KR101105486B1 - Ｆｓｈ 및 ｌｈ과 비이온성 계면활성제의 액상 약제학적 제제 - Google Patents

Ｆｓｈ 및 ｌｈ과 비이온성 계면활성제의 액상 약제학적 제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 난포자극호르몬(FSH), 황체형성호르몬(LH), 및 FSH 및 황체형성호르몬(LH)의 혼합물의 약제학적 제제 분야에 관한 것이며, 그러한 제제를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 플루로닉®F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 FSH, 플루로닉 F68로부터 선택된 계면 활성제를 포함하는 LH, 또는 FSH 및 LH의 액상 또는 냉동건조 제제를 제공한다.
FSH, LH, 약제학적 조성물, 불임

Description

ＦＳＨ 및 ＬＨ과 비이온성 계면활성제의 액상 약제학적 제제{Liquid pharmaceutical formulations of FSH and LH together with a non-ionic surfactant}
본 발명은 난포-자극 호르몬(follicle-stimulating hormone: FSH), 황체형성호르몬(luteinising hormone: LH), 및 FSH와 황체형성호르몬(LH)의 혼합물의 약제학적 제제 분야, 및 그러한 제제를 제조하는 방법에 관한 것이다.
난포자극호르몬, 황체형성호르몬 및 융모성 성선자극호르몬(chorionic gonadotrophin: CG)은 생식샘 자극 호르몬류 (class of gonadotrophin)에 속하는 주사가능한 단백질이다. FSH, LH 및 hCG 는 불임 및 생식기 계통 질환의 남녀 환자의 치료에 단독 또는 혼합하여 사용된다.
자연적으로, FSH 및 LH는 뇌하수체(pituitary gland)에 의해 생성된다. 약제학적 용도로, FSH 및 LH 및 이들의 변이체(variant)들은 재조합방식으로 제조되거나(rFSH 및 rLH), 또는 폐경후 여성의 오줌으로부터 제조될 수 있다(uFSH 및 uLH).
FSH는 보조생식기술(assisted reproductive technologies: ART)을 위해 배란 유도(ovulation induction: OI) 및 조절난소초자극(controlled ovarian hyperstimulation: COH)을 위해 여성 환자에 사용된다. 배란유도를 위한 전형적인 치료요법에서는, FSH 또는 변이체들(약 75~300 IU FSH/일)을 약 6~12일 동안 매일 환자에게 주사투여한다. 조절난소초자극을 위한 전형적인 치료요법에서는, FSH 또는 변이체들은(약 150~600 IU FSH/일) 매일 약 6~12일 동안 환자에게 주사 투여한다.
FSH는 또한 정자부족증(oligospermia)으로 고통받는 남자에게 정자 발생(spermatogenesis)을 유도하기 위해 사용된다. 주 세번씩 150 IU FSH을 주 두 번씩 2'500 IU hCG과 함께 사용하는 치료법은 생식샘저하증(hypogonadotrophic hypogonadism1)으로 고통받는 남자의 사정액내 정자수(sperm count)를 개선하는데 성공적이었다.
LH는 배란유도(OI)와 조절난소초자극(COH)시 FSH와 함께 여성 환자들, 특히 생식샘저하증으로 고통받는 여성들(HH, WHO 군 I)이나 나이든 환자(즉 35세 이상)과 같이 매우 낮은 내부 LH 준위(endogenous LH level) 또는 LH 저항성(resistance to LH)을 갖는 환자들, 및 배아 이식(embryo implantation)이나 조기 유산(early miscarriage)이 문제인 환자들에게 사용된다. FSH와 결합된 LH은 전통적으로 폐경 후 여성의 오줌으로부터 추출된 소위 폐경여성 성선자극호르몬(human menopausal gonadotrophins: hMG) 시료에서 이용되어 왔다. hMG는 1:1 비율의 FSH:LH 활성도를 갖는다.
CG는 LH와 동일한 수용체에서 작용하고 동일한 반응을 유도해 낸다. CG는 LH보다 더 긴 순환반감기(circulation half-life)를 갖으므로 지속성 LH 활성원으로 일반적으로 사용된다. CG는 OI 및 COH 치료법에 사용되어 천연 LH 피크를 모방하여 배란을 촉발한다. FSH 또는 FSH과 LH의 혼합물을 가지고 하는 자극 마지막 단계에서 배란을 촉발하기 위하여, hCG를 주입한다. 상술한 바와 같이,LH-활성이 요구되는 환자들에게 자극중에 LH 활성을 제공하기 위하여, OI 및 COH를 위한 자극 동안 CG가 FSH와 함께 사용될 수도 있다.
FSH, LH 및 CG는 갑상선자극호르몬(thyroid stimulating hormone: TSH)을 또한 포함하는 이질이합체(heterodimer)인 당단백질 호르몬 족(glycoprotein hormone family)의 일원이다. 이 족의 구성원들은 α- 및 β-서브유니트(subunit)를 포함하는 이질이합체이다. 상기 서브유니트들은 비공유 상호작용으로 서로 붙잡혀있다. 인간 FSH(hFSH) 이질이합체는 (i) 다른 인간 호르몬족 구성원들(즉, 융모성 성선자극호르몬("CG"), 황체형성호르몬("LH") 및 갑산성자극호르몬("TSH"))에게도 일반적인 성숙 92 아미노산 당단백질 알파 서브유니트(mature 92 amino acid glycoprotein alpha subunit); 및 (ii) FSH2에 유일한 성숙 111 아미노산 베타 서브유니트(mature 111 amino acid subunit)로 이루어진다. 인간 LH 이질이합체는 (i) 성숙 92 아미노산 당단백질 서브유니트; 및 (ii) LH3에 유일한 성숙 112 베타 서브유니트로 이루어진다. 상기 당단백질의 알파 및 베타 서브유니트는 보존제(preservative), 계면활성제 및 다른 부형제와의 상호작용으로 인하여 제형화시 해리하는 경향이 있다. 서브유니트의 해리는 생화학적 효능4에 손실을 일으킨다.
FSH는 근육내(intramuscular: IM) 주사 또는 피하(subcutaneous: SC) 주사용으로 조제된다. FSH는 2~25℃로 저장될 때 1년 반에서 2년의 저장 기간을 갖는 75 IU/바이알(vial) 및 150IU/바이알의 바이알이나 앰플내에 냉동건조(고형) 형태로 공급된다. 주사용 용액은 냉동건조품을 주사용 물(water for injection: WFI)로 재가공함으로써 형성된다. 배란 유도나 조절난소초자극을 위해서는, 75IU의 투여량으로 시작하여 600IU까지, 약 10일 동안 매일 주사하는 것이 바람직하다. FSH의 양을 증가하는 치료법을 환자의 반응에 따라 3회까지 늘릴 수 있다. 냉동건조된 제제를 가지고, 환자는 희석제로 새로운 바이알의 냉동건조 물질을 재가공하고, 일단위로 재가공후 바로 투여할 필요가 있다[Packge insert N1700101A, 1996 2월 공고, Fertinex TM (urofolitropin for injection, purified) for Subcutaneous injection, by Serono Laboratories, Inc., Randolph, MA].
FSH는 또한 바이알이나 앰플로 싱글도즈(single-dose) 또는 멀티도즈(multi-dose) 액상으로 제형될 수 있다. 싱글도즈 형은 사용 전 저장시 안정하고 효과적이어야만 한다. 멀티도즈형은 사용 전 저장시 안정하고 효과적이어야만 할 뿐 아니라, 앰플의 밀봉이 손상된 후, 멀티도즈 사용 요법 투여기간 동안 박테리아에 대해 상대적으로 안정하고 효과적이어야만 한다. 이러한 이유로, 멀티도즈 형은 때때로 정균제(bacteiostatic agent)를 포함한다.
LH는 근육내(IM) 주사나 피하(SC) 주사용으로 제제된다. LH는 2~25℃로 저장될 때 1년 반에서 2년의 저장 기간을 갖는 75 IU/바이알의 바이알이나 앰플내에 냉동건조(고형) 형태로 공급된다. 주사용 용액은 주사용 물(WFI)로 냉동건조품을 재가공하여 형성된다. 배란 유도나 조절난소초자극을 위해서는, FSH와 함께, 75IU의 투여량으로 시작하여 600IU까지, 약 10일 동안까지 매일 주사하는 것이 요구된다.
EP 0 618 808(어플라이드 리서치 시스템즈 ARS 홀딩 엔.브이.: Applied Reasearch Systems ARS Holding N.V.)는 생식샘자극호르몬과 안정량(stabilizing amount)의 수크로오스(sucrose) 단독 또는 수크로오스와 글리신의 고형 인접 혼합물(solid intimate mixture)을 포함하는 약제학적 조성물을 개시한다.
EP 0 814 841(어플라이드 리서치 시스템즈 ARS 홀딩 엔.브이.)는 재조합 인간 융모생식샘자극호르몬(hCG)과 안정량의 만니톨(mannitol)을 포함하는 안정한, 액상의 약제학적 조성물을 개시한다.
EP 0 448 146(AKZO N.V.)는 1 중량부의 생식샘자극호르몬; 및 상기 생식샘자극호르몬과 관련된 디카르복실산염 안정화제 200~10,000 중량부를 포함하는 냉동건조물을 포함하는 안정화된 생식샘자극호르몬을 개시한다.
EP 0 853 845(Akzo Nobel N.V.)는 생식샘자극호르몬과 안정량의 폴리카르복실산 또는 그의 염 및 안정량의 티오에테르 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 액상 생식샘자극 호르몬 함유 제제를 개시한다.
WO 00/04913 (엘리 릴리 엔드 코.: Eli Lily and Co.)는 알파 또는 베타 서브유니트를 포함하는 FSH 또는 FSH 변이체, 및 페놀, m-크레졸(cresol), p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알콜, 알킬파라벤(alkylparaben)(메틸, 에틸, 프로 필, 부틸등), 염화벤잘코늄(benzalkonium chloride), 염화벤제토늄(benzethonium chloride), 데히드로초산나트륨(sodium dehydroacetate) 및 티메로살(thimerosal)로 이루어진 군으로부터 선택된 보존제, 또는 그의 혼합물을 수용성 희석제 내에 포함하는 제제를 개시한다.
싱글도즈나 멀티도즈 투여를 위한 FSH 또는 FSH 변이체, 및 FSH과 LH의 혼합물의 안정한 액상 제제가 여전히 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 FSH 또는 FSH 변이체, LH 또는 LH 변이체의 새로운 액상 제제뿐 아니라 새로운 냉동건조된 제제, 그의 제조방법 및 불임 빌명의 치료에 대한 그들의 약제학적 또는 수의학적 용도를 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 FSH 및 LH의 혼합물의 새로운 냉동 건조 및 액상 제제, 그의 제조방법 및 불임 질병 치료에 대한 그들의 약제학적 또는 수의학적 용도에 대한 방법을 제공하는 것이다.
첫 번째 양태에서, 본 발명은 FSH 또는 그의 변이체, 및 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드, 바람직하게는 플루로닉(Pluronic® ) F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68의 블록 공중합체로부터 선택된 계면활성제를 포함하는 냉동 건조 및 액상 약제학적 조성물을 제공한다.
두 번째 양태에서, 본 발명은 FSH 또는 그의 변이체, 및 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드, 바람직하게는 플루로닉® F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68의 블록 공중합체로부터 선택된 계면 활성제 및 WFI의 용액을 형성하는 단계를 포함하는 액상 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
세 번째 양태에서, 본 발명은 FSH, 및 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드, 바람직하게는 플루로닉® F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68의 블록 공중합체로부터 선택된 계면활성제를 포함하는 용액을 용기에 시약하는 단계를 포함하는 포장된 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
네 번째 양태에서, 본 발명은 FSH 또는 FSH 변이체, 및 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드, 바람직하게는 플루로닉® F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68의 블록 공중합체로부터 선택된 계면활성제의 용액 및 첫 번째 사용 후 약 24시간 이상의 기간 동안 용액을 유지할 수 있다고 서면 자료를 포함하는 바이알을 포함하는 인간의 약제학적 용도를 위한 제조품을 제공한다.
다섯 번째 양태에서, 본 발명은 FSH 및 LH, 및 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드, 바람직하게는 플루로닉® F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68의 블록 공중합체로부터 선택된 계면 활성제를 포함하는 냉동 건조 및 액상 약제학적 조성물을 제공한다.
여섯 번째 양태에서, 본 발명은 FSH 및 LH ,및 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드, 바람직하게는 플루로닉® F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68의 블록 공중합체로부터 선택된 계면활성제의 용액을 형성하는 단계를 포함하는 냉동 건조 및 액상 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
일곱 번째 양태에서, 본 발명은 FSH 및 LH, 및 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드, 바람직하게는 플루로닉® F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68의 블록 공중합체로부터 선택된 계면활성제를 포함하는 용액을 용기로 시약하는 단계를 포함하는 포장된 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
여덟 번째 양태에서, 본 발명은 FSH 및 LH, 및 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드, 바람직하게는 플루로닉® F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68의 블록 공중합체로부터 선택된 계면활성제를 포함하는 용액 및 첫번째 사용 후 약 24시간 이상의 기간동안 용액을 유지할 수 있다고 서면 자료를 포함하는 바이알을 포함하는 인간의 약제학적 용도를 위한 제조품을 제공한다.
아홉 번째 양태에서, 본 발명은 냉동건조된 FSH 또는 FSH 변이체, 및 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드, 바람직하게는 플루로닉® F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68의 블록 공중합체로부터 선택된 계면 활성제를 포함하는 제1 용기, 및 재가공 용매, 바람직하게는 정균제, 바람직하게는 m-크레졸을 포함하는 수용성 용액을 포함하는 제2 용기를 포함하는 인간의 약제학적 용도를 위한 제조품을 제공한다.
열 번째 양태에서, 본 발명은 냉동 건조된 LH 또는 LH 변이체, 및 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드, 바람직하게는 플루로닉® F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68의 블록 공중합체로부터 선택된 계면 활성제를 포함하는 제1 용기; 및 재가공 용매, 바람직하게는 정균제, 바람직하게는 m-크레졸을 포함하는 수용성 용액을 포함하는 제2 용기를 포함하는 인간의 약제학적 용도를 위한 제조품을 제공한다.
