 또는 증가 등을 극복하기 위하여 1차적으로 약물이 봉입된 약물 함유 과립을 제조한 후, 이를 온도감응 하이드로젤과 혼합하여 하이드로젤에 의해 2차적으로 약물 방출량이 조절되는 약물전달 제형에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 생분해성 고분자와 약물을 함유하는 과립 및 온도감응 하이드로젤을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물전달 제형을 제공하며, 또한 상기 약물전달 제형의 제조방법으로 (a) 분자량 10,000 ~ 200,000 g/mol인 생분해성 고분자에 약물을 혼입시켜 약물 봉입 과립을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 과립을 온도감응 하이드로젤과 혼합시켜 약물 전달체를 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물전달 제형의 제조방법을 제공하는 것을 그 특징으로 한다.
본 발명의 약물전달 제형은 주사 투여 후 초반에 과립으로부터 과량 방출되는 약물을 온도감응 하이드로젤에 의해 단계적으로 제어함으로써 초반에 혈중에 대한 약물 방출을 억제하고 일정한 속도로 약물 방출을 조절하여 혈중 약물 농도를 장시간 일정하게 유지시킬 수 있다.
이하에서는 본 발명의 제조방법을 중심으로 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 한다.
본 발명에서 사용되는 생분해성 고분자는 과립을 둘러싸고 있는 외벽물질(shell)로 사용되며, 상기 생분해성 고분자의 종류 및 조성에 따라 약물 방출 속도가 1차적으로 제어된다(도 1). 상기 생분해성 고분자 내부에 심물질(core)인 약물을 봉입되어 과립을 이루게 된다. 본 발명에서는 생체에 적합하며, 생분해 특성을 가지는 상기 생분해성 고분자를 과립 벽으로 사용하며, 상기 고분자의 종류 및 조합에 따라 약물 방출량 및 속도를 1차적으로 제어할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 상기 생분해성 고분자는 폴리카프로락톤(Polycaprolactone), 폴리알킬카보네이트(Polyalkylcarbonate), 폴리아미노산(Polyamino acid), 폴리하이드록시부티르산(Polyhydroxybutyric acid), 폴리오르토에스테르(Polyorthoester), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride), 플루로닉(Poly(ethylene oxide)poly(propylene oxide)poly(ethylene oxide), Pluronic), 폴리락타이드(Polylactide, PLA), 폴리글라이콜라이드(Polyglycolide, PGA) 또는 이들의 공중합체인 폴리락타이드-co-글라이콜라이드(PLGA)와 이의 성형중합체인 (폴리락타이드-co-글리콜라이드)-글루코스(Polylactide-co-glycolide-glucose, PLGA-glucose), 메톡시폴리에틸렌글리콜-(폴리카프로락톤-co-폴리락타이드) (MPEG-(PCL-co-PLLA) 등의 폴리에스테르 등과 같은 합성 고분자를 비롯하여 카복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose), 알긴, 알긴산(alginic acid), 알지네이트(alginate), 하이알루론산(hyaluronic acid), 폴리펩티드, 단백질, 젤라틴, 카세인, 키틴 유도체, 키토산(chitosan) 등과 같은 천연 고분자를 포함한다.
상기 생분해성 고분자 중 과립의 벽(shell)을 구성하는 고분자를 바람직하게는 폴리락타이드-co-글라이콜라이드(PLGA)를 사용할 수 있다.
상기 생분해성 고분자의 종류 및 조합에 따라 약물 방출량 및 속도를 제어할수 있으며, 예를 들어 폴리락타이드-co-글라이콜라이드(PLGA)는 폴리락타이드(PLA)와 폴리글라이콜라이드(PGA)의 성분비율에 따라 인체 내에서 분해되는 속도가 좌우되며, 이것으로 약물방출 속도 조절이 가능하다. 따라서 이러한 생분해성 고분자를 약물방출을 조절하기 위한 매트릭스로 이용하면 약물 방출속도를 제어할 수 있다.
