NL195056C - Werkwijze voor het bereiden van preparaten die zouten van peptiden met op carboxy eindigende polyesters bevatten. - Google Patents

Description

1 195056

Werkwijze voor het bereiden van preparaten die zouten van peptiden met op carboxy eindigende polyesters bevatten

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een farmaceutisch 5 preparaat dat een zout omvat gevormd uit een kation afgeleid van een peptide met ten minste één basische groep en een anion afgeleid van een op carboxy eindigende polyester.

De vorming van zouten uit peptiden met een basische groep en carboxy eindigende polyesters wordt vermeld in het Europees octrooischrift 58.481. Dit beschrijft farmaceutische preparaten die een polylactide en een zuurstabiel polypeptide bevatten. In deze publicatie wordt gezinspeeld op de mogelijkheid van 10 specifieke wisselwerkingen tussen de eindstandige carboxygroepen van polyesters en de basische groepen peptiden.

In het artikel van J.R. Lawter c.s. Proceed. Inter. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 14 (1987) 99-100 wordt een onderzoek naar de afgifte van een LHRH-analogon uit glycolide-Co-D, L-lactide-microcapsules in een fosfaatbuffer oplossing beschreven. Dit artikel noemt de mogelijke binding van het basische peptide aan 15 eindstandige carboxylaatgroepen (lactaat- en glycolaatgroepen) aan het polymeer en spreekt van peptide-polymeer-”zouten”. De bereiding van de microcapsules wordt niet beschreven. Ook H. Okada c. s. verwijzen in een artikel in Pharmaceutical Research 8 (1991) 584-7, dat betrekking heeft op een onderzoek naar de afgifte uit injecteerbare microbolletjes van leuporolide-acetaat en copoly(DI-melkzuur)glycolzuur), naar de mogelijkheid van zoutvorming tussen peptide en carboxylgroepen van polyesters.

20 In de literatuur wordt de bereiding van een gezuiverd zout gevormd uit een peptide met een basische groep en een op carboxy eindigend polyester niet beschreven.

Gevonden is nu dat als een dergelijk zout wordt bereid en vervolgens wordt gebruikt bij de bereiding van een farmaceutisch preparaat een prëparaat met een gunstig afgifteprofiel wordt verkregen, terwijl het gebruik van een dergelijk vooraf bereid zout ook voordelen bij het bereiden van een farmaceutisch 25 preparaat biedt, zoals de mogelijkheid oplossingen te bereiden van anders slecht of niet oplosbare peptiden. Deze oplossingen kunnen door filtreren eenvoudig gesteriliseerd worden. Door het sproeidrogen van dergelijke oplossingen kunnen gemakkelijk injecteerbare microbolletjes gemaakt worden.

Derhalve voorziet de uitvinding in een werkwijze als in de aanhef omschreven met het kenmerk dat de werkwijze een stap omvat waarbij een vooraf verkregen zout, gevormd uit een kation afgeleid van een 30 peptide met ten minste één basische groep en een anion afgeleid van een op carboxy eindigende polyester, wordt toegevoegd.

Bij de bereiding van het zout kan volgens een voorkeursuitvoeringsvorm zowel het peptide als de polyester in een overmaat ten opzichte van de stoichiometrische hoeveelheid worden toegevoegd.

Bij de bereiding van het preparaat kan volgens een voorkeursuitvoeringsvorm extra peptide en/of extra 35 polyester worden toegevoegd.

Volgens een uitvoeringsvorm heeft het met de werkwijze van de uitvinding bereide preparaat de vorm van een oplossing of dispersie van het zout in een oplosmiddel dat een oplosmiddel is voor de vrije polyester maar niet voor het vrije peptide, waarbij de deeltjesgrootte van het zout in de dispersie kleiner dan 5 pm. Bij voorkeur is de deeltjesgrootte van het zout in dispersie kleiner dan 0,2 pm.

40 Volgens andere uitvoeringsvormen van de uitvinding heeft het bereide preparaat de vorm van micro-deeltjes of een implantaat. Het preparaat is zo geschikt voor injectie of onderhuidse implantatie.

Volgens een uitvoeringsvorm van de uitvinding is het peptide farmacologisch werkzaam.

Volgens een andere uitvoeringsvorm is het peptide farmacologisch onwerkzaam en bevat het preparaat verder een farmacologisch werkzaam peptide.

45 Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm is het peptide gosereline of een farmaceutisch aanvaarbaar zout ervan.

Volgens een andere uitvoeringsvorm wordt het farmacologisch onwerkzame peptide gekozen uit polyarginine, polylysine en poly(arginine-co-lysine), (co)polymeren van neutrale aminozuren in D-, L- en DL-vorm met arginine en/of lysine in D-, L- of racemische vorm, peptiden en (co)polypeptiden waarvan de 50 peptideketens op het N-uiteinde geheel of gedeeltelijk op een basische groep eindigen en waarvan de hoofdketen uit neutrale aminozuurresten bestaat.

Volgens een andere uitvoeringsvorm wordt de polyester gekozen uit polyesters afgeleid van hydroxy-zuren en polyesters gevormd door polycondensatie van diolen en/of polyolen met dicarbonzuren en/of polycarbonzuren.

55 Volgens een ander aspect heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een oplossing of dispersie van een zout gevormd uit een kation afgeleid van een peptide met ten minste één basische groep en een anion afgeleid van een op carboxy eindigende polyester, waarbij men het peptide 195056 2 dat ten minste één basisch aminozuur bevat in een vrije basevorm of in de vorm van een zout met een zwak zuur, en de op carboxy eindigende polyester oplost in een oplosmiddel waarin beide oplosbaar zijn en dat door vriesdrogen verwijderd kan worden, men de ontstane oplossing snel invriest, het ontstane bevroren mengsel vriesdroogt, het resulterende mengsel dispergeert in een oplosmiddel voor het polyester-5 bestanddeel en men het mengsel laat oplossen waarbij het peptide-polyesterzout gevormd wordt.

Volgens nog een ander aspect heeft de uitvinding betrekking op een geTsoleerd zout gevormd uit een kation afgeleid van een peptide met ten minste één basische groep en een anion afgeleid van een op carboxy eindigende polyester.

De term "peptide" wordt hier in generieke zin gebruikt, en daaronder vallen pojy(aminozuren) die 10 normaliter als "peptiden" "polypeptiden" of als "eiwitten” aangeduid worden, en een "basisch peptide" is een peptide dat basisch van aard is, ontstaan uit een overmaat aan basische aminozuren, bijvoorbeeld arginine en/of lysine of ontstaan uit het N-einde van het peptide, of eenvoudig een peptide met ten minste één basische groep, eventueel in aanwezigheid van één of meer zure aminozuren. Onder die term vallen ook synthetische analoga van peptiden, onnatuurlijke aminozuren met basische functies, of met een op 15 andere wijze ingevoerde basiciteit. Het woord "polyester” wordt hierna gebruikt om een op carboxy eindigende polyester aan te duiden.

Het kation van het zout kan afgeleid zijn van een basisch peptide dat farmacologisch werkzaam is, of van een basisch peptide dat farmacologisch onwerkzaam is. Als het basische peptide farmacologisch werkzaam is kan het zout volgens de uitvinding zelf tot een farmaceutische formulering met verlengde 20 werking geformuleerd worden. Als het basische peptide farmacologisch onwerkzaam is kan het zout volgens de uitvinding als hulpstof dienen bij het formuleren van preparaten met vertraagde werking van andere, farmacologisch werkzame peptiden, die dan zuur van aard zijn (met daarin een overmaat aan zure aminozuren zoals asparaginezuur en glutaminezuur), of die neutraal van aard zijn.

In formuleringen van peptiden met vertraagde werking is een aanvullende eis natuurlijk dat het peptide 25 over de beoogde tijdsduur in wezen stabiel moet zijn. Met "in wezen stabiel” wordt bedoeld dat het geneesmiddel in de beoogde tijd niet helemaal onoplosbaar of gedenatureerd wordt, met totaal verlies van farmacologische werkzaamheid.

Geschikte, farmacologisch werkzame peptiden hebben een molecuulgewicht van ten minste 300, en bij voorkeur van ten minste 800. Voorbeelden van zulke peptiden, die over de beoogde tijd in hoofdzaak stabiel 30 zijn, en dus in de preparaten volgens de uitvinding kunnen optreden, zijn oxytocine, vasopressine, adrenocorticotroof hormoon (ACTH), groeifactor voor de epidermis (EGF), prolactine, luteïniserend hormoon, follikel stimulerend hormoon, luliberine of luteïniserend hormoon vrijmakend hormoon (LHRH), insuline, somatostatine, glucagon, interferon, gastrine, tetragastrine, pentagastrine, urogastron, secretine, calcitonine, enkephalinen, endorphinen, hyotorphine, taftsine, thymopoietine, thymosine, thymostimuline, thymus 35 humorale factor, serum-thymusfactor, tumornecrosefactor, kolonie stimulerende factoren, motiline, bombasine, dinorphine, neurotensine, ceruleïne, bradykinine, urokinase, kallikreïne, analoga en antagonisten van stof P, angiotensine II, zenuwgroeifactor, bloed coaguleringsfactoren VII en IX, lysozym-chloride, re nine, bradykinine, tyrocidine, gramicidinen, groeihormonen, melanocyten stimulerend hormoon, thyroïdhormoon vrijmakend hormoon, thyroïd stimulerend hormoon, parathyroïd-hormoon, pancreozymine, cholecystokinine, 40 menselijk placenta-lactogeen, menselijk chorion-gonadotrofine, eiwitsynthese stimulerend peptide, maagzuur remmend peptide, vasoactief darmpeptide, van bloedplaatjes afgeleide groeifactor, groeihormoon vrijmakende factor, eiwit voor de beendermorfogenese, en de synthetische analoga en modificaties en de farmacologisch werkzame fragmenten daarvan.

Bevoorkeurde peptiden in de preparaten volgens de uitvinding zijn de synthetische analoga van LHRH, 45 en in het bijzonder behoren tot die analoga (maar niet die alleen) busereline ([D-Ser(Bu*)e, des-Gly-NH210j-LHRH(1-9)NHEt), desloreline flD-Trp®, des-Gly-NH210]-LHRH(1-9)NHEt), fertireline ([des-Gly-NH210 [-LHRH(1-9)NHEt), gosereline ([D-Ser(Bu')e, Azgly10]-LHRH), histreline ([D-His (Bzl)e, des-Gly-NH210j-LHRH(1-9)NHEt), leuproreline ([D-Leu®, des-Gly-NH210]-LHRH(1-9)NHEt), lutreline ([D-Trp®, MeLeu7, des-Gly-NH210]-LHRH(1-9)NHEt), nafareline ([D-Nal®]-LHRH), tryptoreline ([D-Trp®]-LHRH) en defarmacolo-50 gisch werkzame zouten daarvan.

Farmacologisch onwerkzame basische peptiden die geschikt zijn voor de zouten volgens deze uitvinding zijn polyarginine, polylysine en poly(arginine-co-lysine), (co)polymeren van neutrale aminozuren, alle in D-, L- of DL-vorm, met arginine en/of lysine in D-, L- of racemische vorm, en ook de peptiden en (co)polypepti-den met een skelet van neutrale aminozuren en met een basische groep aan het N-einde.

55 De op carboxy eindigende polyester, die het anion voor het zout volgens de uitvinding levert, kan een homopolyester of een copolyester zijn. Onder die polyesters gaat de voorkeur uit naar die die in waterige of fysiologische omgeving, zoals men die tussen de spieren en onder de huid vindt, afbreken of eroderen tot in 3 195056 water oplosbare fragmenten van laag molecuulgewicht. Met zo’n omgeving is het dominerende proces van de afbraak een eenvoudige hydrolyse, waarbij ester-groepen hydrolytisch doorgeknipt worden, wat tot polyester-fragmenten van lager molecuulgewicht leidt, en uiteindelijk tot het verdwijnen van de formulering uit de plaats van toedienen. Maar ingezien wordt dat op de plaats van injectie of implantatie, en ook op 5 andere plaatsen in het levende weefsel, nog andere afbraakmechanismen een rol kunnen spelen, zoals die die door enzymen verzorgd worden.

Geschikte homo· en copolyesters zijn afgeleid van hydroxyzuren of zijn gevormd door polycondensatie van diolen en/of polyolen, bijvoorbeeld afgeleid van (maar niet alleen van) polyethyleenglycolen, polypropy-leenglycolen, alkyleenglycolen met 2-10 C, glycerol, trimethylolpropaan, en de gepolyoxyethyleerde vormen 10 van polyfunctionele alkoholen zoals glycerol, trimethylolpropaan en suikers, met dicarbonzuren en/of polycarbonzuren, bijvoorbeeld (maar niet alleen van) carbonzuren met 3-12 C, in het bijzonder malonzuur, barnsteenzuur, glutaarzuur, ftaalzuur, mellietzuur en pyromellietzuur, eventueel in aanwezigheid van hydroxyzuren en/of éénwaardige alkoholen.

De bevoorkeurde methoden voor het bereiden van homo- en copolyesters op basis van hydroxyzuren 15 gebeurt door polymerisatie van ringvormige dimeren onder ringopening of door directe polycondensatie van de hydroxyzuren of daarvan afgeleide lactonen. Deze polymerisaties, zowel van het ringopeningstype als van het polycondensatietype, gebeuren bij voorkeur zodanig dat de ontstaande homo- of copolyesters geheel of ten dele polymeerketens hebben met carboxyl-functies. De polycondensatie van de zuur-dimeren onder ringopening gebeurt bij voorkeur in aanwezigheid van een geschikte ketenoverdrager, die zowel het 20 molecuulgewicht als de structuur van de ontstaande homo- of copolyester regelt. Zulke ketenoverdragers zijn water, hydroxycarbonzuren, monocarbonzuren, dicarbonzuren en polycarbonzuren.

Voor door polycondensatie gevormde polyesters gebeurt de condensatie bij voorkeur onder gebruik van een overmaat aan carboxyl-functies, dus met een verhouding van [-COOH] tot {-OH] van 1: 1 of meer. De structuur en het molecuulgewicht van het polycondensaat worden bepaald door de aard van de gebruikte 25 alkoholen (monoölen, diolen, polyolen of mengsels daarvan), de aard van de gebruikte zuren (mono-, di- of polycarbonzuren, of mengsels daarvan), en van de ingezette overmaat aan carbonzuur. In de Krebscyclus optredende zuren zijn bijzonder nuttig.

Voorbeelden van geschikte hydroxyzuren en lactonen de bij het bereiden van voor deze uitvinding nuttige homo- en copolyesters kunnen dienen zijn B-propionolacton, B-butyrolacton, γ-butyrolacton en pivalolacton, 30 en α-hydroxyboterzuur, a-hydroxyisoboterzuur, a-hydroxyvaleriaanzuur, a-hydroxyisovaleriaanzuur, a-hydroxycapronzuur, α-hydroxyisocapronzuur, a-hydroxy-B-methylvaleriaanzuur, a-hydroxyheptaanzuur, a-hydroxidecaanzuur, α-hydroxymyristinezuur en a-hydroxystearinezuur. Bevoorkeurde homo- en copolyesters zijn die die afgeleid zijn van melkzuur in zijn D-, L- of DL-vorm, en van glycolzuur en van de daarmee overeenkomende dimeren lactide en glycolide, en een bevoorkeurde, eventuele ketenonderbreker Is 35 melkzuur.

Hoewel een geneesmiddel dat een macromoleculair, basisch peptide is, geheel of ten dele als polymeer kation kan optreden, en een polyester geheel of ten dele als polymeeranion kan bestaan, gaat de zoutvorming ten gevolge van die zuur-base-wisselwerkingen tussen polymere soorten, bij het gewone mengen en bij gebruik van organische oplosmiddelen, uiterst moeilijk of zelfs helemaal niet. Bijvoorbeeld is het mengen 40 van de twee bestanddelen in de smelt ongeschikt, daar bekend is dat peptiden normaliter niet smelten, maar eerder bij die hoge temperaturen ontleden. Maar ook waar het peptide zou smelten (wat het niet doet) zou het reeds om thermodynamische redenen niet verenigbaar zijn met of niet oplosbaar zijn in een homo-of copolyester.

Peptiden zijn macromoleculen en hebben dus vele van de voor gebruikelijke polymeren typerende 45 eigenschappen. Ze zijn dus (bij afwezigheid van bepaalde chemische of fysische inwerkingen) totaal onverenigbaar met of onoplosbaar in andere macromoleculen met een andere chemische structuur of een ander skelet, daar de vrije energie bij het mengen van twee onderling verschillende types polymeer sterk positief is, en thermodynamisch dus niet begunstigd wordt. De massa van peptiden is sterk polair met sterke waterstofbindingen, waardoor de enthalpie van het mengen van peptiden met homo- of copolyester (die 50 betrekkelijk niet-polair zijn en waarin waterstofbindingen afwezig of zwak zijn) sterk positief is, en dus endotherm en thermodynamisch niet begunstigt. Verder hebben macromoleculen, die per definitie groot zijn, bij mengen een lage entropie, waardoor de mengentropie van twee verschillende soorten macromoleculen erg laag of zelfs negatief is. Zie bijv. blz. 555 van P.J. Florey, "Principles of Polymer Chemistry”, (Cornell Universiteit, 1953), L. Bohn, "Polymer Handbook” (2® druk, J. Wiley & Sons, 1975) op blz. 211, en L. Bohn, 55 in "Rubber Chemistry and Technology”, (1966) blz. 493). Het bij hoge temperatuur in gesmolten toestand mengen van een peptide met een polyester zal er dus helemaal niet toe leiden dat op moleculaire schaal mengen optreedt.

195056 4

Gewoon bij elkaar doen van een peptide en een polyester leidt dus niet tot zoutvorming.

Net zulke moeilijkheden treden op als men zouten uit peptiden en polyesters tracht te vormen in organische oplosmiddelen, tenzij het peptide in dat oplosmiddel enige oplosbaarheid of althans zwelbaar-heid heeft. De oplösbaarheidseigenschappen van de polyesters en de peptiden zijn totaal verschillend.

5 Vloeistoffen waarin het peptide oplost, zoals water, zijn volkomen niet-oplosmiddelen voor de polyester, en vloeistoffen die voor polyesters in het algemeen goede oplosmiddelen zijn, zoals methyleenchloride, nemen van het peptide helemaal niets op. Die oplosmiddelen die zowel het peptide als de polyester opnemen, zoals dimethylsulfoxide, dimethylformamide, dimethylaceetamide en N-methylpyrrolidon, geven weer andere problemen, omdat ze niet bijster vluchtig zijn, hoge kookpunten hebben, en dus uiterst moeilijk te verwijde-10 ren zijn, en ook hebben sommige van die vloeistoffen een onaanvaardbare giftigheid. Het is mogelijk gebleken voor beide bestanddelen bepaalde oplosmiddelen aan te wijzen die vluchtiger en toxicologisch aanvaardbaar zijn, maar zulke oplosmiddelen bieden weer andere problemen. Bijvoorbeeld lost azijnzuur zowel peptiden als polyesters op, maar het gebruik van een grote hoeveelheid zuur brengt het peptide (door de chemische massawerking) tot het bestaan als acetaat (zout), zodat verwijdering van het azijnzuur bij 15 kamertemperatuur (zo 20-25°C) of door vriesdrogen tot fasenscheiding tussen peptide en polyester leidt, en het gewenste zout niet gevormd wordt.

De bereiding van de peptide-polyester-zouten volgens deze uitvinding kan uitgevoerd worden door gebruik te maken van hom- of copolyesters met carboxyl-groepen en peptiden waarvan de basische groepen als vrije basen of als zouten van een zwak zuur optreden, bij voorkeur van een vluchtig zuur en 20 met een dissociatieconstante kleiner dan 10'3 of met een pKa groter dan 3 (pK* = -10log l^, waarbij Ka voor de dissociatieconstante staat). Een bijzonder bevoorkeurd peptidezout is het zout met azijnzuur. Maar vanwege de inherente onverenigbaarheid van de twee soorten macromoleculen moeten bij het genereren van deze peptide-polyester-zouten heel bepaalde omstandigheden ingesteld worden.

Een manier om dat te bereiken is een oplosmiddel te gebruiken waarin het peptide en de polyester beide 25 oplossen, en uit welke oplossing het oplosmiddel direct verwijderd kan worden, waarbij of ten eerste het antipathische zout of ten tweede een mengsel van polyester en peptide achterblijft in een fysische toestand die voorbestemd is om bij verder verwerken het antipathische zout te geven.

Een voorbeeld van de eerste benadering is het gebruik van oplosmiddelen zoals dimethylsulfoxide, dimethylformamide, dimethylaceetamide en N-methylpyrrolidon (maar niet die alleen) die in wezen neutraal 50 zijn en waarin zowel het peptide als de polyester oplossen. Onder normale omstandigheden, zoals hierboven aangegeven, zijn deze oplosmiddelen, door hun hoge kookpunten en doordat ze betrekkelijk weinig vluchtig zijn, uiterst moeilijk te verwijderen. Als een peptide (bijvoorbeeld als acetaat) en een polyester in één van deze oplosmiddelen opgenomen wordt kan het peptide met de sterkere zuurgroep van melkzuur of glycolzuur een zout vormen, daar de sterkere zuurgroep het zwakkere carbonzuur uit het zout 35 verdringt. De massa van het oplosmiddel en het vrijgemaakte azijnzuur (of ander zwak maar vluchtig carbonzuur) kunnen onder vacuüm verwijderd worden en de oplossing die men overhoudt wordt aan gedestilleerd water toegevoegd, zodat het onoplosbare polymere zout neerslaat.

Het gedestilleerde water is bij voorkeur vrij van koolzuur, om de vorming van carbonaten door verdringing van de polyester als anion te voorkomen. Resten oplosmiddel kunnen dan uit het peptide-polyester-zout 40 verwijderd worden door dat verder met water uit te wassen, dat bij voorkeur ook vrij van koolzuur is. In sommige gevallen kan het polymere zout door direct neerslaan in water geïsoleerd worden, zonder dat het nodig is enig oplosmiddel te verwijderen, en die benadering is vooral nuttig indien het peptide als base gebruikt wordt.

Deze werkwijze voor het bereiden van een zout uit een basisch peptide en een op carboxy eindigende 45 polyester, houdt in dat men het peptide, in de vorm van de vrije base of van een zout met een zwak zuur, bijvoorbeeld met azijnzuur, en de op carboxy eindigende polyester oplost in een neutraal polair oplosmiddel waarin beide oplosbaar zijn, het oplosmiddel of het meeste daarvan verwijdert, en de overgehouden geconcentreerde oplossing toevoegt aan een overmaat niet-oplosmiddel voor het peptide-polyester-zout.

