KR20200098384A - 세균 유래 세포 외막 소포체를 포함하는, 혈액-뇌 장벽 투과용 약물 전달체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세균 유래 세포 외막 소포체 (outer membrane vesicle, OMV)를 포함하는, 혈액-뇌 장벽 (Blood-Brain Barrier, BBB) 투과용 약물 전달체 및 세균 유래 세포 외막 소포체 (outer membrane vesicle, OMV)에 뇌질환 치료용 물질이 담지된, 뇌질환 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것으로, 상기 약물 전달체는 뇌의 혈액-뇌 장벽 (Blood-Brain Barrier, BBB)을 통과하여 효과적으로 뇌에 전달되므로, 뇌내 약물 등의 물질 전달이 가능해져 다양한 뇌질환 치료 및 진단에 기여할 수 있으며, 인체 공생세균의 세포 외막 소포체에 의한 뇌질환의 발생기전에 새로운 단서를 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

세균 유래 세포 외막 소포체를 포함하는, 혈액-뇌 장벽 투과용 약물 전달체{Medicament carrier for permeation of a blood-brain barrier comprising bacterial-derived cell outer membrane vesicles}

본 발명은 세균 유래 세포 외막 소포체 (outer membrane vesicle, OMV)를 포함하는, 혈액-뇌 장벽 (Blood-Brain Barrier, BBB) 투과용 약물 전달체 등에 관한 것이다.

혈액-뇌 장벽 (Blood-Brain Barrier; BBB)은 관련된 혈관주위세포 (pericytes) 및 성상세포 (astrocytes)와 접하는 혈관내피세포 간의 0.1 Ω·m 이상의 고도로 높은 전기적 저항성을 갖는 치밀한 연결 (tight junctions)로 구성된 세포 장벽이며, 중추신경계 (central nervous system; CNS)에서 뇌 세포 외액 (brain extracellular fluid)으로부터 순환하는 혈액을 분리하는 고도로 선택적인 투과성을 갖는 장벽으로서, 뇌로의 영양 및 다른 물질의 출입을 조절함으로써 중추신경계를 보호하는 관문 역할을 한다.

통상, 혈액-뇌 장벽은 뇌 기능에 필수적인 글루코스 및 아미노산과 같은 분자들을 선택적으로 이동시킬 뿐만 아니라, 수동적 확산 (passive diffusion)에 의해 물, 몇가지 기체 및 지용성 분자를 통과시킨다. 반면, 혈액-뇌 장벽은 투과성 당단백질 (p-glycoprotein)에 의해 매개되는 능동적 전달 기전에 의해 친유성, 잠재적 신경독소의 출입을 차단한다. 혈액-뇌 장벽은 모든 모세혈관을 따라 형성되며 정상 순환에는 존재하지 않는 모세혈관 주위의 치밀한 연결로 구성된다.

이와 같이, 혈액-뇌 장벽은 혈액을 통해 운반될 수 있는 박테리아, 병원체 및 혈액 내 잠재적 위험물질이 뇌로 전달되는 것을 차단하는 역할을 하지만, 이러한 혈관 장벽으로 인해, 대부분의 중추신경계 약물도 경두개 (transcranial) 전달에 대해 낮은 효율을 나타내며, 이를 보상하기 위하여 이들 약물을 고용량으로 투여하게 되므로 주변 장기에 심각한 부작용을 유발하기도 한다. 따라서, 부정적인 전신 효과를 방지하는 동시에, 화학 약물 (chemodrug)의 치료 효과를 보장하기 위하여 혈액-뇌 장벽을 투과할 수 있는 효율적인 약물 전달 시스템의 발굴이 요구된다.

한편, 외막 소포체 (outer membrane vesicle, 이하 OMV)는 박테리아의 외막(outer membrane)에서 균체 외부로 분출되어 분비되는 20~200 나노미터 크기의 소포체 (vesicle)로서, 박테리아의 외막에 풍부하게 존재하는 지질다당류 (lipopolysaccharide, 이하 LPS)와 외막단백질 (outer membrane protein)들로 구성된 불용성막으로 둘러 싸여진 내공 (lumen)에 다양한 단백질, RNA, DNA등을 포함하고 있으며 끊임없이 생성되어 세균 밖으로 분비된다. 이러한 OMV의 응용 가능한 분야로서 백신, 어주번트, 분비시스템 등에 대한 연구는 있으나 외막 소포체를 혈액-뇌 장벽 통과를 위한 약물 전달체로 이용한 연구는 전무한 실정이다.