상기 생분해성 고분자 폴리락타이드-co-글라이콜라이드(PLGA) 공중합체는 20,000 ~ 200,000 g/mol의 분자량, 바람직하게는 30,000 ~ 90,000 g/mole의 분자량을 갖는 것을 사용하는 것이 좋다. 고분자의 분자량의 따라 방출속도가 다르며, 저분자량의 고분자를 이용할수록 방출이 빠르며, 분자량이 클수록 방출이 느리다. 따라서 과립을 제조하고 그 과립을 이용한 방출제어에 있어서 적절한 분자량의 고분자를 선택하여 제조하는 것이 바람직하다.
상기 생분해성 고분자 중 폴리락타이드-co-글라이콜라이드(PLGA)는 미국 식품의약청(FDA)으로부터 인체에 사용 가능한 무독성 생분해성 고분자로 승인되어 인체 내의 조직 재생을 위한 소재, 약물전달용 담체 또는 수술용 봉합사로 오랫동안 광범위하게 사용되어 왔고, 그 생체적합성이 이미 증명된 바 있다.
본 발명에서 사용가능한 약물은 제한되지는 않으나, 바람직하게는 관절염계 약물, 호르몬, 골대사 제제, 면역억제제, 혈관생성 억제제, 비타민제, 단백질 또는 펩타이드계 약물, 항암제, 진통제, 항염증제, 항궤양제, 당뇨병 치료제 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 경구 투여시 제한적인 단백질 약물을 사용하는 것이 좋다.
상기 생분해성 고분자에 상기 약물을 혼입시켜 약물 봉입 과립을 제조할 수 있다. 상기 과립은 방부제, 보존제 및 부형제 등 1종 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 혼입 과정은 단일축 초음파 분무법[B. S. Kim, J. M. Oh, K. S. Kim et al, Biomaterials, 30, 902 (2009); B. S. Kim, J. M. Oh, H. Hyun et al, MOLECULAR PHARMACEUTICS, 6, 353 (2009)] 또는 실린지를 이용한 과립 제조방법을 통해 수행될 수 있다. 상기 단일축 초음파 분무법을 통하여 중심핵 부분과 중심핵 부분이 코팅되는 바깥쪽 부분의 조성이 다르게 이루어진 이중 구조의 과립을 제조할 수 있으며, 이 경우 과립 내의 약물함량은 60 ~ 70 %로 정도로 우수한 약물 봉입률을 나타내고 초반 방출량 또한 억제된다는 장점이 있다. 하지만 상기 방법만을 통해서는 여전히 초반에 약물이 과다 방출되는 문제점이 있어, 이를 해결하는 동시에 지속적으로 방출량을 조절하기 위해 본 발명에서는 상기 제조된 과립을 온도감응 하이드로젤과 혼합하여 약물 전달체를 제조하는 것을 특징으로 한다.
상기 온도감응 하이드로젤은 온도변화에 따라 용해도의 갑작스러운 변화를 보이는 고분자로써, 상온에서는 졸 상태로 존재하고 인체온도 부근에서는 젤을 형성함으로써 외과적인 수술없이 사용이 가능한 지능형 하이드로젤이며 효과적인 약물방출 제어에 이용 가능하다. 본 발명의 상기 온도감응 하이드로젤은 플루로닉(Poly(ethylene oxide)poly(propylene oxide)poly(ethylene oxide), Pluronic), 폴리카프로락톤, 폴리에틸렌글리콜, 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(MPEG-PCL), 카복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose, CMC), 카복시메틸셀룰로오스(CMC)와 폴리에틸렌이민(PEI)의 혼합물, 알긴, 알긴산(alginic acid), 알지네이트(alginate), 폴리펩티드, 단백질, 젤라틴, 카세인, 키틴 유도체 및 키토산(chitosan) 등과 같은 합성 및 천연 고분자를 사용하여 제조할 수 있으며, 상기 고분자를 인산완충용액 등에 넣어 하이드로젤로 제조할 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니며, 고분자의 종류에 따라 다양한 제조방법을 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 약물전달 제형은 주사제 형태로 사용될 수 있으나 여기에 제한되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위는 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 메톡시폴리에틸렌글리콜 - 폴리카프로락톤 [ MPEG - PCL ] 블록 공중합체의 합성
분자량 3,150 g/mole의 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG)-폴리카프로락톤(PCL) 블록 공중합체를 합성하기 위하여 개시제인 메톡시폴리에틸렌글리콜(1.5 g, 2 mmol, Mn = 750 g/mole)과 톨루엔 80 ㎖을 잘 건조된 100 ㎖ 둥근 플라스크에 넣고 딘 스탁 트랩을 사용하여 3시간동안 130 ℃에서 공비 증류를 실시하였다. 증류 후 톨루엔을 모두 제거하고 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG)을 상온으로 냉각시킨 후 미리 정제된 카프로락톤(CL)(4.8 g, 42 mmol)을 주사기를 이용하여 넣은 후 반응용매로서 미리 정제된 MC 40 ㎖을 넣은 다음, 중합 촉매로서 HClEt2O을 4 ㎖ 넣고 24시간동안 상온에서 교반시켜 주었다. 모든 과정은 고순도 질소 하에서 실시하였다. 반응 후 미 반응 단량체나 개시제를 제거하기 위하여 1,000 ㎖의 헥산에 반응물을 서서히 떨어뜨리면서 침전시켜 주었다. 침전물은 메틸렌클로라이드(MC)에 녹여 거름종이로 거른 후 회전 증발기를 통하여 용매를 제거하고 감압 하에서 건조시켰다.
