KR101740895B1 - 뇌조직에 특이적으로 전달 가능한 뇌조직 표적화 펩티드와 키토산이 결합된 플루로닉 고분자를 포함하는 뇌표적 나노전달체 - Google Patents

뇌조직에 특이적으로 전달 가능한 뇌조직 표적화 펩티드와 키토산이 결합된 플루로닉 고분자를 포함하는 뇌표적 나노전달체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 뇌조직 표적화 펩티드가 결합된 키토산으로 부분 치환된 플루로닉 고분자를 포함하는 나노전달체 및 이를 이용한 뇌표적 전달에 관한 것이다. 본 발명에 의한 뇌조직 표적화 펩티드와 키토산이 결합된 플루로닉 고분자를 포함하는 뇌조직 표적화 나노전달체는 BBB를 통과하는 뇌 표적화와 생체활성 상태로서 약물의 전달을 위해서도 효과적일 뿐만 아니라, 뇌표적 특정 서열을 가지는 펩티드와 키토산의 상승효과는 표적화 효능을 크게 증진시키고, 뇌안의 축적을 연장하는 효과가 우수하므로, 본 발명의 나노전달체는 단백질 및 유전물질뿐만 아니라 미래의 다른 치료제와도 조합하여 전달하는 뇌 표적 전달 매체용으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

뇌조직에 특이적으로 전달 가능한 뇌조직 표적화 펩티드와 키토산이 결합된 플루로닉 고분자를 포함하는 뇌표적 나노전달체{Brain targeting nano-carrier containing pluoronic polymer comprising brain targeting peptide capable of specifice delivery to brain tissue and chitosan}
본 발명은 뇌조직 표적화 펩티드가 결합된 키토산으로 부분 치환된 플루로닉 고분자를 포함하는 나노전달체 및 이를 이용한 뇌표적 전달에 관한 것이다.
지난 수년간 종양, 알츠하이머병 및 파킨슨병과 같은 뇌 질환에 대한 표적 약물 전달 또는 영상화가 연구되어 왔다. 비록 몇몇 뇌질환 질병에 효과적인 약들이 존재하지만, 그 응용성은 뇌로의 낮은 축적, 혈액-뇌-장벽(이하, BBB로 표시) 불투과성 등의 이유로 인해 제한되어 있다.
예로, 화학치료법을 위한 약물들은 뇌로의 접근이 허락되지 않으며, 이로 인해 종양제거를 위해 필요한 농도가 형성되지 못한다. 이러한 것은 뇌암에 의한 높은 치사율의 주원인이 된다. 작은 분자량을 가지면서(분자량 400kDa 이하) 높은 지용성인 분자들은 활성 방출 수송체(active efflux transporters)를 위한 기질이 아니면서 BBB를 투과할 수 있지만, 98% 이상의 작은 분자들은 이러한 뇌의 중심에 위치하기 위한 필요조건을 충족시키지 못한다. 게다가, 큰 분자들은 100% 뇌로의 투입이 불가능하다. 현재, 전세계적으로 15억 명에 달하는 사람들이 뇌질환으로 고통받고 있어, 노화 인구들을 위한 중추신경계(이하, CNS로 표시) 약물의 필요성이 증가하고 있는 실정이다.
이러한 치료를 위해서는 원하는 치료 약물을 뇌로 전달하는 적합한 전략이 개발되어야 한다. 뇌를 관통하여 약물이 충분한 시간을 가지고 원하는 위치에서 생물학적 효과를 나타내는 것이 CNS 약물 개발 프로그램의 최종 목표이다. 이러한 목표를 이루기 위해서는 BBB의 관통이 매우 중요하므로 BBB의 투과성을 극복하고 뇌로의 약물전달 효율을 높이기 위해, BBB를 일시적으로 개방하거나, 약물의 투여량을 증가시키거나, 약물을 중추신경으로 직접 주입하는 등의 방법들이 응용되고 있다. 그러나, 이러한 방법들은 침투적이며, 주사와 독성의 위험성이 존재할 뿐 아니라, 전문 기술을 가진 인력이 필수적이다.
이러한 문제점들을 해결하기 위하여 종래 BBB 내의 특정 전달체(specific carrier)에 의해 전달되게 하는 방법이 있으나, 이러한 약물의 수정(modification)은 뇌로 주입된 후, 수용체에 대한 약물의 친화성에 영향을 주거나, 분자량이 400 kDa 이상으로 커지는 원인이 될 수도 있는 문제점이 있다. 또한, 지용성이 증가된 약물의 경우, 뇌 이외의 장기들에 전달되어 혈액속 약물의 농도가 감소될 수 있는 문제점이 있다.
이에, 많은 연구자들에 의해 주위의 혈액과 단백질의 직접 접촉을 방지할 수 있는 미셀, 나노입자와 리포솜과 같은 전달계들이 체내 단백질 전달을 위해 연구되어 왔다.
이중, 나노입자는 입자의 크기가 수 nm에서 수백 nm크기의, 넓은 표면적을 가진 콜로이드상의 불균일 분산 입자 일종으로 지금까지 수많은 연구에 의해 나노 입자의 제조, 특성 규명, 약물 봉입에 관한 연구가 이루어져 약물 전달체로서의 가능성이 충분히 입증되었다. 나노입자가 인체에 투입될 때는 주사, 경구, 피부 등 다양한 방법을 통해 전달되며 이때의 약물의 분포는 다른 전달체와는 구별되는 약물의 분포를 나타내며 이것은 나노 입자의 특성에 따라 조금씩 다르게 나타난다. 예를 들어, 약물을 인체 내에 투여하면 목표로 하는 장기 외에 다른 장소에도 약물이 분포하게 된다.
이에 따라, 펩티드 변성 생분해성 고분자(PLGA) 나노입자(Vergoni AV, Tosi G, Tacchi R, Vandelli MA, Bertolini A, Costantino L. Nano-particles as drug delivery agents specic for CNS: in vivo biodistribution. Nanomedicine: Nanotech Biol Med 2009;5:369-77) 및 양자점(Santra S, Yang H, Dutta D, Stanley JT, Holloway PH, Tan W, et al. TAT conju-gated, FITC doped silica nanoparticles for bioimaging applications. Chem Commun 2004;24:2810-1), 양자막대(Xu G, Yong KT, Roy I, Mahajan SD, Ding H, Schwartz SA, et al. Bioconjugated quantum rods as targeted probes for efcient transmigration across an in vitro blood-brain barrier. Bioconjug Chem 2008;19:1179-85)와 Cy5.5-NHS(Pham W, Zhao B-Q, Lo EH, Medarova Z. Crossing the blood-brain barrier: a potential application of myristoylated polyarginine for in vivo neuro-imaging. Neuroimage 2005;28:287-92)과 같은 영상화를 위한 특이적 펩티드 결합된 물질뿐 아니라, TAT(전사활성화 인자)와 CTP(세포질 신호전달 펩티드)(Kim D, Jeon C, Kim J-H, Kim M-S, Yoon C-H, Choi I-S, et al. Cytoplasmic transduction peptide (CTP): New approach for the delivery of biomolecules into cytoplasm in vitro and in vivo. Exp Cell Res 2006;312: 1277-88)의 유효성이 보고된 바 있고, 또 다른 경우에서는 종양 혈관계를 표적으로 하는 고리형 펩티드(RGDyK)와 BBB-투과성 Angiopep-2 펩티드를 PAMAM-G5 덴드리머에 표지하여 성공적인 뇌 종양 MRI와 체내 광학 영상을 나타내었다(Yan H, Wang L, Wang J, Weng X, Lei H, Wang X, et al. Two-order targeted brain tumor imaging by using an optical/paramagnetic nanoprobe across the blood brain barrier. ACS Nano 2012;6:410-20). 나아가, AMT 계는 양전하 물질과 음전하를 띤 원형질막 표면 사이의 정전기적 상호작용에 의해 작동되는 물질로써, 세포 표면 결합 부위와 AMT 계의 상호작용은 세포내 이입과 세포통과를 유도하는 것이 알려져 있다(Ye Q, Asherman J, Stevenson M, Brownson E, Katre NV. DepoFoam tech-nology: a vehicle for controlled delivery of protein and peptide drugs.J Control Release 2000;64:155-66).
