CN106687813B - IgM半定量细螺旋体病诊断试剂盒 - Google Patents

IgM半定量细螺旋体病诊断试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及由第一试剂盒及第二试剂盒构成的细螺旋体病诊断试剂盒及利用此的诊断方法，不仅在流行区域(epidemic region)，而且在地方性区域(endemic region)，也可区别细螺旋体病患者进行诊断。

Description

IgM半定量细螺旋体病诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及由第一试剂盒及第二试剂盒构成的细螺旋体病诊断试剂盒及细螺旋体病诊断方法。
技术背景
细螺旋体病是由一种螺旋菌(Spirillum)的肾脏钩端螺旋体(Leptospirainterrogans)被感染发病的人和动物共通传染病。这是带有黄疸和肾脏疾病的急性热性疾病，在1887年被命名为韦尔氏病(Weil's disease)，且被知为传染性疾病。在1918年，从韦尔氏病患者分离原因菌命名为出血性黄疸螺旋体(Spirochaetaicterohaemorrhagiae)，之后改称为出血性黄疸细螺旋体(Leptospira icterohaemorrhagiae)。在分类学上，细螺旋体(Leptospira)属于细螺旋体科(Leptospiraceae family)，细螺旋体属(Leptospiragenus)根据病原性与否分为肾脏钩端螺旋体(Leptospira interrogans)和双曲钩端螺旋体(Leptospira biflexa)。具有病原性的肾脏钩端螺旋体到现在为止被知为由30个血清组(serogroup)分类，包括约300个血清型(serovar)，且这些被知为根据区域血清型分布不同。肾脏钩端螺旋体存在于感染肾脏钩端螺旋体的动物组织内，或即使通过动物的排泄物排出，也在维持约20℃温度可存活数周，所以，通过排泄物排出的菌生存于土壤或水，可感染人。因此，人主要可通过处理感染的动物组织或被咬于感染的动物，或由肾脏钩端螺旋体污染的饮食或水被感染。细螺旋体病被知为主要发生在欧洲、美国、澳大利亚、越南、太过、马来西亚、台湾、中国、日本等。1942年在韩国报告了由血清学证明的细螺旋体病患者的发生，在1984年从肺出血患者细螺旋体菌被分离确认。之后，在韩国与恙虫病、肾综合征出血热、地方性斑疹伤寒一同被指定为第三群法定的传染病。
细螺旋体病的症状在发病初期表现出发热、头痛、肌肉痛、虚脱等典型临床症状的急性热性疾病，严重时可诱发如肺出血的内部器官出血、黄疸、肾功能衰竭的症状。细螺旋体病的发病原理是通过粘膜或受伤的皮肤渗透的细螺旋体，通过血管迅速扩散到全身且渗透到组织内，使细螺旋体菌毒素损伤血管的内皮细胞。这引发长期出血、血液量的低下、低血压等症状，但在发病初期可处方如青霉素的抗生剂，所以，从发病到一至两天，最晚在三至四天内发现极为重要。
用于诊断细螺旋体病的方法，具有世界卫生组织(World Health Organization；WHO)标准方法的显微镜凝集实验(microscopic agglutination test；MAT)。MAT比起其他诊断方法可具有正确诊断的优点。但是，利用存活的菌，所以，具有维持及管理麻烦，且需要高价的设备，并且只有熟练的专家才能进行试验的缺点。所以，在保健所及医院等医疗机关，需要开发简单且迅速，可正确地诊断细螺旋体病的方法。反映此，最近开发了适用免疫层析法(immunochromatography assay)的快速(rapid)试剂盒。快速试剂盒适用现场诊断床边检测(point-of-care testing；POCT)概念，是在15分钟内可迅速正确地诊断细螺旋体病被开发的医疗器械。但是，通常，这些细螺旋体病诊断试剂盒实质上不区分细螺旋体病的流行区域(epidemic region)和地方性区域(endemic region)的被开发使用。但是，在细螺旋体病地方性区域(endemic region)使用试剂盒诊断患者时，因存在于过去被感染的患者或具有隐性感染(inapparent infection)患者的抗体，具有将其诊断为细螺旋体病患者的问题。因此，需要开发区分流行区域(epidemic region)和地方性区域(endemic region)，可诊断细螺旋体病的试剂盒。