상기에서 합성된 공중합체의 구성성분의 몰 비에 대한 분자량은 1H-NMR을 이용하여 측정한 결과, 이론적인 예상 값과 유사한 분자량을 얻을 수 있었고, 다분산도의 측정을 위해 젤 투과 크로마토그래피(GPC)를 이용하여 확인한 결과 1.26의 다분산도를 가짐을 확인하였다.
제조예 2: 메톡시폴리에틸렌글리콜 -( 폴리카프로락톤 - co - 폴리락타이드 ) 블록공중합체의 합성 [ MPEG -(PCL-co-PLLA)](카프로락톤 : 락타이드 = 90 : 10)
분자량 50,750 g/mole의 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG)-폴리카프로락톤(PCL)-co-폴리락타이드(PLLA) 블록 공중합체를 합성하기 위하여 개시제인 메톡시폴리에틸렌글리콜(0.05 g, 6.7 x 10-2 mmol)과 톨루엔 80 ㎖을 잘 건조된 100 ㎖ 둥근 플라스크에 넣고 딘 스탁 트랩을 사용하여 3시간동안 130 ℃에서 공비 증류를 실시하였다. 증류 후 톨루엔을 40 ㎖ 제거하고 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG)을 25 ℃로 냉각시킨 후 미리 정제된 카프로락톤(CL) (3g, 26.3 mmol)과 락타이드(LA) (0.42 g, 2.92 mmol) 넣고 반응용매로서 미리 정제된 톨루엔 40 ㎖을 넣은 음, 중합 촉매로서 Sn(Oct)2를 0.1 ㎖ 넣고 24시간동안 120 ℃에서 교반시켜 주었다. 모든 과정은 고순도 질소 하에서 실시하였다. 반응 후 미 반응 단량체나 개시제를 제거하기 위하여 900 ㎖의 헥산과 100 ㎖의 에테르에 반응물을 서서히 떨어뜨리면서 침전시켜 주었다. 침전물은 메틸렌클로라이드(MC)에 녹여 거름종이로 거른 후 회전 증발기를 통하여 용매를 제거하고 감압 하에서 건조시켰다.
상기에서 합성된 공중합체의 구성성분의 몰 비에 대한 분자량은 1H-NMR을 이용하여 측정한 결과, 이론적인 예상 값과 유사한 분자량 50,300 g/mole을 얻을 수 있었다.
제조예 3 : 단일축 초음파 분사기를 이용한 과립의 제조방법
분자량이 33,000 g/mol인 폴리락타이드-co-글리콜라이드(PLGA, poly(lactic-co-glycolic acid))를 에틸 아세테이트에 3 중량%가 되게 녹이고, 모델약물로써 수용성 단백질이며 형광물질인 FITC가 결합된 소혈청알부민 (BSA-FITC)을 증류수에 5 중량%로 녹여 균일한 약물 분산체 용액을 제조하였다. 이들 용액을 각각의 주사기에 넣은 후, 각 4, 0.2 ㎖/min의 유속으로 단일축 초음파 분사기에 흘려주었다. 0.5 중량% 수용액인 폴리비닐알코올(PVA) 수용액을 준비하고, 제조된 고분자 및 약물 분산용액을 60 Hz의 진동주파로 분사하여 상기 폴리비닐알코올 수용액에 분산시켜 과립을 형성시켰다. 2시간 동안 실온에서 700 rpm으로 교반하여 안정화 시킨 후, 이어서 생성된 과립을 분리하여 증류수를 가하여 세척한 후에 동결 건조하여 단백질 약물이 봉입된 고분자 과립을 얻었다(도 2).
