CN112534262A - 检测手足口病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从测试受试者获得的样本中检测手足口病(HFMD)的方法。特别地，该方法涉及对这些测试受试者的唾液中蛋白质生物标志物的检测。在优选的实施方案中，该方法包括检测唾液样本中至少一种蛋白质生物标志物的存在和/或量，该蛋白质生物标志物选自由PRX‑IV、豆荚蛋白、SIL1和CREG1组成的组，其中唾液中的该蛋白质生物标志物的存在指示手足口病。

Description

检测手足口病的方法
技术领域
本发明涉及一种从测试受试者获得的样本中检测手足口病(Hand-Foot-and-Mouth Disease，HFMD)的方法。特别地，该方法涉及这些测试受试者的唾液中蛋白质生物标志物的检测。
背景技术
HFMD是一种看似无关紧要的急性传染病，通常是轻度和自限性的，是一种广泛流行的病毒性疾病，在西太平洋区域每年数百万名婴幼儿深受其害，其是由来自肠道病毒(Enterovirus)属的人类肠道病毒A种(HEV-A)引起的。近年来，柯萨奇病毒A16(CA16)和肠道病毒71(EV71)是HFMD的主要致病因素(Wang and Liu,2014)。然而，其他HEV-A血清型如柯萨奇病毒A6(CA6)引起的病例数量激增也有报道。HFMD通常是一种自限性疾病，其特征是发烧和丘疹，有时为斑丘疹，手掌、足底、肘部和躯干皮疹以及口腔溃疡。然而，与EV71相关的HFMD在少数情况下，可能迅速发展为严重神经系统并发症(neurologicalcomplications)，例如无菌性脑膜炎和急性弛缓性脑膜炎。这些神经系统并发症可能反过来迅速发展为心肺衰竭和死亡。虽然神经并发症(neurologic complications)在很大程度上与EV71有关，并且据报道也会引起神经系统并发症。由于各种并发症和表现可能由肠道病毒感染引起的，因此，强烈需要对肠道病毒的快速、准确的鉴别，以便可以对感染的患者进行有效隔离，以防止其进一步传播。
HFMD通过粪口或飞沫途径迅速传播，目前由医生通过临床症状和表现进行诊断。一般认为，对于轻度病例，不需要额外的实验室检测。但是，上述情况可能会导致误诊，并可能加剧HFMD在非典型和轻度病例中的传播。此外，目前还没有治愈HFMD的方法。治疗选择项仅限于缓解身体症状。因此，当存在导致死亡的神经系统并发症的风险时，对于涵盖引起HFMD的多种病原体的迅速而准确的诊断变得至关重要。
实验室诊断HFMD的金标准是对来自临床样本(例如喉咙或表皮囊泡拭子)的病毒分离物的鉴定。肠道病毒可以在人类肌肉横纹肌肉瘤(RD)细胞和非洲绿猴肾(Vero)细胞中分离，然后可以进行病毒RNA的逆转录聚合酶链反应(PCR)、间接免疫荧光和病毒微量中和试验。然而，上述方法相当冗长且费时。尽管最近开发了利用诸如定量实时PCR(qRT-PCR)的现代分子程序的快速诊断方法来解决这些问题，但是由于肠道病毒血清型之间的多种遗传差异，仍需要显着提高这种检测的灵敏度。
除了不存在的交叉保护性预防性多价疫苗和有效的广谱抗病毒药物外，缺乏标准化和准确的诊断方法也造成了这种高度传播的传染病的不必要的和潜在的过度的社会经济、财务和/或心理负担。由于实验室基础设施和现场支持有限，在日托中心、学校、社区、机构和门诊场所进行的HFMD诊断通常粗略地依赖于其典型的临床特征。然而，对于无显著性或不典型临床表现而引起的诊断并发症，视觉判断不可避免地导致误诊。因此，不精确的诊断辨别导致不适当的医疗方案或无法控制的疾病传播。
因此，开发HFMD即时检验(point-of-care testing,POCT)对于持续的治疗判断以及及时的临床隔离和针对实际病因的治疗方案都势在必行。如何充分利用病毒动力学是全面诊断导致手足口病的病毒的非穷尽谱的关键瓶颈。因此，在针对多病因性疾病的POC诊断的开发中，以病毒特异性系统宿主特征为方向可能是一种有前景的选择。
因此，需要一种用于检测引起HFMD的病毒的改进的方法。
发明内容
在本说明书中对明显是先前出版的文件的列举或讨论不必然被认为是承认该文件是现有技术的一部分或是公知常识。
本文引用的任何文件均通过引用将其全部内容并入本文。