최근, 안지오펩타이드(angiopep)가 결합된 폴리에틸렌글라이콜(PEG)-변성 나노입자(Xin H, Jiang X, Gu J, Sha X, Chen L, Law K, et al. Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(ε-caprolactone) nanoparticles as dual-targetingdrugdeliverysystemfor brain glioma. Biomaterials 2011;32: 4293-305), Tet1 펩티드-변성 PEG 전달 매체(Kwon EJ, Lasiene J, Jacobson BE, Park I-K, Horner PJ, Pun SH. Targeted nonviral delivery vehicles to neural progenitor cells in the mouse subventricular zone. Biomaterials 2010;31:2417-24), TGNPEG-PLGA(Li J, Feng L, Fan L, Zha Y, Guo L, Zhang Q, et al. Targeting the brain with PEG-PLGA nanoparticles modied with phage-displatyed peptides. Biomaterials 2011;32:4943e50)와 락토페린-PEG PLA 나노입자(Hu K, Li J, Shen Y, Lu W, Gao Z, Zhang Q, et al. Lactoferrin-conjugated PEG-PLA nanoparticles with improved brain delivery: in vitro and in vivo evaluations. J Control Release 2009;134:55e61)와 같은 RMT 및 AMT-결합된 나노입자가 뇌를 표적으로 하는 전달을 이해 적용된 바 있다. 그러나, 입자 자체 또는 조영제 전달을 위한 이들 모든 계는 단백질의 뇌 전달을 나타내지 못하는 문제점이 있다.
본 발명의 해결하고자 하는 과제는 표적 뇌조직에 전달될 수 있는 뇌조직 약물 전달시스템으로서, 나노전달체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 상기 나노전달체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 과제는 상기 나노전달체를 포함하는 뇌질환 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 상기 나노전달체를 포함하는 뇌질환 진단용 영상화제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 키토산기 및 뇌조직 표적화 펩티드가 결합된 플루로닉 기반 나노전달체를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 플루노닉 고분자를 아크릴화된 수용성 키토산으로 부분치환하여 나노전달체를 얻는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 얻은 나노전달체의 키토산에 포함된 아민기를 말레이미드기(MAL)-폴리에틸렌글라이콜(PEG)-N하이드록시숙신이미드(NHS)와 결합시켜 말레이미드기 및 폴리에틸렌글라이콜이 결합된 나노전달체를 얻는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)에서 얻은 말레이미드기 및 폴리에틸렌글라이콜이 결합된 나노전달체에 뇌조직 표적화 펩티드를 결합시키는 단계;를 포함하는 상기 뇌 표적 나노전달체의 제조방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 나노전달체를 포함하는 뇌질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 나노전달체를 포함하는 뇌질환 진단용 영상화제를 제공한다.
본 발명에 의한 뇌조직 표적화 펩티드와 키토산이 결합된 플루로닉 고분자를 포함하는 뇌조직 표적화 나노전달체는 BBB를 통과하는 뇌 표적화와 생체활성 상태로서 약물의 전달을 위해서도 효과적일 뿐만 아니라, 뇌표적 특정 서열을 가지는 펩티드와 키토산의 상승효과는 표적화 효능을 크게 증진시키고, 뇌안의 축적을 연장하는 효과가 우수하므로, 본 발명의 나노전달체는 단백질 및 유전물질뿐만 아니라 미래의 다른 치료제와도 조합하여 전달하는 뇌 표적 전달 매체용으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 일실시예의 뇌조직 표적화 펩티드(광견병 바이러스 당단백질의 단편)와 키토산이 결합된 플루로닉계 나노전달체의 제조방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 일실시예의 나노전달체의 1H-NMR 스펙트럼 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 일실시예의 나노전달체의 온도 감응성 크기 변화를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명에 따른 일실시예의 나노전달체로부터 β-갈락토시다아제의 방출 양상을 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명에 따른 일실시예의 나노전달체의 정맥 내 주사 후의 누드 마우스의 (a) 체내 및 (b) 체외 NIR 형광 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명에 따른 일실시예의 나노전달체의 정맥 내 주사 후의 누드 마우스의 희생 후, (a) 뇌에 축적된 나노 전달체 및 (b) 주요 기관에 분포된 나노전달체의 정량화 그래프를 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명에 따른 일실시예의 나노전달체의 (a) 뇌조직 축적 공초점 현미경 사진(스케일바: 200 ㎛) 및 (b) 정량화 그래프를 나타내는 도면이다.
도 8은 본 발명에 따른 일실시예의 나노전달체 투여 후, 누드마우스의 (a) 뇌의 동결절편에서 X-gal 염색에 의해 평가한 β-갈락토시다아제 효소 활성의 분석 및 (b) 뇌 X-gal 염색의 확대 사진(스케일바: 200 μm)을 나타내는 도면이다.
도 9는 본 발명에 따른 일실시예의 나노전달체 투여 후, 누드마우스의 (a) 뇌에서 β-갈락토시다아제 효소 활성을 정량 분석한 그래프 및 (b) 정맥 내 주사 후 48시간에 마우스 뇌, 비장, 간, 심장, 폐와 신장에 대한 조직 무게(g)당 주사 투여량 비율을 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 종래의 혈액-뇌-장벽(BBB)의 침윤성으로 인해 뇌를 표적으로 하는 약물 또는 조영제의 경우, 뇌 내로 전달이 어려운 문제점이 있고, 뇌 조직에 치료용 단백질을 전달하는 것은 단백질의 크기와 물리-화학적 특성에 의해 더욱 제한되는 등의 문제점을 해결하고자, 뇌조직 표적화 펩티드가 결합된 키토산으로 부분 치환된 플루로닉 고분자를 포함하는 뇌 표적 나노전달체를 제조하고, 뇌 조직에 선택적으로 전달될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 뇌조직 표적화 펩티드가 결합된 키토산으로 부분 치환된 플루로닉 고분자를 포함하는 뇌 표적 나노전달체를 제공한다.
이때, 상기 나노전달체에서 플루로닉 고분자와 키토산은 아실화 반응을 통해 플루로닉 고분자와 아크릴화된 수용성 키토산이 결합된 형태이다.
또한, 본 발명에 따른 상기 뇌조직 표적화 펩티드는 광견병 바이러스 당단백질 단편이다.
이때, 상기 광견병 바이러스 당단백질 단편은 서열번호 1 내지 5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나이고, 바람직하게는 서열번호 1에 해당하는 단편이다.
구체적으로, 본 발명에 따른 상기 나노전달체는 플루로닉 고분자와 키토산을 아실화 반응을 수행하여 플루로닉 고분자에 수용성 키토산을 도입하여 표면을 개질하고, 상기 키토산에 뇌조직에 특이적으로 전달 가능한 뇌조직 표적화 펩티드, 예를 들어 광견병 바이러스 당단백질의 단편을 부착시킴으로써, 정맥주사 등에 의해서 표적 뇌조직에 전달될 수 있는 뇌조직 약물 전달시스템으로의 나노전달체이다.