대한민국등록특허공보 10-1740895호

본 발명자는 혈액-뇌 장벽의 통과가 가능한 약물 전달체에 대하여 예의 연구한 결과, 세포 외막 소포체가 혈액-뇌 장벽을 통과하여 뇌로 직접 전달되는 것을 확인하였으며 나아가, 세포 외막 소포체 내의 물질 등이 뇌로 함께 전달 될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 세균 유래 세포 외막 소포체 (outer membrane vesicle, OMV)를 포함하는, 혈액-뇌 장벽 (Blood-Brain Barrier, BBB) 투과용 약물 전달체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 세균 유래 세포 외막 소포체 (outer membrane vesicle, OMV)에 뇌질환 치료용 물질이 담지된, 뇌질환 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 세균 유래 세포 외막 소포체 (outer membrane vesicle, OMV)에 뇌질환 진단용 물질이 담지된, 뇌질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세균 유래 세포 외막 소포체 (outer membrane vesicle, OMV)를 포함하는, 혈액-뇌 장벽 (Blood-Brain Barrier, BBB) 투과용 약물 전달체를 제공한다.

또한, 본 발명은 세균 유래 세포 외막 소포체 (outer membrane vesicle, OMV)에 뇌질환 치료용 물질이 담지된, 뇌질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 세균 유래 세포 외막 소포체 (outer membrane vesicle, OMV)에 뇌질환 진단용 물질이 담지된, 뇌질환 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 세균은 그람 음성 세균 또는 그람 양성 세균일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 그람 음성 세균은 아그레가티벡터 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세균 유래 세포 외막 소포체는 5 내지 200 nm의 직경을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 뇌질환은 뇌졸중, 중풍, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 루게릭병, 헌팅턴병, 피크 (Pick)병, 크로이츠펠트-야콥 (Creutzfeld-Jakob)병, 혈전증 (thrombosis), 색전증 (em-bolism), 일과성 허혈 발작 (transient ischemic attack), 소경색 (lacune), 뇌일혈, 뇌경색, 두부손상 (head trauma), 뇌순환대사장애, 뇌 기능혼수 및 뇌암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 진단용 조성물은 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물, 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 뇌질환 예방 또는 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 뇌질환 예방 또는 치료용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 세균 유래 세포 외막 소포체의 뇌질환 치료제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.

본 발명의 약물 전달체는 혈액-뇌 장벽 (Blood-Brain Barrier, BBB)을 효과적으로 통과하므로, 고용량의 약물 투여로 인한 주변 장기의 심각한 부작용 없이 뇌에 약물 등의 물질 전달이 가능해져 다양한 뇌질환 치료 및 진단에 기여할 수 있으며 나아가, 인체 공생세균의 세포 외막 소포체에 의한 뇌질환의 발생기전에 관한 새로운 단서도 제공할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 인체에 유용한 세균 혹은 프로바이오틱 유래의 세포 외막 소포체를 뇌에 전달하여 면역반응을 최소화한 새로운 뇌질환 치료 도구로 사용할 수 있다.

