CN101592665B - 一种钩端螺旋体IgM抗体快速检测试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于检测钩端螺旋体IgM抗体的快速检测试纸条包括反应膜和结合物释放垫，所述反应膜具有同时包钩端螺旋体属特异性抗原ompL1和LipL32的检测带和包被二抗IgG的质控带；所述结合物释放垫包被有胶体金标记的抗人IgM单克隆抗体。应用膜层析捕获法，检测标本中钩端螺旋体特异性IgM抗体。应用本发明试纸条检测，操作简单、方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于现场检测和早期诊断，对钩端螺旋体感染诊断起到辅助作用。

Description

一种钩端螺旋体IgM抗体快速检测试纸条

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种钩端螺旋体IgM抗体检测试纸条及其应用。

背景技术

钩端螺旋体病是由致病性钩端螺旋体(简称钩体)所引起的急性传染病。鼠类、猪及其它家畜为主要传染源。钩体随带菌动物尿排出，污染水源，人在接触疫水时，通过皮肤、粘膜而感染。发病多在夏秋割稻季节或在大雨洪水之后。人感染钩体病后，潜伏期多在1～3周。首先形成败血症，可有多种临床表现，包括普通型、肺出血型、黄疸出血型、脑膜脑炎型。约在发病1周左右，发病，进入免疫反应期，表现诸多神经症状。其诊断除依据流行病学及临床症状外，实验室检测是必不可少的，其涉及到的特异性检测有：

1.病原体分离

钩体不易着色，一般显微镜很难观察到，必须采用黑底映光法直接查找钩体。在发病10天内可从血液及脑脊液中分离出钩体。第二周尿中可检出钩体。钩体从体液或组织中分离需要特殊的实验室技术和培养基。

最近用超速离心集菌后直接镜检法、荧光抗体染色法、原血片镀银染色法及甲苯蓝染色等方法直接检查病原体，可达到快速诊断目的，阳性率在50％左右，有助于早期诊断。

动物接种是一种分离病原体的可靠方法，将患者的血液或其他体液接种于动物(幼年豚鼠和金黄地鼠)腹腔内，晚期病例可用尿液接种于动物腹部皮下。接种3～5天，用暗视野检查腹腔液，亦可在接种3～6天时取心血检查。动物接种的阳性率较高，但所需时间较长，所需费用大。

2.血清学试验

(1)凝集溶价试验(凝溶试验)：有较高的特异性和敏感性，但需不同型别活菌操作，凝集素一般在病后7～8天出现，逐渐升高，以超过1∶400效价为阳性，可持续数月到数年。间隔两周双份血清，效价增高4倍以上为阳性。

(2)酶联免疫吸附试验(ELISA)：比凝溶试验阳性出现时间更早和更灵敏。发现显微镜凝集试验与ELISA的总符合率达86.2％。近年来国外已普遍采用钩体IgM抗体技术，有高度特异性。

(3)间接红细胞凝集试验：将从钩体菌体中提取的一种抗原成分，将其吸附于人“O”型红细胞表面致敏，遇到同种抗体，即发生红细胞凝集现象，本试验具钩体感染的属特异性而无群或型的特异性，较凝溶试验阳性出现早，操作简便，不需特殊设备，适合基层推广应用。

(4)间接红细胞溶解试验：用钩体抗原物质将新鲜绵羊红细胞致敏，在补体存在的条件下与含有抗体的血清混合时发生溶血，较间接红细胞凝集试验的灵敏性为高。

(5)间接荧光抗体法：此法是将标准钩体菌株作成涂片，然后将检测病人的血清滴在已知菌株的玻片上，经洗涤，如病人血清中具有抗体，抗原抗体结合，再用抗人球蛋白荧光抗体与此复合物结合，发生荧光，即为阳性，此法无型特异法。本法检出抗体时间及阴转时间均较显凝试验抗体为早，具有一定的早期诊断意义。

上述各项检测，均是用已知钩体抗原检测血中出现的相应抗体，不能做到早期诊断。近年来开展了乳胶凝集抑制试验，反向间接血凝试验与间接荧光抗体染色试验等可以测出血中早期存在的钩体，已取得了早期诊断的初步成果。