在没有现有的即时检验(point-of-care，POC)诊断平台来进行准确诊断和及时病例隔离的情况下，与手足口病(HFMD)的斗争仍然是一项艰巨的挑战。因此，这项唾液生物标志物发现研究的目的是为实现HFMD的POC诊断奠定基础。
有利地，本发明采用还原性脱甲基化(reductive demethylation,R-diMe)化学标记方法与基于高分辨率质谱法(MS)的定量蛋白质组学技术相结合的方法，以筛选HFMD治疗期间整个唾液蛋白质组中普遍调节异常的蛋白质。进一步评估了筛选后的候选物作为HFMD唾液诊断生物标志物的潜力。因此，本发明涉及用于检测从个体获得的样本中的HFMD感染的这些蛋白质生物标志物。
在本发明的一方面，提供了一种用于确定手足口病(hand-foot-and-mouthdisease,HFMD)的方法，该方法包括在唾液样本中检测选自表1中定义的组(如图4所示)的至少一种蛋白质生物标志物的存在和/或量，其中所述唾液样本中所述蛋白质生物标志物的存在指示HFMD。
在不同的实施方案中，本发明的方法包括测量样本中存在的蛋白质生物标志物的量。例如，可以通过测量由本领域技术人员进行的比色测定法检测到的条带或点的强度来测量该量。另外，可以将获得的结果与阳性和阴性对照样本进行比较。
本发明用于检测唾液中所述蛋白质生物标志物的存在和/或量，因为获得唾液样本涉及非侵入性技术，这将有助于从诸如婴儿、学步儿童和幼童的患者中较为容易地收集样本，这些患者构成了受到HFMD影响和困扰的大部分人。鉴于该疾病在学校和日托中心中迅速传播，重要的是每天对这些婴儿、幼儿和儿童进行容易、快速的筛查，以便在这种疾病传播到学校或日托中心的其他人之前，可以快速检测任何感染。快速诊断可以使被感染的孩童远离学校人群，从而使疾病的传播最小化或被阻止。这意味着具备一种检测疾病的非侵入性方法将是有利的。本发明通过允许使用从儿童获得的唾液样本检测疾病来提供这种优势。唾液样本在进行本检测方法之前不需要任何处理。另外，本方法不必由医学专业人员进行，而是可以由父母和学校教师轻松容易地执行和进行，即，即时检验。与之形成对比的是，对儿童进行血液采集以用于HFMD诊断具有挑战性，并且需要在临床条件下进行。
“生物标志物”是指包括任何具有可用于测量疾病进展或治疗效果的特定生物学特性、生化特征或方面的分子指示物。蛋白质和核酸是示例性的生物标志物。特别地，在细胞外检测到的基因组信使可以用作疾病的生物标志物已被普遍接受。特别地，核酸已经在包括血液、尿液和脑脊髓液在内的大多数体液中被鉴定出，并且已成功地被用作疾病的诊断性生物标志物。然而，唾液不是血清的被动“超滤液”，而是包含酶、激素、抗体和其他分子的独特组成。唾液中特异性的和带有信息的生物标志物可望用于诊断疾病和监测人类健康。例如，已在唾液中鉴定出用于监测龋齿、牙周炎、口腔癌和唾液腺疾病的生物标志物。
优选地，蛋白质生物标志物选自由PRX-IV、豆荚蛋白(legumain)、SIL1和CREG1组成的组，并且检测到唾液样本中所述生物标志物中的任何一种或其任何组合的存在和/或量指示HFMD。本方法不仅可以通过检测单个蛋白质生物标志物而且可以通过检测与它们中的任何一种的组合来检测手足口病。
在不同的实施方案中，使用能与至少一种蛋白质生物标志物结合形成结合复合体的结合剂进行检测至少一种蛋白质生物标志物的存在和/或量的步骤。合适的结合剂包括基于它们与表1中列出的本发明的蛋白质生物标志物结合的能力从文库中选择或筛选的任何试剂。例如，结合剂可以是任何肽结合分子，其起作用的方式类似于本申请中描述的与生物标志物蛋白结合的抗体。可以使用分子生物学技术人员已知的任何这类结合或杂合(hydirdisation)方法。此类试剂可以是适合与本发明蛋白质生物标志物中的任何一种结合的任何给定的核酸、蛋白质或氨基酸基序。这些可以包括任何抗体或其片段。
在不同的实施方案中，抗体可以是任何抗人抗体(例如，抗-IgG、-IgM、-IgA等)。
在不同的实施方案中，此类抗体的实例包括任何抗-PRX-IV、抗-豆荚蛋白、抗-SIL1和抗-CREG1抗体。