도 1a는 Aa OMV 및 OMV 용해물 정제 과정의 개략도를 나타낸 것으로, 정제 키트를 사용하여 OMV를 정제하고, RNase A 또는 DNase I을 사용하여 OMV 샘플에서 유리 핵산을 제거하였다.
도 1b는 Aa OMV의 투과 전자 현미경 사진을 나타낸 것으로, 왼쪽 이미지는 직경 10-60 nm의 작은 소포를 나타내며, 오른쪽 이미지는 파괴된 Aa OMV 입자를 나타낸다. 이미지의 원배율은 X 15,000이다. Scale bar=100 nm.
도 1c는 활성화된 U937 세포로 Aa OMV 및 RNA의 자발적 전달을 확인한 결과이다. Aa OMV (4.5 X 10¹¹ 입자) 및 OMV 용해물 (4.5 X 10¹¹ OMV 입자와 동일한 양의 단백질)은 지질 추적 염료 DiD (빨간색) 및 RNA-특이염료 Syto RNA-Select (녹색)로 전염색하였으며, 염색된 OMV 및 OMV 용해물을 37 ℃에서 24 시간 동안 활성화된 U937과 함께 배양하였다. Aa OMV의 공초점 현미경 분석 결과, 공동화하는 OMV를 나타내고 RNA (오버레이)를 함유한 반면, OMV 용해물은 RNA 신호를 나타내지 않았다. 모든 이미지의 원배율은 X1000 이다. Scale bar=5 μm.
도 2a는 Aa OMV가 마우스의 BBB를 통과하는 것을 확인하기 위해, 마우스 뇌 (피질)을 2차원 라이트시트 형광 현미경으로 분석한 결과를 나타낸 것이다. 지질 추적 염료를 OMV 또는 PBS (대조군)로 처리한 다음 초원심분리하여 비혼입 염료를 제거한 후, 염색된 OMV 또는 PBS의 심장 주사 24 시간 후에 마우스 뇌를 관류시키고, 브레인 클리어링 (클레어리티) 기술을 사용하여 제거하였다. 렉틴을 주입하여 뇌 혈관 (녹색)을 나타내고, OMV는 지질 추적 염료 DiD (빨간색)로 인해 빨간색으로 표시된다. Scale bar=100 μm.
도 2b는 Aa OMV를 마우스에 주사하기 전에 지질 추적 염료 DiD (빨간색) 및 RNA- 특이적 염료 Syto RNA-Select (녹색)로 전염색하였다. 염색된 OMV의 심장 주사 후 4 시간 및 24 시간에 마우스 뇌를 관류시켰다. 24 시간 뒤 피질 영역은 적색 반점 (OMV) 및 녹색 반점 (OMV 내부의 RNA)을 나타내며, RNA를 함유하는 OMV는 BBB를 통과할 수 있었으나, 4 시간 뒤 OMV는 뇌 혈관에 남아있다. Scale bar=50μm.
도 3은 OMV의 BBB 통과 및 uptake 여부를 확인하기 위한 생체 내 뇌조직을 영상화한 것이다 (OMV를 흡수한 CX3CR+ 세포의 위치 : →, 혈관 내부; ▲, 혈관 외부).

본 발명자는 혈액-뇌 장벽의 통과가 가능한 약물 전달체에 대하여 예의 연구한 결과, 세포 외막 소포체가 뇌의 혈액-뇌 장벽을 통과하여 뇌로 직접 전달되는 것을 확인하였으며 나아가, 세포 외막 소포체 내의 물질 등이 뇌로 함께 전달될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 실시예에서는, 아그레가티박터 액티노마이세템코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans)의 정제 및 농축을 통해 세포 외막 소포체 획득이 가능함을 확인하였다 (실시예 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 마우스에 본 발명의 약물 전달체를 혈관을 통해 주사시 세포 외막 소포체 및 소포체에 포함된 RNA가 혈액-뇌 장벽을 통과하여 뇌로 직접 전달되는 것을 확인하였다 (실시예 3 내지 실시예 4참조).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 세균 유래 세포 외막 소포체 (outer membrane vesicle, OMV)를 포함하는, 혈액-뇌 장벽 (Blood-Brain Barrier, BBB) 투과용 약물 전달체를 제공한다.

본 발명의 세균은 특정한 세균으로 한정되지는 아니하며, 그람 양성 세균 및 그람 음성 세균을 포함한다. 상기 그람 음성 세균은 아그레가티벡터 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 외막 소포체는 기원이 되는 세포의 세포막 이외의 성분으로써 표적유도 물질 (targeting molecule), 표적세포와의 세포막 융합에 필요한 물질 (fusogen), 사이클로덱스트린, 또는 폴리에틸렌클리콜 등을 포함할 수 있고, 상기 세포막 이외의 성분은 다양한 방법에 의해 추가될 수 있으며, 세포막의 화학적 변형 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 세균 유래 세포 외막 소포체 (outer membrane vesicle, OMV)에 뇌질환 치료용 물질이 담지된, 뇌질환 치료용 약학적 조성물을 포함한다.