3.其它诊断

(1)钩端螺旋体DNA探针技术：早已应用于临床，schoone等1984年证实，用黄疸出血群哥本哈根型Wijnberg株DNA制备探针，可在硝酸纤维素滤膜上检出2pg的同源DNA。且致病性钩体不同血清群Patoc I株呈交义杂交现象。作者认为DNA探针杂交技术是一种敏感性高的早期诊断方法。

(2)DNA基因扩增技术：聚合酶链反应(PCR)的DNA扩增技术目前已引入钩体病的诊断领域。因PCR只要有引物便可进行试验，且方法简便，并适用于大数量标本的流行病学调查。VanEys等1989年用PCR扩增技术对哈焦型钩体感染的牛尿作了检测研究，提出PCR DNA扩增技术完全可作钩体病诊断的一个新型方法。

4.钩端螺旋体膜蛋白的研究：已有研究证明，ompL1和Lip32是钩端螺旋体的主要膜蛋白，特别是Lip32是已知膜蛋白中含量最高的。ELISA研究证实，ompL1和Lip32在感染动物的体内有大量的表达，均具有良好的免疫原性。

发明内容

发明的目的是提供一种使用方便、快捷，用于检测钩端螺旋体特异性抗体的试纸条，检测感染患者标本中钩端螺旋体特异性IgM抗体，用于人钩端螺旋体感染的辅助诊断。

本发明的另一目的在于提供上述试纸条的制备方法。

本发明试纸条包括反应膜和结合物释放垫，所述反应膜具有同时包钩端螺旋体属特异性抗原ompL1和LipL32的检测带和包被二抗IgG的质控带；所述结合物释放垫包被有胶体金标记的抗人IgM单克隆抗体的玻璃纤维膜。

其中，反应膜可为硝酸纤维膜，结合物释放垫可为玻璃纤维膜。

其中，二抗IgG为兔抗鼠IgG抗体。

本发明通过基因工程手段分别获得ompL1和LipL32的基因工程抗原，这可以显著提高试纸条的特异性。

本发明还提供一种制备上述检测试纸条的方法，其包括如下步骤：

1)制备钩端螺旋体属特异性抗原ompL1和LipL32；

2)将步骤1)制备的钩端螺旋体属特异性抗原ompL1和LipL32以及二抗IgG在反应膜上分别形成检测带和质控带，备用；

3)用胶体金标记抗人IgM单克隆抗体，被包被到结合物释放垫中；

4)将制备好的反应膜以及结合物释放垫与样本垫、吸水垫和反应支持物组装成试纸条。

本发明的技术方案是：采用纯化的钩端螺旋体属特异性抗原ompL1和LipL32和兔抗鼠IgG分别固相于硝酸纤维膜上(NC膜)，结合胶体金标记的抗人IgM单克隆抗体，应用膜层析捕获法的原理检测人标本中的钩端螺旋体IgM抗体。

本发明试纸条可用于检测人感染钩端螺旋体早期产生的特异性IgM抗体。

本发明的试纸条利用胶体金标记技术和膜层析技术，用于快速定性半定量检测样本中可能存在的钩端螺旋体特异性IgM抗体，达到快速筛检病人，及时诊断治疗的目的。可节省大量人力物力，方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于现场检测和早期诊断，对钩端螺旋体的感染诊断起到辅助作用。

附图说明

图1：A本发明试纸条的正面示意图；B本发明试纸条的侧面示意图。其中，1：吸水垫；2：硝酸纤维膜(T：钩端螺旋体属特异性抗原ompL1和LipL32；C：包被抗鼠IgG的质控条带)；3：含有胶体金标记的抗人IgM单克隆抗体的玻璃纤维膜；4：金标抗体保护膜；5：反应支持物。

图2：检测结果示意图。其中，从左至右依次为：T、C两条线阳性；C一条线阴性；T、C两条线阴性，无效。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1  钩端螺旋体属特异性抗原ompL1和LipL32的克隆表达

(1)ompL1(登录号为EU022021)和LipL32(登录号为AM936999)

基因的扩增：

根据目的基因片段序列设计引物：

LipL32引物序列

5’GCCGAATTCATGAAAAAACTTTCGATTTTG  3’

5’GCCCTCGAGTTACTTAGTCGCGTCAGAAGC  3’

PCR参数：95℃5min；95℃1min，50℃30s，70℃1min，30个循环；最后70度延伸10min。

ompL1引物序列

5’GCCGATATCATGAGAAAATTATCTTCTCTA  3’