열한 번째 양태에서, 본 발명은 냉동 건조된 FSH 뿐만 아니라 LH 또는 FSH 또는 LH 변이체, 및 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드, 바람직하게는 플루로닉® F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68의 블록 공중합체로부터 선택된 계면활성제를 포함하는 제1 용기; 및 재구성 용매, 바람직하게는 m-크레졸을 갖는 수용성 용액을 포함하는 제2 용기를 포함하는 인간의 약제학적 용도를 위한 제조품을 제공한다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 액상 및 냉동건조 FSH 또는 FSH와 LH 제제는 개선되거나 좀 더 적당한 성질이나 안정성을 갖으며, 여성 및/또는 남성의 불임치료에 유용하다. 이들 제제 및 제조품은 주사용으로 또한 적당하며 다른 투여 방법, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지는 않지만, 코(nasal), 폐(pulmonary), 점막 경유(transmucosal), 피부경유(transdermal), 경구(oral), 피하(subcutaneous), 근육내(intramuscular) 또는 비경구적(parenteral) 지효성 투여(sustained release)에 적당하다. 특히 바람직한 실시예에서, 본 발명의 제제는 피하 및/또는 근육내 주사용이다. 제조된 FSH 또는 FSH와 LH 변이체 용액 및 제제는, 예를 들면 빈도, 투여량, 안락, 사용의 용이성, 생체내 또는 생체외 생물학적 활동도 등과 같은 방식의 적어도 하나를 개선하여 투여의 효과 또는 욕구를 개선하거나, 활동도 또는 안정성의 손실을 줄이거나 방지함으로써, 잘 알려진 상업적 제품에 비하여 시간에 따른 생체내 효능을 또한 증가시킬 수 있다.
여기 사용된 것으로서 난포자극호르몬 또는 FSH은 인간 FSH 또는 "hFSH"-여기에 한정되지는 않음-을 포함하는 완전한 길이의 성숙 단백질로서 제조된 FSH을 말하며, 폐경기 여성의 오줌과 같이 인간의 분비물로부터 분리되거나 재조합적으로 제조된다. 인간 당단백질 알파 서브유니트의 단백질 시퀀스는 SEQ ID NO:1로서 제조되며, 인간 FSH 베타 서브유니트의 단백질 시퀀스는 SEQ ID NO:2로서 주어진다.
"FSH 변이체" 표현은 아미노산 시퀀스, 당화패턴(glycosylation pattern)이 다르거나 또는 인간 FSH의 인터-서브유니트 결합이 다르지만 FSH 활동도를 나타내는 분자들을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들면, 야생형 α-서브유니트 및 하이브리드 β-서브유니트로 이루어진 저활성 변형 재조합 FSH(long-acting modified recombinant FSH), CTP-FSH를 포함하며, 여기서 하이브리드 β-서브유니트는 FSH의 β-서브유니트의 C-말단에 hCG의 카르복시 말단 펩타이드가 융합되었다[라폴트(LaPolt) 등에 의해 기술된, 내분비학(Endocrinology); 1992, 131, 2514`2520; 또는 클라인(Klein)등에 의해 기술된; 저활성 재조합 hFSH 작용제(agonist)의 개발과 특징; Human Reprod. 2003, 18, 50~56]. 또한 다음 시퀀스(N-말단으로부터 C 말단까지)로 이루어진 단일 체인 분자, CTP-FSH를 포함한다:
βFSH βhCG-CTP(113-145) αFSH
클라인 등에 의해 기술된 것처럼, 여기서 βFSH는 FSH의 β서브유니트를 의미하며, βhCG-CTP(113-145)는 hCG의 카르복시 말단 펩타이드를 의미하며, αFSH는 FSH의 α-서브유니트를 의미한다. FSH 변이체의 다른 예로는 WO01/58493(맥시겐:Maxygen), 특히 WO01/593의 청구항 10 및 11에 기술된 것처럼, α- 및/또는 β-서브유니트에 통합된 추가적 당화 사이트를 갖는 FSH 분자, 및 WO98/58957에 기술된 것처럼 인터서브유니트 S-S 결합을 갖는 FSH 분자를 포함한다.
여기서 관계된 FSH 변이체는 SEQ ID NO:2의 완전한 길이의 성숙 단백질보다 짧은 베타 서브유니트의 카르복시 말단 결실(carboxy terminal deletion)을 포함하는 것으로 한다. 인간 베타 서브유니트의 카르복시 말단 결실은 SEQ IDS NOS: 3, 4 및 5로 제조된다. 상기 베타 체인의 카르복시 말단 변이체는 공지의 알파 서브유니트를 사용하여 이합체(dimer)를 형성하여 FSH 변이체 이질이합체(heterodimer)를 형성하는 것으로 이해된다.
FSH 이질이합체 또는 FSH 변이체 이질이합체는 본 건처럼 천연 원료로부터 분리 또는 정제, 또는 화학적 합성 또는 그의 결합에 의해, 재조합과 같은 다른 적당한 방법으로 제조될 수 있다.
"재조합체" 용어는, 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조된 FSH, LH 또는 FSH 와 LH 변이체를 나타낸다(예를 들어 WO/85/01958). 몇 몇 종의 알파 및 베타 서브유니트에 대한 FSH의 유전체 및 cDNA 클론의 시퀀스가 알려져 있다6. 재조합 기술을 사용하여 FSH 또는 LH를 발현하는 방법의 한 예는, 유럽 특허 번호 제 EP 0 211 894호 및 제 EP 0 487 512호에 기술된 것처럼, 별도의 프로모터를 갖는 각각의 서브유니트를 갖는 하나 또는 두 개의 벡터 상에 제공된, FSH 또는 LH의 알파 및 베타 서브유니트를 암호화하는 DNA 시퀀스를 갖는 진핵세포(eukaryotic cell)를 형질전환(transfection)하는 것이다. FSH 또는 LH를 제조하기 위하여 재조합 기술을 사용하는 또 다른 예는, 유럽 특허 번호 제 EP 0 505 500호(어플라이드 리서치 시스템즈 ARS 홀딩 엔브이)에 기술된 것처럼, FSH 또는 LH의 서브 유니트를 암호화하는 내인성 시퀀스(endogenous sequence)에 이종 조절 단편(heterologous regulatory segment)을 수술 연결로 삽입하는 상동재조합(homologous recombination) 기술을 사용하는 것이다.
본 발명에 따라 사용된 FSH 또는 FSH 변이체는 동물세포로부터 얻는 것을 포함하는 재조합 수단뿐만 아니라, 오줌원으로부터 얻는 것과 같이 생물학적 원료로부터 정제될 수도 있다. 허용가능한 방법론은 하콜라, 케이. 분자 및 세포 내분비학, 127:59-69, 1997(Hakola, K. Molecular and Cellular Endocrinology); 키네등, 제이. 바이올.켐., 264:4769~4775, 1989(Keene, et al., J. Biol. Chem., ); 세르파-폴작 등(Cerpa-Poljak, et al.)., 내분비학, 132:351~356, 1993; 다이아스 등(Dias, et al), 제이., 바이올. 켐., 269:25289~25294, 1994; 플락등(Flack, et al.)., 제이. 바이올. 켐., 269:14015~14020, 1994; 및 발로브등(Valove, et al), 내분비학, 135:2657~2661, 1994, 미국 특허 제 3,119,740호 및 제5,767,067호에 기술된 것들을 포함한다.
여기서 사용된 황체형성호르몬 또는 LH는 폐경기 여성의 오줌과 같이 인간 분비물을로부터 분리되거나 재조합적으로 제조되어진, 인간 LH 또는 "hLH"-그러나 이에 한정되지는 않음-를 포함하는 완전한 길이의 성숙 단백질로서 제조된 LH를 나타낸다. 인간 당단백질 알파 서브유니트의 단백질 시퀀스는 SEQ ID NO:1로 제조되며, 인간 LH 베타 서브유니트의 단백질 시퀀스는 SEQ ID NO: 6으로 주어진다. 바람직한 실시예에서, 상기 LH는 재조합체이다.
"LH 변이체" 표현은 아미노산 시퀀스, 당화패턴이 다르거나 또는 인간 LH의 인터-서브유니트 결합이 다르지만 LH 활동도를 나타내는 분자들을 포함하는 것을 의미한다.
LH 이질이합체 또는 LH 변이체 이질이합체는 재조합과 같은 적당한 방법, 본 건처럼 자연원으로부터 분리 또는 정제하는 방법, 또는 화학적 합성, 또는 그들의 조합방법으로 제조될 수 있다.
"투여" 또는 "투여하는"의 용어는 본 발명의 제제를 질병 또는 질환의 치료를 위해 필요시 환자의 몸 안에 들이는 것을 의미한다.
"환자"의 용어는 질병이나 질환을 위해 치료된 포유동물을 의미한다. 환자들은 인간, 양, 돼지, 말, 소, 토끼 등과 같은 것을 기원으로 하나 이에 한정되지는 않는다.
FSH 활동도에 관련된 "효능"의 용어는 스틸맨-포레이 분석8(Steelman-Pohley assay)에서 난소 체중 증가, 또는 여성 환자의 난포성장(follicular growth)과 같이 FSH와 관련된 생물학적 반응들을 이끌어내는 FSH 제제 또는 혼합된 제제의 능력을 나타낸다. 여성 환자의 난포 성장은 예를 들면, 모의 치료 8일째 약 16mm의 평균 직경을 갖는 난포의 수의 형식으로 초음파에 의해 평가될 수 있다. 생물학적 활동도는 FSH에 대해 일반적으로 인정된 기준을 사용하여 평가된다.
LH 활동도와 관련된 "효능"의 용어는 정낭 체중 증가법(seminal vesicle weight gain method)과 같이 LH와 관련된 생물학적 반응을 이끌어내는 LH 제제 또는 혼합된 제제의 능력을 말한다. LH의 생물학적 성능은 LH에 대해 일반적으로 인정된 표준에 관하여 평가된다.
"수용성 희석제" 용어는 물을 포함하는 액상 용매를 말한다. 수용성 용매계는 물 단독으로, 또는 물에 하나 이상의 혼합가능한 용매로 이루어질 수 있으며, 설탕, 완충제, 염 또는 다른 부형제와 같이 해리된 용질을 포함할 수 있다. 더 일반적으로 사용된 비수용성 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올과 같은 짧은 사슬 유기알콜, 아세톤과 같은 짧은 사슬 케톤, 및 글리세롤과 같은 폴리 알콜이다.
"등장제(isotonicity agent)"는 생리적으로 내성이 있고 적당한 긴장성을 제제에게 주어 제제에 접촉하는 세포막을 가로지르는 물의 순이동을 방지하는 화합물이다. 글리세린과 같은 화합물은 공지의 농도로 그러한 목적을 위해 일반적으로 사용된다. 다른 적당한 등장제는 아미노산 또는 프로테인(예를 들면, 글리신 또는 알부민), 염(예를 들면, 염화나트륨), 및 설탕(예를 들면, 덱스트로오스, 수크로오스 및 락토오스)을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
"정균적" 또는 "정균제"의 용어는 항균제로 작용하도록 제제에 첨가되는 화합물이나 조성물을 말한다. 본 발명의 제제를 포함하는 보존된 FSH 또는 FSH 변이체 또는 FSH 및 LH는 상업적으로 사용가능한 다용도 제품, 특히 인체 내에서 사용가능하도록 하는 보존적 효과에 대한 법령 또는 관리 지침을 만족하는 것이 바람직하다. 정균제의 예로는 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질알콜, 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄, 데하이드로아세테이트 나트륨 및 티메로살을 포함한다.
"완충제" 또는 "생리학적으로 허용가능한 완충제"의 용어는 제제 내에서 약제학적 또는 수의학적 사용에 안전한 것으로 알려진 것으로 상기 제제에 대해 원하는 범위의 pH로 제제의 pH를 조절하거나 유지하는 효과를 갖는 화합물의 용액을 나타낸다. 중성산 pH에서 중성 염기 pH로 pH를 조절하는 허용가능한 완충제는 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 아르기닌, TRIS, 및 히스티딘과 같은 화합물을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. "TRIS"는 2-아미노-2-히드록시메틸-1,3-프로판디올 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 나타낸다. 바람직한 완충제는 염수 또는 허용가능한 염을 갖는 포스페이트 완충제이다.
"포스페이트 완충제"의 용어는 원하는 pH로 조절된 인산 또는 그의 염을 포함하는 용액을 말한다. 일반적으로 포스페이트 완충제는 인산, 또는 나트륨 및 칼륨염-그러나 이에 한정되지는 않음-을 포함하는 인산염으로부터 제조된다. 인산의 몇 가지 염들은 산의 나트륨 및 칼륨의 일염기, 이염기 및 삼염기산 염과 같이 종래 기술로 알려져 있다. 인산의 염들은 자연발생염의 수화물로서 발생하는 것으로 또한 알려져 있다. 포스페이트 완충제는 약 pH 4 ~ pH 10과 같은 pH 범위를 포괄할 수 있으며, 바람직하게는 약 pH 5 ~ pH 9의 범위, 더욱 바람직하게는 약 pH 6.0~8.0, 가장 바람직하게는 약 pH 7의 범위를 포괄할 수 있다.
"바이알"의 용어는 포함된 무균 상태로 고형 또는 액상 형태로 FSH를 보유하는데 적당한 보존기에 대하여 폭넓게 사용된다. 여기서 사용된 바이알의 예로서 앰플, 카트리지(cartridge), 블리스터 포장(blister package), 또는 바늘, 펌프(삼투압 포함), 도관(catheter), 피부통과 패취(transdermal patch), 폐 또는 점막 스프레이를 통해 환자에게 FSH를 전달하기에 적당한 기타의 보존기를 포함한다. 비경구적, 폐, 점막, 또는 피부 통과 투여를 위한 제품 포장에 적당한 바이알은 종래기술에 잘 알려져 있다.