나아가, 본 발명에 따른 나노전달체의 크기는 30-100 nm인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 50-70 nm이다.
상기 범위를 벗어나는 경우, 특히, 나노전달체의 크기가 30 nm 미만인 경우, 정맥 주사시, 모세혈관 벽을 통해 유출되어 선택적으로 약물을 전달하기 어려운 문제점이 있고, 100 nm 초과인 경우, 대식세포에 의해 나노전달체가 제거가 될 수 있는 문제점이 있다.
본 발명의 플루로닉 고분자는 폴리에틸렌옥사이드(PEO)-폴리프로필렌옥사이드(PPO)-폴리에틸렌옥사이드(PEO)의 구조를 갖는 고분자로써, 화학적으로 가교된 안정한 구조, 시험관내 및 체내 안정성, 단백질 담지의 용이성과 효율성 및 비-세포 독성뿐만 아니라, 온도 감응성과 같은 여러 이점이 있는 고분자이다.
이때, 사용가능한 본 발명에서 플루로닉 고분자의 분자량은 8000-15000 달톤(Da)을 사용할 수 있고, 바람직하게는 8500-13000 Da를 사용할 수 있으나, 이에 한정하지 않으며, 상기 범위는 특정 플루로닉의 폴리에틸렌옥사이드 (PEO)-폴리프로필렌옥사이드 (PPO)-폴리에틸렌옥사이드(PEO)의 구조적 특성에 따른 분자량의 범위를 지정하여 선택할 수 있다.
또한, 본 발명의 키토산은 음전하를 띄는 양이온성 리간드로서 키토산은 나노전달체의 활성 수송을 용이하게 할 수 있으며, 뇌혈관장벽(BBB)의 통과를 용이하게 하기 위하여 도입되었다.
이때, 사용가능한 상기 키토산의 분자량은 1-50 킬로달톤(kDa)이고, 바람직하게는 5-10 kDa이다.
상기 범위에 따라 도입된 수용성 키토산은 나노전달체의 양이온성을 위해 선택된 범위이며, 수용성 키토산으로서의 특성을 위한 분자량의 범위로서 상기 명시된 범위가 적당하다. 해당 범위의 키토산은 분자량에 따라 도입가능하며, 양이온성의 차이에 따라 선택되어질 수 있다.
나아가, 상기 키토산의 탈아세트화도는 80-95%인 것을 사용하는 것이 바람직하다.
키토산의 탈아세트화도가 높을수록 상기 플루로닉 고분자와의 결합 수율이 높아지는 장점이 있다.
또한, 본 발명의 뇌조직에 특이적으로 전달 가능한 서열을 가지는 뇌조직 표적화 펩티드, 예를 들어 광견병 바이러스 당단백질 단편인 RVG는 신경세포에서 니코틴성 아세틸콜린 수용체(AchR)와 특이적으로 상호작용하고 뇌 내에서 역행성 축삭 운반을 매개하고 바이러스성 벡터의 분포를 증가시키는 역할을 수행한다.
본 발명에 따른 나노전달체의 약물 봉입 효율 및 뇌조직에 선택적으로 약물의 전달 효과를 확인하기 위하여 광견병 바이러스 당단백질 단편으로서 특이적 서열을 가지는 펩티드가 결합된 플루로닉계 나노전달체 내 β-갈락토시다아제의 봉입 효율 및 방출 효과, 나노전달체 투여 후, 누드 마우스 뇌의 체내 광학 영상 촬영, 뇌의 체외 영상 측정 및 뇌에 전달된 나노전달체에 봉입된 β-갈락토시다아제의 조직화학 분석, 주요 기관과 뇌에서 β-갈락토시다아제의 체내 효소활성 측정 실험을 수행한 결과, 약물 봉입 효율이 우수하고(실험예 4 및 5 참조), 약물 방출 효과가 우수하고(실험예 6 참조), 누드마우스의 정맥내에 본 발명의 나노전달체를 투여한 결과, 누드마우스의 머리근처에서 나노전달체의 신호가 관찰되었으며, 누드마우스 희생 후, 주요기관의 나노전달체의 위치를 확인한 결과, 다른 기관에 비해서 뇌에 분포되어 있음을 확인하였다(실험예 7 및 8 참조). 또한, 본 발명의 나노전달체를 투여한지 48시간 이내에 뇌의 모든 영역에서 약물에 대한 효과를 나타내는 것을 확인하였다(실험예 9 및 10 참조).
본 발명에 의한 뇌조직 표적화 펩티드와 키토산이 결합된 플루로닉 고분자를 포함하는 나노전달체는 BBB를 통과하는 뇌 표적화와 생체활성 상태로서 약물의 전달을 위해서도 효과적이고, 뿐만 아니라, 뇌조직 표적화 펩티드와 키토산의 상승효과는 크게 표적화 효능을 증진시키고, 뇌 안의 축적을 연장시키는 효과가 우수하므로 본 발명에 따른 나노전달체는 단백질 및 유전물질뿐만 아니라 미래의 다른 치료제와도 조합하여 전달하는 뇌 표적 전달 매체용으로 유용하게 사용될 수 있다.
나아가, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 상기 뇌 표적 나노전달체의 제조방법을 제공한다:
(a) 플루노닉 고분자를 아크릴화된 수용성 키토산으로 부분치환하여 나노전달체를 얻는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 얻은 나노전달체의 키토산에 포함된 아민기와 말레이미드기(MAL)-폴리에틸렌글라이콜(PEG)-N하이드록시숙신이미드(NHS)를 결합시켜 말레이미드기 및 폴리에틸렌글라이콜이 결합된 나노전달체를 얻는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)에서 얻은 말레이미드기 및 폴리에틸렌글라이콜이 결합된 나노전달체에 뇌조직에 특이적으로 전달 가능한 뇌조직 표적화 펩티드를 결합시키는 단계.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 (a)는 플루노닉 고분자 및 수용성 키토산을 이용하여, 키토산으로 부분 치환된 나노전달체를 도입하는 단계로써,플루로닉 고분자 및 아크릴화된 수용성 키토산을 아실화 반응시켜 키토산을 도입하여 표면을 개질하는 단계이다.
구체적으로, 인산염 완충용액 상에서 플루로닉 고분자와 아크릴화된 수용성 키토산을 2-4시간 동안 반응시켜 본 발명의 플루로닉 고분자의 비닐기를 키토산으로 부분 치환한 후, 광개시제를 첨가한 다음 UV광을 10-20분 동안 조사하여 키토산이 결합된 플루로닉 고분자를 포함하는 나노전달체를 얻을 수 있다.
이때, 인산염 완충용액의 산도(pH)는 7.5 내지 8.5로 제조하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 8.0 내지 8.2로 제조하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 UV광은 1.0 내지 1.5 mW/cm2의 크기로 조사할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
나아가, 본 발명의 플루로닉 고분자의 분자량은 1800-15000 달톤(Da)을 사용할 수 있고, 바람직하게는 8500-13000 Da를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 (b)는 상기 단계 (a)에서 얻은 나노전달체의 키토산과 MAL-PEG-NHS를 반응시켜 본 발명의 나노전달체 상의 1차 아미노기와 이종 2 관능성 PEG와 NHS기 사이의 특이적 반응에 의해 MAL-PEG가 결합된 나노전달체를 얻는 단계이다.
이때, 본 발명의 MAL-PEG-NHS의 첨가 비율은 상기 단계 (a)에서 얻은 나노전달체의 아민기에 대하여 1:1.5-2.5의 몰 비율로 첨가되는 것이 바람직하다.