5’GCACTCGAGTTACTTTGCGTTGCTTTCGTC  3’

PCR参数：95℃5min；95℃1min，55℃30s，72℃1min，30个循环；最后72度延伸10min。

(2)目的基因的克隆和阳性重组子的筛选

将两种PCR扩增产物电泳后切胶回收，分别与PMD-18T克隆载体16度过夜连接后，转化到DH5α感受态细胞中，挑取单克隆菌株，37度过夜培养，提取质粒后，以质粒为模板进行PCR鉴定阳性克隆菌株，测定序列。

(3)融合表达载体的构建

用限制性内切酶EcoR1、Xho1分别酶切T/ompL1和LipL32和pGEX-4T-1，1％琼脂糖电泳切胶回收目的片段和pGEX-4T-1双酶切后的大片段，用T4连接酶16度过夜连接，连接产物转入BL21感受态细胞，LB固体培养基培养8～10小时，挑取单菌落培养过夜后提取质粒，用PCR及限制性内切酶EcoR I、XhoI双酶切分别鉴定，PCR产物和酶切产物用1％琼脂糖电泳进行分析，筛选阳性克隆，将重组的质粒测序。

(4)蛋白的诱导表达

筛选出的阳性克隆菌在LB培养基中摇菌培养过夜后，将过夜菌按照1∶100的比例接种至1000ml LB液体培养基中，37度摇床培养。基因转化菌在接种后2小时为最佳诱导时机(OD600nm 0.5)，对于ompL1，IPTG浓度0.3mmol/L，对于LipL32，IPTG浓度为0.5mmol/L，均于29度诱导表达8小时。

(5)表达蛋白的纯化、鉴定

将(4)中1000ml菌液12000r/m、4度离心，弃上清，将菌体用细胞裂解液裂解，使用含有GST标签的亲和层析柱子纯化融合蛋白，用GST-融合蛋白纯化试剂盒(B-PER细菌GST标签融合蛋白柱式纯化Kit货号：78200赛默飞世尔科技)，按试剂盒推荐步骤和体系进行纯化，纯化产物进行SDS-PAGE电泳以判断纯化效果，通过紫外薄层测得产率在95％以上。

Western-blot鉴定融合蛋白的免疫活性。切取一半胶用BioRad公司生产的半干电转仪转于硝酸纤维素膜上，进行印迹试验，一抗为钩端螺旋体单抗(北京博奥森生物技术有限公司)，TMB显色后，结果有特异性蛋白条带出现。

上述步骤(2)、(3)、(4)和(5)所述的步骤中，ompL1和LipL32是平行的。即，ompL1和LipL32均采用上述步骤进行了表达和鉴定。

实施例2  钩端螺旋体IgM抗体胶体金快速检测试纸条(参见图1)

(1)胶体金-抗人IgM结合物的制备：

经实验确定，抗人IgM单克隆抗体胶体标记的其最佳结合pH值为8.0，胶体金和抗体的配比为40μg/ml胶体金。标记胶体金经稳定剂(0.5％BSA，pH8.0，0.01M Tris缓冲液)处理后，按每平方厘米65μl的量，取胶体金-抗体结合物溶液，均匀吸附于玻璃纤维上，冷冻干燥，并在干燥环境中保存。

(2)包被抗原于硝酸纤维膜：

将混合的表达蛋白(ompL1和LipL32按1∶1混合)用0.01M PBS稀释成3mg/ml。将抗鼠IgG多克隆抗体用0.01M PBS稀释成2mg/ml。用喷膜机将二者以1μl/cm的速度喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测线和对照线。两条线之间的间隔为0.5cm。

把固定有抗原抗体的硝酸纤维置37℃烤箱中干燥2小时。干燥环境中保存备用。

(3)钩端螺旋体IgM抗体检测试剂盒组成

反应支持物为6.5cm×0.4cm PCV板；吸水垫为2cm×0.4cm的滤油纸；1.8cm×0.4cm的硝酸纤维膜依次包被抗鼠IgG，钩端螺旋体属特异性表达蛋白ompL1和LipL32，0.4cm×0.4cm的含有胶体金标记的抗人IgM抗体的玻璃纤维；金标抗体保护膜(样品垫)为2.7cm×0.4cm的滤纸纤维；即形成了钩端螺旋体抗体检测试纸条(胶体金法)。