De tweede benadering, die ook berust op het gebruik van een oplosmiddel waarin zowel het peptide als 50 de polyester oplosbaar zijn, berust er op dat dat oplosmiddel door invriezen en gebruikelijk vriesdrogen, of door sproeidrogen te verwijderen is. Een wezenlijk deel van die werkwijze is het verwijderen van het oplosmiddel uit het mengsel met peptide en polyester op uiterst snelle wijze, bijna momentaan en bij voorkeur bij een temperatuur beneden het glasovergangspunt van de polyester en het peptide. In dit geval kan het oplosmiddel neutraal of zuur zijn, en een bevoorkeurd oplosmiddel is azijnzuur.

55 Zulk uiterst snel verwijderen van het oplosmiddel uit een oplossing die tot op zekere hoogte viskeuze stroming of visco-elastisch gedrag vertoont leidt tot een fasenscheiding van de twee niet met elkaar te verenigen types macromoleculen op een uiterst kleine, kolloïdale schaal. D.w. z. het ontstaande peptide- 5 195056 polyester-mengsel heeft een uiterst hoge oppervlaktespanning en een hoge oppervlakte-energie. Ten gevolge daarvan zal, als een ander oplosmiddel voor de polyester, welke normaliter het peptide niet zal oplossen, aan peptide-polyester-mengsels van dit type (die in wezen vrij van oplosmiddel zijn) toegevoegd wordt de hoge oppervlakte-energie door zoutvorming dissiperen en zal de kolloTdale aard van het peptide in 5 de polyester verdwijnen. Geschikte oplosmiddelen voor deze tweede benadering moeten door vriesdrogen of door sproeidrogen te verwijderen zijn, en daartoe behoren, onder meer, azijnzuur, dioxaan/water-mengsels en tert-butanol/water-mengsels.

Meer in het bijzonder wordt bij deze werkwijze de oplossing van het peptide en het polymelkzuur, of van een copolymeer van melkzuur en glycplzuur druppelsgewijs toegevoegd aan vloeibare stikstof. Dat leidt tot 10 een meer of minder momentaan invriezen van de azijnzuur-oplossing, en de meer of minder momentane vorming van een in wezen oplosmiddelvrij mengsel van peptide en polyester. Vriesdrogen ter verwijdering van het azijnzuur leidt tot een peptide-polyester-product dat op uiterst fijne, kolloTdale schaal vermengd is.

Bij vele peptiden wordt de kolloTdale aard van zulk materiaal aangetoond als een oplosmiddel voor de polyester toegevoegd wordt, bijvoorbeeld methyleenchlorlde, dat dan een uiterst fijne kolloTdale suspensie 15 geeft, en uiteindelijk kan er, als men het mengsel laat staan, een heldere oplossing verkregen worden, mits er in het mengsel een overmaat aan carbonzuur-functies was, waarbij de overmaat aan oppervlakte-energie verloren gaat bij de vorming van het peptide-polyester-zout. Andere procedures om het mengsel van peptide, polyester en azijnzuur momentaan in te vriezen kunnen toegepast worden in plaats van het druppelsgewijs toevoegen van vloeibare stikstof, bijvoorbeeld het druppelen van het mengsel in een 20 combinatie van vast koolzuur en hexaan.

Hypothetisch kan de totaal onoplosbare stof natuurlijk oplosbaar gemaakt worden als die zich tot uiterst fijne deeltjes laat verkleinen. Indien aangenomen wordt dat het deeltje een bol met een straal r en een dichtheid σ is, met een oppervlakte-energie γ, dan zal zo’n deeltje een oppervlakte-energie 4πή hebben.

Ook zal het een massa 4/3. π3σ hebben, zodat de oppervlakte-energie per eenheid aan massa 3nr/ar is.

25 Laten wij nu twee gevallen van verzadigde oplossingen in beschouwing nemen: (i) als de overmaat vaste stof uiterst grof is en dus weinig oppervlakte-energie heeft en de verzadigde oplossing een concentratie C8 heeft dan Is de vrije energie (volgens Gibbs: G1 oplossing = G0 + RTInCe = G1^ (ii) als de overmaat vaste stof in de vorm van erg kleine deeltjes met straal r is is de vrije energie van de 30 oplossing (volgens Gibbs) in evenwicht met die uiterst fijne deeltjes:

G oplossing = + RTInC

maar in dat geval heeft de vaste stof een vrije energie van G’vast + “"'er, en G2op,ossing - Go + RTInC + G1TOSt + ^or, 35 of G’va,, + G0 = RTInC - 3reT/or.

Maar uit (i) volgt dat G’vast - G0 = RTInCg, en dus G0 + RTInC - ^/cr = G0 + RTIn Ce, 40 of C - Ce.e3*7<rr zodat (in theorie) C toeneemt als r afneemt.

In het normale geval is een hogere oplosbaarheid dan normaal ten gevolge van de kleinheid der deeltjes metastabiel, en groeien de deeltjes, bijvoorbeeld door oplossen en herkristalliseren, zodat het effect van de hogere oppervlakte-energie teniet gedaan wordt. Maar in de kleine deeltjes van peptide-polyester-mengsels 45 kan zoutvorming optreden, en dat betekent een andere manier om de oppervlakte-energie van de kolloTdale deeltjes te verlagen door de vorming van een oplosbaar amfipathisch zout, welke als oplossing de laagste vrije energie heeft.

Het zout gevormd uit een kation afgeleid van een peptide met ten minste één basische groep en een anion afgeleid van een op carboxy eindigende polyester kan ook worden bereid met een werkwijze waarbij 50 men het basische peptide in de vorm van een zout met een sterk zuur (zoals het chloride of het sulfaat) laat reageren met alle of een deel van de polyester in de vorm van een zout met een geschikt alkali- of aardalkalimetaal, bijvoorbeeld met een natrium-, kalium-, calcium- of magnesiumcarboxylaat. Voor polyesters van laag molecuulgewicht (bijvoorbeeld beneden 10.000) kunnen de alkalimetaal-zouten in water oplossen of althans heel fijn verdeeld worden. Het toevoegen van zo’n oplossing of dispersie aan een 55 waterige oplossing van het polypeptide (bij voorkeur vrij van koolzuur) leidt tot het neerslaan van het in water onoplosbare, amfipathische peptide-polyester-zout.

Evenzo kunnen de chloriden of sulfaten van "gepegyleerde” basische peptiden (de polyoxyethyleen- 195056 6 conjugaten van peptiden) gedeeltelijk verenigbaar met of oplosbaar zijn in oplosmiddelen zoals methy-leenchloride, en de natrium· of kalium-zouten van op carboxy eindigende polyesters kunnen in methy-leenchloride ook oplosbaar zijn. Dus als twee zulke zouten in geëigende verhoudingen met elkaar gemengd worden ontstaat door dubbele ontleding het oplosbare peptide-polyester-zout, terwijl het alkalimetaalchloride 5 of-sulfaat neerslaat

De hierboven genoemde thermodynamische onverenigbaarheid van verschillende macromoleculen was al vele jareri bekend, maar is in de stand der techniek van het langzaam afgeven van peptiden uit polyestermatrices zelden in beschouwing genomen. Een noodzakelijke consequentie van deze thermodynamische onverenigbaarheid, oftewel onoplosbaarheid, is dat polyesters onder normale omstandigheden voor 10 zulke peptiden totaal ondoordringbaar zijn. Voor van de verdeling afhankelijke diffusie van een peptide volgens Fick door een polyester moet het peptide enige oplosbaarheid in de polyester hébben. Maar wegens de bovengenoemde oorzaken kan dat hier niet het geval zijn, en dus is transport van het peptide door de polyester ten gevolge van de van verdeling afhankelijke diffusie van Fick onmogelijk.

Maar als, zelfs alleen maar bij wijze van spreken, het peptide of één van zijn synthetische analoga enige 15 oplosbaarheid In of verenigbaarheid met de polyester had, dan zou transport door de polyester ten gevolge van-diffusie nog onmogelijk zijn. Reeds lang is onderkend dat het vrije volume in de polyester, ten gevolge van rotaties en verplaatsingen van de polyester-segmenten, waardoor moleculen er doorheen kunnen diffunderen, onvoldoende is voor het door diffusie doorlaten van macromoleculen met molecuulgewichten groter dan ongeveer 500 of zo (zie bijv. R.W. Baker en H.K. Lonsdale, ’’Controlled Release: Mechanisms 20 and Rates” in ’’Controlled Release of Biologically Active Agents” onder redactie van A. C. Tanquary en R.E. Lacey (Plenum Press, 1974) biz. 15 e.v.).

Maar hoewel transport van een peptide door een polyester ten gevolge van de diffusie van Fick in wezen onmogelijk is met peptiden groter dan ongeveer 500 Da of zo is continue afgifte van de polypeptiden desalniettemin bereikt. Het Europese octrooischrift nr. 58. 481 laat zien hoe continu afgeven van een 25 peptide uit een polyester bereikt werd door de zeer verschillende eigenschappen van de twee macromoleculen te benutten; peptiden zijn hydrofiel en in water oplosbaarzen de polyesters zijn hydrofoob en in water onoplosbaar. Bij de in dat octrooischrift beschreven formuleringen werd afgifte van peptiden voornamelijk bereikt door de waterige poriën, die aanvankelijk gevormd worden door het peptide eenvoudigweg uit de oppervlaktegebieden van de formulering uit te logen, of uit peptidegebieden die continu met het oppervlak 30 van de formulering doorlopen. Dit uitlogen is een eerste fase van het afgeven, en hydrolytische afbraak van de polyester leidt tot de vorming van nog meer poriën in de polyester, en aldus kan nog meer peptide vrijkomen, wat door afbraak en erosie bepaald wordt. Als de porositeit ten gevolge van hydrolytische afbraak van de polyester niet snel genoeg optreedt is het aanvankelijke vrijkomen ten gevolge van uitlogen afgelopen voordat voldoende door afbraak veroorzaakte porositeit in het afgevende systeem gevormd wordt, 35 en dan ziet men een discontinu afgeven van het peptide. De parameters van de in EP 58.481 beschreven formuleringen waren daarom zodanig gekozen dat hydrolytische afbraak van de polyester te julstertijd in verband met het aanvankelijke uitlogen optreedt, zodat men er zeker van is dat de twee fasen van het vrijkomen elkaar overlappen, wat tot een continu vrijkomen van het peptide leidt.

Hoewel transport van een peptide door de polyesterfase ten gevolge van de diffusie van Rek in het geval 40 van die eenvoudige peptide-polyester-mengsels onmogelijk is is er in het geval van formuleringen van peptide-polyesterzouten volgens deze uitvinding, eventueel in aanwezigheid van vrij polymeer, een totaal andere situatie. In formuleringen die deze stoffen bevatten is er geen afzonderlijke fase van alleen polyester; de continue fase die het vrijkomen van het peptide bepaalt is eerder geheel of gedeeltelijk het peptide-polyester-zout zelf. Vrij peptide heeft enige oplosbaarheid In deze fase van peptide-polyester-zout 45 en dus kan bij het formuleren van zulke stof echte van de verdeling afhankelijke diffusie van Fick optreden, mits aan de andere eisen, zoals een voldoende vrij volume, voldaan, is.

Doordat het peptide-polyester-zout een sterk hydrofiel segment heeft nemen de peptide-polyester-zoutformuleringen veel meer water op dan de polyester alleen. Verder is in deze formuleringen de wateropname nog verder versterkt door de ionogene aard van de wisselwerking tussen peptide en polyester 50 en door de solvatatie van ionen of ionenparen in dat macromoleculaire zout door water. Dat houdt in dat het peptide-polyester-zout in wezen een hydrogel is, en dat schept meer beweeglijkheid van de macromoleculaire segmenten van dit polykation-polyanioncomplex. Dat betekent dat het vrije volume van het matrix in feite groter is en dat een macromoleculair peptide er dus in past.

Het netto effect van deze eigenschappen van het peptide-polyester-zout (eventueel in aanwezigheid van 55 vrij polymeer) is dat diffusietransport van een macromoleculair peptide door de matrix van peptide-polyester-zout of van mengsel van zout met vrij polymeer mogelijk is. Dat is een totaal andere situatie dan die men met polyester alleen heeft, of met enkelvoudige mengsels van peptiden en polyesters, en dus staan 7 195056 matrices of membranen op basis van verhoogde doorlaatbaarheid ten gevolge van het gebruik vein peptide-polyester-zouten aan de basis van formuleringen voor de hierna in de beschrijving te beschrijven beheerste afgifte van peptiden.

De peptide-polyester-zouten volgens deze uitvinding bieden dus nieuwe en onverwachte voordelen bij 5 het ontwerpen van systemen voor het parenteraal afgeven van geneesmiddelen, op basis van oplossingen of dispersies van diverse mengsels van vrije peptiden, vrije polyesters en van peptide-polyester-zouten, zowel in waterige als in niet-waterige, farmaceutisch aanvaardbare injectiebases, en op basis van onderhuidse implantaten, welke intramusculair of subcutaan geTnjiceerd of geïmplanteerd kunnen worden, en dat dankzij de nieuwe en onverwachte oplosbaarheid van deze peptiden bevattende brokstukken in lipofiele 10 systemen. Verder kunnen formuleringen op basis van deze peptidepolyester-zouten, in het bijzonder die met sterk lipofiele polyesters, ook langs andere routes toegediend worden. Vein bijzonder belang is de orale route, waarbij de diverse combinaties van peptide-polyester-zout en/of vrij peptide en/of vrije polyester ook , met goed effect ingezet kunnen worden. In vele gevallen heeft het bij oraal toedienen de voorkeur een farmaceutisch aanvaardbare drager zoals een plantaardige olie of variant daarvan te gebruiken, en 15 daaronder vallen ook mono-, dien triglyceriden, al dan niet met andere oliën gemengd. Van minder belang zijn de plaatselijk op te brengen en de rectaal en intranasaal in te brengen preparaten.

Buiten het reeds besproken Europese octrooischrift nr. 58.481 (van 1982) vormen Lawter c. s. (loc. dt.) en Okada c. s. (loc. cit.) de enige stand der techniek die aanvragers van dit octrooi kennen en waarin de mogelijkheid van het verkrijgen van peptide-polyester-zouten genoemd is, maar deze beide publikaties zijn 20 slechts speculatief doordat zij niet aangeven hoe de beweerde wisselwerking gerealiseerd of benut zou kunnen worden. Het is nog een doel van deze uitvinding farmaceutische formuleringen met verlengde afgifte te verschaffen, welke diverse combinaties van peptide-polyester-zout en/of vrij peptide en/of vrije polyester in diverse verhoudingen bevatten om tot ten minste drie verschillende profielen van beheerste afgifte van geneesmiddel te komen.

25 Het ontwerp van de farmaceutische preparaten volgens deze uitvinding berust op de volgende ovenwegingen. Terwijl een eenvoudig peptide normaliter in water oplosbaar is, zijn zowel zijn zout met een polyester als de vrije polyester zelf normaliter totaal in water onoplosbaar (hoewel men zal onderkennen dat zeer korte oligomere polyesters en copolyesters, die zelf in water onoplosbaar zijn, in de vorm van peptide-zouten wel in water oplosbaar kunnen zijn). Maar incuberen van een mengsel van peptide-30 geneesmiddel met polyester, waarvan al het peptide of een deel daarvan als zout met polyester aanwezig is in fysiologische vloeistoffen leidt tot enige afbraak van de polyester. Als deze gedegradeerde producten in water onoplosbaar zijn blijft het afbrekende peptide-polyester-zout voortgaan onoplosbaar te zijn. Als de polyester aan de andere kant aanvankelijk van voldoend laag molecuulgewicht is of een polymeer bestanddeel van even laag of net zo laag molecuulgewicht bevat, zodat in water oplosbare, van de 35 polyester afgeleide zure fragmenten gevormd worden, dan zijn deze fragmenten (als anionen) samen met het polypeptide (het kation) mee te transporteren. Aangetoond is dat bij de nieuwe peptide-polyester-zout-preparaten volgens deze uitvinding, dat het direct beginnen van het vrijkomen sterk afhankelijk is van het molecuulgewicht en van de molecuulgewichtsverdeling van de polyester.

De molecuulgewichtverdeling wordt gedefinieerd als

Aft Mui

Mn waarb'i (naar gewicht gemiddeld . , v SW,. Μ) Σπι · Mp molecuulgewicht) = —=-= -=—— 2w, Ση,. M, 45 en Mn (naar getal gemiddeld molecuulgewicht) = en waarbij w, de gewichtsfractie aan polymeermoleculen met molecuulgewicht M, en n, het aantal polymeer-moleculen met molecuulgewicht M, is.

De molecuulgewichtsverdeling wordt ook wel de ’’polydispersiteit” genoemd en de diverse invullingen voor nauwe, normale, meest waarschijnlijke én ruime verdeling zijn welbekend (zie bijvoorbeeld de 2e druk van 50 "Polymer Handbook”, J. Wiley & Sons, 1975, IV-3). Een polydispersiteit kleiner dan 1,8 wordt algemeen aanvaard als een nauwere verdeling of lagere polydispersiteit, 1,8 tot 2,2 is normaal, de meest waarschijnlijke verdeling of normale polydispersiteit, en met meer dan ongeveer 2,2 heeft men een brede verdeling of hoge polydispersiteit.

Voor het parenteraal toedienen van genezende peptiden, door intramusculaire of subcutane injectie of met 55 een subdermaal implantaat, hebben polyesters met een naar getal gemiddeld molecuulgewicht boven 2000, oftewel met een inherente viscositeit van een 1 gew. % oplossing in chloroform bij 25°C, gelijk aan of groter 195056 8 dan 0,08 dl/g, en tot en met 4,0 dl/g de voorkeur. Voor het toedienen langs andere routes, bijvoorbeeld oraal, is het bevoorkeurde traject van naar getal gemiddeld molecuulgewicht 500 tot 5000.

Uit bovenstaande overwegingen, die bij de stand der techniek genegeerd werden, is het duidelijk dat afbraak van de polyesters, vooral in aanwezigheid van een basisch peptide, tot een klein aantal in water 5 oplosbare fragmenten, en de tijd waarin dat optreedt bepaald zullen worden door het molecuulgewicht en de verdeling van het molecuulgewicht. In wezen directe afbraak treedt op, tot in water oplosbare fragmenten van polyesters met naar getal gemiddeld molecuulgewicht beneden ongeveer 10.000 als tot die met molecuulgewichten beneden ongeveer 15.000 (afhankelijk van het type van de molecuulgewichtsverdeling), maar in het algemeen geldt: hoe lager de polydispersiteit van de polyester hoe lager het naar getal 10 gemiddelde molecuulgewicht dat nodig is voor een directe afbraak tot in water oplosbare fragmenten. Met polyesters met naar getal gemiddelde molecuulgewichten boven 15.000 zijn normale of brede verdelingen nodig. Opnieuw is dat ten dele afhankelijk van de aard en het type van de molecuulgewichtsverdeling, maar in het algemeen geldt: hoe hoger het naar gewicht gemiddelde molecuulgewicht, hoe hoger de polydispersiteit moet zijn om een vroege afbraak tot in water oplosbare fragmenten te bereiken.

15 Met polyester- en peptide-preparaten waarin al het of een deel van het peptide in de vorm van een peptidepolyester-zout is, dat eventueel nog vrije polyester bevat, kan men drie verschillende afgifteprofielen hebben. De eerste daarvan heeft men als er afbraak van de polyester optreedt zodat er in wezen direct zure, in water oplosbare of althans hydrofiele fragmenten ontstaan, wat tot de directe afgifte van peptide volgens het volgende mechanisme leidt: 20 Pn'.D+ 5S22S Pn_1'.D+ + P —> P,^ + P\D+ —> peptide komt vrij polymeer/peptidezout dat onoplosbaar in water is waarvan P een in waarin PO* een in water oplosbaar of water oplosbaar hydrofiel fragment, geneesmiddel is en P^ 25 maar Pp./D* in water is een in water onoplosbaar is onoplosbaar afgebroken polymeer (P = in water oplosbaar, afgebroken polyester-fragment, of een hydrofiel in water onoplosbaar polyester-30 fragment dat in water oplosbaar is in de vorm van een zout met het basische peptide.

D = basisch peptide).

In het eerste geval kan het preparaat al het geneesmiddel als peptide-polyester-zout bevatten, maar ook kan het naast het peptide-polyester-zout enig vrij, niet gebonden geneesmiddel bevatten, en in beide 35 gevallen is er eventueel ook wat vrij polymeer. Maar dat polymeer breekt in aanwezigheid van peptide tot in water oplosbare fragmenten af, bijna meteen, met als consequentie dat er bijna direct een lang aanhoudend afgeven van peptide begint.

Opgemerkt moet worden dat de diffusie van het vrije, in water oplosbare peptide door het afbrekende preparaat vergemakkelijkt wordt door de verhoogde doorlaatbaarheid van het matrix ten gevolge van de 40 aanwezigheid van het peptide-polyester-zout in de continue fase, hetgeen het vrijkomen beïnvloedt

Het tweede van deze gevallen treedt op als als het genezende peptide als zout met polyester aanwezig is (eventueel in aanwezigheid van wat vrije polyester, maar de polyester breekt niet meteen tot in water oplosbare fragmenten af. Dat leidt tot een aanlooptijd in het begin, gedurende welke er geen peptide vrijkomt. Ook al geeft het peptide-polyester-zout een hogere doorlaatbaarheid van de matrix voor vrij 45 diffunderend peptide, is er geen vrij peptide voor die diffusie beschikbaar. Al het peptide is in de vorm van een in water onoplosbaar peptide-polyesterzout, en pas na een duidelijk merkbare tijd breekt de polyester tot in water oplosbare fragmenten af en ontstaat er vrij en transporteerbaar geneesmiddel. Dat leidt tot een zekere aanlooptijd, gedurende welke er geen peptide is om af te geven, en na die aanlooptijd begint de afgifte. Dit tweede geval is ideaal voor een pulserende afgifte over een zekere tijd van oplosbare vaccins en 50 peptiden.

Het derde geval is er als een formulering op basis van een peptide-polyester-systeem is, met peptide zowel in vrije vorm als in de vorm van een zout, en eventueel ook in aanwezigheid van enige vrije polyester, waarvan de polyester een naar gewicht gemiddeld molecuulgewicht boven ongeveer 15.000 (en bij voorkeur boven ongeveer 30.000) en een nauwe of meest waarschijnlijke molecuulgewichtsverdeling heeft, in een 55 fysiologische omgeving geplaatst wordt, zodat men die bij in intramusculaire en subcutane injecties vindt; dan treedt er een discontinue afgifte op. Een eerste fase van de afgifte treedt op door de aanwezigheid van wat vrij peptide, en dankzij de mogelijkheid door het beter doordringbare peptide-polyester-systeem 9 195056 getransporteerd te worden. Als deze eerste fase van de afgifte van het vrije peptide voltooid is voordat afbraak van de polyester van dat peptide-polyester-zout optreedt, en er nog meer vrij peptide ontstaat, dan zal een discontinue afgifte van het peptide het gevolg zijn.

