DK176134B1 - Salte af peptider med carboxy-terminerede polyestere - Google Patents

Description

DK 176134 B1 (b) opløsning af peptidet indeholdende mindst en basisk aminosyre, i fri baseform eller i form af et salt med en svag syre, og den carboxyterminerede polyester i et opløsningsmiddel, hvori begge er opløselige, og som er i stand til at kunne fjernes ved frysetørring, frysning af den resulterende opløsning med høj hastighed, frysetørring af den resulterende frosne blanding, dis-pergering af den resulterende blanding i et opløsningsmiddel for polyesterkomponenten samt at blandingen lades gå i opløsning, efterhånden som peptid-polyestersaltet dannes, eller (c) omsætning af peptidet, der indeholder mindst en basisk aminosyre, i form af et salt med en stærk syre, med en polyester, hvori noget eller al polyesteren foreligger i form af et carboxyl syre salt med et egnet alkalimetal eller jordalkalimetal.

DK 176134 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte salte sammensat af en kation afledt af et peptid indeholdende mindst én basisk gruppe og en anion afledt af en carboxy-termineret polyester, fremgangsmåder til fremstilling af sådanne salte 5 samt anvendelsen af sådanne salte til fremstilling af farma-, ceutiske midler med forlænget frigørelse. Saltene ifølge op findelsen har en række forskellige egenskaber, der er nyttige ved formulering af farmaceutiske midler med forlænget frigørelse, uanset om saltene foreligger i ren form eller forelig-10 ger i blanding med enten et overskud af peptidet i dets frie, ubundne form eller et overskud af den frie polyester. Sådanne salte er amfipatiske, idet de er sammensat af dels et peptid, som er hydrofilt og lipofobt, og dels af en polyester, som er hydrofob og lipofil.

15 Ordet "peptid" benyttes her i en generisk betydning som indbefattende poly(aminosyrer), der normalt generelt omtales som "peptider", "polypeptider" eller "proteiner"; og et "basisk peptid" er et peptid, som er basisk af natur hidrørende fra tilstedeværelsen af et overskud af basiske aminosyrer, f.eks.

20 arginin eller lysin, eller hidrørende fra peptidets N-terminal, eller simpelt hen et peptid, som indeholder mindst én basisk gruppe, eventuelt i nærværelse af en eller flere sure aminosyregrupper. Udtrykket indbefatter også syntetiske analoger af peptider, ikke-naturlige aminosyrer med basisk funk-25 tionalitet eller en hvilken som helst anden form for indført basicitet. Ordet "polyester" benyttes i det følgende i betydningen en carboxy-termineret polyester.

Europæisk patent nr. 58.481 omtaler muligheden for specifikke kemiske vekselvirkninger mellem en polyesters terminale 30 carboxylsyregruppe og en eller flere basiske grupper i et peptid. Lawter et al., Proc. Int. Symp. Control Rel. Bioact. Mater., 14, 19, (1987) og Okada et al., Pharmaceutical

Research, 8, 584 - 587 (1991) , omtaler også denne mulighed, men disse publikationer er spekulative i denne henseende, idet 35 de ikke specielt beskriver et sådant specifikt peptid-poly- 2 DK 176134 B1 estersalt, ikke antyder noget om hvorledes sådanne salte kan fremstilles og er tavse med hensyn til eventuelle gunstige virkninger, som kunne hidrøre fra anvendelsen af sådanne salte til fremstilling af farmaceutiske midler.

5 Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes der imidlertid et middel indeholdende eller omfattende, som oprindeligt fremstillet, et salt dannet af en kation afledt af et peptid indeholdende mindst én basisk gruppe og en anion afledt af en carboxy-termineret polyester; idet midlet foreligger i form af 10 en opløsning eller dispersion af saltet i et opløsningsmiddel, som er et opløsningsmiddel for den frie polyester, men ikke et opløsningsmiddel for det frie peptid, og idet partikelstørrelsen af saltet i nævnte dispersion er mindre end 5 μιη og fortrinsvis mindre end 0,2 μπί; eller i form af mikropartikler 15 eller et implantat til injektion eller sub-dermal implante-ring.

Den kationiske komponent af saltet kan være afledt af et basisk peptid, som er farmakologisk aktivt, eller af et basisk peptid, som er farmakologisk inaktivt. Når det basiske peptid 20 er farmakologisk aktivt, kan saltet ifølge opfindelsen selv være formuleret som et farmaceutisk middel med forlænget frigørelse. Når det basiske peptid er farmakologisk inaktivt, kan saltet ifølge opfindelsen anvendes som en excipiens til formulering af midler med forlænget frigørelse indeholdende andre, 25 farmakologisk aktive peptider, som enten er sure af natur (omfattende et overskud af sure aminosyrer, såsom asparagin-syre og glutaminsyre) eller er neutrale af natur.

I peptidformuleringer med forlænget frigørelse er et yderligere krav naturligvis, at peptidet bør være i det væsentlige 30 stabilt i formuleringen over den forudsete frigørelsesperiode.

Ved "i det væsentlige stabilt" menes, at lægemidlet ikke gøres fuldstændig uopløseligt eller denatureret med fuldstændigt tab af farmakologisk aktivitet i løbet af den brugstid, som påregnes for formuleringen.

DK 176134 B1 3

Egnede farmakologisk aktive peptider har en molekylvægt på mindst 300Da og fortrinsvis mindst 800Da. Eksempler på sådanne peptider, som kan være i det væsentlige stabile i formuleringerne med forlænget frigørelse over den tilsigtede fri-5 gøre1sesperiode, og som derfor kan anvendes i midlerne ifølge opfindelsen, er oxytocin, vasopressin, adrenocorticotrofisk hormon (ACTH), epidermal vækstfaktor (EGF), prolactin, lute-iniserende hormon, follikelstimulerende hormon, luliberin eller luteiniserende hormonfrigørende hormon (LHRH), insulin, 10 somatostatin, glucagon, interferon, gastrin, tetragastrin, pentagastrin, urogastron, secretin, calcitonin, enkephaliner, endorphiner, kyotorphin, taftsin, thymopoietin, thymosin, thymostimulin, thymus-humoralfaktor, serum-thymusf aktor, tumor-necrosisfaktor, kolonistimulerende faktorer, motilin, 15 bombesin, dinorphin, neurotensin, cerulein, bradykinin, urokinase, kallikrein, stof P -analoger og -antagonister, angiotensin II, nervevækstfaktor, blodkoagulationsfaktor VII og IX, lysozymchlorid, renin, bradykinin, tyrocidin, gramicidiner, væksthormoner, melanocytstimulerende hormon, thyroidhormon-20 frigørende hormon, thyroidstimulerende hormon, parathyroidhor-mon, pancreozymin, cholecystokinin, humant placentalt lactogen, humant chorionisk gonadotropin, proteinsyntesestimuleren-de peptid, gastrisk inhiberende peptid, vasoaktivt tarmpeptid, blodpladeafledt vækstfaktor, væksthormonfrigørende hormon, 25 knogle-morphogenisk protein og syntetiske analoger og modifikationer samt farmakologisk aktive fragmenter deraf.

Foretrukne peptidkomponenter i midlerne ifølge opfindelsen er syntetiske analoger af LHRH, og især indbefatter sådanne analoger, men er ikke begrænsede til buserelin ([D-Ser(BUt)6, 30 des-Gly-NH210]-LHRH(1-9)NHEt) , deslorelin ([D-Trp6, des-Gly-NH210]-LHRH(l-9NHEt), fertirelin ( [des-Gly-NH210]-LHRH(1-9)NHEt), goserelin ([D-Ser(Bufc)6, Azgly10]-LHRH), histrelin ([D-His(Bzl)6, des-Gly-NH210]-LHRH(1-9)NHEt), leuprorelin ([D-leu6, des-Gly-NH210]-LHRH(1-9)NHEt), lutrelin ([D-Trp6, 35 MeLeu7, des-Gly-NH210]-LHRH(1-9)NHEt), nafarelin ([D-Nal6]-LHRH), tryptorelin ( [D-Trp6]-LHRH) og farmakologisk aktive 4 DK 176134 B1 salte deraf.

Egnede farmakologisk inaktive basiske peptider, som kan anvendes i saltene ifølge opfindelsen, er polyarginin, polylysin og poly(arginin-co-lysin), (co-)polymerer af neutrale aminosyrer 5 i D-, L- eller DL-form med arginin og/eller lysin i D-, L-eller rasemisk form, eller peptider eller (co-)polypeptider, hvori peptidkæderne er helt eller delvis afsluttet med en basisk gruppe ved N-terminalen, og grundskelettet er sammensat af neutrale aminosyrerester.

10 Den carboxy-terminerede polyester, der anvendes som kilden for anionen i saltet ifølge opfindelsen, kan være en homo-poly-ester eller en co-polyester. Sådanne foretrukne polyestere er dem, som nedbrydes eller eroderer i et vandigt, fysiologisk miljø, såsom det der findes i intramuskulært eller subkutant 15 væv, til vandopløselige fragmenter med lav molekylvægt. I dette miljø er den dominerende nedbrydningsproces simpel bulkhydrolyse, som indebærer hydrolytisk fraspaltning af estergrupper, hvilket fører til homo- eller co-polyesterfragmenter med lavere molekylvægt og til sidst til formuleringens for-20 svinden fra administrationsstedet. Det erkendes imidlertid, at på disse injektions- eller implanteringssteder samt på andre steder i levende væv kan andre nedbrydningsmekanismer være impliceret, såsom de af enzymer formidlede.

Egnede homo- og co-polyestere er de af hydroxysyrer eller fra 25 polykondensationen af dioler og/eller polyoler afledte, f.eks.

(men ikke begrænset til) polyethylenglycoler, polypropylengly-coler, 2-10C alkylenglycoler, glycerol, trimethylolpropan samt polyoxyethylerede former af polyfunktionelle alkoholer, såsom glycerol, trimethylolpropan og sukkerarter, med dicarboxyl-30 syrer og/eller polycarboxylsyrer, f.eks. (men ikke begrænset til) (1-10C alkan)dicarboxylsyrer, især malonsyre, ravsyre og glutarsyre, phthalsyrer, mellit- og pyromellitsyre, eventuelt i nærværelse af en eller flere hydroxysyrer og/eller mono-oler.

DK 176134 B1 5

De foretrukne metoder til fremstilling af homo- og co-poly-estere baseret på hydroxysyrer er metoder, der gør brug af ringåbnende polymerisation af cyklisk syre-dimererne eller af direkte polykondensation eller co-polykondensation af hydroxy-5 syrerne eller blandinger af hydroxysyrerne, eller lactoner afledt af sådanne hydroxysyrer. Disse polymerisationer, både af den ringåbnende type eller polykondensationstypen, udføres fortrinsvis således, at de resulterende homo- eller co-poly-estere helt eller delvis indeholder polymerkæder med carboxyl-10 syrerfunktionalitet. Den ringåbnende polykondensation af syre-dimererne udføres således i nærværelse af et passende polymerkæde -overføringsmiddel eller -co-initiator, der styrer både molekylvægten og opbygningen af den resulterende homo- eller co-polyester. Sådanne egnede overføringsmidler er vand, 15 hydroxycarboxylsyrer, monocarboxylsyrer, dicarboxylsyrer og polycarboxylsyrer.

I tilfælde af polyestere fremstillet ved polykondensation eller co-polykondensation udføres polymerisationen under sådanne betingelser, at et overskud af carboxylsyrefunktionali-20 tet anvendes, dvs. at forholdet mellem [-COOH] og [-OH] er lig med eller større end 1. Strukturen og molekylvægten af poly-kondensatet bestemmes af naturen af de benyttede alkoholer (om de er mono-oler, dioler eller polyoler eller en blanding), naturen af de benyttede syrer (om de er mono-, di- eller poly-25 carboxylsyrer eller en blanding), og størrelsen af overskuddet af benyttet carboxylsyre. Syrer impliceret i Krebs-cyklen er særlig anvendelige.

Eksempler på egnede hydroxysyrer eller lactoner, der kan anvendes til fremstilling af ifølge den foreliggende opfindelse 30 anvendelige homo- eller co-polyestere, indbefatter /?-propiono-lacton, j8-butyrolacton, γ-butyrolacton og pivalolacton, og a-hydroxysmørsyre, a-hydroxy i sosmørsyre, of-hydroxyvalerianesyre, α-hydroxyisovalerianesyre, or-hydroxycapronsyre, a-hydroxyiso-capronsyre, a-hydroxy-/3-methylvalerianesyre, or-hydroxyheptan-35 syre, Qf-hydroxydecansyre, α-hydroxymyristinsyre og or-hydroxy- DK 176134 B1 6 stearinsyre. Sådanne foretrukne homo- og co-polyestere er de, der er afledt fra mælkesyre i dens D-, L- eller DL-form, og af glycolsyre, eller de tilsvarende lactid- og glycolid-dimerer, og en foretrukken eventuel kædestandser er mælkesyre.

5 Selvom et makromolekylært, basisk peptid-lægemiddel kan eksistere helt eller delvis som en polymer-kation, og en polyester kan eksistere helt eller delvis som en polymer-anion, er saltdannelse hidrørende fra syre-basereaktion mellem sådanne polymere arter under anvendelse af konventionelle blande-10 processer eller under anvendelse af organiske opløsningsmidler yderst vanskelig eller endog umulig. For eksempel er smelteblanding af de to komponenter uegnet, eftersom det er velkendt, at peptider normalt ikke smelter, men derimod dekompo-nerer ved de forhøjede temperaturer, der almindeligvis anven-15 des til smeltning af polymerer. Selv om peptidet kunne smeltes (hvilket det ikke gør), ville det imidlertid være uforligeligt med eller uopløseligt i en homo- eller co-polyester af termodynamiske grunde, som følger.

Peptider er makromolekyler og har således mange af konven-20 tionelle polymerers typiske egenskaber. De er derfor (ved fravær af specifikke kemiske eller fysiske vekselvirkninger) fuldstændig uforligelige med eller uopløselige i andre makromolekyler, som har anderledes kemisk og polymer grundskelet-struktur, eftersom den frie energi ved blanding af de to uens 25 polymer typer er stærkt positiv og således ikke er termodynamisk begunstiget. I bulk-tilstanden er peptider yderst polære og stærkt hydrogenbundne molekyler med det resultat, at enthalpien ved blanding af peptider med homo- eller co-polyestere (som er relativt ikke-polære, og i hvilke hydrogenbin-! 30 ding enten mangler eller er svag) er stærk positiv; dvs. ikke begunstiget endotermisk og termodynamisk. Endvidere er makromolekyler definitionsmæssigt store og har således en lav egen entropi, hvilket resulterer i at entropien ved blanding af to forskellige makromolekylære arter er meget lav eller endog 35 negativ. (Se f.eks. P.J. Florey, "Principles of Polymer DK 176134 B1 7

Chemistry", Cornell University, 1953, 555; L. Bohn, "Polymer Handbook", 2. udgave, J. Wiley 1975, III-211; og L. Bohn,

Rubber Chemistry and Technology, 1966, 493). Blanding af et peptid med en polyester ved forhøjet temperatur vil følgelig i 5 den smeltede tilstand ikke give anledning til blanding i den molekylære skala, der er nødvendig for at saltdannelse finder sted. Simpel blanding af et peptid og en polyester giver derfor ikke anledning til saltdannelse.

Lignende vanskeligheder eksisterer i forbindelse med forsøg på 10 at danne salte af peptider og polyestere under anvendelse af organiske opløsningsmidler, med mindre peptidet har en vis opløselighed eller kvældbarhed i opløsningsmidlet. Polyesteres og peptiders opløselighedsegenskaber er fuldstændig forskellige. Opløsningsmidler, som opløser peptidet, såsom vand, er 15 absolutte ikke-opløsningsmidler for polyesteren; og gode opløsningsmidler for polyesteren, såsom dichlormethan, er generelt absolutte ikke-opløsningsmidler for peptidet. De opløsningsmidler, som kan opløse både peptidet og polyesteren, såsom dimethylsulfoxid, dimethyl formamid, dimethylacetamid og 20 N-methylpyrrolidon, har forskellige problemer, fordi de er relativt ikke-flygtige, har høje kogepunkter og således er yderst vanskelige at fjerne, og også på grund af nogle af disse opløsningsmidlers uacceptable toksicitet. Det har været muligt at finde frem til visse opløsningsmidler for begge 25 komponenter, som er mere flygtige og er toksikologisk acceptable, men sådanne opløsningsmidler frembyder andre vanskeligheder. For eksempel er eddikesyre et opløsningsmiddel for både peptider og polyestere, men brugen af en stor mængde syreopløsningsmiddel prædisponerer peptidet til at eksistere som 30 acetatsaltet (på grund af massevirkningseffekter) , så at fjernelsen af eddikesyren ved stuetemperatur (ca. 20 - 25°C) eller ved hjælp af frysetørring resulterer i faseseparation af peptidet og polyesteren, så at den ønskede saltdannelse har tendens til ikke at finde sted.

DK 176134 B1 8

Den foreliggende opfindelse tager derfor sigte på at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af et salt, som omfatter en kation af et basisk peptid og en anion af en car-boxy-termineret polyester.

5 Fremstillingen af peptid-polyestersaltene ifølge den foreliggende opfindelse kan udføres ved anvendelse af homo- eller co-polyestere indeholdende carboxylsyregrupper samt peptider, hvori de basiske rester forekommer som den frie base eller som salte af en svag syre, fortrinsvis en flygtig syre, som har en 10 syredissociationskonstant på mindre end 10-3 eller en pKa-værdi (pKa = -log1QKa, hvor Ka er syredissociationskonstanten) på mere end 3. Et sådant særlig foretrukket basisk peptidsalt er et salt med eddikesyre. På grund af den iboende uforligelighed af de to makromolekylære arter skal der imidlertid 15 anvendes særlige betingelser, ved hvilke disse peptid-poly-estersalte kan dannes.

Et middel til opnåelse af dette er at anvende et opløsningsmiddel, som opløser både peptidet og polyesteren til dannelse af en opløsning, hvorfra opløsningsmidlet kan fjernes direkte 20 under efterladelse af enten, for det første, det amfipatiske salt eller, for det andet, en blanding af polyester og peptid i en fysisk tilstand, som er prædisponeret til dannelse af det amfipatiske salt efter yderligere behandling.

Et eksempel på den første løsning består i brug af opløsnings-25 midler såsom, men ikke begrænset til dimethylsulfoxid, dimethylformamid, dimethylacetamid og N-methylpyrrolidon, som er i det væsentlige neutrale og kan være opløsningsmidler for både peptidet og polyesteren. Under normale omstændigheder som ovenfor anført er disse opløsningsmidler yderst vanskelige at 30 fjerne som følge af deres høje kogepunkter og relative ikke-flygtighed. Når et peptid (f.eks. som et acetatsalt) og en polyester opløses i et af disse opløsningsmidler, har peptidet tendens til at eksistere som saltet med polyesteren, idet den stærkere sure mælke- eller glycolsyregruppe i polyesteren DK 176134 B1 9 fortrænger den svagere carboxylsyre. Hovedmængden af opløsningsmidlet og frigjort eddikesyre (eller anden svag, men flygtig carboxylsyre) kan fjernes under vakuum, og den tilbageværende opløsning indeholdende peptid-polyestersaltet 5 sættes til destilleret vand til udfældning af det uopløselige polymere salt.

Det destillerede vand er fortrinsvis carbondioxidfrit med henblik på undgåelse af dannelsen af carbonatsalte ved fortrængning polyesteranionen. Tilbageværende opløsningsmiddel i 10 peptid-polyestersaltet kan derpå fjernes ved yderligere vaskning med vand, som også fortrinsvis er carbondioxidfrit. Under visse omstændigheder kan det polymere salt isoleres ved direkte udfældning i vand uden noget behov for fjernelse af noget opløsningsmiddel, og denne løsning er særlig anvendelig, 15 når peptidet anvendes som basen.

Ifølge et yderligere træk ved opfindelsen er der således tilvejebragt en fremgangsmåde til fremstilling af et salt omfattende et basisk peptid og en carboxy-termineret polyester, som omfatter opløsning af det basiske peptid, i fri baseform eller 20 i form af et salt med en svag syre, f.eks. eddikesyre, og den carboxy-terminerede polyester i et neutralt, polært opløsningsmiddel, hvori begge er opløselige, fjernelse af opløsningsmidlet eller det meste af opløsningsmidlet samt tilsætning af den tilbageværende koncentrerede opløsning til et 25 overskud af et ikke-opløsningsmiddel for peptid-polyestersaltet .

Den anden løsning, der også er baseret på brug af et opløsningsmiddel, som opløser både peptidet og polyesteren, beror på at nævnte opløsningsmiddel kan fjernes ved hjælp af frys-30 ning og konventionel frysetørring eller ved hjælp af sprøjtetørring. En vigtig del af denne fremgangsmåde er fjernelsen af opløsningsmidlet fra peptid-polyesterblandingen med en ekstremt hurtig, næsten øjeblikkelig hastighed og fortrinsvis ved en temperatur, som er under polyesterens og peptidets i i j DK 176134 B1 10 glasovergangstemperatur. I dette tilfælde kan opløsningsmidlet være neutralt eller surt, og et foretrukket opløsningsmiddel er eddikesyre.

En sådan ekstremt hurtig fjernelse af opløsningsmiddel fra en 5 opløsning, som udviser en vis grad af viskos strømning eller viskos-elastisk opførsel, resulterer i at faseseparation af de to uforligelige makromolekylære typer finder sted i ekstremt lille kolloidal-skala. Dette vil sige, at den resulterende peptid-polyesterblanding har et ekstremt stort overfladeareal 10 og overfladeenergi. Når et andet anderledes opløsningsmiddel for polyesteren, som normalt er et ikke-opløsningsmiddel for peptidet, sættes til i det væsentlige opløsningsmiddelfri peptid-polyesterblandinger af denne type, går den høje overfladeenergi som konsekvens tabt som følge af saltdannelse, og 15 peptidets kolloidale natur i polyesteren forsvinder. Egnede opløsninger til denne anden løsning skal kunne frysetørres og indbefatter, men er ikke begrænsede til eddikesyre, dioxan/vand-blandinger og tert-butanol/vand-blandinger, eller skal kunne sprøjtetørres.

20 Ifølge et yderligere træk ved opfindelsen er der således tilvejebragt en fremgangsmåde til fremstilling af et salt omfattende et basisk peptid og en carboxy-termineret polyester, hvilken fremgangsmåde omfatter opløsning af det basiske peptid, i fri baseform eller i form af et salt med en svag syre, 25 f.eks. eddikesyre, og den carboxy-terminerede polyester i et opløsningsmiddel, hvori begge er opløselige, og som er i stand til at kunne fjernes ved hjælp af frysetørring, frysning af den resulterende opløsning med stor hastighed, frysetørring af den resulterende frosne blanding, dispergering af den resulte-30 rende blanding i et opløsningsmiddel for polyesterkomponenten og at blandingen får lov til at opløses, efterhånden som peptid-polyestersaltet dannes.

Ved denne fremgangsmåde sættes nærmere betegnet opløsningen af peptidet og polymælkesyren, eller en copolymer af mælkesyre og DK 176134 B1 11 glycolsyre, i eddikesyre til flydende nitrogen på dråbevis måde. Dette resulterer i en mere eller mindre øjeblikkelig frysning af eddikesyreopløsningen og en mere eller mindre øjeblikkelig dannelse af en i det væsentlige opløsningsmiddel-5 fri peptid-polyesterblanding. Frysetørring til fjernelse af j eddikesyreopløsningsmidlet resulterer i et peptid-polyester-produkt, som er blandet i en ekstremt fin kolloidal skala. For mange peptider demonstreres et sådant materiales kolloidale natur, når et opløsningsmiddel for polyesteren tilsættes, 10 f.eks. dichlormethan, når en yderst fin kolloidal suspension dannes, og forudsat at der er et overskud af carboxylsyre-funktionalitet i blandingen, kan en klar opløsning til sidst opnås ved henstand, idet den overskydende overfladeenergi går tabt, når peptid-polyestersaltet dannes. Andre procedurer til 15 mere eller mindre øjeblikkelig frysning af peptid/polyester/-eddikesyreblandingen kan benyttes i stedet for dråbevis tilsætning til flydende nitrogen, f.eks. tildrypning af blandingen til en blanding af fast carbondioxid og hexan.