또한, 본 발명은 세균 유래 세포 외막 소포체 (outer membrane vesicle, OMV)에 뇌질환 진단용 물질이 담지된, 뇌질환 진단용 조성물을 포함한다.

본 발명에서 상기 소포체의 크기는 치료용 물질 또는 진단용 물질이 필요한 조직에 따라 다양한 크기로 제조될 수 있고, 예를 들어 5 내지 200 nm, 5 내지 150 nm, 5 내지 100 nm, 5 내지 90 nm, 5 내지 85 nm, 5 내지 80 nm, 5 내지 80 nm, 5 내지 75 nm, 5 내지 70 nm, 5 내지 65nm, 10 내지 200 nm, 10 내지 150 nm, 10 내지 100 nm, 10 내지 90 nm, 10 내지 85 nm, 10 내지 80 nm, 10 내지 80 nm, 10 내지 75 nm, 10 내지 70 nm, 10 내지 65nm, 20 내지 200 nm, 20 내지 150 nm, 20 내지 100 nm, 20 내지 90 nm, 20 내지 85 nm, 20 내지 80 nm, 20 내지 80 nm, 20 내지 75 nm, 20 내지 70 nm, 또는 20 내지 65nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 소포체에 담지되는 물질은 특별히 제한되지 않으며, 뇌질환 치료용 또는 진단용 물질일 수 있고, 세포 외부에서 준비된 물질을 담지할 수 있으며, 담지되는 물질은 1개 또는 2개 이상일 수 있다.

상기 진단용 또는 치료용 물질은 뇌질환 치료용 약물, 펩타이드, 단백질, 독소, 핵산, 비드, 마이크로입자, 및 나노 입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 뇌질환 치료용 약물은 예를 들어, 레보도파, 렘베르디메본, 가바 (GABA), 니플루믹산 및 이의 프로드러그 등의 약물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 핵산은 DNA, RNA, 앱타머 (aptamer), LNA (locked nucleic acid), PNA (peptide nucleic acid), 및 모폴리노 (morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, 상기 나노입자는 산화철, 금, 은, 탄소나노튜브, 그래핀 양자점, 및 자기 비드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 진단용 조성물은 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지를 포함할수 있다.

검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하며, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물, 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등을 사용할 수 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 형광물로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있다. 방사성 동위원소로는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 표지는 형광단일 수 있다. 형광단은 예를 들어, BODIPY 493/503, BODIPY FL, BODIPY R6G, BODIPY 530/550, BODIPY TMR, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, BODIPY TR, 플루오레세인, 5(6)-카복시플루오레세인, 2,7-디클로로플루오레세인, N,N-비스(2,4,6-트리메틸페닐)-3,4,9,10-페릴렌비스 (디카복시미드, HPTS, 에틸 에오신, DY-490XL 메가스토크스 (MegaStokes), DY-485XL 메가스토크스 (MegaStokes), 아디론닥크 그린 (Adirondack Green) 520, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, YOYO-1, 5-FAM, BCECF, BCECF , 디클로로플루오레세인, 로다민 (rhodamine) 110, 로다민 123, 로다민 그린 (Green), YOPRO-1, SYTOX 그린, 나트륨 그린, SYBR 그린 I, 알렉사 플루오로 (Alexa Fluor) 500, FITC, Fluo-3, Fluo-4, 플루오로-에메랄드 (fluoro-emerald), YoYo-1 ssDNA, YoYo-1 dsDNA, YoYo-1, SYTO RNA-Select, 디베르사 그린 (Diversa Green)-FP, 드래곤 그린 (Dragon Green), 에바그린 (EvaGreen), 설프 그린 (Surf Green) EX, 스펙트럼 그린 (Spectrum Green), 오레곤 그린 (Oregon Green) 488, 뉴로트레이스 (NeuroTrace) 500525, NBD-X, 미토트랙커 그린 (MitoTracker Green) FM, 라이소트랙커 그린 (LysoTracker Green) DND-26, CBQCA, PA-GFP (활성화 이후), WEGFP (활성화후), FIASH-CCXXCC, 아자미 그린 모노머릭 (Azami Green monomeric), 아자미 그린 (Azami Green), EGFP (Campbell Tsien 2003), EGFP (Patterson 2001), 플루오레세인, 캐데 그린 (Kaede Green), 7-벤질아미노-4-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸, 벡슬 (Bexl), 독소루비신 (Doxorubicin), 루미오 그린 (Lumio Green) 및 수퍼글로 (SuperGlo) GFP로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 약물 전달체의 제형에는 제한이 없다

