KR101607398B1 - 이중 약물 방출 기능을 가진 온도감응성 플루로닉-키토산올리고당-카토제닌 나노 복합체 - Google Patents

이중 약물 방출 기능을 가진 온도감응성 플루로닉-키토산올리고당-카토제닌 나노 복합체 Download PDF

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임군일
강미란
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동국대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 플루로닉-키토산올리고당-카토제닌 복합체 입자를 이용한 온도감음성 이중 약물 전달체에 관한 것이다. 본 발명의 약물 전달체는 카토제닌과 나노입자에 봉입된 진통제 약물의 방출 속도를 온도 변화를 통하여 조절함으로써, 지속적인 연골 재생 효과 및 빠른 항염 효과를 가지므로 골 질환의 예방 또는 치료에 있어서, 보다 효과적으로 접근하여 치료할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

이중 약물 방출 기능을 가진 온도감응성 플루로닉-키토산올리고당-카토제닌 나노 복합체 {Thermally responsive Pluronic-Chitosan oligosaccharides-katogenin tri-complex nanoparticle with dual drug release profiles}
본 발명은 플루로닉-키토산올리고당-카토제닌 복합체 입자를 이용한 온도감음성 이중 약물 전달체로서, 보다 구체적으로는 플루로닉(pluronics), 키토산올리고당(Chitosan oligosaccharides), 및 카토제닌(Kartogenin)이 순차적으로 공유결합으로 연결된 나노 복합체 입자; 및 상기 복합체 입자 내에 봉입된 약물을 포함하는, 이중 약물 전달체에 관한 것이다.
일반적으로 척추동물의 관절을 이루는 연골 조직은 한번 손상되면 정상적으로 생체 내에서 재생이 매우 어렵다. 이러한 관절의 연골조직이 손상될 경우, 심한 통증과 함께 일상 활동에 제한을 받게 되며, 만성화될 경우, 치명적인 퇴행성 관절염 등이 유발되어 정상적인 생활이나 직업적인 활동에 방해가 되는바, 현대인의 생활에 큰 영향을 미치게 된다.
이러한 연골손상은 관절 연골조직의 외상성 결손이나 점진적인 파괴를 가져오는 골관절염에 의하여 높은 빈도로 발생하고 있다. 따라서, 골관절염 치료방법에 대한 연구가 진행 중에 있으며 연골성형술(chondroplasty), 골연골 이식술(osteochondral transplantation), 자가유래 연골세포 이식술(autologous chondrocyte transplantation) 등이 시행되고 있으나, 60대 이하의 비교적 젊은 환자에 시술하는 경우는 인공관절의 수명이 문제가 된다.
또한, 스테로이드제제 또는 히알루론산을 관절에 직접 주입하는 국소주사치료법이 널리 이용되고 있으나, 이러한 소염진통제류의 약물은 증상을 완화시키는 효과가 있는 반면, 연골의 약화와 전신적인 부작용을 초래할 수 있으며, 손상된 연골을 재생할 수 없어서 근본적인 치료법이 되지 못한다. 따라서, 골관절염 부위에서 연골 재생을 유도할 수 있는 약물을 국소주사치료에 적용한다면 더욱 효과가 높은 치료법이 될 것이다.
한편, 골관절염의 치료를 위한 약물의 투여방법 측면에서, 관절 내 주사법은 손상된 관절에 직접 약물을 주입할 수 있어 기대효과가 가장 높은 치료법이다. 하지만 관절 내로 주입된 액체 상태의 약물은 빠른 확산으로 관절 내에서 머무를 수 있는 시간이 매우 짧아 약물의 농도를 높이거나 투여 횟수를 증가시켜야만 하는데, 이 경우 오히려 전신부작용을 초래할 수 있다.
또한, 연골 재생을 위한 골관절염의 약물치료는 단순한 연골 손상의 진행 억제 및 손상된 연골의 재생을 위한 약물 뿐만 아니라, 염증부위의 빠른 통증완화를 위한 약물도 병행하여 투여하고 있으며, 약리 또는 약동학적 특성 차이에 의해 투여횟수가 더욱 증가하게 될 우려가 있다.