En fuldstændig uopløselig forbindelse kan selvsagt i teorien 20 gøres opløselig, hvis den kan formindskes til en tilstrækkeligt lille gennemsnitlig partikelstørrelse. Hvis det antages, at partiklen er en kugle med radius r, har massefylden o, og at den har en overfladeenergi γ, vil en sådan partikel have en overfladeenergi 4τττ2γ knyttet dertil. Den vil også have en 25 masse på ^/^.τιχ^σ, og overfladeenergien per enhedsmasse er således 37rVar· Betragt nu to tilfælde af mættede opløsninger: 1 når overskud af fast stof er ekstremt groft og derfor har meget lille overfladeenergi, og den mættede opløsning har en koncentration Dg, da er Gibbs frie energi: 30 G opløsning = G0 + RTlnCs = clfast stof' (ii) når overskuddet af fast stof er ekstremt små partikler med radius r, er Gibbs frie energi i opløsningen, som er i ækvilibrium med ekstremt små partikler: DK 176134 B1 12

^opløsning = G0 + RTlnC

men i dette tilfælde har det faste stof en Gibbs fri energi på G fast stof + ^t ax’ 5 °9 ^opløsning = G0 + RTlnC = Qlfast stof + 37ΓΎ/στ> eHer G1^,. etof = GQ + RTlnC - 3irVffr.

Men ud fra (i) ovenfor,

Qlfast stof = G0 + RTlnCs' og derfor 10 G0 + RTlnC - 3lty/0 = G0 + RTln Cs, eller C = 05.β37ΓΎ/σι· så at C (hypotetisk) stiger, når r falder.

I det sædvanlige tilfælde er højere end normal opløselighed som følge af lille partikelstørrelse metastabil, og partikler-15 ne vokser i størrelse, f.eks. ved opløsning og omkrystallisation, så at virkningen af høj overfladeenergi ophæves. Salt-dannelse kan imidlertid forekomme i tilfælde af peptid-poly-esterblandinger med lille partikelstørrelse, og dette frembyder et alternativt middel til formindskelse af de kolloidale 20 partiklers overfladeenergi ved at muliggøre dannelsen af et opløseligt amfipatisk salt, der som en opløsning frembyder den laveste fri energi-tilstand.

Ifølge et yderligere træk ved opfindelsen er der tilvejebragt en fremgangsmåde til fremstilling af et salt omfattende et 25 basisk peptid og en carboxy-termineret polyester, hvilken DK 176134 B1 13 fremgangsmåde omfatter omsætning af et basisk peptid i form af et salt med en stærk syre, såsom et chlorid eller sulfat, med en polyester, hvori noget eller al polyesteren foreligger i form af et carboxylsyresalt med et egnet alkalimetal eller 5 jordalkalimetal, f.eks. et natrium-, kalium-, calcium- eller magnesiumcarboxylatsalt. I tilfælde af polyestere med lav molekylvægt (med et vægtgennemsnit af molekylvægt på mindre end ca. 10.000) kan saltene med alkalier opløses eller disper-geres meget fint i vand. Tilsætning af en sådan opløsning 10 eller dispersion til en vandig opløsning (fortrinsvis fri for carbondioxid) af peptidet resulterer i udfældning af det vand-uopløselige, amfipatiske peptid-polyestersalt.

Chlorid- eller sulfatsaltene af "pegylerede" basiske peptider (polyoxyethylenkonjugater af peptider) er eller kan på lignen-15 de måde være delvis forligelige med eller opløselige i opløsningsmidler, såsom dichlormethan, og natrium- eller kaliumsaltene af carboxy-terminerede polyestere kan også være opløselige i dichlormethan. Når to sådanne salte blandes i de behørige forhold, dannes således det opløselige peptid-polyestersalt 20 ved hjælp af dobbelt dekomponering med udfældning af alkali-metalchloridet eller -sulfatet.

Den ovenfor omtalte termodynamiske forligelighed af forskellige makromolekyler har været kendt i mange år, men den har sjældent indgået i nogen betragtning i den kendte teknik ved-25 rørende forlænget frigørelse af peptidlægemidler fra poly-estermatrix'er. En nødvendig konsekvens af denne termodynamiske uforligelighed eller uopløselighed er, at under normale omstændigheder er polyestere fuldstændig uigennemtrængelige for peptidlægemidler. For at koncentrationsafhængig Fickian-30 diffusion af et peptidlægemiddel gennem en polyester kan finde sted, skal peptidet have en vis opløselighed i polyesteren. Af de ovenfor omtalte årsager er dette imidlertid ikke tilfældet, og transport af peptidet gennem polyesteren ved hjælp af koncentrationsafhængig Fickian-diffusion er således umulig.

--. - DK 176134 B1 14

Endvidere, for ræsonnementets skyld, selv om peptidlægemidlet eller en af dets syntetiske analoger havde en vis opløselighed i eller forligelighed med polyesteren, ville transport via diffusion gennem polyesterfasen stadig være umulig. Det har 5 længe været erkendt, at det frie volumen i polyesteren, som skyldes rotationsmæssig og translationsmæssig polyesterseg-ment-mobilitet, og som skulle muliggøre passage af diffunderende molekyler, er utilstrækkelig stort til at rumme diffusionen af makromolekyler med molekylvægte på mere end ca.

10 500Da eller lignende. (Se f.eks. R.W. Baker og H.K. Lonsdale, "Controlled Release: Mechanisms and Rates" i "Controlled Release of Biologically Active Agents, udgivet af A.C. Tranquary og R.E. Lacey, Plenum Press, 1974, 15 og følgende).

Selv om transport af et peptidlægemiddel gennem en polyester 15 via Fickian-diffusion er i det væsentlige umulig for peptider på mere end ca. 500Da eller lignende, er imidlertid kontinuert frigørelse af polypeptider ikke desto mindre blevet opnået. Europæisk patent nr. 58.481 beskriver hvorledes kontinuert frigørelse af et peptidlægemiddel fra en polyester blev opnået 20 ved anvendelse af meget forskellige egenskaber hos de to makromolekyler, peptider, som er hydrofile og vandopløselige, og polyestere, som er hydrofobe og vanduopløselige. I de i dette patent beskrevne formuleringer opnåedes peptidlægemid-delfrigørelse primært gennem vandholdige porer, som dannes til 25 at begynde med ved hjælp af simpel udludning af peptid fra områder ved formuleringens overflade eller fra områder af peptidlægemiddel, som er kontinuerte eller støder op til formuleringens overflade. Denne udludning tilvejebringer en indledningsvis frigørelsesfase, og efterfølgende bulk-hydrolytisk 30 nedbrydning af polyesteren resulterer i dannelse af yderligere porøsitet inden i polyesteren, og yderligere peptidfrigørelse, bestemt af nedbrydning og erosion, kan således finde sted.

Hvis porøsiteten hidrørende fra hydrolytisk polyesterne'dbryd-ning ikke foregår hurtigt nok, er den indledningsvise fri-35 gørelse fra udludningsfasen afsluttet før tilstrækkelig nedbrydningsfremkaldt porøsitet er dannet i udleveringssystémet, DK 176134 B1 15 og diskontinuert frigørelse af peptidet opnås. De i EP 58.481 omhandlede formuleringers parametre blev derfor valgt således, at hydrolytisk nedbrydning af polyesteren fandt sted på det rigtige tidspunkt i relation til den indledningsvise udlud-5 nings-frigørelsesfase til således at sikre, at de to frigørelsesfaser overlappede resulterende i kontinuert frigørelse af peptidlægemidlet.

Medens Fickian-diffusionstransport af et peptid gennem polyesterfasen er umulig i tilfælde af disse simple peptid-poly-10 esterblandinger, opstår imidlertid en fuldstændig anderledes situation i tilfælde af formuleringer af peptid-polyester-saltene ifølge den foreliggende opfindelse, eventuelt i nærværelse af fri polymer. I formuleringer indeholdende disse materialer er der ingen separat fase bestående af polyester 15 alene; i stedet er den kontinuerte fase, som styrer frigørelse af peptidet, helt eller delvis peptid-polyestersaltet. Frit peptid har nogen opløselighed i denne fase af peptid-polyestersalt, og i formuleringer, der gør brug af sådanne materialer, er sand koncentrationsafhængig Fickian-diffusion af et 20 peptid mulig, hvis de andre betingelser, såsom effektivt frit volumen, er til stede.

På grund af at peptid-polyestersaltet indeholder et meget hydrofilt segment, har peptid-polyestersalt-formuleringen en meget højere vandoptagelse end polyesteren alene. I disse 25 formuleringer er vandoptagelsen endvidere forøget endnu mere, som følge af den ioniske natur af peptid-polyester-veksel-virkningen, tillige med solvatiseringen med vand af ioner eller ionpar i det makromolekylære salt. Dette indebærer en i det væsentlige hydrogel-natur af peptid-polyestersaltet og 30 tilvejebringer en stigning i mobilitetsgraderne af makromolekylære segmenter i polykation-polyanion-komplekset. Dette betyder, at matrixmaterialets effektive frie volumen stiger og således kan rumme et makromolekylært peptid.

DK 176134 B1 16

Nettoeffekten af disse egenskaber hos peptid-polyestersaltet (eventuelt i nærværelse af fri polymer) er at muliggøre Fickian-diffusionstransport af et makromolekylært peptid gennem matrix'en af peptid-polyestersalt eller det blandede salt 5 og fri polymerfase. Dette er en fuldstændig anderledes situation end den der foreligger med polyester alene eller med simple blandinger af peptider og polyestere, og matrix'er eller membraner med forlænget frigørelse baseret på den forøgede permeabilitet hidrørende fra brugen af peptid-polyester-10 saltet er således centrale for formuleringerne med hensyn til den herefter i denne ansøgning beskrevne kontrollerede frigørelse af peptider.

Peptid-polyestersaltene ifølge den foreliggende opfindelse frembyder således nye og uventede fordele i udformningen af parenterale lægemiddeludleveringssystemer baseret på opløsninger eller dispersioner, der gør brug af forskellige blandinger af frie peptidlægemidler, fri polyester og peptid-polyestersalt, i både vandige og ikke-vandige farmaceutisk acceptable injektionsopløsninger og på basis af sub-dermale implan-20 tater, der kan injiceres, intramuskulært eller subkutant, eller implanteres, i kraft af den nye og uventede opløselighed af disse peptidholdige molekyldele i lipofile opløsningsmidler. Formuleringer baseret på disse peptid-polyestersalte, især sådanne, der gør brug af meget lipofile polyestere, kan 25 endvidere også administreres ad andre veje. Af særlig vigtighed er den orale vej , med hvilken de forskellige kombinationer af peptid-polyestersalt og/eller frit peptidlægemiddel og/eller fri polyester kan anvendes med god virkning. I mange tilfælde er det til oral administration foretrukket at benytte 30 en farmaceutisk acceptabel bærer, såsom en vegetabilsk olie eller en variant deraf, og indbefattende mono-, di- og tri-glycerider enten alene eller i blanding med andre olier. Af mindre betydning er den topiske, rektale og intranasale administrationsvej.

DK 176134 B1 17

Bortset fra det ovenfor omtalte europæiske patent nr. 58.481 (1982) angiver Lawter et al. (ovenfor anført) og Okada et al. (ovenfor anført) kun den af ansøgerne kendte teknik, der angår muligheden for opnåelse af peptid-polyestersalte, men begge 5 disse publikationer er spekulative, idet de ikke beskriver hvorledes denne formodede vekselvirkning kan gennemføres eller udnyttes. Opfindelsen tager yderligere sigte på tilvejebringelse af farmaceutiske formuleringer med forlænget frigørelse omfattende forskellige kombinationer af peptid-polyestersalt 10 og/eller frit peptidlægemiddel og/eller fri polyester i forskellige forhold til opnåelse af mindst tre forskellige profiler af styret lægemiddelfrigørelse.

Ifølge et yderligere træk ved den foreliggende opfindelse er der således tilvejebragt et farmaceutisk middel med forlænget 15 frigørelse omfattende et peptid-polyestersalt som ovenfor defineret og/eller frit peptidlægemiddel og/eller fri polyester samt eventuelt en eller flere andre farmaceutiske excipienser.

Udformningen af de farmaceutiske midler ifølge opfindelsen er 20 baseret på følgende betragtninger. Medens et simpelt peptidlægemiddel normalt er opløseligt i vand, er både saltet deraf med en polyester og selve den frie polyester normalt fuldstændig vanduopløselige (selv om det erkendes, at i tilfælde af meget lave oligomere former af polyestere og co-polyestere, 25 selv om de selv kan være vanduopløselige, kan de være vandopløselige, når de foreligger i form af et peptid-polyestersalt) . Inkubation af en blanding af et peptidlægemiddel og en polyester, hvori alt eller en del af peptidet foreligger som i peptid-polyestersaltet, i vandige fysiologiske væsker resul-30 terer imidlertid i nogen nedbrydning af polyesteren. Hvis disse nedbrudte produkter er vanduopløselige, så vil det under nedbrydning værende peptid-polyestersalt fortsat være uopløseligt. Hvis på den anden side polyesteren til at begynde med har tilstrækkelig lav molekylvægt eller indeholder en polymer-35 komponent med samme eller lignende lave molekylvægt, så at j DK 176134 B1 18 vandopløselige polyesterafledte sure fragmenter produceres, da er disse fragmenter (som anioner) co-transporterbare sammen med polypept idkat ionen. Det er blevet vist for de hidtil ukendte peptid-polyestersalt-midler ifølge opfindelsen, at 5 umiddelbar frigørelse er stærk afhængig af polyesterkomponentens molekylvægt og molekylvægtsfordeling.

Molekylvælgtsfordeling defineres som «w 10 »n

Ew^.M^ En^.M^2 hvor Mw (vægtgennemsnit af molekylvægt) = - = -

Ew^ En^.M^

Eni.Mi 15 og Mn (talgennemsnit af molekylvægt) = -

En^ og hvor er vægt-brøkdelen af polymermolekyler, der har en molekylvægt M^, og er antallet af polymermolekyler med molekylvægt .

20 Molekylvægtsfordeling omtales ofte som polydispersitet, og de forskellige værdier for snæver, normal eller mest sandsynlig samt bred fordeling er velkendte (se f.eks. "Polymer Handbook", 2. udgave, J. Wiley 1975, IV-3) . Det er almindelig accepteret, at en polydispersitet på mindre end 1,8 er en 25 snæver fordeling eller lav polydispersitet, ca. 1,8 til 2,2 er en normal eller mest sandsynlig fordeling eller normal polydispersitet, og mere end ca. 2,2 er en bred fordéling eller høj polydispersitet.

Til administrationen af peptidlægemidler ad den parenterale 30 vej, såsom intramuskulær eller subkutan injektion eller sub- DK 176134 B1 19 dermal implantering af et depot eller udleveringssystem, foretrækkes polyestere med et talgennemsnit af molekylvægt på mere end 2.000Da eller et logaritmisk viskositetstal ved 1% vægt/vol ved 25°C i chloroform på mere end eller lig med 0,08 5 dl/g og op til og inklusive 4,0 dl/g. Til administration ad andre veje, såsom oralt, er det foretrukne interval for tal-gennemsnit af molekylvægt 500 til 5.000Da.

Det er indlysende ud fra de ovennævnte betragtninger, som i det store og hele har været overset i den kendte teknik, at 10 nedbrydningen af polyesterne, især i nærværelse af basisk peptid, til frembringelse af endog en ringe brøkdel af vandopløselige afledte fragmenter, samt tidsintervallet hvor dette finder sted, vil blive styret af molekylvægt og molekylvægtfordeling. I det væsentlige øjeblikkelig nedbrydning til vand-15 opløselige fragmenter finder sted under anvendelse af polyestere med både snæver og normal fordeling og med vægtgennemsnit af molekylvægte på henholdsvis mindre end ca. 10.000Da og mindre end ca. l5.000Da (afhængigt af typen af molekylvægtfordeling) , men jo lavere polyesterens polydispersitet er, des 20 lavere er generelt det til øjeblikkelig nedbrydning til vandopløselige fragmenter krævede vægtgennemsnit af molekylvægte.

For polyestere med vægtgennemsnit af molekylvægt på mere end 15.000Da kræves normale eller brede fordelinger. Igen afhænger dette delvis af naturen og typen af molekylvægtfordelingen, 25 men jo højere vægtgennemsnittet af molekylvægt er, des højere er generelt den krævede polydispersitet til opnåelse af tidlig nedbrydning til vandopløselige fragmenter.

For polyester- eller co-polyester- og peptidholdige midler, hvori noget er alt peptidet foreligger i form af et peptid-30 polyestersalt, eventuelt indeholdende fri polyester, kan tre forskellige frigørelsesprofiler opnås. Den første af disse foreligger, når nedbrydning af polyesteren finder sted til opnåelse af i det væsentlige øjeblikkelig dannelse af sure, vandopløselige eller hydrofile fragmenter, som resulterer i 35 øjeblikkelig frigørelse af peptid i overensstemmelse med føl- 20 DK 170134 B1 gende mekanisme: nedbrydes

Pn-.D+--------> Pn_r.D+ + p ------> Pn-l + P'*D+------> <- 5 lægemiddelfrigørelse polymer/ hvor P er et hvor P~D+ er lægemid- nedbrudt, en vandoplø- delsalt, vandopløse- selig lægesom er ligt eller middelart, og 10 fuld- hydrofilt pn-l er en stændig fragment, men vanduopløse- uoplø- Pn_^_D+ er lig nedbrudt seligt vanduopløse- polymer i vand 1ig 15 (P = et vandopløseligt, nedbrudt polyesterfragment eller et hydrofilt, vanduopløseligt nedbrudt polyesterfragment, som er gjort vandopløseligt, når det foreligger i form af et salt med det basiske peptid.

D = basisk peptid.) 20 I dette første tilfælde kan midlet enten indeholde alt lægemidlet som peptid-polyestersalt, eller det kan indeholde noget frit, ubundet lægemiddel foruden noget peptid-polyestersalt, i begge tilfælde også eventuelt i nærværelse af fri polymer. Polymeren nedbrydes imidlertid til vandopløselige fragmenter, 25 i nærværelse af peptid næsten øjeblikkeligt, med den konsekvens at næsten øjeblikkelig, forsinket kontinuert frigørelse af peptidet begynder. Det skal bemærkes, at diffusionen af det frie, vandopløselige peptid gennem det under nedbrydning værende middel lettes af den forøgede gennemtrængelighed af 30 matrix'en som følge af tilstedeværelsen af peptid-polyestersaltet i den kontinuerte fase, som modulerer frigørelsen.

Det andet af disse tilfælde foreligger, når alt peptidlægemidlet er til stede som peptid-polyestersaltet (eventuelt i nær- DK 176134 B1 21 værelse af fri polyester), men polyesteren nedbrydes ikke øjeblikkeligt til vandopløselige fragmenter. Dette resulterer i et begyndelsesinterval, i hvilket der ikke sker nogen frigørelse af peptidlægemiddél. Selv om peptid-polyestersaltet 5 bibringer matrix'en forøget permeabilitet for frit diffunderende peptid, er der intet frit peptidlægemiddel til rådighed til diffusion. Al peptidet foreligger i form af et vanduoplø-seligt peptid-polyestersalt, og det er først efter en betragtelig tid at polyesteren nedbrydes til vandopløselige frag-10 menter og giver anledning til frit og transporterbart lægemiddel. Dette resulterer i en forlænget induktionsperiode, under hvilken der til at begynde med ikke sker nogen peptidfrigørelse, efter hvilken induktionsperiode frigørelse begynder. Dette andet tilfælde er ideelt for reguleret og pulseret frigørelse 15 af opløselige vacciner og peptider.

Det tredje tilfælde foreligger, når en formulering baseret på et peptid-polyesterlægemiddelsystem, som indeholder et peptidlægemiddel både i dets frie form og i form af et polymer-lægemiddelsalt, eventuelt også i nærværelse af fri polyester, og 20 hvori polyesteren har et vægtgennemsnit af molekylvægt på mere end ca. 15.000Da (og fortrinsvis mere end 30.000Da) samt har en snæver eller mest sandsynlig molekylvægtsfordeling, anbringes i et fysiologisk miljø, såsom det der findes på intramus-kulære og subkutane injektionssteder, idet diskontinuert fri-25 gørelse kan opnås. En første fase af frigørelse fremkommer som følge af tilstedeværelsen af frit peptidlægemiddel og dets evne til at blive transporteret gennem det mere gennemtrænge-lige peptid-polyestersaltsystem. Hvis denne første fase af frigørelse af frit peptidlægemiddel er afsluttet før nedbryd-30 ning af polyesteren i peptid-polyestersaltet finder sted til dannelse af yderligere frit peptidlægemiddel, så vil diskontinuert peptidlægemiddelfrigørelse være resultatet.

Hvis der ikke er noget interval, i hvilket frit peptidlægemiddel mangler i midlet under dets nedbrydning, da vil kontinuert 35 frigørelse selvsagt blive opnået. Denne frigørelsesprofil - 22 DK 178134 B1 minder om den i europæisk patent nr. 58.481 omhandlede, men frigørelsesmekanismen i europæisk patent nr. 58.481 og de benyttede materialer (intet peptid-polyestersalt) er helt forskellige fra de i nærværende beskrivelse definerede meka-5 nismer og materialer. Afhængigt af frigørelsesprofil er disse blandinger ideelle for kontinuert frigørelse af peptider, proteiner og opløselige vacciner.

Som ovenfor anført er disse peptid-polyester-lægemiddelsalt-systemer, deres fysisk-kemiske egenskaber samt mekanismerne, 10 ved hvilke frigørelse af peptidet finder sted, helt forskellige fra de der er omhandlet i de europæiske patenter nr. 58.481 og 52.510 samt i alle andre publikationer vedrørende peptidfrigørelse fra homo- og co-polymerer af mælkesyre og glycolsyre, som kendes af opfinderen af den foreliggende op-15 findelse. Af disse omtaler kun europæisk patent nr. 58.481, Lawter et al. (nævnt ovenfor) og Okada et al. (nævnt ovenfor) saltdannelse hidrørende fra den ioniske vekselvirkning mellem polyester-carboxylsyregrupper og basiske aminosyrer i peptider, men midlet fremstillet som deri beskrevet indeholder 20 intet peptidlægemiddel/polyestersalt. Disse tidligere beskrivelser er imidlertid spekulative i denne henseende og fastslår ikke på afgørende vis, at sådanne vekselvirkninger i virkeligheden finder sted, og de viser heller ikke hvorledes sådanne peptid-polyestersalte kan fremstilles og isoleres og derpå 25 anvendes til at frembringe frigørelsen af peptider med en række forskellige frigørelsesprofiler i kraft af deres uventede opløselighed i lipofile organiske opløsningsmidler.

Til egenskaberne hos peptid-polyesterblandinger, som vil bestemme frigørelse, og som ikke hidtil har været nævnt, hører 30 antallet af basiske, funktionelle grupper i peptidet samt antallet af carboxylsyregrupper i polyesteren. De ovenfor nævnte publikationer er også tavse med hensyn til de bemærkelsesværdig og uventede virkninger, der hidrører fra brugen af peptid-polyestersaltene, samt den overraskende høje gennem-35 trængelighed af systemer, som helt eller delvis indeholder DK 176134 B1 23 peptid-polyestersaltet, sammenlignet med gennemtrængeligheden af polyesteren alene, eller blandinger, hvori de to komponenter blot er blandede, og som derfor ikke indeholder noget peptid-polyestersalt.