"안전성"의 용어는 본 발명의 제제에서 FSH 및 LH의 물리적, 화학적 및 형태적(conformational) 안정성을 나타낸다(생물학적 효능의 유지를 포함). 단백질 제제의 불안정성은 단백질 분자의 화학적 분해나 응집으로 인해 더 고차원의 중합체를 형성하거나, 이질이합체의 단량체로의 해리, 탈당화(deglycosylation), 당화의 변형, 산화(특히 α-서브유니트의 산화) 또는 본 발명에 포함된 FSH 폴리펩타이트의 적어도 하나 이상의 생물학적 활동도를 감소시키는 다른 구조적 변형에 의해 야기될 수 있다.
"안정한" 용액 또는 제제는 그 안의 단백질의 분해, 변형, 응집, 생물학적 활성도의 손실 등의 정도가 허용가능하게 조절되고, 시간의 경과와 함께 조절할 수 없을 정도로 증가하지는 않는 것을 말한다. 바람직하게는 상기 제제는 약 2~8℃, 더욱 바람직하게는 약 4~5℃의 온도에서 6 개월 동안 적어도 약 80%의 표지된 FSH 활성도 및 적어도 약 80%의 표지된 LH 활성도를 보유한다. FSH 활성도는 스틸맨-폴레이 난소 체중 증가 생물학적 분석5(bioassay)을 사용하여 측정될 수 있다. LH 활성도는 정낭 무게 증가 생물학적 분석10을 사용하여 측정될 수 있다.
"처치"의 용어는 난포 또는 고환 자극(testicular stimulation) 또는 FSH 및/또는 LH에 의해 조절된 다른 생리학적 반응을 위해 FSH 및/또는 LH 투여가 요구되는 환자에 투여, 계속 관리(follow up), 관리 및/또는 치료를 나타낸다. 처치는 그러므로 남성에 있어서 정자 질의 개선 및 유도, 테스토스테론의 분비의 자극, 여성에 있어서 난포 발달(follicular development) 또는 배란 유도를 위해 FSH 및/또는 LH의 투여를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
"멀티도즈 용도"의 용어는 한번 이상의 주입, 예를 들면 2, 3, 4, 5, 6 이상의 주입를 위해 하나의 바이알, 앰플 또는 카트리지의 FSH 제제 또는 FSH와 LH 제제를 사용하는 것을 포함한다. 주입은 적어도 약 12시간, 24시간, 48시간 등의 기간에 걸쳐, 바람직하게는 약 12일의 기간까지의 기간에 걸쳐 이루어지는 것이 바람직하다. 주입은 예를 들면, 6, 12, 24, 48 또는 72 시간의 기간으로 시간 간격을 둘 수 있다.
단백질의 "염"은 산 또는 염기 첨가 염이다. 그러한 염들은 바람직하게는 단백질 내 하나 이상의 하전기(charged group)와 하나 이상의 생물학적으로 허용가능한, 비독성 양이온 또는 음이온들 사이에 형성된다. 유기 및 무기 염들은 예를 들면, 염산, 유황산(sulphuric acid), 술폰산(sulfonic acid), 타르타르산(tartaric acid), 푸마르산(fumaric acid), 브롬화수소산(hydrobromic acid), 글리콜산(glycolic acid), 시트르산(citric acid), 말레인산(maleic), 인산, 숙신산(succinic acid), 아세트산, 질산, 벤조인산, 아스코르브산(ascorbic acid), p-톨루엔술포닌산, 벤젠술포닌산, 나프탈렌술포닌산, 프로피온산, 탄산 등과 같은 산 또는 예를 들면, 암모늄, 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘으로부터 제조된 것들을 포함한다.
본 발명자들은 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드, 바람직하게는 플루로닉® F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉® F68, 특히 바람직하게는 플루로닉 F68(BASF, 플루로닉 F68은 또한 폴록사머 188로 알려져 있다)의 블록 공중합체로부터 선택된 계면활성제를 가지고 FSH 및 FSH와 LH의 혼합물을 제제화함으로써 바이알 및/또는 전달 장치(예를 들면 주사, 펌프, 도관 등)의 표면으로의 흡수로 야기된 유효성분(FSH 또는 FSH와 LH)의 손실을 최소화하는 안정한 제제를 얻는다는 것을 발견하였다.
본 발명자들은 또한 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드, 바람직하게는 플루로닉® F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉® F68, 특히 바람직하게는 플루로닉 F68(BASF, 플루로닉 F68은 또한 폴록사머 188로 알려져 있다)의 블록 공중합체로부터 선택된 계면활성제를 가지고 FSH 및 FSH와 LH의 혼합물을 제제화함으로써, m-크레졸 및 페놀과 같은 정균제의 존재하에서 침전의 문제점을 피할 수 있는 안정한 제제를 얻을 수 있다는 것을 발견하였다. 혼탁 또는 우유 용액을 일으키는 침전은 TWEEN 20이 m-크레졸 또는 페놀과 함께 사용될 때 발생한다.
플루로닉 계면활성제는 에틸렌 옥사이드(EO) 및 플로필렌 옥사이드(PO)의 블록 공중합체이다. 프로필렌 옥사이드 블록(PO)은 두개의 에틸렌 옥사이드(EO) 블록 사이에 샌드위치되어 있다.
Figure 112005055780857-pct00001
EO PO EO
플루로닉 계면 활성제는 두 단계 공정으로 합성된다:
1. 프로필렌 옥사이드를 프로필렌 글리콜의 두 개의 히드록시기에 조절 첨가하여 원하는 분자량의 소수성을 제조하는 단계; 및
2. 에틸렌 옥사이드를 첨가하여 친수성기 사이에 소수성을 끼워 넣는 단계.
플루로닉® 77에서, 폴리옥시에틸렌(친수성)의 퍼센트는 70%이며, 소수성(폴리옥시프로필렌)의 분자량은 약 2,306Da이다.
플루로닉 F87에서, 폴리옥시에틸렌(친수성)의 퍼센트는 70%이며, 소수성(폴리옥시프로필렌)의 분자량은 약 2,644Da이다.
플루로닉 F88에서, 폴리옥시에틸렌(친수성)의 퍼센트는 80%이며, 소수성(폴리옥시프로필렌)의 분자량은 약 2,644Da이다.
플루로닉 F68에서, 폴리옥시에틸렌(친수성)의 퍼센트는 80%이며, 소수성(폴리옥시프로필렌)의 분자량은 약 1,967Da이다.
플루옥시 F77의 전형적인 성질은 다음에 리스트하였다:
평균 분자량: 6600;
용융/유동 점(melt/pour point): 48℃;
20℃에서 물리적 형태: 고체;
점도(점도계:brookfield) cps: 480[25℃에서 액상, 60℃에서 페이스트 및 77℃에서 고체];
표면 장력, 25℃에서 dynes/cm;
0.1% 농도: 47.0
0.01% 농도: 49.3
0.001% 농도: 52.8
누졸(Nujol) 대한 계면 장력, 25℃에서 dynes/cm;
0.1% 농도: 17.7
0.01% 농도: 20.8
0.01% 농도: 25.5
드레이브 습윤(Draves Wetting), 25℃ 초;
1.0% 농도: > 360
0.1% 농도: > 360
기포 높이
로스 마일(Ross Miles), 0.1%, 50℃에서 mm: 100
로스 마일(Ross Miles), 0.1%, 26℃에서 mm: 47
역동성(dynamic), 0.1%, 400㎖/min에서 mm : >600
수용액에서 구름점, ℃
1% 농도: > 100
10% 농도: > 100
HLB (친수-친지 균형: hydrophile-lipophile balance): 25
플루로닉 F87의 전형적인 성질은 다음에 리스트되어 있다:
평균 분자량: 7700;
용융/유동 점: 49℃;
20℃에서 물리적 형태: 고체;
점도(점도계) cps: 700[25℃에서 액상, 60℃에서 페이스트 및 77℃에서 고체];
표면 장력, 25℃에서 dynes/cm;
0.1% 농도: 44.0
0.01% 농도: 47.0
0.001% 농도: 50.2
누졸(Nujol) 대한 계면 장력, 25℃에서 dynes/cm;
0.1% 농도: 17.4
0.01% 농도: 20.3
0.01% 농도: 23.3
드레이브 습윤, 25℃ 초;
1.0% 농도: > 360
0.1% 농도: > 360
기포 높이
로스 마일, 0.1%, 50℃에서 mm: 80
로스 마일, 0.1%, 26℃에서 mm: 37
역동성(dynamic), 0.1%, 400㎖/min에서 mm : >600
수용액에서 구름점, ℃
1% 농도: > 100
10% 농도: > 100
HLB (친수-친지 균형: hydrophile-lipophile balance): 24
플루로닉 F88의 전형적인 성질은 다음에 리스트되어 있다:
평균 분자량: 11400;
용융/유동 점: 54℃;
20℃에서 물리적 형태: 고체;
점도(점도계) cps: 2300[25℃에서 액상, 60℃에서 페이스트 및 77℃에서 고체];
표면 장력, 25℃에서 dynes/cm;
0.1% 농도: 48.5
0.01% 농도: 52.6
0.001% 농도: 55.7
누졸(Nujol) 대한 계면 장력, 25℃에서 dynes/cm;
0.1% 농도: 20.5
0.01% 농도: 23.3
0.01% 농도: 27.0
드레이브 습윤, 25℃ 초;
1.0% 농도: > 360
0.1% 농도: > 360
기포 높이
로스 마일, 0.1%, 50℃에서 mm: 80
로스 마일, 0.1%, 26℃에서 mm: 37
역동성(dynamic), 0.1%, 400㎖/min에서 mm : >600
수용액에서 구름점, ℃
1% 농도: > 100
10% 농도: > 100
HLB (친수-친지 균형: hydrophile-lipophile balance): 28
플루로닉 F68의 전형적인 성질은 다음에 리스트되어 있다:
평균 분자량: 8400;
용융/유동 점: 52℃;
20℃에서 물리적 형태: 고체;
점도(점도계) cps: 1000[25℃에서 액상, 60℃에서 페이스트 및 77℃에서 고체];
표면 장력, 25℃에서 dynes/cm;
0.1% 농도: 50.3
0.01% 농도: 51.2
0.001% 농도: 53.6
누졸(Nujol) 대한 계면 장력, 25℃에서 dynes/cm;
0.1% 농도: 19.8
0.01% 농도: 24.0
0.01% 농도: 26.0
드레이브 습윤, 25℃ 초;
1.0% 농도: > 360
0.1% 농도: > 360
기포 높이
로스 마일, 0.1%, 50℃에서 mm: 35
로스 마일, 0.1%, 26℃에서 mm: 40
역동성(dynamic), 0.1%, 400㎖/min에서 mm : >600
수용액에서 구름점, ℃
1% 농도: > 100
10% 농도: > 100
HLB (친수-친지 균형): 29
상기 리스트된 것과 유사한 성질을 같는 다른 중합체도 또한 본 발명의 제제에 사용될 수 있다. 바람직한 계면 활성제는 플루로닉 F68과 이와 유사한 성질을 갖는 계면 활성제이다.
플루로닉, 특히 플루로닉 F68은 원하는 저장기간(예를 들면, 6~12~24 개월) 동안 FSH 및/또는 LH 안정성을 유지하기에 충분한 농도이면서 또한, 바이알, 앰플 또는 카트리지 또는 주사와 같이 표면 흡착으로 인한 단백질의 손실을 방지하기에 충분한 농도로 제제 내에서 존재하는 것이 바람직하다.
바람직하게는 플루로닉, 특히 플루로닉 F68의 액상 제제에서의 농도는 약 0.01mg/ml~약 1mg/ml, 더욱 바람직하게는 0.05mg/ml~0.5mg/ml, 더욱 바람직하게는 0.2mg/ml~0.4mg/ml, 가장 바람직하게는 약 0.1mg/ml이다.
동결건조 제제 내 난포자극호르몬(FSH)은 총 제제의 약 0.1~10㎍/mg의 농도(w/w)로 존재하는 것이 바람직하다. 한 실시예에서, 난포자극호르몬(FSH)는 총 제제의 약 0.3~5㎍/mg의 농도로 존재한다. 또 다른 실시예에서, 난포자극호르몬(FSH)은 총 제제의 약 0.37~2㎍/mg의 농도로 존재한다.
동결건조 제제 내 황체형성호르몬(LH)은 총 제제의 약 0.1~3㎍/mg의 농도로 존재하는 것이 바람직하다. 한 실시예에서, 황체형성호르몬(LH)은 총 제제의 약 0.1~1㎍/mg의 농도로 존재한다. 또 다른 실시예에서, 황체형성호르몬(LH)은 총 제제의 0.1~0.6㎍/mg의 농도로 존재한다.
FSH를 포함하는 액상 제제-재가공 제제를 포함-에서, 제제 내의 FSH의 농도는 약 150IU/ml~2,000IU/ml, 더욱 바람직하게는 약 300IU/ml~1,500IU/ml, 더욱 더 바람직하게는 450IU/ml~750IU/ml, 가장 바람직하게는 600IU/ml이다.
LH를 포함하는 액상 제제-재가공 제제를 포함-에서, 제제 내 LH의 농도는 약 50IU/ml~2,000IU/ml, 더욱 바람직하게는 150IU/ml~1,500IU/ml, 더욱 더 바람직하게는 300IU/ml~750IU/ml, 특히 바람직하게는 625IU/ml이다.
FSH 및 LH를 포함하는 제제에서, FSH 대 LH의 비(FSH:LH, IU:IU, FSH는 쥐 난소 무게 증가 분석으로 측정하고 LH는 쥐 정낭 무게 증가 분석으로 측정)는 약 6:1~1:6, 더욱 바람직하게는 4:1~1:2, 더욱 더 바람직하게는 3:1~1:1의 범위 내인 것이 바람직하다. 특히 바람직한 비는 1:1 및 2:1이다.
동결 건조 제제에서는, 계면 활성제, 예를 들면 플루로닉 F68은 총 제제의 약 0.001~0.1mg/mg의 농도, 바람직하게는 0.01~0.075mg/mg의 농도로 존재하는 것이 바람직하다.
재가공 제제에서, 플루로닉, 특히 플루로닉 F68의 농도는 약 0.01~1mg/ml, 더욱 바람직하게는 0.05~0.5mg/ml, 더욱 더 바람직하게는 0.2~0.4mg/ml, 가장 바람직하게는 0.1mg/ml이다.