따라서, 이중 약물 전달체를 이용한 치료가 주요한 과제의 대상이 되고 있고, 이에 대한 연구가 이루어지고 있으나(한국 특허공개번호 10- 2006-0064048), 아직은 미비한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 디클로페낙(Diclofenac)이 봉입된 플루로닉-키토산올리고당-카토제닌 tri-complex 나노 입자에서 온도 변화에 의한 디클로페낙의 속방형 방출과 카토제닌의 서방형 방출을 확인하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 플루로닉(pluronics), 키토산올리고당(Chitosan oligosaccharides), 및 카토제닌(Kartogenin)이 순차적으로 공유결합으로 연결된 나노 복합체 입자; 및 상기 복합체 입자 내에 봉입된 약물을 포함하는, 온도감음성 이중 약물 전달체을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 이중 약물 전달체를 유효성분으로 포함하는, 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 플루로닉(pluronics), 키토산올리고당(Chitosan oligosaccharides), 및 카토제닌(Kartogenin)이 순차적으로 공유결합으로 연결된 나노 복합체 입자; 및 상기 복합체 입자 내에 봉입된 약물을 포함하는, 온도감음성 이중 약물 전달체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 공유결합은 아마이드 결합(amide bond)일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 봉입된 약물은 소염진통제일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 소염진통제는 디클로페낙(Diclofenac)일 수 있다.
본 발명은 상기 이중 약물 전달체를 유효성분으로 포함하는, 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 골질환은 골관절염(osteoarthritis)일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조성물은 관절 내 주사제 제제일 수 있다.
본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골 질환의 치료방법을 제공한다.
본 발명은 이중 약물 전달체를 포함하는 조성물의 골 질환의 치료용도를 제공한다.
본 발명은 플루로닉-키토산올리고당-카토제닌 복합체 나노입자(Pluronic-Chitosan oligosaccharides-katogenin tri-complex nano particle)를 이용한 온도감음성 이중 약물 전달체에 관한 것으로서, 상기 나노입자에 공유결합된 카토제닌과 나노입자에 봉입된 소염진통제 약물의 방출 속도를 온도 변화를 통하여 조절할 수 있음을 확인하였고, 이에 따른 지속적인 연골 재생 효과 및 빠른 항염 효과를 확인하였는바, 골 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 tri-complex의 합성 반응에 대한 화학구조식을 나타낸 모식도이다.
도 2는 카토제닌-키토산올리고당 복합체를 적외선분광광도계(FT-IR; Fourier Transform Infrared spectrophotometer)를 통하여 확인한 결과이다.
도 3은 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 tri-complex 나노 입자의 (a) 키토산올리고당, (b) 카토제닌, (c) COOH-F127-COOH, 및 (d) 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 tri-complex 나노 입자의 공유결합을 적외선분광광도계(FT-IR; Fourier Transform Infrared spectrophotometer)를 통하여 확인한 결과이다(COS : 키토산올리고당, KGN : 카토제닌, aF127 : COOH-F127-COOH, F127/COS/KGN : 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 tri-complex 나노 입자).
도 4는 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 tri-complex 나노 입자의 (a) 키토산올리고당, (b) 카토제닌, (c) COOH-F127-COOH, 및 (d) 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 tri-complex (F127/COS/KGN) 을 수소핵자기공명분광기(1H-NMR; Proton Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy)를 통하여 확인한 결과이다.
도 5는 디클로페낙이 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 나노입자의 제조과정 모식도이다.
도 6은 디클로페낙이 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌나노입자의 형태를 전자현미경으로 관찰한 결과이다.
도 7은 (a)(b) 카토제닌의 몰분율 변화에 따른 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 나노입자의 온도 변화(4℃~37℃)에 따른 크기 변화 차이를 확인한 결과, (c) 플루로닉F127-COOH의 몰분율을 변화에 따른 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 나노 입자의 온도 변화에 따른 크기 변화 차이를 확인한 결과, (d) 온도 변화(4℃~37℃)에 따른 나노입자(4F127, 5F127)의 크기 변화를 통해 상변이 여부를 확인한 결과이다.