5 Denne forskel i permeabilitet kan demonstreres i simple diffusionscelleforsøg, ved hvilke en kontinuert og fejlfri polyestermembran, der adskiller to vandholdige rum, hvoraf det ene indeholder en vandig peptidopløsning, og det andet indeholder den vandige fase alene, ikke vil tillade peptidtransport deri-10 gennem, forud for signifikant nedbrydning af membranpolyesteren. I modsætning hertil tillader membraner, der helt eller delvis indeholder peptid-polyestersaltet, lægemiddeltransport gennem den saltholdige membran ved hjælp af koncentrationsafhængig diffusion, endog når peptidet har en større molekyl-15 vægt end 500Da.

Peptid-polyestersaltene ifølge opfindelsen har mange andre overraskende og anvendelige · fordelagtige egenskaber, der er ukendte i hvilke som helst lignende kendte materialer, og som er særlig nyttige ved udformningen og fremstillingen af farma-20 ceutiske udleveringssystemer. En af de mest nyttige af disse egenskaber er den gode opløselighed af pept idet, når det foreligger i form af et polyestersalt, i organiske opløsningsmidler, hvori peptider normalt er fuldstændig uopløselige. Dette frembyder overordentlig mange fordele i farmaceutisk fremstil-25 ling i den henseende, at det muliggør anvendelse af nye processer og procedurer til fremstilling af lægemiddeludleveringssystemer og især letter aseptisk fremstilling. Disse processer og procedurer og de benyttede materialer er fuldstændig forskellige fra de som kendt teknik beskrevne procedu-30 rer og materialer.

Opløsninger af et peptid-polyestersalt, eventuelt indeholdende fri polymer, og/eller frit peptid i en solubiliseret eller dispergeret form kan således sterilfiltreres og derved lette løsningen af problemerne, der normalt er forbundet med den 24 DK 1178134 B1 sterile fremstilling af peptidformuleringer i fast form eller som suspension. En sterilfiltreret opløsning af et peptidpolyestersalt kan derfor underkastes en række forskellige farmaceutiske tørringsprocedurer i et aseptisk miljø. Sprøjte-5 tørring, sprøjtefrysning og andre tørringsprocedurer, som frembringer faste partikler, er foretrukne fremgangsmåder, som let egner sig til aseptisk arbejde.

Særlig nyttig er dannelsen af mikropartikler med partikelstørrelser i intervallet fra 0,2 μπι til 500 μιη, der kan suspende-10 res i en farmaceutisk acceptabel injektionsvehikel. Sådanne mikropartikler kan suspenderes i en vandig injektionsvehikel før anvendelse eller alternativt i en organisk injektionsvehikel, som er et ikke-opløsningsmiddel for de benyttede materialer. Til udleveringssystemer baseret på homo- og co-polymerer 15 af mælkesyre og glycolsyre er sådanne egnede organiske bærere meget lipofile olier, såsom (men ikke begrænset til) ethyl-oleat, isopropylmyristat, vegetabilske olier og forskellige fede glycerider. Under visse omstændigheder foretrækkes det at anvende blandinger af sådanne lipofile bærere.

20 Selv om sådanne lipofile bærere er ikke-opløsningsmidler for udleveringsformer baseret på mælkesyre og glycolsyre, er de uegnede til anvendelse sammen med meget lipofile polyestere, såsom de der er baseret på langkædede hydroxysyrer, f.eks. hydroxystearinsyrer. Til sådanne meget lipofile polyestere 25 eller co-polyestere foretrækkes hydrofile, organiske injektionsvehikler, såsom (men ikke begrænset til) propylenglycol og polyethylenglycol med lav molekylvægt. Vandige injektionsvehikler er selvsagt også egnede til udleveringssystemer baseret på de mere lipofile polymerer.

30 Et alternativt middel til fremstilling af mikropartikler anvender en anden uventet og fordelagtig egenskab hos peptid-polyestersaltene ifølge opfindelsen. Peptid-polyestersaltet består af et hydrofilt peptid, som termodynamisk fortrinsvis vil eksistere eller opløses i et vandigt eller polært miljø DK 176134 B1 25 ! eller fase, og en polyesterkæde, som er hydrofob, og som termodynamisk fortrinsvis vil opløses i en hydrofob fase. Dette vil sige, at peptid-polyestersaltet er amfipatisk og har overfladeaktive egenskaber, som ikke findes i simple peptidsalte.

5 Denne overfladeaktivitet resulterer i, at peptid-polyestersaltet foretrækker at eksistere ved en fase-grænseflade, og på grund af saltets generelle natur (den hydrofobe kædes omfang og længde) opnås den for peptid-polyestersaltet termodynamisk mest stabile type dispersion i en i det store og hele vandige 10 fase ved at eksistere som en dispersion i vand (da den afgørende micellekoncentration er meget lav, og ikke alt saltet kan eksistere ved grænsefladen i mange situationer).

Det kan derfor ses, at peptid-polyestersaltet er et yderst effektivt dispergeringsmiddel til frembringelse samt til op-15 retholdelse af vandige dispersioners stabilitet. Ved denne anden procedure til fremstilling af mikropartikelformede farmaceutiske formuleringer dispergeres peptid-polyesteropløsnin-gen (såsom f.eks. i dichlormethan) simpelt hen i en vandig fase, som eventuelt kan indeholde en viskositetsforøgende 20 polymer, såsom (men ikke begrænset til) polyvinylalkohol, under udnyttelse af peptid-polyestersaltets overfladeaktive egenskaber. Selv om nogle organiske opløsninger indeholdende sådanne peptid-polyestersalte spontant kan dispergere, kræves som generel regel nogen omrøring eller forskydning til frem-25 stilling af den vandige dispersion.

Et yderligere foretrukket træk ved fremgangsmåden som ovenfor anført består i at udføre operationerne således, at den vandige dispergering udføres effektivt i fravær af carbondioxid og i en inert atmosfære. Det foretrækkes endvidere, at den orga-30 niske opløsning af peptid-polyestersaltet er fri for carbondioxid, fordi koncentrationen af carbondioxid i luft og vand under normale betingelser er tilstrækkelig høj, sammenlignet med koncentrationerne af polyester-carboxylsyregrupper, til at indgå i konkurrerende saltdannelse som følge af massevirk-35 ningseffekter ifølge ligningen: DK 176134 B1 26

P".D+ + HC03“ > D+.HC03“ + P

<- hvor P er polyester og D er peptidlægemiddel. De resulterende vandige dispersioner kan derpå tørres ved hjælp af en række 5 forskellige metoder, såsom fjernelse af det organiske opløsningsmiddel under vakuum efterfulgt af frysetørring eller ved hjælp af direkte fjernelse af både opløsningsmidlet og vandet i en enkelt frysetørringsoperation. Det resulterende produkt kan derpå anvendes til at fremstille egnede farmaceutiske 10 præparater til injektion på den ovenfor beskrevne måde.

Et yderligere alternativt middel til fremstilling af mikropar-tikelformede farmaceutiske formuleringer gør brug af en i det væsentlige tør opløsning af peptid-polyestersaltet indeholdende kolloidalt dispergeret frit peptid i et egnet organisk 15 opløsningsmiddel eller bærer. (Udtrykket "i det væsentlige tør" benyttes, da det er praktisk taget umuligt at fjerne alle spor af vand fra peptidet, og desuden betyder det, at intet af lægemidlet eksisterer som en vandig opløsning i en separat vandig fase.) Tilsætning af et ikke-opløsningsmiddel for poly-20 meren under betingelser med kraftig omrøring efterfulgt af tilsætning af det opløsningsmiddel-kvældede peptid-polyestersalt (eventuelt indeholdende fri polymer og eventuelt indeholdende frit lægemiddel) til et stort volumen af et andet ikke-opløsningsmiddel med henblik på yderligere hærdning og stabi-25 lisering af de udfældede mikropartikler fører til den endelige form. Under de behørige betingelser eller i nærværelse af egnede overfladeaktive midler, såsom (men ikke begrænset til) fedtsyreesterne af sorbitol, kan udfældningen af mikropartik-lerne tydeligvis udføres under anvendelse af et enkelt ikke-30 opløsningsmiddel for polyesteren, f.eks. en paraffin, såsom hexan.

Mikropartiklerne fremstillet ved hjælp af de forskellige heri beskrevne fremgangsmåder er strukturelt fuldstændig forskellige fra mikrokapslerne fremstillet i overensstemmelse med de DK 176134 B1 27 i europæisk patent nr. 52.510 (Syntex) og 145.240 (Takeda) omtalte metoder, ved hvilke peptiderne indkapsles i en fase af polyester alene. Mikrokapsler defineres som én eller flere kerner af én forbindelse eller ét materiale inden i en konti-5 nuert anden fase, så at en kontinuert belægning af den anden fases materiale fuldstændig omslutter eller mikroindkapsler kernematerialet således, at intet af dette materiale eksisterer ved mikrokapslernes overflade, og mikroindkapslet kernemateriale i alle henseender bevarer de fysisk-kemiske og 10 termodynamiske egenskaber hos den ikke-indkapslede kerneforbindelse eller det ikke-indkapslede kernemateriale.

I europæisk patent nr. 52.510 blev en faseseparation-fnugdan-nelsesproces således benyttet til belægning af små dråber af en vandig, fortyndet opløsning af peptidet, så at polymeren 15 alene bestod af en kontinuert belægning rundt om de vandige smådråber. Dette vil sige, at de er sande mikrokapsler, der har mikrokuglers geometri og facon. Efter isolation af de udfældede mikrokapsler samt hærdning og tørring opnåedes et produkt, hvori peptidlægemidlet eksisterer som en diskret 20 kerne eller diskrete kerner inden i en polymeromslutning. På grund af tilstedeværelsen af vand i det indre af mikrokapslen forud for tørring kan dets fjernelse under dehydreringsprocessen ved en temperatur, som er under polymerens glasovergangstemperatur, resultere i en partikel, der er meget perforeret.

25 På intet trin indebærer fremgangsmåden og materialerne, der anvendes eller beskrives i europæisk patent nr. 52.510, et peptid-polyestersalt, og den omhandlede fremgangsmåde muliggør heller ikke steril filtrering af en peptid-polyesteropløsning eller -suspension, hvis aseptisk fremstilling er påkrævet.

30 Endvidere benyttede dette tidligere patent specifikt polyesterne baseret på mælkesyre og/eller glycolsyre som beskrevet i US patent nr. 3.773.919 (Boswell), som deri defineres som værende benzenopløselige ved 25°C. Ifølge den foreliggende opfindelse foretrækkes benzenuopløselige polyestere, som er 35 baseret på mælkesyre og/eller glycolsyre, men som er opløseli- DK 176134 B1 28 ge i chloroform, til relativt korte udleveringsperioder, f.eks. mindre end to måneder.

I europæisk patent nr. 190.833 (Takeda) blev peptidet omsluttet som en geleret, vandig opløsning af lægemiddel, og den 5 vandige, gelerede fase blev dispergeret i en polymeropløsning.

Denne vand(vandig lægemiddelgel)-i-olie (polymeropløsning)-dispersion blev derpå selv dispergeret i vand under forskydning til opnåelse af en vand-i-olie-i-vand-dobbeltdispersion.

Efter fjernelse af det organiske opløsningsmiddel under vakuum 10 samt frysetørring opnåedes mikrokapsler, hvori lægemidlet/ge-leringsmidlet var indkapslet ved hjælp af polymeren alene. Produkterne fremstillet ved denne fremgangsmåde bevarer lægemidlet som det simple salt, og ikke som polymersaltet af peptidet. De farmaceutiske formuleringer ifølge den foreliggende 15 opfindelse har derfor opbygninger, fysisk-kemiske karakteristika og termodynamiske egenskaber, som er fuldstændig forskellige fra produkterne beskrevet i de europæiske patenter nr. 52.510, 145.240 og 190.833, hvori mikrokapslerne har facon og geometri som mikrokugler, i hvilke en kerne eller kerner af 20 lægemiddel er fuldstændig omsluttet af polymer alene.

Produkterne ifølge den foreliggende ansøgning kan også have geometri og facon som (men er ikke begrænset til) mikrokugler, men enten er de slet ikke mikrokapsler som ovenfor defineret, men er i stedet opløsninger af peptid-polyestersalt (eventuelt 25 også indeholdende fri polymer), eller de er mikrokapsler, hvori frit peptidlægemiddel er indkapslet i en kontinuert fase eller belægning af polymer-lægemiddelsaltet, eventuelt også indeholdende fri polymer. Som ovenfor anført er et sådant polymer-lægemiddelsalts permeabilitetsegenskaber fuldstændig 30 forskellige fra egenskaberne hos fri polymer alene, så at produkterne ifølge den foreliggende opfindelse frigør deres , peptidlægemiddelmængde på en måde, der er helt forskellig fra de måder, som er beskrevet i de tidligere europæiske patenter nr. 52.510, 145.240 og 190.833.

DK 176134 B1 30 (b) et farmaceutisk acceptabelt organisk opløsningsmiddel, som er et opløsningsmiddel for den frie polyester, men ikke et opløsningsmiddel for det frie peptid, (c) et overskud af polyesteren, og eventuelt 5 (d) et overskud af det frie peptidlægemiddel i en solubi- liseret eller kolloidalt dispergeret form.

Egnede basiske peptider og carboxy-terminerede polyestere er de ovenfor definerede, og særlig foretrukne peptider er de ovenfor definerede syntetiske LHRH-analoger.

10 Til polyester-peptidlægemiddelsalte, hvori polyesteren er baseret på homo- og co-polymerer af mælkesyre og glycolsyre, indbefatter egnede farmaceutisk acceptable organiske opløs- i ningsmidler, men er ikke begrænset til benzylbenzoat, benzyl- i alkohol, ethyllactat, glyceryltriacetat, citronsyreestere og j 15 polyethylenglycoler, alkoxypolyethylenglycoler og polyethy-lenglycolacetater med lav molekylvægt (< 1000) etc., og af disse foretrækkes benzylbenzoat og benzylalkohol, især benzylbenzoat.

Det eneste krav til et sådant organisk opløsningsmiddel er, at 20 det er farmaceutisk acceptabelt, og at polyester-peptidlæge-middelsaltet er opløseligt deri. Uanset om et sådant enkelt opløsningsmiddel anvendes, eller en blanding af sådanne opløsningsmidler, kan egnetheden af sådanne opløsningsmidler let bestemmes ved hjælp af simple forsøg. Homo- og co-polymerer af 25 mælkesyre og glycolsyre hører til de mest polære og lipofile polyestere, og de vil således ikke opløses i sådanne organiske injektionsopløsningsmidler som ethyloleat, vegetabilske olier og andre lipofile bærere, men homo- og co-polymerer baseret på lipofile monomerer eller co-monomerer, eller lipofile hydroxy-30 syrer, såsom hydroxystearinsyre, er opløselige i sådanne lipofile injektionsvehikler.

DSC 176134 01 29

En yderligere udførelsesform for opfindelsen består således i fremstilling af enten mikrokugler, som ikke er mikrokapsler, under anvendelse af en opløsning af peptid-polyestersaltet, eventuelt indeholdende fri polymer, eller fremstilling af 5 mikrokugler, som er mikrokapsler, men som omfatter frit lægemiddel indkapslet ved hjælp af en fase eller belægning af peptid-polyestersalt, der eventuelt indeholder fri polymer.

Sådanne forskellige partikler kan fremstilles ved hjælp af en række forskellige metoder, såsom udfældning, faseseparation-10 fnugdannelse, sprøjtetørring og sprøjtefrysning. Den foretrukne partikelstørrelse ligger i intervallet fra 0,2 μιη til 500 /im, og de nævnte partikler kan som en suspension injiceres i en egnet injektionsvehikel.

Særlig effektive og nyttige parentérale farmaceutiske formule-15 ringer af peptidlægemidler kan også fremstilles i form af opløsninger af et lægemiddel-polyestersalt, eventuelt indeholdende fri polyester og eventuelt indeholdende dispergeret eller solubiliseret frit lægemiddel, i et farmaceutisk acceptabelt organisk opløsningsmiddel, som er et opløsningsmiddel 20 for den frie polyester, men et ikke-opløsningsmiddel for peptider og simple salte deraf, såsom f.eks. chlorider og acetater.

Ifølge den foreliggende opfindelse er der imidlertid således tilvejebragt et farmaceutisk middel omfattende et peptidlæge-25 middel og en polyester til forlænget frigørelse af peptidlægemidlet, kendetegnet ved, at midlet foreligger i form af en opløsning omfattende: (a) et basisk peptidlægemiddel som ovenfor defineret med en molekylvægt på mindst 300Da og fortrinsvis mindst 30 800Da, som foreligger i form af et salt med polyeste ren, hvilket salt omfatter en kation af det basiske peptid og en anion af en carboxy-termineret polyester, i DK 176134 B1 31

Forholdet mellem peptidlægemiddel og polyester i de faste stoffer, som opløses til dannelse af midlet ifølge opfindelsen som opløsning, vil naturligvis variere i overensstemmelse med peptidlægemidlets virkningsstyrke, naturen af den benyttede 5 polyester og tidsrummet for ønsket frigørelse af peptidlægemiddel .

Den foretrukne mængde inkorporeret peptidlægemiddel er fra 0,1 til 30% vægt/vol. Generelt afhænger den optimale lægemiddelmængde af polyesterens molekylvægt og dens molekylvægtsfor-10 deling, tidsrummet for ønsket frigørelse samt peptidlægemidlets virkningsstyrke. For lægemidler med relativt lav virkningsstyrke kan højere niveauer af inkorporering selvsagt være påkrævet.

Midlets vandoptagelse er en vigtig faktor til styring af ha-15 stigheden af hydrolytisk fraspaltning af polyesteren, og hastigheden af vandoptagelse er i nogen grad bestemt af lægemiddelmængden i midlet. I tilfælde, hvor relativt hurtig lægemiddelfrigørelse kræves over et relativt kort tidsrum, f.eks. tre måneder, kan således op til 30% peptidlægemiddel-påfyldning 20 være passende.

Monomersammensætningen af en co-polyester, f.eks. forholdet mellem lactid og glycolid i lactid-co-glycolidpolyestere, er også vigtig til bestemmelse af hastighederne af polyesternedbrydning og peptidlægemiddelfrigørelse. Varighed af frigørelse 25 bestemmes også delvis af vægtgennemsnittet af polyesterens molekylvægt, men mængden af peptidlægemiddel, som kan inkorporeres som lægemiddel-polyestersalt, bestemmes af talgennemsnittet af molekylvægt. Dette betyder, at polydispersitet (forholdet mellem vægtgennemsnit og talgennemsnit af molekyl-30 vægte) er en vigtig parameter.

Til varigheder af peptidlægemiddelfrigørelse fra en til fire måneder foretrækkes således midler omfattende polyestere med vægtgennemsnit af molekylvægt fra 4.000 til 20.000 og med DK 176134 B1 32 polydispersiteter fra 1,2 til 2,2 samt pept idlægemiddel indhold fra 0,1 til 30%. Jo lavere lægemiddelmængden er, des lavere er generelt det krævede vægtgennemsnit af molekylvægt og des højere er den krævede polydispersitet af polyesteren. Til 5 længere frigørelsesperioder, f.eks. fra to til seks måneder, foretrækkes det at anvende peptidlægemiddelmængder fra 0,1 til 20%, og polyestere med vægtgennemsnit af molekylvægte fra 8.000 til 20.000 samt polydispersiteter fra 1,5 til > 2,2. Til frigørelsesperioder på mere end seks måneder foretrækkes pep-10 tidlægemidler fra 0,1 til 10%, idet der anvendes polyestere med et vægtgennemsnit af molekylvægt fra 20.000 til 50.000 samt polydispersiteter på > 1,8.

Omfanget af inkorporering af peptid-polyester i alt som faste stoffer i midlet ifølge opfindelsen vil selvsagt variere af-15 hængigt peptidkomponentens virkningsstyrke, tidsrummet, over hvilket udlevering af peptidlægemidlet ønskes, opløseligheden af den samlede mængde faste stoffer i det valgte opløsningsmiddel samt volumenet og viskositeten af midlet som opløsning, som det er ønsket at administrere.

20 Viskositeten af midlet ifølge opfindelsen som opløsning bestemmes af polyesterens molekylvægt samt mængden af peptidlægemiddel. Opløsninger indeholdende mere end ca. 40% faste stoffer vægt/vol (peptidlægemiddel/polyestersalt, frit lægemiddel, fri polyester) , og når polyesteren har et vægtgennem-25 snit af molekylvægt på > 8.000, er generelt vanskelige at administrere ved injektion på grund af deres viskositet. Opløsninger på s 40% vægt/vol foretrækkes således i tilfælde af disse polyestere. Til midler i opløsningsform omfattende polyestere med vægt gennemsnit af molekylvægt fra ca. 8.000 til ca.

30 20.000 foretrækkes koncentrationer på s 30% vægt/vol, og til midler i opløsningsform omfattende polyestere med molekylvægt fra ca. 20.000 til ca. 50.000 foretrækkes koncentrationer på s 20% vægt/vol. Under nogle omstændigheder, f.eks. hvis midlet ønskes injiceret under anvendelse af en meget snæver nål, kan 35 opløsninger med meget lav viskositet være foretrukne, og kon- j i ..................... --- DK 176134 B1 33 centrationen kunne formindskes til 2% vægt/vol eller endnu mindre, men der vil selvsagt være en balance mellem at formindske viskositeten og forøge volumenet, som skal injiceres .

5 Ifølge et yderligere træk ved opfindelsen anvises en fremgangsmåde til fremstilling af et middel ifølge opfindelsen, som omfatter: 1. opløsning af en intim blanding af det basiske peptidlægemiddel og polyesteren i det farmaceutisk acceptable opløs- 10 ningsmiddel; eller 2. langsom tilsætning af en opløsning af peptidlægemidlet i en 1-6C alkanol til dannelse af en opløsning af polyesteren i et til injektion egnet opløsningsmiddel, hvorefter, hvis det hydrolytiske opløsningsmiddel ikke er farmaceu- 15 tisk acceptabelt til injektion, det fjernes ved fordamp ning, eller dets fjernelse kan være unødvendig, hvis det hydrolytiske opløsningsmiddel er farmaceutisk acceptabelt til injektion.

Den intime blanding af det basiske peptidlægemiddel og poly-20 esteren, som benyttes i fremgangsmåde l. ovenfor, opnås fortrinsvis ved opløsning af det basiske peptid og polyesteren i et opløsningsmiddel eller én opløsningsmiddelblanding, som er i stand til at opløse både det basiske peptidlægemiddel og polyesteren, og som er i stand til at blive frysetørret. Egne-25 de eksempler på sådanne opløsningsmidler eller opløsningsmiddelblandinger er iseddikesyre og blandinger af dioxan og vand, efterfulgt af frysetørring af den således opnåede opløsning. Alternativt kan de to komponenter opløses i f.eks. dimethyl-sulfoxid, og opløsningsmidlet kan derefter fjernes.

30 Den intime blanding kan også opnås ved at opløse peptidlægemidlet i et hydrolytisk opløsningsmiddel, f.eks. methanol, og ved at sætte denne opløsning til en opløsning af polyesteren i DK 176134 B1 34 f.eks. dichlormethan efterfulgt af fjernelse af opløsningsmidlerne, f.eks. ved fordampning.