发明内容
技术课题
本发明的目的是提供细螺旋体病诊断试剂盒及利用此的诊断方法，更具体地提供由第一试剂盒及第二试剂盒构成的细螺旋体病诊断试剂盒及利用此的诊断方法。
但是，本发明要解决的课题不限定于上述提及的课题，且没有被提及的其他课题，可从以下记载明确地理解给从业者。
技术方案
本发明的第一侧面是提供一种细螺旋体病诊断试剂盒，由第一试剂盒及第二试剂盒构成，其中，所述第一试剂盒包括1.2μg至2.0μg的细螺旋体抗原，且所述第二试剂盒包括0.6μg至0.9μg的细螺旋体抗原及BSA，并且所述细螺旋体抗原源于细螺旋体脂多糖的多糖。
根据一个实施例，使用所述细螺旋体病诊断试剂盒，可由MAT测定的Ab效价(Abtiter)判别1:50至1:200。
根据一个实施例，所述BSA可以是0.1至0.4μg。
根据一个实施例，所述第一试剂盒还可包括OD 3.5至4.5的金-共轭-山羊-抗人IgM抗体，及所述第二试剂盒还可包括OD 1.5至2.5的金-共轭-山羊-抗人IgM抗体。
根据一个实施例，所述试剂盒可以是利用免疫层析法的条类型、利用免疫层析法的设备类型或微型板块类型。
根据一个实施例，所述条类型的试剂盒可包括硝化纤维膜、共轭垫、吸收垫及样品垫。
本发明的第二侧面提供一种用于诊断细螺旋体病提供信息的方法，由MAT测定的Ab效价(Ab titer)为了提供1:50至1:200的细螺旋体病患者诊断所需的信息，包括：使用所述细螺旋体病诊断试剂盒，检测患者的样品内细螺旋体IgM抗体。
根据一个实施例，所述患者的样品可以是血清、血浆或全血。
根据一个实施例，其步骤还可包括：比较所述第一试剂盒内检测出细螺旋体IgM抗体与否和所述第二试剂盒内检测出细螺旋体IgM抗体与否。
根据一个实施例，检测所述抗体的步骤利用抗原-抗体反应，且所述抗原-抗体反应可利用从酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫检定法(radioimmnoassay；RIA)、夹心式测定(sandwich assay)、免疫印迹、免疫沉淀法、免疫组化染色法(immnohistochemicalstaining)、流式细胞术(flow cytometry)、荧光激活细胞分离法(FACS)、酶基质比色法及抗原-抗体凝聚法形成的群中选择的一个以上方法。
技术效果
根据本发明的由第一试剂盒及第二试剂盒构成的，细螺旋体病诊断试剂盒及利用此的诊断方法，可由MAT诊断测定的Ab效价(Ab titer)为1:50至1:200的细螺旋体病患者，所以，不仅在流行区域(epidemic region)，而且在地方性区域(endemic region)也可诊断细螺旋体病患者。
附图说明
图1是示出根据本发明的一个实施例的条型细螺旋体病诊断试剂盒。
具体实施方式
以下，参考附图对实施例进行详细地说明。示出在各图的相同参考符号表示相同的部件。
在以下说明的实施例中，可附加多样的变更。以下说明的实施例不限于实施形态，应该理解为，包括对这些的所有变更、均等物或者代替物。
在实施例中使用的用语，只是为了说明特定的实施例而被使用，而不是意图限定实施例。除了明确的指定意思以外，单数的表现包括复数的表现。在本说明书中，“包括”或者“具有”等用语是为了指定说明书上记载的特征、数字、步骤、动作、构成要素、组件或者这些组合的存在，并且要理解为，不是预先排除一个或者其以上的其他特征，或者数字、步骤、动作、构成要素、组件或者这些组合的存在或者附加可能性。
除了被定义为其他，包括技术或者科学用语，这里所使用的所有用语与实施例所属领域的技术人员一般的理解，具有相同的意思。一般使用的，如被定义在字典的用语被解释成与相关技术上下文具有相同的意思，并且除了在本申请中明确地定义以外，不能解释成理想的或者过度形式的意思。
还有，参考附图进行说明时，与图的符号无关，相同的构成要素赋予相同的参考符号，对此的重复说明给予省略。在说明实施例时，对相关公开技术的具体说明，被判断为模糊实施例的说明时，其详细地说明给予省略。