도 8은 디클로페낙이 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 나노입자로부터 방출된 (a) 카토제닌 및 (b) 디클로페낙의 함량을 액체크로마토그래피 (HPLC)로 분석한 결과이다(3F127/COS/KGNDCF w/: 플루로닉F127:키토산올리고당:카토제닌=3:1:0.1로 구성된 DCF가 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 tri-complexed 나노입자만 처리한 군, 3F127/COS/KGNDCF w/o cs : 플루로닉F127:키토산올리고당:카토제닌=3:1:0.1로 구성된 DCF가 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 tri-complexed 나노입자 및 cold shock 처리한 군, 4F127/COS/KGNDCF w/ : 플루로닉F127:키토산올리고당:카토제닌=4:1:0.1로 구성된 DCF가 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 tri-complexed 나노입자만 처리한 군, 4F127/COS/KGNDCF w/o cs : 플루로닉F127:키토산올리고당:카토제닌=4:1:0.1로 구성된 DCF가 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 tri-complexed 나노입자 및 cold shock 처리한 군).
도 9는 골수간엽줄기세포에서 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 tri-complex 나노입자에 의한 Collagenase type II (COL2A1)과 Aggrecan의 유전자 발현 증가를 확인한 결과이다(KGN : 액체상태의 카토제닌을 단독으로 처리한 군, F127/COS/KGNDCF w/o cs : DCF가 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 나노입자를 처리한 군, F127/COS/KGNDCF w/ cs : DCF가 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 나노입자 및 cold shock 처리한 군).
도 10은 골수간엽줄기세포에서 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 tri-complex 나노입자에 의한 Collagenase type II (COL2A1)과 Aggrecan의 단백질 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 11은 연골세포 및 U937 세포에서, 디클로페낙이 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 나노입자를 처리에 의한 IL-6의 분비량 측정한 결과이다(LPS: LPS(lipopolysaccharide)만을 처리한 군, LPS+nanoparticles w/o cs: LPS 처리 후 디클로페낙이 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 나노입자만을 처리한 군, LPS+nanoparticles w/ cs: LPS 처리 후 디클로페낙이 디클로페낙이 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 나노입자 및 cold shock 처리한 군).
본 발명자들은 디클로페낙이 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 나노 복합체 입자(Pluronic-Chitosan oligosaccharides-katogenin tri-complex nano particle)에서, 카토제닌 또는 플루로닉F127-COOH의 몰분율, 및 온도 변화에 따른 입자의 크기 변화를 확인하였다, 또한, Cold shock 처리를 한 경우, 디클로페낙의 속방형 방출 및 빠른 항염 효과와 공유결합된 카토제닌의 서방형 방출 및 지속적인 연골 분화 효과를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 플루로닉(pluronics), 키토산올리고당(Chitosan oligosaccharides), 및 카토제닌(Kartogenin)이 순차적으로 공유결합으로 연결된 나노 복합체 입자; 및 상기 복합체 입자 내에 봉입된 약물을 포함하는, 온도감음성 이중 약물 전달체를 제공한다.
본 발명에서 손상된 관절 부위로 방출되는 이중 약물은 손상된 연골의 재생을 촉진시키는 카토제닌과 나노 복합체 입자 내 봉입된 약물로서, 본 발명에서, "카토제닌"은 연골에 있는 중간엽 줄기세포의 활동을 촉발시켜 연골세포가 생성되게 함으로써 손상된 연골의 재생을 촉진시키는 화합물이며, 퇴행성 관절염 모델 쥐를 이용한 실험에서, 중간엽 줄기세포로부터 연골세포로의 분화를 확인한바 있다. 또한, 본 발명에서, "나노 복합체 입자 내 봉입된 약물"은 소염진통제일 수 있으며, 이는 동통을 제거하거나 경감시키는 것을 목적으로 사용하는 약물로서, 본 발명의 목적상 손상된 연골 부위의 동통을 완화시키는 약물을 일컬으며, 바람직하게는 디클로페낙(Diclofenac)일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서는 소수성 약물인 카토제닌을 친수성인 키토산 올리고당에 결합시키고, 상기 카토제닌-키토산 올리고당 복합체를 순차적으로 플루로닉에 결합시킴으로써, 나노 복합체 입자를 제조하였으며, 상기 카토제닌과 키토산 올리고당, 키토산 올리고당과 플루로닉간의 화학결합은 공유결합으로서, 바람직하게는 아마이드 결합일 수 있다. 또한, 상기 나노 복합체 입자 내에 소염진통제를 봉입함으로써, 염증부위의 손상된 연골의 재생 효과뿐만 아니라, 염증부의의 통증 완화 효과 역시 가지는 이중 약물 전달체를 제조하였다.