Als er geen tussenpauze optreedt, gedurende welke vrij peptide tijdens de afbraak van de polyester 5 aanwezig is, dan treedt er natuurlijk continue afgifte op. Zo’n afgifteprofiel lijkt op dat wat in het Europese octrooischrift nr. 58.481 geopenbaard is, maar het mechanisme van de afgifte uit de producten volgens dat Europese octrooischrift nr. 58.481 en de gebruikte materialen (geen peptide-polyester-zout) zijn heel verschillend van het mechanisme dat nu optreedt en van de materialen die men volgens deze uitvinding gebruikt. Afhankelijk van het afgifteprofiel zijn deze mengsels ideaal voor een continue afgifte van peptiden, 10 eiwitten en oplosbare vaccins.

Zoals hierboven als gesteld zijn deze peptidepolyester-zoutsystemen, hun fysisch-chemische eigenschappen en het mechanisme waarmee afgifte van het peptide optreedt, sterk verschillend van wat in de Europese octrooien nr. 58.481 en 52.510 genoemd is, en ook verschillend van alles wat er al gepubliceerd is over het vrijkomen van peptiden uit homo- en copolymeren van melkzuur en glycolzuur, althans voor 15 zover uitvinder dezes weet. Hiervan noemen alleen het Europese octrooischrift nr. 58.481 van Lawter c.s. (loc. cit.) en Okada c.s. (loc. cit.) op enige wijze de zoutvorming ten gevolge van Ionische wisselwerking tussen de carboxyl-groepen van polyesters en de basische aminozuren in de peptiden, maar de eerder beschreven preparaten bevatten geen zouten van geneeskrachtige peptiden met polyesters. Deze eerdere beschrijvingen zijn bovendien in dit opzicht speculatief, en de conclusie dat zulke wisselwerkingen inderdaad 20 optreden wordt er niet in getrokken, en ook wordt er niet in aangetoond hoe zulke peptide-polyester-zouten gevormd en geïsoleerd worden, en daarna toegepast voor de afgifte van peptiden, met een zekere verscheidenheid in afgifteprofielen, dankzij hun onverwachte oplosbaarheid in lipofiele organische oplosmiddelen.

Onder de kenmerken van de peptide-polyestermengsels die dit afgeven mede bepalen, en die tot nog toe 25 niet genoemd zijn, zijn het aantal basische groepen van het peptide en het aantal carboxyl-groepen van de polyester. De bovengenoemde publikaties zwijgen ook over de opmerkelijke en onverwachte effecten van het gebruik van de peptidepolyester-zouten en over de verrassend hoge doorlaatbaarheid van systemen die geheel of ten dele dat peptidepolyester-zout bevatten, vergeleken met de doorlaatbaarheid van de polyester alleen, of van mengsels waarin die twee bestanddelen eenvoudig gemengd zijn en die dus geen peptide-30 polyester-zout bevatten.

Het verschil in doorlaatbaarheid kan met eenvoudige proeven met diffusiecellen aangetoond worden, waarbij een continu polyestermembraan vrij van gebreken, dat twee watercompartimenten van elkaar scheidt, de ene met de peptide-oplossing en de andere met alleen waterfase, geen peptide zal doorlaten voordat er een duidelijke afbraak van het polyestermembraan optreedt. Daarentegen zullen membranen die 35 geheel of ten dele het peptide-polyester-zout bevatten transport van genezend peptide door het zout bevattende membraan doorlaten ten gevolge van de van de verdeling afhankelijke diffusie, zelfs als het peptide een molecuulgewicht boven 500 heeft.

De peptide-polyester-zouten volgens deze uitvinding kunnen nog vele andere verrassende en nuttige voordelen bieden, die bij de materialen volgens de stand der techniek niet bekend waren, en die vooral 40 nuttig zijn bij het ontwerpen en maken van farmaceutische, afgevende systemen. Eén van de nuttigste van deze eigenschappen is de goede oplosbaarheid van het peptide, in de vorm van een polyester-zout, in organische oplosmiddelen waarin peptiden normaliter totaal onoplosbaar zijn. Dit geeft heel veel voordelen voor de farmaceutische praktijk, waarbij nieuwe werkwijzen en procedures gebruikt worden voor het maken van geneesmiddelen afgevende systemen, en vooral vergemakkelijkt het de aseptische bereiding. Deze 45 werkwijzen en procedures, en de gebruikte materialen, zijn totaal verschillend van de procedures en materialen volgens de stand der techniek.

Oplossingen van peptide-polyester-zouten, die eventueel nog vrij polymeer en/of vrij peptide in opgeloste of gedispergeerde vorm bevatten, kunnen dus steriel gefiltreerd worden wat de normaliter moeilijke fabricage van steriele formuleringen van vaste of suspensie-preparaten vergemakkelijkt. Een steriel 50 gefiltreerde oplossing van een peptide-polyester-zout kan dus uiteenlopende farmaceutische manipulaties in een aseptische omgeving ondergaan. Sproeidrogen, sproeistremmen en andere droogprocedures die vaste deeltjes geven zijn bevoorkeurde werkwijzen die zich goed voor aseptische uitvoering lenen.

Bijzonder nuttig is het maken van microdeeltjes met deeltjesgrootten tussen 0,2 pm en 500 pm, die in een farmaceutisch aanvaardbare injectiedrager gesuspendeerd kunnen worden. Zulke microdeeltjes kunnen 55 voor gebruik in een waterig injectiemedium gesuspenderd worden, of anders in een organisch injectle-medium dat voor de gebruikte stoffen geen oplosmiddel is. Nog andere afgiftesystemen op basis van homo-en copolymeren van melkzuur en glycolzuur, die als zodanig bruikbaar zijn, zijn sterk lipofiele oliën, zoals 195056 10 ethyloleaat, isopropylmyristaat, plantaardige olie en diverse vetzuurglyceriden (maar niet die alleen). Onder bepaalde omstandigheden verdient het de voorkeur mengsels van zulke lipofiele dragers te gebruiken.

Hoewel zulke lipofiele dragers geen oplosmiddelen zijn voor de afgiftevormen op basis van melkzuur en glycolzuur zijn ze ongeschikt voor de sterk lipofiele esters, zoals die op basis van hydroxyzuren met lange 5 ketens, bijvoorbeeld hydroxystearinezuren. Met zulke sterk lipofiele polyesters en copolyesters hebben heterofiele organische injectiemedia de voorkeur, zoals propaandiol en polyethyleenglycol van laag molecuulgewicht (maar niet die alleen).

Het is duidelijk dat waterige injectiedragers ook geschikt zijn als afgiftesystemen op basis van sterker lipofiele polymeren. , 10 Bij een andere manier om microdeeltjes te maken past men een andere onverwachte en voordelige eigenschap van de peptide-polyester-zouten volgens de uitvinding toe.

Het peptide-polyester-zout bevat een hydrofiel peptide dat thermodynamisch de voorkeur aan een , waterfase of polaire fase om zich heen de voorkeur zou geven, en uit een polymeerketen die hydrofoob is en thermodynamisch in een hydrofobe fase zou willen oplossen. D.w.z. het peptidepolyester-zout is 15 amfipathisch en heeft oppervlak-actieve eigenschappen die in de eenvoudige peptide-zouten niet optreden. Deze~oppervlakt&activiteit leidt er toe dat het peptide-polyester-zout bij voorkeur in het scheidingsvlak der fasen zit en vanwege de algemene aard van het zout (gewichtsaandeel en lengte van de hydrofobe keten) is het thermodynamisch meest stabiele type dispersie in een in hoofdzaak uit water bestaande fase bij deze peptide-polyester-zouten die van dispersie in water (daar de kritieke micel-concentratie erg laag is en niet al 20 het zout onder vele omstandigheden in het scheidingsvlak kan zitten).

Men ziet dus dat het peptide-polyester-zout een uiterst doeltreffend dispersiemiddei is bij het maken en stabiel handhaven van waterige dispersies. Bij deze tweede procedure voor het maken van farmaceutische microdeeltjesformuleringen wordt de peptide-polyester-oplossing (bijvoorbeeld in methyleenchloride) eenvoudig in een waterfase gedispergeerd, welke eventueel een viscositeit verhogend polymeer zoals 25 polyvinylalkohol bevat (maar niet dat alleen) waarbij men de oppervlakte-activiteit van het peptide-polyester-zout benut. Hoewel sommige organische oplossingen die zulke peptide-polyester-zouten bevatten spontaan kunnen dispergeren zijn als regel enig roeren of enige afschuifkrachten nodig bij het aanmaken van waterige dispersies.

Een ander bevoorkeurd aspect van de werkwijze is, zoals hierboven al aangegeven, het zodanig 30 uitvoeren van de bewerkingen dat de waterige dispersie doeltreffend onder inerte atmosfeer en vrij van kooldioxide blijft. Verder verdient het de voorkeur dat de organische oplossing van het peptide-polyester-zout vrij van kooldioxide blijft, omdat de concentratie van lucht en water asm kooldioxide onder normale omstandigheden voldoende hoog is, vergeleken met de concentraties aan polyester en aan carboxyl-groepen, om concurrerende zoutvorming ten gevolge van de chemische massawerking 35 P\D+ + HC03- ±5 D+.HCCV + P

te laten optreden, waarbij P voor polyester en D voor peptide staat. De waterige dispersies die dan ontstaan kunnen met een verscheidenheid van technieken gedroogd worden, zoals verwijderen van het organische oplosmiddel onder vacuüm, gevolgd door vriesdrogen, en het direct verwijderen van zowel oplosmiddel als water In één enkele bewerking. Het ontstane product kan dein gebruikt worden om op de 40 hierboven beschreven wijze geschikte farmaceutische injectiepreparaten te maken.

Bij een andere manier om farmaceutische microdeeltjespreparaten te maken gebruikt men een in wezen droge oplossing van het peptide-polyester-zout in een geschikt organisch oplosmiddel of drager, dat kolloTdaal gedispergeerd vrij peptide bevat. (De term ”in wezen droog” wordt gebruikt omdat het in feite onmogelijk is alle sporen water uit het peptide te verwijderen, en verder houdt het in dat helemaal geen 45 genezend peptide als waterige oplossing, als afzonderlijke waterfase aanwezig is). Het onder krachtig roeren toevoegen van een niet-oplosmiddel voor het polymeer, gevolgd door het toevoegen van het met oplosmiddel gezwollen peptide-polyester-zout (dat eventueel vrij polymeer en eventueel vrij geneesmiddel bevat) aan een grote hoeveelheid tweede niet-oplosmiddel, om de neergeslagen microdeeltjes verder uit te harden en te stabiliseren, leidt tot de uiteindelijke vorm. Natuurlijk kan het neerslaan van de microdeeltjes 50 onder geëigende omstandigheden of bij aanwezigheid van geschikte oppervlak-actieve stoffen, zoals de vetzuuresters van sorbitol (maar niet die alleen) het neerslaan van de microdeeltjes uitgevoerd worden in één enkel niet-oplosmiddel voor de polyester, bijvoorbeeld in een paraffien zoals hexaan.

De met de hier beschreven diverse werkwijzen gemaakte microdeeltjes zijn in structuur totaal verschillend van de volgens de Europese octrooischriften nr. 52.510 (van Syntex) en nr. 145.240 (van Takeda) 55 gemaakte microcapsules, waarbij de peptiden in een fase van polyester alleen ingekapseld worden. Microcapsules worden gedefinieerd als één of meer kernen van de verbinding of de stof binnen een continue tweede fase, zodat een continue bekleding van tweede fase het kernmateriaal totaal omsluit of ”op 11 195056 microschaal inkapselt” en waarbij geen materiaal aan het oppervlak van de microcapsules zit, zodat het op microschaal ingekapselde kernmateriaal in alle opzichten de fysischchemische en thermodynamische eigenschappen van het niet ingekapselde kernmateriaal behoudt

Zo wordt volgens het Europese octrooischrift nr. 52.510 een coacervatie met fasenscheiding toegepast 5 om druppeltjes verdunde peptide-oplossing zodanig te bekleden dat het polymeer alleen maar een continue bekleding rondom de waterige druppeltjes vormt. D.w.z. dit zijn echte microcapsules, die vorm en geometrie van microbolletjes hebben. Na het isoleren van de neergeslagen microcapsules en het uitharden en drogen werd een product verkregen waarin het geneeskrachtige peptide een afzonderlijke kern of een aantal kernen in een polymere omhulling vormen.

10 Vanwege de aanwezigheid van water in het binnenste van de microcapsules voordat men die droogt gaat het ontwateren bij een temperatuur beneden het glasovergangspunt van het polymeer, wat kan leiden tot een geperforeerd deeltje. In geen fase houden de volgens het Europese octrooi nr. 52.510 te gebruiken werkwijze en materialen een peptide-polyesterzout in, en met de daar onthulde werkwijze is geen steriele filtratie van zo’n peptide-polyester-oplossing of -suspensie mogelijk (als er asept'sche bereiding gewenst is). 15 Verder gebruikte men volgens dit eerdere octrooi polyesters op basis van melkzuur en/of glycolzuur, beschreven in het Amerikaanse octrooischrift nr. 3.773.919 van Boswell, die beschreven worden als bij 25°C in benzeen oplosbaar. Volgens onderhavige uitvinding hebben in benzeen onoplosbare polyesters, op basis van melkzuur en/of glycolzuur, welke in chloroform oplosbaar zijn, de voorkeur voor betrekkelijk korte afgiftetijden, van zeg zo minder dan twee maanden.

20 Volgens het Europese octrooi nr. 190.833 (van Takeda) werd het peptide ingesloten als gegeleerde waterige oplossing van het geneesmiddel, en werd die gegeleerde waterfase in een polymeer-oplossing gedispergeerd. Deze waterige dispersie van gel in olie werd daarna zelf onder afschuifkrachten in water gedispergeerd, tot een dubbele water-in-olie-in-water-dispersie. Na verwijdering van het organische oplosmiddel onder vacuüm of door vriesdrogen had men microcapsules waarin de combinatie van 25 geneesmiddel en gelmiddel alleen door het polymeer omhuld was. De producten van die werkwijze behouden het geneesmiddel als eenvoudig zout, en niet als zout met een polymeer. De farmaceutische preparaten volgens deze uitvinding hebben dus structuren, fysisch-chemische eigenschappen en thermodynamische eigenschappen die totaal verschillend zijn van die van de producten volgens de Europese octrooischriften nr.’s 52.510,145.240 en 190.833, waarvan de microcapsules de vorm en geometrie van 30 microbolletjes hebben, waarvan hun geneesmiddelkern of -kernen totaal omhuld worden door polymeer alleen.

De producten volgens deze uitvinding kunnen ook de geometrie en de vorm van microbolletjes hebben (maar niet van die alleen), of zijn helemaal geen microbolletjes zoals hierboven gedefinieerd of het zijn eerder oplossingen van peptide-polyester-zout (met eventueel wat vrij polymeer) of het zijn microbolletjes 35 waarin het vrije peptide omhuld wordt door een continue fase van polymeer-peptide-zout, dat eventueel ook nog wat vrij polymeer bevat. Zoals hierboven al aangegeven zijn de doorlaatbaarheidseigenschappen van zulke polymeer-peptide-zouten totaal verschillend van die van vrij polymeer alleen, zodat de producten volgens deze uitvinding hun genezende peptide afgeven op een wijze die totaal verschillend is van wat eerder in de Europese octrooischriften nr.’s 52.510,145.240 en 190.833 beschreven is.

40 Een andere uitvoeringsvorm van de uitvinding is dus of de bereiding van microbolletjes die geen microcapsules zijn (waarbij men een oplossing van het peptide-polyester-zout heeft die eventueel vrij polymeer bevat) of de bereiding van microbolletjes die microcapsules zijn maar vrij geneesmiddel bevatten dat omhuld wordt door een fase of bekleding van peptide-polyester-zout, dat eventueel vrij polymeer bevat Zulke diverse deeltjes kunnen gemaakt worden met een verscheidenheid van methoden zoals neerslaan, 45 coacerveren met fasenscheiding, sproeidrogen en sproeikoelen. De bevoorkeurde deeltjesgrootte gaat van 0,2 pm tot 500 pm, en die deeltjes kunnen in een geschikt injectiemedium als suspensie geïnjiceerd worden.

Bijzonder doeltreffende en nuttige parenterale formuleringen van de genezende peptiden kunnen ook gemaakt worden in de vorm van oplossingen van peptide-polyesterzout, die eventueel vrije polyester en ook eventueel gedispergeerd of in oplossing gebracht vrij geneesmiddel bevatten, in een farmaceutisch 50 aanvaardbaar organisch oplosmiddel dat een oplosmiddel voor de vrije polyester is, maar niet voor de peptiden en voor de eenvoudige zouten daarvan, zoals de chloriden en acetaten.

Een volgens de uitvinding bereid farmaceutisch preparaat dat een geneeskrachtig peptide en een polyester bevat, voor een langdurige afgifte van het geneeskrachtige peptide, is geschikt in de vorm van een oplossing met daarin: 55 (a) een basisch geneeskrachtig peptide, zoals hierboven reeds gedefinieerd, met een molecuulgewicht van ten minste 300 en bij voorkeur van ten minste 800, in de vorm van een zout met de polyester, welk zout een van het basische peptide afgeleid kation en een van het op carboxy eindigende polyester afgeleid 195056 12 anion, (b) een farmaceutisch aanvaardbaar organisch oplosmiddel dat een oplosmiddel voor de vrije polyester maar niet voor het vrije peptide is, (c) een overmaat polyester en eventueel 5 (d) een overmaat vrij peptide in opgeloste of kolloldaal gedispergeerde vorm.

Geschikte basische peptiden en op carboxy eindigende polyesters zijn hierboven gedefinieerd en in het bijzonder bevoorkeurde peptiden zijn de hierboven genoemde LHRH-analoga.

Voor peptide-polyester-zouten waarvan de polyester op basis van homo- en copolymeren van melkzuur en glycolzuur is, geschikte, farmaceutisch aanvaardbare organische oplosmiddelen zijn benzylbenzoaat, 10 benzylalkohol, ethyllactaat, glyceroltriacetaat, esters van citroenzuur en polyethyleenglycolen van laag molecuulgewicht (<1000), alkoxypolyethyleenglycolen, de polyethyleenacetaten, enz. (maar niet die alleen) en daaronder hebben benzylbenzoaat en benzylalkohol de voorkeur, vooral benzylbenzoaat.

De enige eis aan zo’n organisch oplosmiddel is dat het farmaceutisch aanvaardbaar is en dat het polyesterpeptide-zout er in oplost. Of één zo’n oplosmiddel gebruikt wordt of niet of een mengsel van zulke 15 oplosmiddelen, de geschiktheid van zulke oplosmiddelen is vlot met eenvoudige proefjes vast te stellen. Homo- en copolymeren van melkzuur en glycolzuur behoren tot de sterkst polaire en meest lipofobe polyesters en zullen dus niet in zulke organische injectieoplosmiddelen als ethyloleaat, plantaardige oliën e.d. oplossen, maar homo- en copolymeren op basis van lipofiele monomeren en comonomeren of op basis van lipofiele hydroxyzuren zoals hydroxystearinezuur, zijn in zulke lipofiele oplosmiddelen oplosbaar.

20 De verhouding van geneeskrachtig peptide tot polyester in de vaste stoffen die tot oplosmiddelpreparaten volgens de uitvinding opgelost worden zal natuurlijk variëren met de sterkte van het peptide als geneesmiddel, de aard van de gebruikte polyester en de tijd waarover men afgifte van het peptide verlangt

Het bevoorkeurde gehalte tot welke men het geneeskrachtige peptide opneemt ligt tussen 0,1 en 30 gew.%. In het algemeen is de beste belading met geneesmiddel afhankelijk van het molecuulgewicht van 25 de polyester en van zijn molecuulgewichtsverdeling, van de gewenste duur van de afgifte en van de-sterkte van het peptide. Het is duidelijk dat bij peptiden van lage geneeskracht hogere gehalten nodig zijn.

De opname van water door het preparaat is een belangrijke factor bij het in de hemd houden van de hydrolytische afbraak van de polyester, en het tempo van de wateropname kan tot op zekere hoogte bepaald worden door belading van het preparaat met geneesmiddel. In het geval dat een betrekkelijk snel 30 afgeven van het geneesmiddel over betrekkelijk korte tijd gewenst wordt, zeg over drie maanden, is belading met tot 30 gew.% peptide geëigend.

De monomeersamenstelling van een copolyester, bijvoorbeeld de verhouding van lactide tot glycolide in polyesters uit melkzuur en glycolzuur, is ook belangrijk voor het tempo van de polyesterafbraak en het vrijkomen van het peptide. De duur van dit vrijkomen wordt ten dele ook bepaald door het gemiddelde 35 molecuulgewicht van de polyester, maar de hoeveelheid peptide die als zout van geneesmiddel met polyester opgenomen kan worden wordt door het naar getal gemiddelde molecuulgewicht bepaald. D.w.z. de polydispersiteit (verhouding van naar gewicht gemiddeld tot naar getal gemiddeld molecuulgewicht) is een belangrijke parameter.

Voor het afgeven van geneeskrachtig peptide over 1 tot 4 maanden hebben preparaten met polyesters 40 met naar gewicht gemiddeld molecuulgewicht tussen 4000 en 20.000 en met een polydispersiteit tussen 1,2 en 2,2 en met een peptide-gehalte van 0,1 tot 30% de voorkeur. In het algemeen moet de polydispersiteit van de polyester hoger zijn en moet het naar gewicht gemiddelde molecuulgewicht kleiner zijn naarmate de polydispersiteit van de polyester kleiner zijn. Voor langere afgiftetijden, zeg zo van 2 tot 6 maanden, heeft het de voorkeur beladingen met peptide tussen 0,1 en 20% en polyesters met naar gewicht gemiddelde 45 molecuulgewichten tussen 8000 en 20.000 en polydispersiteiten tussen 1,5 en >2,2 te gebruiken. Voor nog langere afgiftetijden dan 6 maanden hebben peptidebeladingen tussen 0,1 en 10% de voorkeur, waarbij men polyesters met naar gewicht gemiddeld molecuulgewicht tussen 20.000 en 50.000 en met polydispersiteiten >1,8 gebruikt.

De totale belading van het preparaat volgens de uitvinding met peptide-polyester-zout zal natuurlijk 50 variëren, afhankelijk van de geneeskrachtige sterkte van het peptide, de tijd waarover afgifte van het peptide gewenst wordt, de oplosbaarheid van de vaste stof in het gekozen oplosmiddel en volume en viscositeit van het oplosmiddelpreparaat dat men wil toedienen.