제조예 4. 실린지를 이용한 과립의 제조방법
제조예 2에서 얻은 메톡시폴리에틸렌글리콜-(폴리카프로락톤-co-폴리락타이드) 블록 공중합체 0.2 g과 형광물질인 FITC를 20 mg을 THF 0.7 ㎖에 넣고 교반한 후 60 ℃에서 30분 간 인큐베이션 시켜 약물이 상기 공중합체에 분산된 약물분산체 용액을 제조하였다. 폴리비닐알콜(PVA) 1 중량% 수용액을 45 ℃로 준비하고, 제조된 약물분산체 용액을 도 4에 나타나 바와 같이 실린지를 사용하여 상기 폴리비닐알콜 수용액에 분산시켜 과립을 형성시켰다. 2시간 동안 교반하면서 서서히 온도를 상온으로 낮추어 용매의 증발 및 과립의 형성을 유도하였다. 이어서 생성된 과립을 분리하여 증류수를 가하여 세척한 후에 동결 건조하여 약물 함유 고분자 과립을 얻었다.
제조예 5 : 플루로닉 ( Pluronic ) 하이드로젤의 제조
플루로닉(Pluronic, Mn = 12,000 Da)을 인산완충용액(PBS, pH 7.4)에 20 중량%가 되게 넣어 4 ℃ 온도에서 교반하여 용액으로 제조한 후, 4 ℃ 온도에서 2 일 동안 냉장보관 하였다.
제조예 6 : 카복시메틸셀룰로오스 ( CMC ) 하이드로젤의 제조
카복실메틸셀룰로오스(CMC, Low viscosity, viscosity = 50 ~ 200 cP, Batch# 078K0164)를 인산완충용액(PBS, pH 7.4)에 3 중량%가 되게 넣어 실온에서 1 일 동안 교반하여 완전히 녹인 후, 4 ℃ 온도에서 2 일 동안 냉장보관 하였다.
제조예 7 : 카복시메틸셀룰로오스 ( CMC )/폴리에틸렌이민( PEI ) 하이드로젤의 제조
카복시메틸셀룰로오스(CMC) 용액은 점성이 50 ~ 200 cP(low viscosity)인 카복시메틸셀룰로오스를 인산완충용액(PBS, pH 7.4)에 3 중량%로 용해시켜 제조하였으며, 폴리에틸렌이민(PEI) 용액은 분자량이 423 g/mol인 폴리에틸렌이민과 염화수소(HCl)의 몰비가 1:1이 되도록 44 중량% 용액으로 제조하였다. 이렇게 만들어진 카복시메틸셀룰로오스 용액과 폴리에틸렌이민 용액을 90:10의 중량 비율로 혼합하여 카복시메틸셀룰로오스/폴리에틸렌이민(CMC/PEI) 하이드로젤을 제조하였다.
제조예 8 : 키토산( Chitosan ) 하이드로젤의 제조
키토산(Chitosan) 용액은 점성이 200 ~ 800 cP(medium molecular weight, Batch# 03318AJ)인 키토산을 0.1 mol/L의 아세트산 용액 18 ㎖으로 용해시킨 후, 상기 용액을 5 ㎖ 바이알에 4 ㎖을 넣은 후 교반하여 제조하였으며, 키토산 용액 대비 20 중량%로 1 ㎖의 증류수에 용해시킨 베타-글리세롤포스페이트 디소듐 솔트 하이드레이트 (β-Glycerophosphate disodium salt hydrate)를 실린지를 이용하여 키토산 용액에 천천히 첨가시켜 주었다. 1 시간 30 분 동안 4 ℃로 천천히 교반하여 안정화 시켜 키토산 하이드로젤을 제조하였다.