在本发明使用的用语‘诊断’意味着确认病理状态的存在后特征。此外，本发明在目的上的诊断是确认细螺旋体病。
在本发明使用的用语‘细螺旋体病’，是指细螺旋体(Leptospira)内病院螺旋菌引发的疾病。
在本发明使用的用语流行区域(epidemic region)，是指在哪个时期特定传染病集中发生的区域。
在本发明使用的用语地方性区域(endemic region)，是指特定传染病持续发生的区域。
本发明的细螺旋体病诊断试剂盒由第一试剂盒及第二试剂盒构成，且所述第一试剂盒包括1.2至2.0μg的细螺旋体菌抗原，所述第二试剂盒包括0.6至1.0μg的细螺旋体菌抗原及BSA，且所述细螺旋体菌抗原源于细螺旋体菌脂多糖的多糖。
为了检测对细螺旋体菌的抗体，本发明的细螺旋体病诊断试剂盒，在细螺旋体内的脂多糖(LPS)将脂分离的多糖(polysaccharide)利用为抗原。细螺旋体菌的脂多糖(LPS)由脂类A(lipid A)、核心多糖(core polysaccharide)及O-特性侧链(O-specific sidechain)构成。脂类A和核心多糖由2-酮-3脱氧辛酸(2-keto-3-deoxyoctanic acid；KDO)连接，核心多糖由葡萄糖、半乳糖及N-乙酰氨基葡萄糖构成。更具体地，为了增加抗原抗体反应性，将去除脂类A的以属(genus)特性的特性侧链及核心多糖构成的多糖，利用为抗原(参照实施例1)。
历来使用的细螺旋体病诊断试剂盒的抗原及金-共轭浓度，其目的只是检测抗体的存在与否，所以，只可判别因抗原-抗体反应的发色与否，来任意选定抗体量并使用。但是，本发明的细螺旋体病诊断试剂盒是从检测存在于患者内抗体的与否，进一步地，只有哪种程度范围的抗体量滴定到诊断试剂盒时，选择性地发色的诊断试剂盒。需要这些诊断试剂盒是根据流行区域和地方性区域，存在于生命体的抗体量相异，所以，只由单纯的测定抗体与否的诊断试剂盒，很难正确地进行诊断。
本发明的细螺旋体病诊断试剂盒由第一试剂盒及第二试剂盒构成，且所述第一试剂盒包括1.2至2.0μg的细螺旋体菌抗原，优选地是1.4至1.8μg，更优选地是1.6μg，所述第二试剂盒包括0.6至0.9μg的细螺旋体菌抗原，优选地是0.8μg。通过所述第一试剂盒及第二试剂盒的抗原-抗体反应，可判别IgM切断(cut-off)为50(MAT Ab titer 1:50)至IgM切断(cut-off)为200(MAT Ab titer 1:200)的患者。此外，第二试剂盒可包括BSA或酪蛋白。因包括BSA或酪蛋白，可调整对细螺旋体菌的抗原-抗体反应程度。
根据本发明的细螺旋体病诊断试剂盒，在生物学样品用于测定对细螺旋体菌的抗体水准，诊断细螺旋体病的试剂盒，包括用于观察抗原-抗体复合体形成，作用为在细螺旋体菌的抗体反应的抗原的，源于细螺旋体菌的脂多糖的多糖。
根据一个实施例，包括在本发明的细螺旋体病诊断试剂盒的第二试剂盒的BAS或酪蛋白的量，可以是0.1至0.4μg。包括BSA时，优选地，包括在所述第二试剂盒的BSA及细螺旋体菌抗原的量的总合是1μg。BSA执行降低抗原-抗体特异反应的反应性作用，具有BSA的量超过0.4时，对MAT Ab效价为50至200，可降低第二试剂盒的反应度，且未满0.1时，抗原-抗体反应性变高，可导致伪阳性的问题。(参照实施例2-3)
根据一个实施例，所述第一试剂盒还包括OD 3.5至4.5的金-共轭-山羊-抗人IgM抗体，及所述第二试剂盒还可包括OD 1.5至2.5的金-共轭-山羊-抗人IgM抗体。所述第一试剂盒的金-共轭-山羊-抗人IgM抗体以未满OD 3.5被包括时，因抗原-抗体反应的发色可显示地不好，且以超过OD 4.5被包括时，可具有在切断值未满MAT Ab效价50样品，可导致阳性的问题。此外，所述第二试剂盒的金-共轭-山羊-抗人IgM抗体以未满OD 1.5被包括时，因抗原-抗体反应的发色可显示地不好，且以超过OD 2.5被超过时，可具有在切断值未满MAT Ab效价200样品，可导致阳性的问题。(参照实施例2-3)