또한, 본 발명에서, "온도감음성"은 온도에 따라 약물 방출 거동을 조절할 수 있는 능력으로서, 골관절염 환자의 염증 완화를 위한 냉온찜질 요법에 착안하여, 온도변화에 따라 약물 방출을 조절할 수 있도록 온도감응성 폴리머인 플루로닉을 상기 약물 전달체 제조에 적용하여, 나노 입자에 봉입된 진통제의 속방형 방출 및 공유결합된 카토제닌의 서방형 방출을 유도하였다. 따라서, 본 발명의 온도감음성 이중 약물 전달체는 온도조절에 의한 약물 방출로 연골 손상 부위에 대해 빠른 진통 소염효과와 지속적인 연골 재생 효과를 갖는다.
본 발명의 일 실시예에서는 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 나노입자 및 디클로페낙이 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 나노입자를 제조하여(실시예 1 내지 2 참조), 플루로닉, 카토제닌의 몰분율 및 온도 변화에 따른 나노입자의 크기 변화를 확인하였다(실시예 3 참조). 또한, 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 나노입자에서, cold shock를 준 경우, 카토제닌의 서방출 및 지속적인 연골 재생효과를 확인하였으며 디클로페낙의 속방출 및 빠른 항염효과를 확인하였는바(실시예 4 내지 6 참조), 온도에 따라 이중 약물의 방출을 조절할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 상기 이중 약물 전달체를 유효성분으로 포함하는, 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 골 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 골 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 예방 또는 치료의 대상인 "골 질환"은 조골세포의 활성 촉진으로 골량 증가가 필요 또는 요구되는, 상태 또는 질병을 의미하는 것으로 골량 저하 질환을 포함하며, 바람직하게는 골관절염(osteoarthritis)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성셀룰로스, 폴리비닐피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 바람직하게는 관절 내 주사제로 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 골 질환 치료를 위한 종래의 관절 내 주사제와 달리 온도 변화에 따른 나노 입자에 봉입된 진통제의 속방형 방출 및 공유결합된 카토제닌의 서방형 방출이 가능하므로 골 질환의 효과적인 치료법이 될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있으며, 본 발명의 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래 의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약제학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 150mg, 바람직하게는 0.01내지 100mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 또한, 투여 경로, 골 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 상기 약물이 관절내 주사제 제제로서 투여되는 경우, 플루로닉-키토산 올리고당-카토제닌 나노입자는 바람직하게는 체중 1kg 당 0.2mg을 3주 간격으로 2회 관절 내로 투여할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골 질환의 치료방법을 제공한다. 본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 tri-complex 나노 입자의 제조 및 확인
플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 tri-complex 나노 입자의 합성을 위하여 먼저, 반응유도체인 EDC/NHS(ethyl(dimethylaminopropyl)carbodiimide/ N-Hydroxysuccinimide)를 사용하여 카토제닌의 카르복실그룹과 키토산올리고당의 아민그룹간 공유결합 형성을 유도하였다. 키토산올리고당에 대한 적정 몰비의 카토제닌 (키토산올리고당:카토제닌 1:0.02, 1:0.1, 1:0.5)을 EDC/NHS 반응유도체와 1시간동안 25℃에서 반응시킨 후, 1%(v/v) acetic acid 용매에 녹인 키토산올리고당 용액에 첨가하여 24시간 동안 저속으로 교반하였으며, 투석을 통해 결합되지 않은 카토제닌, 키토산올리고당 및 EDC/NHS를 제거하고 동결 건조하여 키토산올리고당-카토제닌 복합체를 제조하였다.