제조예 9 : 메톡시폴리에틸렌글리콜 - 폴리카프로락톤 ( MPEG - PCL ) 하이드로젤의 제조
상기 제조예 1에서 얻은 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(MPEG-PCL) 블록 공중합체를 20 중량%의 농도로 인산완충용액(PBS, pH 7.4)에 완전히 용해시킨 후 균일 분산된 고분자의 평형을 유지하기 위해 2 일 동안 4 ℃에서 냉장 보관하였다.
실시예 1 : 상기 제조예 3을 상기 제조예 5에 균일 분산시켜 주사제형으로 제조한 후 in vivo 주입
상기 제조예 5에서 제조한 플루로닉 하이드로젤 1 ㎖에 상기 제조예 3에서 제조된 약물 2 mg을 함유하고 있는 과립을 균일 분산 시킨 후 1 ㎖ 실린지에 넣어 주사제형으로 제조하였다. 제조 즉시 쥐의 피하에 주입하여 젤을 형성 시켰다.
실시예 2 :상기 제조예 3을 상기 제조예 6에 균일 분산시켜 주사제형으로 제조한 후 in vivo 주입
하이드로젤로써 상기 제조예 6의 CMC 하이드로젤을 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
실시예 3 : 상기 제조예 3을 상기 제조예 7에 균일 분산시켜 주사제형으로 제조한 후 in vivo 주입
하이드로젤로써 상기 제조예 7의 CMC/PEI 하이드로젤을 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
실시예 4 : 상기 제조예 3을 상기 제조예 8에 균일 분산시켜 주사제형으로 제조한 후 in vivo 주입
하이드로젤로써 상기 제조예 8의 키토산 하이드로젤을 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
실시예 5 : 상기 제조예 3을 상기 제조예 9에 균일 분산시켜 주사제형으로 제조한 후 in vivo 주입
하이드로젤로써 상기 제조예 9의 MPEG-PCL 하이드로젤을 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
비교예 1: 형광물질인 FITC 가 결합된 소혈청알부민 ( BSA - FITC ) 단독 용액 제조
형광물질인 FITC가 결합된 소혈청알부민 (BSA-FITC) 2 mg을 인산완충용액 (PBS, pH 7.4) 1 ㎖에 완전히 녹여 주사제형을 제조하였다.
비교예 2: 과립 단독군 제조
상기 제조예 3에서 얻은 과립 1.99 mg을 총 량의 20 중량%에 해당하는 양의 5 중량% 디-만니톨 (D-mannitol), 2 중량% 카복시메틸셀룰로오스(CMC), 0.1 % 트윈 80 (Tween 80)을 증류수에 균일 분산시켜 1 ㎖ 실린지에 넣어 주사제형으로 제조하였다.
실험예 1: 형광물질인 FITC 가 결합된 소혈청알부민 ( BSA - FITC ) 용액을 주입한 후 꼬리정맥에서 혈장 채취
상기 비교예 1에서 제조한 BSA-FITC 약물 용액을 1 ㎖ 실린지를 이용하여 쥐의 피하에 주입하였고, 각 시간 별로 쥐의 꼬리정맥에서 혈액을 취하여 헤파린:증류수가 1:499의 비율로 제조된 용액 200 ㎕가 담긴 에펜돌프 튜브에 담은 후 원심분리 시켰다. 적혈구는 아래층에 가라앉고 혈장은 상층에 존재하게 되는데, 이 때 상층액 200 ㎕를 취하여 증류수 100 ㎕, 66 mM 에틸렌다이아민테트라아세트산 (EDTA) 300 ㎕, 그리고 50 mM N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산 (HEPES) 400 ㎕를 첨가한 후 형광분광기를 이용하여 혈중에 남아 있는 BSA-FITC의 양을 측정 하였다.
혈액을 취하는 시간은 제형을 주입한 즉시 30 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 6 시간, 9 시간, 12 시간, 24 시간이 경과된 시점과 그 후 매일 동일한 시간에 실시하였고, 약물의 방출을 확인하기 위한 시료는 빛을 차단하여 형광 분광기(Jasco, FP-6500)를 이용하여 여기 490 ㎚, 방출 525 ㎚의 조건에서 발산강도를 통하여 정량분석을 실시하였다.