作为观察抗原-抗体复合体形成的免疫分析方法，具有免疫印迹、酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbentassay；ELISA)、放射免疫检定法(radioimmunoassay；RIA)、放射免疫扩散(radioimmunodiffusion)、扩散(Ouchterlony)免疫扩散法、火箭(rocket)免疫电泳、免疫组织着色、免疫沉淀法(immunoprecipitation assay)、补体结合试验(complement Fixation Assay)、免疫荧光(immunofluorescence)、免疫层析法(immunochromatography)、FACS等，但不限定于此。
本发明的细螺旋体病诊断用试剂盒不只是与抗体特异性结合的所述多糖，而且包括在免疫学分析使用的，在相应领域一般使用的道具、试剂等。由这些道具或试剂可包括适合载体、可生成检测信号的标志物质、溶解剂、清洗剂、缓冲剂、稳定剂等，但不限定于此。此外，本发明的诊断用试剂盒不限定于此，可以是微型板块、试纸设备、免疫层析试纸条、径向分区免疫鉴定设备、流入式(flow-through)设备等类型。
优选地，诊断试剂盒是利用免疫层析法的试纸条型的诊断试剂盒或设备型的诊断试剂盒。利用免疫层析法的诊断，在生物学样品血清中的抗体与结合在胶体金颗粒(colloidal gold particle)的示踪剂抗体(tracer antibody)反应之后，经毛细管现象通过硝化纤维膜的微孔(micropore)移动的过程中，与固定在微孔内部表面的捕捉抗原(capture antigen)结合形成发色条，可由肉眼辨别阳性及阴性。所述“示踪剂抗体”是指与细螺旋体菌的抗体反应，且与色彩颗粒结合的抗体。
根据一个实施例，本发明的细螺旋体病诊断试剂盒的抗原-抗体复合体可利用色彩颗粒结合法，例如，作为色彩颗粒可使用胶体金颗粒或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠子(bead)。更优选地，可利用金胶体。
图1是示出根据本发明的一个实施例的条型细螺旋体病诊断试剂盒。
根据一个实施例，本发明的细螺旋体病诊断试剂盒，可由吸收样品的样品垫(sample pad)；与样品内的抗体结合的，包括示踪剂抗体的金共轭垫(gold conjugationpad)；包括本发明多糖的反应线(test line)和包括抑制蛋白质的对照线(control line)及为了去除非特异性抗体的前反应线(pre-test line)被处理的反应膜(test membrane)；及包括吸收剩余量样品的吸收垫(absorption pad)的测试条构成。所述反应线包括本发明的多糖，所述对照线包括兔子抗-山羊IgG的抑制蛋白质。此外，前反应线可包括本发明的细螺旋体菌的脂多糖(LPS)和结构类似的革兰氏阴性菌，例如，将E.coli，假单胞杆菌等的脂多糖(LPS)以0.5至1mg/ml的浓度。所述金共轭垫可包括被金标记的山羊抗-人IgM。
根据一个实施例，本发明的细螺旋体病诊断试剂盒为利用免疫层析法的条类型诊断试剂盒时，诊断细螺旋体病的方法如下。首先，将要检测的生物学样品滴定到所述诊断试剂盒样品被吸收部位的样品垫时，生物学样品由毛细管现象，达到金共轭垫(goldconjugation pad)，使样品内的抗体结合在金共轭垫内的示踪剂抗体，例如，在金标记抗人IgM山羊抗体(gold labeled anti-human IgM goat antibody)，形成胶体。在这种情况下，要标本的生物学样品，没有固定在所述金共轭垫，继续移动达到本发明的多糖抗原被固定的反应线(test line)。被细螺旋体菌感染的患者的生物学样品，与所述多糖抗原进行抗原-抗体反应，但结合在患者的金共轭垫内的特定示踪剂抗体，对细螺旋体菌的抗体结合在固定在反应线的多糖抗原，形成红紫色条，可由肉眼观察。并且，与生物学样品内抗体不反应的剩余金共轭垫内的示踪剂抗体达到对照线，与抑制蛋白质进行反应并形成红紫色条，显示检测的适当性。如此的，本发明的所述诊断试剂盒利用由抗原-抗体反应的免疫层析方法，不需特别地设备可由肉眼快速地确认检测结果。还有，所述诊断试剂盒去除由前反应线(pretest line)，可将实际不保有对细螺旋体菌的抗体，误判为保有的肯能行，提高细螺旋体病诊断的正确性。