Q

En vandig opløsning af peptidlægemidlet i form af chloridsal-tet kan alternativt sættes til en vandig opløsning eller dis-5 persion af natriumsaltet af polyesteren, og blandingen kan frysetørres til opnåelse af en blanding af peptidlægemid-let/polyestersaltet samt natriumchlorid. Sidstnævnte kan om ønsket fjernes ved blanding af produktet i et organisk opløsningsmiddel og frafiltrering af det uopløselige natrium-10 chlorid.

I fremgangsmåde 1. kan opløsning af den intime blanding i det farmaceutisk acceptable opløsningsmiddel fremskyndes ved hjælp af opvarmning og/eller omrøring af reaktionsblandingen.

I fremgangsmåde 2. ovenfor er et egnet alkanolopløsningsmiddel 15 for peptidet f.eks. methanol, ethanol eller propylen-1,2-diol.

En hovedfordel ved farmaceutiske peptidlægemiddelprodukter i form af opløsninger af et polyester-peptidlægemiddelsalt, eventuelt indeholdende frit lægemiddel og/eller fri polyester, er at fremstilling af et injicerbart produkt i steril form, 20 som er beregnet til øjeblikkelig anvendelse uden noget behov for for-blanding før administration til en patient, kan foretages under anvendelse af sterilfiltrering. Dette er en meget simplere fremstillingsproces end steriliseringen af et fast stof eller suspensionsprodukt. En alternativ fremgangsmåde til 25 fremstilling af sterile, injicerbare opløsninger består i opløsning af et sterilt polyester-peptidlægemiddelsalt, eventuelt indeholdende frit lægemiddel og/eller fri polyester, i den farmaceutisk acceptable organiske injektionsvehikel.

Selvom disse formuleringer primært er sådanne til parenterale 30 administrationsveje, kan polyester-lægemiddelsaltene ifølge opfindelsen også anvendes til fremstilling af oralt administrerbare formuleringer.

DK 176134 B1 35

En helt anderledes type formulering, som kan injiceres eller implanteres subdermalt, er et lægemiddeludleveringssystem baseret på implantater eller blandinger af forskellige implantattyper. Disse kan fremstilles ud fra polyester-peptidlæge-5 middelsaltene ifølge opfindelsen, eventuelt indeholdende frit lægemiddel og/eller fri polyester, under anvendelse af konventionelle polymersmelte-forarbejdningsmetoder, såsom, men ikke begrænset til ekstrusion, og formpresning og sprøjtestøbning, ved hvilke forhøjede temperaturer (fortrinsvis under 100°C) 10 anvendes til smeltning af polyester-lægemiddelsaltet ved fremstillingen af implantatet. Fremstilling af sådanne implantater kan udføres under aseptiske betingelser eller alternativt ved hjælp af afsluttende sterilisering ved hjælp af bestråling under anvendelse af, men ikke begrænset til 7- eller røntgen-15 stråler. Disse faste doseringsformer kan formindskes til mikropartikelformer ved hjælp af findeling eller formaling. De foretrukne partikelstørrelser kan ligge i intervallet fra 1 pim til 500 /xm, og disse mikropartikel-udleveringssystemer (som er hverken mikrokugler eller mikrokapsler) kan suspenderes i en 20 egnet konventionel farmaceutisk acceptabel injektionsvehikel.

Smelteforarbejdningen af peptid-polyesterlægemiddelsaltet udtrykker og illustrerer en særdeles signifikant og vigtig forskel mellem de fysisk-kemiske og termodynamiske egenskaber hos peptid-polyesterlægemiddelsaltene ifølge opfindelsen og 25 hos de frie peptider og simple salte deraf. Peptid-polyester-saltene ifølge opfindelsen smelter og flyder i mange tilfælde i modsætning til de frie peptider og deres simple salte, såsom chlorider og acetater, der ikke smelter, men dekomponerer ved forhøjet temperatur.

30 Nedbrydning af polyestere afhænger til dels af deres molekylvægt og polydispersitet. For at nedbrydning kan finde sted hovedsagelig ved hydrolytisk fraspaltning af estergrupper, skal polyesteren eller en farmaceutisk formulering indeholdende en polyester selvsagt optage vand. I tilfælde af de 35 systemer, hvor den frigørelsesstyrende matrix eller membran DK 176134 B1 36 som helhed eller for en dels vedkommende indeholder peptid-polyesterlægemiddelsalt, vil der ske en højere vandoptagelse ved hjælp af den styrende matrix eller membran sammenlignet med polyesteren alene. Kontinuerte matrixfaser eller membraner 5 indeholdende polyester-lægemiddelsalt nedbryder følgelig forskelligt fra de kontinuerte matrixfaser eller membraner, der er baseret på polyester alene. Det vil også forstås, at diffusionshastigheden af vand eller fysiologisk væske ind i en sådan frigørelsesstyrende polyestermatrix eller -membran del-10 vis vil styre nedbrydningshastigheden. Denne diffusion af vand eller fysiologiske væsker reguleres også af formuleringens dimensioner og form, og lægemiddelfrigørelse fra midler indeholdende polymere salte af polypeptider og polyestere er således også afhængig af disse faktorer.

15 Af særlig interesse som polyesterkomponenten af peptid-poly-esterlægemiddelsaltene ifølge opfindelsen er de på homo- og co-polymerer af mælkesyre og glycolsyre baserede, hvor mælkesyren kan foreligge i en hvilken som helst eller flere af sine optisk aktive og racemiske former. Polyestere af denne almene 20 type har været kendt i mange år og har været undersøgt detaljeret i en række forskellige lægemiddeludleveringssystemer med styret frigørelse (se f.eks. "Controlled Release of Bioactive Agents from Lactide/Glycolide Polymers" af D.H. Lewis i "Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems", udg. M.

25 Chasin & R. Langer, Marcel Dekker, og henvisninger deri).

For eksempel angiver US patent nr. 3.773.919 i brede, almene vendinger, at farmaceutiske formuleringer af lactid-polyestere og lactid- co-polyestere med styret frigørelse indeholdende antimikrobielle polypeptider vil kunne fremstilles. De deri 30 omhandlede antimikrobielle peptider er imidlertid utilfreds- ! stillende til dannelse af et polyestersalt, eftersom de forekommer enten som sulfater eller har andre træk, som hæmmer eller forhindrer dannelsen af et polyester-peptidlægemiddelsalt. Når eksemplerne vist i dette patent følges, resulterer DK 176134 B1 37 blandingen af peptidlægemidlet, uanset dets natur, med en polymer ved en forhøjet temperatur som omhandlet i virkeligheden i katastrofal dekomponering af peptidlægemidlet.

Et antimikrobielt polypeptid, colistin, er på lignende måde 5 omhandlet i europæisk patent nr. 25.698 som en af mange opremsede forbindelser, der angiveligt kan formuleres sammen med polylactid, men endnu en gang har denne forbindelse strukturelle træk, som hindrer saltdannelse med polyesterens terminale carboxylsyregrupper. Colistin anvendes farmaceutisk kun 10 som colistinsulfat eller colistinsulfomethat natrium, hvoraf ingen former muliggør fremstilling af amfipatiske salte med polyestere ifølge den foreliggende opfindelse. Anden kendt teknik, som omhandler brugen af polypeptider sammen med bionedbrydelige polymere baseret på homo- og co-polymerer af 15 mælkesyre og glycolsyre, er de europæiske patenter nr. 52.510, 58.481, 145.240 og 190.833, der er henvist til i det fore gående .

Selv om co-polymerer af mælkesyre og glycolsyre har været kendt i mange år, er kompleksiciteten af deres opbygning med 20 hensyn til fordelingen af co-monomerenhederne og deres følgende sekvenslængde (forløb af den samme individuelle co-monomerenhed i co-polymeren, som er andet end tilfældige), og virkningen af sådanne stukturelle variationer ved brug som lægemiddelfrigørelsesmatrix'er har i det store og hele været 25 overset i den kendte teknik. Denne co-polymeropbygning bestemmer, delvis, både opløseligheden og kvældbarheden af polymeren i opløsningsmidler, såsom benzen, samt nedbrydningshastigheden. Denne korrelation blev først iagttaget af Hutchinson (europæisk patent nr. 58.481), men er i den foreliggende op-30 findelse blevet udvidet.og forfinet.

Til illustration af dette punkt omhandler US patent nr. 3.773.919 visse lægemiddelformuleringer med styret frigørelse, der bruger 50/50 co-polyestere af mælkesyre og glycolsyre, som er opløselige i benzen, og dette US patent er i virkeligheden DK 176134 B1 38 specifikt begrænset (i henseende til mælke/glycol-co-polyme-rer) til dem, der er benzenopløselige. Anvendeligheden af disse benzenopløselige co-polyestere er blevet yderligere forstærket af deres specifikke brug i europæisk patent nr.

5 52.510. Det tidligere US patent nr. 2.703.316 (som var i fæl les eje med US patent nr. 3.773.919) omhandlede imidlertid 50/50 lactid/glycolid-co-polyestere, som var uopløselige i benzen. Eftersom disse to US patenter var i fælles eje (duPont), må det antages, at i opfindelsen omhandlet i det 10 senere af disse patenter var de benzenuopløselige co-polymerer ringere i nogen henseende sammenlignet med de der var benzen-opløselige. Dette synspunkt forstærkes af europæisk patent nr. 52.510, som kun benyttede de benzenopløselige co-polymerer omhandlet i US patent nr. 3.773.919.

15 Den kendte teknik, med undtagelse af ansøgers eget europæiske patent nr. 58.481, har overset virkningen, som opbygningen af co-polyestere af mælkesyrer og glycolsyrer har på deres opløselighed og nedbrydelighed. Det er vist, at for polyestere af ens molekylvægt og molekylvægtfordeling gælder den følgende 20 generelle relation i de fleste tilfælde for polyestere, som er opløselige i chloroform ved 25°C, nemlig at benzenuopløselige polyestere nedbrydes hurtigere end polyestere, som kvælder, men ikke opløses af benzen, og sådanne benzen-kvældbare polyestere nedbrydes hurtigere end de polyestere, som er frit 25 opløselige i benzen, når nedbrydningsforsøg udføres i vandige fysiologiske væsker eller i puffer ved pH 7,4 ved 37°C. Det er følgelig særlig nyttigt at anvende polyestere, som er uopløselige i benzen, til opnåelse af kontinuert frigørelse af peptider fra parenterale formuleringer over et relativt kort 30 tidsrum, f.eks. fra en uge til 2 måneder.

For midler, som kan indeholde fra 0,1% vægt/vol peptid op til 75% vægt/vol peptid gælder således det følgende med hensyn til polyester-sammensætning og dens relationer til opbygning, viskositet og polydispersitet.

DK 176134 B1 39

Til fremstilling af peptid-polyesterlægemiddelsalte, som kan formuleres i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse til opnåelse af kontinuert lægemiddelfrigørelse over et tidsrum på en uge til to måneder, ligger den molære sammensætning 5 af sådanne benzenuopløselige polyestere, der fortrinsvis har en normal til bred polydispersitet, fortrinsvis i intervaller fra 60% glycolsyre (eller glycolid)/40% mælkesyre (eller lactid) til ca. 25% glycolsyre (eller glycolid)/75% mælkesyre (eller lactid), og sådanne polyestere har fortrinsvis et loga-10 ritmisk viskositetstal ved 1% vægt/vol i chloroform ved 25°C i intervallet fra 0,08 til 4,0 dl/g.

Ved passende valg af polyesterparametrene indbefattet molekylvægt og molekylvægtfordeling er det også muligt at opnå kontinuert frigørelse af polypeptider over et tidsrum fra en uge 15 til to måneder fra formuleringer ifølge den foreliggende opfindelse ved anvendelse af polymælkesyre-homopolymer- eller co-polyestere med en molær sammensætning i intervallet fra 35% glycolsyre (eller glycolid)/65% mælkesyre (eller lactid) til 10% glycolsyre (eller glycolid)/90% mælkesyre (eller lactid), 20 der er opløselige i benzen, har et logaritmisk viskositetstal ved 1% i chloroform ved 25°C fra 0,08 til 0,5 dl/g og har en snæver til bred polydispersitet.

Kontinuert frigørelse af peptider over et forholdsvis længere tidsrum, f.eks. to til seks måneder, fra formuleringer ifølge 25 den foreliggende opfindelse kan opnås ved anvendelse af polymælkesyre -homopolymer- eller co-polyestere med en molær sammensætning i intervallet fra 35% glycolsyre (eller glycolid) /65% mælkesyre (eller lactid) til 0% glycolsyre (eller glycolid)/100% mælkesyre (eller lactid), som er benzenopløse-30 lige, har et logaritmisk viskositetstal ved 1% vægt/vol i chloroform ved 25°C fra 0,08 til 0,8 dl/g og har en snæver til bred polydispersitet.

Kontinuert frigørelse af peptider over et meget langt tidsrum, f.eks. op til to år, fra formuleringer ifølge den foreliggende DK 176134 B1 40 opfindelse kan opnås ved anvendelse af polymælkesyre-homopoly-mer- eller co-polyestere med en molær sammensætning i intervallet fra 25% glycolsyre (eller glycolid)/75% mælkesyre (eller lactid) til 0% glycolsyre (eller glycolid)/100% mælke-5 syre (eller lactid), som er benzenopløselige, har et logaritmisk viskositetstal ved 1% vægt/vol i chloroform ved 25°C fra 0,2 til 4,0 dl/g og en normal til høj polydispersitet.

Tidsmæssigt reguleret eller pulseret frigørelse (med en induktionsperiode forud for frigørelse) eller diskontinuert frigø-10 relse (hvor der er en begyndelsesfase med frigørelse efterfulgt af et tidsrum med ingen frigørelse eller ineffektiv frigørelse, efterfulgt af en anden fase med frigørelse) over et relativt kort tidsrum, f.eks. op til to måneder, kan opnås med formuleringen ifølge den foreliggende opfindelse ved 15 anvendelse af benzenuopløselige polymere, som har en snæver til mest sandsynlig molekylvægtfordeling samt et logaritmisk viskositetstal ved 1% vægt/vol i chloroform ved 25°C fra 0,3 til 4,0 dl/g.

Endnu et træk ved den foreliggende opfindelse, som er nyt og 20 adskiller opfindelsen fra alle andre tidligere beskrevne lægemiddel-udleveringssystemer med styret frigørelse på basis af polyestere eller co-polyestere, og som yderligere styrer frigørelseshastigheden, er omfanget af inkorporering af peptid som polyestersaltet (eventuelt i nærværelse af frit lægemiddel 25 og/eller fri polymer). Dette yderligere styringstræk afviger fuldstændigt fra de parametre, som resulterer i forøgede frigørelseshastigheder i flere konventionelle udleveringssystemer på basis af polyestere, som er rettet mod udlevering af meget lipofile lægemidler med relativt lav vandig opløselighed, 30 såsom steroider. Når omfanget af lægemiddelinkorporering stiger, ses i de tilfælde generelt en forøget frigørelseshastighed, selv om sådanne systemers vandoptagelse er formindsket, som følge af det forøgede fasevolumen af lipofilt lægemiddel. Sådanne forøgede frigørelseshastigheder af lægemidler, såsom 35 steroider, afhænger i realiteten af lægemidlets bevarelse af DK 176134 B1 41 dets termodynamiske identitet samt af simpel Fickian-diffusionskinetik (se Baker og Lonsdale, anført ovenfor). Det vil sige, at for sådanne lægemidler som steroider stiger simple Fickian-diffusionshastigheder, når lægemiddelmængden stiger, 5 og forudsat at det lipofile lægemiddel har nogen opløselighed i den lipofile polymer.

En fuldstændig anderledes situation foreligger imidlertid i forbindelse med produkterne ifølge den foreliggende opfindelse. Det er nu erkendt, at en stor komponentdel af nedbryd-10 ningen af polyestere og co-polyestere er hydrolyse af estergrupper, og hastigheden, med hvilken dette finder sted, afhænger af vandoptagelse (se Pitt og Zhong-wei Gu, J. Controlled Release, 4, 283 - 292 (1987); Hutchinson og Furr, ibid., 13, 279 - 294 (1990)). Peptider er hydrofile, og deres saltdan- 15 nelse med polyestere resulterer i en fase indeholdende polyester-lægemiddelsalt, som har en højere vandoptagelse end polyesteren alene. Dette vil sige, at polyesterkæden i saltet kan nedbryde hurtigere end fri polyester alene, som har en lignende sammensætning, molekylvægt og polydispersitet. Da 20 peptidfrigørelse er stærkt afhængig af nedbrydning, reguleres frigørelse delvis både af omfanget af inkorporering af poly-ester-peptidlægemiddelsaltet i midlet samt af mængden af peptid i saltet. For polyestere eller co-polyestere af samme sammensætning og opbygning resulterer forøgelse af den ene 25 eller begge disse parametre i forøgede frigørelseshastigheder og kan i sagens natur under visse omstændigheder formindske de tidsrum, over hvilke frigørelse kan finde sted. Omfang af peptid-lægemiddelinkorporering, enten som polyester-lægemiddelsalt eller som polyester-lægemiddel salt i kombination med 30 frit peptid, ligger fortrinsvis i intervallet fra 0,1% vægt/vægt til 75% vægt/vægt i polyester-lægemiddelformuleringen.

Peptid-lægemiddelmængden i midlet ifølge opfindelsen og dens ændring med polyester-molekylvægt og -polydispersitet er som 35 følger. Til kontinuert frigørelse af et peptid over meget : r— DK 176134 B1 42 lange tidsrum, f.eks. op til to år, foretrækkes lave niveauer af lægemiddelinkorporering, der ligger i intervallet fra 1,0% til 20% vægt/vægt, under anvendelse af polyestere, som har et foretrukket vægtgennemsnit af molekylvægt på 20.000Da eller 5 mere og polydispersiteter på mere end 2,2 og fortrinsvis mere end 3,5. Disse parametre for meget langvarig frigørelse afhænger også til dels af andre træk ved lægemiddelformuleringen, såsom sammensætning med hensyn til indhold af co-monomer, opbygning, opløselighed/uopløselighed i benzen samt geometri 10 og dimensioner af doseringsformen. En polyester med vægtgennemsnit af molekylvægt på ca. 20.000 har et logaritmisk viskositetstal på ca. 0,2, afhængigt af sådanne faktorer som dens struktur, sammensætning og polydispersitet.

Til kontinuert frigørelse over relativt lange tidsrum, f.eks.

15 op til seks måneder, ligger foretrukne niveauer af peptidlægemiddel inkorporering i et interval fra 0,5% til 35% vægt/vægt under anvendelse af polyestere eller co-polyestere med vægtgennemsnit af molekylvægte på fortrinsvis 10.000Da eller mere samt polydispersiteter på mere end 1,8 og fortrins-20 vis mere end 2,2, afhængigt af alle andre parametre, såsom sammensætning, opbygning, opløselighed/uopløselighed i benzen samt geometri og dimensioner af doseringsfornerne.

Til kontinuert frigørelse over relativ korte tidsrum, f.eks. op til to måneder, ligger foretrukne niveauer af peptid-læge-25 middel inkorporering i et interval fra 0,1% til 75% vægt/vægt under anvendelse af polyestere med foretrukne vægtgennemsnit af molekylvægte på 2.000Da eller mere samt polydispersiteter på mere end 1,2, afhængigt af alle andre parametre, såsom sammensætning, opbygning, opløselighed/uopløselighed i benzen 30 samt geometri og dimensioner af doseringsformerne. .

En yderligere parameter, som yderligere styrer peptid-lægemid-delfrigørelse fra formuleringer ifølge opfindelsen, og som kendte typer af udleveringssysterner baseret på homo- og co-polymerer af mælkesyre og glycolsyre mangler, er peptidets DK 176134 B1 43 funktionalitet med hensyn til antallet af basiske grupper, såsom arginin- og lysinrester, i peptid-lægemiddelmolekylet, samt funktionaliteten af polyesteren eller co-polyesteren med hensyn til det gennemsnitlige antal carboxylsyregrupper inde-5 holdt i den gennemsnitlige polymer- eller co-polymerkæde. Til kontinuert frigørelse af peptidlægemidlet forholder det sig generelt således, at jo større omfanget af sådan polyfunktionel vekselvirkning i peptid-polyester-polyelektrolytkomplekset er, jo større er den krævede polydispersitet. Til diskonti-10 nuert eller pulseret frigørelse foretrækkes derimod polydis-persiteter på mindre end 2,2.

En af de relativt sjældne forekomster af gensidig forligelighed eller opløselighed af to polymertyper, der har forskellige kemiske opbygninger, er repræsenteret af blandinger af poly-15 estere, som er baseret på homo- og co-polymerer af mælkesyre og glycol syre, med polyoxyethylener med lav molekylvægt og især polyethylenglycoler med lav molekylvægt. Denne forligelighed er blevet benyttet med god effekt i polyester-peptid-lægemiddelsalte og deres fremstilling, ifølge den foreliggende 20 opfindelse på en hidtil ukendt og uventet måde. Det er således kendt, at visse farmakologiske aktive peptider kan "pegyleres", dvs. konjugeres med en polyethylenglycol eller alkoxy-polyethylenglycol på en sådan måde, at pept idet s farmakologiske aktivitet bevares. Tilstedeværelsen af den konjuge-25 rede polyoxyethylenkæde i det pegylerede peptidmolekyle gør således det pegylerede peptid delvis forligeligt med polyesteren eller co-polyesteren.

Forudsat at de tilbageblivende glycin- eller argininrester i det pegylerede peptid forekommer som salte af svage syrer, 30 letter denne forligelighed således fremstillingen af poly-ester-peptidlægemiddelsaltet og tilfører et yderligere element til styring af frigørelse. Farmakologisk aktive konjugater af peptider med andre vandopløselige polymerer, såsom polysaccha-rider, syntetiske polypeptider og polyvinylpyrrolidon, er også 35 anvendelige, men er mindre foretrukne, eftersom ingen af disse DK 176134 B1 44 sidstnævnte vandopløselige polymerer er opløselig eller forligelig med polyesteren eller co-polyesteren.

Den foreliggende opfindelse gør fortrinsvis brug af farmakologisk aktive lægemidler indeholdende basisk funktionalitet. Den 5 kan imidlertid også gøre brug af peptider, som er farmakologisk aktive, og som er hverken neutrale eller har tendens til at eksistere i det store og hele som polyanioner (peptider med overskud af carboxylsyrefunktionalitet).

I det første af disse tilfælde (et farmakologisk aktivt neu-10 trait polypeptid indeholdende hverken sure eller basiske rester) anvendes et salt af et syntetisk polypeptid, som indeholder basisk funktionalitet, og som er farmakologisk inaktivt, samt polyesteren. Et sådant salt af det farmakologisk inaktive syntetiske polypeptid og polyesteren eller co-15 polyesteren er også amfipatisk og kan således fungere som et dispergeringsmiddel til solubilisering eller kolloidal disper gering af et farmakologisk aktivt, men neutralt peptid i en organisk fase.

I det andet af disse tilfælde (hvor det farmakologisk aktive 20 polypeptid indeholder tilbageværende carboxylsyrefunktionalitet) anvendes et salt af et syntetisk polypeptid, der har mindst to basiske grupper i den syntetiske polypeptidkæde, og som er farmakologisk inaktivt, samt en polyester eller co-polyester. I saltet af det syntetiske polypeptid og polyester 25 er i dette andet tilfælde koncentrationen af basiske funktionelle grupper i saltet større end koncentrationen af carboxyl-syregrupper i det sure, farmakologisk aktive peptid. Denne overskydende basiske funktionalitet i saltet kan derpå ved yderligere saltdannelse reagere med carboxylsyregrupperne i 30 det sure, farmakologisk aktive peptid. Det resulterende kompleks af salte kan derpå solubiliseres eller dispergeres i et organisk opløsningsmiddel eller en organisk fase, som normalt er et fuldstændigt ikke-opløsningsmiddel for det pågældende peptid, men som er opløsningsmidler for polyesteren eller co- DK 176134 B1 45 polyesteren, på den ovenfor for andre polvester-peptidsalte beskrevne måde.