De viscositeit van het vloeibare preparaat volgens de uitvinding wordt bepaald door de molecuulgewichten van polyester en peptide. In het algemeen zijn oplossingen die meer dan ongeveer 40% vaste stof 55 (peptide-polyester-zout en vrij peptide of vrije polyester) en waarvan de polyester een naar gewicht gemiddeld molecuulgewicht >8000 heeft, wegens hun viscositeit moeilijk door injectie toe te dienen.

Bij deze polyesters hebben oplossingen van < 40 gew.% dus de voorkeur. Voor preparaten die 13 19505$ polyesters met naar gewicht gemiddeld molecuulgewicht van ongeveer 8000 tot ongeveer 20.000 hebben hebben concentraties van < 30 gew.% de voorkeur, en voor oplossingen met polyesters met molecuulge-wichten van ongeveer 20.000 tot ongeveer 50.000 hebben concentraties van < 20% de voorkeur. In sommige gevallen hebben oplossingen van erg lage viscositeit de voorkeur, bijvoorbeeld als men het 5 preparaat door een erg dunne naald wil injiciëren, en men kan de concentratie verlagen tot 2 gew. % of minder, maar er zal natuurlijk een balans moeten zijn tussen de verlagen van de viscositeit en een vergroting van het volume dat men dan moet injiciëren.

In nog een ander aspect verschaft deze uitvinding een werkwijze voor het bereiden van een preparaat volgens de uitvinding, bestaande uit 10 1. het oplossen van een innig mengsel van het basische peptide en de polyester in een farmaceutisch aanvaardbaar oplosmiddel, of 2. het langzaam toevoegen van een oplossing van het peptide in een alkanol met 1-6 C aan een oplossing van de polyester in een voor injectie geschikt oplosmiddel, waarna het hydroxy-oplosmiddel, als het niet farmaceutisch voor injectie aanvaardbaar is, door verdamping verwijderd wordt, als het hydroxy-oplosmiddel 15 farmaceutisch wel voor injectie aanvaardbaar is, hoeft het niet verwijderd te worden.

Het bij de eerste werkwijze hierboven gebruikte innige mengsel van basisch peptide en polyester wordt bij voorkeur verkregen door het basische peptide en de polyester in een mengsel van vloeistoffen op te lossen, waarin zowel het basische peptide als de polyester kunnen oplossen, en dat voor vriesdrogen geschikt is. Geschikte voorbeelden van zulke oplosmiddelen en mengsels van oplosmiddelen zijn ijsazijn en 20 mengsels van dioxaan met water, en zulke oplossingen laten zich vriesdrogen. Alternatief kunnen de twee bestanddelen in bijvoorbeeld dimethylsulfoxide opgelost worden, dat later verwijderd wordt

Het innige mengsel kan ook verkregen worden door het geneeskrachtige peptide in een hydroxy-oplosmiddel op te nemen, bijvoorbeeld in methanol, en deze oplossing dan aan een oplossing van de polyester (bijvoorbeeld in methyleenchloride) op te lossen, gevolgd door verwijdering van de oplosmiddelen, 25 bijvoorbeeld door verdamping.

Alternatief kan de waterige oplossing van het geneeskrachtige peptide als chloride toegevoegd worden aan een waterige oplossing of dispersie van het natrium-zout van de polyester, en wordt het mengsel gevriesdroogd tot een mengsel van peptide-polyester-zout en natriumchloride.

Dat laatste kan desgewenst verwijderd worden door het product met een organisch oplosmiddel te 30 mengen en het onoplosbare natriumchloride af te filtreren.

Bij de eerste werkwijze kan het oplossen van het innige mengsel in het farmaceutisch aanvaardbare oplosmiddel versneld worden door dat mengsel te verhitten en/of te roeren. Bij de tweede werkwijze is een geschikt oplosmiddel voor het peptide bijvoorbeeld methanol, ethanol of propaandiol-1,2.

Een belangrijk voordeel van de farmaceutische peptide-producten in de vorm van oplossingen van 35 polyesterpeptide-zouten met eventueel nog vrij peptide en/of nog vrije polyester is dat de bereiding van een injiceerbaar product in steriele vorm, voor direct gebruik zonder dat men het preparaat voor het toedienen eerst moet aanmaken, met steriel filtreren kan gebeuren. Dat is een veel eenvoudiger bewerking dan het steriliseren van een vaste stof of een suspensie. Een andere werkwijze voor het bereiden van steriele injectieoplossingen is het oplossen van een steriel polyester-peptide-zout, dat eventueel nog vrij peptide of 40 vrije polyester bevat, in een farmaceutisch aanvaardbaar organisch oplosmiddel.

Hoewel deze formuleringen in de eerste plaats voor parenterale toediening bedoeld zijn kan het peptide-polyester-zout volgens de uitvinding ook in de vorm van oraal toe te dienen formuleringen gemaakt worden.

Een heel ander type formulering, dat geïnjiceerd of subdermaal geïmplanteerd kan worden is een 45 geneesmiddel afgevend systeem op basis van implantaten of mengsels van verschillende types implantaat. Deze kunnen uit de peptidepolyester-zouten volgens de uitvinding, die eventueel nog vrij peptide of vrije polyester bevatten, met gebruikelijke technieken uit de polymeersmelt gemaakt worden, zoals extrusie, het persen tot pillen en injectiegieten, waarbij hogere temperaturen (bij voorkeur beneden 100°C) voor het smelten van het peptide-polyester-zout toegepast worden (maar niet de genoemde methoden alleen). Het 50 bereiden van zulke implantaten kan onder aseptische omstandigheden gebeuren, maar ook kan men aan het einde van de bereiding door bestraling steriliseren, wat niet tot γ- of röntgenstralen beperkt Is. De vaste doseringsvormen kunnen door verpoederen of vermalen tot microdeeltjes verkleind worden.

De bevoorkeurde deeltjesgrootte loopt van 1 pm tot 500 pm, en deze microdeeltjes, die noch micro-bolletjes noch microcapsules zijn, kunnen in een gebruikelijke en geschikte, farmaceutisch aanvaardbare 55 injectiedrager gesuspendeerd worden.

Het uit de smelt verwerken van de peptide-polyester-zouten belichaamt een significant en zeer belangrijk verschil tussen de fysisch-chemische en thermodynamische eigenschappen van de peptide-polyester-zouten 195056 14 volgens de uitvinding en de vrije peptiden en eenvoudige zouten daarvan. De peptide-polyester-zouten volgens deze uitvinding zijn in vele gevallen te smelten en vloeien, zulks anders dan de vrije peptiden en hun eenvoudige zouten, zoals de chloriden en acetaten, welke bij hogere temperatuur niet smelten maar ontleden.

5 Afbraak van polyesters is ten dele afhankelijk van hun molecuulgewicht en hun polydispersiteit. Het is duidelijk dat opdat hydrolyse van de ester-groepen optreedt de polyester van een farmaceutische formulering water op moet nemen. Voor die systemen waarvan het afgiftebepalende matrix of membraan geheel of ten dele uit peptide-polyester-zout bestaat of dat bevat zal er een hogere wateropname door het bepalende matrix of membraan zijn dan door polyester alleen. Continue matrixfasen of membranen die 10 peptidepolyester-zouten bevatten breken dan ook anders af dan continue matrixfasen of membranen die alleen uit polyester bestaan. Men zal ook begrijpen dat de diffusie van water of fysiologische vloeistoffen door dergelijke beheersende polyestermatrices of membranen het tempo van afbreken geheel of ten dele zullen bepalen. Deze diffusie van water of fysiologische vloeistof wordt ook beheerst door de vorm en de afmetingen van de formulering, en dus is het vrijkomen van geneesmiddel uit preparaten die polymere 15 zouten van polypeptiden en polyesters bevatten ook van die factoren afhankelijk.

Van bijzonder belang als polyester-bestanddelen van de zouten volgens deze uitvinding zijn die op basis van homo- en copolymeren van melkzuur en glycolzuur, waarvan het melkzuur in optisch actieve of racemische vorm kan verkeren. Polyesters van dat algemene type zijn al vele j aren bekend en zijn in uiteenlopende systemen met beheerste afgifte van het geneesmiddel in detail onderzocht (zie bijvoorbeeld 20 "Controlled Release of Bioactive Agents from Lactide/Glycolide Polymers" van D.H. Lewis in "Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems”, onder redactie van M. Chasin & R. Langer, (Marcel Dekker) en de daarin genoemde literatuur).

Bijvoorbeeld beschrijft het Amerikaanse octrooischrift nr. 3.773.919 in brede termen dat farmaceutische formuleringen van lactide-polyesters en -copolyesters met daarin tegen microben werkende polypeptiden, 25 met beheerste afgifte bereid zouden kunnen worden. Maar de daarin genoemde antimicrobiêle peptiden voldoen niet goed voor het vormen van polyester-zouten doordat het sulfaten zijn, of doordat ze andere eigenschappen hebben die de vorming van peptide-polyester-zouten afremmen of voorkomen. Inderdaad gebeurt, bij het nawerken van de in dat octrooischrift gegeven voorbeelden, het mengen van het peptide (ongeacht de aard daarvan) met een polymeer bij verhoogde temperatuur, wat tot een katastrofale afbraak 30 van het peptide leidt

Evenzo wordt in het Europese octrooischrift nr. 25.698 het tegen microben werkende polypeptide colistine als één van de vele verbindingen genoemd die met polylactide te formuleren zou zijn, maar opnieuw heeft die verbinding structuuraspecten die zoutvorming met de eindstandige carboxy-groepen van de polyester voorkomen. Colistine wordt alleen als coiistinesulfaat of -methosulfaat gebruikt, die geen van 35 beide de vorming van amfipathische zouten met de polyesters volgens deze uitvinding mogelijk maken. Andere eerdere publikaties die het gebruik van polypeptiden met biologisch afbreekbare polymeren op basis van homo- en copolymeren van melkzuur en glycolzuur beschrijven zijn de eerder genoemde Europese octrooischriften nr.’s 52.510, 58.481,145.240 en 190.833.

Hoewel copolymeren van melkzuur en glycolzuur al vele jaren bekend zijn heeft men over de effecten 40 van hun ingewikkelde structuur, wat de verdeling van de comonomeereenheden en de homogene stukken in de ketens (stukken met één enkel monomeer, dus niet willekeurig) en de effecten van zulke structuurvariatie op het gebruik als geneesmiddel afgevende matrices betreft, in de eerdere publikaties niet onder ogen willen zien. Deze copolymeer-structuur bepaalt, althans ten dele, zowel de oplosbaarheid als de zwelbaar· heid van het polymeer in oplosmiddelen zoals benzeen, alsmede het tempo van de afbraak daarvan. Dit 45 verband werd het eerste opgemerkt door Hutchinson (in Europees octrooischrift nr. 58.481) maar dat is bij onderhavige uitvinding verder uitgewerkt en beter bekeken.

Om dit punt toe te lichten laat het Amerikaanse octrooischrift nr. 3.773.919 bepaalde formuleringen met beheerste afgifte zien, waarbij men 50/50-copolyester van melkzuur en glycolzuur gebruikt die in benzeen oplosbaar is, en inderdaad is dit Amerikaanse octrooischrift wat de melkzuur/glycolzuur-copolymeren betreft 50 in hoofdzaak beperkt tot die die in benzeen oplosbaar zijn. De toepasbaarheid van deze in benzeen oplosbare copolyesters is verder versterkt door het specifieke gebruik daarvan dat in het Europese octrooischrift nr. 52.510 beschreven is. Maar eerder waren 50/50-copolyesters uit melkzuur en glycolzuur die in benzeen oplosbaar zijn bekend uit het Amerikaanse octrooischrift nr. 2.703.316 (met de zelfde eigenaar als het Amerikaanse octrooi nr. 3.773.919). Daar deze twee octrooien de zelfde eigenaar hadden 55 (duPont), mag men aannemen dat de in het laatste octrooischrift beschreven, in benzeen onoplosbare copolymeren in één of ander opzicht inferieur waren aan die die in benzeen oplosbaar waren. Die gedachte wordt versterkt door het Europese octrooischrift nr. 52.510, waarin alleen de in benzeen oplosbare 15 195056 copolymeren volgens het Amerikaanse octrooi nr. 3.773.919 gebruikt werden.

Behalve in ons eigen Europese octrooischrift nr. 58.481 is in eerdere publikaties het effect van de structuur van copolyesters van melkzuur en glycolzuur op hun oplosbaarheid en biologische afbreekbaarheid uit de weg gegaan. Wij hebben aangetoond dat voor polyesters van vergelijkbaar molecuulgewicht en 5 vergelijkbare molecuulgewichtsverdeling in de meeste gevallen het volgende algemene verband opgaat bij esters die bij 25°C in chloroform oplosbaar zijn: in benzeen onoplosbare polyesters breken sneller af dan polyesters die met benzeen zwellen maar er niet in oplossen, en zulke met benzeen zwellende polyesters breken sneller af dan de polyesters die goed in benzeen oplosbaar zijn, mits die afbraakproeven uitgevoerd worden in fysiologische vloeistoffen of in buffers met pH = 7,4 bij 37°C. Het is dan ook bijzonder nuttig in 10 benzeen onoplosbare polyesters te gebruiken voor een continue afgifte van peptiden uit die parenterale formulering over betrekkelijk korte tijden, zo van 1 week tot 2 maanden.

Dus geldt wat de polyester-samenstelling en het verband daarvan met structuur, viscositeit en polydisper-siteit betreft het volgende voor peptide-preparaten met 0,1 tot 75 gew.% peptide.

Voor het bereiden van peptide-polyester-zouten die volgens deze uitvinding geformuleerd kunnen worden 15 tot continu over 1 week tot 2 maanden geneesmiddel afgevende systemen loopt de molaire samenstelling van zulke in benzeen onoplosbare polyesters, met bij voorkeur een brede tot normale polydispersiteit, bij voorkeur van 60% glycolzuur (of glycolide) en 40% melkzuur (of lactide) tot ongeveer 25% glycolzuur (of glycolide) met 75% melkzuur (of lactide), en zulke polyesters hebben bij voorkeur in chloroform bij 25°C een inherente viscositeit tussen 0,08 en 4,0 dl/g.

20 Bij geschikte keuze van de polyester-parameters, waaronder het molecuulgewicht en de molecuulgewichtverdeling, is het ook mogelijk continue afgifte van de polypeptiden over 1 week tot 2 maanden uit formuleringen volgens de uitvinding te bereiken, waarbij men melkzuur-homopolymeren en -copolymeren met een samenstelling van 35% glycolzuur (of glycolide) met 65% melkzuur (of lactide) tot 10% glycolzuur (of glycolide) met 90% melkzuur (of lactide), gebruikt die in benzeen oplosbaar zijn, bij 1% 25 in chloroform van 25°C een inherente viscositeit van 0,08 tot 0,5 dl/g en een nauwe tot brede polydispersiteit hebben.

Continue afgifte van peptiden over een langere tijd, zeg zo van 2 tot 6 maanden, uit formuleringen volgens deze uitvinding kan bereikt worden met samenstellingen met 35% glycolzuur (of glycolide) en 65% melkzuur (of lactide) tot 0% glycolzuur (of glycolide) en 100% melkzuur (of lactide), welke in benzeen 30 oplosbaar zijn, bij 1% in chloroform van 25°C, een inherente viscositeit tussen 0,08 en 0,8 dl/g hebben en een nauwe tot brede polydispersiteit vertonen.

Continu afgèven van peptiden over heel lange tijden, zeg zo van 2 jaar, uit formuleringen volgens deze uitvinding, kan bereikt worden uit melkzuur-homopolymeren en -copolymeren met 25% glycolzuur (of glycolide) en 75% melkzuur (of lactide) tot 0% glycolzuur (of glycolide) en 100% melkzuur (of lactide), welke 35 in benzeen oplosbaar zijn en bij 1% in chloroform van 25°C een inherente viscositeit tussen 0,2 en 4,0 dl/g en een normale tot hoge polydispersiteit hebben.

Gefaseerde of pulserende afgifte (met een wachttijd voordat het afgeven begint) of discontinue afgifte (met een beginfase in de afgifte gevolgd door een tijd waarover weinig of niets vrijkomt, gevolgd door een tweede afgiftefase) over betrekkelijk korte tijd, zeg zo tot 2 maanden toe, kan bereikt worden met formulerin-40 gen volgens deze uitvinding die in benzeen oplosbare polymeren met een nauwe tot meest waarschijnlijke molecuulgewichtverdeling en bij 1% in chloroform van 25°C een inherente viscositeit tussen 0,3 en 4,0 dl/g hebben.

Nog een ander aspect van deze uitvinding, dat nieuw is en de uitvinding van alle eerder beschreven systemen met een beheerste afgifte van het geneesmiddel op basis van polyesters of copolyesters 45 onderscheidt, en waarmee het tempo van afgeven verder in de hand te houden is, is de mate waarin het preparaat met peptide als polyester-zout beladen wordt, eventueel in aanwezigheid van vrij peptide of vrij polymeer. Dit nog andere beheersende aspect verschilt geheel van die parameters die bij gebruikelijke afgiftesystemen op basis van polyesters het afgiftetempo beheersen; die zijn gericht op het afgeven van sterk iipofiele geneesmiddelen met betrekkelijk lage oplosbaarheid in water, zoals steroTden. In die gevallen 50 ziet men in het algemeen een hoger tempo van afgeven naarmate het gehalte aan geneesmiddel toeneemt, zelfs als de wateropname van zulke systemen met een toenemend volume van de Iipofiele geneesmiddel-fase omlaag gaat. In feite is het afgiftetempo van geneesmiddelen zoals steroTden afhankelijk van het geneesmiddel dat zijn thermodynamische aard behoudt en van de kinetica van de eenvoudige diffusie volgens Fick (zie Baker en Lonsdale, loc. cit.). D.w.z. met toenemende belading met geneesmiddelen zoals 55 steroTden en met enige oplosbaarheid van dat Iipofiele geneesmiddel in het Iipofiele polymeer gaat de eenvoudige diffusie volgens Fick omhoog.

Een totaal andere situatie krijgt men echter met de producten volgens deze uitvinding. Nu wordt 195056 16 onderkend dat een belangrijke component van de afbraak van de polyesters en copolyesters de hydrolyse der ester-groepen is, en het tempo waarin dat optreedt is afhankelijk van de opname van water (zie Pitt en Zhong-wei Gu in J. Controlled Release 4 (1987) 283-292; Hutchinson en Furr in idem, 13 (1990) 279-294. Peptiden zijn hydrofiel en hun zoutvorming met polyesters leidt tot een peptide-polyester-zout bevattende 5 fase met een hogere wateropname dan de polyester alleen. D.w.z. dat de polyester-keten in het zout sneller kan afbreken dan in het vrije polyester alleen bij een zelfde samenstelling, molecuulgewicht en polydispersi-teit. Daar het afgeven van het peptide sterk van de afbraak afhankelijk is wordt het vrijkomen ten dele bepaald door zowel de beladingsgraad van het preparaat met peptidepolyester-zout als door het peptide-aandeel van dat zout. Bij polyesters en copolyesters van de zelfde samenstelling en structuur leidt 10 verhoging van één van deze beide parameters tot een hoger afgiftetempo, en dat kan - onder bepaalde omstandigheden - de tijd waarover dit afgeven optreedt beperken. Gehalten aan peptide, hetzij als peptide-polyester-zout hetzij als peptide-polyester-zout in combinatie met vrij peptide, lopen bij voorkeur van 0,1 gew.% tot 75 gew.% van de formulering.

De belading van het preparaat volgens de uitvinding met peptide en de variatie daarvan met het 15 molecuulgewicht van de polyester en met de polydispersiteit is als volgt. Voor continue afgifte van het peptide over lange tijden, van zo tot 2 jaar toe, hebben lage gehalten aan geneesmiddel, van 1,0% tot 20 gew.%, en polyesters met een molecuulgewicht van 20.000 of hoger en polydispersiteiten boven 2,2 (bij voorkeur boven 3,5) de voorkeur. Deze parameters voor afgifte over heel lange tijden hangen ook ten dele van andere aspecten van zo'n formulering af, zoals gehalte aan comonomeer, structuur, oplosbaarheid of 20 onoplosbaarheid in benzeen en vormgeving en afmetingen van de doseringsvormen. Een polyester met naar gewicht gemiddeld molecuulgewicht van ongeveer 20.000 heeft een inherente viscositeit van ongeveer 0,2, afhankelijk van zulke factoren als structuur, samenstelling en polydispersiteit

Voor een continu afgeven over betrekkelijk lange tijden, van zo tot 6 maanden toe, lopen de gehalten aan geneeskrachtig peptide bij voorkeur van 0,5% tot 35 gew.%, gebruikt men bij voorkeur polyesters of 25 copolyesters met naar gewicht gemiddeld molecuulgewicht van 10.000 of hoger en polydispersiteiten boven 1,8 en bij voorkeur boven 2,2, ook nog afhankelijk van andere parameters zoals samenstelling, structuur, oplosbaarheid of onoplosbaarheid in benzeen, en vorm en afmetingen van de doseringsvormen.

Voor continue afgifte over betrekkelijk korte tijd, zeg zo tot 2 maanden toe, lopen de gehalten aan peptide bij voorkeur van 0,1% tot 75 gew.%, gebruikt men bij voorkeur polyesters met een naar gewicht 30 gemiddeld molecuulgewicht van 2000 of hoger en polydispersiteiten boven 1,2, alles afhankelijk van andere parameters zoals samenstelling, structuur, oplosbaarheid of onoplosbaarheid in benzeen en vorm en afmetingen van de doseringsvormen.

Nog een andere parameter die het vrijkomen van peptiden uit formuleringen volgens deze uitvinding bepaalt en die in eerder bekende afgiftesystemen op basis van homo- en copolymeren van melkzuur en 35 glycolzuur niet optreedt is de functionaliteit van het peptide, wat het aantal basische groepen zoals arginine-en lysine-residuen in het peptide betreft, en de functionaliteit van de polyester of copolyester wat het gemiddelde aantal carboxyl-groepen per gemiddelde polymeer- of copolymeerketen betreft. In het algemeen moet voor een continue afgifte van het peptide de mate van polyfunctionele wisselwerking tussen peptide en polyester in het zout groter en de polydispersiteit hoger zijn. Daarentegen heeft voor discontinue of 40 doserende afgifte een polydispersiteit beneden 2,2 de voorkeur.