상기 범위를 벗어나는 경우, 특히, MAL-PEG-NHS에 따른 첨가 비율이 표적화 펩타이드의 결합과 연관이 있으므로, 나노전달체의 아민기에 대하여 1.5 몰 미만으로 첨가되는 경우, 표적 펩타이드가 적게 결합되어 나노전달체로서의 효율이 떨어지는 문제점이 있고, 2.5 몰 초과로 첨가되는 경우, 나노전달체에 남아있는 아민기의 수가 적어지므로 키토산의 양전하성 효과가 떨어지는 문제점이 있다.
한편, 본 발명에서는 중간 링커로서 작용하는 NHS-PEG-MAL의 MAL과의 콘쥬게이션을 위해 RVG와 같이 각 펩타이드는 말단에 시스테인 간기가 추가된 펩티드 모델을 사용하였다.
나아가, 본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 (c)는 상기 단계 (b)에서 얻은 말레이미드기 및 폴리에틸렌글라이콜이 결합된 나노전달체에 뇌조직에 특이적으로 전달 가능한 서열을 가지는 뇌조직 표적화 펩티드, 예를 들어 광견병 바이러스 당단백질 단편을 결합시키는 단계이다.
상기 단계 (c)에 있어서, 말레이미드기는, 예를 들어 뇌조직 표적화 서열을 가지는 펩티드로서 광견병 바이러스 당단백질 단편인 RVG를 사용하는 경우, 티올기 사이에서 특이적 반응에 의해 뇌조직 표적화 서열을 가지는 펩티드가 키토산 상에 결합될 수 있다.
이때, 본 발명의 상기 단계 (b)에서 얻은 말레이미드기 및 폴리에틸렌글라이콜이 결합된 나노전달체에는 시스테인과 같은 -SH 서열이 포함된 다양한 특정 펩티드 또한 결합가능하다.
또한, 본 발명은 뇌조직 표적화 펩티드가 결합된 키토산으로 부분 치환된 플루로닉 고분자를 포함하고, 뇌조직에 약물을 전달하기 위한 뇌 표적 나노전달체를 포함하는 뇌질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 나노전달체는 약물 봉입 효율이 우수하고(실험예 4 및 5 참조), 약물 방출 효과가 우수하고(실험예 6 참조), 누드마우스의 정맥내에 본 발명의 나노전달체를 투여한 결과, 누드마우스의 머리근처에서 나노전달체의 신호가 관찰되었으며, 누드마우스 희생 후, 주요기관의 나노전달체의 위치를 확인한 결과, 다른 기관에 비해서 뇌에 분포되어 있음을 확인하였다(실험예 7 및 8 참조). 또한, 본 발명의 나노전달체를 투여한지 48시간 이내에 뇌의 모든 영역에서 약물에 대한 효과를 나타내는 효과(실험예 9 및 10 참조)가 있으므로, 나노전달체 내에 약물을 봉입하여 투여함으로써, 뇌질환 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
이때, 상기 약물은 뇌질환 치료용 약물로써, 레보도파, 렘베르디메본, 가바(GABA), 니플루믹산 및 이의 프로드러그 등의 약물을 본 발명의 나노전달체에 봉입하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 뇌질환은 뇌암, HIV 뇌증, 뇌전증(간질), 파킨슨병 및 알츠하이머병 등을 포함한다.
나아가, 본 발명은 뇌조직 표적화 펩티드가 결합된 키토산으로 부분 치환된 플루로닉 고분자를 포함하는 뇌 표적 나노전달체를 포함하는 뇌질환 진단용 영상화제를 제공한다.
본 발명의 나노전달체는 누드마우스의 다른 기관보다 뇌에 대부분 분포되어 있으므로(실험예 7 및 8 참조), 나노전달체 내에 MRI 및 PET 조영제 등을 봉입함으로써, 뇌질환 진단용 영상화제로 유용하게 사용될 수 있다.
이때, 상기 MRI 조영제는 상자성 물질, 가돌리늄과 망간의 착화합물 형태로써, Gd-DTPA, Gd-DTPA-BMA, Gd-DOTA, Gd-DO3A 및 초상자성 물질인 산화철 등으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종이고, 상기 PET 조영제로서 방사성 동위원소 18F, 124I, 64Cu, 99 mTc 및 11In 등으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종이고, 킬레이트 DOTA 및 DTPA 착화합물 형태로서 나노운반체에 도입 가능하다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 실시예 및 실험예에 의해 한정되지는 않는다.
시료
(1) 플루로닉 F 127(PEO 100 PPO 65 PEO 100, MW 12,600)(이하, PF 127)을 BASF Corp.(Seoul, Korea)로부터 제공받았다.
(2) 아크릴로일 클로라이드, 트리에틸아민, 무수 톨루엔, 시스테아민, 글리시딜 메타크릴레이트(GMA), 닌히드린 시약(2 % 용액), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 β-D-갈락토피라니시드(X-gal), 칼륨 헥사시아노페레이트(III), 칼륨 헥사시아노페레이트(II) 3수화물, 핵 고속 적색(nuclear fast red) 용액과 β-갈락토시다아제 효소 분석 시약[β-갈락토시다아제(15 kU, 대장균 유래), 인산나트륨, o-니트로페닐 β-D-갈락토시드(ONP-Gal), 염화마그네슘, 2-메르캅토에탄올(2-ME)]은 알드리치(Milwaukee, WI, USA)로부터 구입하였다.
(3) 4-(2-히드록시에톡시) 페닐-(2-히드록시-2-프로필) 케톤(Irgacure 2959)은 Ciba Specialty Chemicals Inc.(Basel, Switzerland)으로부터 제공되었다.
(4) 수용성 키토산[키토올리고당, 분자량 약 10 kDa, 탈아세틸화도 = 85.0%]은 Kittolife Co., Ltd.(Seoul, Korea)로부터 구입하였다.
(5) Cy5.5의 단일-반응성 히드록시숙신이미드 에스테르(NHS-cy5.5)는 Amersham Bioscience(Piscataway, NJ, USA)로부터 구입하였다.
(6) 이종 2관능성 폴리에틸렌 글리콜, α-말레이미드-ω-N-히드록시-숙신이미드 에스테르 폴리에틸렌 글리콜(MAL-PEG-NHS, MW: 2.1 kDa)은 Creative PEGWorks(Winston-Salem, NC, USA)으로부터 구입하였다.
(7) RVG29-시스펩타이드(Cyspeptide)는 AnyGen, Inc.(Gwangju, Korea)로부터 구입하였다.
(8) 메르마플루오르 수용성 봉입제(PermaFluor Aqueous Mounting) 매질은 Thermo scientific(Fremont, CA, USA)로부터 구입하였다. 모든 화학물질은 분석용으로, 더 이상 정제하지 않고 사용하였다.
플루로닉계 나노전달체를 단일상 광중합에 의해 제조하였다. 또한 추가 결합을 위한 소수의 아민기가 있는 나노전달체 단독(Bare-형) 또는 키토산-관능화된 나노전달체(Chito-형)를 이전에 보고된 바에 따라 제조하였다.
< 제조예 1> 아민이 결합된 플루노닉 고분자를 포함하는 베어-형( bare - type ) 나노전달체의 제조
베어-형 나노전달체를 제조하기 위하여, 시스테아민(0.35 mg/0.3 ㎖)을 DA-PF 127(14 mg/154 ㎕)와 인산염 완충액(pH 8.1) 중에서 3시간 반응시켜 마이클-타입(Michael-type) 반응에 의해 DA-PF127의 비닐기를 아민기로 부분 치환하였다. 그 다음, 상기 반응 용액을 탈이온수로 희석하여 0.77 중량%의 DA-PF127을 제조하였다. 상기 용액에 광개시제(Irgacure 2959, 0.05 중량%)를 첨가한 다음, UV광(1.3 mW/cm2)을 15분간 조사한 후, 상기 관능화된 나노전달체 용액을 투석막(셀룰로오스 에스테르, MWCO 300 kDa)으로 투석하여 아민이 결합된 플루로닉 고분자를 포함하는 베어-형 나노전달체를 얻었다.