본 발명에서 사용하는 용어 "뇌질환"은 뇌혈관 또는 뇌신경 손상에 의해 뇌조직의 기능이 가역적 또는 비가역적으로 저하 또는 소실되는 병적상태 (pathologic condition)를 의미한다.

본 발명에서 상기 뇌질환은 뇌졸중, 중풍, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 루게릭병, 헌팅턴병, 피크 (Pick)병, 크로이츠펠트-야콥 (Creutzfeld-Jakob)병, 혈전증 (thrombosis), 색전증 (em-bolism), 일과성 허혈 발작 (transient ischemic attack), 소경색 (lacune), 뇌일혈, 뇌경색, 두부손상 (head trauma), 뇌순환대사장애, 뇌 기능혼수 및 뇌암으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 질병일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 뇌질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 뇌질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 약학적 조성물 (pharmaceutical composition)은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제, 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 "담체 (carrier)"란 비이클 (vehicle)이라고도 불리며, 세포 또는 조직 내로의 단백질 또는 펩타이드의 부가를 용이하게 하는 화합물을 의미하는 것으로서, 예를 들어 디메틸술폭사이드 (DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기물의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.

본 발명에서 "희석제 (diluent)"란 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 체액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다. 여기에 사용된 아젤라산을 함유하는 화합물들은 인간 환자에게 그 자체로서, 또는 결합 요법에서와 같이 다른 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형제와 함께 혼합된 약학적 조성물로서, 투여될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 분해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 근육 주입, 정맥내 주입, 심장내 주입, 피하 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 약물전달체는 뇌질환 치료를 위한 약학적 조성물에 1 pg 내지 30 g w/v%로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 대용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에서 “개체”란 척추동물이라면 제한되지 아니하나, 구체적으로는 인간, 마우스, 래트, 기니어 피그, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개, 고양이, 어류 및 파충류에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.

본 발명에서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 소포체에 뇌질환의 진단에 필요한 프라이머 (primer), 프로브 (probe), 안티센스 핵산 (antisense nucleic acid), 또는 항체 (antibody)가 담지 (loading)된 것을 포함하는, 뇌질환 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는, 뇌질환 진단용 키트를 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 실험방법

실시예 1-1. 배양

Aggregatibacter actinomycetemcomitans [Aa, American Type Culture Collection (ATCC) 33384; Manassas, VA, USA)를 혐기성 인큐베이터에서 뇌 심장 주입(BHI; Becton Dickinson, San Diego, CA, USA) 한천 플레이트에 접종 하였다. 24 시간 후, 콜로니를 골라 BHI 배지에서 48 시간 동안 배양하고, 혐기성 인큐베이터를 5 % CO₂, 5 % H₂ 및 90 % N₂에서 37 ℃로 유지시켰다. OMV 정제를 위해 상청액을 수집하고, RNA 분리 및 순도 평가를 위해 박테리아 펠렛을 수집 하였다.

U937 세포는 10 % 소 태아 혈청이 보충된 RPMI1640 배지에서 유지한 다음, 100 ng/ml의 프로피디움 모노아지드 (PMA; MilliporeSigma, MA, USA)로 48 시간 동안 대식세포로 분화시켰다.