Eén van de betrekkelijk zeldzame gevallen dat wederzijdse verenigbaarheid of oplosbaarheid van twee types polymeer met verschillende chemische structuur optreedt ziet men bij mengsels vein polyesters op basis van homo- en copolymeren van melkzuur en glycolzuur met polyoxyethylenen van laag molecuulgewicht, en vooral met polyethyleenglycolen met laag molecuulgewicht. Deze verenigbaarheid is bij deze 45 uitvinding op nieuwe en onverwachte wijze goed toegepast in de peptide-polyester-zouten en hun bereiding. Zo is het bekend dat bepaalde farmacologisch werkzame peptiden "gepegyleerd” kunnen zijn, d.w.z. geconjugeerd met een polyethyleenglycol of een alkoxypolyethyleenglycol, zodanig dat de farmacologische werkzaamheid van het peptide behouden blijft. De aanwezigheid in het gepegyleerde peptide van de geconjugeerde polyoxyethyleen-keten maakt het gepegyleerde peptide gedeeltelijk verenigbaar met de 50 polyesters of copolyesters.

Zo vergemakkelijkt deze verenigbaarheid de bereiding van de peptide-polyester-zouten en geeft het nog een element voor het in de hand houden van het vrijkomen, mits de overblijvende lysineen arginine-resten van het gepegyleerde peptide als zouten van zwakke zuren optreden. Farmacologisch werkzame conjugaten van peptiden met andere in water oplosbare polymeren, zoals polysacchariden, synthetische polypepti-55 den en polyvinylpyrrolidon, zijn soms ook nuttig, maar hebben minder voorkeur, daar geen van deze laatste in water oplosbare polymeren in de polyester of copolyester oplosbaar of daarmee verenigbaar is.

De uitvinding kan ook toegepast worden op peptiden die farmacologisch werkzaam zijn en of neutraal 17 195056 zijn of een sterke neiging hebben voornamelijk als polyanionen op te treden (polypeptiden met een overmaat aan carboxyl-functies). In de eerste van deze gevallen (een farmacologisch werkzaam neutraal polypeptide dat noch zure noch basische resten heeft) wordt een polyester gebruikt en een synthetisch polypeptide dat een basische functie heeft en farmacologisch onwerkzaam is. Zo’n zout van farmacologisch 5 onwerkzaam synthetisch polypeptide met polyester of copolyester is ook amfipathisch en kan dus dienen tot het dispergeren, solubiliseren of kolloïdaal dispergeren van een farmacologisch werkzaam maar neutraal peptide in een organische fase.

In het tweede van die gevallen (waarbij het farmacologisch werkzame polypeptide nog resten car-boxylfuncties heeft) wordt een zout van een polyester of copolyester met een synthetisch polypeptide met 10 ten minste twee basische groepen gebruikt dat farmacologisch onwerkzaam is. In dit tweede geval is de concentratie in het zout van het synthetische polypeptide met de polyester aan functionele basische groepen groter dan de concentratie aan carboxylgroepen in het farmacologisch werkzame, zure peptide. Die . overmaat basische functies kan in het zout dan verder reageren onder vorming van nog meer zout met carboxylgroepen van het zure, farmacologisch werkzame peptide. De aldus ontstane zouten kunnen dan in 15 een organisch oplosmiddel of organische fase (die normaliter het peptide in kwestie totaal niet oplost maar de polyester of copolyester wel) op de hierboven voor andere peptide-polyester-zouten beschreven wijze gesolubiliseerd of gedispergeerd worden.

Omdat zouten van peptiden met basische functionaliteit met polyesters of copolyesters met carboxyl-functionaliteit amfipathisch zijn kan hun oppervlakte-activiteit gebruikt worden om het dispergeren van 20 andere hydrofiele geneesmiddelen of waterige suspensies van zulke geneesmiddelen in een organisch oplosmiddel of in een organische fase dat/die het peptide-polyester-zout bevat te vergemakkelijken.

De uitvinding wordt nu toegelicht, maar niet beperkt door de volgende voorbeelden.

Het meten van de viscositeiten en hun verband met de op diverse wijzen gemiddelde molecuulgewichten is door Sorensen en Campbell in ’’Preparative Methods of Polymer Chemistry”, 2® druk, 1968, Interscience 25 Division, John Wiley & Sons op biz. 43-50 besproken. In de hierna te geven voorbeelden werd een Ubbelohde-viscosimeter gebruikt waardoor puur chloroform in ongeveer 100 seconden doorliep.

Chloroform werd als oplosmiddel gebruikt daar dit zowel de in benzeen oplosbare als de in benzeen onoplosbare polymeren met de genoemde samenstellingen oplost

Molecuulgewichten en molecuulgewichtsverdelingen van de in deze aanvrage beschreven polyesters 30 boven ongeveer 2000 werden bepaald door uitsluitingschromatografie ten opzichte van polystyreen-standaarden over gemengde B-kolommen van 3 x 30 cm met PL Gel (van de Polymer Laboratories te Church Stretton, Shropshire, Verenigd Koninkrijk) die in serie geschakeld stonden en waaraan een beschermingskolom van 10 pm vooraf ging. Tetrahydrofuran werd als oplosmiddel bij 40°C gebruikt met een nominaal debiet van 1 ml/minuut. De molecuulgewichten werden berekend met het Data Analysis Package 35 van de Perkin-Elmer 7700 Professional Computer met GPC-software.

Voor het meten van de molecuulgewichten beneden 2000 is uitsluitingschromatografie niet de bevoor-keurde methode, en in plaats daarvan werd niet-waterige potentiometrische titratie gebruikt waarmee men het molecuulgewicht of het equivalentgewicht van de polyester vond, door directe meting van het carboxyl· gehalte van de polyester of de copolyester. Niet-waterige potentiometrische titraties werden in het algemeen 40 uitgevoerd aan een bekend gewicht aan polyester of copolyester, opgelost in aceton dat 10% water bevatte. De titraties gebeurden met verdunde NaOH-oplossingen in door Radiometer (te Kopenhagen, Denemarken) geleverde apparatuur. Die bestond uit een titrator (TTT 80), een autoburette (ABU 80), een pH-meter (PHM 83) en een Russell-elektrode CMAWK. De titratieuitkomsten werden uitgezet op een Servograph (REC 80) en het molecuulgewicht van het polymeer is dan 45 wx 1000 xf vxn waarbij w de gebruikte hoeveelheid polymeer is, f het gemiddelde aantal carboxyl-groepen per polymeerketen, v het gebruikte volume aan NaOH-oplossing en 50 n de normaliteit van de gebruikte NaOH-oplossing.

Voorbeeld 1

Van goserelineacetaat werd 100,6 mg (overeenkomende met ongeveer 86 mg vrij peptide) en van 50/50 D,L-lactide/glycolide-copolymeer, met één eindstandige carboxyl-groep per polymeerketen, met een 55 naar gewicht gemiddeld molecuulgewicht van 4300 en met een inherente viscositeit bij 1% in chloroform van 25eC van 0,08 dl/g, dat in benzeen onoplosbaar was, werd 300,3 mg in ijsazïjn vrij van anhydride opgelost en dat werd tot 3 ml aangevuld. De azijnzuur-oplossing van peptide en polymeer werd druppelsgewijs in 195056 18 vloeibare stikstof geschonken en de bevroren druppels werden 24 uur onder hoog vacuüm gehouden. Het gevriesdroogde product werd tenslotte 24 uur bij 50°C onder hoog vacuüm nagedroogd, wat een polyester-geneesmiddel-mengsel gaf met nominaal ongeveer 25 gew.% goserelineacetaat (overeenkomende met ongeveer 22,3 gew.% peptide als vrije base).

5 De 400 mg gedroogd polyester-geneesmiddel-mengsel werd in methyleenchloride gebracht en dat werd tot 4 ml aangevuld. Aanvankelijk had men een troebel, kolloïdaal mengsel, maar in de loop van een uur klaarde dit geleidelijk aan tot een heldere oplossing. Die oplossing werd als dunne film uitgeschonken en die liet men ongeveer 6 uur bij kamertemperatuur drogen, waarna nog 20 uur onder hoog vacuüm bij 50°C gedroogd werd. Aldus werd een heldere, doorzichtige film met daarin het zout van geneesmiddel met 10 polyester verkregen.

(i) De 100 mg aldus verkregen heldere, doorzichtige film werd gesmolten en onder samendruk bij 80°C gevormd tot weer een doorzichtige film, van ongeveer 0,02 cm dikte. Bij 24 uur onderdompelen in water van 37°C nam het gewicht van de gehydrateerde film van geneesmiddel met polymeer toe tot 225 mg. Daarentegen kwam 100 mg op dezelfde wijze behandelde film van polyester alleen op niet meer dan 15 126 mg, en een film gemaakt uit een eenvoudig mengsel van 25 mg goserelineacetaat en 75 mg polymeer (gemaakt door geneesmiddel toe te voegen aan een oplossing van het polymeer in dichloormethaan, het oplosmiddel te verwijderen en het dan overgehouden materiaal te persen tot een film van ongeveer 0,02 cm dikte) in 24 uur in water van 37°C op slechts 136 mg. Uit deze proef is duidelijk dat de combinatie van polyester met geneesmiddel aanzienlijk sterker hydrofiel is (en ook meer water opneemt) dan zowel de 20 polyester alleen als een eenvoudig mengsel van geneesmiddel en polyester.

Het eenvoudige mengsel van geneesmiddel en polymeer in dichloormethaan vertoonde zelfs na 1 maand geen tekenen van oplossen, en na drogen en persgieten gaf het eenvoudige mengsel een ondoorzichtige film. Maar de heldere, doorzichtige film gaf bij oplossen in methyleenchloride (100 mg in 1 ml) een heldere, doorzichtige polyester-metgeneesmiddel-oplossing. Aan die oplossing werd 50 μΙ trichloorazijnzuur 25 toegevoegd en dat mengsel werd hevig geroerd. Er was toen direct een neerslag van gosereline als trifluoracetaat.

Deze twee proeven laten zien dat de twee, op de hierboven beschreven wijze verkregen, heldere en doorzichtige films die polyester-geneesmiddel-zout bevatten, met gebruikelijke technieken tot gevormde afgiftesystemen verwerkt kunnen worden. Verder bevat dit product werkelijk geen azijnzuur of acetaat, en 30 het geneesmiddel moet dus in de vorm van een polyester-zout verkeren. Dat polyestergeneesmiddel-zout ontstaat doordat de eindstandige groepen van melkzuur en glycolzuur veel sterker zijn dan azijnzuur, en dus het zwakkere azijnzuur uit het zout verdringen. Het polymere carbonzuur van het in methyleenchloride oplosbare zout kan op zijn beurt door een veel sterker carbonzuur, zoals trifluorazijnzuur, verdrongen worden. Als dat gebeurt ontstaat het trifluoracetaat van het peptide, en dat is niet in methyleenchloride 35 oplosbaar en slaat neer.

(ii) Van de heldere, doorzichtige film, verkregen op de hierboven beschreven wijze, werd 50 mg tot een film van ongeveer 0,02 cm dikte gevormd. Die film werd in een met fosfaat gebufferde zout-oplossing (die 0,02% natriumazide bevatte en pH = 7,4 had) van 37°C geïncubeerd, en van die buffer-oplossing werd zo nu en dan de UV-extinctie opgenomen om de vrijkomende hoeveelheid gosereline te vinden. Het gevormde 40 product gaf continu over ongeveer 2 weken gosereline af, was na 3 weken helemaal volledig afgebroken en was uit het incubatiemedium verdwenen.

Die proef laat de toepasbaarheid van in benzeen onoplosbare polymeren van erg laag molecuulgewicht zien voor het afgeven van geneesmiddel over een betrekkelijk korte tijd.

In plaats van uit goserelineacetaat kunnen net zulke gevormde formuleringen gemaakt worden uit van 45 nature voorkomende gonadotrofine afgevende hormonen of uit andere, sterk werkende synthetische analoga daarvan (of het nu agonisten of antagonisten zijn), zoals tryptoreline, leuproreline, busereline en nafareline, bij voorkeur in de vorm van zouten met azijnzuur of andere zwakke zuren, of uit andere polypeptide-hormonen die de afscheiding van intact gonadotrofine of van brokstukken daarvan regelen. 1 2 3 4 5 6

Voorbeeld 2 2

Van de bij voorbeeld 1 verkregen heldere, doorzichtige film werd 100 mg samen met 1,05 g 3 50/50 D,L-lactide/g!ycolide-copolymeer, met een naar gewicht gemiddeld molecuulgewicht van 121.000 en 4 een bij 1% in chloroform van 25°C inherente viscositeit van 0,84 dl/g (die in benzeen onoplosbaar was), in 5 100 ml methyleenchloride opgelost. Die oplossing werd hevig geroerd op 1000 rpm terwijl er langzaam over 6 een uur 50 ml siliconolie aan toegevoegd werd, waardoor zowel het zout van polyester met geneesmiddel als de vrije polyester neersloegen. Na 1 uur werd het gedeeltelijk neergeslagen mengsel van geneesmlddel-polyester-zout, vrije polyester, siliconolie en methyleenchloride onder hevig roeren in 2 liter hexaan 19 195056 geschonken, waardoor de microdeeltjes van geneesmiddel-polyesterzout en vrij polyester uitharden. Dat mengsel werd 2 uur geroerd en na bezinken werd de laag hexaan afgeschonken en weggedaan. De microdeeltjes (met daarin ongeveer 1,95 gew.% gosereline als vrije base) werden driemaal met 500 ml vers hexaan uitgewassen, tenslotte door filtreren geïsoleerd en 24 uur onder hoog vacuüm bij 35°C gedroogd.

5 De aldus verkregen, ongeveer bolvormige microdeeltjes, die een oplossing van geneesmiddel-polyester in vrij polymeer waren, hadden een gemiddelde deeltjesgrootte van 30 pm.

Van dit deel werd 250 mg in gebufferde zoutoplossing (met 0,02% natriumazide en pH = 7,4) bij 37°C geïncubeerd, en van de buffer-oplossing werd zo nu en dan de UV-extinctie opgenomen om de vrijgekomen hoeveelheid gosereline te vinden. De microdeeltjes gaven het geneesmiddel over ongeveer 5 weken af, en 10 waren na 7 weken helemaal uit het incubatiemedium verdwenen.

Het bij deze proef gebruikte polymeer-preparaat was een mengsel van twee copolymeren met de zelfde lactide/glycolide-samenstelling, maar met verschillende molecuulgewichten, en dat als hier beschreven mengsel in benzeen onoplosbaar was, een naar gewicht gemiddeld molecuulgewicht van 108.000, een polydispersiteit van 5,1 en bij 1% in chloroform van 25°C een inherente viscositeit van 0,72 dl/g had.

15 Deze proeven laten de toepasbaarheid van in benzeen onoplosbare polyesters met hoog molecuulgewicht en hoge polydispersiteit zien voor het afgeven van gosereline over betrekkelijk korte tijden van zo 5-7 weken.

Net zulke microdeeltjes-formuleringen kunnen gemaakt worden als men in plaats van goserelineacetaat of van nature optredende analoga van gonadotrofine vrijmakende hormonen of sterk werkende synthetische 20 analoga daarvan (agonisten of antagonisten) gebruikt, zoals tryptoreline, leuproreline, busereline en nafareline, bij voorkeur als acetaten of als zouten met andere zwakke zuren, en ook met andere polypeptide-hormonen die het afgeven van intacte gonadotrofinen of afzonderlijke brokstukken daarvan beheersen of althans beïnvloeden.

25 Voorbeeld 3

In 4 ml ijsazijn vrij van anhydride werden 101 mg goserelineacetaat (overeenkomende met ongeveer 86 mg gosereline als vrije base) en 299,7 mg 100% poly(D,L-melkzuur), dat in benzeen oplosbaar was, een naar gewicht gemiddeld molecuulgewicht van ongeveer 5400 en bij 1% in chloroform van 25°C een inherente viscositeit van 0,08 dl/g had, opgelost. Deze azijnzuur-oplossing van gosereline en polyester werd 30 druppelsgewijs in vloeibaar stikstof geschonken en de bevroren druppeltjes werden geïsoleerd, 24 uur onder vacuüm gevriesdroogd en daarna onder hoog vacuüm 24 uur bij 55°C nagedroogd.

(i) Het ontstane droge product werd in 4 ml methyleenchloride gebracht, wat aanvankelijk een troebel mengsel gaf, maar snel oploste tot een heldere oplossing die door een steriliserend nylon filter van 0,2 pm gefiltreerd werd.

35 Die proef laat zien dat oplossingen van polyesterzouten van gosereline steriel gefiltreerd kunnen worden, dus anders dan mengsels of dispersies van eenvoudige geneesmiddel-zouten in organische oplossingen van die polyester.

(ii) Onder hevig roeren werd 50 pi trifluorazijnzuur toegevoegd aan 1 ml bij (i) verkregen heldere oplossing. Er ontstond direct een neerslag van gosereline als trifluoracetaat, wat laat zien dat gosereline in die 40 methyleenchloride-oplossing als zout met op carboxyl eindigende polyester aanwezig was.

Net zulke steriele oplossing-formuleringen kunnen gemaakt worden met in plaats van goserelineacetaat of de van nature optredende gonadotrofine vrijmakende hormonen of de sterk werkende synthetische analoga (agonisten of antagonisten) daarvan, zoals tryptoreline, leuproreline, busereline en nafareline, bij voorkeur als acetaten of als zouten met andere zwakke zuren, en ook uit andere polypeptide-hormonen die 45 het vrijkomen van intacte gonadotrofinen of van afzonderlijke brokstukken daarvan beheersen of althans beïnvloeden.

Voorbeeld 4

Van de in voorbeeld 3 verkregen oplossing van gosereline-polyester in methyleenchloride werd 2 ml met 50 nog meer methyleenchloride verdund tot 10 ml. Die oplossing werd onder hevig roeren in 1 liter hexaan gesproeid, wat microdeeltjes gaf die na 24 uur drogen onder vacuüm op 45°C in grootte varieerden van ongeveer 2 pm tot ongeveer 30 pm, met een gemiddelde van ongeveer 10 pm. Het goserelinegehalte van deze microdeeltjes kwam overeen met ongeveer 22% (als vrije base).

Deze microdeeltjes werden bij 37°C geïncubeerd met zout-oplossing die met fosfaat op pH = 7,4 55 gebufferd was, en de bovenstaande vloeistof daarvan werd zo nu en dan met UV op gosereline onderzocht. Het gosereline kwam er voortdurend uit vrij, en dat vrijkomen was in ongeveer 8 weken voltooid; na 11 weken waren de microdeeltjes volledig afgebroken en uit het incubatiemedium verdwenen. Die proef liet de 195056 20 toepasbaarheid van in benzeen oplosbare polyesters van erg laag molecuulgewicht zien voor het bereiken van een continue afgifte van het peptide over ongeveer 2 maanden.

Als bij bovengenoemde proeven het goserelineacetaat vervangen werd door het trifluoracetaat werd niet een heldere oplossing verkregen, maar in plaats daarvan een dispersie van goserelinetrifiuoracetaat in de 5 polyesteroplossing in methyleenchloride. Dat mengsel zal niet door een filter van 0,2 pm gaan, kan niet steriel gefiltreerd worden en geeft bij versproeien in geroerd hexaan hun gestremde en uitgevlokte massa in plaats van microdeeltjes.

Het gosereline-polyester-zout heeft dus eigenschappen die dit zout veel gemakkelijker tot microdeeltjes te formuleren maken dan mengsels van het eenvoudige zout in een oplossing van zo’n polymeer van erg 10 laag molecuulgewicht

Net zulke microdeeltjes kunnen gemaakt worden als men in plaats van goserelineacetaat of van nature optredende gonadotrofine vrijmakende hormonen of andere, sterk werkende synthetische analoga (agonisten of antagonisten) daarvan gebruikt, zoals tryptoreline, leuproreline, busereline en nafareline, bij voorkeur als acetaten of als zouten met andere zwakke zuren, of anders met alle andere polypeptide-15 hormonen die het uitscheiden van intacte gonadotrofinen of afzonderlijke brokstukken daarvan beheersen of althans beïnvloeden.

Voorbeeld 5

In 2 ml van anhydridevrij ijsazijn werden 304 mg goserelineacetaat, overeenkomende met ongeveer 248 mg 20 vrije base en 102 mg 100% poly(D.L-melkzuur) met een naar gewicht gemiddeld molecuulgewicht van ongeveer 5400, een inherente viscositeit van 0,08 dl/g (1% in chloroform van 25°C) en een polydispersiteit van 1,8 opgelost. De azijnzuur-oplossing van gosereline en polyester werd druppelsgewijs in vloeibare stikstof geschonken en de bevroren druppeltjes werden geïsoleerd, 24 uur onder hoog vacuüm gevriesdroogd en daarna nog 24 uur onder hoog vacuüm bij 55°C nagedroogd.

25 Het verkregen product werd aan 2 ml methyleenchloride toegevoegd, wat een troebel, kolloïdaal mengsel gaf dat bij bewaren niet totaal ophelderde. Dat mengsel in methyleenchloride was in wezen een dispersie van goserelineacetaat in het gosereline-polyester-zout.

Deze dispersie van gosereline in methyleenchloride-oplossing van polyester-gosereline-zout werd geformuleerd tot microdeeltjes die gosereline bevatten voor ongeveer 72% als vrije base en met vrij 30 goserelineacetaat in de continue fase van het gosereline-polyester-zout gedispergeerd, wat door sproei-drogen, sproeikoelen, eenvoudig neerslaan en door coacerveren onder fasenscheiding kon gebeuren.

Net zulke microdeeltjes konden geformuleerd worden als men in plaats van goserelineacetaat of van nature optredende gonadotrofine vrijmakende hormonen of sterk werkende synthetische analoga (agonisten of antagonisten) daarvan gebruikte, zoals tryptoreline, leuproreline, busereline en nafareline, bij voorkeur als 35 acetaten of als zouten met andere zwakke zuren, of anders nog andere polypeptide-hormonen die het vrijkomen van intacte gonadotrofinen of van afzonderlijke brokstukken daarvan beheersen of althans beïnvloeden.

Voorbeeld 6 40 Een copolyester die voor 78% D,L-melkzuur en voor 22% uit glycolzuur opgebouwd was werd bereid door gemeenschappelijke condensatie van de twee hydroxyzuren. Na zuivering van dit copolymeer door een oplossing van die copolyester in aceton aan methanol toe te voegen, waardoor de copolyester neersloeg, en het neerslag af te scheiden en te drogen werd een copolyester verkregen met een naar gewicht gemiddeld molecuulgewicht van ongeveer 11.000, een naar getal gemiddeld molecuulgewicht (bepaald door 45 niet-waterige potentiometrische titratie, met de aanname dat elke polyesterketen één enkele eindstandige carboxyl-groep had) van 6100 (en dus met een polydispersiteit van 1,6) en met een inherente viscositeit bij 1% in chloroform van 25°C van 0,15 dl/g.