닌히드린 분석법을 이용하여 분석한 결과, 플루로닉 고분자에 대한 아민-관능화도는 2.1 중량%로 확인되었다.
< 제조예 2> 키토산이 결합된 플루로닉 고분자를 포함하는 키토 -형( Chito - type ) 나노전달체의 제조
상기 제조예 1에서 시스테아민을 사용하는 대신 아크릴화된 수용성 키토산(2.8 mg, 0.2 μmol)(GMA-chitosan)을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법을 수행하여 키토산이 결합된 플루로닉 고분자를 포함하는 키토-형 나노전달체를 얻었다.
닌히드린 분석법을 이용하여 분석한 결과, 플루로닉 고분자에 대한 키토산-관능화도는 11.4 중량%로 확인되었다.
< 실시예 1> 광견병 바이러스 당단백질 단편( RVG29 - Cys ) 및 키토산이 결합된 플루로닉 고분자를 포함하는 키토 -형 나노전달체의 제조
단계 1: 말레이미드기 - PEG 및 키토산이 결합된 플루로닉 고분자를 포함하는 키토 -형 나노전달체의 제조
PBS(pH 8.0, 0.3 ㎖)에서 상기 제조예 2에서 얻은 키토-형 나노전달체(1.6 mg, 1.27 μmol의 아민기)를 MAL-PEG-NHS(0.13 mg, 0.67 μmol, 나노전달체의 아민:MAL-PEG-NHS = 2:1)와 상온에서 3시간 동안 반응시켰다. 미반응 이종 이관능성 PEG를 제거하기 위해서 용액 전체를 투석막(셀룰로오스 에스테르, MWCO 300 kDa)을 이용하여 투석하고 동결건조하여 MAL-PEG-NC를 얻었다.
단계 2: 광견병 바이러스 당단백질 단편( RVG29 - Cys ) 및 키토산이 결합된 플루로닉 고분자를 포함하는 키토-형 나노전달체의 제조
상기 단계 1에서 얻은 MAL-PEG-NC를 PBS(pH 7.0, 0.3 ㎖)에서 펩티드 RVG29-Cys(2.9 mg, 0.8 μmol)와 48시간 동안 상온에서 반응시켜 MAL-PEG-NC의 MAL기와 RVG29-Cys의 티올기 사이의 특이적 반응에 의해 나노전달체에 RVG29-Cys를 결합시켰다. 미반응 펩티드 RVG29-Cys를 제거하기 위해서 생성물 용액을 투석하였고(셀룰로오스 에스테르, MWCO 300 kDa), 광견병 바이러스 당단백질 단편(RVG29-Cys) 및 키토산이 결합된 플루로닉 고분자를 포함하는 키토-형 나노전달체를 얻었다.
< 비교예 1> 광견병 바이러스 당단백질 단편( RVG29 - Cys )이 결합된 플루로닉 고분자를 포함하는 베어-형 나노전달체의 제조
상기 실시예 1에서 키토-형 나노전달체를 사용하는 대신 상기 제조예 1에서 얻은 베어-형 나노전달체(1.7 mg, 1.34 μmol의 아민기)를 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법을 수행하여 광견병 바이러스 당단백질 단편(RVG29-Cys)이 결합된 플루로닉 고분자를 포함하는 베어-형 나노전달체를 얻었다.
< 실험예 1> 1 H- NMR 특성 분석
상기 실시예 1 및 비교예 1에서 제조된 광견병 바이러스 당단백질 단편이 결합된 나노전달체를 핵자기공명(NMR) 분광법(DMSO 중, JNM-ECX-400P, JEOL, Japan)에 의해 분석하였다.
결과
도 2에 나타낸 바와 같이, 1) 6.7 ppm 위치에서 NHS-PEG-MAL의 특징적인 MAL기 피크가 확인되었고, 2) RVG-PEG-NC의 MAL기는 없어지는 것을 알 수 있는데, MAL기가 펩티드 RVG29-Cys의 티올기와 반응하였음을 시사하는 것으로써, 본 발명에 따른 광견병 바이러스 당단백질 단편이 결합된 나노전달체의 메틸 양성자는 1.9 ppm 위치에서 확인되었다.
< 실험예 2> 광견병 바이러스 당단백질 단편이 결합된 나노전달체의 크기와 표면 전하의 변화 측정
광견병 바이러스 당단백질 단편이 결합된 나노전달체의 온도 감수성 크기 변화 및 표면 전하 변화를 전기영동 광산란 분광계(ELS-Z, Otsuka Electronics Co., Japan)를 이용하여 측정하였다. 무처리군 1 및 2의 광견병 바이러스 당단백질 단편이 결합되지 않은 키토형 나노전달체 및 베어형 나노전달체의 크기 및 표면 전하 데이터는 종래 보고된 자료를 통해 확인하였다.
결과
(1) 나노전달체의 직경 변화
하기 표 1 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 광견병 바이러스 당단백질 단편을 나노전달체에 부착한 결과, 크기에 유의적인 영향을 주지 않았으며, 본 발명에 따른 실시예 1(광견병 바이러스 당단백질 단편이 결합된 키토형 나노전달체) 및 비교예 1(광견병 바이러스 당단백질 단편이 결합되지 않은 베어형 나노전달체)는 각각 광견병 바이러스 당단백질 단편이 결합되지 않은 키토형 나노전달체(무처리군 1)와 베어형 나노전달체(무처리군 2)의 크기와 유사한 크기로 형성하고 있음을 확인하였으며, 온도 감수성 크기 변화를 나타냄에 따라, 나노전달체에 대한 광견병 바이러스 당단백질 단편의 결합은 나노전달체의 구조에 영향을 주지 않음이 확인되었다.
구분 크기(nm)
4 ℃ 25 ℃ 37 ℃
실시예 1
(RVG-Chito-NC)		 511±38
(0.34±0.01)		 162±22
(0.30±0.01)		 65±14
(0.30±0.02)
비교예 1
(RVG-Bare-NC)		 463±33
(0.28±0.02)		 155±27
(0.29±0.01)		 58±12
(0.31±0.01)
무처리군 1
(Chito-NC)		 392±41
(0.27±0.02)		 142±44
(0.29±0.02)		 61±12
(0.31±0.02)
무처리군 2
(Bare-NC)		 423±33
(0.22±0.02)		 148±36
(0.24±0.01)		 52±10
(0.22±0.02)
(2) 나노전달체의 표면 전하 변화
표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1 및 비교예 1의 제타 전위 역시 광견병 바이러스 당단백질 단편의 결합에 의해서 영향을 받지 않았으나, 실시예 1의 광견병 바이러스 당단백질 단편이 결합된 키토형 나노전달체는 광광견병 바이러스 당단백질 단편이 결합되지 않은 키토형 나노전달체(무처리군 1)와 유사한 제타 전위를 나타내는 것을 확인하였고, 비교예 1의 광견병 바이러스 당단백질 단편이 결합된 베어형 나노전달체 및 광견병 바이러스 당단백질 단편이 결합되지 않은 베어형 나노전달체(무처리군 2)보다는 제타 전위가 더 큰 것이 확인됨에 따라 되었다. 키토산-결합이 주로 나노전달체의 표면 전하 상태를 결정하는 것으로 판단된다.