FSH 및 LH는 재조합되어 제조되는 것이 바람직하며, 특히 FSH 또는 LH의 인간 당단백질 알파-서브유니트 및 베타-서브유니트의 유전암호를 지정하는 DNA를 포함하는 벡터 또는 벡터들로 형질 전환된 중국 햄스터 난소 세포에서 제조되는 것이 바람직하다. 알파 및 베타-서브유니트를 암호화하는 DNA는 동일한 벡터 또는 다른 벡터에 존재할 수 있다.
재조합체 FSH 및 LH는 그의 뇨대조체(urinary counterpart)에 비해 몇 가지 장점을 갖는다. 재조합 세포를 사용하는 배양과 분리 기술에 의하면 뱃치(batch)들 사이에 일관성이 유지된다. 반대로, 뇨 FSH 및 LH는 서브 유니트의 순도, 당화패턴, 사이알리레이션(sialylation) 및 산화와 같은 특징들이 뱃치마다 매우 크게 변한다. 재조합체 FSH 및 LH는 뱃치 간의 일관성 및 순도가 높기 때문에, 등전압촛점맞추기(isoelectric focussing: IEF)과 같은 기술을 사용하여 호르몬을 쉽게 동정하고 정량화할 수 있다. 재조합체 FSH 및 LH가 용이하게 동정되고 정량화될 수 있다는 점은 생물학적 분석법에 의한 충전보다는 호르몬 덩어리로 바이알을 충전할 수 있게 한다.
본 발명의 FSH의 제제는 pH 7.0, pH 7.2 및 7.4pH를 포함하는, 6.0~8.0 사이의 pH, 바람직하게는 6.8~7.8pH를 갖는 것이 바람직하다. 바람직한 완충제는 바람직한 상대이온(counterion)으로 나트륨 또는 칼륨 이온을 갖는 포스페이트이다. 둘베코 인산염 완충 식염수(Dulbecco's Phosphate buffered saline)와 같은 인산염 완충 식염수가 종래 기술에서 잘 알려져 있다. 총 용액에서 완충제 농도는 약 5mM, 9.5mM, 10mM, 50mM, 100mM, 150mM, 200mM, 250mM, 및 500mM 사이에서 변할 수 있다. 바람직하게는 완충제 농도는 약 10mM이다. 특히 pH 7.0을 갖는 포스페이트 이온의 완충액 10mM가 바람직하다.
본 발명의 FSH 및 LH의 혼합물의 제제는 약 pH 7.0, pH 8.0 및 pH 8.2를 포함하는, 6.0~9.0 사이의 pH, 더욱 바람직하게는 6.8~8.5pH, 가장 바람직하게는 약 pH 8.0이 바람직하다.
본 발명은, 액상 제제뿐 아니라 재가공될 수 있는 동결건조(동결) 제제로도 가능하며, 여기서 용매는(재가공도 역시 동일)는 주사용 물이다. 액상 제제는 싱글도즈 또는 멀티도즈일 수 있다. 멀티도즈 용도를 의도한 본 발명의 액상 및 동결건조 FSH 및/또는 LH 제제는 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질알콜, 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸등), 티몰(thymol), 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄, 데히드로아세테이트 나트륨 및 티머로살과 같은 정균제를 포함하는 것이 바람직하다. 특히 페놀, 벤질알콜 및 m-크레졸이 바람직하며, 페놀 및 m-크레졸이 더욱 바람직하며, m-크레졸이 가장 바람직하다. 상기 정균제는 멀티도즈 주입기간 동안 제제를 반드시 무균(주입에 적당한 정도)을 유지하는 데 효과적인 농도를 줄 수 있는 양으로 사용되며, 여기서 멀티도즈 주입기간은 약 12시간 또는 24시간 ~ 12일 또는 14일, 바람직하게는 약 6일~12일일 수 있다. 정균제는 약 0.1%(정균제의 질량/용매의 질량)~약 2.0%, 더욱 바람직하게는 0.2%~1.0%가 바람직하다. 벤질 알콜의 경우에, 바람직한 농도는 0.9%이다. 페놀의 경우에, 특히 바람직한 농도는 약 0.5%이다. m-크레졸의 경우에, 특히 바람직한 농도는 0.3%이다(예를 들면 WFI에서 약 3mg/ml).
바람직한 실시예에서, 본 발명은 FSH 또는 그의 변이체, 플루로닉® 77, 플루로닉F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68로부터 선택된 계면 활성제, 및 m-크레졸과 페놀로부터 선택된 정균제, 바람직하게는 m-크레졸을 포함하는 액상의 약제학적 조성물, 바람직하게는 멀티도즈 용도로 제조되는 액상의 약제학적 조성물을 제공한다.
더 바람직한 실시예에서, 본 발명은 LH, 플루로닉® 77, 플루로닉F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68로부터 선택된 계면 활성제, 및 m-크레졸과 페놀로부터 선택된 정균제, 바람직하게는 m-크레졸을 포함하는 액상의 약제학적 조성물, 바람직하게는 멀티도즈 용도로 제조되는 액상의 약제학적 조성물을 제공한다.
더 바람직한 실시예에서, 본 발명은 FSH과 LH, 플루로닉® 77, 플루로닉F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68로부터 선택된 계면 활성제, 및 m-크레졸과 페놀로부터 선택된 정균제, 바람직하게는 m-크레졸을 포함하는 액상의 약제학적 조성물, 바람직하게는 멀티도즈 용도로 제조되는 액상의 약제학적 조성물을 제공한다. FSH와 LH는 약 2:1~1:1의 비로 존재하는 것이 바람직하다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명은 FSH 또는 그의 변이체, 및 플루로닉 F®77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68로부터 선택된 계면 활성제, 및 m-크레졸과 페놀로부터 선택된 정균제, 바람직하게는 m-크레졸, 및 WFI의 수용액을 형성하는 단계를 포함하는 액상 약제학적 조성물을 제조하는 방법, 바람직하게는 멀티도즈 용도로 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명은 LH, 플루로닉 F®77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68로부터 선택된 계면 활성제, 및 m-크레졸과 페놀로부터 선택된 정균제, 바람직하게는 m-크레졸, 및 WFI의 수용액을 형성하는 단계를 포함하는 액상 약제학적 조성물을 제조하는 방법, 바람직하게는 멀티도즈 용도로 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명은 FSH와 LH, 플루로닉 F®77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68로부터 선택된 계면 활성제, 및 m-크레졸과 페놀로부터 선택된 정균제, 바람직하게는 m-크레졸, 및 WFI의 수용액을 형성하는 단계를 포함하는 액상의 약제학적 조성물을 제조하는 방법, 바람직하게는 멀티도즈 용도로 액상의 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
보다 더 바람직한 실시예에서, 본 발명은 FSH, 플루로닉 F®77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68로부터 선택된 계면 활성제, 및 m-크레졸 및 페놀로부터 선택된 정균제, 바람직하게는 m-크레졸을 포함하는 용액을 시약하는 단계를 포함하는 포장된 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명은 FSH와 LH, 플루로닉 F®77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68로부터 선택된 계면 활성제, 및 m-크레졸 및 페놀로부터 선택된 정균제, 바람직하게는 m-크레졸을 포함하는 용액을 시약하는 단계를 포함하는 포장된 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명은 FSH 또는 FSH 변이체의 용액, 플루로닉 F®77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68로부터 선택된 계면 활성제, 및 m-크레졸 및 페놀로부터 선택된 정균제, 바람직하게는 m-크레졸, 및 첫 번째 사용 후 약 24시간 이상 기간 동안 용액을 유지할 수 있다고 서면 자료를 포함하는 바이알을 포함하는 인간의 약제학적 용도를 위한 제조품을 제공한다.
상기 서면 자료는 첫번째 사용 후 약 12 또는 14일까지 용액을 유지할 수 있다는 것을 나타내고 있는 것이 바람직하다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명은 FSH 및 LH의 용액, 플루로닉 F®77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68로부터 선택된 계면 활성제, 및 m-크레졸 및 페놀로부터 선택된 정균제, 바람직하게는 m-크레졸, 첫 번째 사용 후 약 24시간 이상의 기간 동안 용액을 유지할 수 있다고 서면 자료를 포함하는 바이알을 포함하는 인간의 약제학적 용도를 위한 제조품을 제공한다. 상기 서면 자료는 첫번째 사용 후 약 12 또는 14일까지 용액을 유지할 수 있다는 것을 나타내고 있는 것이 바람직하다.
특히 바람직한 실시예에서, 상기 제제는 m-크레졸 및 플루로닉 F68을 포함한다. 본 발명자들은 놀랍게도 플루로닉 F68을 포함하는 제제가 m-크레졸이 존재시 다른 계면활성제에서 관찰되는 문제인 침전이 생기지 않는다는 것을 발견하였다.
첫 번째 사용 전에, 즉 바이알 앰플이나 카트리지의 밀봉이 벌어지기 전에, 본 발명의 제제는 적어도 6, 12 또는 24 개월 동안 유지될 수 있다. 바람직한 저장 조건하에서, 첫 번째 사용전에, 제제는 약 2~8℃, 보다 바람직하게는 약 4~5℃의 온도에서, 직사광선을 피한다(바람직하게는 어두운 곳에 보관).
구체적인 실시예에서, 본 발명은 FSH 또는 그의 변이체, 및 플루로닉® F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68로부터 선택된 계면 활성제, 바람직하게는 플루로닉 F68을 포함하는 재가공용 냉동 건조 제제, 바람직하게는 멀티도즈 용도의 냉동 건조 제제를 제공한다.
또 다른 구체적인 실시예에서, 본 발명은 LH, 플루로닉® F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68로부터 선택된 계면 활성제, 바람직하게는 플루로닉 F68을 포함하는 재가공용 냉동 건조 제제, 바람직하게는 멀티도즈 용도의 냉동 건조 제제를 제공한다.
또 다른 구체적인 실시예에서, 본 발명은 FSH와 LH, 플루로닉® F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68로부터 선택된 계면 활성제, 바람직하게는 플루로닉 F68을 포함하는 냉동 건조 제제, 바람직하게는 멀티도즈 용도의 냉동 건조 제제를 제공한다.
FSH와 LH는 약 2:1~1:1의 비(FSH:LH)로 존재하는 것이 바람직하다.
또 다른 구체적인 실시예에서, 본 발명은 FSH 또는 그의 변이체와, 플루로닉® F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68로부터 선택된 계면 활성제와의 혼합물을 형성하고, 상기 혼합물을 냉동건조하는 단계를 포함하는 냉동건조 제제를 제조하는 방법, 바람직하게는 재가공 후 멀티도즈 용도로 사용되는 냉동 건조 제제를 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 구체적인 실시예에서, 본 발명은 LH과, 플루로닉® F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68로부터 선택된 계면 활성제의 혼합물을 형성하고, 상기 혼합물을 냉동건조하는 단계를 포함하는 냉동 건조 제제, 바람직하게는 재가공후 멀티도즈 용도로 사용되는 냉동 건조 제제를 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 구체적인 실시예에서, 본 발명은 FSH와 LH, 및 플루로닉® F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68로부터 선택된 계면 활성제의 혼합물을 형성하고 상기 혼합물을 냉동건조하는 단계를 포함하는 냉동 건조 제제, 바람직하게는 재가공 후 멀티도즈 용도로 사용되는 냉동 건조 제제를 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명은 FSH, 플루로닉® F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68로부터 선택된 계면활성제를 포함하는 냉동 건조 혼합물을 시약하는 단계를 포함하는 포장된 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명은 LH과, 플루로닉® F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68로부터 선택된 계면활성제를 포함하는 냉동 건조 혼합물을 용기내로 시약하는 단계를 포함하는 포장된 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명은 FSH 및 LH과, 플루로닉® F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68로부터 선택된 계면활성제를 포함하는 냉동 건조 혼합물을 용기 내로 시약하는 단계를 포함하는 포장된 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명은 냉동 건조된 FSH 또는 FSH 변이체와, 플루로닉® F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68로부터 선택된 계면활성제를 포함하는 제1 용기 또는 바이알을 포함하는 인간의 약제학적 용도를 위한 제조품을 제공한다. 제2 용기 또는 바이알은 재가공용 희석제, 바람직하게는 물과 m-크레졸 및 페놀로부터 선택된 정균제, 바람직하게는 m-크레졸을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명은 냉동 건조된 LH 또는 LH 변이체와, 플루로닉® F77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68로부터 선택된 계면활성제를 포함하는 제1 용기 또는 바이알을 포함하는 인간의 약제학적 용도를 위한 제조품을 제공한다. 제2 용기 또는 바이알은 재가공용 희석제, 바람직하게는 물과 m-크레졸 및 페놀로부터 선택된 정균제, 바람직하게는 m-크레졸을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명은 냉동 건조된 FSH 또는 FSH 변이체와 LH 또는 LH 변이체와, 플루로닉 F®77, 플루로닉 F87, 플루로닉 F88 및 플루로닉 F68로부터 선택된 계면활성제를 포함하는 제1 용기 또는 바이알을 포함하는 인간의 약제학적 용도를 위한 제조품을 제공한다. 제2 용기 또는 바이알은 재가공용 희석제, 바람직하게는 물과 m-크레졸 및 페놀로부터 선택된 정균제, 바람직하게는 m-크레졸을 포함한다.
특히 바람직한 실시예에서, 재가공을 위한 용매는 m-크레졸을 포함한다. 본 발명자들은 플루로닉 F68을 포함하는 냉동 건조 제제가, m-크레졸을 포함하는 희석제로 재가공될 때에는, 다른 계면활성제, 예를 들면, 트윈(Tween)를 사용할 때 관찰되는 문제인 침전이 생기지 않는다는 것을 발견하였다.
본 발명의 냉동 건조 제제는 적어도 약 6개월, 12 개월 또는 24개월 동안 유지될 수 있다. 바람직한 저장 조건하에서, 첫 번째 사용 전에, 제제는 직사광선을 피하고(바람직하게는 어두운 곳에 보관), 약 25℃, 바람직하게는 약 2~8℃, 보다 바람직하게는 약 4~5℃의 온도에서 보관한다.