그 결과, 비교예 1의 경우, 과도한 약물의 방출이 일어나게 되어 단시간에 약물이 모두 방출되는 경향을 보였으나, 실험예 2는 비교예 1의 결과에 비하여 초기 약물 방출량이 약 25 % 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 실험예 3의 경우, 단계적 약물 방출 시스템의 제형을 제조한 것으로써, 초기 약물의 과도한 방출 없이 지속적으로 약물이 방출되고 있음을 확인할 수 있었다(도 6).
실험예 2: 과립 단독 용액을 주입한 후 꼬리정맥에서 혈장 채취
상기 비교예 2에서 얻은 과립 용액을 사용한 것을 제외하고, 실험예 1과 동일한 방법으로 수행하여 약물을 방출량을 확인하였다.
실험예 3: 플루로닉 하이드로젤을 주입한 후 꼬리정맥에서 혈장 채취
과립을 둘러싸고 있는 하이드로젤로써 플루로닉 하이드로젤을 사용한 것을 제외하고, 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 수행하여 약물의 방출량을 확인하였다.
실험예 4: CMC 하이드로젤을 주입한 후 꼬리정맥에서 혈장 채취
과립을 둘러싸고 있는 하이드로젤로써 CMC 하이드로젤을 사용한 것을 제외하고, 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 수행하여 약물의 방출량을 확인하였다.
실험예 5: CMC / PEI 하이드로젤을 주입한 후 꼬리정맥에서 혈장 채취
과립을 둘러싸고 있는 하이드로젤로써 CMC/PEI 하이드로젤을 사용한 것을 제외하고, 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 수행하여 약물의 방출량을 확인하였다.
실험예 6: 키토산 하이드로젤을 주입한 후 꼬리정맥에서 혈장 채취
과립을 둘러싸고 있는 하이드로젤로써 키토산 하이드로젤을 사용한 것을 제외하고, 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 수행하여 약물의 방출량을 확인하였다.
실험예 7: MPEG - PCL 하이드로젤을 주입한 후 꼬리정맥에서 혈장 채취
과립을 둘러싸고 있는 하이드로젤로써 MPEG-PCL 하이드로젤을 사용한 것을 제외하고, 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 수행하여 약물의 방출량을 확인하였다.
실험예 8: 단계적 약물방출 시스템 제형의 in vivo 젤 형성 및 형태 관찰
단계적 약물 방출 제형을 실온에서 졸 상태로 유지시킨 후 일회용 주사기를 사용하여 1 ㎖씩 쥐의 피하에 주입하였다. 1일 경과 후 주사부위를 절제하여 젤 형성을 확인하였고 SEM으로 몰폴로지를 확인하였다(도 7). 상기 실시예 1 ~ 실시예 5 및 비교예 2의 제형은 캡슐이 조직 내에 많이 분포하고 있는 형태를 관찰할 수 있었으며, 실시예 4와 실시예 5의 제형을 제외하고는 모두 1주, 2주, 3주 및 4주 경과한 시점에서 형성된 제형이 생분해되어 그 크기가 작아지는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 실시예 4와 5의 제형은 4주 경과 후에도 제형의 크기의 변화가 거의 없는 것을 확인하였다. 이러한 현상은 형광 발현 이미지를 통해서도 관찰할 수 있는데, 1주, 2주, 3주 및 4주 경과한 시점에서 형광 발현 정도를 확인해보니 제형의 크기가 줄어들수록, 즉 시간이 경과됨에 따라 제형이 생분해되면서 약물 방출량 또한 증가하여 제형 속에 남아있는 약물의 양이 줄어들어 있는 것을 관찰할 수 있었다. 반면, 실시예 4와 5의 경우에는 4주 경과 후에도 제형 내부에 존재하는 약물의 양이 타 제형보다 더 많이 관찰되었다(도 8).
또한 상기 제형을 쥐의 피하로부터 절제한 후 액체질소룰 이용하여 급속냉각 시킨 후, 절단하여 그 절단면을 형광현미경을 통하여 관찰하였다. 도 8의 결과와 마찬가지로 시간 경과에 따라 제형 내부에 존재하는 약물의 양이 차이를 보이는 것을 확인할 수 있었다(도 9).
따라서 본 발명의 단계적 약물전달제형은 약물을 둘러싸고 있는 두 가지 이상의 생분해성 고분자의 종류에 따라서 약물 방출 속도 및 방출 기간을 조절할 수 있을 것이라 사료된다.