플루로닉과 키토산올리고당의 공유결합유도를 위해 플루로닉의 양쪽 말단이 카르복시기로 치환된 dicarboxylated 플루로닉 (HOOC-플루로닉-COOH)을 제조하였다. 먼저, 플루로닉 F127 (63g), 숙신산 (1.25g), 4 dimethylaminopyridine (1.2g), triethylamine (1.4 mL)을 anhydrous dioxane (200 mL)에 녹여 24h 동안 교반하였다. 이 후, Dioxane을 회전증발농축기로 증발시키고, diethyl ether를 첨가하여 합성된 HOOC-플루로닉-COOH을 침전시킨 후, diethyl ether는 진공 오븐에서 건조시켜서 HOOC-플루로닉-COOH의 하얀색 가루를 수득하였다.
상기 합성된 키토산올리고당-카토제닌 복합체와 HOOC-플루로닉-COOH을 이용하여 emulsification/solvent evaporation 방법으로 나노입자를 제조하는 과정에서 키토산올리고당과 플루로닉의 공유결합을 유도하였다. 키토산올리고당에 대한 적정 몰비의 플루로닉 (키토산올리고당:플루로닉 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5)을 EDC를 dichloromethane에 녹인 후 30분동안 반응시켰다. 이 후, 1%(v/v) acetic acid 용매에 녹인 키토산올리고당-카토제닌 복합체에 위에서 준비된 플루로닉 반응액을 드롭방식으로 떨어뜨리고 고주파에 반응시켜 에멀젼화를 유도하여 나노입자를 제조하였다. 상기 입자를 24시간 동안 교반하면서 키토산올리고당과 플루로닉의 충분한 공유결합을 유도하였으며, 이 후 반응액인 투명해질 때까지 회전증발기로 dichloromethane을 증발시키고 제조된 나노입자는 동결 건조하여 회수하였다. 본 실시예에서 사용된 키토산올리고당에 대한 카토제닌의 몰분율은 1:0.02, 1:0.1, 1:0.5이며, 키토산올리고당에 대한 플루로닉의 몰분율은 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5로 합성되었다.
또한, 상기 각 합성반응에 있어서, 생성물을 확인하기 위하여, 적외선분광광도계(FT-IR; Fourier Transform Infrared spectrophotometer) 및 수소핵자기공명분광기(1H-NMR; Proton Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) 분석을 실시하였다.
도 2 에 나타낸 바와 같이, 적외선분광광도계(FT-IR)에서, 키토산의 첫 번째 아민그룹의 강한 N-H 결합에 비해 약한 N-H 결합을 가진 두 번째 아민그룹이 카토제닌의 카르복실기와 공유결합하면서 고유의 amide 결합을 잃어버린 것을 확인하였다.
또한, 도 3 에 나타낸 바와 같이, COOH-플루로닉F127-COOH에 대한 적외선분광광도계(FT-IR)에서 wavelength 1735에서 카르복실기에 특이적인 peak가 관찰되었으며, 말단기의 카르복실기의 치환을 확인하였으며, 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 tri-complex에 대한 적외선분광광도계(FT-IR)에서 카토제닌의 -CONH-기와 COOH-F127-COOH의 카르복실기 및 C=O 그룹의 작용기가 나타내는 resonance peaks가 관찰되었으며, 이로써, 키토산올리고당의 아민기에 플루로닉F127-COOH 및 카토제닌이 성공적으로 공유결합됨을 확인하였다.
아울러, 도 4에 나타낸 바와 같이, 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 tri-complex에 대한 수소핵자기공명분광(1H-NMR)에서, 카토제닌 벤젠고리의 수소가 나타내는 reasonance peak (δ7.5-8), 키토산 올리고당의 C2 위치의 메틸(-CH3)/메틸렌(-CH2)기에 있는 수소의 reasonance peak (δ1.9/δ2.7), 및 COOH-F127-COOH의 메틸렌(-CH2-CH2-CONH-)기에 있는 수소의 reasonance peak (δ2.2/δ2.4)을 관찰하였으며, 이를 통해 키토산올리고당의 아민기에 플루로닉F127-COOH 및 카토제닌이 성공적으로 공유결합됨을 확인하였다.