실시예 1-2. OMV 샘플 준비

원하는 광학 밀도에 도달 할 때까지 BHI에서 Aa를 혐기적으로 성장시켰다. 박테리아 배양 상청액은 4 ℃에서 15 분 동안 6000g에서 원심 분리하여 수집하였으며, 수집된 상청액을 0.22mm 기공 필터 (MilliporeSigma)를 통해 여과하여 남은 박테리아를 제거한 후, 이어서 MasterFlex L / S 완전 펌프 시스템 (Cole-Parmer, VernonHills, IL, USA) 및 Pellicon 2 mini 한외 여과 모듈(MilliporeSigma)로 한외 여과를 수행하였다. OMV는 제조사의 프로토콜에 따라 ExoBacteria OMV Isolation Kits(SBI, PaloAlto,CA,USA)를 사용하여 여과 및 농축된 상청액으로부터 수득하였다. 단리된 OMV (50 μl)를 1μl의 RNaseA (1 U/μl; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)및 DNase I (2 U/μl; ThermoFisher Scientific)로 1ml의 OMV로 처리하고 37 ℃에서 25 분 동안 배양하였다. ExoBacteria OMV 분리 키트를 사용하여 OMV를 다시 정제하였다.

물리적 OMV 용해를 위해, 1ml의 OMV를 5 회 동결 및 해동 한 다음 30 초 동안 초음파 처리 한 다음 30 초 동안 얼음에 넣었다. 이어서, 1 μl의 RNase A 또는 DNase I을 1 ml의 용해된 OMV에 첨가하고 37 ℃에서 25 분 동안 배양하였다 (도 1a 참조). 정제된 OMV의 멸균성을 점검한 후, 필요할 때까지 -80 ℃에서 보관하였다.

염색을 위해, OMV (PBS에 100μl에 용해됨) 및 PBS (100 μl, 염료 제어)를 37 ℃에서 1 시간 동안 2μM Syto RNA-Select 녹색 형광 세포 염색 키트 (Thermo Fisher Scientific) 및 10 μM 적색 형광 친유성 트레이서 1,1'-dioctadecyl-3,3,39,39-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate 염 (DiD; Thermo Fisher Scientific)과 함께 배양하였다. 샘플을 PBS로 1 회 세척한 다음 4 ℃, 150,000g에서 1 시간 동안 초원심분리시켰다.

온전한 OMV 및 용해된 OMV 모두 LPS에 대해 테스트하였다. LPS 농도는 Pierce LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation Kit(Thermo Fisher Scientific)로 제조사의 지시에 따라 측정되었다.

실시예 1-3. OMV 분석

OMV는 제조사의 프로토콜에 따라 NanoSight 시스템을 사용하여 나노 입자 추적 분석에 의해 분석되었다. 샘플을 PBS 1 ml의 총 부피의 100 배로 희석하였다. 입자농도는 브라운 운동에 기초하여 입자 크기를 측정하고, 각 샘플에서 입자 농도를 정량화 하였다. OMV 정량은 Bradford 시약 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)과 Nano-Sight 시스템을 사용하여 수행되었다.

실시예 1-4. 공 초점 레이저 스캐닝 현미경

염색된 OMV를 PMA 전처리 된 U937 세포에 첨가하고, 37 ℃에서 24 시간 동안 배양한 다음, PBS로 2 회 세척한 후 DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) 와 배양하였다. 염색된 OMV가 첨가된 세포를 레이저 스캐닝 공초점 현미경 (LSM Zeiss 700; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) 으로 시각화하였다.

실시예 1-5. 투과 전자 현미경

정제된 OMV 샘플을 PBS로 20회 희석하고 염색없이 200 메쉬 폼바르/카본 그리드 (Ted Pella, Redding, CA, USA) 에 적용하였다. OMV 샘플을 그리드상에서 밤새 건조시키고 100 kV로 작동하는 전자 현미경 (HT7700; Hitachi, Tokyo, Japan) 으로 관찰하였다.

실시예 1-6. 브레인 클리어링 (Brain clearing)

이소플루란(isoflurane) 기화기가 장착된 설치류 흡입 마취 장치 (VetEquip, Livermore, CA, USA)를 사용하여 마우스 (C57BL, 6 주령의 수컷)를 깊게 마취시켰다. 운반 기체로서, 100 % 산소를 400 ml/분의 유속으로 사용하고, 마우스에 4 또는 24 시간 동안 100 μl OMV 용액을 심장 주사 (cardiac injection)하였다. 그 다음, 바이나리 브레인 클리어링(Binaree Brain Clearing) 키트 (Cat. SHBC-001, Binaree, Korea)를 사용하여 뇌를 제거했다. 우선, 세척되지 않은 뇌를 4% 파라 포름알데히드 (paraformaldehyde)가 포함된 인산완충생리식염수에서 12시간 이상 고정시킨 다음, 고정된 뇌를 고정 용액 (fixing solution)에 24시간 동안 담근 다음 35 ℃에서 48시간 동안 진탕 배양기에서 조직 세척 용액으로 배양하였다. 그 다음, 세척액으로 3번 세척한 후 세척한 뇌를 마운팅 (mounting) 및 저장 (storage) 용액 (Cat. SHMS-050, Binaree, Korea)에서 배양하였다.