抗体可以是单克隆的或多克隆的。合适的单克隆抗体可以通过已知技术制备，例如在“Monoclonal Antibodies:A manual of techniques”,H Zola(CRC Press,1988)和“Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and applications”,J G R Hurrell(CRC Press,1982)中描述的那些技术，两者均通过引用并入本文。片段可以包含一个或更多个可变重链(VH)或可变轻链(VL)结构域。例如，术语抗体片段包括Fab样分子(Betteretal(1988)Science 240,1041)；Fv分子(Skerra er al(1988)Science 240,1038)；单链Fv(ScFv)分子，其中VH和VL配偶体结构域通过柔性寡肽连接(Bird er al(1988)Science242,423；Huston et al(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,5879)和包含分离的V结构域的单域抗体(dAbs)(Ward et al(1989)Nature 341,544)。它还包括任何“抗体变体”，其意指任何合成抗体、重组抗体或抗体杂合体，例如但不限于通过免疫球蛋白轻链和/或重链可变区和/或恒定区的噬菌体展示产生的单链抗体分子，或能够在本领域技术人员已知的免疫测定形式中结合抗原的其他免疫相互作用分子。
对保留其特异性结合位点的抗体片段的合成所涉及的技术的综述见Winter&Milstein(1991)Nature 349,293-299。
在不同的实施方案中，结合剂可能是适体。
分子文库，例如抗体文库(Clackson et al,1991,Nature 352,624-628；Marks etal,1991,J Mol Biol 222(3):581-97)，肽文库(Smith,1985,Science 228(4705):1315-7)，表达的cDNA文库(Santi et al(2000)J Mol Biol 296(2):497-508)，抗体框架以外的其他骨架的文库，例如亲合体(Gunneriusson ef al,1999,Appl Environ Microbiol 65(9):4134-40)或基于适体的文库(Kenan ef al,1999,Methods Mol Biol 118,217-31)可用作结合剂的来源，从该来源中选择对给定基序具有特异性的结合剂用于本发明的方法中，特别是会与表1中定义的那些蛋白质生物标志物粘附并结合的那些结合剂。
分子文库可以在原核细胞(Clackson et al,1991,同上；Marks et al,1991,同上)中或真核细胞(Kieke et al,1999,Proc Natl Acad Sci USA,96(10):5651-6)中在体内表达，或者可以在体外表达而无细胞参与(Hanes&Pluckthun,1997,Proc Natl Acad SciUSA 94(10):4937-42；He&Taussig,1997,Nucleic Acids Res 25(24):5132-4；Nemoto etal,1997,FEBS Lett,414(2):405-8)。在使用基于蛋白质的文库的情况下，经常将编码潜在结合分子文库的基因包装在病毒中，并将潜在结合分子展示在病毒表面(Clackson et al,1991，同上；Marks et al,1991，同上；Smith,1985，同上)。
当从文库中选择潜在的结合分子时，通常使用一种或几种具有确定的基序的选择子肽(selector peptides)。提供结构、降低的肽的柔性或允许与结合分子相互作用的带电荷、极性或疏水性侧链的氨基酸残基可用于设计选择子肽的基序。
如将详细描述的，在不同的实施方案中，本发明的方法通过任何合适的阵列来进行。在侧向流层析检测(lateral flow assay)的例子中，将一抗固定在基体(substrate)(例如膜)或基质(matrix)上以捕获生物标志物蛋白。然后，使捕获抗体与生物标志物蛋白结合，将捕获抗体与在捕获蛋白质生物标志物时变色的酶偶联。
这样，在不同的实施方案中，测试样本中的至少一种生物标志物用可检测的部分标记。可检测的部分可选自由：荧光部分、发光部分、化学发光部分、放射性部分和酶促部分组成的组。