실시예 2. 디클로페낙이 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 tri-complex 나노입자의 제조 및 확인
실시예 1에서 제조된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 tri-complex 나노 입자를 이용하여 디클로페낙이 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 나노입자를 제조하였으며, 제조된 나노 입자를 전자현미경으로 관찰하였다.
보다 구체적으로 디클로페낙 (5mg)과 나노입자 (10mg)을 deionized water에 부유하고 4℃에서 24시간 동안 천천히 교반하였으며, 반응액을 55℃에서 10분간 heating한 후, 10,000 rpm에서 centrifuge하고 상층액을 제거하여 디클로페낙이 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 나노입자를 제조하였다. 이 후, deionized water에 부유한 나노입자를 stud에 한 방울 떨어뜨리고 상온에서 건조한 후, 물기가 완전히 없어지면 백금코팅하고 FE-SEM으로 관찰하여 나노입자의 형태를 확인하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 디클로페낙이 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 나노입자의 둥근 형태를 확인하였다.
실시예 3. 플루로닉 F127 및 카토제닌의 몰분율 변화에 따른 나노입자 크기 변화 확인
플루로닉F127-COOH:키토산올리고당의 몰분율을 4:1로 고정하고, 카토제닌의 몰분율을 변화시킨 경우, 온도(4℃, 37℃)에 따른 나노입자의 크기 변화 차이를 평가하였고, 키토산올리고당:카토제닌의 몰분율을 1:0.1로 고정하고 플루로닉F127-COOH의 몰분율을 변화시킨 경우, 온도 변화(4℃, 37℃)에 따른 나노입자의 크기 변화 차이를 평가하였다. 또한, 상변이가 일어나는 온도 구간을 확인하기 위해 4℃에서 37℃ 까지 온도변화에 따른 나노입자의 크기변화를 확인하였으며, 이 때, 플루로닉:키토산올리고당:카토제닌의 몰분율이 4:1:0.1인 나노입자(4F127)와 5:1:0.1인 나노입자(5F127)간 상변이를 비교함으로써, 플루로닉의 몰분율 변화에 따른 나노입자의 상변이의 차이를 관찰하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 카토제닌의 몰분율이 증가할수록 온도변화에 따른 나노입자의 크기변화가 줄어들어든 반면, 플루로닉F127-COOH의 몰분율이 증가할수록 온도변화에 따른 나노입자의 크기 변화가 증가하였다. 4℃에서 37℃ 까지 온도변화에 따른 나노입자의 크기변화를 관찰한 결과, 24℃에서 27℃ 사이에서 급격한 나노입자의 크기변화가 일어남을 확인하였으며, 저온 상태에서, 나노 입자가 팽창함을 확인하였다. 또한 나노입자 제조시 플루로닉의 몰분율이 증가할수록 온도변화에 따른 나노입자의 상변이 폭이 커짐을 확인하였다.
상기 결과는 플루로닉F127, 키토산올리고당 및 카토제닌의 몰분율 조절로 온도변화에 따른 나노입자의 크기 변화를 조절할 수 있음을 의미한다.
실시예 4. 디클로페낙이 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 나노입자에서 카토제닌의 서방형 방출 및 디클로페낙 속방형 방출의 서방형 방출 확인
디클로페낙이 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 나노입자에서의 약물 방출을 확인하기 위하여, 시험관 내 약물방출실험으로서, 나노입자로부터 방출된 카토제닌 및 디클로페낙의 함량을 액체크로마토그래피 (HPLC)로 분석하였으며, cold shock(F127/COS/KGNDCF w/o cs, F127/COS/KGNDCF w/ cs)에 따른 방출 속도의 차이를 비교하였다.