구분 제타전위
(mV, 25 ℃)
실시예 1
(RVG-Chito-NC)		 11.3±0.6
비교예 1
(RVG-Bare-NC)		 1.9±1.1
무처리군 1
(Chito-NC)		 12.8±2.4
무처리군 2
(Bare-NC)		 2.1±1.3
< 실험예 3> 나노전달체에 대한 광견병 바이러스 당단백질 단편의 결합 효율 측정
도 1에 나타낸 바와 같이, 나노전달체에 대한 광견병 바이러스 당단백질 단편의 결합 효율을 측정하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
나노전달체를 근적외선(NIR) 형광색소분자인 Cy5.5 분자로 화학적으로 표지한 후, NHS-Cy5.5를 실시예 1 및 비교예 1의 나노전달체에 남아 있는 아민기와 반응시켜 나노전달체에 부착하였다. 탈이온수(2 ㎖)에서 각각의 나노전달체(15 mg)를 NHS-Cy5.5(25 μg)와 상온에서 5시간 동안 암조건으로 반응시키고, 미반응 염료를 2일 동안 탈이온수 중에서 투석(셀룰로오스 에스테르, MWCO 300 kDa)에 의해 제거한 후, 광광견병 바이러스 당단백질 단편 결합효율을 주사 다중-웰 분광광도계(FL600, Bio-Tek　, Winooski, VT, USA)로 광견병 바이러스 당단백질 단편 RVG29-Cys 중 트립토판(Trp) 잔기의 형광세기(Ex = 280 nm, Em = 355 nm)를 측정하였고, 치환도는 형광 분광광도계(F-7000, HITACHI, Japan)에 의해 특성 분석하였다(Ex=675 nm, Em=694 nm).
결과
각각의 실시예 1 및 비교예 1의 나노전달체에 대한 광견병 바이러스 당단백질 단편의 결합 효율은 81%(나노전달체 1.8 중량%)인 것으로 확인되었고, 염료 치환도는 0.08% 이하로 측정되었다.
< 실험예 4> 광견병 바이러스 당단백질 단편이 결합된 플루로닉계 나노전달체 내 β- 갈락토시다아제의 봉입 효율
본 발명에 따른 광광견병 바이러스 당단백질 단편이 결합된 플루로닉계 나노전달체 내 β-갈락토시다아제의 봉입 효율을 측정하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
본 발명에 따른 각각의 실시예 1, 비교예 1 및 무처리군 1 및 2의 나노전달체(15 mg)를 100 μg의 β-갈락토시다아제를 함유하는 0.5 ㎖ 수용액과 혼합한 다음, 4 ℃에서 12시간 동안 배양하여 나노전달체 안에 단백질이 자발적으로 담지되도록 유도하였다.
나노전달체 내 β-갈락토시다아제의 봉입 효율과 담지량을 10분간 상온에서 14,000 rpm으로 스핀 여과 후, 매질 내 잔류 단백질 양을 측정하였다.
결과
측정 결과, 본 발명에 따른 본 발명에 따른 각각의 실시예 1, 비교예 1 및 무처리군 1 및 2의 나노전달체 내에 β-갈락토시다아제가 90% 이상으로 봉입된 것을 확인하였다.
< 실험예 5> β- 갈락토시다아제가 봉입된 광견병 바이러스 당단백질 단편이 결합된 플루로닉계 나노전달체의 크기와 표면 전하의 변화 측정
본 발명에 따른 β-갈락토시다아제가 봉입된 광견병 바이러스 당단백질 단편이 결합된 플루로닉계 나노전달체의 크기 및 표면 전하를 측정하기 위하여 상기 실험예 2와 같이, 전기영동 광 산란 분광계(ELS-Z, Otsuka Electronics Co., Japan)를 이용하여 측정하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
구분
 크기(nm) 제타전위
(mV,25 ℃)
4 ℃ 25 ℃ 37 ℃
실시예 1
(β-갈락토시다아제 봉입)		 532±26
(0.31±0.01)		 148±31
(0.33±0.01)		 63±32
(0.31±0.01)		 12.1±0.8
비교예 1
(β-갈락토시다아제 봉입) 		503±37
(0.31±0.02)		 152±28
(0.33±0.01)		 62±31
(0.31±0.03)		 2.4±1.2
표 3에 나타낸 바와 같이, 나노전달체에 β-갈락토시다아제를 봉입한 결과, 나노전달체의 크기 및 이의 제타 전위에 있어서 주목할 만한 변화가 전혀 나타나지 않았다. 또한, 크게 음전하를 띤 β-갈락토시다아제(pI ~ 4.4)를 담지한 후 제타 전위 변화가 전혀 없다는 것은 본 발명에 따른 나노전달체에 β-갈락토시다아제가 효율적으로 담지되었다는 것을 뒷받침한다.
< 실험예 6> β- 갈락토시다아제가 봉입된 광견병 바이러스 당단백질 단편이 결합된 플루로닉계 나노전달체로부터 β- 갈락토시다아제의 시험관내 방출 효과 측정
본 발명에 따른 광견병 바이러스 당단백질 단편이 결합된 플루로닉계 나노전달체의 방출량 조절 효과를 알아보기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
상기 실험예 4에서 얻은 각각의 β-갈락토시다아제가 담지된 나노전달체 현탁액(0.5 ㎖)을 투석막(셀룰로오스 에스테르, MWCO 300 kDa)에 넣고 10% 우태아 혈청(FBS)이 부가된 5 ㎖ 인산 완충 식염수(PBS, 0.05% NaN3)에 위치시키고 37 ℃의 진탕 라커에서 100 rpm으로 유지하여 분석하였다. 각 시점에서 방출 매질 전체를 새로운 것으로 대체하였다. 각 시점에서 방출된 β-갈락토시다아제의 양은 β-갈락토시다아제 효소 분석 장치를 이용하여 분석하였다(n=3).
시약들(시약 A: 100 mM 인산나트륨 용액, 시약 B: 100 mM 인산나트륨 완충액, 시약 C: 68 mM ONP-Gal, 시약 D: 30 mM 염화마그네슘 용액, 시약 E: 3.36 M 2-ME)은 Sigma Procedure Information(Sigma Prod., Milwaukee, WI, USA)에 준하여 제조하였다.
시약 B를 적당한 pH 조건에서(37 ℃에서 pH 7.4) 시약 A와 혼합하고 4 ℃에서 보관하였다. 다음, 이 혼합물(A+B, pH 7.4, 1.3 ㎖)을 시약 D(50 ㎕)와 시약 E(50 ㎕)와 혼합한 다음, β-갈락토시다아제(50 ㎕)를 함유하는 방출 매질을 첨가하였다. 이 혼합액을 37 ℃에서 2분간 배양한 다음, 시약 C(50 ㎕)를 첨가하였다. 410 nm에서 흡광도를 측정하고 β-갈락토시다아제의 기지 농도를 이용하여 얻은 표준 그래프 곡선으로부터 β-갈락토시다아제의 농도를 계산하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
결과
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1, 비교예 1 및 무처리군 1 및 2의 나노전달체들은 표면 변성과 펩티드 결합과 관계없이 방출 양상은 유사하였다. 유사한 방출 패턴에 따라, 각각 상이한 나노전달체로부터 서로 다른 뇌 축적과 단백질의 체내 분포는 각종 나노전달체의 전달 특성에 기인한 것임이 분명하다.
따라서, 본 발명에 따른 나노전달체는 β-갈락토시다아제와 같은 단백질 약물용 전달 운반체로서 유용하게 사용될 수 있다.