액상 또는 재가공 멀티도즈 제제의 첫 번째 사용 후, 상기 제제는 적어도 약 24시간, 바람직하게는 약 4, 5 또는 6일, 더욱 바람직하게는 12일이나 14일 동안까지 유지될 수 있다. 첫 번째 사용 후 제제는 실온 이하(즉 약 25℃ 이하), 바람직하게는 약 10℃ 이하, 더욱 바람직하게는 2~8℃에서, 가장 바람직하게는 약 5~0℃에서 저장되는 것이 바람직하다.
본 발명의 제제는 메티오닌, 중아황산나트륨(sodium bissulfite), 에틸렌디아민테트라아세트산의 염(salts of ethylenediaminetetraacetic acid: EDTA), 부틸화된 히드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene: BHT), 및 부틸화된 히드록시 아니솔(butylated hydroxy anisole: BHA)과 같은 항산화제를 포함한다. 가장 바람직한 것은 메티오닌이다. 상기 항산화제는 FSH 및 LH(특히 α-서브유니트)의 산화를 방지한다.
액상 및/또는 재가공된 제제에서 메티오닌은 약 0.01~1.0mg/ml, 더 바람직하게는 약 0.05~0.5mg/ml, 가장 바람직하게는 약 0.1mg/ml의 농도로 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명의 제제는 수크로오스, 덱스트로오스, 락토오스, 만니톨 및/또는 글리세롤과 같은 안정화제 및 긴장성 조절제(tonicity adjusting agent)로서 단당류 또는 이당류, 또는 당알콜을 포함하는 것이 바람직하다. 가장 바람직한 것은 약 60mg/ml 농도의 수크로오스이다.
상술한 것처럼, 본 발명은 정균제를 포함하거나 재가공시 정균제가 첨가되는, 싱글도즈 및 멀티도즈용 액상 제제를 제공한다. 본 발명의 제제는 약제학적 또는 수의학적 용도로 적당하다.
상술한 것처럼, 바람직한 실시예에서, 본 발명은 포장재(packaging material); 및 FSH 또는 FSH 변이체, LH, 또는 FSH 및 LH, 플루로닉 F68 및 페놀 및 m-크레졸로부터 선택된 정균제, 경우에 따라서 완충제 및/또는 기타 부형제와 수용성 희석제의 용액을 포함하는 바이알을 포함하는 제조품을 제공하며, 여기서, 상기 포장재는 첫 번째 사용 후 24 시간 이상의 기간 동안 상기 용액이 유지될 수 있다는 것을 나타내는 서면 자료를 포함한다. 본 발명은 포장재, 본 발명에 따른 FSH 또는 FSH 변이체의 제제를 포함하는 바이알을 포함하는 제조품을 더 포함하며, 여기서 상기 포장재는 환자에게 수용성 희석제로 FSH 또는 FSH 변이체를 재가공하여, 24시간 이상의 기간 동안 유지될 수 있는 용액을 형성하라고 지시하는 서면 자료를 포함한다.
상술한 것처럼, 바람직한 실시예에서, 본 발명은 포장재와, 냉동 건조된 FSH 또는 FSH 변이체, LH 또는 LH 변이체, 또는 FSH 및 LH, 플루로닉 F68을 포함하는 바이알을 포함하는 제조품을 제공한다. 희석제를 포함하는 제2 용기 내 정균제는 페놀 및 m-크레졸로부터 선택되며, 경우에 따라 다른 부형제가 더 포함되며, 여기서 상기 포장재는 첫 번째 사용 후 24 시간 이상의 기간 동안 그러한 용액이 유지될 수 있다는 것을 나타내는 서면 자료를 포함한다.
본 발명의 제제 내의 단백질 호르몬의 함량은, 예를 들면 용액 제제가 피부 투과 팻치, 폐, 근육내 또는 삼투압 또는 마이크로 펌프 방법과는 다른 것처럼, 의도하는 투여 용기에 따라 달라지며, 작용가능한 농도가 더 낮고 더 높을 수 있지만, 재가공에 따라 약 1.0㎍/ml~50mg/ml의 농도를 만들 수 있는 함량을 포함한다. 단백질 호르몬 농도는 약 5.0㎍/ml ~ 2mg/ml, 더욱 바람직하게는 약 10㎍/ml~ 1 mg/ml, 가장 바람직하게는 약 50㎍/ml~200㎍/ml이 바람직하다.
본 발명의 제제 내의 단백질 호르몬의 함량은, 예를 들면 용액 제제가 피부 투과 팻치, 폐, 근육내 또는 삼투압 또는 마이크로 펌프 방법과는 다른 것처럼, 의도하는 투여 용기에 따라 달라지며 작용가능한 농도가 더 낮고 더 높을 수 있지만, 재가공에 따라 약 1.0㎍/ml~50mg/ml의 농도를 만들 수 있는 함량을 포함한다. 단백질 호르몬 농도는 약 5.0㎍/ml ~ 2mg/ml, 더욱 바람직하게는 약 10㎍/ml~ 1 mg/ml, 가장 바람직하게는 약 50㎍/ml~200㎍/ml이 바람직하다.
본 발명의 제제는 24개월 동안(첫 번째 사용 전)의 포장 시간에서 FSH 활성 및/또는 LH 활성의 적어도 약 80%가 유지되는 것이 바람직하다. FSH 활성은 스틸맨-포레이 난소 무게 증가 생물적분석법5을 사용하여 측정될 수 있다. LH 활성은 쥐의 정낭 무게 증가 생물적분석법을 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명의 액상 제제는 FSH 또는 FSH 변이체, LH, 또는 FSH 및 LH의 혼합물과 플루로닉 F68, 및 페놀 및 m-크레졸로부터 선택된 정균제를 고체형태로서 혼합하는 단계, 또는 FSH 또는 FSH 변이체, LH 또는 FSH 및 LH("단백질")의 혼합물 및 플루로닉 F68 및 페놀 및 m-크레졸로부터 선택된 정균제를 수용성 희석제에 해리시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 성분들을 혼합하고 수용성 희석제에 해리시키는 것은 종래의 해리 및 혼합 방법을 사용하여 수행된다. 적당한 제제를 제조하기 위하여, 예를 들면, 적량의 FSH 또는 FSH 변이체, LH 또는 FSH 및 LH의 혼합물의 완충용액을, 원하는 농도의 단백질, 플루로닉 F68 및 정균제를 제공할 수 있기에 충분한 양의 플루로닉 F68, 및 페놀 및 m-크레졸로부터 선택된 정균제의 완충용액과 혼합한다. 이후 혼합된 용액을 바이알, 앰플 또는 카트리지 내로 시약한다. 본 방법의 변형은 당업자에게 알려져 있을 것이다. 예를 들면 성분 첨가의 순서, 추가 첨가제의 사용 여부, 제제가 제조되는 온도와 pH 등은 모두 사용된 투여의 농도와 수단을 최적화시킬 수 있는 모든 인자들이다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 액상 제제는 제제의 모든 성분(예를 들면, 완충액 소디움 포스페이트, 수크로오스, 트윈, 메티오닌, FSH 및/또는 LH)의 각각의 원액(stock solution)을 공지 농도로 제조하고, 용적량(volumetric amount)을 나누어 최종 제제와 같은 성분의 "모용액(mother solution)"을 형성함으로써 제조된다. 상기 "모용액"은 듀로포어®(밀리포어)[Duropore®(Millipore)] 0.22 마이크로 PDF 막을 통해 여과되어 미생물을 제거하고, 분취량(aliquot)을 바이알, 앰플 또는 카트리지와 같은 각 용기에 시약한다.
본 발명의 냉동 건조 제제는 FSH 또는 FSH 변이체, LH 또는 FSH 변이체, 또는 FSH 및 LH의 혼합물과, 플루로닉 F86, 및 항산화제 및/또는 완충제와 같은 다른 부형제를 혼합하는 단계 및 상기 혼합물을 냉동건조하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 상기 성분들을 혼합하고 그들을 냉동건조하는 것은 종래의 방법을 사용하여 수행한다. 적당한 제제를 제조하기 위하여, 예를 들면, 적량의 FSH 또는 FSH 변이체, LH 또는 LH 변이체 또는 FSH 및 LH의 혼합물을 플루로닉 F68과 혼합하고 얻어진 혼합물을 냉동건조 한 후 바이알, 앰플 또는 카트리지 내로 시약한다. 본 방법의 변경은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들면 성분 추가의 순서, 추가된 첨가제의 사용 여부, 제제가 제조되는 온도 및 pH는 사용된 투여의 농도 및 수단을 최적화시킬 수 있는 모든 인자들이다.
본 발명의 제제는 알려진 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 이들 싱글 바이알 시스템을 포함하는 예들은 이지젝®(EasyJect®), 고날-F®펜(Gonal-F®Pen), 휴마젝®(Humaject®), 노보펜®(NovoPen®), 비-디®펜(B-D®Pen), 오토펜®(AutoPen®), 및 옵티펜®(PotiPen®)과 같은 용액 투여를 위한 펜-주입 장치를 포함한다.
현재 청구된 제품들은 포장재를 포함한다. 상기 포장재는, 관리기관이 요구하는 정보외에, 제품이 사용될 수 있는 조건을 제공한다. 본 발명의 포장재는 환자에게 FSH 또는 FSH 변이체를 수용성 희석제로 재구성하여 용액을 형성하고, 2개의 바이알, 젖음/건조, 제품에 대해 그 용액을 24시간 이상의 기간에 걸쳐 사용하라는 지시를 한다. 하나의 바이알, 용액 제품에 대하여, 상기 라벨은 그러한 용액이 첫 번째 사용 후 24시간 이상의 기간 동안, 바람직하게는 12 또는 14일까지의 기간 동안 저장될 수 있다는 것을 나타낸다. 현재 청구된 제품들은 인간 약제학적 제품 용도로 유용한다.
안정한 보존 제제는 맑은 용액으로 환자에게 제공될 수 있다. 상기 용액은 한번에사용되거나 또는 여러 번 재사용될 수 있으며 일 회 또는 수회의 환자치료에 사용될 수 있으며, 따라서 현재 이용가능한 것보다 더 편리한 치료법을 제공할 수 있다.
여기에 기술된 안정하거나 보존된 제제 또는 용액 내의 FSH 또는 FSH 변이체, LH, 또는 FSH 및 LH의 혼합물은 본 발명에 따라, SC 또는 IM 주입; 피부투과, 폐, 근육 내, 이식, 삼투압 펌프, 카트리지, 마이크로 펌프, 경구 또는 종래 기술로서 당업자에게 잘 알려진 다른 수단을 포함하는 여러 가지 투여방법을 통해 환자에게 투여될 수 있다.
도 1은 플루로닉 F68을 포함하는 FSH의 제제에서 산화된 α-서브유니트의 0, 1, 및 2주째의 퍼센트를 나타낸 것으로, 메티오닌이 없는 제제("메티오닌 무")에 대한 10㎍/㎖("Meth 10mcg/ml") 및 100㎍/㎖("Meth 100mcg/ml")의 메티오닌를 포함하는 제제 내에서의 산화된 서브 유니트의 퍼센트를 나타낸 것이다.
다음 예들은 단지 본 발명의 제제 및 조성물의 제조를 더 설명하기 위하여 제공된 것이다. 본 발명의 범위는 다음 예들로 이루어진 것으로 해석되어서는 않된다.
실시예 1
비교 제제
물질
항목 제조사
후보실험 제제용 r-hFSH 덩어리 세로노 SA 실험실
(Laboratoires Serono SA)
D-만니톨
(DAB, Ph Eur, PB, FU, USP, FCC, E421)		 머크사(Merck)
수크로오스
(DAB, Ph Eur, BP, NF)		 머크사
NaCl(ACS, ISO) 머크사
Na2HPO42H2O
(분석용 GR)		 머크사
NaH2PO4H2O
(분석용 GR)		 머크사
벤질알콜
(분석용 GR)		 머크사
m-크레졸
(합성용)		 머크사
트윈20(폴리소르빈산염 20)
(합성용)		 머크사
플루로닉 F68(폴록사머 188) 시그마
l-메티오닌
(생화학용)		 머크사
오르소-인산 85%
(Ph Eur, BP, NF)		 머크사
1.5mL 유리 카트리지 SFAM
[아구에탄트(Aguettant)에서 실리콘화 됨]
러버 타입 A 웨스트 컴퍼니
크림 캡(Crim cap) 아구에탄트
밀렉스-GV(Millex-GV)
시링지 드리븐 필터 장치(Syringe Driven Filter Unit)-듀라포어		 밀리포어
듀라포어 막 필터 0.22㎛ GV 밀리포어
20mL 플라스틱 시링지 플라스틱팩 벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson)
여과용 스틸 홀더 사토리우스(Sartorius)
장치
HPLC 시스템 검출기 모드 486 또는 490
컨트롤러 모드 600S
펌프 모드 626
오토샘플러 모드 717		 물 2
pH 미터 모드 654 메트로오옴 1
삼투압계 030-D 오스모멧
(osmomat)		 1
다음 연구는 수많은 제제로 다음 파라미터를 평가한 것이다.
- 계면활성제 및 정균제의 적합성(compatibility)
- 알파-서브유니트의 산화
제제는 멀티도즈 제제이며 트윈 20 이나 플루로닉 F68 및 정균제를 포함하였다. 다음 세 가지의 정균제를 평가하였다.
- 벤질 알콜 0.9%
- m-크레졸 0.3%
- 페놀 0.5%
트윈 20 및 플루로닉 F68을 다음 농도 범위로 사용하였다:
- 트윈 20: 10~100㎍/g의 범위
- 플루로닉 F68: 10~100㎍/g의 범위
제조된 용액을 표 1에 리스트 하였다.