(4)钩端螺旋体IgM抗体检测试剂盒特异性及敏感度检测

特异性检测：用本品检测正常人血清，伤寒病人血清、流感病人血清、呼吸道感染病人血清、血吸虫病人血清、腹泻病人血清，均为阴性。

敏感度检测：ELISA法筛选IgM阳性血清，共5份。检测结果如下：

表1与ELISA法的对比

血清编号	ELISA效价	胶体金法检测结果
			1	1∶320	1∶80
2	1∶160	1∶40

3	1∶320	1∶80
			4	1∶320	1∶80
5	1∶640	1∶80

实施例3  检测方法(参见图2)

将患者全血、血浆或血清标本100-150μl直接滴加入实施例2试纸条“4”处，样品液沿膜上行，10-15分钟判读结果。

结果：

如检测样本中含有钩端螺旋体IgM抗体，则与试纸条上胶体金标记的抗人IgM单克隆抗体形成相应的复合物，上行与包被在硝酸纤维膜上的钩端螺旋体属特异性抗原结合，形成红色线条，即在T处形成红色条带。

无论标本中是否含有相应的抗体，胶体金标记的抗人IgM单克隆抗体继续向上爬行与包被在膜上的抗鼠IgG形成红色沉淀线，即在“C”处形成红色条带。此线是质控线，如胶体金失效，此线就不会出现，说明试纸条失效。

              序列表

<110>北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司

<120>一种钩端螺旋体IgM抗体快速检测试纸条

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gccgaattca tgaaaaaact ttcgattttg                                      30

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gccctcgagt tacttagtcg cgtcagaagc                                      30

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gccgatatca tgagaaaatt atcttctcta                                      30

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gcactcgagt tactttgcgt tgctttcgtc                                      30

Claims (2)

1.一种检测试纸条，包括反应膜和结合物释放垫，所述反应膜具有同时包被钩端螺旋体属特异性抗原ompL1和LipL32的检测带和包被二抗IgG的质控带；所述结合物释放垫包被有胶体金标记的抗人IgM单克隆抗体；所述反应膜为硝酸纤维素膜，结合物释放垫为玻璃纤维膜，所述的二抗IgG为抗鼠IgG；

所述胶体金标记的抗人IgM单克隆抗体通过以下方法制备得到：抗人IgM单克隆抗体胶体金标记的pH值为8.0，胶体金和抗体的配比为40μg/ml胶体金，标记胶体金经稳定剂处理后，按每平方厘米65μl的量，取胶体金-抗原结合物溶液，均匀吸附于玻璃纤维上，所述稳定剂配方为0.5%BSA，pH8.0，0.01M Tris缓冲液；

硝酸纤维素膜上包被抗原的方法为：将表达蛋白ompL1和LipL32按1:1混合，用0.01M PBS稀释成3mg/ml，将抗鼠IgG多克隆抗体用0.01M PBS稀释成2mg/ml，用喷膜机将二者以1μl/cm的量喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测线和对照线；所述钩端螺旋体属特异性抗原ompL1和LipL32是应用基因工程方法重组表达获得，PCR扩增LipL32的引物序列为：

5’GCCGAATTCATGAAAAAACTTTCGATTTTG3’

5’GCCCTCGAGTTACTTAGTCGCGTCAGAAGC3’

PCR参数：95℃5min；95℃1min，50℃30s，70℃1min，30个循环；最后70度延伸10min；

PCR扩增ompL1的引物序列为：

5’GCCGATATCATGAGAAAATTATCTTCTCTA3’

5’GCACTCGAGTTACTTTGCGTTGCTTTCGTC3’

PCR参数：95℃5min；95℃1min，55℃30s，72℃1min，30个循环；最后72度延伸10min。

2.一种制备权利要求1所述试纸条的方法，其包括如下步骤：

1）制备钩端螺旋体属特异性抗原ompL1和LipL32；

2）将步骤1）制备的钩端螺旋体属特异性抗原ompL1和LipL32以及二抗IgG在反应膜上分别形成检测带和质控带，备用；

3）用胶体金标记抗人IgM单克隆抗体，并包被到结合物释放垫中；

4）将制备好的反应膜以及结合物释放垫与样本垫、吸水垫和反应支持物组装成试纸条。

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