JP2013185858A - 外膜ヴェシクルを用いた歯周病原細菌の検査方法及び測定用器具 - Google Patents

Abstract

【課題】精度良く簡便に歯周病等の診断に有用な唾液等の菌の外膜ヴェシクルを用いた菌の検査方法及びこの検査方法に使用する測定用器具を提供する。
【解決手段】検出を目的とする菌の外膜ヴェシクルを測定用器具の測定部に予め配置しておき、被験者から採取した検体を該測定部に接触させ、抗原抗体反応により検体内の前記外膜ヴェシクルに対応する抗外膜ヴェシクル抗体を検出する。この菌の検査方法を実施するための測定用器具は、検出を目的とする菌の外膜ヴェシクルが予め測定部に配置されている。
【選択図】なし

Description

本発明は、歯周病等の診断に有用な唾液等の歯周病原細菌の外膜ヴェシクルを用いた歯周病原細菌の検査方法及びこの検査方法に使用する測定用器具に関するものである。

歯周病疾患の対策としては、正しい歯磨きや定期検診によるプラークコントロール、食生活の改善等の予防行為が挙げられる。しかし現実的には、静かに進行する歯周病疾患を可能な限り早期に的確に発見し、その症状に適した治療を行うことが非常に重要なポイントとなっている。

歯周病の診断方法としては、歯周病原細菌の遺伝子中に存在する特定配列をインベーダー・アッセイ法を用いて検出する方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。このような遺伝子を用いた診断方法は特異性が高く正確に菌数を測定することができるものの、唾液等の検体を検査センターに一旦送り、検査センター内でＤＮＡの抽出，増幅等の専門操作を行う必要があるため、時間及び費用がかかるという欠点がある。

また歯周ポケットからの滲出液には、種々の酵素類が含まれていることを利用して、滲出液からの酵素を分析する診断方法が知られている（例えば、特許文献２参照。）。しかしながら、酵素は複数種類の菌が同じ酵素を放出するために菌種を正確に特定することができなかった。またこの方法は、５０〜６０℃で５〜３０分間インキュベーションする必要があるため、高価な装置及び複数の操作を要することから一般歯科診療室や集団検診で行うことが現実的ではなかった。

更に、歯肉に炎症が起きると歯周溝や歯周ポケットから出血が起こることが知られている。この唾液中に存在する潜血の濃度を潜血由来ヘモグロビンのペルオキシダーゼ様反応にて測定する方法もある（例えば、特許文献３参照。）。しかし、唾液中には好中球由来のミエロペルオキシダーゼや唾液ペルオキシダーゼが普遍的に存在しているために、この診断方法の精度は高くなかった。更に、診断直前のプロービング等の検査による出血を検出してしまう問題もあった。

特開２００７−２４４３４９号公報 特開平２−２６１３９６号公報 特開２００２−１８１８１５号公報

そこで本発明は、精度良く簡便に歯周病の診断が可能な歯周病原細菌の検査方法及びこの検査方法に使用する測定用器具を提供することを課題とする。

本発明者等は前記課題を解決するために鋭意検討した結果、歯周病原細菌の抗原性と免疫原性，病原性を保持する外膜ヴェシクル（OMV：outer membrane vesicle；以後、単にＯＭＶと称することがある。）に着目し、このＯＭＶを用いて唾液等に含まれている抗ＯＭＶ抗体を検出すれば、精度良く簡便に目的とする菌の存在や活性度を診断することが可能であることを究明して本発明を完成した。

即ち本発明は、検出を目的とする歯周病原細菌の外膜ヴェシクルを測定用器具の測定部に予め配置しておき、被験者から採取した検体を該測定部に接触させ、抗原抗体反応により検体内の前記外膜ヴェシクルに対応する抗外膜ヴェシクル抗体を検出することを特徴とする歯周病原細菌の検査方法、及びこの検査方法を実施するための検出を目的とする歯周病原細菌の外膜ヴェシクルが予め測定部に配置されていることを特徴とする測定用器具である。

本発明に係る外膜ヴェシクルを用いた歯周病原細菌の検査方法及び測定用器具は、精度良く簡便に歯周病原細菌の診断が可能な優れた検査方法及び測定用器具である。

本発明で用いる外膜ヴェシクルを得る方法は、例えば、検査を目的とする歯周病原細菌を培養してその培養上清を遠心分離する方法がある。その他にも培養上清を微小フィルターにかけることで精製する方法等がある。具体的には、検査を目的とする歯周病原細菌により、２５００〜５０００×ｇの遠心分離を１０〜２０分程度行い、その上澄み液を採取し、更に７００００〜１５００００×ｇの遠心分離を１〜４時間行い、上澄み液を除去することで得ることができる。

検査を目的とする歯周病原菌としては，例えば、Porphyromonas gingivalis(以下、P.gingivalisと言う。)、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Treponema denticola、Tannerella forsythia、Prevotella intermedia、Fusobacterium nucleatum/periodonticum、Campylobacter rectus、Eikenella corredens等がある。被験者から採取する検体としては、前記目的とする菌の存在する検体を適宜採取すればよく、例えば尿，血清，唾液，歯肉溝滲出液，歯垢等がある。中でも、歯肉溝滲出液，歯垢，唾液が検体としては好ましい。