표 1: 비교 제제
ID ＃ Na2HPO42H2O(mg/g) NaH2PO4H2O
(mg/g)		 r-hFSH* 플루로닉F68(㎍/g) 트윈20
(㎍/g)		 정균제 부형제
(mg/g)
1P 1.11 0.45 600IU/g 10 - 0.5% 페놀 수크로오스
70.6
2P 1.11 0.45 600IU/g 10 - 0.5% 페놀 만니톨
38.7
3P 1.11 0.45 600IU/g 100 - 0.5% 페놀 수크로오스
70.6
4P 1.11 0.45 600IU/g 100 - 0.5% 페놀 만니톨
38.7
5P 1.11 0.45 600IU/g - 10 0.5% 페놀 수크로오스
70.6
6P 1.11 0.45 600IU/g - 10 0.5% 페놀 만니톨
38.7
7 1.11 0.45 600IU/g - 100 0.9%
벤질 알콜		 NaCl 6.0
8 1.11 0.45 600IU/g - 100 0.9%
벤질 알콜		 수크로오스
62.3
9 1.11 0.45 600IU/g - 100 0.9%
벤질알콜		 만니톨
34.1

표 1: 비교 제제
ID ＃ Na2HPO42H2O(mg/g) NaH2PO4H2O
(mg/g)		 r-hFSH* 플루로닉F68(㎍/g) 트윈20
(㎍/g)		 정균제 부형제
(mg/g)
10 1.11 0.45 600IU/g - 100 0.3%
m-크레졸		 NaCl 7.6
11 1.11 0.45 600IU/g - 100 0.3%
m-크레졸		 수크로오스
78.0
12 1.11 0.45 600IU/g - 100 0.3%
m-크레졸		 만니톨
42.7
13 1.11 0.45 600IU/g - 10 0.9%
벤질 알콜		 NaCl 6.0
14 1.11 0.45 600IU/g - 10 0.9%
벤질 알콜		 수크로오스
62.3
15 1.11 0.45 600IU/g - 10 0.9%
벤질 알콜		 만니톨
34.1
16 1.11 0.45 600IU/g - 10 0.3%
m-크레졸		 NaCl 7.6
17 1.11 0.45 600IU/g - 10 0.3%
m-크레졸		 수크로오스
78.0
18 1.11 0.45 600IU/g - 10 0.3%
m-크레졸		 만니톨
42.7


표 1: 비교 제제
ID ＃ Na2HPO42H2O(mg/g) NaH2PO4H2O
(mg/g)		 r-hFSH* 플루로닉F68(㎍/g) 트윈20
(㎍/g)		 정균제 부형제
(mg/g)
19 1.11 0.45 600IU/g 100 - 0.9%
벤질알콜		 NaCl 6.0
20 1.11 0.45 600IU/g 100 - 0.9%
벤질 알콜		 수크로오스
62.3
21 1.11 0.45 600IU/g 100 - 0.9%
벤질 알콜		 만니톨
34.1
22 1.11 0.45 600IU/g 100 - 0.3%
m-크레졸		 NaCl 7.6
23 1.11 0.45 600IU/g 100 - 0.3%
m-크레졸		 수크로오스
78.0
24 1.11 0.45 600IU/g 100 - 0.3%
m-크레졸		 만니톨
42.7
25 1.11 0.45 600IU/g 10 - 0.9%
벤질알콜		 NaCl 6.0
26 1.11 0.45 600IU/g 10 - 0.9%
벤질 알콜		 수크로오스
62.3
27 1.11 0.45 600IU/g 10 - 0.9%
벤질 알콜		 만니톨
34.1


표 1: 비교 제제
ID ＃ Na2HPO42H2O(mg/g) NaH2PO4H2O
(mg/g)		 r-hFSH* 플루로닉F68(㎍/g) 트윈20
(㎍/g)		 정균제 부형제
(mg/g)
28 1.11 0.45 600IU/g 100 - 0.3%
m-크레졸		 NaCl 7.6
29 1.11 0.45 600IU/g 100 - 0.3%
m-크레졸		 수크로오스
78.0
30 1.11 0.45 600IU/g 100 - 0.3%
m-크레졸		 만니톨
42.7
* 단백질 함량 대신에 그의 생물학적 효능을 기초로 FSH를 제제에 첨가하였다.
제제의 시각검사 결과, 트윈 20 및 m-크레졸, 또는 트윈 20 및 페놀을 포함하는 FSH 제제는 흰색의 유백색 부유액(white opalescent suspension)을 만들기 때문에 트윈 20은 m-크레졸 및 페놀과 함께 사용할 수 없다는 것으로 결론지었다. 반대로, 플루로닉 F68을 포함하는 FSH 제제는 m-크레졸 및 페놀과 이러한 문제를 나타내지 않았다. 플루로닉 F68의 사용은 페놀 및 m-크레졸의 사용을 가능하게 한다.
FSH 및 플루로닉 F68과 항산화제의 결합
플루로닉 F68의 존재하에서 α-서브유니트의 산화를 방지하는 능력을 다음 항산화제들에 대하여 평가하였다.
- 메티오닌: 10~100㎍/g
- 아스코르브산: 10~100㎍/g
수크로오스 및 만니톨을 긴장제(tonicity agent)로 사용하였고 트윈 20 또는 플루로닉을 100㎍/g의 농도로 첨가하였다.
제조된 제제를 표 2에 리스트하였다.
표 2 메티오닌 유무에 따른 비교예
ID# Na2HPO4
2H2O
(mg/g)		 NaH2PO4
H2O
(mg/g)		 RhFSH 플루로닉F68
(㎍/g)		 트윈20
(㎍/g)		 아스코르브산
(㎍/g)		 메티오닌
(㎍/g)		 정균제 부형제
31 1.11 0.45 600IU/g 100 - - - 0.3%
m-크레졸		 수크로오스
32 1.11 0.45 600IU/g 100 - - - 0.3%
m-크레졸		 만니톨
33 1.11 0.45 600IU/g - 100 - - 0.9%
벤질알콜		 수크로오스
34 1.11 0.45 600IU/g - 100 - - 0.9%
벤질알콜		 만니톨
35 1.11 0.45 600IU/g 100 - - - 0.9%
벤질알콜		 수크로오스
36 1.11 0.45 600IU/g 100 - - - 0.9%
벤질알콜		 만니톨
37 1.11 0.45 600IU/g 100 - - 10 0.3%
m-크레졸		 수크로오스
38 1.11 0.45 600IU/g 100 - - 10 0.3%
m-크레졸		 만니톨
39 1.11 0.45 600IU/g 100 - - 100 0.3%
m-크레졸		 수크로오스

표 2 메티오닌 유무에 따른 비교예
ID# Na2HPO4
2H2O
(mg/g)		 NaH2PO4
H2O
(mg/g)		 RhFSH 플루로닉F68
(㎍/g)		 트윈20
(㎍/g)		 아스코르브산
(㎍/g)		 메티오닌
(㎍/g)		 정균제 부형제
40 1.11 0.45 600IU/g 100 - - 100 0.3%
m-크레졸		 만니톨
41 1.11 0.45 600IU/g 100 - 10 - 0.3%
m-크레
졸
수크로오스
42 1.11 0.45 600IU/g 100 - 10 - 0.3%
m-크레
졸
만니톨
43 1.11 0.45 600IU/g 100 - 100 - 0.3%
m-크레졸
수크로오스
44 1.11 0.45 600IU/g 100 - 100 - 0.3%
m-크레졸
만니톨
45 1.11 0.45 600IU/g - 100 - 10 0.9%
벤질
알콜
수크로오스
46 1.11 0.45 600IU/g - 100 - 10 0.9%
벤질
알콜
만니톨
47 1.11 0.45 600IU/g - 100 - 100 0.9%
벤질
알콜
수크로오스
48 1.11 0.45 600IU/g - 100 - 100 0.9%
벤질
알콜		 만니톨


표 2 메티오닌 유무에 따른 비교예
ID# Na2HPO4
2H2O
(mg/g)		 NaH2PO4
H2O
(mg/g)		 RhFSH 플루로닉F68
(㎍/g)		 트윈20
(㎍/g)		 아스코르브산
(㎍/g)		 메티오닌
(㎍/g)		 정균제 부형제
49 1.11 0.45 600IU/g - 100 10 - 0.9%
벤질
알콜		 수크로오스
50 1.11 0.45 600IU/g - 100 10 - 0.9%
벤질
알콜		 만니톨
51 1.11 0.45 600IU/g - 100 100 - 0.9%
벤질
알콜
수크로오스
52 1.11 0.45 600IU/g - 100 100 - 0.9%
벤질
알콜
만니톨
53 1.11 0.45 600IU/g 100 - - 10 0.9%
벤질
알콜
수크로오스
54 1.11 0.45 600IU/g 100 - - 10 0.9%
벤질
알콜
만니톨
55 1.11 0.45 600IU/g 100 - - 100 0.9%
벤질
알콜
수크로오스
56 1.11 0.45 600IU/g 100 - - 100 0.9%
벤질
알콜
만니톨
57 1.11 0.45 600IU/g 100 - 10 - 0.9%
벤질
알콜
수크로오스

표 2 메티오닌 유무에 따른 비교예
ID# Na2HPO4
2H2O
(mg/g)		 NaH2PO4
H2O
(mg/g)		 RhFSH 플루로닉F68
(㎍/g)		 트윈20
(㎍/g)		 아스코르브산
(㎍/g)		 메티오닌
(㎍/g)		 정균제 부형제
58 1.11 0.45 600IU/g 100 - 10 - 0.9%
벤질
알콜		 만니톨
59 1.11 0.45 600IU/g 100 - 100 - 0.9%
벤질
알콜		 수크로오스
60 1.11 0.45 600IU/g 100 - 100 - 0.9%
벤질
알콜		 만니톨
61 1.11 0.45 600IU/g 100 - - - 페놀 수크로오스
62 1.11 0.45 600IU/g 100 - - - 페놀 만니톨
63 1.11 0.45 600IU/g 페놀 수크로오스
64 1.11 0.45 600IU/g 100 - - 10 페놀 만니톨10페놀만니톨
65 1.11 0.45 600IU/g 100 - - 100 페놀 수크로오스
66 1.11 0.45 600IU/g - - 100 페놀 만니톨
67 1.11 0.45 600IU/g 100 - 10 - 페놀 수크로오스
68 1.11 0.45 600IU/g 100 - 10 - 페놀 만니톨
69 1.11 0.45 600IU/g 100 - 100 - 페놀 수크로오스
70 1.11 0.45 600IU/g 100 - 100 - 페놀 만니톨
단백질 함유량 대신에 생물학적 효능을 기초로 FSH를 제제에 첨가하였다.
20g의 제제를 팔콘 폴리프로필렌 튜브(Falcon polypropylene tube)에 투입하여 제조하고 3cm2 0.22㎛ 밀렉스-지브이 시링지 드리븐 필터 장치 듀라포어(Millex-GV Ayringe Driven filter unit durapore)를 통해 여과한 후, t=0에서의 값을 분석하였다. 상기 용액을 이후 40℃에서 저장하고 다음 개요에 따라 시험하였다:
분석 시험 T=0 1 주 2 주 3 주 4 주
산화된 알파 서브유니트에 대해
역상-HPLC(%)(Reverse Phase-HPLC)		 X X X X X
단백질 정량을 위해 크기별 배제 HPLC(㎍/g)
(Size Exclusion-HPLC)		 X X X X X
정성적 자유 서브유니트에 대해 크기별 배제 HPLC X X X X X
(X): 시험됨
역상 HPLC는 FSH, 플루로닉 F68, m-크레졸 및 메티오닌(10 및 100㎍/ml)을 포함하는 제제에서, 도 1에서 보여진 것처럼, 상기 제제가 40℃에서 저장되었을 때, FSH의 α-서브유니트의 산화가 메티오닌을 포함하지 않은 제제에 비하여 매우 감소하였다는 것을 나타내었다. 두 개의 실험을 평균하면, 메티오닌을 포함하지 않은 제제에서, 산화된 α-서브유니트는 T=0에서 2.3%, T=1주에서 4.0%, 및 T=2주에서 7.1%이다. 10㎍/ml 메티오닌을 포함하는 제제에서, 산화된 α-서브유니트는 T=0 에서 2.0%, T=1 주에서 3.2%, T= 2주에서 3.8%이다. 100㎍/ml 메티오닌을 포함하는 제제에서, 산화된 α-서브유니트는 T=0에서 1.8%, T=1 주에서 1.7%, T= 2주에서 1.3%이다.
실시예 2
피하 또는 근육내 주사용 재조합체 FSH 의 액상 싱글도즈 제제
실시예 1의 결과를 기초로 하여, 다음 제제를 제조하였다.
표 3에 리스트된 성분 1~7을 WFI의 용량액(volumetric solution)으로 제조하였다. 각 용액의 분취량을 혼합 용기에 첨가하여 "모용액(mother solution)"을 형성하였다. 상기 모용액을 10.9 마이크로그램(150IU) 또는 5.45 마이크로그램(75IU)의 FSH를 포함하도록 바이알에 시약하였다.
재조합체 FSH를 사용하면, 생물활성(bioactivity) 및 특이활성(specific activity)이 일정하여, 생물학적 정량보다는 덩어리로 FSH가 채워질 수 있게 한다.
표 3 FSH 싱글도즈 액상 제제의 성분
성분 # 처방 150IU FSH 75 IU FSH
1 rhFSH(㎍/바이알) 10.9(150IU) 5.45(75IU)
2 수크로오스(mg/바이알) 15.00 7.50
3 NaH2PO4H2O(mg/바이알) 0.111 0.0555
4 Na2HPO42H2O(mg/바이알) 0.273 0.1365
5 플루로닉 F68(mg/바이알) 0.025 0.0125
6 메티오닌(mg/바이알) 0.025 0.0125
7 m-크레졸(mg/바이알) 0.75 0.375
8 PH 7.0 7.0
9 WFI 1ml이 되도록 충분량 0.5ml이 되도록 충분량
상기 바이알들을 채우고 멸균조건에서 밀봉하였다. 상기 제제는 실온에서 2년의 저장기간을 갖는다.
실시예 3
피하 또는 근육내 주사용 재조합체 FSH 의 액상 멀티도즈 제제
실시예 1의 결과를 기초로 하여, 다음 멀티도즈 제제를 제조하였다.