根据一个实施例，可检测对细螺旋体菌抗体的生物学样品，包括血液、血清、血浆等，但不限定于此。
实施例1：制造源于细螺旋体菌的多糖抗原
1-1.培养细螺旋体菌株
将EMJH培养基基础(Leptospira medium base Ellinghausen McCulloughHohnson Harris)融化成0.23g/100ml灭菌后，添加EMJH培养基添加剂10ml制造培养基。在此培养基接种细螺旋体菌，在24℃进行振荡培养五天。
1-2.制造细螺旋体抗原
将在EMJH培养基培养五天的细螺旋体菌，在4080xg圆心分离20分钟，将菌体由1XPBS缓仲剂(buffer)(137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、2mM KH2PO4)清洗三回后，在100℃加热一个小时。其中，使蛋白水解酶(Proteinase)K成为进行处理，在37℃通宵(overnight)地进行反应。之后，使EGTA成为2mM进行添加，在70℃反应15分钟之后，由4℃、180,000xg圆心分离两个小时。在淀积物加H2O漂浮，制造脂多糖(lipopolysaccharide)(Westpha&Jann，1965)。在如此净化的LPS抗原，使乙酸为1％进行处理，在100℃加温一小时之后，由2980xg圆心分离20分钟，去除淀积部分的脂A(lipid A)制造多糖抗原。被制造的抗原在人肠杆菌(Escherichia coli)与上述方法相同地处理净化的LPS(sigma)，将得到的多糖使用为对照菌(standard)测定量。
实施例2：制作诊断试剂盒
将塑料背板(backing)的NC膜作为基本结构，在中间固定抗原，储蓄中合体的玻璃纤维膜(共轭垫)贴在下部，吸收过量水溶液的纤维质膜接触地贴在两端部(样品垫、吸收垫)，由相互间连接的形态构成。位于下端的玻璃纤维膜吸收力强，不仅在短时间内可吸收样品，而且溶解的中合体移动到上部免疫条之前，延长停滞时间，可诱导分析物质和中合体间的有效反应。在中间的免疫条上空间上分离固定，可感知分析物质测定抗原(测试线或固定线(capture line))和中合体的特异抗体(对照线(control line))，位于免疫条上端的吸收垫(absorption pad)纤维质膜，可使迅速地吸收过量的样品。
2-1.在硝化纤维膜上固定化细螺旋体抗原(polysaccharide)
捕获分析特异抗体作用的特异抗原的固定化，在纤维质(NC)膜上经静电相互作用(electrostatic interaction)执行。从塑料背板NC膜条4X25mm下端离1cm的部分、抑制抗体(rabbit anti-goat IgG)在离1.4cm的位置使用分散器，将净化的抗原(dispenser)以1ul/cm的速度滴定。滴定的膜在37℃烘干一个小时。
2-2.决定用于前反应线(pre-test line)的抗原
发生由抗原(polysaccharide)的非特异性信号时，为了去除非特异抗体，在滴定位置前端滴定前反应线(pretest line)，可进行去除。使用了与细螺旋体LPS一部分类似的其他细菌(E.coli,Psudomonas aeruginosa)的LPS。
2-3.抗原浓度和金-共轭浓度
之前使用的细螺旋体病诊断试剂盒的抗原及金-共轭浓度，单纯地以检测抗体存在与否为目的，所以，只判断因抗原-抗体反应的发色与否被使用。但是，进一步的从抗体的测定与否，重要的是某些程度范围的抗体量只滴定到诊断试剂盒时，选择性地决定发色的抗原及金-共轭浓度。这如上述，根据流行区域和地方性区域，存在于生命体的抗体量可相异，所以，很难只由单纯抗体的与否，进行正确地诊断。
(1)抗原浓度和金共轭浓度
将试剂盒内滴定的抗原浓度的每试剂盒作为0.2μg、0.4μg、0.8μg，且将金-共轭OD作为1、2、3、4，在各个情况下制造各9个试剂盒。被使用的抗体以标准IgM分别使用显示的效价160、320、640。
表1是显示根据抗原浓度及金-共轭OD的试剂盒反应。
<表1>