< 실험예 7> 누드 마우스 뇌의 체내 광학 영상 촬영
체내 동물 실험을 위해서 6주령의 웅성 흉선 누드 마우스(C3H/HeN, Oriental Bio Co., Seongnam, Korea)를 이용하였고 광주과학기술원(GIST) 실험동물운영위원회의 안내지침에 따라 다루었다. 4종의 실시예 1, 비교예 1 및 무처리군 1 및 2의 나노전달체(5 mg/kg)를 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사하였다. 나노전달체를 정맥내 주사한지 2시간, 16시간, 24시간과 48시간 후에 광학 영상을 IVIS 100 영상 장치(xenogeny Corp., Alameda, CA, USA)를 이용하여 촬영하였다. 형광노출시간은 10초이었고 시야는 12.5 cm로 유지하였다. 675 nm 광을 이용하여 Cy5.5 분자를 여기시키고, 시간-상관 단광자 계수 장치를 이용하여 발광을 수집하였다.
또한, 주요 기관과 뇌에서 각종 나노전달체의 체내 분포를 얻기 위해서 나노전달체를 마우스에 정맥내 주사한지 2시간, 24시간과 48시간 후에 마우스를 희생시켰다. 뇌, 간, 폐, 비장, 심장과 신장과 같은 적출 기관의 NIR 형광 영상을 얻었다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
결과
(1) 나노전달체의 정맥내 주사 후, 누드 마우스의 체내 NIR 형광 측정 결과
도 5a에 나타낸 바와 같이, 무처리군 2(Bare-NC)의 경우에는 전체적으로 약한 NIR 형광 신호가 검출되었다. 초기 시점(2시간)에서는 신장 가까이에서 약한 신호가 검출되었지만, 이후 전신에서 형광 신호가 시간경과에 따라 감소하는 것으로 확인되었고, 이에 비해 무처리군 1(Chito-NC)의 경우에는 2시간째에 신체 다른 부분에 비해 머리 가까이에서 강한 형광신호를 나타내었지만, 이후 시간경과에 따라 감소하는 것으로 확인되었으나, 비교예 1(RVG-Bare-NC)의 경우에는 머리 근처에서 강한 형광세기가 2시간 내지 12시간 그리고 24시간째에는 증가하였지만, 48시간째에는 감소하는 것으로 확인되었다. 이에 따라, 순환 중에 뇌에 대한 일정부분 표적화 가능성이 확인되었다.
한편, 본 발명에 따른 실시예 1(RVG-Chito-NC)의 경우에는 머리 근처에서 초기부터 매우 강한 신호가 관찰되었고, 48시간까지 크게 감소하지 않고 그대로인 반면에 신체 다른 부분에서의 신호는 48시간째에 명백하게 감소하는 것으로 확인되었다.
(2) 마우스 희생 후, 주요기관의 체외 NIR 형광 측정 결과
도 5b에 나타낸 바와 같이, 보다 정확하게 분석하게 위해서 주사한지 2시간, 24시간과 48시간 후에 마우스를 희생시키고 뇌 뿐 아니라 주요 기관(간, 폐, 비장, 심장과 신장)을 적출하고 이들 기관의 형광세기를 평가하였다.
그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1의 나노전달체(RVG-Chito-NC)는 다른 모든 나노전달체보다 뇌에서 유의적으로 더 높은 세기를 보였는데, 이는 효율적인 뇌 표적화를 위해 키토산과 RVG가 필요하다는 것을 입증하고 있다.
또한, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 48시간 후의 체내 분포 측정 결과, 본 발명에 따른 실시예 1의 나노전달체(RVG-Chito-NC)의 표적-특이적으로 전달하는 것을 확인하였고, 가장 강한 신호는 여전히 간으로부터 비롯되었지만, 실시예 1의 나노전달체는 나머지 나노전달체보다 뇌로부터의 신호가 절대적으로 가장 높은 것으로 확인되었고, 뿐만 아니라, 실시예 1의 나노전달체는 다른 나노전달체보다 간을 포함한 다른 기관에서의 세기에 비해 뇌에서의 세기가 탁월하게 높이 나타나는 것으로 확인되었다.
< 실험예 8> 광견병 바이러스 당단백질 단편이 결합된 나노전달체를 정맥내 주사한 후 뇌의 체외 영상 측정
실시예 1 및 비교예 1의 나노전달체에 Cys5.5를 표지한 후, 정맥 내 주사한지 48시간 후에 희생시킨 마우스의 뇌를 PBS로 세척하고, 24시간 동안 4%(w/v) 포름알데히드 용액으로 고정한 후, 탈이온수로 세척하였다. 상기 뇌를 염색시약인 OCT 화합물에서 동결하고, 80 ℃에서 보관한 다음, 20 μm 두께로 절개하였다. 상기 OCT 화합물을 제거하기 위해서 상기 절편을 탈이온수로 5분 동안 2번 세척하고 봉입매로 봉입하였다. 뇌 절편의 영상을 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM, Fluo View FV1000, Olympus, Japan)을 이용하여 기록하였다.
결과
도 7a에 나타낸 바와 같이, 뇌에서 Cy5.5-표지된 나노전달체를 나타내는 적색 형광 점들은 비교예 1의 나노전달체(RVG-Bare-NC)보다는 실시예 1의 나노전달체(RVG-Chito-NC)에서 훨씬 더 많이 존재하는 것을 확인되었다.
특히, 하기 표 4 및 도 7b에 나타낸 바와 같이, 4종의 나노전달체의 뇌 축적을 정량 분석 결과, 광견병 바이러스 당단백질 단편(RVG)이 뇌 축적에 효과적이었지만, 키토산과의 상승작용이 훨씬 더 효과적이었음을 명확히 증명하고 있다. 따라서 본 발명에 따른 실시예 1의 나노전달체(RVG-Chito-NC)가 뇌를 표적으로 하는 축적에 있어 최적인 것으로 판단된다.
구분 상대 강도(a.u.)
실시예 1
(RVG-Chito-NC)		 5.5
비교예 1
(RVG-Bare-NC)		 2.7
무처리군 1
(Chito-NC)		 0.1
무처리군 2
(Bare-NC)		 0.1
< 실험예 9> 뇌에 전달된 β- 갈락토시다아제의 조직화학 분석
본 발명에 따른 나노전달체의 BBB 통과 여부를 확인하기 위해서, 하기 실험을 수행하였다.
본 발명에 따른 실시예 1, 비교예 1 및 무처리군 1 및 2의 나노전달체 각각을 정맥 내 주사 한지 2시간, 24시간과 48시간 후에, 또한 식염수 또는 β-갈락토시다아제를 정맥 내 주사한 대조군의 뇌와 주요 기관을 희생시켰다.
뇌에 전달된 β-갈락토시다아제의 특성을 X-gal 염색에 의해 분석하였다. 건조되지 않도록 뇌 절편을 가습실에서 X-gal 모액(DMSO 중 4 % X-gal, 희석 완충액 중 희석비 1:40)과 혼합한 X-gal 희석 완충액(PBS 중 5 mM 칼륨 시안화제2철 결정, 5 mM 칼륨 시안화제2철 삼수화물과 2 mM MgCl2) 중 37 ℃에서 2시간 동안 배양하였다. 뇌 절편을 PBS로 5분간 세척한 후 탈이온수로 세척하였다. 대조 염색을 위해서 절편을 핵 고속 적색 용액으로 5분간 배양한 다음, 탈이온수로 짧은 시간 세척하였다. 이 뇌 절편을 봉입매로 봉입하고 형광 현미경(TE2000-U, Nikon Co, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하였다.