표 4에 리스트된 성분 1~7을 WFI의 용량액으로 제조하였다. 각 용액의 분취량을 혼합 용기에 첨가하여 "모용액(mother solution)"을 형성하였다. 상기 모용액을 22.2 마이크로그램(305IU) 또는 33.3 마이크로그램(458IU) 및 66.7 마이크로그램(916IU)의 FSH를 포함하도록 바이알에 시약하였다. 얻어진 제제는 총 300, 450 및 900 IU의 FSH를 공급한다.
상기 카트리지들을 채우고 멸균조건에서 밀봉하였다. 멀티도즈 제제를 약 2~8℃, 바람직하게는 약 4~5℃에서 첫 번째 사용까지 약 2년 동안 저장할 수 있다. 첫 번째 사용 후, 상기 카트리지는 멀티도즈의 기간에 걸쳐 약 2~8℃, 바람직하게는 4~5℃에서 저장되어야만 하며, 상기 멀티도즈의 기간은 24시간, 2일, 또는 12일 또는 14일까지 수 있다.
표 4. FSH 멀티도즈 액상 제제의 성분들
성분 # 처방 300 IU FSH 450 IU FSH 900 IU FSH
1 rhFSH(㎍/카트리지) 22.2(305 IU) 33.3(458IU) 66.7(916IU)
2 수크로오스(mg/카트리지) 30.0 45.0 90.0
3 NaH2PO4H2O
(mg/카트리지)		 0.225 0.337 0.675
4 Na2HPO42H2O
(mg/카트리지)		 0.555 0.832 1.665
5 플루로닉 F68
(mg/바이알)		 0.050 0.075 0.150
6 메티오닌(mg/바이알) 0.050 0.075 0.150
7 m-크레졸(mg/바이알) 1.50 2.25 4.50
8 pH 7.0 7.0 7.0
9 WFI 0.5ml까지
충분한 량		 0.75ml까지
충분한 량		 1.5ml까지
충분한 량
실시예 4
피하 또는 근육내 주사용 재조합 FSH 의 액상 싱글도즈 제제
다음 제제를 제조하였다.
표 5에 리스트된 성분 1~7을 WFI의 용량액으로 제조하였다. 각 용액의 분취량을 혼합 용기에 첨가하여 "모용액(mother solution)"을 형성하였다. 상기 모용액을 3 마이크로그램(75IU)의 LH를 포함하도록 바이알에 시약하였다. 얻어진 제제는 싱글도즈의 75IU LH이다.
재조합체 LH를 사용하면, 생물활성 및 특이활성이 일정하여, 생물학적 정량보다는 덩어리로 LH가 채워질 수 있게 한다.
표 5. LH 싱글도즈 액상 제제의 성분
성분 # 처방 75 IU LH
1 rhLH(㎍/바이알) 3.0
2 수크로오스(mg/바이알) 52.5
3 NaH2PO4H2O
(mg/바이알)		 0.052
4 Na2HPO42H2O
(mg/바이알)		 0.825
5 플루로닉 F68
(mg/바이알)		 0.0125
6 메티오닌(mg/바이알) 0.125
7 m-크레졸(mg/바이알) 0.375
9 WFI 0.5ml까지
충분한 양
상기 바이알들을 채우고 멸균조건에서 밀봉하였다. 상기 제제는 2년의 저장기간을 갖는다.
실시예 5
피하 또는 근육내 주사용 재조합 FSH 및 LH (2:1)의 액상 멀티도즈 제제
FSH:LH의 비가 2:1의 비를 갖는, FSH 및 LH의 멀티도즈 제제를 제조하였다.
표 6에 리스트된 성분 1~8을 WFI의 용량액으로 제조하였다. 각 용액의 분취량을 혼합 용기에 첨가하여 "모용액"을 형성하였다. 필요한 경우 NaOH 또는 HCl을 첨가하여 상기 모용액의 pH를 8.0으로 조정하였다. 상기 모용액을 18.3 ㎍ LH(457IU)와 66.7㎍ FSH(916IU)를 포함하도록 카트리지에 시약하여 각각 150IU FSH를 갖는 6개 도즈; 9.2㎍ LH(230IU)와 33.3㎍ FSH(458IU)으로, 150IU FSH를 각각 포함하는 3개의 도즈; 및 6.1㎍ LH(152.5IU)와 22.23㎍ FSH(305IU)로 각각 150IU FSH를 포함하는 2개의 도즈를 제조하였다.
각 카트리지들을 채우고 멸균조건에서 밀봉하였다. 멀티도즈 제제를 약 2~8℃, 바 람직하게는 약 4~5℃에서 첫 번째 사용까지 약 2년 동안 저장할 수 있다. 첫 번째 사용 후, 상기 카트리지는 멀티도즈의 기간에 걸쳐 약 2~8℃, 바람직하게는 4~5℃에서 저장되어야만 하며, 상기 멀티도즈의 기간은 24시간, 2일, 또는 12일 또는 14일까지 수 있다.
표 6. FSH 및 LH(2:1) 멀티도즈 액상 제제의 성분
성분 # 처방 6 도즈 3 도즈 2 도즈
1 rhLH(㎍/카트리지) 18.3(457 IU) 9.2(230IU) 6.1(152.5IU)
2 rhFSH(㎍/카트리지) 66.7(916IU) 33.3(458 IU) 22.23(305IU)
3 수크로오스(mg/카트리지) 115.5 57.75 38.5
4 H3PO4
(mg/카트리지)		 1.35 0.735 0.49
5 NaOH
(mg/카트리지)		 pH 8.0이 되도록 충분한 양 pH 8.0까지 충분양 pH 8.0까지 충분양
6 플루로닉 F68
(mg/바이알)		 375.0 187.5 125.0
7 메티오닌(㎍/카트리지) 225 112.5 75.0
8 m-크레졸(mg/카트리지) 4.5 2.25 1.5
9 pH 8.0 8.0 8.0
10 WFI 1.5ml까지
충분한 량		 0.75ml까지
충분한 량		 0.5ml까지
충분한 량
실시예 6
피하 또는 근육내 주사용 재조합 FSH 및 LH (1:1)의 액상 멀티도즈 제제
FSH:LH의 비가 1:1인, FSH 및 LH의 멀티도즈 제제를 제조하였다.
표 7에 리스트된 성분 1~8을 WFI의 용량액으로 제조하였다. 각 용액의 분취량을 혼합 용기에 첨가하여 "모용액"을 형성하였다. 필요한 경우 NaOH 또는 HCl을 첨가하여 상기 모용액의 pH를 8.0으로 조정하였다. 상기 모용액을 36.6㎍ LH(914IU)와 66.7 ㎍ FSH(916IU)를 포함하도록 카트리지에 시약하여 각각 150IU FSH를 갖는 6개 도즈; 18.4㎍ LH(460IU)와 33.3㎍ FSH(458IU)으로, 150IU FSH를 각 각 포함하는 3개의 도즈; 및 12.2㎍ LH(305IU)와 22.23㎍ FSH(305IU)로 각각 150IU FSH를 포함하는 2개의 도즈를 제조하였다.
각 카트리지들을 채우고 멸균조건에서 밀봉하였다. 멀티도즈 제제를 약 2~8℃, 바람직하게는 약 4~5℃에서 첫 번째 사용까지 약 2년 동안 저장할 수 있다. 첫 번째 사용 후, 상기 카트리지는 멀티도즈의 기간에 걸쳐 약 2~8℃, 바람직하게는 4~5℃에서 저장되어야만 하며, 상기 멀티도즈의 기간은 24시간, 2일, 또는 12일 또는 14일까지 수 있다.
표 7. FSH 및 LH(1:1) 멀티도즈 액상 제제의 성분
성분 # 처방 6 도즈 3 도즈 2 도즈
1 rhLH(㎍/카트리지) 36.6(914IU) 18.4 (460IU) 12.2 (305IU)
2 rhFSH(㎍/카트리지) 66.7(916IU) 33.3(458 IU) 22.23(305IU)
3 수크로오스(mg/카트리지) 115.5 57.75 38.5
4 H3PO4
(mg/카트리지)		 1.35 0.735 0.49
5 NaOH
(mg/카트리지)		 pH 8.0이 되도록 충분한 양 pH 8.0까지 충분양 pH 8.0까지 충분양
6 플루로닉 F68
(mg/바이알)		 375.0 187.5 125.0
7 메티오닌(㎍/카트리지) 225 112.5 75.0
8 m-크레졸(mg/카트리지) 4.5 2.25 1.5
9 pH 8.0 8.0 8.0
10 WFI 1.5ml까지
충분한 량		 0.75ml까지
충분한 량		 0.5ml까지
충분한 량
실시예 7
LH 와 혼합된 FSH 의 액상 멀티도즈 제제의 안정성 실험
7.1 단백질 함량에 대한 역상 HPLC 분석
실시예 5의 제제(6 도즈)를 역상 HPLC 방법을 사용하여, FSH와 LH에 모두에 대한 단백질 함량을 평가하였다.
단백질 함량(FSH 및 LH)은 0 시간에서 측정하고,이후 4℃에서 1, 2, 3 및 6 개월의 저장 후 측정하였다. 얻어진 결과를 표 8에 FSH 또는 LH㎍/용매g으로서 리스트하였다.
7.2 산화된 알파- 서브유니트의 분석
실시예5의 제제 내의 산화된 알파-서브유니트의 퍼센트를 역상 HPLC(RP-HPLC) 방법으로 측정하였다.
산화된 알파-서브유니트의 퍼센트를 0시간, 이후 4℃에서 1, 2, 3 및 6 개월 저장 후 측정하였다.
7.3 FSH 의 생체내 분석
실시예 5의 제제(6 도즈)를 스틸맨-포레이 난소 중량 증가 생물학적 분석법을 사용하여 0 시간에서, 그리고 4℃에서 1, 2, 3 및 6개월의 저장 후 FSH 활성에 대해 시험하였다. 결과를 국제단위(international units: IU)/용매g으로서 표 8에 리스트하였다.
7.4 LH 의 생체내 분석
실시예 5의 제제(6 도즈)를 쥐 정낭 중량 증가 생물학적 분석법을 사용하여 0 시간에서, 그리고 4℃에서 1, 2, 3 및 6개월의 저장 후 LH 활성에 대해 시험하였다. 결과를 국제단위(international units: IU)/용매g으로서 표 8에 리스트하였다.
7.5 자유 서브 유니트의 평가( rFSH + rLH )
실시예 5의 제제에 대하여 자유 서브유니트의 퍼센트는 SDS-PAGE에 의해 평가하였다.
0시간, 그리고 4℃에서 1, 2, 3 및 6개월의 저장 후 측정하였다. 결과는 총 단백질(rFSH + rLH)의 퍼센트로서 기록하고, 표 8에 리스트하였다.
7.5 응집성 (aggregate) 평가
실시예 5의 제제에 대해, 응집성의 퍼센트는 7.5에서 자유 서브유니트의 평가를 위한 상술된 SDS-PAGE로 평가하였으며, 다만, 더 높은 분자량 응집체들은 총 단백질(rFSH + rLH)의 퍼센트로 결정하였다. 0시간, 그리고 4℃에서 1, 2, 3 및 6개월의 저장 후 측정하였다. 결과는 표 8에 리스트하였다.
7.6 가시 입자(Visible particle)
실시예 5의 제제를 입자에 대해, 0시간 그리고 4℃에서 1, 2, 3 및 6개월의 저장 후 가시적으로 평가하였다. 결과를 표 8에 기록하였다.
7.7 pH
표 8. 0시간, 그리고 4℃에서 1, 2, 3 및 6개월의 저장 후 FSH 및 LH(2:1)의 액상 제제에 대한 분석 매개변수
분석 0 시간 1 개월 2 개월 3 개월 6 개월
RP-HPLC에의한 rFSH 함량
(㎍/g)		 46.50 46.98 46.71 46.31 44.98
RP-HPLC에의한 rLH 함량
(㎍/g)		 11.74 11.81 12.68 12.67 13.21
산화된 α-서브유니트 % 2.29 2.17 2.08 2.48 2.95
FSH 553의 생체내 분석 (IU/g) 566 시험하지 않음 시험하지 않음 시험하지 않음 578 (23주)
LH에 대한 생체내 분석(IU/g) 331 시험하지 않음 시험하지 않음 311 286
SDS-PAGE 자유 서브유니트(rFSH + rLH;%) ≤5 시험하지 않음 시험하지 않음 ≤5 ≤5 (23주)
SDS-PAGE 응집체(rFSH + rLH;%) ≤2 시험하지 않음 시험하지 않음 > 3 4
가시 입자 자유 시험하지 않음 시험하지 않음 자유 자유
pH 8.262 8.215 8.216 8.188 8.238
실시예 8
FSH 및 LH 냉동건조 멀티도즈 제제
다음 조성을 갖는 두 개의 냉동건조 제제 A 및 B를 제조하였다.
제제 A
FSH ㎍ 32.75(450 I.U.)
LH ㎍ 9.0(225 I.U.)
수크로오스 mg 15.0
NaH2PO4H2O mg 0.052
Na2HPO42H2O mg 0.825
플루로닉 F68 mg 0.05
L-메티오닌 mg 0.05
제제 B
FSH ㎍ 65.5(900 I.U.)
LH ㎍ 18.0(450 I.U.)
수크로오스 mg 30.0
NaH2PO4H2O mg 0.104
Na2HPO42H2O mg 1.65
플루로닉 F68 mg 0.10
L-메티오닌 mg 0.10
상기 제조 방법은 약물질(drug substance)을 직접적으로 성분들과 혼합하고, 얻어진 용액을 여과하고 여과된 것을 냉동건조하는 단계로 이루어진다.