在表1可知，根据抗原浓度及金-共轭的OD，可检测抗体的量不同，特别地，金-共轭OD值为2的情况下，可根据抗原及抗体的量，获得显著性的结果。
(2)第二试剂盒抗原浓度
试剂盒内金-共轭OD值作为2，抗原的浓度的没试剂盒作为0.2μg、0.4μg、0.8μg，分别制作各10个试剂盒。在各个试剂盒使用IgM效价显示160、320、640的十个抗体，测试试剂盒的反应。被使用的抗体如下。
-效价160：99-7、00-224、01-224、87-109、88-123
-效价320：90-226、95
-效价640：99-4、00-100、91-188
表2至4显示根据抗原及抗体浓度的试剂盒反应。
<表2>
<表3>
<表4>
将金-共轭OD值固定为2，测试根据抗原量和抗体量的发色程度的结果，抗原的量滴定到0.4μg以下时，具有发色的程度低，或根据抗体量的区别不容易的问题。
(3)BSA浓度
在试剂盒内滴定的抗原添加BSA，使滴定总量成为每试剂盒1μg的进行制造。各试剂盒分别包括0.1μg抗原+0.9μgBSA、0.2μg抗原+0.8μgBSA、0.4μg抗原+0.6μg BSA、0.6μg抗原+0.4μgBSA、0.8μg抗原+0.2μgBSA。在各个试剂盒使用IgM效价显示160、320、640的十个抗体，测试试剂盒的反应。被使用的抗体如下。
-效价160：99-7、00-224、01-224、87-109、88-123
-效价320：90-226、95
-效价640：99-4、00-100、91-188
表5至9显示根据抗原及BSA浓度的试剂盒反应。
<表5>
<表6>
<表7>
<表8>
<表9>
添加BSA使根据抗体量的发色程度的判别更容易。此外，0.6μg抗原+0.4μgBSA及0.8μg抗原+0.2μgBSA时，优选地，判别IgM抗体效价160和IgM抗体效价320。
(4)第一试剂盒抗原浓度
分别制造各12个包括每试剂盒抗原浓度由0.8μg、1.6μg或3.2μg的试剂盒，且通过3回(每回各4个)执行实验。
抗原的浓度为1.6μg时，根据试剂盒内反应的发色程度，最为没噪音显示得很好。
2-4.标本的浓度
用于试剂盒的人血清浓度，或试剂盒内抗原或与金共轭相同，过量或少量时，可诱导非特异性反应。因此，优选地，用于诊断试剂盒的标本为血清或血浆时，取由的样品稀释液(Sample diluent)稀释成约100倍使用，全血时取由的样品稀释液稀释成约50倍使用。由微量移液管取此稀释的标本注入到标本注入部。或由微量移液管取的血清或血浆，或全血，使吸收到标本注入部底板的样品垫进行注入，且即刻将7滴样品稀释液(Sample diluent)注入到标本注入部。
综上所述，实施例虽然由限定的实施例和图被说明，但是本领域的技术人员可从上述的说明多样地修正及变更。例如，由说明的技术与说明的方法和其他顺序被执行，和/或由说明的系统、结构、装置、回路等，构成要素与说民的方法和其他形态被键合或者组合，或者由其他构成要素或者均等物对置或者置换，也可达到适当的结果。
所以，其他具体体现、其他实施例及与专利请求范围均等的，也属于后述的专利请求范围的范围。

Claims (3)

1.一种细螺旋体病诊断试剂盒，由第一试剂盒及第二试剂盒构成，其中，
所述第一试剂盒包括1.2μg至2.0μg的细螺旋体抗原，且
所述第二试剂盒包括0.8μg至0.9μg的细螺旋体抗原及0.1μg至0.2μg BSA，
所述第二试剂盒所包括的细螺旋体抗原及BSA的总含量为1μg，
所述细螺旋体抗原源于细螺旋体脂多糖的多糖，
所述多糖对细螺旋体属特异，由O-特异性侧链及核心多糖构成，所述多糖是除去类脂A的，并且
所述第一试剂盒还包括OD 3.5至4.5的金-共轭-山羊-抗人IgM抗体，及
所述第二试剂盒还包括OD 1.5至2.5的金-共轭-山羊-抗人IgM抗体。
2.根据权利要求1所述的细螺旋体病诊断试剂盒，其特征为，区别流行区域的细螺旋体病或地方性区域的细螺旋体病。