형광 신호는 5x / 0.1 이중 측광 광학계 (dual side illumination optic) 및 Plan-neofluar 5x / 0.16 대물 렌즈 (Zeiss)를 갖는 Lightsheet Z.1 형광 현미경 (Zeiss Corporation, Jena, Germany)을 사용하여 영상화 하였다. 형광 신호는 488 nm 및 638 nm 레이저로 여기(excited)되었고, 방출은 505-545 nm 및 660 nm 밴드 패스 필터로 감지되었다.

LSFM의 모든 이미지 데이터는 ZEN 소프트웨어 (Zeiss)의 czi 파일 유형으로 저장되었으며 이미지는 Arivis vison 4D 소프트웨어 (arivis-AG, Rostock, Germany) 및 Imaris 소프트웨어 (Bitplane, 미국)를 사용하여 재구성 및 3D 렌더링되었고 한국 뇌 연구소의 BRCF (Brain Research Core Facility)에서 상기 LSFM 이미지 및 이미지 렌더링 데이터 전체를 수집했다.

실험은 바이나리 (Binaree)에 의해 수행되었으며 동국대학교 동물 관리 기관 및 사용위원회에 의해 동물 실험 프로토콜(IACUC-2017-015)이 승인되었다.

실시예 2. Aa OMV 및 OMV 용해물의 정제, 및 대식세포로의 흡수

OMV 외부에서 DNA 및 RNA의 효과를 배제하기 위해, OMV 막 투과성이 아닌 DNase I 및 RNase A를 사용하여 실시예를 수행하였으며, 그에 따라 내부 핵산은 손상되지 않은 것으로 가정하였다.

먼저, 도 1a에 나타난 바와 같이, 분해된 Aa OMV (OMV 용해물)를 DNase I 및/또는 RNaseA로 처리한 후 OMV와 비교하였다.

도 1b에 나타난 바와 같이, Aa OMV 크기는 10 내지 60 nm 범위인 반면, OMV 용해물은 투과 전자 현미경에서 파괴된 입자만을 나타냄을 확인하였다.

그런 다음 내부 RNA를 사용하여 OMV의 공초점 현미경 분석을 수행하였다. OMV 및 OMV 용해물의 소포는 활성화된 U937 세포에서의 처리 후에 나타났다. Syto RNA-Select 시약은 막 투과성이므로, OMV 내부의 RNA를 라벨링하여 RNA가 U937 세포 내부의 OMV 막과 함께 위치 할 수 있었다.

그 결과, 도 1c에 나타난 바와 같이, OMV 용해물은 U937 세포에서 RNA를 포함하지 않는 것으로 나타났으며, 이는 RNA가 RNase A에 의해 완전히 제거되었음을 나타낸다.

실시예 3. Aa OMV를 운반하는 exRNA의 마우스 BBB를 통과 확인

생쥐와 인간의 엑소 좀과 같은 EV는 뇌로 전달되는 것으로 알려져 있지만, OMV에 의한 BBB의 교차 메카니즘은 불분명하였다. 이에, BBB를 가로 질러 Aa OMV가 자연적으로 뇌로 전달 될 수 있는지 시험하기 위해, Aa OMV를 마우스에 주사 하였다.

DiD 염료 및/또는 Syto RNA-Select 염색된 Aa OMV를 심장 내 주사 후, 마우스 뇌를 비운 후, 2D 및 3D 시각화 도구를 사용하여 RNA의 OMV 및 염색을 분석 하였다. 먼저, 심장 내 주사 24 시간 후에 염색된 OMV (RNA는 염색되지 않음)를 관찰하였다.