결과
도 8a 및 도 8g에 나타낸 바와 같이, 유리 β-갈락토시다아제를 정맥내 주사하였더니 뇌에서 검출될만한 효소활성을 보이지 않았다. 무처리군 1 및 2의 나노전달체를 사용한 경우, 효소 활성은 초기 시간(2시간)에 희미하게 관찰된 다음, 시간 경과에 따라 사라졌다. 한편, 비교예 1의 나노전달체의 경우, 정맥내 주사한 후에 효소 산물이 뇌에서 조직화학에 의해 분명하게 검출되었지만, 실시예 1의 나노전달체를 이용한 경우에서, 훨씬 크고 긴 효소활성의 검출이 관찰되었다. 특히, 실시예 1의 나노전달체를 정맥내 주사한 지 48시간 내에 뇌의 모든 영역에서 큰 β-갈락토시다아제 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
< 실험예 10> 주요 기관과 뇌에서 β- 갈락토시다아제의 체내 효소활성
본 발명에 따른 나노전달체에 의한 뇌 및 주요기관에서의 β-갈락토시다아제의 체내 효소 활성을 알아보기 위하여 주요 기관과 뇌 전달을 효소활성 검사를 수행하였다.
희생시킨 기관(뇌, 간, 폐, 비장, 심장과 신장) 내 β-갈락토시다아제 양을 측정하였다. 탈이온수로 균질화한 후(IKA ULTRA-TURRAX T25 digital, IKA, Japan)(모터 속도: 24,000 rpm에서 1분간), 균질액을 10분간 12,000 rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 이용하여 β-갈락토시다아제 효소활성을 측정하였다. β-갈락토시다아제의 시험관내 방출에서 이용한 방법을 이용하여 각 기관 내 β-갈락토시다아제의 농도를 측정하였다.
결과
(1) 뇌 내의 β- 갈락토시다아제 효소 활성의 정량 분석
도 9a에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1의 나노전달체를 이용한 경우, 뇌에서 가장 높은 β-갈락토시다아제 효소활성이 발견되었고 또한 뇌에서 오래 잔류하였다. 나아가 식염수 또는 β-갈락토시다아제를 주사한 대조군 마우스는 검출될만한 효소활성을 갖지 않았는데, 이는 상기 실험예 6의 X-gal 염색 결과와 부합한다.
또한, 도 9b에 나타낸 바와 같이, 외부 전위를 인가하지 않고도 최적의 실시에 1의 나노전달체는 주사한 지 48시간 이후에 뇌 조직 그램 당 주사 투여량의 25% 이상의 수치를 나타내는 것을 확인하였다.
한편, 이는 나노전달체의 체내 분포와 동일한 경향성을 나타냈고(도 6b 참조), 이 결과를 통해 뇌 표적화에 대한 RVG와 키토산의 효능과 상승작용이 확인된다. 이에, 본 발명에 따른 나노전달체의 효소 약물에 대한 뇌-표적 전달 매체로서도 효과적이고 전달된 효소는 생물학적 활성이 유지되었음을 명확히 입증되었다.
본 발명에 의한 광견병 바이러스 당단백질 단편과 키토산이 결합된 플루로닉 고분자를 포함하는 뇌표적 나노전달체는 BBB를 통과하는 뇌 표적화와 생체활성 상태로서 약물의 전달을 위해서도 효과적이고, 뿐만 아니라, 광견병 바이러스 당단백질 단편과 키토산의 상승효과는 크게 표적화 효능을 증진시키고 뇌 내 축적을 연장하는 효과가 있으므로, 본 발명의 나노전달체는 단백질 및 유전물질뿐만 아니라 미래의 다른 치료제와도 조합하여 전달하는 뇌 표적 전달 매체용으로 유용하게 사용될 수 있다.
<110> Gwangju Institute of Science and Technology <120> Brain targeting nano-carrier containing pluoronic polymer comprising brain targeting peptide capable of specifice delivery to brain tissue and chitosan <130> HPC-3265 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RVG PEPTIDE <400> 1 Tyr Thr Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Gly Thr Pro Cys Asp Ile 1 5 10 15 Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Asn Gly Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Cys <210> 2 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CTP PEPTIDE <400> 2 Gly Ala Thr Cys Cys Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys 1 5 10 15 Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Cys Gly Cys Gly Gly Cys Gly 20 25 30 Thr Ala Ala Thr Cys 35 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TGN PEPTIDE <400> 3 Thr Gly Asn Tyr Lys Ala Leu His Pro His Asn Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Cys <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Angiopep-2 PEPTIDE <400> 4 Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr 1 5 10 15 Glu Glu Tyr Cys 20 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT-1 PEPTIDE <400> 5 His Leu Asn Ile Leu Ser Thr Leu Trp Lys Tyr Arg Cys 1 5 10

Claims (16)

  1. 광견병 바이러스 당단백질 단편(RVG29-Cys) 및 키토산이 결합된 폴리에틸렌옥사이드(PEO)-폴리프로필렌옥사이드(PPO)-폴리에틸렌옥사이드(PEO)의 구조를 갖는 플루로닉 고분자를 포함하는 뇌 표적 나노전달체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 플루로닉 고분자 및 키토산은 플루로닉 고분자와 아크릴화된 수용성 키토산을 아실화 반응을 통해 결합하는 것을 특징으로 하는 나노전달체.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 광견병 바이러스 당단백질 단편은 서열번호 1 내지 5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 나노전달체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 나노전달체 크기는 300-100 nm인 것을 특징으로 하는 나노전달체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 플루로닉 고분자의 분자량은 8000-15000 달톤(Da)인 것을 특징으로 하는 나노전달체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 키토산의 분자량은 5-15 킬로달톤(kDa)인 것을 특징으로 하는 나노전달체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 키토산의 탈아세트화도는 80-95%인 것을 특징으로 하는 나노전달체.
  9. (a) 폴리에틸렌옥사이드(PEO)-폴리프로필렌옥사이드(PPO)-폴리에틸렌옥사이드(PEO)의 구조를 갖는 플루노닉 고분자에 아크릴화된 수용성 키토산을 결합하여 나노전달체를 얻는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 얻은 나노전달체의 키토산에 포함된 아민기를 말레이미드기(MAL)-폴리에틸렌글라이콜(PEG)-N-하이드록시숙신아미드(NHS)와 결합시켜 말레이미드기 및 폴리에틸렌글라이콜이 결합된 나노전달체를 얻는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)에서 얻은 말레이미드기 및 폴리에틸렌글라이콜이 결합된 나노전달체에 뇌조직에 특이적으로 전달 가능한 광견병 바이러스 당단백질 단편(RVG29-Cys)을 결합시키는 단계;
    를 포함하는 제1항의 뇌 표적 나노전달체의 제조방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제1항의 뇌 표적 나노전달체를 포함하는 뇌조직 영상화제.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 영상화제는 영상화제의 나노전달체 내에 MRI 또는 PET 조영제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 봉입하여 사용하는 것을 특징으로 하는 영상화제로서,
    상기 MRI 조영제는 가돌리늄과 망간의 착화합물 형태로써, Gd-DTPA, Gd-DTPA-BMA, Gd-DOTA, Gd-DO3A 및 초상자성 물질인 산화철로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하며,
    상기 PET 조영제는 방사성 동위원소 18F, 124I, 64Cu, 99 mTc 및 11In로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종이고, 킬레이트 DOTA 또는 DTPA 착화합물 형태로서 나노운반체에 도입 가능한 것을 특징으로 하는 뇌조직 영상화제.
  15. 삭제
  16. 삭제
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