3.根据权利要求1所述的细螺旋体病诊断试剂盒，其特征为，由MAT测定的Ab效价判别1:50至1:200。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102013954B1 (ko) * 2016-12-26 2019-08-23 주식회사 이뮨메드 서울바이러스와 푸말라바이러스 유래의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질 및 한탄바이러스 유래의 재조합 당단백질을 포함하는 신증후군출혈열 진단용 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트
CN111474293B (zh) * 2020-04-27 2023-05-05 广东博创佳禾科技有限公司 一种青枯病菌溶液测定方法及测定系统

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101592665A (zh) * 2008-05-26 2009-12-02 北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司 一种钩端螺旋体IgM抗体快速检测试纸条
CN101600965A (zh) * 2007-03-08 2009-12-09 疫免美德有限公司 钩端螺旋体病诊断试剂盒
CN203083998U (zh) * 2012-12-31 2013-07-24 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 用于检测膀胱癌的集合胶体金试纸

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5989547A (en) * 1996-01-22 1999-11-23 University Of California Leptospiral outer membrane proteins
CA2501939C (en) * 2002-10-10 2013-10-08 Cornell Research Foundation, Inc. Novel immunogenic proteins of leptospira
KR101323371B1 (ko) * 2011-05-03 2013-10-29 김수동 인간의 소변을 검체로 이용하여 전립선암을 진단하는 진단키트 및 그 제조방법
JP2016503011A (ja) * 2012-12-12 2016-02-01 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア レプトスピラ症の診断および処置のための方法およびタンパク質抗原の組成物

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101600965A (zh) * 2007-03-08 2009-12-09 疫免美德有限公司 钩端螺旋体病诊断试剂盒
CN101592665A (zh) * 2008-05-26 2009-12-02 北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司 一种钩端螺旋体IgM抗体快速检测试纸条
CN203083998U (zh) * 2012-12-31 2013-07-24 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 用于检测膀胱癌的集合胶体金试纸

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
H.M.E.FRÉNAY et al..Discrimination of Epidemic and Nonepidemic Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Strains on the Basis of Protein A Gene Polymorphism.《Jouranl of Clinical Microbiology》.1994,第32卷(第3期),第846-847页.

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