På grund af at salte af peptider indeholdende basisk funktio-nalitet med polyestere og co-polyestere indeholdende carboxyl-5 syrefunktionalitet er amfipatiske, kan deres overfladeaktive egenskaber anvendes til at lette dispergeringen af andre hydrofile lægemidler eller vandige suspensioner af sådanne lægemidler i et organisk opløsningsmiddel eller en organisk fase indeholdende polyester-peptidsaltet. Brugen af sådanne 10 amfipatiske salte af peptider med polyestere eller co-poly-estere som dispersions- eller solubiliseringsmidler udgør et yderligere træk ved opfindelsen.

j^pf i'rrdelsen~iil'ustxeres--i-;--'men—begrænses~rkke''-af~de--følgende' jek-sempiexr"/ 15 Målingen af viskositeter og deres relation til de forskellige gennemsnit af molekylvægte er omtalt i Sorensen og Campbell, "Preparative Methods of Polymer Chemistry", 2. udgave, 1968, Interscience Division of John Wiley, side 43-50. I de nedenfor omtalte eksempler benyttedes et Ubbelohde-viskosimeter, 20 som angiver en strømningstid for chloroform alene på ca. 100 sekunder. Chloroform blev benyttet som opløsningsmiddel, eftersom dette var et opløsningsmiddel for både benzenopløselige og benzenuopløselige polymerer over det omhandlede sammensætningsinterval.

25 Molekylvægte og molekylvægtfordelinger af i denne ansøgning beskrevne polyestere med molekylvægt over ca. 2.000Da blev ved hjælp af størrelsesudelukkelseskromatografi bestemt i forhold til polystyrenstandarder under anvendelse af 3 x 30 cm PL Gel, 10 μπι blandede B-søjler (fra Polymer Laboratories, Church 30 Stretton, Shropshire, UK), som var serieforbundne og udstyret med en 10 μπι beskyttelsessøjle. Tetrahydrofuran blev benyttet som opløsningsmiddel ved 40°C med en nominel strømningshastighed på 1 ml per minut. Molekylvægtkarakteristika blev beregnet DK 176134 01 46 ved anvendelse af Data Analysis Package Perkin-Elmer 7700 Professional Computer med GPC-software.

Til måling af molekylvægte på mindre end 2.000Da er størrelsesudelukkelseskromatografi ikke den foretrukne metode til 5 molekylvægtbestemmelse, og i stedet kan ikke-vandig potentio-metrisk titrering anvendes til opnåelse af enten polyesterens molekylvægt eller ækvivalentvægt ved direkte måling af polyesterens eller co-polyesterens carboxylsyreindhold. Ikke-vandige potentiometriske titreringer blev generelt udført 10 under anvendelse af en kendt vægt af polyester eller co-poly-ester opløst i acetone indeholdende 10% vol/vol vand. Titreringer blev udført ved anvendelse af fortyndede natriumhydroxidopløsninger og ved anvendelse af udstyr leveret af Radiometer (København, Danmark). Dette bestod af en titrator 15 (TTT 80) og autoburette (ABU 80), et pH-meter (PHM 83) samt en Russel CMAWK-elektrode. Titreringen blev optegnet på en Servograph (REC 80), og polymerens molekylvægt er w x 1000 x f 20 v x n hvor w er vægten af benyttet polymer, f er det gennemsnitlige antal carboxyl syregrupper per polymerkæde, v er volumenet af benyttet natriumhydroxid, og 25 n er normaliteten af det benyttede natriumhydroxid.

Eksempel 1

Goserelinacetat (100,6 mg, ækvivalent med ca. 86 mg heptid som fri base) og 50/50% molær D,L-lactid/glycolid-co-polymer (300,3) indeholdende én terminal carboxylsyregruppe per poly-30 merkæde og med et vægtgennemsnit af molekylvægt på 4.300Da og DK 176134 B1 47 et logaritmisk viskositetstal ved 1% vægt/vol i chloroform ved 25°C på 0,08 dl/g, og som var uopløselig i benzen, blev opløst i anhydridfri iseddikesyre (3 ml) . Eddikesyreopløsningen af lægemiddel og polymer blev dråbevis sat til flydende nitrogen, 5 og de frosne smådråber blev frysetørret i 24 timer under høj -vakuumbetingelser. Det frysetørrede produkt blev til slut eftertørret ved 50°C i 24 timer under højvakuum til opnåelse af en polyester-lægemiddelblanding indeholdende nominelt ca.

25% vægt/vægt goserelinacetat (ækvivalent med ca. 22,3% 10 vægt/vægt peptid som fri base).

Den tørrede polyester-lægemiddelblanding (400 mg) blev sat til dichlormethan og bragt op på 4 ml. Til at begynde med opnåedes en uklar, kolloidal blanding, men i løbet af en 1 time klarede denne gradvis til dannelse af en klar opløsning. Opløsningen 15 blev støbt som en film, og man lod den tørre ved stuetemperatur i ca. 6 timer og derpå i 20 timer ved 50°C under høj-vakuum. En klar, transparent film indeholdende polyester-lægemiddelsalt blev således opnået.

(i) Den således opnåede klare, transparente film (100 mg) 20 blev smeltet og presset ved 80°C til opnåelse af en ca. 0,02 cm tyk transparent film. Ved neddykning i vand ved 37°C i 24 timer steg vægten af den hydratiserede lægemiddel-polymerfilm til 225 mg. I modsætning hertil steg på lignende måde behandlet polyester alene (100 mg) til kun 126 mg i vægt, og en film 25 omfattende en simpel blanding af goserelinacetat (25 mg) og polymer (75 mg) (fremstillet ved at sætte lægemiddel til en opløsning af polymer i dichlormethan, fjerne opløsningsmidlet og presse det resulterende materiale til dannelse af en ca.

0,02 cm tyk film) vejede kun 136 mg efter 24 timers neddykning 30 i vand ved 37°C. Det fremgår af dette forsøg, at polyesterlægemiddelsalt-sammensætningen er betydelig mere hydrofil og har en højere vandoptagelse end både polyesteren alene og simple blandinger af lægemiddel og polyester.

DK 176134 B1 48 I den simple blanding af lægemiddel og polymer i dichlormethan udviste lægemidlet intet tegn på opløsning endog efter 1 måned, og efter tørring og presning resulterede den simple blanding i en uigennemsigtig film. Ved et yderligere eksperi-5 ment blev imidlertid den som ovenfor anført opnåede transparente film (100 mg) opløst i dichlormethan (1 ml) til dannelse af en klar, transparent polyester-lægemiddelopløsning. Til denne opløsning sattes trifluoreddikesyre (50 μλ), og blandingen omrørtes kraftigt. Der skete en øjeblikkelig udfældning af 10 goserelin som trifluoracetatsaltet.

Disse to forsøg viser, at den som ovenfor beskrevet opnåede klare, transparente film indeholdende polyester-lægemiddelsalt er i stand til at blive oparbejdet til et formgivet udleveringssystem under anvendelse af konventionel polymer-smelte-15 fabrikationsteknik. Endvidere indeholder dette produkt praktisk talt ingen eddikesyre eller acetatanion, og lægemidlet skal således eksistere i form af polyestersaltet. Polyesterlægemiddelsaltet fremkommer, fordi de terminale mælkesyreeller glycolsyregrupper på co-polymeren er meget kraftigere 20 syrer end eddikesyre, og den svagere eddikesyre således fortrænges af polymeren. Polymer-carboxylsyren i det dichlor-methanopløselige polyester-lægemiddelsalt kan på sin side fortrænges af en endnu stærkere carboxylsyre, såsom trifluoreddikesyre. Når dette finder sted, dannes trifluoracetatsaltet 25 af pept idet, og det udfældes, da det ikke er opløseligt i dichlormethan.

(ii) Den som ovenfor beskrevet opnåede klare, transparente film (50 mg) indeholdende polyester-lægemiddelsaltet blev formet til opnåelse af en ca. 0,02 cm tyk film. Filmen blev 30 inkuberet i phosphatpufret saltvand (indeholdende 0,02% natriumazid) ved pH 7,4 og 37°C, og pufferopløsningen blev periodisk analyseret ved hjælp af UV til bestemmelse af mængden af frigjort goserelin. Dette formede produkt frigjorde kontinuerligt goserelin over ca. 2 uger og var efter 3 uger 35 praktisk talt fuldstændigt nedbrudt og forsvandt fra inkuba- ! i DK 176134 B1 49 tionsmediet.

Dette forsøg viser anvendeligheden af benzenuopløselige polymerer med meget lav molekylvægt til udlevering af lægemiddel over et kort tidsinterval.

5 Lignende formede formuleringer kan fremstilles ved i stedet for goserelinacetat at anvende enten naturligt forekommende gonadotropinfrigørende hormoner eller andre meget virksomme analoger (agonistiske eller antagonistiske) af gonadotropin-friegørende hormon, såsom tryptorelin, leuprorelin, buserelin 10 og nafarelin, fortrinsvis som acetatsaltene eller salte med andre svage syrer; eller ethvert andet pept idhormon, som styrer sekretion af det intakte gonadotropin eller en hvilken som helst af gonadotropin-underenhederne.

Eksempel 2 15 Det i Eksempel l ovenfor opnåede klare, transparente filmprodukt (100 mg) og en 50/50 molær D,L-lactid/glycolid-co-polymer (1,05 g) med et vægtgennemsnit af molekylvægt på l21.000Da og et logaritmisk viskositetstal ved 1% vægt/vol i chloroform ved 25°C på 0,84 dl/g, og som er uopløselig i benzen, blev opløst 20 i dichlormethan (100 ml) . Opløsningen blev omrørt kraftigt ved 1000 omdrejninger per minut (o/m), og siliconeolie (50 ml) blev langsomt tilsat over l time til udfældning af både polyester-lægemiddelsaltet og den frie polyester. Efter 1 time blev den delvis udfældede blanding af polyester-lægemiddel-25 salt, fri polyester, siliconeolie og dichlormethan sat til kraftigt omrørt hexan (2 liter) til hærdning af mikropartik-lerne af polyester-lægemiddelsalt og fri polyester. Denne blanding blev omrørt i 2 timer og fik derpå lov til at sedimentere, hvorpå hexanlaget blev bortkastet. Mikropartiklerne 30 (indeholdende ca. 1,95% vægt/vægt goserelin som fri base) blev vasket tre gange med frisk hexan (500 ml) og til slut isoleret ved filtrering samt tørret ved 35°C i 24 timer under høj -vakuum. Den gennemsnitlige størrelse af de således opnåede DK 176134 B1 50 tilnærmelsesvis sfæriske mikropartikler, som omfatter en opløsning af polyester-lægemiddelsalt i fri polymer, var ca. 30 μπι.

En del af dette produkt (250 mg) blev inkuberet i phosphatpuf-5 ret saltvand (indeholdende 0,02% natriumazid) ved pH 7,4 og 37°C, og pufferopløsningen blev periodisk analyseret ved hjælp af UV til bestemmelse af mængden af frigjort goserelin. Mikro-partiklerne frigjorde lægemiddel.over ca. 5 uger, og efter 7 uger var de praktisk talt forsvundet fra inkubationsmediet.

10 Det til dette forsøg benyttede polymermateriale var en blanding af to co-polymerer af samme laet id-glycolid-sammensætning, men med meget forskellige molekylvægte, og var som en blanding som heri beskrevet uopløselig i benzen, havde et vægtgennemsnit af molekylvægt på 108.000Da, en polydispersitet 15 på 5,1 og et logaritmisk viskositetstal ved 1% vægt/vol i chloroform ved 25°C på 0,72 dl/g.

Disse forsøg viser anvendeligheden af benzenuopløselige polyestere med høj molekylvægt og høj polydispersitet til frigørelse af goserelin over relativt korte tidsrum på 5 - 7 uger.

20 Lignende mikropartikelformuleringer kan fremstilles ved i stedet for goserelinacetat at anvende enten naturligt forekommende analoger af gonadotropinfrigørende hormoner eller andre meget virksomme syntetiske analoger (agonister eller antagonister) af gonadotropinfrigørende hormon, såsom tryptorelin, 25 leuprorelin, buserelin eller nafarelin, fortrinsvis som acetatsaltene eller salte med andre svage syrer,· eller ethvert i andet polypeptidhormon, som styrer eller modulerer sekretion af de intakte gonadotropiner eller enhver af de individuelle gonadotropin-underenheder.

Eksempel 3 DK 176134 B1 51 j

Goserelinacetat (101 mg, ækvivalent med ca. 86 mg goserelin som fri base) og en 100% molær poly(D,L-mælkesyre) (299,7 mg), som var opløselig i benzen, havde et vægtgennemsnit af mole-5 kylvægt på ca. 5.400Da, et logaritmisk viskositetstal ved 1% vægt/vol i chloroform ved 25°C på 0,08 dl/g og en polydisper-sitet på 1,8, blev opløst i anhydridfri iseddikesyre (4 ml).

Denne eddikesyreopløsning af goserelin og polyester blev dråbevis sat til flydende nitrogen, og de frosne smådråber blev 10 isoleret, frysetørret under vakuum i 24 timer og derpå tørret ved 55°C i 24 timer under højvakuum.

(i) Det opnåede tørrede produkt blev sat til dichlormethan (4 ml) til opnåelse af en til at begynde med uklar blanding, som hurtigt opløstes til opnåelse af en klar opløsning, der 15 blev filtreret gennem et 0,2 μτη nylon-steriliseringsfilter.

Dette forsøg viser, at opløsninger af polyestersaltet af goserelin kan sterilfiltreres i modsætning af blandinger eller dispersioner af simple lægemiddelsalte i en organisk opløsning af polyesteren.

20 (ii) Trifluoreddikesyre (50 μτη) blev sat til den klare di-chlormethanopløsning (i) ovenfor (1 ml) under kraftig omrøring. Der skete en øjeblikkelig udfældning af goserelin i form af trifluoracetatsaltet deraf, hvilket viser, at goserelin var til stede i dichlormethanopløsningen som saltet med 25 den carboxy-terminerede polyester.

Lignende sterile opløsningsformuleringer kan fremstilles under anvendelse, i stedet for goserelinacetat, af enten naturligt forekommende gonadotropinfrigørende hormoner eller andre meget virksomme syntetiske analoger (agonistiske eller antagonisti-30 ske) af gonadotropinfrigørende hormon, såsom tryptorelin, leuprorelin, buserelin eller naferelin, fortrinsvis som acetatsaltene eller salte med andre svage syrer,· eller ethvert DK 176134 B1 52 andet polypeptidhormon, som styrer eller modulerer sekretion af de intakte gonadotropiner eller hvilke som helst af de individuelle gonadotropin-underenheder.

Eksempel 4 5 Dichlormethanopløsningen af den ifølge Eksempel 3 opnåede goserelin-polyester (2 ml) blev fortyndet med mere dichlor-methan og bragt op på 10 ml. Denne opløsning blev indsprøjtet i kraftigt omrørt hexan (1 liter) til opnåelse af mikropartikler, som efter isolation og tørring under vakuum ved 45°C i 24 10 timer havde størrelser i intervallet fra ca. 2 μτη til ca. 30 μτη med en gennemsnitsstørrelse på ca. 10 μτη. Goserelinindhol-det i disse mikropartikler var ækvivalent med ca. 22% som fri base.

Disse mikropartikler blev inkuberet i saltvand, pufret med 15 phosphat til pH 7,4 ved 37°C, og supernatanten blev periodisk analyseret for goserelin ved hjælp af UV. Goserelin blev frigjort kontinuerligt, frigørelsen var i det væsentlige afsluttet efter ca. 8 uger, og efter 11 uger var mikropartikleme fuldstændig nedbrudt og forsvandt fra inkubationsmediet. Dette 20 forsøg viser anvendeligheden af benzenopløselige polyestere med meget lav molekylvægt til opnåelse af kontinuert peptidfrigørelse over ca. 2 måneder.

Hvis goserelinacetatet ved de ovennævnte forsøg erstattes af trifluoracetatsaltet opnås ikke en klar opløsning, men i 25 stedet indeholder polyesteropløsningen i dichlormethan i det væsentlige en dispersion af goserelintrifluoracetat. Denne blanding vil ikke passere gennem et 0,2 μτη filter, og den er således ikke i stand til at blive sterilf iltreret; og en sådan dispersion af goserelintrifluorphosphat i polyesteropløsningen 30 frembragte ved indsprøjtning i omrørt hexan en størknet og flokkuleret masse frem for mikropartikler.

DK 176134 B1 53

Goserelin-polyestersaltet har således egenskaber, som gør det meget lettere at formulere til en mikropartikelform end blandinger af det simple salt i en opløsning af polymer med meget lav molekylvægt.

5 Lignende mikropartikelformuleringer kan fremstilles ved i stedet for goserelinacetat at anvende enten naturligt forekommende gonadotropinfrigørende hormoner eller andre meget virksomme syntetiske analoger (agonister eller antagonister) af gonadotropinf rigørende hormon, såsom tryptorelin, leuprorelin, 10 buserelin eller nafarelin, fortrinsvis som acetatsaltene eller salte med andre svage syrer; eller ethvert andet polypeptid-hormon, som styrer eller modulerer sekretion af de intakte gonadotropiner eller hvilke som helst af de individuelle gona-dotropin-underenheder.

15 Eksempel 5

Goserelinacetat (304 mg, ækvivalent med ca. 248 mg goserelin som fri base) og 100% molær poly (D, L-mælkesyre) (102 mg) med et vægtgennemsnit af molekylvægt på ca. 5.400, et logaritmisk viskositetstal ved 1% vægt/vol i chloroform ved 25°C på 0,08 20 dl/g samt en polydispersitet på 1,8 blev opløst i anhydridfri iseddikesyre (2 ml) . Eddikessyreopløsningen af goserelin og polyester blev derpå dråbevis sat til flydende nitrogen, og de frosne smådråber blev isoleret, frysetørret under højvakuum i 24 timer og derpå tørret under vakuum ved 55°C i 24 timer.

25 Det resulterende produkt blev sat til dichlormethan (2 ml) til opnåelse af en uklar, kolloidal blanding, som ikke blev fuldstændig klar med tiden. Denne blanding i dichlormethan omfattede i det væsentlige en dispersion af goserelinacetat i goserelin-polyestersaltet .

30 Denne dispersion af goserelinacetat i methylenchloridopløsnin-gen af polyester-goserelinsaltet blev formuleret til en mikropartikelform indeholdende goserelin ækvivalent med ca. 72% DK 176134 B1 54 vægt/vægt som fri base, hvori det frie goserelinacetat er dispergeret gennem det hele af en kontinuert fase af gosere-lin-polyestersaltet, ved hjælp af sprøjtetørring, sprøjtestørkning, simpel udfældning eller ved hjælp af fasesepa-5 ration-fnugdannelse.

Lignende mikropartikelformuleringer kan fremstilles i stedet for goserelinacetat at anvende enten naturligt forekommende gonadotropinfrigørende hormoner eller andre meget virksomme syntetiske analoger (agonister eller antagonister) af gonado-10 tropinfrigørende hormoner, såsom tryptorelin, leuprorelin, buserelin eller nafarelin, fortrinsvis som acetatsaltene eller salte med andre svage syrer,· eller ethvert andet polypeptidhormon, som styrer eller modulerer sekretion af de intakte gonadotropiner eller hvilke som helst af individuelle under-15 enheder deraf.

Eksempel 6

En co-polyester af D,L-mælkesyre og glycolsyre, som har en molær sammensætning på 78% D,L-mælkesyre og 22% glycolsyre, blev fremstillet ved co-polykondensation af de to hydroxy-20 syrer. Efter rensning af co-polymeren ved tilsætning af en opløsning af co-polyesteren i acetone til methanol til udfældning af co-polyesteren samt fraskillelse og tørring af det udfældede materiale havde co-polyesteren et vægtgennemsnit af molekylvægt på ca. ll.OOODa, et talgennemsnit af molekylvægt 25 (bestemt ved ikke-vandig potentiometrisk titrering under antagelse af, at hver co-polyesterkæde har kun én terminal carboxyl syregruppe) på 6.100Da, og derfor en polydispersitet på 1,6, og et logaritmisk viskositetstal ved 1% vægt/vol i chloroform ved 25°C på 0,15 dl/g.

30 Goserelinacetat (228,9 mg, ækvivalent med ca. 200 mg goserelin som fri base) og den ovenfor beskrevne co-polyester (1,8 g) blev opløst i anhydridfri iseddikesyre (10 ml) . Den således opnåede goserelin-polyesteropløsning blev dråbevis sat til DK 176134 B1 55 flydende nitrogen, og de frosne smådråber blev isoleret, frysetørret i 24 timer og derpå til slut tørret ved 50°C i 24 timer under vakuum.

Den tørrede goserelin-polyesterblanding blev sat til dichlor-5 methan (10 ml) til opnåelse af til at begynde med en uklar, kolloidal blanding, men efter 24 timer havde denne skiftet til en klar opløsning, som kunne filtreres gennem et 0,2 μτη nylonsteriliseringsfilter.

Når trifluoreddikesyre blev sat til en lille aliquot mængde af 10 denne klare opløsning, skete der en øjeblikkelig udfældning af goserelinet som trifluoracetatsaltet deraf, hvilket viser, at i den klare, transparente dichlormethanopløsning var goserelinet i goserelin-polyesterblandingen hovedsagelig eller som helhed til stede som polyestersaltet.

15 Dichlormethanopløsningen af goserelin-polyestersaltet blev inddampet til tørhed, og det resulterende faste stof blev tørret ved stuetemperatur i 6 timer og derpå ved 55°C i 20 timer under vakuum til opnåelse af en klar, støbt film indeholdende goserelin-polyestersalt.

20 Den tørrede goserelin-polyesterblanding, der var fremstillet som ovenfor beskrevet (1 g) , blev opløst i 8 ml dichlormethan.

Den resulterende opløsning blev anbragt i en 250 ml flerhalset rundbundet kolbe og skyllet med en nitrogenstrøm til fjernelse af al luft og til frembringelse af en carbondioxidfri atmos-25 fære. Vand (90 ml), som forinden var blevet afgasset til fjernelse af al carbondioxid og derpå opbevaret under carbondioxidfrit nitrogen, blev indført i kolben, og blandingen omrørtes kraftigt ved ca. 500 o/m under en atmosfære, som var i det væsentlige carbondioxidfri. Dichlormethanopløsningen af 30 goserelin-polyestersalt dispergerede hurtigt til opnåelse af en stabil olie (dichlormethanopløsning af lægemiddel-polymer-salt) -i-vand-dispersion. Under opretholdelse af omrøring ved ca. 200 o/m blev et vakuum gradvis anlagt, og hovedmængden af DK 176134 B1 56 dichlormethanet blev fordampet under vakuum til opnåelse af en dispersion af goserelin-polyestersalt i vand. Frysetørring af denne dispersion frembragte mikropartikler, hvori goserelinet er til stede som goserelin-polyestersaltet med en gennemsnit-5 lig partikelstørrelse på ca. 20 μτη, som viste sig at frigøre goserelin over ca. 6 uger efter inkubation i saltvand, pufret med phosphat til pH 7,4 ved 37°C, og supernatanten blev periodisk analyseret for goserelin ved hjælp af UV.

Lignende mikropartikler kan også fremstilles ved at der i den 10 vandige fase inkorporeres stoffer, som vides at forbedre poly-peptidstabilitet, såsom mannitol. Selv om det foretrækkes at udføre den ovennævnte fremgangsmåde i en carbondioxidfri atmosfære, er det ikke desto mindre muligt at opnå tilfredsstillende resultater i nærværelse af spor af carbondioxid, 15 afhængigt af polyestermolekylvægt og lægemiddelmængde.