In 10 ml van anhydridevrij ijsazijn werden 228,9 mg goserelineacetaat (overeenkomende met ongeveer 200 mg vrije base) en 1,8 g van de zo juist beschreven copolyester opgelost. De aldus verkregen 50 gosereline-polyester-oplossing werd druppelsgewijs aan vloeibaar stikstof toegevoegd, en de bevroren druppeltjes werden geïsoleerd, 24 uur gevriesdroogd en daarna onder vacuüm 24 uur bij 50°C nagedroogd.

Het gedroogde mengsel van gosereline en polyester werd aan 10 ml methyleenchloride toegevoegd, wat aanvankelijk een troebel, kolloïdaal mengsel gaf, maar na 24 uur was dat in een heldere oplossing overgegaan, welke door een steriliserend nylon filter van 0,2 pm gehaald kon worden.

55 Toen aan een kleine portie van die heldere oplossing trifluorazijnzuur toegevoegd werd was er een direct neerslag van het gosereline als trifluoracetaat, wat laat zien dat in de heldere, doorzichtige methyleenchlori-deoplossing het gosereline van het gosereline-polyestermengsel voornamelijk of volledig als polyester-zout 21 195056 aanwezig was. De oplossing van het gosereline-polyester-zout in methyleenchloride werd drboggedampt en de vaste stof werd 6 uur bij Kamertemperatuur en 20 uur onder vacuüm bij 55°C gedroogd, wat een heldere, gegoten film gaf die goserelinepolyester-zout bevatte.

Van het aldus bereide droge gosereline-polyestermengsel werd 1 g in 8 ml methyleenchloride opgelost.

5 De ontstane oplossing werd in een veelhals-rondbodemkolf van 250 ml geplaatst, die met een stroom stikstof uitgespoeld werd, zodat alle lucht daaruit verdreven en er een atmosfeer vrij van koolzuur gevormd werd. Toen werd in de kolf 90 ml water gebracht dat van te voren ontgast was zodat alle koolzuur eruit verdwenen was, en dat mengsel werd hevig geroerd met ongeveer 500 rpm, onder een atmosfeer die in wezen vrij van koolzuur was. De oplossing van het gosereline-polyester-zout in methyleenchloride disper-10 geerde snel tot een stabiele olie (dispersie van geneesmiddel-polymeerzout in methyleenchloride-oplossing). Onder voortgezet roeren op ongeveer 200 rpm werd er geleidelijk aan vacuüm op gezet en het grootste deel van het methyleenchloride verdampte onder dat vacuüm, wat een dispersie van gosereline-polyester-zout in water gaf. Vriesdrogen van deze dispersie gaf microdeeltjes, waarin het gosereline als gosereline-polyester-zout aanwezig was met een gemiddelde deeltjesgrootte van ongeveer 20 pm, waaruit het 15 gosereline over ongeveer 6 weken geleidelijk aan vrijkwam bij incuberen met met fosfaat gebufferde zout-oplossing (pH = 7,4) van 37°C, waarbij de bovenstaande vloeistof zo nu en dan met UV op gosereline bekeken werd.

Net zulke microdeeltjes kunnen ook gemaakt worden door in de waterfase stoffen zoals mannitol op te nemen, waarvan men weet dat ze de stabiliteit van polypeptiden verhogen. Hoewel het de voorkeur heeft 20 die werkwijze onder koolzuurvrije atmosfeer uit te voeren is het toch mogelijk bevredigende uitkomsten te verkrijgen in aanwezigheid van sporen kooldioxide, afhankelijk van het molecuulgewicht van de polyester en van de belading met geneesmiddel.

Net zulke steriele oplossingen, gegoten films en microdeeltjes kunnen op een zelfde wijze gemaakt worden als men in plaats van goserelineacetaat of van nature voorkomende analoga van gonadotrofine 25 afgevende hormonen of andere sterk werkende, synthetische analoga (agonisten of antagonisten) daarvan gebruikt, zoals tryptoreline, leuproreline, busereline en nafareline, bij voorkeur als acetaten of als zouten met andere zwakke zuren, of nog andere polypeptide-hormonen die het vrijkomen van intacte gonadotrofinen of brokstukken daarvan beheersen of althans beïnvloeden.

30 Voorbeeld 7

De in voorbeeld 5 beschreven procedure werd herhaald, wat een heldere, doorzichtige film gaf en van die film werd 1 g in 4 ml methyleenchloride opgelost. Die oplossing werd tot ongeveer 35°C opgewarmd en toen werd een oplossing van 15 mg gezuiverd gelatine in 100 pi water van ongeveer 40°C toegevoegd, en dat mengsel werd hevig bij ongeveer 35°C geroerd tot een uiterst fijne dispersie van waterige gelatine-oplossing 35 in de methyleenchloride-oplossing van het gosereline-polyester-zout. Bij afkoelen tot kamertemperatuur bleef de kolloïdale aard van de suspensie behouden.

Die proef iaat zien dat het gosereline-polyesterzout oppervlak-actief is en gebruikt kan worden om stabiele dispersies in de oliefase (zoals methyleenchloride) te verkrijgen van waterige oplossingen van andere in water oplosbare stoffen zoals gelatine, polysacchariden en andere hydrofiele polymeren, en ook 40 omgekeerd.

De in voorbeeld 6 beschreven werkwijze werd herhaald onder toepassing van de hierboven beschreven dispersie van waterig gelatine in de methyleenchlorideoplossing van het gosereline-polyester-zout, wat een microcapsule-product gaf dat zowel gelatine als goserellnepolyester-zout bevatte.

Andere laagmoleculaire verbindingen kunnen in de waterige polymeer-fase opgenomen worden. In het 45 bijzonder is het soms nuttig verbindingen zoals mannitol, waarvan men weet dat ze de stabiliteit van peptiden verhogen, daarin op te nemen. Maar ook kunnen andere stabiliserende stoffen in beide waterfasen van de ingewikkelde water-in-olie-inwater-dispersie opgenomen worden, welke waterig gelatine gedisper-geerd in de methyleenchloride-oplossing van het gosereline-polyester-zout bevatten, en de ontstaande waterin-olie-dispersie op zijn beurt in water te dispergeren.

50 Net zulke suspensies en microdeeltjes kunnen op een zelfde wijze gemaakt worden, waarbij men in plaats van goserelineacetaat andere sterk werkende analoga (agonisten of antagonisten) van gonadotrofine vrijmakende hormonen gebruikt, zoals tryptoreline, leuproreline, busereline en nafareline, bij voorkeur als zouten van azijnzuur of van andere zwakke zuren, of anders nog andere polypeptidehormonen die het vrijkomen van intacte gonadotrofinen of van brokstukken daarvan beheersen of althans beïnvloeden.

195056 22

Voorbeeld 8

In 70 ml van anhydridevrij ijsazijn werden 771 mg goserelineacetaat (overeenkomende met ongeveer 670 mg vrije base), 1,8 g D.L-lactide/glycolide-copolymeer met een naar gewicht gemiddeld molecuulge-wicht van ongeveer 3600 en bij 1% in chloroform van 25eC inherente viscositeit van 0,08 dl/g en 4,2 g 5 95/5-copolymeer van D,L-lactide en glycolide met een naar gewicht gemiddeld molecuulgewicht van ongeveer 15.000 en bij 1% in chloroform van 25°C inherente viscositeit van 0,17 dl/g opgelost. De gecombineerde polymeren hadden een naar gewicht gemiddeld molecuulgewicht van ongeveer 12.300 Da en een polydispersiteit van ongeveer 2,6. De gosereline-polyester-oplossing werd druppelsgewijs In vloeibaar stikstof gebracht en de bevroren druppeltjes werden geïsoleerd en ongeveer 18 uur onder hoog 10 vacuüm gevriesdroogd. Het geneesmiddel-polymeer-mengsel werd tenslotte 24 uur onder hoog vacuüm bij 55°C gedroogd.

De 6 g gedroogd geneesmiddel-polymeer-mengsel werd in 60 ml methyleenchloride gebracht, wat aanvankelijk een troebel, kolloïdaal mengsel gaf, dat in de loop van 1 uur in een heldere oplossing van het gosereline-polyester-zout in methyleenchloride overging.

15 Die oplossing werd gesproeidroogd in een sproeidroger van Buchi bij een inlaattemperatuur van 60°C en een uitlaattemperatuur. van 35°C, wat ongeveer bolvormige microdeeltjes met doorsneden van ongeveer 1 pm tot ongeveer 10 pm gaf.

In deze microdeeltjes is het geneesmiddel in wezen volledig aanwezig als gosereline-polyester-zout, daar het gehalte aan azijnzuur (als vrij zuur of als anion) 0,06% of minder is, in plaats van de 0,6 tot 0,7% die 20 men zou vinden als het gosereline er als acetaat in zat.

Deze microdeeltjes werden toen verder opgewerkt door ze bij 80°C te persgieten tot een heldere, doorzichtige en brosse film.

Deze proef laat de toepasbaar van peptide-zouten met in benzeen oplosbare polyesters van laag molecuulgewicht en eventueel van hoge polydispersiteit zien.

25 Net zulke oplossingen v. microdeeltjes en onder persen gegoten formuleringen kunnen gemaakt worden als men In plaats van goserelineacetaat of van nature optredende gonadotrofine vrijmakende hormonen of andere, sterk werkende synthetische analoga (agonisten of antagonisten) van gonadotrofine vrijmakende hormonen gebruikt, zoals tryptoreline, leuproreline, busereline of nafareline, bij voorkeur als zouten van azijnzuur of andere zwakke zuren, of nog andere polypeptide-hormonen die het vrijkomen van intacte 30 gonadotrofinen of van brokstukken daarvan regelen of althans beïnvloeden.

Voorbeeld 9

Goserelineacetaat en andere sterk werkende synthetische agonisten van gonadotrofine vrijmakende hormonen zijn selectieve chemische castratiemiddelen die gebruikt worden voor het behandelen van door 35 hormonen bepaalde kankers zoals prostaatkanker bij mannen en borstkanker bij vrouwen voor de menopauze. Deze geneesmiddelen worden ook gebruikt voor niet-kwaadaardige gynaecologische aandoeningen van vrouwen, en ze werken uiteindelijk door het onderdrukken van afscheidingen van gonadotrofinen door de hypofyse, wat op zijn beurt tot het onderdrukken van geslachtshormonen, oestrogeen bij vrouwen en testosterin bij mannen, leidt 40 Continu en blijvend vrijkomen van zulke geneesmiddelen kan dan ook in vitro geëvalueerd worden bij normale volwassen vrouwelijke ratten met regelmatige oestrus. Bij dat dier is de oestrus-cyclus ongeveer 4 dagen en blijkt het optreden van oestrus doordat men in op de dag van de oestrus genomen vaginale uitstrijkjes alleen verhoornde cellen vindt. Als het dier chemisch gecastreerd is, door een stof als gosereline, treedt de oestrus niet op, wat tot de afwezigheid van verhoornde cellen in vagina-uitstrijkjes leidt. De dieren 45 komen door de chemische castratie in een langdurige periode tussen twee cycli in, en dat blijft zo zolang voldoende van dat middel vrijkomt.

(i) Van de in voorbeeld 8 verkregen microdeeltjes werd 450 mg gedispergeerd in 3 ml water dat 2 gew. % natriumcarboxymethylcellulose en 0,2% polysorbaat 80 bevatte. Elk van 10 normale volwassen vrouwelijke ratten met een regelmatige cyclus kregen elk daarvan 0,2 ml, dat subcutaan geïnjiceerd werd, 50 en het daaruit voortvloeiende effect op de oestrus-cyclus werd gevolgd aan de microscopische beoordeling van vagina-uitstrijkjes. De dieren kwamen in een continue fase tussen de cycli in, d.w.z. dat ze chemisch gecastreerd waren, wat 95 ± 3 dagen aanhield.

Deze proef laat zien dat een waterige suspensie van een gosereline-polyester-zout op basis van een laag moleculaire, in benzeen oplosbare polyester een betrekkelijk lange tijd (ongeveer 3 maanden) van 55 beheerste afgifte van een peptide geeft met een metabolische halfwaardetijd van slechts 4-6 uur.

(ii) Van de in voorbeeld 8 verkregen microdeeltjes werd 450 mg in ethyloleaat gedispergeerd, dat tot 3 ml aangevuld werd. Opnieuw werd hiervan 0,2 ml door subcutane injectie toegediend aan zes vrouwelijke 23 195056 ratten met regelmatige cyclus. De dieren traden nu in een continue fase tussen de cycli in, welke 81 ± 3 dagen aanhield.

Die proef laat zien dat een oplossing van gosereline-polyester-zout in een organisch injectiemedium dat geen oplosmiddel voor de polyester alleen is een betrekkelijk lange tijd geeft waarover het peptide beheerst 5 afgegeven wordt

Voorbeeld 10

In 5 ml anhydridevrij ijsazijn werden 50,3 mg leuprorelineacetaat en 453,2 mg van de in voorbeeld 6 beschreven copolyester met 78 mol.% D,L-melkzuur en 22 mol.% glycolzuur opgelost. De ontstane 10 oplossing werd druppelsgewijs in vloeibare stikstof gebracht en de bevroren druppeltjes werden 22 uur onder hoog vacuüm gevriesdroogd, en daarna 24 uur onder hoog vacuüm bij 55°C nagedroogd.

De aldus verkregen 500 mg product werden in een rondbodemkolf van 100 ml in 10 ml herdestilleerd , aceton opgelost, wat een aanvankelijk troebel, kolloïdaal mengsel gaf, dat echter geleidelijk tot een heldere oplossing opklaarde. Het aceton werd onder vacuüm verdampt en de ontstane heldere film werd 4 uur 15 onder hoog vacuüm bij 55°C gedroogd. Deze film van leuproreline-polyester-zout werd opnieuw opgelost in 1Omlacetonendie oplossing werd ontgast en met stikstof uitgespoeld.

Onder stikstof werd 200 ml vers gedestilleerd water hevig geroerd en de aceton-oplossing van het leuproreline-polyester-zout werd onder roeren op het water gesproeid. Toen alle aceton-oplossing ver-sproeid was werd er nog 4 uur verder geroerd, waarna men het mengsel liet bezinken. De microdeeltjes van 20 het leuproreline-polyesterzout bezonken en de bovenstaande waterige vloeistof werd weggedaan. De microdeeltjes werden opnieuw gesuspendeerd in 200 ml koolzuurvrlj water en die suspensie werd nog een uur onder stikstof geroerd. De microdeeltjes werden afgescheiden, door het mengsel eerst te laten bezinken, dan de waterlaag af te schenken en vervolgens het residu te filtreren, waardoor de microdeeltjes van de overmaat water gescheiden werden. De microdeeltjes werden 24 uur onder hoog vacuüm bij 30°C 25 gedroogd, wat een product gaf met een gemiddelde deeltjesgrootte van ongeveer 15 pm.

Deze microdeeltjes-formulering van leuprorelinepolyester-zout werd in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (pH = 7,4) van 37°C geïncubeerd, en in de bovenstaande vloeistof bepaalde men zo nu en dan met ÜV het leuproreline-gehalte. Het leuproreline werd er continu over ongeveer 5 weken aan afgegeven, na welke tijd de formulering volledig afgebroken was.

30 Net zulke microdeeltjesformuleringen kunnen op een zelfde wijze gemaakt worden waarbij men in plaats van leuproreline hetzij van nature voorkomend gonadotrofine vrijmakende hormonen of andere sterke synthetische analoga (agonisten of antagonisten) daarvan gebruikt, zoals tryptoreline, gosereline, busereline en nafareline, bij voorkeur als zouten vein azijnzuur of van andere zwakke zuren, of andere polypeptide-hormonen die het vrijkomen van intacte gonadotrofinen of onderdelen daarvan beheersen.

35

Voorbeeld 11 i) In 60 ml anhydridevrij ijsazijn werd 2,28 g goserelineacetaat, overeenkomende met 2,00 g vrije base, opgelost. Een mengsel van twee 95/5% D,L-melkzuur/glycoizuur-copolymeren (12,6 g copolymeer met een naar gewicht gemiddeld molecuulgewicht van 15.846 en een polydispersiteit van 1,38, en 5,4 g copolymeer 40 met een naar gewicht gemiddeld molecuulgewicht van 3896 en een polydispersiteit vein 1,78) werden onder roeren in 150 ml ijsazijn vrij van anhydride opgelost. De oplossing van het geneesmiddel werd aan de copolymeer-oplossing toegevoegd en er grondig mee gemengd. Dit mengsel werd toen druppelsgewijs in vloeibare stikstof gebracht, waardoor het tot kleine pareltjes bevroren werd en de vaste stof werd twee dagen lang gevriesdroogd met behulp van een vriesdroger van Edwards met hoog vacuüm. Het gedroogde 45 materiaal werd nog 24 uur in een vacuümoven bij 50-55°C nagedroogd.

Van het droge product werd 100 mg aan 1 ml methyleenchloride toegevoegd en dat bleek in 2 uur daarin volledig op te lossen tot een heldere oplossing. Uit dit voorbeeld blijkt dat de vorming van het gosereline-polyester-zout een goede oplosbaarheid aan dat geneesmiddel geeft, zodat het in een niet-polair oplosmiddel opgenomen kan worden.

50 ii) In 60 ml ijsazijn vrij van anhydride werd 2,28 g goserelineacetaat (overeenkomende met ongeveer 2,00 g gosereline als vrije base) opgelost. Een mengsel van twee D,L-melkzuur-homopolymeren (12,6 g polymeer met een naar gewicht gemiddeld molecuulgewicht van I5.I78 en een polydispersiteit van 1,27 en 5,4 g polymeer met een naar gewicht gemiddeld molecuulgewicht van 4204 en een polydispersiteit van 1,84) werd onder roeren in 150 ml anhydridevrij ijsazijn opgelost, dus met een overmaat aan carboxylgroepen aan 55 het copolymeer ten opzichte van de basische groepen van het geneesmiddel; dit gaf een heldere oplossing. Die oplossing werd aan de polymeer-oplossing toegevoegd en er grondig mee gemengd, en dat mengsel werd toen in vloeibare stikstof gedruppeld, waarin het kleine pareltjes vormde. De vaste stof werd nog twee 195056 24 dagen gevriesdroogd in een vriesdroger van Edwards met hoog vacuüm, en het gedroogde matériaa! werd nog 24 uur in een vacuümoven op 50-55°C nagedroogd.

Van het droge product werd 100 mg aan 1 ml methyleenchloride toegevoegd en daarin bleek het in 2 uur tot een heldere oplossing op te lossen. Uit dit voorbeeld blijkt dat de vorming van het gosereline-polyester-5 zout het geneesmiddel goed oplosbaar maakt, zodat het in een niet-polair oplosmiddel opgenomen kan worden.

iii) In 60 ml anhydridevrij azijnzuur werd 2,28 g goserelineacetaat (overeenkomende met 2,00 g gosereline als vrije base) opgelost. Een mengsel van 12,6 g 80/20 copolymeer van D,L-melkzuur en glycolzuur (met een naar gewicht gemiddeld molecuulgewicht van 106.510 en een polydispersiteit vein 2,27) en 5,4 g 95/5 10 copolymeer van D,L-melkzuur en glycolzuur (met een naar gewicht gemiddeld molecuulgewicht van 3896 en een polydispersiteit van 1,78), dus met eên overmaat aan copolymeer-carboxyl-groepen ten opzichte van het basische geneesmiddel, werd onder roeren in 150 ml anhydridevrij ijsazijn opgelost, wat een heldere oplossing gaf. De oplossing van het geneesmiddel werd aan de copolymeer-oplossing toegevoegd en er grondig mee gemengd. Dat mengsel werd in vloeibare stikstof gedruppeld, waarin het kleine pareltjes gaf, 15 en de vaste stof werd twee dagen in een vriesdroger van Edwards met hoog vacuüm gedroogd, en het gedroogde materiaal werd 24 uur in een vacuümoven op 50-55°C verder gedroogd.

Van dit droge product werd 100 mg in 1 ml methyleenchloride gebracht en daarin bleek het in 2 uur op te lossen tot een heldere oplossing. Uit dit voorbeeld blijkt dat de vorming van het gosereline-polyester-zout het geneesmiddel een goede oplosbaarheid geeft, zodat het in een niet-polair oplosmiddel opgenomen kan 20 worden.

iv) In 60 ml ijsazijn vrij van anhydride werd 2,17 g goserelineacetaat (overeenkomende met 1,90 g gosereline als vrije base) opgelost. Een mengsel van twee 67/33-copolymeren van D,L-melkzuur en glycolzuur (12,0 g copolymeer met een naar gewicht gemiddeld molecuulgewicht van 35.833 en een polydispersiteit van 1,83 en 5,15 g polymeer met een naar gewicht gemiddeld molecuulgewicht van 4116 en 25 een polydispersiteit van 1,86) dus met een overmaat aan polymeer-carboxyl-groepen ten opzichte van het basische geneesmiddel, werd onder roeren in 150 ml ijsazijn vrij van anhydride opgelost, wat een heldere oplossing gaf. Die oplossing werd aan de copolymeer-oplossing toegevoegd en er grondig mee geroerd. Dat mengsel werd toen in vloeibare stikstof gedruppeld, waarin het vrije pareltjes gaf. De vaste stof werd twee dagen in een vriesdroger van Edwards met hoog vacuüm gedroogd, en het droge materiaal werd nog 30 24 uur in een vacuümoven op 50-55°C nagedroogd.

Van dat droge product werd 100 mg aan 1 ml methyleenchloride toegevoegd en daarin bleek het in 10 minuten totaal op te lossen tot een heldere vloeistof. Uit dit voorbeeld blijkt dat de vorming van het gosereline-polyester-zout het geneesmiddel een goede oplosbaarheid geeft, zodat het in een niet-polair oplosmiddel opgenomen kan worden.

35

Vergelijkend voorbeeld

In 60 ml ijsazijn vrij van anhydride werd 2,28 g goserelineacetaat (overeenkomende met ongeveer 2,00 g gosereline als vrije base) opgelost. Een 50/50-copolymeer van D.L-melkzuur en glycolzuur (18,0 g polymeer met een naar gewicht gemiddeld molecuulgewicht van 22.307 en een polydispersiteit van 2,07), dus met 40 een ongeveer stoechiometrisch gelijke hoeveelheid copolymeer-carboxyl-groepen en basische groepen, werd onder roeren in 150 ml ijsazijn vrij van anhydride opgelost, wat een heldere oplossing gaf. De oplossing van het geneesmiddel werd aan de copolymeeroplossing toegevoegd en er grondig mee gemengd. Dat mengsel werd in vloeibare stikstof gedruppeld, waarin het vrije pareltjes gaf. De vaste stof werd nog twee dagen in een vriesdroger van Edwards met hoog vacuüm gedroogd, en de droge stof werd 45 nog 24 uur in een vacuümoven op 50-55°C nagedroogd.