보다 구체적으로 동결건조된 F127/COS/KGNDCF 나노입자 (100mg)을 PBS에 부유하고 37℃ 100rpm shaking incubator에 반응시켰다. 각 sampling time에 10,000rpm centrifugation으로 나노입자를 침전시키고 상층액을 수거하고 같은 volume의 fresh PBS로 교체하였다. 각 sampling time에 10분 동안 ice에서 처리함으로써 Cold shock을 가하였으며, 디클로페낙 및 카토제닌의 함량은 HPLC로 분석하였다.
아울러, 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 나노입자의 각 구성물질의 몰농도 비율은 3F127/COS/KGN의 경우, 플루로닉F127:키토산올리고당:카토제닌=3:1:0.1이며, 4F127/COS/KGN의 경우, 플루로닉F127:키토산올리고당:카토제닌=4:1:0.1이었으며, 이를 통하여, 플루로닉F127의 몰 농도 비율에 따른 각 물질의 방출 속도차이를 확인하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 디클로페낙이 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 tri-complex 나노입자에서의 카토제닌 서방출을 확인하였으며, cold shock를 준 경우, 좀 더 빠른 카토제닌의 방출 속도를 보였으나, 이 경우에도 2주까지 60%이하의 지속적인 방출을 확인하였다.
또한, 디클로페낙이 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 나노입자에서 디클로페닉의 속방출을 확인하였으며, 특히, cold shock를 준 경우, 9시간 이내에 90%에 가까운 빠른 방출 속도를 확인한 반면, cold shock를 주지 않은 경우, 24시간동안 20% 정도의 상대적으로 느린 방출 속도를 확인하였다.
아울러, 플루로닉F127의 몰농도 비율이 높은 4F127/COS/KGN의 경우, 3F127/COS/KGN와 비교하여, 카토제닌은 느리게 방출되었으며, 디클로페낙은 빠르게 방출되었다 따라서, 4F127/COS/KGN (플루로닉F127:키토산올리고당:카토제닌=4:1:0.1 몰농도) 나노입자에서 최적의 카토제닌 서방형 방출 및 디클로페낙의 속방형 방출 효과를 얻을 수 있음을 확인하였다.
상기 결과는 연골 재생 약물인 카토제닌의 서방형 방출로 국소 부위에서 지속적인 연골 재생 효과를 가질수 있음을 의미하며, 소염진통제인 디클로페낙은 온도 변화(cold shock)에 따른 입자의 팽창에 의해 빠른 방출이 유도됨을 의미한다.
실시예 5. 디클로페낙이 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 나노입자의 연골 분화 효과 확인
실시예 4의 카토제닌의 서방형 방출에 따른 지속적인 연골 재생 효과를 확인하기 위하여 골수간엽줄기세포에 액체상태의 카토제닌을 단독으로 처리한 군(KGN), 디클로페낙이 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 나노입자를 처리한 군(F127/COS/KGNDCF w/o cs), 및 디클로페낙이 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 나노입자를 처리한 후 cold shock를 가한 군(F127/COS/KGNDCF w/ cs)간 연골 분화 인자인 Collagenase type II (COL2A1)과 Aggrecan 유전자 및 단백질의 발현율을 평가하였다.
보다 구체적으로 Pellet 형태로 배양한 골수간엽줄기세포를 Trans well plate의 하층 well로 옮기고, 0.05 μm pore size 의 Membrane을 깔아준 상층 well에 100nM의 카토제닌을 분비할 수 있는 디클로페낙이 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 나노입자를 각각을 처리하였다. 3주 후, TRIzol (Invitrogen Co.)을 처리하여 RNA를 분리하고, Maxime RT preMix kit oligo(dT) primer (iNtRon biotechnology)를 이용하여 역전사 시켰으며, Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase (GAPDH), collagen type II (COL2A1), aggrecan, 유전자의 발현량은 real-time polymerase chain reaction으로 정량하여 house keeping 유전자인 GAPDH의 발현량과 비교, 상대 정량하였다.