Lignende formuleringer i form af steril opløsning, støbt film og mikropartikel kan fremstilles på en lignende måde ved i stedet for goserelinacetat at anvende enten de naturlige analoger af gonadotropinfrigørende hormoner eller andre meget 20 virksomme syntetiske analoger (agonister eller antagonister), såsom tryptorelin, leuprorelin, buserelin eller nafarelin, fortrinsvis som acetatsalte eller salte med andre svage syrer,· eller ethvert andet polypeptidhormon, som kan styre eller modulere sekretionen af intakte gonadotropiner eller hvilke 25 som helst af deres underenheder.

Eksempel 7

Den i Eksempel 5 beskrevne procedure blev gentaget til opnåelse af den klare, transparente film, og denne film (1 g) blev opløst i dichlormethan (4 ml) . Opløsningen blev opvarmet 30 til ca. 35°C, og derpå blev en vandig opløsning ved ca. 40°C af renset gelatine (15 mg) i vand (100 μΐ) sat til dichlor-methanopløsningen af goserelin-polyestersalt, og blandingen omrørtes kraftigt ved ca. 35°C til opnåelse af en yderst fin DK 176134 B1 57 dispersion af den vandige gelatineopløsning i dichlormethan-opløsningen af goserelin-polyestersaltet. Ved afkøling til stuetemperatur bevaredes suspensionens kolloidale natur.

Dette forsøg viser, at goserelin-polyestersaltet har over-5 fladeaktive egenskaber og kan anvendes til opnåelse af stabile dispersioner i en olieagtig fase, såsom dichlormethan, af vandige opløsninger af andre vandopløselige stoffer, såsom gelatine, polysaccharider og andre hydrofile polymerer, eller visa versa.

10 Den i Eksempel 6 beskrevne proces blev gentaget under anvendelse af dispersionen af vandig gelatine i dichlormethan-opløsningen af det ovenfor beskrevne goserelin-polyestersalt til opnåelse af et mikrokapselprodukt, som indeholder både gelatine og goserelin-polyestersalt.

15 Andre forbindelser med lav molekylvægt kan inkorporeres i den vandige polymerfase. Især er det undertiden nyttigt at inkorporere forbindelser, såsom mannitol, der vides at forøge stabiliteten af peptider. Alternativt kan disse stabiliserende stoffer inkorporeres i begge vandige faser af den komplekse 20 vand-i-olie-i-vand-dispersion, som omfatter vandig gelatine dispergeret i dichlormethanopløsningen af goserelin-polyester-salte, og den resulterende vand-i-olie-dispersion er igen dispergeret i vand.

Lignende suspension- og mikropartikelformuleringer kan frem-25 stilles ved i stedet for goserelinacetat på lignende måde at anvende andre meget virksomme analoger (agonister eller antagonister) af gonadotropinfrigørende hormon, såsom tryp-torelin, leuprorelin, buserelin eller nafarelin, fortrinsvis som acetatsaltene eller salte med andre svage syrer; eller 30 ethvert andet polypeptidhormon, som kan styre eller modulere sekretionen af intakte gonadotropiner eller hvilke som helst af deres underenheder.

58 DK 11761134 B1

Eksempel 8

Goserelinacetat (771 mg, ækvivalent med ca. 670 mg goserelin som fri base), 95/5 molær D,L-lactid/glycolid-co-polymer (1,8 g) med et vægtgennemsnit af molekylvægt på ca. 3.600Da og et 5 logaritmisk viskositetstal ved 1% vægt/vol i chloroform ved 25°C på 0,08 dl/g samt 95/5 molær D, L-lactid/glycolid-co-polymer med et vægt gennemsnit af molekylvægt på ca. 15.000Da og et logaritmisk viskositetstal ved 1% vægt/vol i chloroform ved 25°C på 0,17 dl/g (4,2 g) blev opløst i anhydridfri 10 iseddikesyre (70 ml) . De forenede polymerer havde et vægtgennemsnit af molekylvægt på ca. 12.300Da og en polydisper-sitet på ca. 2,6. Goserelin-polyesteropløsningen blev dråbevis sat til flydende nitrogen, og de frosne smådråber blev isoleret og frysetørret under højvakuum i ca. 18 timer. Den frem-15 stillede lægemiddel-polymerblanding blev til slut tørret ved 55°C i 24 timer under højvakuum.

Den tørrede lægemiddel-polymerblanding (6 g) blev sat til dichlormethan (60 ml) til opnåelse af en til at begynde med uklar kolloidal blanding, som i løbet af 1 time gradvis 20 klarede til opnåelse af en klar opløsning af goserelin-polyestersalt i dichlormethan.

Denne opløsning blev sprøjtetørret under anvendelse af en Buehi-sprøjtetørrer og ved anvendelse af en indløbstemperatur på 60°C og en udløbstemperatur på 35°C til fremstilling af 25 tilnærmelsesvis sfæriske mikropartikler på ca. 1 μτα til ca. 10 μπι.

I disse mikropartikler er lægemidlet til stede i det væsentlige fuldstændigt som goserelin-polyestersaltet, da eddikesyre indholdet, som fri syre eller anion, er 0,06% eller 30 mindre, i stedet for 0,6 til 0,7%, der ville være påkrævet, hvis goserelinet forelå som acetatsaltet deraf.

DK 176134 B1 59

Ved yderligere forarbejdning ved hjælp af presning ved 80°C resulterede disse mikropartikler i en klar, transparent og skør film.

Dette forsøg viser anvendeligheden af peptidsalte med benzen-5 opløselige polyestere af polymerer med lav molekylvægt og eventuelt med høj polydispersitet.

Lignende opløsnings-, mikropartikel- og formede formuleringer kan fremstilles ved i stedet for goserelinacetat at anvende enten naturligt forekommende gonadotropinfrigørende hormoner 10 eller andre meget virksomme syntetiske analoger (agonister eller antagonister) af gonadotropinfrigørende hormon, såsom tryptorelin, leuprorelin, buserelin eller nafarelin, fortrinsvis som acetatsaltene eller salte med andre svage syrer; eller hvilke som helt andre polypeptidhormoner, som styrer sekretion 15 af de intakte gonadotropiner eller hvilke som helst af gonadotropin-underenhederne.

Eksempel 9

Goserelinacetat og andre meget virksomme syntetiske agonister af gonadotropinfrigørende hormon er selektive kemiske kastra-20 tionsmidler, som anvendes til behandling af hormonafhængige cancere, såsom prostatacancer hos mænd og brystcancer hos kvinder før menopausen. Disse lægemidler anvendes også til behandling af ikke-ondartede gynækologiske tilstande hos kvinder, og de fungerer ved til sidst at undertrykke hypofysens 25 sekretioner af gonadotropiner, hvilket igen fører til en undertrykkelse af seksualhormonerne, såsom østrogen hos kvinder og testosteron hos mænd.

Kontinuert forsinket frigørelse af sådanne lægemidler kan følgelig bedømmes in vivo i den normale voksne hunrotte, der 30 har regelmæssige oestrusperioder. I dette dyr er oestrus-perioden ca. 4 dage, og forekomsten af oestrus viser sig ved tilstedeværelsen af kun forhornede celler i vaginale smear, DK 176134 B1 60 udtaget på oestrusdagen. Hvis dyret kastreres kemisk ved hjælp af et lægemiddel, såsom goserelin, så indtræder oestrus ikke, hvilket fører til fravær af forhornede celler i vaginale smear. Dyrene vil komme ind i en forlænget dioestrusperiode 5 fremkaldt ved hjælp af kemisk kastration, og dioestrus vil blive opretholdt i så lang tid som effektive mængder af lægemiddel frigøres.

(i) De i Eksempel 8 opnåede mikropartikler (450 mg) blev dispergeret i vand indeholdende 2% vægt/vol natriumcarboxy- 10 methylcellulose og 0,2% vægt/vol polysorbate 80 og bragt op på 3 ml med vand. 0,2 ml (ækvivalent med ca. 3 mg goserelin som fri base) blev subkutant injiceret i 10 normale, voksne hunrotter med regelmæssig periodicitet, og den efterfølgende virkning på oestrus-periodicitet blev bestemt ved hjælp af 15 mikroskopisk undersøgelse af vaginal smear. Dyrene kom ind i en kontinuert dioestrusfase, dvs. kemisk kastration, der varede 95 ± 3 dage.

Dette forsøg viser, at en vandig suspensionsformulering af goserelin-polyestersalt, der er baseret på en benzenopløselig 20 polyester med lav molekylvægt, tilvejebringer et relativt langt tidsrum med styret frigørelse i ca. 3 måneder af et peptidlægemiddel, som har en metabolisk halveringstid på kun 4 -6 timer.

(ii) De i Eksempel 8 opnåede mikropartikler (450 mg) blev 2 5 dispergeret i ethyloleat og bragt op på 3 ml. Igen blev 0,2 ml formulering administreret til (seks) hunrotter med regelmæssig periodicitet ved hjælp af subkutan injektion. Dyrene kom ind i en kontinuert dioestrusfase, der varede 81 ± 3 dage-

Dette forsøg viser, at en opløsningsformulering af goserelin-30 polyestersalt i en organisk injektionsvehikel, som er et ikke-opløsningsmiddel for polyesteren alene, tilvejebringer et relativt langt tidsrum med styret frigørelse af peptidlægemiddel .

DK 176134 B1 61

Eksempel 10

Leuprorelinacetat (50,3 mg) og co-polyesteren omfattende 78 mol% D,L-mælkesyre og 22 mol% glycolsyre, som ovenfor beskrevet i Eksempel 6 (453,2 mg), blev opløst i anhydridfri 5 iseddikesyre (5 ml). Den resulterende opløsning blev dråbevis sat til flydende nitrogen, og de frosne smådråber blev frysetørret under højvakuum i 22 timer samt derpå yderligere tørret ved 55°C i 24 timer under højvakuum.

Det resulterende produkt (500 mg) blev opløst i redestilleret 10 acetone (10 ml) i en 100 ml rundbundet kolbe til opnåelse af til at begynde med en uklar, kolloidal blanding, der gradvis klarede til en transparent opløsning. Acetonen afdampedes under vakuum, og den resulterende klare film blev tørret ved 55°C i 4 timer under højvakuum. Denne film af leuprorelin-15 polyestersalt blev genopløst i acetone (10 ml) , og opløsningen blev afgasset og derpå renset med nitrogen.

Frisk destilleret vand (200 ml) blev omrørt kraftigt under nitrogen, og acetoneopløsningen af leuprorelin-polyestersalt blev sprøjtet på overfladen af det omrørte vand. Efter at al 20 acetoneopløsningen var blevet udsprøjtet, blev omrøring opretholdt i yderligere en time, hvorpå blandingen fik lov til at sedimentere. Mikropartiklerne af leuprorelin-polyestersaltet sedimenterede, og den vandige supernatant blev bortkastet. Mikropartiklerne blev resuspenderet i en yderligere mængde 25 carbondioxidfrit vand (~200 ml), og suspensionen blev omrørt under nitrogen i yderligere en time. Mikropartiklerne blev separeret ved først at lade blandingen sedimentere, ved at fradekantere det vandige lag og ved derpå at filtrere resten til adskillelse af mikropartiklerne fra det overskydende vand.

30 Mikropartiklerne blev tørret ved 30°C i 24 timer under høj-vakuum til opnåelse af et produkt, som havde en gennemsnitlig partikelstørrelse på ca. 15 /im.

DBC 176134 B1 62

Denne mikropartikelformulering af leuprorelin-polyestersalt blev inkuberet i saltvand, pufret med phosphat til pH 7,4 ved 37°C, og supernatanten blev periodisk analyseret for leupro-relin ved hjælp af UV. Leuprorelin blev frigjort kontinuerligt 5 i ca. 5 uger, efter hvilken tid formuleringen var fuldstændig nedbrudt.

Lignende mikropartikelformuleringer kan fremstilles på lignende måde ved i stedet for leuprorelin at anvende enten naturligt forekommende gonadotropinfrigørende hormoner eller 10 andre meget virksomme syntetiske analoger (agonister eller antagonister) af gonadotropinfrigørende hormon, såsom tryp-torelin, goserelin, buserelin eller nafarelin, fortrinsvis som acetatsaltene eller andre salte med svage syrer; eller hvilke som helst andre polypeptidhormoner, som styrer sekretion af de 15 intakte gonadotropiner eller hvilke som helst af gonado-tropin-underenhederne.

Eksempel 11 i) Goserelinacetat (2,28 g, ækvivalent med ca. 2,00 g goserelin som fri base) blev opløst i anhydridfri iseddikesyre (60 20 ml). En blanding af to 95/5% molær poly(D,L-mælkesyre)/poly-glycolsyre)-copolymerer (12,6 g af en copolymer med et vægtgennemsnit af molekylvægt på 15.846 og en polydispersitet på 1,38 samt 5,4 g af en copolymer med et vægtgennemsnit af molekylvægt på 3.896 og en polydispersitet på 1,78) og tilveje-25 bringende derfor et overskud af copolymer-carboxylsyreendegrupper i forhold til basisk lægemiddel, blev opløst under omrøring i anhydridfri iseddikesyre (150 ml) til opnåelse af en klar opløsning. Lægemiddelopløsningen blev sat til copoly-meropløsningen og blandet grundigt. Denne blanding blev derpå 30 dråbevis sat til flydende nitrogen til frysning af den som små perler, og det faste materiale blev frysetørret i to dage under anvendelse af en Edwards høj vakuum-frysetørrer. Det tørrede materiale blev yderligere tørret ved 50-55°C i en vakuumovn i 24 timer.

DK 176134 B1 63

Dette tørrede produkt (100 mg) blev sat til dichlormethan (1 ml) og viste sig at blive fuldstændig opløst i løbet af 2 timer til opnåelse af en klar opløsning. Det vises i dette eksempel, at dannelsen af polyester-goserelinsaltet bibringer 5 lægemidlet god opløselighed, så at det kan opløses i et ikke-polært opløsningsmiddel.

ii) Goserelinacetat (2,28 g, ækvivalent med ca. 2,00 g goserelin som fri base) blev opløst i anhydridfri iseddikesyre (60 ml). En blanding af to 100% molær poly(D,L-mælkesyre)- 10 polymerer (12,6 g af en polymer med et vægtgennemsnit af molekylvægt på 15.178 og en polydispersitet på 1,27 samt 5,4 g af en polymer med et vægtgennemsnit af molekylvægt på 4.204 og en polydispersitet på 1,84) og tilvejebringende derfor et overskud af copolymer-carboxylsyreendegrupper i forhold til basisk 15 lægemiddel, blev under omrøring opløst i anhydridfri iseddikesyre (150 ml) til opnåelse af en klar opløsning. Lægemiddelopløsningen blev sat til polymeropløsningen og blandedes grundigt, og denne blanding blev derpå dråbevis sat til flydende nitrogen til frysning af den som små perler. Det faste 20 materiale blev frysetørret i to dage under anvendelse af en Edwards højvakuum-frysetørrer, og de tørrede materialer blev yderligere tørret ved 50-55°C i en vakuumovn i 24 timer.

Dette tørrede produkt (100 mg) blev sat til dichlormethan (1 ml) og viste sig at blive fuldstændig opløst i løbet af 2 25 timer til opnåelse af en klar opløsning. Det vises i dette eksempel, at dannelsen af polyester-goserelinsaltet bibringer lægemidlet god opløselighed, så at det kan opløses i et ikke-polært opløsningsmiddel.

iii) Goserelinacetat (2,28 g, ækvivalent med ca. 2,00 g 30 goserelin som fri base) blev opløst i anhydridfri iseddikesyre (60 ml). En blanding af en 80/20% molær poly(D,L-mælkesyre)/-polyglycolsyre)-copolymer (12,6 g af en copolymer med et vægtgennemsnit af molekylvægt på 106.510 og en polydispersitet på 2,27) og en 95/5% molær poly (D,L-mælkesyre)/polyglycolsyre) - DK 176134 B1 64 copolymer (5,4 g af en copolymer med et vægtgennemsnit af molekylvægt på 3.896 og en polydispersitet på 1,78) og derfor tilvejebringende et overskud af copolymer-carboxylsyreendegrupper i forhold til basisk lægemiddel, blev under omrøring 5 opløst i anhydridfri iseddikesyre (150 ml) til opnåelse af en klar opløsning. Lægemiddel opløsningen blev sat til copolymer-opløsningen og blandedes grundigt. Denne blanding blev derpå dråbevis sat til flydende nitrogen til frysning af den som små perler, det faste materiale blev frysetørret i to dage under 10 anvendelse af en Edwards høj vakuum-fryse tørrer, og det tørrede materiale blev yderligere tørret ved 50-55°C i en vakuumovn i 24 timer.

Dette tørrede produkt (100 mg) blev sat til dichlormethan (1 ml) og viste sig at blive fuldstændigt opløst i løbet af 2 15 timer til opnåelse af en klar opløsning. Det vises i dette eksempel, at dannelsen af polyester-goserelinsaltet bibringer lægemidlet god opløselighed, så at det kan opløses i et ikke-polært opløsningsmiddel.

iv) Goserelinacetat (2,17 g, ækvivalent med ca. 1,90 g 20 gosérelin som fri base) blev opløst i anhydridfri iseddikesyre (60 ml). En blanding af to 67/33% molær poly(D,L-mælkesyre)/-polyglycolsyre)-copolymerer (12,0 g af en copolymer med et vægtgennemsnit af molekylvægt på 35.833 og en polydispersitet på 1,83 samt 5,15 g af en polymer med et vægt gennemsnit af 25 molekylvægt på 4.116 og en polydispersitet på 1,86) og derfor tilvejebringende et overskud af polymer-carboxylsyreendegrupper i forhold til basisk lægemiddel, blev under omrøring opløst i anhydridfri iseddikesyre (160 ml) til opnåelse af en klar opløsning. Lægemiddel opløsningen blev sat til copolymer-30 opløsningen, og der blandedes grundigt. Denne blanding blev derpå dråbevis sat til flydende nitrogen til frysning af den som små perler. Det faste materiale blev frysetørret i to dage under anvendelse af en Edwards høj vakuum-frysetørrer, og det tørrede materiale blev yderligere tørret ved 50-55°C i en 35 vakuumovn i 24 timer.

DK 176134 B1 65

Dette tørrede produkt (100 mg) blev sat til dichlormethan (1 ml) og viste sig at blive fuldstændig opløst i løbet af 10 minutter til dannelse af en klar opløsning. Det vises ved hjælp af dette eksempel, at dannelsen af polyester-goserelin-5 saltet bibringer lægemidlet god opløselighed, så at det kan opløses i et ikke-polært opløsningsmiddel.

Sammenligninqseksempel

Goserelinacetat (2,28 g, ækvivalent med ca. 2,00 g goserelin som fri base) blev opløst i anhydridfri iseddikesyre (60 ml).

10 En 50/50% molær poly(D,L-mælkesyre)/polyglycolsyre)-copolymer (18,0 g polymer med et vægtgennemsnit af molekylvægt på 22.307 og en polydispersitet på 2,07) og derfor tilvejebringende en tilnærmelsesvis støkiometrisk ækvivalent mængde copolymer-carboxyl syreendegrupper i forhold til basisk lægemiddel, blev 15 under omrøring opløst i anhydridfri iseddikesyre (150 ml) til dannelse af en klar opløsning. Lægemiddelopløsningen blev sat til copolymeropløsningen, og der blandedes grundigt. Denne blanding blev derpå dråbevis sat til flydende nitrogen til frysning af den som små perler. Det faste materiale blev fry-20 setørret i to dage under anvendelse af en Edwards højvakuum-frysetørrer, og det tørrede materiale blev yderligere tørret ved 50-55°C i en vakuumovn i 24 timer.

Dette tørrede produkt (100 mg) blev sat til dichlormethan (1 ml) og viste sig ikke at være fuldstændig opløst efter 4 ti-25 mer, men opløstes til dannelse af en klar opløsning efter 4 dage. Det vises ved hjælp af dette eksempel, at dannelsen af polyester-goserelinsaltet for at bibringe lægemidlet god opløselighed, så at det kan opløses i et ikke-polært opløsningsmiddel, finder meget lettere sted, når copolymer-car-30 boxy1syreendegrupperne foreligger i overskud i forhold til det basiske lægemiddel.

De tørrede produkter i-iv blev opløst i dichlormethan og sprøjtetørret under anvendelse af en Buehi 190 laboratorie-

______ ___ I

DK 176134 B1 66 skala-sprøjtetørrer, i overensstemmelse med følgende tabel:

Produkt Forhold mellem produkt Indløbstem- Udløbstem-og opløsningsmiddel (%) peratur °C peratur °C

i 10 48 32 5 ii 10 58 38 iii 2 58 44 iv 10 55 35

Sprøjtetørringen af produkterne i-iv resulterede i små partikler med en diameter på ca. 1-10 μτη i størrelse bestemt ved 10 scanning elektronmikroskopi. De endelige partikler blev analyseret for eddikesyreindhold ved anvendelse af en gaskromatografisk analyse med en grænse for påvisning på ca. 0,03%.

Ingen eddikesyre blev fundet i disse formuleringer ved anvendelse af denne analyse, og dette viser, at lægemidlet forelig-15 ger som polyestersaltet og ikke acetatsaltet, eftersom eddikesyremængder på ca. 0,5% ville forventes i tilfælde af acetatsaltet.

Sprøjtetørrede partikler (50 mg) i-iv ovenfor blev opløst i dichlormethan (0,5 ml) til opnåelse af en klar opløsning. En 20 dråbe trifluoreddikesyre blev sat til hver, og i hvert tilfælde resulterede dette i dannelse af et hvidt præcipitat. Prøverne blev centrifugeret til opsamling af præcipitaterne, som blev vasket med dichlormethan. HPLC-analyse viste, at det udfældede materiale var goserelin. Disse eksempler viser, at 25 lægemidlet kan fortrænges fra lægemiddel-polyestersaltet opløst i et ikke-polært opløsningsmiddel ved tilsætning af en stærk syre, og at dette får lægemidlets opløseligheds-egenskaber i ikke-polært opløsningsmiddel til at vende tilbage til de for syresaltet af et peptidlægemiddel forventede (dvs.

30 ikke opløseligt).

DK 176134 B1 67

Eksempel 12

De sprøjtetørrede partikler i-iv i eksempel 11 blev disper-geret (18% vægt/vol) i en vandig bærer, som er egnet til injektion (2% natriumcarboxymethylcellulose [Fluka, middel 5 viskositet], 0,2% polysorbate 80 [Tween (varemærke), Fluka].

De sprøjtetørrede partikler fra eksempel 11, dispergeret i den ovenfor beskrevne injektionsvehikel, blev injiceret i ti hunrotter af Wistar-herkomst. Blodprøver blev udtaget fra halerne af fem rotter på dagene 7, 14 og 28, og disse prøver blev 10 analyseret for goserelin under anvendelse af en radio-immunoanalyse med kendt specificitet for lægemidlet og dokumenteret mangel på krydsreaktivitet over for metabolitter.

Resultaterne af disse forsøg viste, at denne formulering tilvejebragte målelige blodniveauer af goserelin i mindst 4 uger.

15 Eksempel 13

Sprøjtetørret produkt ii fra eksempel 11 blev dispergeret i følgende vandige injektionsvehikler.

a. natriumcarboxymethylcellulose (middel viskositetskvalitet, Fluka) 1,0%, og polysorbate 80 (Tween) 0,75%.

20 b. methylcellulose (15 mPa.s, Fluka) 0,75% og polysorbate 80 (Tween) 0,75%.

Disse formuleringer dispergeredes godt i disse bærere og var egnede til parenteral administration.