Van dit droge product werd 100 mg in 1 ml methyleenchloride opgelost en daarin bleek het na 4 uur nog niet totaal opgelost te zijn, maar in vier dagen ontstond er wel een heldere oplossing. Uit dit voorbeeld blijkt dat de vorming van het gosereline-polyester-zout, voor een goede oplosbaarheid van het geneesmiddel, zodat het in een niet-polair oplosmiddel opgenomen kan worden, optreedt als er ten opzichte van het 50 basische geneesmiddel een overmaat aan copolymeer-carboxyl-groepen is.

De gedroogde producten i-iv werden in methyleenchloride opgelost en met een laboratorium-sproeidroger van Buchi volgens deze tabel gesproeidroogd: 25 195056 • Product Verhouding van product Inlaattemp. Uitlaattemp.

tot oplosm. in% in°C in °C

i 10 48 32 5 ii 10 58 38 iii 2 58 44 iv 10 55 35 10 Het sproeidrogen van oplossingen i-iv gaf kleine deeltjes met een doorsnede van ongeveer 1-10 pm (bepaald met aftastende elektronenmicroscopie). Deze uiteindelijke deeltjes werden met gaschromatografie op azijnzuur geanalyseerd, met een aantoningsgrens van 0,03%. In al deze formuleringen werd geen azijnzuur gevonden, en dat laat zien dat het geneesmiddel als polyester-zout aanwezig is, en niet als azijnzuur-zout, daar men voor het acetaat een azijnzuur-gehalte van ongeveer 0,5% zou verwachten.

15 Van de bovengenoemde droge stoffen i-iv werd 50 mg in 0,5 ml methyleenchloride opgelost, wat heldere oplossingen gaf. Aan elk daarvan werd één druppel trifluorazijnzuur toegevoegd, en dat leidde in al die gevallen tot witte neerslagen. De monsters werden gecentrifugeerd om die neerslagen te verzamelen, en die werden met methyleenchloride uitgewassen. Bij HPLC bleken die neerslagen gosereline te zijn. Die voorbeelden laten zien dat de polyester uit deze zouten in niet-polaire oplosmiddelen verdrongen kan 20 worden door er sterk zuur aan toe te voegen, en dat leidt er toe dat de oplosbaarheid van het zout van het geneesmiddel met dat sterke zuur terugkomt (d.i. het is niet oplosbaar).

Voorbeeld 12

De gesproeidroogde deeltjes i-iv van voorbeeld 11 (met een sterkte van 18%) werden in een voor injectie 25 geschikte waterige drager gedispergeerd (2% natriumcarboxymethylcellulose (van Fluka, met middelmatige viscositeit) en 0,2% polysorbaat 80 ("Tween” van Fluka)) gedispergeerd.

De in de aldus aangemaakte injectiedrager gedispergeerde droge deeltjes van voorbeeld 11 werden in 10 vrouwelijke ratten (afgeleid van de Wistar-stam) geïnjiceerd. Op dagen 7,14 en 28 werden uit de staarten van 5 ratten bloedmonsters genomen en die monsters werden op gosereline geanalyseerd met een 30 radioimmunoessaai met bekende specificiteit voor dat geneesmiddel, waarbij er geen kruisreactiviteit met metabolieten was.

De uitkomsten van deze proeven lieten zien dat men met die formulering gedurende ten minste vier weken meetbare bloedgehalten aan gosereline bereikte.

35 Voorbeeld 13

Het gesproeidroogde product ii ven voorbeeld 11 werd in de volgende waterige injectiemedia gedispergeerd.

a. 1,0% natriumcarboxymethylcellulose (van middelmatige viscositeit, Fluka) en 0,75% polysorbaat 80 (’Tween”).

b. 0,75% methylcellulose (15 mPa.s, van Fluka) en 0,75% polysorbaat 80 (’Tween”).

40 Deze formuleringen dispergeerden in deze dragers goed en waren geschikt voor parenterale toediening.

Voorbeeld 14

Van het gesproeidroogde product ii) van voorbeeld 11 werd 400 mg in 4 ml methyleenchloride opgelost. Dat werd met behulp van een injectiespuit onder roeren met in een 0,25% oplossing van polyvinylalkohol (PVA 45 van Aldrich, voor 75% gehydrolyseerd) in water gebracht. Na twee minuten werd de roersnelheid op 800 rpm teruggebracht en dat werd 30 minuten voortgezet. Het roeren werd toen onderbroken en men liet de deeltjes bezinken. De PVA-oplossing werd afgeschonken en de deeltjes werden tweemaal met ijskoud water uitgewassen en door centrifugeren weer verzameld. Tenslotte werden de deeltjes door vriesdrogen gedroogd, en het eindproduct was fijnverdeeld en bevatte gosereline.

50

Voorbeeld 15

De gesproeidroogde formulering iv) van voorbeeld 11 werd bij 82°C geëxtrudeerd tot een cilindrisch extrudaat met een doorsnede van ongeveer 1 mm. Dit extrudaat werd tot stukjes van ongeveer 36 mg versneden, met in elk 3,6 mg gosereline. Dit extrudaat was volledig helder en doorzichtig, en niet wit, welk 55 laatste voorkomen typerend is voor een eenvoudig mengsel van geneesmiddel en polymeer, dat men krijgt als het peptide geen zout met de polyester vormt (zoals bijvoorbeeld in het in de handel verkrijgbare depotpreparaat "Zoladex” (handelsmerk). De helderheid van dit extrudaat geeft aan dat het peptide 195056 26 gosereline met de polyester verenigbaar is en niet in een andere fase zit, die tot verstrooiing van het licht en een wit voorkomen zou leiden. Deze verenigbaarheid kan alleen optreden als het peptide in de zelfde fase als het polymeer zit, d.i. als het een zout van de polyester is.

Onder verdoving werden 3,6 mg-depotpreparaten in 21 van de Wistar-stam afgeleide ratten geïmplan-5 teerd. Op verschillende tijdstippen daarna werden drie dieren gedood en werden de depots teruggenomen. De teruggevonden depots werden in een maatkolf in ijsazijn opgelost en met overmaat water werd het polymeer neergeslagen. Dat werd dan gefiltreerd (over Millex, 0,5 pm) en de filtraten werden met HPLC op gehalte aan geneesmiddel onderzocht. Het afgifteprofiel van de depots werd berekend door vergelijking met de geneesmiddel-gehalten van de depots die niet geïmplanteerd waren, en die op een zelfde wijze 10 geanalyseerd waren.

Deze depots van een geneesmiddel-polyester-zout gaven een lang aanhoudende afgifte van gosereline in vivo, welke ten minste 4 weken aanhield.

Voorbeeld 16 15 (i) Onder roeren werd 8,87 g 95/5-lactide/glycolidecopolymeer (één enkele eindstandige carboxy-groep per keten,_Mw = 5750-en.polydispersiteit = 1,5 MG volgens eindgroeptitratie 2516 g/mol, inherente viscositeit bij 1% in chloroform 0,10 dl/g) werd met roeren in 50 ml methyleenchloride opgelost Hieraan werd 1,13 g goserelineacetaat toegevoegd, wat een troebele suspensie gaf. Nu werd onder roeren 5 ml methanol toegevoegd en na 30 minuten was het mengsel volledig helder. Het oplosmiddel werd in een draal· 20 verdamper uit de oplossing verwijderd, wat een heldere vaste stof gaf. Die vaste stof werd opnieuw opgelost in 50 ml methyleenchloride en dat oplosmiddel werd opnieuw in een draaiverdamper verwijderd. Dit opnieuw oplossen en opnieuw droogdampen werd nog twee keer herhaald, wat een zeer viskeuze vloeistof gaf die onder hoog vacuüm tot een wit schuim gedroogd werd. Dat schuim werd opgebroken, nog 24 uur bij kamertemperatuur onder vacuüm gedroogd, wat een fijne amorfe stof gaf.

25 (ii) De bij i) beschreven werkwijze werd herhaald, nu met 8,87 g 75/25-lactide/glycolide-copolymeer met één enkele carboxyl-groep (Mw = 10900, polydispersie = 1,85, MG volgens titratie van de eindgroep 3210 en inherente viscositeit bij 1% in chloroform 0,14 dl/g), wat een fijne amorfe stof gaf.

Formulering nr. 1 30 Van het bij i) van voorbeeld 1 verkregen gosereline-lactide/glycolide-zout werd 1 g aan 2 ml benzylbenzoaat (99% van Janssen) toegevoegd, en dat werd met een in de hand gehouden heteluchtpistool verwarmd totdat de vaste stof in oplossing gegaan was. In 110 pl van die oplossing zat er 3,6 mg gosereline.

Formulering nr. 2 35 Net als formulering nr. 1, behalve dat het oplosmiddel een mengsel van 1,7 ml (67%) benzylbenzoaat (99% van Janssen) en voor 33% benzylalkohol (watervrij, 99% van Aldrich) was. In 100 pl van die formulering zat er 3,6 mg gosereline.

Formulering nr. 3 40 Net als formulering nr. 1, behalve dat het oplosmiddel benzylalkohol was (1,7 ml watervrij, 99% van Aldrich). In 100 pl van die oplossing zat er 3,6 mg gosereline.

Formulering nr. 4

Net als formulering nr. 1, behalve dat er nu 1 g zout uit gosereline en lactide/glycolide-copolymeer uit (ii) en 45 3 ml benzylbenzoaat gebruikt werden. In 150 pl van die oplossing zat 3,6 mg gosereline.

Formulering nr. 5

Net als formulering nr. 4, behalve dat nu het ook voor formulering nr. 2 gebruikte mengsel van oplosmidde* len gebruikt werd. In 100 μΙ van die oplossing zat 3,6 mg gosereline.

50

Formulering nr. 6

Net als formulering nr. 4, behalve dat het oplosmiddel van formulering nr. 3 gebruikt werd. In 100 μΙ van die oplossing zat 3,6 mg gosereline. 1

Biologische evaluering

Het vrijkomen van gosereline uit de bovengenoemde formuleringen 1 t/m 6 in vivo werd bepaald door dagelijks de vaginale uitstrijkjes van gedoteerde vrouwelijke ratten te bekijken. De normale oestrus-cyclus 27 195056 « (oestrus, dioestrus, met-oestrus en pro-oestrus) kan uit de aandelen van de diverse typen cellen ‘ (leucocyten-, epitheel- en verhoomde cellen) in het uitstrijkje bepaald worden. Als de afgifte van het geneesmiddel uit de formuleringen continu is wordt de normale oestrus-cyclus onderbroken en blijven de ratten in de dioestrus, zo lang het vrijkomen van gosereline voortgaat 5

Formuleringen nr.’s 1 t/m 6 werden aan groepen van zes vrouwelijke ratten met regelmatige cyclus toegediend, in een dosis van 3,6 mg gosereline per rat. Voor het subcutaan toedienen van de formuleringen werd een injectiespuit met naald ”20” gebruikt. Als blanco diende een groep van vijf ratten waarvan niets 10 toegediend werd. Dagelijks werden van die ratten vaginale uitstrijkjes gemaakt en die werden bekeken om de oestrus-fase van elk dier na te gaan, en de verkregen uitkomsten waren als volgt:

Formulering nr. Gemiddelde duur van de dioestrus 15 (dagen) (± standaard fout) 1 100 ±2,7 2 120 ±6,3 3 69 ± 5,9 20 4 59 ±1,2 5 61 ± 2,1 6 53 ± 3.7 25 Uit die uitkomsten kan men zien dat alle zes formuleringen langer dan 6 weken gosereline afgaven en dat formuleringen nr.’s 1 en 2 drie maanden of langer gosereline afgaven. Verder kan men uit deze voorbeelden zien dat de formuleringen van de gosereline-polyester-zouten als oplossingen verstrekt kunnen worden, welke parenteraal met een fijne injectienaald toegediend kunnen worden, en dat zulke formuleringen geschikt zijn voor de behandeling van door hormonen bepaalde tumoren in de mens.

30

Voorbeeld 17 Formulering nr. 1

Als formulering nr. 1 van voorbeeld 16.

35

Formulering nr. 2

De in voorbeeld 16 (i) beschreven werkwijze werd herhaald, waarbij nu een lactide-homopolymeer met één eindstandige carboxyl-groep (Mw = 5092, polydispersiteit = 1,44, MG volgens titratie van de eindgroep 2270) en 0,46 g goserelineacetaat gebruikt werden. Het gehalte van deze amorfe stof aan azijnzuur werd 40 met gaschromatografie bepaald en bleek 0,14% te zijn.

Van dit gosereline-polylactide-zout werd 1 g in 2 ml benzylbenzoaat gebracht (99% van Janssen) en dat werd onder schudden verwarmd met een In de hand gehouden heteluchtpistool totdat de vaste stof in oplossing gegaan was.

In 110 pl van die oplossing zat 3,6 mg gosereline.

45

Formulering nr. 3

In 100 ml ijsazijn werden 7,86 g 95/5-lactide/glycolide-copolymeer met één enkele eindstandige carboxyl-groep (Mw = 5750, polydispersiteit = 1,50, MG volgens titratie van de eindgroep 2516) en 0,98 g goserelineacetaat opgelost. Die oplossing werd bevroren door ze in vloeibare stikstof te druppelen, gevolgd door 50 twee dagen vriesdrogen.

De verkregen vaste stof werd nog 24 uur bij 40°C nagedroogd. Het azijnzuur-gehalte van deze gevriesdroogde stof werd met gaschromatografie bepaald en bleek 0,17% te zijn.

Van dit gosereline-lactide/glycolide-zout werd 1 g in 2 ml benzylbenzoaat gebracht (99% van Janssen) en dat werd onder schudden verwarmd met een in de hand gehouden heteluchtpistool totdat de vaste stof in 55 oplossing gegaan was. In 110 pl van die oplossing zat 3,6 mg gosereline.

Men kan dus zien dat formulering van gosereline als polyester-zout goede oplosbaarheid aan dat geneesmiddel geeft, zodat het in lipofiele oplosmiddelen zoals benzylbenzoaat opgelost kan worden, waarin 195056 28 goserelineacetaat zelf niet oplosbaar is.

Biologische evaluering 5 Formuleringen nr.’s 1-3 werden in een dosis van 3,6 mg gosereline per rat toegediend aan groepen van 10 vrouwelijke ratten met regelmatige cyclus, net zoals beschreven in voorbeeld 16. Na dit doseren bleken de dieren in een periode van voortdurende dioestrus te komen, wat een continue afgifte van gosereline aangeeft. De gemiddelde duur van die dioestrus-periode van elk van die groep ratten vindt men in de volgende tabel. Uit die tabel kan men zien dat alle drie formuleringen gosereline langer bleven afgeven dan 10 14 weken.

Formulering nr. Gemiddelde duur van de dioestrus (in dagen) 15 (± standaard fout) 1 104 (± 5,4) 2 99 (± 3,9) 3 101 (± 2,8) 20

Verder kan men uit deze voorbeelden zien dat de formuleringen van gosereline-polyester-zout als oplossingen geleverd kunnen worden die parenterale toediening met een nauwe injectiespuit toelaten, en dat zulke formuleringen geschikt zijn voor het behandelen van door hormonen in de mens bepaalde tumoren.

25 Voorbeeld 18

Formulering nr. 1

In 50 ml ijsazijn werd 4,5 g 95/5-lactide/glycolide-copolymeer met één enkele eindstandige carboxyl-groep per keten (Mw = 6806, polydispersiteit = 1,55, MG volgens titratie van de eindgroep 3027, inherente 30 viscositeit bij 1% in chloroform 0,108 dl/g) opgelost. Aan die oplossing werd 0,56 g goserelineacetaat toegevoegd (overeenkomende met 0,50 g gosereline) en dat mengsel werd 10 minuten geroerd, wat al een heldere oplossing gaf. Die werd ingevroren door het in vloeibare stikstof te druppelen, gevolgd door twee dagen vriesdrogen. De verkregen vaste stof werd toen nog 24 uur bij 40°C nagedroogd. Het azijnzuur-gehalte van de gevriesdroogde vaste stof werd met gaschromatografie bepaald en bleek 0,3% te zijn.

35 Van dit gosereline-lactide/glycolide-copolymeerzout werd 1,0 g in 2,0 ml benzylbenzoaat gebracht (99% van Janssen) en dat werd onder verwarming en roeren opgelost

De uiteindelijke oplossing bevatte 3,67 mg gosereline per 110 pl, en het gosereline-gehalte van het eindproduct was 10,0 gew.%. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Formulering nr. 2 2

De hierboven voor formulering nr. 1 beschreven werkwijze werd herhaald, waarbij men nu 4,0 g 95/5 3 lactide/glycolide-copolymeer met één enkele eindstandige carboxyl-groep (Mw = 6011, polydispersiteit = 4 1,56, MG volgens titratie van de eindgroep 2700, inherente viscositeit bij 1% in chloroform 0,099 dl/g) en 5 1,12 g goserelineacetaat (overeenkomende met 1,0 g vrije base) nam. Het azijnzuurgehalte van deze 6 gevriesdroogde vaste stof werd met gaschromatografie bepaald en bleek 0,83% te zijn, en het gosereline- 7 gehalte van het eindproduct was 19,46%.

8

Van dit gosereline-lactide/glycolide-zout werd 0,54 g in 2,46 ml benzylbenzoaat (99% van Janssen) 9 gebracht en het werd er onder verwarmen en roeren in opgelost. De uiteindelijke oplossing bevatte 3,50 mg 10 gosereline per 110 pl.

11 12

Formulering nr. 3 13

De hierboven voor formulering nr. 2 beschreven werkwijze werd herhaald, nu met 2,1 g lactide/ 14 glycolidecopolymeer en 1,0 g goserelineacetaat (overeenkomende met 0,9 g gosereline). Het azijnzuur 15 gehalte van deze gevriesdroogde stof werd met gaschromatografie bepaald en bleek 1,14% te zijn, en het 16 gosereline-gehalte van het eindproduct was 28,91 gew.%.

Van dit gosereline-lactide/glycolide-mengsel werd 0,36 g in 2,64 ml benzylbenzoaat gebracht (99% van Janssen) en het werd er onder verwarming en roeren in opgelost.

t 29 195056

De uiteindelijke oplossing bevatte 3,47 mg gosereline per 110 pl.

Formulering nr. 4 5 De hierboven voor formulering nr. 1 beschreven werkwijze werd herhaald, nu met 8,66 g 95/5-lactide/ glycolide-copolymeer met één eindstandige carboxyl-groep (Mw + 5604, polydispersiteit — 1,71, MG volgens titratie van de eindgroep 1960, inherente viscositeit bij 1% in chloroform 0,094 dl/g) en 1,08 g goserelinea-cetaat (overeenkomende met 0,96 g gosereline). Het azijnzuur-gehalte van de gevriesdroogde vaste stof werd met gaschromatografie bepaald en bleek 0,08% te zijn en het gosereline-gehalte van het eindproduct 10 was 9,90 gew.%.

Van dit gosereline-lactide/glycolide-mengsel werd 1,0 g aan 2,0 ml benzylbenzoaat toegevoegd (99% van Janssen) en het werd er onder verwarmen en roeren in opgelost. De uiteindelijke oplossing bevatte 3,67 g . gosereline per 110 μΙ.

15 Biologische evaluering

Formuleringen nr.’s 1-4 werden aan groepen van 9 of 10 vrouwelijke ratten met regelmatige cyclus toegediend, in een dosis van 3,6 mg gosereline per rat, net zoals beschreven in voorbeeld 16. Na dit toedienen bleken de dieren in een periode van voortdurende dioestrus te komen, wat een continue afgifte van gosereline aangeeft. De gemiddelde duur van de dioestrus van iedere groep van ratten ziet men in de 20 volgende tabel. Uit deze tabel kan men zien dat alle drie formuleringen gosereline gedurende ongeveer 3 maanden of langer bleven afgeven.

Formulering nr. Gemiddelde duur van de dioestrus 25 (in dagen) (± standaard fout) 1 114 ±1,8 2 94 ± 4,6 3 97 ±5,3 30 4 83 ±4,3

Verder kan men uit deze voorbeelden zien dat de formuleringen van het peptide-polyester-zout oplossingen kunnen geven die gemakkelijk parenteraal met een fijne injectienaald toe te dienen zijn, en dat zulke 35 formuleringen geschikt zijn voor de behandeling van door hormonen bepaalde tumoren bij de mens.

Voorbeeld 19

Van het gosereline-polyester-zout (ii) van voorbeeld 16 werd 3,75 g in 50 ml methyleenchloride opgelost, dat vooraf door een filter van 0,45 pm gehaald was. Die oplossing werd door een teflon filtermembraan van 40 0,5 pm (Whatman WTP) in een kolf gefiltreerd die in een autoclaaf gesteriliseerd was. Het oplosmiddel werd er in een draaiverdamper uitgehaald, wat een viskeuze vloeistof gaf, en lucht werd door een filter van 0,5 pm in die draaiverdamper gelaten. De viskeuze vloeistof werd onder vacuüm tot een wit schuim verwarmd en gedroogd. Het verkregen schuim werd in een cabinet met laminaire stroming in ampullen met krimpsluiting gebracht en vers gedestilleerde oplosmiddelen werden aan al die formuleringen van 45 gosereline-polyesterzout toegevoegd, die in wezen vrij van deeltjes waren.

Formulering nr. 1

In 3 ml benzylbenzoaat (vers gedestilleerd, kp = 10670 3 mb) werd 1 g vaste stof opgelost en dat werd met een heteluchtpistool verwarmd totdat de stof in oplossing was. In die formulering zat 3,6 mg gosereline per 50 145 pl.

Formulering nr. 2

Van de stof werd 1 g toegevoegd aan 1,7 ml benzylalkohol (vers gedestilleerd, kp = 4470,3 mb) en het werd er onder verwarming met een heteluchtpistool in opgelost.

55 Die formulering bevatte 3,6 mg gosereline per 100 pl.

* 195056 30

Biologische evatuehng

Twee groepen van tien vrouwelijke ratten kregen subcutaan met behulp van een injectiespuit met naald ”20” formuleringen nr.’s 1 en 2 in een dosis van 3,6 mg per rat.

Daarna werden uit de ratten op verschillende tijdstippen bloedmonsters genomen (na 1 week (n - 4), na 5 4 weken en na 6 weken (n = 3). De bloedmonsters werden door radioimmunoessaai op goserelina geanalyseerd. Met beide formuleringen werden meetbare gehalten aan gosereline gevonden, wat aangeeft dat deze formuleringen meerdere weken dat peptide bleven afgeven. In het bloedprofiel met formulering nr.