또한, 연골 분화 4주 후 pellet을 수거하고 RIPA lysis buffer (Thermo scientific)로 total protein을 분리하였다. 8 % SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 단백질 전개 후, polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane에 blotting하였으며, 0.05%(v/v) tween 20이 포함된 PBS에 5%(v/w) skim milk를 첨가한 후, 단백질이 블로팅된 membrane을 1시간 동안 반응시켰다. SOX9 (SRY (sex determining region Y)-box 9), Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase (GAPDH), collagen type II (COL2A1), aggrecan, 에 대한 Primary antibody를 4℃에서 overnight 반응시키고, horseradish peroxidase가 표지된 secondary antibody를 상온에서 1시간 처리하였다. chemiluminescence (ECL) Western blotting detection reagent (Amersham Biosciences)로 발광된 시그널을 LAS-3000 (Fujifilm)를 이용하여 이미지를 획득하였다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 디클로페낙이 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 나노입자를 처리한 그룹은 액체상태의 카토제닌을 처리한 그룹보다 2~4배 이상 높은 COL2A1의 유전자 발현율을 보였으며, Aggrecan에서도 2~2.5배 이상 높은 유전자 발현율을 확인하였으며, cold shock를 가한 경우, COL2A1 및 Aggrecan의 발현이 더욱 증가하였다.
또한, 도 10에 나타낸 바와 같이, real-time qPCR 결과와 마찬가지로, 디클로페낙이 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 나노입자를 처리한 그룹은 액체상태의 카토제닌을 처리한 그룹보다 더 높은 COL2A1 및 Aggrecan의 단백질 발현율을 확인하였다.
상기 결과를 통해서 나노입자에서 지속적으로 방출된 카토제닌에 의한 연골 재생 효과의 증가를 확인하였다.
실시예 6. 디클로페낙이 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 tri-complexed 나노입자에 의한 빠른 항염 효과 확인
실시예 4의 디클로페낙의 빠른 방출에 따른 항염효과를 확인하기 위하여 연골세포 및 U937 macrophage-like cells에 LPS(lipopolysaccharide)만을 처리한 군(LPS), LPS 처리 후 디클로페낙이 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 tri-complex 나노입자만을 처리한 군(LPS+nanoparticles w/o cs), 및 LPS 처리 후 디클로페낙이 디클로페낙이 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 tri-complex 나노입자 및 cold shock 처리한 군(LPS+nanoparticles w/ cs)간 함염증성 cytokine인 IL-6의 분비량을 비교하였다.
보다 구체적으로, 연골 (1×105cells/well) 및 U937 (1×105cells/well) 세포를 6-well 플레이트에 배양하고 Lipopolysaccharide (LPS) (1㎍/ml)로 염증반응을 유도한 후, 2일 동안 DCF 100nM을 분비할 수 있는 F127/COS/KGNDCF 나노입자를 각 세포에 처리하였다. 시간별로 배양액을 수거하여 분비가 억제된 IL-6를 enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA)로 정량하였다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 디클로페낙이 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 tri-complex 나노입자 처리군에서 IL-6의 분비량이 유의적으로 감소하였다. 또한, cold sock를 준 그룹과 그렇지 않은 그룹을 비교하였을 때, cold shock를 준 그룹에서 IL-6의 분비량이 더욱 효과적으로 줄어들었다.
상기 결과는 디클로페낙이 봉입된 플루로닉F127-키토산올리고당-카토제닌 tri-complex 나노입자에서 온도 변화(cold shock)에 의한 빠른 디클로페낙의 방출로 더욱 효과적인 항염 효과를 가질 수 있음을 의미한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (7)

  1. 온도감응성 이중 약물 전달체를 유효성분으로 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 약물 전달체는 플루로닉(pluronics), 키토산올리고당(Chitosan oligosaccharides), 및 카토제닌(Kartogenin)이 순차적으로 공유 결합으로 연결된 나노 복합체; 및 상기 복합체 내에 봉입된 소염 진통제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 공유결합은 아마이드 결합(amide bond)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 소염진통제는 디클로페낙(Diclofenac)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 골 질환은 골관절염(osteoarthritis)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 관절 내 주사제 제제인 것을 특징으로 하는, 조성물.








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