Eksempel 14 25 Sprøjtetørret produkt ii fra eksempel 11 (400 mg) blev opløst i dichlormethan (4 ml) . Dette blev ved hjælp af en sprøjte sat til en opløsning af 0,25% polyvinylalkohol (PVA) i vand DK 176134 B1 68 (Aldrich, 75% hydrolyseret, molekylvægt 2.000), der blev omrørt med 2.500 o/m. Efter to minutter blev omrøringshastigheden formindsket til 800 o/m, og omrøring blev fortsat i yderligere 30 minutter. Omrøring blev derpå standset, og de 5 dannede partikler fik lov til at sedimentere. PVA-opløsningen blev dekanteret fra, og partiklerne vaskedes derpå to gange med iskoldt vand og blev udvundet ved centrifugering. Partiklerne blev til slut tørret ved hjælp af frysetørring, og det endelige produkt var et fint, partikelformet materiale inde-10 holdende goserelin.

Eksempel 15

Sprøjte tørret formulering iv fra eksempel 11 blev ved 82 °C ekstruderet til opnåelse af et cylindrisk ekstrudat på ca. en mm i diameter. Dette ekstrudat blev derpå skåret i længder, 15 der vejede ca. 36 mg og indeholdt ca. 3,6 mg goserelin. Dette ekstrudat var fuldstændig klart for lys i stedet for at være hvidt af udseende, idet sidstnævnte udseende er typisk for en simpel blanding af lægemiddel og polymer, der er fremstillet uden at danne saltet af peptidet med polyesteren (som i f.eks.

20 det kommercielt tilgængelige "Zoladex"-depot - "Zoladex" er et varemærke). Klarheden af dette ekstrudat viser, at peptidet goserelin er forligeligt med polyesterfasen i stedet for at foreligge i en separat fase, som resulterer i lysspredning og et hvidt udseende. Denne forligelighed kan kun forekomme, hvis 25 peptidet foreligger i den samme fase som polymeren, dvs. at det foreligger som saltet af polyesteren.

Enkelte sådanne 3,6 mg depoter blev implanteret i 21 rotter af Wistar-herkomst under bedøvelse. På efterfølgende tidspunkter blev grupper på tre dyr dræbt, og depoterne blev genvundet. De 30 udvundne depoter blev opløst i iseddikesyre i en volumetrisk kolbe, og polymeren blev udfældet ved tilsætning af et overskud af vand. Dette blev derpå filtreret fra (Millex 0,5 μτα) og filtratet analyseret for lægemiddelindhold ved hjælp af HPLC. Depoternes frigørelsesprofil blev beregnet i relation DK 176134 B1 69 til lægemiddelindholdet i depoter, som ikke var blevet implan-teret, og som blev medtaget i den samme analyse. Disse depoter af lægemiddel-polyestersalt resulterede i forsinket frigørelse af goserelin in vivo i et tidsrum på mindst fire uger.

5 Eksempel 16 (i) Lactid/glycolid-copolymer (95/5) med en enkelt terminal carboxylsyregruppe (8,87 g, molekylvægt = 5.750, polydisper-sitet = 1,5, molekylvægt ifølge endegruppetitrering = 2.516 g/mol, logaritmisk viskositetstal ved 1% vægt/vol i chloroform 10 = 0,10 dl/g) blev opløst i dichlormethan (50 ml) under om røring. Hertil blev tilsat 1,13 g goserelinacetat, hvorved en uklar suspension dannedes. Methanol (5 ml) blev tilsat under omrøring, og efter 30 minutter var blandingen fuldstændig klar. Opløsningsmidlet blev derpå fjernet fra opløsningen ved 15 hjælp af rotationsfordampning til efterladelse af et klart, fast stof. Dette faste stof blev genopløst i dichlormethan (50 ml), og opløsningsmidlet fjernedes atter ved rotationsfordampning. Genopløsningstrinnet og trinnet til fjernelse af opløsningsmiddel blev gentaget yderligere to gange til efter-20 ladelse af en meget viskos væske, som blev tørret under høj-vakuum til dannelse af et hvidt skum. Skummet blev brudt op og tørret under vakuum i yderligere 24 timer ved stuetemperatur til opnåelse af et fint, amorft fast stof.

(ii) Den under i) ovenfor beskrevne fremgangsmåde blev gen-25 taget under anvendelse af en lactid/glycolid-copolymer (75/25) med en enkelt terminal carboxylsyre (8,87 g, molekylvægt = 10.900, polydispersitet = 1,85, molekylvægt ifølge endegruppetitrering = 3.210 g/mol, logaritmisk viskositetstal ved 1% vægt/vol i chloroform = 0,14 dl/g) til opnåelse af et fint, 30 amorft fast stof.

ΌΚ 176134 B1 70

Formulering 1

Goserelin-lactid/glycolid-polymersaltet fra (i) ovenfor (1 g) blev sat til benzylbenzoat (99%, fra Janssen, 2 ml), og dette blev opvarmet under anvendelse af en manuelt ført varmluft-5 pistol under omrøring af blandingen indtil det faste stof var opløst. 110 μΐ af denne opløsningsformulering indeholdt 3,6 mg goserelin.

Formulering 2

Som formulering 1 med den undtagelse, at opløsningsmidlet var 10 en blanding (1,7 ml) af 67% benzylbenzoat (99%, fra Janssen) og 33% benzylalkohol (vandfri, 99%, fra Aldrich) . 100 μΐ af denne opløsningsformulering indeholdt 3,6 mg goserelin.

Formulering 3

Som formulering 1 med den undtagelse, at opløsningsmidlet var 15 benzylalkohol (1,7 ml, vandfri, 99%, fra Aldrich). 100 μΐ af denne opløsningsformulering indeholdt 3,6 mg goserelin.

Formulering 4

Som formulering 1, med undtagelse af goserelin-lactid/-glycolid-polymersaltet fra (ii) ovenfor (1 g) og 3 ml benzyl-20 benzoat blev benyttet. 150 μΐ af denne opløsningsformulering indeholdt 3,6 mg goserelin.

Formulering 5

Som formulering 4 med den undtagelse, at opløsningsmiddelblandingen fra formulering 2 blev benyttet. 100 μΐ af denne opløs-25 ningsformulering indeholdt 3,6 mg goserelin.

DK 176134 B1 71

Formulering 6

Som formulering 4 med den undtagelse, at opløsningsmidlet fra formulering 3 blev benyttet. 100 μΐ af denne opløsningsformulering indeholdt 3,6 mg goserelin.

5 Biologisk vurdering

Frigørelse af goserelin fra de ovennævnte formuleringer 1 til 6 in vivo blev bestemt ved daglig undersøgelse af vaginale smear fra doserede hunrotter. Den normale oestrusperiode (oestrus, dioestrus, met-oestrus, pro-oestrus) kan følges ud 10 fra mængderne af de forskellige celletyper (leukocytiske, epithel-og forhornede) i smear. Hvis frigørelsen af lægemiddel fra formuleringerne er kontinuert, afbrydes den normale oestrusperiode, og rotterne vil forblive i dioestrus så længe frigørelse af goserelinet fortsætter.

15 Formuleringer 1-6 blev doseret til grupper (n = 6) af hunrotter med regelmæssig periodicitet i en dosis på 3,6 mg goserelin pr. rotte. En sprøjte udstyret med en 20 gauge nål blev benyttet til subkutan dosering af formuleringerne. En ikke-doseret gruppe på 5 rotter blev benyttet som kontrolgruppe.

20 Vaginal smear blev dagligt udtaget fra rotterne og undersøgt til bestemmelse af rotternes oestrustilstand, og de opnåede resultater var som følger:

Formulering nr. Gennemsnitlig varighed af dioestrus (dage) (± s.e.) 25 1 100 ± 2,7 2 120 ± 6,3 3 69 ± 5,9 4 59 ± 1,2 5 61 ± 2,1 30 6 53 + 3,7 ΒΚ 176134 B1 72

Af disse resultater kan det ses, at alle seks formuleringer resulterede i perioder med goserelinfrigørelse på mere end 6 uger, og at formuleringerne 1 og 2 frigjorde goserelin i et tidsrum på 3 måneder eller mere. Det kan yderligere ses af 5 disse eksempler, at formuleringerne indeholdende goserelin-polyestersaltet kan opnås som opløsninger, der let kan administreres parenteralt under anvendelse af en nål med snæver lysning, og at sådanne formuleringer er hensigtsmæssige til behandling af hormonafhængige svulster i mennesker.

10 Eksempel 17

Formulering 1

Som formulering fra eksempel 16.

Formulering 2

Fremgangsmåden beskrevet i eksempel 16 (i) blev gentaget under 15 anvendelse af en polyl act id-homopolymer med en enkelt terminal carboxylsyre (molekylvægt = 5.092, polydispersitet = 1,44, molekylvægt ifølge endegruppetitrering = 2.270 g/mol) samt goserelinacetat (0,46 g). Eddikesyreindholdet i dette amorfe, faste stof blev bestemt ved hjælp af gaskromatografi og viste 20 sig at være 0,14%.

Dette goserelin-lactidpolymersalt (1 g) blev sat til benzyl-benzoat (99%, fra Janssen, 2 ml) , og dette blev opvarmet under anvendelse af en manuelt ført varmluftpistol under omrøring af blandingen, indtil det faste stof var opløst. 110 μΐ af denne 25 opløsningsformulering indeholdt 3,6 mg goserelin.

Formulering 3

En lactid/glycolid-copolymer (95/5) med en enkelt terminal carboxylsyre (7,86 g, molekylvægt = 5.750, polydispersitet = 1,50, molekylvægt ifølge endegruppetitrering = 2.516 g/mol) og ' DK 176134 B1 73 goserelinacetat (0,98 g) blev opløst i iseddikesyre (100 ml).

Denne opløsning blev frosset ved dråbevis tilsætning til flydende nitrogen efterfulgt af frysetørring i 2 dage. Det resulterende faste stof blev derpå tørret i yderligere 24 timer ved 5 40°C. Eddikesyreindholdet i dette frysetørrede faste stof blev bestemt ved hjælp af gaskromatografi og viste sig at være 0,17%.

Denne goserelin-lactid/glycolid-copolymerblanding (1 g) blev sat til benzylbenzoat (2 ml, 99%, fra Janssen), og dette blev 10 opvarmet ved anvendelse af en manuelt ført varmluftpistol under omrøring af blandingen, indtil det faste stof var opløst. 110 μΐ af denne opløsningsformulering indeholdt 3,6 mg goserelin.

Det kan derfor ses, at formulering af goserelin som polyester-15 saltet bibringer lægemidlet gode opløselighedsegenskaber, så at det kan opløses i lipofile opløsningsmidler, såsom benzylbenzoat, hvori goserelinacetat selv ikke er opløseligt.

Biologisk vurdering

Formuleringer 1-3 blev doseret til grupper (n = 10) af hunrot-20 ter med regelmæssig periodicitet i en dosis på 3,6 mg goserelin pr. rotte som beskrevet i eksempel 16. Efter dosering viste dyrene sig at komme ind i en periode med kontinuert dioestrus, som indikerer kontinuert frigørelse af goserelin.

Den gennemsnitlige varighed af dioestrusperioden er for hver 25 gruppe af rotter anført i den følgende tabel. Af denne tabel kan det ses, at alle tre formuleringer resulterede i perioder med goserelinfrigørelse på mere end 14 uger.

Formulering nr. Gennemsnitlig varighed af dioestrus (dage) (± s.e.) 30 1 104 (± 5,4) 2 99 (± 3,9) 3 101 (± 2,8) ! j DK 176134 B1 74

Det kan yderligere ses af disse eksempler, at formuleringerne indeholdende goserelin-polyestersaltet kan tilvejebringes som opløsninger, der let kan administreres parenteralt under anvendelse af en nål med snæver lysning, og at sådanne for-5 muleringer er hensigtsmæssige til behandling af hormonafhængige svulster hos mennesker.

Eksempel 18

Formulering 1

Lactid/glycolid-copolymer (95/5) med en enkelt terminal carlo boxylsyre (4,5 g, molekylvægt = 6.806, polydispersitet = 1,55, molekylvægt ifølge endegruppetitrering = 3.027 g/mol, logaritmisk viskositetstal ved 1% vægt/vol i chloroform = 0,108 dl/g) blev opløst i iseddikesyre (50 ml). Til denne opløsning blev tilsat goserelinacetat (0,56 g, ækvivalent med 0,5 g gosere-15 lin) , og blandingen blev omrørt i 10 minutter til opnåelse af en klar, farveløs opløsning. Denne blev frosset ved dråbevis tilsætning til flydende nitrogen efterfulgt af frysetørring i 2 dage. Det resulterende faste stof blev derpå tørret i yderligere 24 timer ved 40°C. Eddikesyreindholdet i dette fryse-20 tørrede faste stof blev bestemt ved hjælp af gaskromatografi og viste sig at være 0,3%.

Denne goserelin-lactid/glycolid-copolymerblanding (1,0 g) blev sat til benzylbenzoat (2,0 ml, 99%) fra Janssen) og blev opløst under opvarmning og omrøring. Den endelige opløsning 25 indeholdt 3,67 mg goserelin i 110 μΐ, og goserelinindholdet i slutproduktet var 10,0% vægt/vægt.

Formulering 2

Fremgangsmåden beskrevet ovenfor for formulering 1 blev gentaget under anvendelse af en lactid/glycolid-copolymer (95/5) 30 med en enkelt terminal carboxylsyre (4,0 g, molekylvægt = 6.011, polydispersitet = 1,56, molekylvægt ifølge endegruppe- DK 176134 B1 75 titrering = 2.700 g/mol, logaritmisk viskositetstal ved 1% vægt/vol i chloroform = 0,099 dl/g) samt 1,12 g goserelin-acetat (ækvivalent med 1,0 g goserelin). Eddikesyreindholdet i dette frysetørrede faste stof blev bestemt ved hjælp af gas-5 kromatografi og viste sig at være 0,83%, og goserelinindholdet i slutproduktet var 19,46% vægt/vægt.

Denne goserelin-lactid/glycolid-copolymerblanding (0,54 g) blev sat til benzylbenzoat (2,46 ml, 99%, fra Janssen) og blev opløst under opvarmning og omrøring. Den endelige opløsning 10 indeholdt 3,50 mg goserelin i 110 μΐ.

Formulering 3

Fremgangsmåden beskrevet ovenfor for formulering 2 blev gentaget under anvendelse af 2,1 g af lac tid/glycol id-copolymeren og 1,0 g goserelinacetat (ækvivalent med 0,9 g goserelin).

15 Eddikesyreindholdet i dette frysetørrede faste stof blev bestemt ved hjælp af gaskromatografi og viste sig at være 1,14%, og goserelinindholdet i slutproduktet var 28,91% vægt/vægt.

Denne goserelin-lactid/glycolid-copolymerblanding (0,36 g) blev sat til benzylbenzoat (2,64 ml, 99%, fra Janssen) og blev 20 opløst under opvarmning og omrøring. Den endelige opløsning indeholdt 3,47 mg goserelin i 110 μΐ.

Formulering 4

Fremgangsmåden beskrevet ovenfor for formulering 1 blev gentaget under anvendelse af en lactid/glycolid-copolymer (95/5) 25 med en enkelt terminal carboxylsyre (8,66 g, molekylvægt = 5.604, polydispersitet = 1,71, molekylvægt ifølge endegruppetitrering = 1.960 g/mol, logaritmisk viskositetstal ved 1% vægt/vol i chloroform = 0,094 dl/g) og 1,08 g goserelinacetat (ækvivalent med 0,96 g goserelin). Eddikesyreindholdet i dette 30 frysetørrede faste stof blev bestemt ved hjælp af gaskromatografi og viste sig at være 0,08%, og goserelinindholdet i DK 176134 B1 76 slutproduktet var 9,90% vægt/vægt.

Denne goserelin-lactid/glycolid-copolymerblanding (1,0 g) blev sat til benzylbenzoat (2,0 ml, 99%, fra Janssen) og blev opløst under opvarmning og omrøring. Den endelige opløsning 5 indeholdt 3,67 mg goserelin i 110 μΐ.

Biologisk vurdering

Formuleringer 1-4 blev doseret til grupper (n = 9 eller 10) af hunrotter med regelmæssig periodicitet i en dosis på 3,6 mg goserelin pr. rotte som beskrevet i eksempel 16. Efter dose-10 ring viste dyrene sig at komme ind i en periode med kontinuert dioestrus angivende kontinuert frigørelse af goserelin. Den gennemsnitlige varighed af dioestrusperioden er for hver rottegruppe angivet i den følgende tabel. Af denne tabel kan det ses, at alle tre formuleringer resulterede i perioder med 15 goserelinfrigørelse i et tidsrum på ca. 3 måneder eller mere.

Formulering nr. Gennemsnitlig varighed af dioestrus (dage) (± s.e.) 1 114 ±1,8 2 94 ± 4,6 20 3 97 ± 5,3 4 83 ± 4,3

Det kan yderligere ses af disse eksempler, at formuleringerne indeholdende lægemiddel-polyestersaltet kan opnås som opløsninger, der let kan administreres parenteralt under anvendelse 25 af en nål med snæver lysning, og at sådanne formuleringer er hensigtsmæssige til behandling af hormonafhængige svulster i mennesker.

Eksempel 19

Goserelin-polyestersaltet (ii) fra eksempel 16 (3,75 g) blev 30 opløst i dichlormethan (50 ml), der forinden var blevet fil- i DK 176134 B1 77 treret gennem et 0,45 μπι filter. Denne opløsning blev filtreret gennem en 0,5 μπι teflonf iltermembran (Whatman WTP) ind i en kolbe, der var blevet steriliseret under anvendelse af en autoklav. Opløsningsmidlet blev fjernet ved anvendelse af en 5 rotationsfordamper til opnåelse af en viskos væske, og luft fik derpå adgang til rotationsfordamperen gennem et 0,5 μπι filter. Den viskose væske blev varmet op og tørret under vakuum til opnåelse af et hvidt skum. Det opnåede skum blev vejet i autoklavbehandlede små medicinflasker med krympetop i et 10 kammer med laminar strømning, og frisk destillerede opløsningsmidler blev tilsat til opnåelse af opløsningsformuleringer af goserelin-polyestersaltet, som var i det væsentlige uden indhold af partikelformet materiale.

Formulering 1 15 1 g af det faste stof blev sat til benzylbenzoat (destilleret, kogepunkt 106°C ved 0,3 mb, 3 ml) og blev opvarmet under anvendelse af en varmluftpistol indtil det var opløst. 145 μΐ af denne opløsningsformulering indeholdt 3,6 mg goserelin.

Formulering 2 20 1 g af det faste stof blev sat til benzylalkohol (destilleret, kogepunkt 44°C ved 0,3 mb, 1,7 ml) og blev opvarmet under anvendelse af en varmluftpistol indtil det var opløst. 100 μΐ af denne opløsningsformulering indeholdt 3,6 mg goserelin.

Biologisk vurdering 25 To grupper på 10 hunrotter blev under anvendelse af en 20 gauge nål doseret subkutant med formuleringerne 1 og 2 i en dosis på 3,6 mg pr. rotte. Terminale blodprøver blev udtaget fra rotterne på efterfølgende tidspunkter (l uge (n = 4) , 4 uger og 6 uger (n = 3)). Blodprøverne blev analyseret for 30 goserelin ved hjælp af radioimmunoanalyse. Målelige blodniveauer af goserelin blev fundet i forbindelse med begge formu DK 176134 B1 78 leringer, hvilket viser, at opløsningsformuleringerne resulterede i forsinket lægemiddelfrigørelse i flere uger. Blod-niveauprofilen for formulering 1 viste sig at toppe efter ca.

4 uger, medens toppen i tilfælde af formulering 2 indtrådte 5 efter uge 1, og blodniveauerne derefter viste sig at falde progressivt med tiden. Blodniveauprofilen i tilfælde af formulering 1 anses for mere ønskelig end formulering 2's blod-niveauprofil som følge af de mere konstante blodniveauer, som opnås, når benzylbenzoat anvendes som opløsningsmiddel for 10 opløsningsformuleringen.

Det kan yderligere ses af disse eksempler, at formuleringerne indeholdende lægemiddel-polyestersaltet kan opnås som opløsninger, der let kan administreres parenteralt under anvendelse af en nål med snæver lysning, og at sådanne formuleringer er 15 hensigtsmæssige til behandling af hormonafhængige svulster i mennesker.

Eksempel 20

En lactid/glycolid-copolymer (95/5) med en enkelt terminal carboxylsyre (9,0 g, molekylvægt = 6.011, polydispersitet = 20 1,56, molekylvægt ifølge endegruppetitrering = 2.700 g/mol, logaritmisk viskositetstal ved 1% vægt/vol i chloroform = 0,099 dl/g) blev opløst i dichlormethan (100 ml). Goserelin-acetat (1,124 g, ækvivalent med 1 g goserelin) blev sat til denne opløsning under omrøring efterfulgt af tilsætning af 25 methanol (10 ml) . Den opnåede uklare suspension blev omrørt ved stuetemperatur i ca. 1 time indtil opnåelse af en klar opløsning. Opløsningsmidlet blev fjernet ved anvendelse af en rotationsfordamper til opnåelse af en klar, viskos væske.

Denne blev derpå genopløst i dichlormethan og atter tørret som 30 før. Dette trin blev gentaget yderligere to gange, og den til slut opnåede viskose væske blev tørret under højvakuum til fremstilling af et hvidt skum, som blev yderligere vakuumtørret natten over. Skummet blev brudt til et fint pulver, der blev vakuumtørret i en dag ved stuetemperatur. Benzylbenzoat DK 176134 B1 79 (20 ml, 99%, fra Janssen) blev sat til dette pulver, og den resulterende blanding blev under omrøring forsigtigt opvarmet til opnåelse af en opløsning.

Biologisk vurdering 5 Denne opløsningsformulering indeholdende goserelin blev doseret subkutant til hver af 45 hunrotter (220 μΐ, ækvivalent med 7,3 mg goserelin) under anvendelse af en 20 gauge nål. Grupper på fem rotter blev dræbt og blodprøver udtaget på dagene 1 og 4 samt efter 1, 3, 5, 7, 9, 11 og 13 uger. Endvidere blev 10 blodprøver udtaget fra halevenen hos grupper på fem rotter efter 2, 4, 6, 8, 10 og 12 uger. Prøverne blev analyseret for goserelin ved hjælp af radioimmunanalyse, og resultaterne viser, at denne væskeformulering af goserelin-polyestersalt resulterede i målelige blodniveauer af lægemiddel i ca. 11 15 uger efter dosering, samt viser, at formuleringen resulterer i forsinket frigørelse af goserelin in vivo.

Det kan yderligere ses af disse eksempler, at formuleringerne indeholdende lægemiddel-polyestersaltet kan opnås som opløsninger, der let kan administreres parenteralt under anvendelse 20 af en nål med snæver lysning, og at sådanne formuleringer vil være hensigtsmæssige til behandling af hormonafhængige svulster i mennesker.

Eksempel 21

Det som stof P kendte peptid blev i form af sit acetatsalt 25 (fra Sigma, 2 mg) sat til dichlormethan (3 ml) og grundigt omrørt. Peptidet viste ingen tegn på opløsning i opløsningsmidlet og vedblev at foreligge som en uklar suspension.