検出を目的とする菌のＯＭＶを予め配置する測定用器具は、従来の抗原抗体反応を検出する測定用器具が使用できる。例えば、ＥＬＩＳＡ法であればマイクロプレートの穴底部を抗ＯＭＶ抗体の測定部としてＯＭＶを固定して配置する。固定方法は従来の抗原の固定方法が特に制限無く使用可能であり、ＯＭＶを炭酸バッファやＰＢＳ，ＴＲＩＳ液等に懸濁させ、この溶液をマイクロプレートの穴底部に添加し、液を乾燥させて物理的に吸着させる方法や、市販されているＥＬＩＳＡプレート作製キットを用いる方法等で固定することができる。

ＥＬＩＳＡ法での抗ＯＭＶ抗体を検出する方法は、前記の方法でＯＭＶを固定し修飾したマイクロプレートにウシ血清アルブミン溶液やスキムミルク溶液等でブロッキングを施した後、検体を添加し、抗体抗原反応により検体中の抗ＯＭＶ抗体をマイクロプレートの穴底部上に捕捉して、不純物を洗浄により除去する方法がある。更に、前記方法等で捕捉した抗体を特異的に認識する市販の酵素修飾抗体とその反応基質を用いて発色、蛍光させて明確に検出する方法もある。具体的にはアルカリホスファターゼ修飾された抗ヒト免疫グロブリン抗体と基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸ナトリウムとを用いて反応させた後、プレートリーダーにて吸光度を測定する方法や、ペルオキシダーゼ修飾された抗ヒト免疫グロブリン抗体と基質である３，３‘，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）等を用いて反応させた後、プレートリーダーにて吸光度を測定する方法等で検出する方法がある。

また例えば、イムノクロマト法であれば、従来のイムノクロマト法での捕捉物質を配置している場所を抗ＯＭＶ抗体の測定部として、ＯＭＶをメンブレン等の多孔質体内に固定することで配置が行われる。具体的には、多孔質体としてニトロセルロースメンブレンを用い、その上に微量の液体を直線状に配置できる抗体塗付機を用いてＯＭＶを含む測定部作製溶液をニトロセルロースメンブレン上にＯＭＶを配置する。

イムノクロマト法での抗ＯＭＶ抗体を検出する方法は、検出部に配置したＯＭＶと検体中の抗ＯＭＶ抗体とを抗体抗原反応させ、更に標識修飾された抗免疫グロブリン抗体を用いて視認できるラインを測定する方法で検出する方法がある。具体的な修飾物質としては、金コロイド，白金コロイド，ラテックスビーズ等の色素や、発色基質と共に使う場合ならばアルカリホスファターゼ，ペルオキシダーゼ等の酵素が利用できる。

また例えば、免疫沈降法であれば、一般にタンパク質等を回収するために利用されるビーズ等の担体を抗ＯＭＶ抗体の測定部として利用することができる。ビーズの種類はシリカ性，ラテックス性，磁性ビーズ等がある。ＯＭＶとビーズとを結合させる方法は、ビーズ上のタンパク質の官能基を利用したカップリング反応等、一般的に知られている方法が利用可能である。検体中の抗ＯＭＶ抗体を検出する方法は、前記ビーズを入れたカラムに検体を添加し、ビーズと検体中の抗ＯＭＶ抗体とを結合させ、不純物を洗浄により洗い流すことで抗ＯＭＶ抗体を精製し、更にビーズと抗ＯＭＶ抗体との結合を切り離すことにより抗ＯＭＶ抗体のみを含んだ溶液を得る。この溶液中の抗ＯＭＶ抗体量を一般的な方法（ブラッドフォード法、ＢＣＡ法等）のタンパク質定量法を用いて測定して検出することができる。

本発明における検出を目的とする歯周病原細菌の外膜ヴェシクルが予め測定部に配置されている測定用器具としては、ＥＬＩＳＡ法に使用するマイクロプレートを挙げることができる。具体的には、検出を目的とする歯周病原細菌の外膜ヴェシクルが予め測定部である穴底に固定され配置されているマイクロプレートである。同様に、従来のＥＬＩＳＡ法で使用されていた微小流路、キャピラリー等の測定用器具の測定部にＯＭＶを配置した測定用器具を挙げることができる。

本発明における検出を目的とする歯周病原細菌の外膜ヴェシクルが予め測定部に配置されている測定用器具としては、イムノクロマト法で使用する器具を挙げることができる。具体的には、試験溶液滴下窓と検査結果検出窓とが設けられた上カバーと、試験片設置ガイドが設けられた下カバーと、上カバーと下カバーとの間に収納されている多孔質性であって薄板状の多孔質片とから成る免疫クロマトグラフィー検査用具において、その多孔質膜片は、その片端に検体中に含まれている抗ＯＭＶ抗体と特異的に結合する抗体が検出可能な標識が付着された状態で含まれた検体滴下部があり、中程に抗ＯＭＶ抗体と特異的に結合するＯＭＶが予め配置された測定部があり、該測定部を挟んで検体滴下部と反対側の端に検体吸収部が配置されている測定用器具を例示することができる。