상기 방법의 각 단계에 대한 설명은 다음과 같다:
- 타르 용기(tared container)에 WFI, 디-소디움 히드로겐 포스페이트 디히드레이트(di-sodium hydrogen phosphate dihydrate), 소디움 디히드로겐 포스페이트 모노히드레이트(sodium dihydrogen phosphate monohydrate), 수크로오스, 5%의 플루로닉 F68 및 L-메티오닌을 첨가하고 완전히 해리될 때까지 10분동안 교반하는 단계
- pH를 체크하고 10% NaOH 또는 희석된 H3PO4를 사용하여 최종적으로 pH 7.00±0.2로 교정하는 단계
- FSH 및 LH를 상기 제조된 혼합물에 첨가하고 얻어진 용액을 10분 동안 서서히 교반하는 단계
- pH를 다시 체크하고 10% NaOH 또는 희석된 H3PO4를 사용하여 최종적으로 pH 7.00±0.1로 교정하는 단계
- 여과비가 15g/cm2 이상인 0.22㎛ 듀라포어 막을 가지고 1.5 대기압보다 낮은 압력의 질소 기체 하에서 용액을 여과하는 단계
- 미리 멸균한 플라스크에 상기 용액을 수집하는 단계
- 상기 여과된 용액을 유리 용기에 채우고, 스톱퍼를 잠그고 채워진 바이알들을 스테인리스 스틸 쟁반에 놓는 단계
- 상기 쟁반들을 냉동 건조기에 장착하고 다음 냉동 건조 사이클을 사용하여 제품을 냉동건조하는 단계:
. + 4℃ 에서 약 20분 동안 평형화시키는 단계
. 선반의 온도를 - 25℃로 하고 약 2시간 동안 유지하는 단계
. 선반의 온도를 - 15℃로 하고 약 1시간 동안 유지하는 단계
. 선반의 온도를 - 45℃로 하고 약 3시간 동안 유지하는 단계
. 응축기 온도를 - 65℃로 낮추는 단계
. 챔버를 진공으로 하는 단계
. 진공의 값이 7x10-2mBar에 도달할 때 선반의 온도를 - 10℃로 올리고 14시간 동안 유지하는 단계
. 8시간에 걸쳐 선반의 온도를 +35℃로 올리고 사이클의 마지막까지 유지하는 단계(14시간)
. 진공상태를 해제하고 건조 질소가 챔버에 들어가게 하는 단계
. 냉동건조기의 자동 시스템으로 마개를 하는 단계
. 막아진 바이알들을 적당한 플립오프 캡(flip-off cap)을 가지고 밀봉하는 단계
상기 제제 A 및 B는 25±2℃에서 저장되었고, 하기에 지시한 것처럼 안전성과 생물학적 활성을 시험하였다. 조성물의 분석에 앞서, 물을 사용하여 정균제로서 0.3%의 m-크레졸을 포함하는 주사액으로 상기 제제를 재구성하였다.
안전성과 생물학적 활성의 값은 다음과 같이 결정하였다:
. FSH에 대한 생체 내 분석: 스틸맨-포레이 난소 중량 증가 생물학적 분석법을 사용하여 FSH 활성에 대해 상기 제제를 시험하였다.
. LH에 대한 생체 내 분석: 쥐 정낭 중량 증가 분석법을 사용하여 LH 활성에 대해 상기 제제를 시험하였다.
. 산화된 α-서브유니트의 분석: 산화된 α-서브유니트의 퍼센트는 역상 HPLC(게HPLC) 방법으로 측정하였다.
. 자유 서브유니트(rFSH + rLH)의 평가: 자유 서브유니트의 퍼센트는 SDS- PAGE로 평가하였다.
. 응집체의 평가: 응집체의 퍼센트는 자유 서브유니트의 평가에 대한 상술된 SDS-PAGE로 평가하였다.
유럽 약전(European Pharmacopeia)의 규정에 따라 생물학적 시험을 수행하였다. 특히 상기 시험들은 "메노트로핀(Menotropin)" 단행본에 보고된다.
표 9는 제제 A의 안정성 및 생물학적 활성에 관한 분석 시험들의 결과를 요약한 것이다. 이 값들은 4개의 체크 포인트로 결정되었다: 0 시간, 및 25±2℃의 저장 온도에서 1, 3 및 6 개월 후.
표 9
시험 시간
0		 1 개월 3 개월 6 개월
생물학적 활성
I.U. FSH		 416 420 415 417
생물학적 활성 I.U. LH 276 250 259 270
산화된 생산물 % 1.95 1.81 1.95 1.57
다이머/응집체 % < 2 < 2 < 2 < 2
자유 서브유니트 % < 5 < 5 < 5 < 5
표 10은 제제 B의 안정성 및 생물학적 활성에 관한 분석 시험들의 결과를 요약한 것이다. 이 값들은 4개의 체크 포인트로 결정되었다: 0 시간, 및 25±2℃의 저장 온도에서 3, 6 및 9 개월 후.
표 10
시험 시간
0		 3 개월 6 개월 9 개월
생물학적 활성
I.U. FSH		 821 850 830 838
생물학적 활성 I.U. LH 570 564 580 622
산화된 생산물 % 1.0 0.9 1.0 1.0
다이머/응집체 % < 2 < 2 < 2 < 2
자유 서브유니트 % < 5 < 5 < 5 < 5
표 9 및 표 10으로부터 제제 A 및 B의 생물학적 활성은 저장 9개월 후까지 잘 보존되는 것으로 결론지을 수 있다. 상기 제제는 높은 안정성을 갖는다.
상기의 높은 안정성은 다량의 재조합체 FSH 및 재조합체 LH에 의해 영향받지 않는다.
시퀀스:
SEQ ID NO. 1: 인간 당단백질 α-서브유니트
SEQ ID NO. 2: hFSH β-서브유니트
SEQ ID NO. 3: hFSH β-서브유니트 변이체 1
SEQ ID NO. 4: hFSH β-서브유니트 변이체 2
SEQ ID NO. 5: hFSH β-서브유니트 변이체 3
SEQ ID NO. 6: hLH β-서브유니트
본 발명은 난포-자극 호르몬(follicle-stimulating hormone: FSH), 황체형성호르몬(luteinising hormone: LH), 및 FSH와 황체형성호르몬(LH)의 혼합물의 약제학적 제제 분야, 및 그러한 제제를 제조하는 방법에 관한 것으로, 싱글도즈나 멀티도즈 투여를 위한 FSH 또는 FSH 변이체, 및 FSH과 LH의 혼합물의 안정한 액상 제제 를 제공할 수 있다.
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Claims (45)

  1. 난포-자극 호르몬(FSH), 또는 SEQ ID Nos. 3, 4 및 5에 의해 코딩되는 β-서브유니트(subunit)를 갖는 변이체들로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종 이상의 변이체; 폴록사머 188 계면 활성제; 메티오닌; 및 페놀 및 m-크레졸로부터 선택된 정균제;를 포함하는 것을 특징으로 하는 불임 치료용 액상 약제학적 조성물.
  2. 난포-자극 호르몬(FSH), 또는 SEQ ID Nos. 3, 4 및 5에 의해 코딩되는 β-서브유니트(subunit)를 갖는 변이체들로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종 이상의 변이체; 황체형성호르몬(LH); 폴록사머 188 계면 활성제; 메티오닌; 및 페놀 및 m-크레졸로부터 선택된 정균제;를 포함하는 것을 특징으로 하는 불임 치료용 액상 약제학적 조성물.
  3. 황체형성호르몬(LH); 폴록사머 188 계면 활성제; 메티오닌; 및 페놀 및 m-크레졸로부터 선택된 정균제;를 포함하는 것을 특징으로 하는 불임 치료용 액상 약제학적 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 난포-자극호르몬(FSH)이 150IU/ml~1,200IU/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 불임 치료용 액상 약제학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 난포-자극호르몬(FSH)이 300IU/ml~900IU/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 불임 치료용 액상 약제학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 난포-자극호르몬(FSH)이 600IU/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 불임 치료용 액상 약제학적 조성물.
  7. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 황체형성호르몬(LH)이 150IU/ml~1,200IU/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 불임 치료용 액상 약제학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 황체형성호르몬(LH)이 300IU/ml~750IU/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 불임 치료용 액상 약제학적 조성물.
  9. 난포-자극 호르몬(FSH), 또는 SEQ ID Nos. 3, 4 및 5에 의해 코딩되는 β-서브유니트(subunit)를 갖는 변이체들로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종 이상의 변이체; 폴록사머 188 계면 활성제; 메티오닌; 및 페놀 및 m-크레졸로부터 선택된 정균제를 포함하는 재구성용 용매;를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조품.
  10. 황체형성호르몬(LH); 폴록사머 188 계면 활성제; 메티오닌; 및 페놀 및 m-크레졸로부터 선택된 정균제를 포함하는 재구성용 용매;를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조품.
  11. 난포-자극 호르몬(FSH), 또는 SEQ ID Nos. 3, 4 및 5에 의해 코딩되는 β-서브유니트(subunit)를 갖는 변이체들로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종 이상의 변이체; 황체형성호르몬(LH) 또는 그의 변이체; 폴록사머 188 계면 활성제; 메티오닌; 및 페놀 및 m-크레졸로부터 선택된 정균제를 포함하는 재구성용 용매;를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조품.
  12. 제9항 또는 제11항에 있어서,
    상기 난포-자극호르몬(FSH)이 총 제제의 0.1~10㎍/mg의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 제조품.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 난포-자극호르몬(FSH)이 총 제제의 0.3~5㎍/mg의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 제조품.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 난포-자극호르몬(FSH)이 총 제제의 0.37~2㎍/mg의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 제조품.
  15. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 황체형성호르몬(LH)이 총 제제의 0.1~3㎍/mg의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 제조품.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 황체형성호르몬(LH)이 총 제제의 0.1~1㎍/mg의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 제조품.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 황체형성호르몬(LH)이 총 제제의 0.1~0.6㎍/mg의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 제조품.
  18. 제2항에 있어서,
    상기 난포자극호르몬(FSH)이 인간 난포자극호르몬이거나; 상기 황체형성호르몬(LH)이 인간 황체형성호르몬(LH)이거나; 또는 상기 난포자극호르몬(FSH)이 인간 난포자극호르몬이고 상기 황체형성호르몬(LH)이 인간 황체형성호르몬(LH)인 것을 특징으로 하는 불임 치료용 액상 약제학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 난포자극호르몬이 인간 뇨 난포자극호르몬이거나; 상기 황체형성호르몬(LH)이 인간 뇨 황체형성호르몬(LH)이거나; 또는 상기 난포자극호르몬이 인간 뇨 난포자극호르몬이고 상기 황체형성호르몬(LH)이 인간 뇨 황체형성호르몬(LH)인 것을 특징으로 하는 불임 치료용 액상 약제학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 난포자극호르몬이 인간 재조합체 난포자극호르몬이거나; 상기 황체형성호르몬(LH)이 인간 재조합체 황체형성호르몬(LH)이거나; 또는 상기 난포자극호르몬이 인간 재조합체 난포자극호르몬이고 상기 황체형성호르몬(LH)이 인간 재조합체 황체형성호르몬(LH)인 것을 특징으로 하는 불임 치료용 액상 약제학적 조성물.
  21. 제2항에 있어서,
    FSH와 LH의 비가 6:1 ~ 1:6의 범위 내인 것을 특징으로 하는 불임 치료용 액상 약제학적 조성물.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 FSH과 LH의 비가 4:1 ~1:2의 범위 내인 것을 특징으로 하는 불임 치료용 액상 약제학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 FSH와 LH의 비가 3:1 ~ 1:1의 범위 내인 것을 특징으로 하는 불임 치료용 액상 약제학적 조성물.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 FSH와 LH의 비가 2:1 ~ 1:1의 범위 내인 것을 특징으로 하는 불임 치료용 액상 약제학적 조성물.
  25. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 정균제가 m-크레졸인 것을 특징으로 하는 불임 치료용 액상 약제학적 조성물.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 m-크레졸이 0.3%(중량/중량 용매)의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 불임 치료용 액상 약제학적 조성물.
  27. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    수크로오스를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 불임 치료용 액상 약제학적 조성물.
  28. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    pH 6.0~8.0의 인산염 완충액를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 불임 치료용 액상 약제학적 조성물.
  29. 제28항에 있어서,
    pH 7.0의 인산염 완충액을 포함하는 것을 특징으로 하는 불임 치료용 액상 약제학적 조성물.
  30. 제29항에 있어서,
    rFSH, 폴록사머 188, 수크로오스, 메티오닌, m-크레졸, 및 pH 7.0의 수용성 인산염 완충액을 포함하는 것을 특징으로 하는 불임 치료용 액상 약제학적 조성물.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 rFSH가 600IU/ml의 농도, 상기 폴록사머 188이 0.1mg/ml의 농도, 상기 수크로오스가 60mg/ml의 농도, 상기 메티오닌이 0.1mg/ml의 농도, 및 상기 인산염 완충액이 인산염 10mM로 존재하는 것을 특징으로 하는 불임 치료용 액상 약제학적 조성물.
  32. 제11항에 있어서,
    재조합체 FSH 32.75㎍, 재조합체 LH 9.0㎍, 수크로오스 15.0mg, NaH2PO4H2O 0.052mg, Na2HPO42H2O 0.825mg, 폴록사머 188 0.05mg 및 L-메티오닌 0.05mg를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조품.
  33. 제11항에 있어서,
    재조합체 FSH 65.5㎍, 재조합체 LH 18.0㎍, 수크로오스 30.0mg, NaH2PO4H2O 0.104mg, Na2HPO42H2O 1.65mg, 폴록사머 188 0.10mg 및 L-메티오닌 0.10mg를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조품.
  34. FSH, 폴록사머 188 계면 활성제, 및 액상 희석제를 포함하는 용액을 형성하는 단계; 및
    메티오닌; 및 페놀 및 m-크레졸로부터 선택된 정균제를 추가하는 단계를 포함하는 약제학적 조성물의 제조 방법.
  35. FSH; 폴록사머 188 계면 활성제; 메티오닌; 및 페놀 및 m-크레졸로부터 선택된 정균제를 포함하는 용액을 바이알, 앰플 또는 카트리지에 넣는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 포장된 약제학적 조성물의 제조방법.
  36. FSH, LH, 또는 FSH 및 LH; 및 폴록사머 188 계면 활성제를 혼합하는 단계,
    메티오닌을 상기 혼합물에 추가하는 단계,
    상기 혼합물을 냉동건조하는 단계, 및
    및 페놀 및 m-크레졸로부터 선택된 정균제를 포함하는 재구성 용매를 공급하는 단계를 포함하는 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 제조품의 제조방법.
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