En lactid/glycolid-copolymer (70/30) med en enkelt terminal carboxylsyre (225 mg, molekylvægt = 9,755, polydispersitet = 30 1,52, molekylvægt ifølge endegruppetitrering = 1.800) blev sat til dichlormethan (25 ml) . Dette blev omrørt i 15 minutter til ^__ DK 176134 B1 80 opnåelse af en klar, farveløs opløsning. Hertil sattes en opløsning af stof P (25 mg) i methanol (0,5 ml). Den resulterende uklare suspension blev omrørt i 1 time, på hvilket tidspunkt en fuldstændig klar opløsning var dannet. Opløs-5 ningsmidlet blev fjernet ved rotationsfordampning, og det opnåede klare "glasagtige" faste stof blev genopløst i di-chlormethan (5 ml), og der blev atter inddampet. Dette blev gentaget to gange. Det endelige faste stof blev opløst i di-chlormethan (3 ml), og opløsningen blev langsomt dryppet ned 10 på PTFE-belagt klæde, idet opløsningsmidlet fik lov til at fordampe til dannelse af en tynd film af et klart, farveløst, glasagtigt fast stof (peptidindhold 9,1% vægt/vægt).

Denne film (96,8 mg) blev anbragt i en lille medicinflaske, og phosphatpufret saltvand (2 ml, pH 7,4) blev tilsat (puffer 15 blev forinden filtreret gennem et 0,2 μια filter og indeholdt 0,02% natriumazid som konserveringsmiddel) . Den lille medicinflaske blev anbragt i en inkubator ved 37°C, og pufferen fjernedes og erstattedes periodisk. Den fjernede puffer blev analyseret for frigørelse af stof P under anvendelse af et ultra-20 violet spektrofotometer (Hewlett Packard 8452Ά) ved 210 nm, mod standardopløsninger af stof P. Resultaterne viser, at stof P kan opløses i dichlormethan, når det foreligger som salte af en carboxytermineret lactid/glycolid-copolymer, og at det i dette opløsningsmiddel kan forarbejdes til dannelse af en tynd 25 film, som tilvejebringer kontinuert frigørelse af peptidet i et tidsrum på ca. 4 uger.

Eksempel 22

En vandig opløsning af leuprolidacetat (i øvrigt kendt som leuprorelinacetat) (300 μΐ af en 330 mg/ml opløsning) sættes 30 under betingelser med høj forskydning til 20 ml af en 10% vægt/vægt opløsning af poly (hydroxystearinsyre) , der har et I talgennemsnit af molekylvægt på ca. 2000, i Miglyol 812 (tri- ! glycerider af mættede fedtsyrer med middel kædelængde indbe fattende linoleinsyre, fra Dynamit Nobel, England) til dan- i DK 176134 B1 81 nelse af leuprolid-polymersaltet, delvis ved olie/vand-grænse-fladen, hvilket salt stabiliserer den kolloidale vand-i-olie-suspension. Vandet fjernes ved 50°C ved omrøring under høj-vakuum, indtil blandingen ikke længere skummer og bobler, til 5 opnåelse af et olieagtigt produkt, som udviser en meget svag uklarhed, og som er egnet til oral administration.

Eksempel 23

Lys8-vasopressin-acetatsalt (2 mg, fra Sigma) blev sat til dichlormethan {3 ml) og omrørt. Peptidet viste intet tegn på 10 opløsning i opløsningsmidlet og vedblev at foreligge som en uklar suspension.

En lactid/glycolid-copolymer (70/30) med en enkelt terminal carboxylsyre (225 mg, molekylvægt = 9.755, polydispersitet = 1,52, molekylvægt ifølge endegruppetitrering = 1.800) blev sat 15 til dichlormethan (5 ml) . Denne blanding omrørtes i 15 minutter til opnåelse af en klar, farveløs opløsning. Lys8-vaso-pressin (25 mg, fra Sigma) og methanol (0,5 ml) blev sat til denne opløsning. Den resulterende uklare suspension blev omrørt i 1 time, på hvilket tidspunkt en fuldstændig klar opløs-20 ning var dannet. Opløsningsmidlet fjernedes ved hjælp af rotationsfordamper, og det opnåede klare, "glasagtige" faste stof blev genopløst i dichlormethan (5 ml) og geninddampet. Dette blev gentaget to gange. Det endelige faste stof blev opløst i dichlormethan (3 ml) , og opløsningen blev langsomt dryppet ned 25 på PTFE-belagt klæde, idet opløsningsmidlet fik lov at fordampe til dannelse af en tynd film af et klart, farveløst og glasagtigt fast stof (Lys8-vasopressinindhold 10% vægt/vægt).

Denne film (97,31 mg) blev anbragt i en lille medicinflaske, og phosphatpufret saltvand (2 ml, pH 7,4) blev tilsat (puffer 30 blev forinden filtreret gennem et 0,2 μια filter og indeholdt 0,02% natriumazid som konserveringsmiddel). Den lille medicinflaske blev anbragt i en inkubator ved 37°C, og pufferen fjernedes og erstattedes periodisk. Pufferen blev analyseret for ^_I__ DIC 178134 B1 82 frigørelse af Lys8-vasopressin under anvendelse af et ultraviolet spektrofotometer (Hewlett Packard 8452A) ved 210 nm mod standardopløsninger af Lys8-vasopressin. Resultaterne af dette forsøg er vist i den følgende tabel. Forsøget viser, at Lys8-5 vasopressin kan opløses i dichlormethan, når det foreligger som saltet af en carboxytermineret lactid/glycolid-copolymer, og at den resulterende blanding resulterer i kontinuert fri- -gørelse af peptidet i et tidsrum på mindst 4 uger.

Frigørelse af Lys8-vasopressin in vitro 10 Tid (dage) Frigørelse af Lys8-vasopressin fra film (%) 1 4,11 4 5,45 7 5,55 15 14 5,75 21 26,82 28 47,27

Eksempel 24

To formuleringer indeholdende ZENECA ZD6003 ([Met-1, Arg11, 20 Ser17,27,60,65^ human G-CSF (granulocyt-kolonistimulerende faktor, der er modificeret med polyethylenglyeol 5000 som beskrevet i reference eksempel 4 eller 7 i europæisk patentpublikation nr. 0 473 268) i lactid/glycolid-copolymer blev fremstillet som følger.

25 (i) Dichlormethan (4 ml) blev sat til et frysetørret præparat indeholdende ZD6003 (39,72 mg). Dette resulterede i en uigennemsigtig dispersion af lægemiddel i opløsningsmidlet. En lactid/glycolid-copolymer (75/25) med en enkelt terminal carboxylsyre (363,6 mg, molekylvægt = 9.963, polydispersitet = 30 2,19, molekylvægt ifølge endegruppetitrering = 2.815) blev tilsat, og en klar opløsning dannedes.

DK 176134 B1 83

Denne opløsning blev sat til en opløsning (400 ml) af methyl-cellulose (0,25% vægt/vol Methocel, 15 mPa.s, fra Fluka) i vand under forskydning (2.150 o/m, Heidolph RZR50 omrører).

Efter omrøring ved denne hastighed i 3 minutter blev om-5 røringshastigheden formindsket til 800 o/m. De resulterende partikler fik derpå lov til at sedimentere under tyngdens indflydelse i 30 minutter, idet opløsningen blev holdt kold over is. Supernatanten blev derpå bortkastet, og partiklerne blev vasket ved resuspendering i iskoldt destilleret vand (50 10 ml) samt centrifugering ved 1000 o/m. Dette blev gentaget fire gange, og partiklerne blev derpå til sidst frysetørret.

Partikler fremstillet på denne måde var af god kvalitet, idet de er sfæriske og har en middelstørrelse på 32 μτη bestemt ved hjælp af billedanalyse fra optisk mikroskopi. Disse partiklers 15 lægemiddelindhold blev bestemt ved ekstraktion efterfulgt af HPLC-analyse og viste sig at være 9,45%, der repræsenterer en inkorporeringseffektivitet på 96% af det til dannelse af mikropartiklerne benyttede lægemiddel.

(ii) Dichlormethan (4 ml) blev sat til et frysetørret præpa-20 rat indeholdende ZD6003 (44,18 mg). Dette resulterede i en uigennemsigtig dispersion af lægemiddel i opløsningsmiddel. En lactid/glycolid-copolymer (75/25, 364,1 mg, molekylvægt = 16.800 ifølge størrelsesudelukkelseskromatografi, polydisper-sitet = 2,2, fra Boehringer Ingelheim) blev tilsat. Et forsøg 25 på at bestemme polymerens molekylvægt via endegruppetitrering blev gennemført, men var ikke muligt som følge af meget lave niveauer af titrerbare molekyldele, og følgelig har denne polymer ikke en terminal carboxylsyre. Blandingen af lægemiddelopløsningen og polymeren blev ikke klar efter tilsætning af 30 polymeren, og blandingen vedblev at være en uklar dispersion, hvilket som forventet viser, at ved fravær af syre-endegrupper i polymeren kunne intet peptid-polyestersalt dannes.

Denne blanding blev sat til en opløsning (400 ml) af methyl-cellulose (0,25% vægt/vol Methocel, 15 mPa.s, Pluka) i vand DK 176134 B1 84 under forskydning (2.150 o/m; Heidolph RZR50 omrører). Efter omrøring ved denne hastighed i 3 minutter blev omrøringshastigheden formindsket til 800 o/m. De resulterende partikler fik derpå lov til at sedimentere under tyngdens indflydelse i 5 30 minutter, idet opløsningen blev holdt kold over is. Super- natanten blev derpå bortkastet, og partiklerne vaskedes ved resuspendering i destilleret vand (50 ml) samt centrifugering ved 1000 o/m. Dette blev gentaget fire gange, og partiklerne blev derpå til slut frysetørret.

10 Partikler fremstillet på denne måde var af ringe kvalitet sammenlignet med de under (i) ovenfor opnåede, idet nogle havde ujævn facon og en middelstørrelse på 40 μιη bestemt ved hjælp af billedanalyse fra optisk mikroskopi. Lægemiddelindholdet i disse partikler blev bestemt ved ekstraktion efter-15 fulgt af HPLC-analyse og viste sig at være 2,05%, som repræsenterer en inkorporeringseffektivitet på 19% af det til dannelse af mikropartiklerne benyttede lægemiddel.

Det ovennævnte eksempel viser, at ZD6003 kan opløses i di-chlormethan under tilstedeværelse af en polymer med en enkelt 20 terminal carboxylsyre, på trods af at dichlormethan selv er et ikke-opløsningsmiddel for lægemidlet. Endvidere kan en sådan opløsning anvendes til dannelse af mikropartikler af lægemiddel og polymer med en meget høj inkorporeringsgrad af lægemiddel . I modsætning hertil viser det ovennævnte eksempel også, 25 at ZD6003 ikke kan opløses i dichlormethan i nærværelse af en polymer, når en sådan polymer ikke har en terminal carboxylsyre, og kun danner en uklar dispersion. Sådanne uklare dispersioner af ZD6003 i en opløsning af polymer uden nogen terminal carboxylsyre resulterer endvidere i dårlig inkorporering 30 af lægemiddel, når de oparbejdes til dannelse af mikropartikler.

Eksempel 25 DK 176134 B1 85

(i) Goserelinacetat (22,47 mg, ækvivalent med 19,99 mg goserelin) blev sat til benzylbenzoat (2,21 g, 99%, fra Janssen). Denne blanding blev anbragt i en inkubator ved 40°C

5 og omrørt kontinuert i 9 dage under anvendelse af en magnetisk omrører. Efter 2 og 9 dage blev aliquot mængder udtaget og centrifugeret i 15 minutter ved 13.000 o/m til pelletering af uopløst lægemiddel. Aliquot mængder af supernatant (ca. 100 mg) blev afvej et nøjagtigt i 50 ml volumetriske kolber. Is-10 eddikesyre (2 ml) blev sat til hver kolbe efterfulgt til supplering til ønsket volumen med en vandig opløsning af tri-fluoreddikesyre (0,5% vol/vol). En del af denne opløsning blev anbragt i et centrifugerør og centrifugeret ved 13.000 o/m i 15 minutter til fraskillelse af suspenderet materiale. Super-15 natanten blev derpå analyseret for goserelinindhold under anvendelse af HPLC. Intet goserelin kunne påvises i nogen prøve. Grænsen for påvisning af goserelin ved denne HPLC-ana-lyse var 0,2 ^g/ml, og grænsen for mængdebestemmelse var 0,5 μg/ml. Ligevægtsopløseligheden (ved 40°C) af goserelin i ben-20 zylbenzoat kan således ud fra det ovenfor nævnte bestemmes som mindre end 0,2 /zg/mg.

(ii) En 1 actid/glycolid-copolymer (95/5) med en enkelt terminal carboxylsyre (291,9 mg, molekylvægt = 6.742, polydisper-sitet = 1,61, molekylvægt ifølge endegruppetitrering = 2.565 25 g/mol, logaritmisk viskositetstal ved 1% vægt/vol i chloroform = 0,103 dl/g) blev sat til benzylbenzoat (3,38 g, 99%, fra Janssen) til dannelse af en opløsning. Goserelinacetat (22,52 mg, ækvivalent med 20,03 mg goserelin) blev sat til denne.

Denne blanding blev inkuberet, og prøver blev udtaget derfra 30 som beskrevet under (i) ovenfor. Intet goserelin kunne påvises i benzylbenzoatet efter 2 dage, men efter 9 dage påvistes et niveau på ca. 0,2 μg goserelin pr. mg benzylbenzoat. Grænsen for påvisning af goserelin ved denne HPLC-analyse var som angivet under (i) ovenfor. Ud fra dette kan det vises, at 35 ligevægtsopløseligheden (ved 40°C) af goserelin i benzylben- ! DK 176134 B1 86 zoat, når det foreligger som en simpel blanding med en lac-tid/glycolid-copolymer, kan bestemmes til 0,2-0,5 μg/mg.

(iii) En lactid/glycolid-copolymer (95/5) med en enkelt terminal carboxylsyre (9,0 g, molekylvægt = 6.011, polydisper-5 sitet = 1,56, molekylvægt ifølge endegruppetitrering = 2.700 g/mol, logaritmisk viskositetstal ved 1% vægt/vol = 0,099 dl/g) blev opløst i dichlormethan (100 ml). Hertil sattes goserelinacetat (1,124 g, ækvivalent med 1 g goserelin) under omrøring efterfulgt af tilsætning af methanol (10 ml) . Den 10 opnåede uklare suspension blev omrørt ved stuetemperatur i ca.

1 time indtil opnåelse af en klar opløsning. Opløsningsmidlet blev fjernet under anvendelse af en rotationsfordamper til opnåelse af en klar, viskos væske. Denne blev derpå genopløst i dichlormethan og atter tørret som tidligere. Dette trin blev 15 derpå gentaget yderligere to gange, og den opnåede viskose væske blev til slut tørret under højvakuum til dannelse af et hvidt skum, som blev yderligere vakuumtørret natten over. Skummet blev brudt til et fint pulver, som blev vakuumtørret i en dag ved stuetemperatur. Til dette pulver sattes benzylben-20 zoat (20 ml, 99%, fra Janssen), og den resulterende blanding blev forsigtigt opvarmet under omrøring til opnåelse af en opløsning.

Opløsningen blev blandet grundigt, og en 1 ml prøve blev anbragt i en centrifuge og roteret ved 14.000 o/m i 30 minutter.

25 En aliquot mængde af supernatanten blev forsigtigt fjernet og vejet i en 50 ml volumetrisk kolbe. Prøven blev analyseret for goserelinindhold som beskrevet under (i) . Goserelinindholdet i denne opløsning viste sig at være 24,6 ^g/mg benzylbenzoat.

Dette eksempel viser, at benzylbenzoat er et meget dårligt 30 opløsningsmiddel for goserelinacetat. Tilsætningen af en lactid/glycolid-polymer til dannelse af en simpel blanding med goserelinacetat i benzylbenzoat fører endvidere ikke til en mærkbar stigning i ligevægtsopløseligheden af goserelinacetat i benzylbenzoat. Goserelin/polyestersalt kunne imidlertid

Claims (13)

1. Middel indeholdende eller omfattende, som til at begynde med fremstillet, et salt dannet ud fra en kation afledt af et peptid indeholdende mindst en basisk gruppe samt en anion 10 afledt af en carboxyltermineret polyester; hvor midlet foreligger i form af en opløsning eller dispersion af saltet i et opløsningsmiddel, som er et opløsningsmiddel for den frie polyester, men ikke et opløsningsmiddel for det frie >peptid, idet partikelstørrelsen af saltet i nævnte dispersion er 15 mindre en 5 μτη og fortrinsvis mindre end 0,2 μπί; eller foreligger i form af mikropartikler eller et implantat, til injektion eller subdermal implantering.

2. Middel ifølge krav 1, hvori peptidet er farmakologisk aktivt og er valgt blandt oxytocin, vasopressin, adrenocorti- 20 cotropt hormon (ACTH), epidermal vækstfaktor (EGF), prolactin, luteiniserende hormon, follikelstimulerende hormon, luliberin eller luteiniserende hormonfrigørende hormon (LHRH), insulin, somatostatin, glucagon, interferon, gastrin, tetragastrin, pentagastrin, urogastron, secretin, calcitonin, enkephaliner, 25 endorphiner, kyotorphin, taftsin, thymopoietin, thymosin, thymostimulin, thymus-humoral faktor, serum-thymusf aktor, tumor-necrosisfaktor, kolonistimulerende faktorer, motilin, bombesin, dinorphin, neurotensin, cerulein, bradykinin, urokinase, kallikrein, stof P-analoger og -antagonister, angioten-30 sin II, nervevækstfaktor, blodkoagulationsfaktor VII og IX, lysozymchlorid, renin, bradykinin, tyrocidin, gramicidiner, væksthormoner, melanocytstimulerende hormon, thyroidhormon-frigørende hormon, thyroidstimulerende hormon, parathyroidhor- DK 176134 B1 88 mon, pancreozymin, cholecystokinin, human placenta-lactogen, human chorionisk gonadotrophin, proteinsyntesestimulerende peptid, gastrisk inhiberende peptid, vasoaktivt tarmpeptid, blodpladeafledt vækstfaktor, væksthormonfrigørende faktor, 5 knoglemorphogenisk protein, og syntetiske analoger og modifikationer samt farmakologisk aktive fragmenter deraf.

3. Middel ifølge krav 1, hvori peptidet er farmakologisk inaktivt og er valgt blandt polyarginin, polylysin og poly(argi-nin-co-lysin) , (co-)polymerer af neutrale aminosyrer, i D-, L-10 eller DL-form, med arginin og/eller lysin i D-, L- eller race-misk form, eller peptider eller (co-)polypeptider, hvori peptidkæderne helt eller delvis er afsluttet af en basisk gruppe ved N-terminalen, og grundskelettet består af neutrale amino-syrerester.

4. Middel ifølge krav l, hvori polyesteren er valgt blandt sådanne afledt af hydroxysyrer og sådanne hidrørende fra poly-kondensation af dioler og/eller polyoler med dicarboxylsyrer og/eller polycarboxylsyrer.

5. Fremgangsmåde til fremstilling af en opløsning eller dis-20 persion af et salt ifølge krav 1, som omfatter (a) opløsning af peptidet indeholdende mindst en basisk aminosyre, i fri baseform eller i form af et salt med en svag syre, og den carboxyterminerede polyester i et neutralt, polært opløsningsmiddel, hvori begge er op-25 løselige, fjernelse af opløsningsmidlet eller det meste af opløsningsmidlet og derpå tilsætning af den tilbageværende koncentrerede opløsning til et overskud af et ikke-opløsningsmiddel for peptid-polyestersaltet, eller 30 (b) opløsning af peptidet indeholdende mindst en basisk aminosyre, i fri baseform eller i form af et salt med en svag syre, og den carboxyterminerede polyester i et ; ji DK 176134 B1 89 opløsningsmiddel, hvori begge er opløselige, og som er i stand til at kunne fjernes ved frysetørring, frysning af den resulterende opløsning med høj hastighed, frysetørring af den resulterende frosne blanding, dis-5 pergering af den resulterende blanding i et opløs ningsmiddel for polyesterkomponenten samt at blandingen lades gå i opløsning, efterhånden som peptid-polyestersaltet dannes, eller (c) omsætning af peptidet, der indeholder mindst en basisk 10 aminosyre, i form af et salt med en stærk syre, med en polyester, hvori noget eller al polyesteren foreligger i form af et carboxyl syresalt med et egnet alkalimetal eller jordalkalimetal.

5 Patentkrav

6. Middel ifølge krav 1, der omfatter et farmakologisk aktivt 15 peptid og en polyester, til forlænget frigørelse af peptidlægemidlet, kendetegnet ved, at midlet foreligger i form af mikropartikler med diameter fra 0,2 μτη til 500 μτη, suspenderet i en farmaceutisk acceptabel injektionsvehikel .

7. Middel ifølge krav 6, hvori injektionsvehiklen er vandig eller er en organisk vehikel, som er et ikke-opløsningsmiddel for de benyttede materialer, eller, til meget lipofile polyestere, er en hydrofil, organisk injektionsvehikel.

8. Middel ifølge krav 1, der omfatter et farmakologisk aktivt 25 peptid og en polyester, til forlænget frigørelse af peptidlægemidlet, kendetegnet ved, at midlet foreligger i form af en farmaceutisk acceptabel opløsning, som omfatter: (a) et peptidlægemiddel indeholdende mindst en basisk ami nosyre som defineret i det foregående og med en mole-30 kylvægt på mindst 300Da, som foreligger i form af et salt med polyesteren, idet saltet omfatter en kation af det basiske peptid og en anion af en carboxyter- DK 176134 01 90 mineret polyester, (b) et opløsningsmiddel, som er et opløsningsmiddel for den frie polyester, men ikke et opløsningsmiddel for det frie peptid, 5 (c) et overskud af polyesteren og eventuelt (d) noget af nævnte peptid i solubiliseret eller kollo- idalt dispergeret fri form.

9. Middel ifølge krav 8, hvori det basiske peptidlægemiddel er en syntetisk analog af luteiniserende hormonfrigørende hormon 10 valgt blandt buserlin ( [D-Ser (Bu**) 6, des-Gly-NH210] -LHRH(1-9)NHEt), deslorelin([D-Trp6, des-Gly-NH210]-LHRH(1-9)NHEt), fertirelin ([des-Gly-NH210]-LHRH(1-9)NHEt), goserelin ([D- Ser(But)6, Azgly10]-LHRH), histrelin ([D-His (Bzl) 6, des-Gly-NH210]-LHRH(1-9)NHEt), leuprorelin ([D-Leu6, des-Gly-NH210]-15 LHRH(1-9)NHEt, lutrelin ([D-Trp6, MeLeu7, des-Gly-NH210]-LHRH(1-9)NHEt), nafarelin ([D-Nal6]-LHRH), tryptorelin ([D-Trp6]-LHRH), og farmakologisk aktive salte deraf.

10. Middel ifølge krav 8, hvori opløsningsmidlet er valgt blandt benzylbenzoat, benzylalkohol, ethyllactat, glyceryltri- 20 acetat, estere af citronsyre og polyethylenglycoler, alkoxy-polyethylenglycoler og polyethylenglycolacetater med lav molekylvægt (<1000).

11. Middel ifølge krav 8, hvori forholdet mellem basisk pep- j tidlægemiddel-polyestersalt og fri polyester er fra 1:0 til 25 0,1:10.

12. Middel ifølge krav 8, hvori forholdet mellem faste stoffer i alt og opløsningsmiddel er fra 2% vægt/vol til 40% vægt/vol.

13. Fremgangsmåde til fremstilling af et farmaceutisk middel ifølge krav 8, som omfatter -- DK 176134 B1 91 (a) opløsning af en intim blanding af peptidlægemidlet og polyesteren i det farmaceutisk acceptable opløsningsmiddel; eller (b) langsom tilsætning af en opløsning af peptidlægemidlet 5. en 1-6C alkanol til en opløsning af polyesteren i et til injektion egnet opløsningsmiddel, hvorefter, hvis opløsningsmidlet i peptid-udgangsopløsningen ikke er farmaceutisk acceptabelt til injektion, dette opløsningsmiddel fjernes. 10