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

＜歯周病原細菌のＯＭＶの調整＞
歯周病原細菌の一つであるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを、オートクレーブ滅菌したＢｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）に濃度１μｇ／ｍｌのビタミンＫ，及び５μｇ／ｍｌのヘミンを添加した培地を用いて２日間嫌気培養を行った。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの株はＷ８３を用いた。培養液を遠心分離することで培養上清のみを採取し、更に０．２２μｍフィルターを用いて菌体を除去し、１００，０００×ｇの条件で３時間超遠心分離を行い、ペレットを採取した。採取したペレットは２０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファを用いて懸濁しＯＭＶ溶液を得た。作製したＯＭＶのタンパク質量はブラッドフォード法にて測定した。

＜ＥＬＩＳＡ法での抗ＯＭＶ抗体検出＞
９６穴プレートに１μｇ／ｍｌに調整したＯＭＶ溶液１００μｌを添加し、充分に乾燥させ、プレート底部に吸着させ固定した。
１％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ／ＰＢＳでブロッキングを行った後、パラフィンワックスガムを用いて採取した刺激唾液を添加し、抗体抗原反応を行った。
アルカリホスファターゼ修飾抗ヒトＩｇＡ抗体を用いて抗ＯＭＶ抗体を標識し、ｐ−ニトロフェニルリン酸ナトリウムを用いた発色反応をプレートリーダーで測定した。
その結果、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの株Ｗ８３のＯＭＶに対する唾液中のヒトＩｇＡ抗体価に示す図１のように、唾液サンプル中に存在する抗ＯＭＶ抗体を検知することが可能であることが確認でき、またＣＰＩコードの平均値が高い場合に大きくなることが分かった。従って、抗ＯＭＶ抗体の力価は、少なくともＣＰＩコードと関連していることが明らかであることが分かった。同様の方法でＣＰＩコード以外の臨床症状との組合せ等を加えて評価すれば、より精度の高い検査を行うこともできる。

＜イムノクロマト法での抗ＯＭＶ抗体検出＞
ニトロセルロースメンブレン（製品名：ＨｉＦｌｏｗ Ｐｌｕｓ ＨＦ１２０，ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を厚さ０．４ｍｍの台紙に貼り付けた後、長さ５０ｍｍ，幅５ｍｍとなるように切断した。２５μｇ／ｍｌに調整したＯＭＶ溶液２μｌを前記メンブレン中央部へ円形状になるよう滴下し、充分に乾燥させることでＯＭＶをメンブレン上に配置した。このＯＭＶを配置したメンブレンの一端に長さ１０ｍｍのグラスファイバー製のサンプルパッドを貼り付け試験端とした。更に、反対側の端に長さ３０ｍｍの吸水濾紙を貼り付けイムノクロマト試験用ストリップを作製した。
ＰＢＳＴを用いて４倍に希釈した刺激唾液１００μｌと抗ヒトＩｇＡ抗体修飾金コロイド溶液１０μｌを混合した溶液にイムノクロマト試験用ストリップの試験端を挿入し、１５分後に目視にて確認し、赤い円形の着色が見られる場合を＋、見られない場合を−として判定した。
その結果、表１のようにイムノクロマト法にて抗ＯＭＶ抗体を検出可能であることが確認できた。更に、前記のＥＬＩＳＡ法の結果等を利用すれば、検出の閾値等を定めることも可能となり精度を高めることができることが示唆された。

Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの株Ｗ８３のＯＭＶに対する唾液中のヒトＩｇＡ抗体価をアルカリホスファターゼ修飾抗ヒトＩｇＡ抗体を利用して測定した結果を示す図である。

Claims (4)

1. 検出を目的とする歯周病原細菌の外膜ヴェシクルを測定用器具の測定部に予め配置しておき、被験者から採取した検体を該測定部に接触させ、抗原抗体反応により検体内の前記外膜ヴェシクルに対応する抗外膜ヴェシクル抗体を検出することを特徴とする歯周病原細菌の検査方法。
2. 検出を目的とする歯周病原細菌の外膜ヴェシクルが予め測定部に配置されていることを特徴とする測定用器具。
3. 検出を目的とする歯周病原細菌の外膜ヴェシクルが予め穴底部に配置されているマイクロプレートである請求項２に記載の測定用器具。
4. 試験溶液滴下窓と検査結果検出窓とが設けられた上カバーと、試験片設置ガイドが設けられた下カバーと、上カバーと下カバーとの間に収納されている多孔質性であって薄板状の多孔質片とから成る免疫クロマトグラフィー検査用具であって、該多孔質膜片は、その片端に検体中に含まれている抗ＯＭＶ抗体と特異的に結合する抗体が検出可能な標識が付着された状態で含まれた検体滴下部があり、中程に抗ＯＭＶ抗体と特異的に結合するＯＭＶが予め配置された測定部があり、該測定部を挟んで検体滴下部と反対側の端に検体吸収部が配置されている測定用器具である請求項２に記載の測定用器具。

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