실험예 9: 단계적 약물방출 시스템 제형의 조직학적 평가
상기 1주, 2주, 3주 및 4주 경과한 시점에서 쥐의 피하로부터 제거된 제형을 10% 포르말린에 고정하였고, 고정된 제형을 파라핀 블록으로 제작하여 4 ㎛ 두께로 자른 후 슬라이드에 고정하고 조직학적 평가를 하기 위하여 H&E, ED1 염색을 실시하였다. H&E 염색은 가장 기본적인 염색법으로 세포의 핵에 특이적으로 염색되는 헤마톡실린(hematoxylin)과 세포질에 염색되는 에오신(eosin)을 이용한 염색법으로 핵과 세포질의 성상을 확인할 수 있는 염색법으로써 이식 체의 전체적인 세포 거동과 몰폴로지를 확인하기 위하여 진행되었다. 상기 H&E 염색을 통하여 마크로파지, 호중구, 림프구가 제형 안에 존재하며, 제형 내의 과립의 분포 정도를 관찰할 수 있었다 (도 10). 또한 이식된 제형의 염증 반응 확인을 위하여 ED1 (mouse anti rat CD68; Serotec, UK) 발현을 확인하였다(도 11).
상기 실험은 통하여 본 발명의 젤이 생체적합성을 가지며 면역 염증 반응을일으키지 아니함을 확인하여, 조직공학적 지지체로 활용될 수 있음을 알 수 있었다.

Claims (11)

  1. 생분해성 고분자와 약물을 함유하는 과립; 및
    온도감응 하이드로젤
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물전달 제형에 있어서, 상기 온도감응 하이드로젤은 플루로닉(Poly(ethylene oxide)poly(propylene oxide)poly(ethyleneoxide), Pluronic), 카복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose), 카복시메틸셀룰로오스(CMC)와 폴리에틸렌이민(PEI)의 혼합물, 및 키토산(chitosan) 중에서 선택된 1종 이상으로부터 제조되는 것이고, 상기 생분해성 고분자는 폴리락타이드-co-글라이콜라이드(PLGA)와 폴리에틸렌글리콜(Polyethyleneglycol, PEG), 카프로락톤(Caprolactone, CL), 글리콜라이드(Glycolide, GA) 및 락타이드(Lactide, LA)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약물전달 제형.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 10,000 ~ 200,000 g/mol의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 약물전달 제형.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 약물은 관절염계 약물, 호르몬, 골대사 제제, 면역억제제, 혈관생성 억제제, 비타민제, 단백질 또는 펩타이드계 약물, 항암제, 진통제, 항염증제, 항궤양제 및 당뇨병 치료제 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약물전달 제형.
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 과립은 방부제, 보존제 및 부형제 중 선택되는 1종 이상의 첨가제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약물전달 제형.
  7. (a) 분자량 10,000 ~ 200,000 g/mol인 생분해성 고분자에 약물을 혼입시켜 약물 봉입 과립을 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 과립을 온도감응 하이드로젤과 혼합시켜 약물 전달체를 형성하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물전달 제형의 제조방법에 있어서, 상기 온도감응 하이드로젤은 플루로닉(Poly(ethylene oxide)poly(propylene oxide)poly(ethyleneoxide), Pluronic), 카복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose), 카복시메틸셀룰로오스(CMC)와 폴리에틸렌이민(PEI)의 혼합물, 및 키토산(chitosan) 중에서 선택된 1종 이상으로부터 제조되는 것이고, 상기 생분해성 고분자는 폴리락타이드-co-글라이콜라이드(PLGA)와 폴리에틸렌글리콜(Polyethyleneglycol, PEG), 카프로락톤(Caprolactone, CL), 글리콜라이드(Glycolide, GA) 및 락타이드(Lactide, LA)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 삭제
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 약물은 관절염계 약물, 호르몬, 골대사 제제, 면역억제제, 혈관생성 억제제, 비타민제, 단백질 또는 펩타이드계 약물, 항암제, 진통제, 항염증제, 항궤양제 및 당뇨병 치료제 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약물전달 제형의 제조방법.
  10. 삭제
  11. 제 7 항에 있어서, 상기 (a)단계의 혼입은 단일축 초음파 분무법 또는 실린지를 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 약물전달 제형의 제조방법.
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