1 bleek er na ongeveer 4 weken een piek op te treden, terwijl de piek bij formulering nr. 2 na één week optrad en het bloedgehalte daarna monotoon bleef dalen. Het met formulering nr. 1 optredende bloedprofiel 10 wordt geacht wenselijker te zijn dan die met formulering 2, omdat meer constante bloedgehalten bereikt worden met benzoylbenzoaat als oplosmiddel voor deze formuleringen.

Verder kan men uit deze voorbeelden zien dat de formuleringen van het peptide-polyester-zout als oplossingen verstrekt kunnen worden die gemakkelijk met een fijne injectienaald parenteraal toe te dienen zijn, en dat zulke formuleringen geschikt zijn voor de behandeling van door hormonen bepaalde tumoren in 15 de mens.

Voorbeeld 20

In 100 ml methyleenchloride werd 9,0 g 95/5 lactide/glycolide-copolymeer met één enkele eindstandige carboxyl-groep (Mw = 6011, polydispersiteit = 1,56, MG door titratie van de eindgroep = 2700, inherente 20 viscositeit bij 1% in chloroform = 0,099 dl/g) opgelost. Hieraan werd onder roeren 1,124 g goserelineacetaat (overeenkomende met 1 g vrij gosereline) toegevoegd, gevolgd door nog 10 ml methanol. De troebele suspensie werd ongeveer een uur bij kamertemperatuur geroerd, waarbij een heldere oplossing ontstond.

Het oplosmiddel werd er in een draaiverdamper uit verwijderd, wat een heldere, viskeuze vloeistof gaf. Die werd toen net als te voren in methyleenchloride opgelost.

25 Die stap werd nog twee keer herhaald en de uiteindelijk verkregen viskeuze vloeistof werd onder hoog vacuüm gedroogd tot een wit schuim, die overnacht onder hoog vacuüm verder gedroogd werd. Het schuim werd tot een wit poeder opgebroken, dat een dag bij kamertemperatuur onder vacuüm gedroogd werd. Aan dit poeder werd 20 ml benzylbenzoaat toegevoegd (99% van Janssen) en het ontstane mengsel werd onder schudden zacht verwarmd, wat een oplossing gaf.

30

Biologische evaluering

Deze gosereline-formulering werd subcutaan aan 45 vrouwelijke ratten toegediend met behulp van een injectiespuit met naald ”20” in een dosis van 220 pl, met in elk 7,3 mg gosereline. Groepen van vijf ratten werden afgemaakt op dagen 1 en 4 en na 1, 3, 5, 7, 9,11 en 13 weken en daar werden bloedmonsters uit 35 genomen. Bovendien werden bloedmonsters genomen uit de staartaders van groepen van vijf ratten na 2, 4, 6, 8,10 en '12 weken. De monsters werden door radioimmunoessaai op gosereline onderzocht en de uitkomsten laten zien dat deze formuleringen van gosereline-polyester-zouten 11 weken lang meetbare bloedgehalten aan dat peptide gaven, en laten dus zien dat de formulering in vivo een lang aanhoudende afgifte van gosereline geeft.

40 Verder kan men uit deze voorbeelden zien dat de formuleringen van dit peptide-polyester-zout als oplossingen verstrekt kunnen worden die zich gemakkelijk met een injectienaald met nauwe naald parenteraal laten toedienen en dat zulke formuleringen geschikt lijken voor het behandelen van door hormonen in de mens veroorzaakte tumoren. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Voorbeeld 21 2

Van het als "stof P” bekende peptide In de vorm van zijn acetaat (van Sigma) werd 2 mg grondig met 3 ml 3 methyleenchloride geschud. Het peptide vertoonde geen tekenen van oplossen, en het bleef een troebele 4 suspensie.

5

In 25 ml methyleenchloride werd 225 mg 70/30 lactide/glycolide-copolymeer met één enkele eindstandige 6 carboxyl-groep (Mw = 9755, polydispersiteit = 1,52, MG volgens titratie van de eindgroep = 1800) opgeno 7 men. Dat werd 15 minuten tot een heldere, kleurloze oplossing geroerd. Hieraan werd een oplossing van 8 25 mg stof P in 0,5 ml methanol toegevoegd. De ontstane troebele suspensie werd 1 uur geroerd, waarna 9 er een volledig heldere oplossing gevormd was. Het oplosmiddel werd in een draaiverdamper verwijderd en 10 de heldere "glasachtige” stof werd opnieuw in 5 ml methyleenchloride opgelost en dat werd opnieuw 11 drooggedampt. Dat werd tweemaal herhaald. De uiteindelijke vaste stof werd in 3 ml methyleenchloride opgelost en die oplossing werd langzaam op een met PTFE bekleed weefsel gedruppeld, waarna men het oplosmiddel liet verdampen en er een dunne film heldere, kleurloze, glasachtige vaste stof ontstond (met 31 195056 « peptide-gehalte van 9,1 gew.%).

Van dit stofje met film werd 96,8 mg in een kleine ampul geplaatst en er werd 2 ml met fosfaat gebufferde zout-oplossing (pH = 7,4) aan toegevoegd, welke vooraf door een filter van 0,2 pm gehaald was en 0,02% natriumazide als conserveringsmiddel bevatte. De ampul werd in een broedstoof op 37°C gehouden 5 en de buffer werd er periodiek uitgenomen en vervangen. De uitgenomen buffer werd op de vrijkomende stof met een ultraviolet-spectrofotometer (Hewlett Packard 8452A) bij 210 nm gemeten tegen standaardoplossingen van stof P. Uit de uitkomsten blijkt dat stof P in methyleenchloride kan oplossen als zout van een lactide/ glycolide-copolymeer met carboxyl-uiteinden, en dat het tot een dunne film verwerkt kan worden, welke het peptide gedurende ongeveer 4 weken continu afgeeft 10

Voorbeeld 22

Van een waterige oplossing met 330 mg/ml leuprolide-acetaat (ook wel bekend als ’’leuprorelineacetaat”) werd 300 pl onder sterke afschuifkrachten toegevoegd aan 20 ml 10% oplossing van polyhydroxystearine-zuur met een naar getal gemiddeld molecuulgewicht van ongeveer 2000 in Miglyol 812 (triglyceriden van 15 middelmatig lange verzadigde vetzuren en linoleenzuur, afkomstig vein Dynamit Nobel) wat een leuprolide-polymeer-zout gaf, ten dele aan het scheidingsvlak van olie met water, welk zout de kolloïdale water-in-olie-suspensie verder stabiliseert. Het water werd er onder roeren en onder hoog vacuüm uit verwijderd, totdat het mengsel niet langer borrelde en schuimde, wat een oliepreparaat met een heel fijne troebeling gaf, dat voor oraal toedienen geschikt was.

20

Voorbeeld 23

Aan 3 ml methyleenchloride werd onder roeren 2 mg Lyse-vasopressine-acetaat (van Sigma) toegevoegd. Het peptide vertoonde geen tekenen in die vloeistof op te lossen en het bleef een troebele suspensie.

Aan 5 ml methyleenchloride werd 225 mg 70/30 lactide/glycolide-copolymeer met één enkele eindstan-25 dige carboxyl-groep (Mw = 9755, polydispersiteit = 1,52, MG volgens titratie van de eindgroep 1800) toegevoegd. Het mengsel werd 15 minuten geroerd tot een heldere, kleurloze oplossing. Hier aan werden 25 mg Lys8-vasopressine (van Sigma) en 0,5 ml methanol toegevoegd. De ontstane troebele suspensie werd een uur geroerd, waarbij zich een volledig heldere oplossing vormde. Het oplosmiddel werd er in een draaiverdamper uitgehaald en de heldere "glasachtige” vaste stof werd in 5 ml methyleenchloride opgelost 30 en die werd opnieuw verdampt. Dat werd tweemaal herhaald. Uiteindelijk werd de vaste stof in 3 ml methyleenchloride opgelost en die oplossing werd langzaam op met PTFE bekleed weefsel gedruppeld, waarna men het oplosmiddel liet verdampen zodat zich een dunne film van heldere, kleurloze, glasachtige stof vormde (met Lys8-vasopressine-gehalte van 10 gew.%).

Van deze film werd 97,31 mg in een klein vaatje geplaatst en er werd 2 ml met fosfaat gebufferde 35 zoutoplossing (pH = 7,4) aan toegevoegd, welke vooraf door een filter van 0,2 pm gehaald was en 0,02% natriumazide als conserveringsmiddel bevatte. Het vaatje werd in een broedstoof op 37eC gehouden en de buffer werd er zo nu en dan uitgenomen en dan vervangen. De buffer werd in een ultraviolet-spectrofotometer (Hewlett Packard 8452A) bij 210 nm op het vrijkomende Lyse-vasopressine geanalyseerd, tegen standaardoplossingen van Lyse-vasopressine. De uitkomsten van deze proef staan in de volgende 40 tabel. Uit de proef blijkt dat Lys8-vasopressine als zout van lactide/glycolide-copolymeer met carboxyl-uiteinden in methyleenchloride kan oplossen, en dat dit mengsel gedurende ten minste 4 weken dit peptide continu afgeeft.

Vrijkomen van Lys8-vasopressine in vitro 45 Tijd (dagen) Vrijkomen van Lys°vaso pressine uit de film (in %) 1 4,11 4 5,45 50 7 5,55 14 5,75 21 26,82 28 47,27 % 195056 32

Voorbeeld 24

Twee met polyethyleenglycol 5000 gemodificeerde formuleringen van ZENECA ZD6003 ([Met'1, Arg11,

Ser17·27,60,65] menselijk G-CSF (granulocyten-kolonie stimulerende factor)) zoals beschreven in vergelijkings-voorbeelden 4 en 7 van het Europese octrooischrift nr. 0.473.268 in lactide/glycolide-copolymeer werden als 5 volgt aangemaakt.

(i) Aan 39,72 mg gevriesdroogd preparaat van ZD6003 werd 4 ml methyleenchloride toegevoegd. Dat leidde tot een wittige dispersie van geneesmiddel in oplosmiddel. Er werd 363,6 mg 75/25 lactide/glycolide-copolymeer met één enkel eindstandige carboxyl-groep (Mw = 9963, polydispersiteit = 2,19, MG volgen titratie van de eindgroep = 2815) aan toegevoegd en er ontstond een heldere oplossing.

10 Die oplossing werd onder sterke afschuifkrachten toegevoegd aan 400 ml 0,25% methylcellulose van 15 mPa.s (Methocel van Fluka) in water. Na 3 minuten roeren in dit tempo werd het roeren vertraagd tot 800 rpm. Men liet de deeltjes toen 30 minuten onder de zwaartekracht bezinken, waarbij de vloeistof met ijs gekoeld bleef. De bovenstaande vloeistof werd toen weggedaan en de deeltjes werden door opnieuw suspenderen in 50 ml ijskoud water en centrifugeren op 1000 rpm gewassen. Dat werd viermaal herhaald 15 en tenslotte werden de deeltjes gevriesdroogd.

De op.deze wijze gemaakte deeltjes waren van goede kwaliteit, bolvormig met een gemiddelde doorsnede van 32 pm, zoals men onder de gewone microscoop kon zien. Het gehalte van deze deeltjes aan actieve stof werd bepaald door extractie gevolgd door HPLC, en bleef 9,45% te zijn, wat een opname-efficiëntie van 96% in de microdeeltjes was.

20 (ii) Aan 44,18 mg gevriesdroogd preparaat van ZD6003 werd 4 ml methyleenchloride toegevoegd. Dat leidde tot een ondoorzichtige dispersie van het geneesmiddel in die vloeistof. Er werd 364,1 mg 75/25 lactide/glycolide-copolymeer (van Boehringer Ingelheim, Mw = 16.800 volgens uitsluitingschromatografie en polydispersiteit 2,2) aan toegevoegd. Er werd een poging gedaan het molecuulgewicht van het polymeer door titreren van de eindgroepen te bepalen, maar dat bleek door het erg lage gehalte aan titreerbare 25 groepen niet mogelijk, en dit polymeer heeft dus geen eindstandige carboxyl-groepen. Het mengsel van oplossing van de actieve stof en het polymeer werd bij toevoegen van het polymeer niet helder en het bleef een troebele dispersie, wat aangeeft dat er - bij afwezigheid van zure eindgroepen in het polymeer - geen peptide-polyester-zout ontstaat

Dit mengsel werd op onder afschuifkrachten (Heidolph roerder RZR50 met 2150 rpm) in 400 ml 0,25% 30 methylcellulose met 15 mPa.s (Methocel van Fluka) toegevoegd. Na 3 minuten roeren onder dit tempo werd de roersnelheid tot 800 rpm verlaagd. Men liet de ontstane deeltjes 30 minuten onder de zwaartekracht bezinken, waarbij de vloeistof op ijs koud gehouden werd. De bovenstaande vloeistof werd toen weggedaan en de deeltjes werden door opnieuw suspenderen in 50 ml gedestilleerd water en centrifugeren op 1000 rpm uitgewassen. Dat werd viermaal herhaald en de deeltjes werden tenslotte gevriesdroogd.

35 De op deze wijze gemaakte deeltjes waren, vergeleken met de volgens (i) hierboven verkregen deeltjes, van inferieure kwaliteit, sommige onregelmatig van vorm en met een gemiddelde afmeting van 40 pm, zoals men bij bekijken onder de gewone microscoop kon zien. Het gehalte van deze deeltjes aan actieve stof werd bepaald door HPLC na extractie en bleek 2,05% te zijn, wat een opname-efficiëntie van 19% in de microdeeltjes betekende.

40 Het bovenstaande voorbeeld laat zien dat ZD6003 in aanwezigheid van een polymeer met eindstandige carboxylgroepen in methyleenchloride kan oplossen, ook al is methyleenchloride zelf geen oplosmiddel voor dat peptide. Bovendien kan zo’n oplossing gebruikt worden voor het vormen van microdeeltjes van dat peptide met het polymeer, met een hoge mate van opname van dat geneesmiddel. Daarentegen laat dit voorbeeld ook zien dat ZD6003 in aanwezigheid van een polymeer niet in methyleenchloride kan oplossen 45 als dat polymeer geen eindstandige carboxyl-groepen heeft en dan alleen maar een mistige dispersie geeft

Verder leidt zo’n mistige dispersie van ZD6003 in een oplossing van een polymeer zonder eindstandige carboxylgroepen bij het verwerken tot microdeeltjes tot slechte opname van dat geneesmiddel.

Voorbeeld 25 50 (i) Aan 2,21 g benzylbenzoaat (99% van Janssen) werd 22,47 mg goserelineacetaat (overeenkomende met 19,99 mg vrije base) toegevoegd. Dat mengsel werd in een broedstoof van 40°C geplaatst en 9 dagen met een magnetische roerder geroerd. Na 2 dagen en 9 dagen werden monsters van bekende grootte genomen en 15 minuten op 13.000 rpm gecentrifugeerd, waardoor niet opgeloste geneeskrachtige stof gesedimen-teerd werd. Porties van de bovenstaande vloeistof (van ongeveer 100 mg) werden nauwkeurig in maatkol-55 ven van 50 ml afgewogen. Aan elk daarvan werd 2 ml ijsazijn toegevoegd, gevolgd door aanvullen met 0,05% trifluorazijnzuur in water. Een deel van die oplossing werd in een centrifugebuis geplaatst en 15 minuten op 13.000 rpm gecentrifugeerd, waardoor gesuspendeerd materiaal gesedimenteerd werd. De

Claims (14)

33 195056 bovenstaande vloeistof werd dan met HPLC op gosereline geanalyseerd. In geen van beide monsters werd ' gosereline aangetoond. Bij deze HPLC-bepaling is de ondergrens van het aantoonbare 0,2 pm/ml en de ondergrens voor het kwantitatief bepaalbare was 0,5 pm/ml. De evenwichtsoplosbaarheid (bij 40°C) van gosereline in benzylbenzoaat kan hieruit dus op minder dan 0,2 pm/mg gesteld worden. 5 (ii) Aan 3,38 g benzylbenzoaat (99% van Janssen) werd 291,9 mg 95/5 lactide/glycolide-copolymeer met één enkele eindstandige carboxyl-groep (Mw - 6742, polydispersiteit = 1,61, MG volgens titratie van de eindgroep = 2565, inherente viscositeit bij 1% in chloroform = 0,103 dl/g) toegevoegd. Aan deze oplossing werd 22,52 mg goserelineacetaat (overeenkomende met 20,03 mg vrij gosereline) toegevoegd. Dat mengsel werd geïncubeerd zo^ls hierboven bij (i) beschreven. Na twee dagen was nog geen 10 gosereline in het benzoylbenzoaat aantoonbaar, maar na 9 dagen vond men ongeveer 0,2 pg/mg benzylbenzoaat. De aantoningsgrens van het gosereline bij deze bepaling is hierboven bij (i) aangegeven. Hieruit kan men zien dat de evenwichtsoplosbaarheid (bij 40°C) van gosereline in benzylbenzoaat, indien als eenvoudig mengsel met lactide/glycolide-copolymeer aanwezig, op 0,2-0,5 pm/mg geschat kan worden. (iii) In 100 ml methyleenchloride werd 9,0 g 95/5 lactide/glycolide-copolymeer met één enkele eindstan-15 dige carboxyl-groep (Mw = 6011, polydispersiteit = 1,56, MG volgens titratie van de eindgroep = 2700, inherente-viscositeit bij 1% in chloroform = 0,099 dl/g) opgelost. Hieraan werd onder roeren 1,124 g goserelineacetaat (overeenkomende met 1 g gosereline) toegevoegd, gevolgd door 10 ml methanol. De troebele suspensie werd ongeveer 1 uur bij kamertemperatuur geroerd, waarbij een heldere oplossing ontstond. Het oplosmiddel werd in een draaiverdamper verwijderd, wat een 20 heldere vloeistof gaf. Die werd net als te voren in methyleenchloride opgelost en opnieuw gedroogd. Die stap werd nog twee keer herhaald en de uiteindeiijk verkregen viskeuze vloeistof werd onder hoog vacuüm gedroogd tot een wit schuim, dat overnacht verder onder vacuüm gedroogd werd. Dat schuim werd tot een fijn poeder opgebroken dat nog 1 dag bij kamertemperatuur onder vacuüm gedroogd werd. Aan dit poeder weg 20 ml benzylbenzoaat (99% van Janssen) toegevoegd en dat mengsel werd onder roeren zacht 25 verwarmd, waardoor een oplossing ontstond. Die oplossing werd grondig gemengd en een monster van 1 ml werd 30 minuten op 14.000 rpm gecentrifugeerd. Een monster van de bovenstaande vloeistof werd er zorgvuldig afgenomen en in een maatkolf van 50 ml afgewogen. In dit monster werd het gosereline bepaald zoals bij (i) beschreven. Het gosereline-gehalte van deze oplossing bleek 24,6 pm per mg benzylbenzoaat te zijn. 30 Dit voorbeeld laat zien dat benzoylbenzoaat voor goserelineacetaat een heel pover oplosmiddel is. Verder leidt het toevoegen van lactide/glycolide-polymeer tot een eenvoudig mengsel van goserelineacetaat niet tot een duidelijke toename van de oplosbaarheid in benzoylbenzoaat Maar het gosereline-polyester-zout kon in benzoylbenzoaat opgelost worden tot een oplossing met een veel hogere concentratie dan de hierboven bepaalde evenwichtsoplosbaarheid van vrij gosereline in dat 35 oplosmiddel.

1. Werkwijze voor het bereiden van een farmaceutisch preparaat dat een zout omvat gevormd uit een kation afgeleid van een peptide met ten minste één basische groep en een anion afgeleid van een op carboxy eindigende polyester, met het kenmerk, dat de werkwijze een stap omvat waarbij een vooraf verkregen zout, gevormd uit een kation afgeleid van een peptide met ten minste één basische groep en een anion afgeleid van een op carboxy eindigende polyester, wordt toegevoegd.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het zout wordt bereid door hetzij het peptide met ten minste één basische groep hetzij de op carboxy eindigende polyester in een overmaat ten opzichte van de stoichiome-trische hoeveelheid toe te voegen.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, die als verdere stap het toevoegen van extra peptide en/of extra polyester omvat.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, 2 of 3, waarbij het preparaat de vorm heeft van een oplossing of dispersie van het zout in een oplosmiddel dat een oplosmiddel is voor de vrije polyester maar niet voor het vrije peptide, waarbij de deeltjesgrootte van het zout in de dispersie kleiner dan 5 pm is.

5. Werkwij ze volgens conclusie 4, waarbij de deeltjesgrootte van het zout in de dispersie kleiner dan 0,2 μ is.

6. Werkwijze volgens conclusie 1, 2 of 3, waarbij het preparaat de vorm heeft van microdeeltjes.

7. Werkwijze volgens conclusie 1,2 of 3, waarbij het preparaat de vorm heeft van een implantaat.

8. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, waarbij het peptide farmacologisch werkzaam is. 195056 34 «

9. Werkwijze volgens conclusie 8, waarbij het peptide gosereline of een farmacologisch aanvaardbaar zout ervan is.

10. Werkwijze volgens een der conclusies 1-7, waarbij het peptide farmacologisch onwerkzaam is en het preparaat voorts een farmacologisch werkzaam peptide omvat

11. Werkwijze volgens conclusie 10, waarbij het farmacologisch onwerkzame peptide wordt gekozen uit polyarginine, polylysine en poly(arginine-co-lysine), (co) polymeren van neutrale aminozuren in D-, L- en DL-vorm met arginine en/of lysine in D-, L- of racemische vorm, peptiden en (co)polypeptiden waarvan de peptideketens op het N-uiteinde geheel of gedeeltelijk op een basische groep eindigen en waarvan de hoofdketen uit neutrale aminozuurresten bestaat.

12. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies waarbij de polyester wordt gekozen uit polyesters afgeleid van hydroxyzuren en polyesters gevormd door polycondensatie van diolen en/of polyolen met dicarbonzuren en/of polycarbonzuren.

13. Werkwijze voor het bereiden van een oplossing of dispersie vein een zout gevormd uit een kation afgeleid van een peptide met ten minste één basische groep en een anion afgeleid van een op carboxy 15 eindigende polyester, waarbij men het peptide dat ten minste één basisch aminozuur bevat in een vrije basevorm of in de vorm van een zout met een zwak zuur, en de op carboxy eindigende polyester oplost in een oplosmiddel waarin beide oplosbaar zijn en dat door vriesdrogen verwijderd kan worden, men de ontstane oplossing snel invriest, het ontstane bevroren mengsel vriesdroogt, het resulterende mengsel dispergeert in een oplosmiddel voor het polyester-bestanddeel en men het mengsel laat oplossen waarbij 20 het peptide-polyester-zout gevormd wordt.

14. Zout gevormd uit een kation afgeleid van een peptide met ten minste één basische groep en een anion afgeleid van een op carboxy eindigende polyester.