그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이, 붉게 염색된 소포는 혈관 (녹색 렉틴) 주위에 퍼져있는 반면, PBS 대조군은 신호를 보이지 않았다. 구체적으로, 마우스 두뇌(피질)의 뇌 혈관(녹색 부분)을 넘어 혈관 주위 전체에 붉은색(세포 외막 소포체, DiD로 염색)이 퍼져 있어 세포 외막 소포체가 혈액-뇌 장벽을 통과 했음을 확인하였다. 반면, 대조군인 인산완충생리식염수를 염색하여 마우스에 주입한 경우에는 혈관 주변에 붉은색의 세포 외막 소포체가 전혀 보이지 않음을 확인하였다.

다음으로, 염색된 OMV 및 RNA의 4 시간 및 24 시간 심장 내 주사 결과를 비교 하였다.

그 결과, 도 2b에 나타난 바와 같이, 4 시간 후, OMV 및 RNA는 여전히 혈관에 포획되어 있었지만, 24 시간 후에는 잘 퍼져있음을 확인하였다. 즉, 심장 내 주사 24 시간 후, OMV 및 RNA의 용량-의존적 신호가 관찰되었다. 녹색으로 표시되는 세포 외막 소포체와 함께 겹쳐진 사진 (ovrelay)에서도 세포 외막과 세포 외막 내 RNA가 함께 존재함을 확인하였다.

상기 결과는 세포 외막 소포체뿐만 아니라 그 내부에 담지된 물질도 함께 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있음을 의미한다

실시예 4. OMV의 BBB 통과 및 uptake 여부 확인

BBB를 통과하여 Aa OMV가 자연적으로 뇌로 전달 될 수 있는지 시험하기 위해, Aa OMV를 마우스에 주사 하였다.

CX3CR1+ 골수 단핵구 세포는 CX3CR1^{gfp /+}TG 마우스의 intrinsic GFP로 표지되었으며, OMV는 DID 염료로, 혈고나은 형광표지자와 결합된 항-CD31 항체를 정맥주사함으로써 표지하였다.

OMV 100 μL 주사시점을 기준으로 OMV 주사 직전, 주사 후 4 시간 및 8시간 시점에 생체 내 뇌조직의 영상화를 진행하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 4시간 시점에서 대부분의 OMV가 혈관 내부에서 관찰되었으나, 8시간 시점에서 혈관 내외부에 위치한 CX3CR1+ 세포에 의해 흡수된 것을 관찰하였다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (9)

1. 세균 유래 세포 외막 소포체 (outer membrane vesicle, OMV)를 포함하는, 혈액-뇌 장벽 (Blood-Brain Barrier, BBB) 투과용 약물 전달체.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 세균은 그람 음성 세균 또는 그람 양성 세균인 것을 특징으로 하는, 혈액-뇌 장벽 투과용 약물 전달체.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 그람 음성 세균은 아그레가티벡터 악티노마이세텀코미탄스 (Aggregatibacter actinomycetemcomitans)인 것을 특징으로 하는, 혈액-뇌 장벽 투과용 약물 전달체.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 세균 유래 세포 외막 소포체는 5 내지 200 nm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는, 혈액-뇌 장벽 투과용 약물 전달체.
   
5. 세균 유래 세포 외막 소포체 (outer membrane vesicle, OMV)에 뇌질환 치료용 물질이 담지된, 뇌질환 치료용 약학적 조성물.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 뇌질환은 뇌졸중, 중풍, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 루게릭병, 헌팅턴병, 피크 (Pick)병, 크로이츠펠트-야콥 (Creutzfeld-Jakob)병, 혈전증 (thrombosis), 색전증 (em-bolism), 일과성 허혈 발작 (transient ischemic attack), 소경색 (lacune), 뇌일혈, 뇌경색, 두부손상 (head trauma), 뇌순환대사장애, 뇌 기능혼수 및 뇌암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 뇌질환 치료용 약학적 조성물.
   
7. 세균 유래 세포 외막 소포체 (outer membrane vesicle, OMV)에 뇌질환 진단용 물질이 담지된, 뇌질환 진단용 조성물.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 조성물은 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는, 뇌질환 진단용 조성물.
   
9. 제8항에 있어서,
   상기 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 뇌질환 진단용 조성물.
   

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