“可检测的部分”(detectable moiety)是指包括可以被检测并且该部分的相对量和/或位置可以被确定的任何部分。可检测的部分可以是荧光和/或发光和/或化学发光部分，当暴露于特定条件下时其可以被检测。例如，荧光部分可能需要暴露于特定波长和强度的辐射(即，光)以引起荧光部分的激发，从而使其能够在可以检测到的特定波长下发射可检测的荧光。
在不同的实施方案中，可检测的部分是金胶体。可替代地，或额外地，可以将本发明中使用的抗体与胶体金或金纳米颗粒偶联。
可替代地，可检测的部分可以是能够将(优选不可检测的)底物转化为可以被观察到的和/或可被检测到的可检测产物的酶。所使用的合适酶的实例可以是已知用于诸如ELISA测定中的那些酶。
可替代地，可检测的部分可以是可用于成像的放射性原子。合适的放射性原子包括用于闪烁显像研究的99mTc和123I。其他易于检测的部分包括例如，用于磁共振成像(MRI)的自旋标记物，例如再次被包括进来的123I、131I、111In、19F、13C、15N、17O、钆、锰或铁。显然，要检测的试剂(诸如例如，本文所述的测试样本和/或对照样本中的一种或多种蛋白质和/或用于检测所选蛋白质的抗体分子)必须具有足够的适当原子同位素以使可检测的部分易于被检测。
可以将放射性或其他标记物以已知方式掺入本发明的试剂(即，存在于本发明的方法的样本中的蛋白质和/或本发明的结合剂)中。例如，如果结合部分是多肽，则其可以被生物合成，或者可以使用的合适的氨基酸前体通过化学的氨基酸合成方法来合成，所述前体包括，例如，氟-19代替氢。诸如99mTc、123I、186Rh、188Rh和111In的标记物可以例如通过结合部分中的半胱氨酸残基连接。钇-90可以通过赖氨酸残基连接。氯甘脲(IODOGEN)方法(Fraker et al(1978)Biochem.Biophys.Res.Comm.80,49-57)可用于掺入123I。参考文献(“Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy”,J-F Chatal,CRC Press,1989)详细描述了其他方法。将其他可检测部分(例如酶促、荧光、发光、化学发光或放射性部分)缀合至蛋白质的方法是本领域众所周知的。
在不同的实施方案中，使用侧向流层析检测进行检测至少一种蛋白质生物标志物的存在和/或量的步骤。此类检测是简单的基于纤维素的设备，旨在检测液体样本(基质)(在当前例子中是唾液)中存在(或不存在)靶标分析物，无需专用且昂贵的设备。代表性的，这些测试用于家庭检验、即时检验或实验室用途的医学诊断。该技术基于一系列毛细管床，例如多孔纸、微结构化聚合物或烧结聚合物。这些元件中的每一个都具有自发传送唾液的能力。
第一元件(唾液样本垫)充当海绵并容纳过量的样本流体。浸泡后，流体迁移到结合有抗-蛋白质生物标志物的第二元件(“抗-蛋白质生物标志物”缀合垫)，即在盐糖基质中的干燥形式的生物活性颗粒，该生物活性颗粒包含确保蛋白质生物标志物(如果存在于唾液样本中)与其固定在颗粒表面上的化学配偶体(chemical partner)(例如，抗-蛋白质生物标志物)之间发生的优化化学反应的所有物质。当样本流体溶解该盐糖基质时，它也溶解该颗粒，并且在一种组合的传送作用下，样本和缀合物在流过多孔结构时混合。通过这种方式，分析物结合到颗粒上，同时进一步迁移通过第三毛细管床。这种材料具有一个或多个区域(通常称为条带)，制造商可以将第三分子固定在该区域上。当样本-缀合物混合物到达这些条带时，分析物已经结合在颗粒上，且第三“捕获”分子结合该复合物。一段时间后，当越来越多的流体通过条带时，颗粒聚积，条带区域变色。通常，至少有两个条带：一个(对照条带)捕获任何颗粒，从而表明反应条件和技术运行良好；而另一个包含特定的捕获分子，仅捕获其上已固定了分析物分子的那些颗粒。通过这些反应区后，流体进入最终的多孔材料——芯(wick)，该芯仅充当废物容器。
在不同的实施方案中，本发明的方法可以在反向侧向流层析检测中进行。在这种检测中，该方法包括：(a)提供具有第一端和第二端的固体支持物；(b)将结合剂(例如，本发明中描述的抗体)固定在固体支持物上，所述结合剂可以包含多于一种，并且如果这样的话，它们被分开地固定并且沿着固体支持物彼此间隔开；(c)将分子固定在固体支持物的第二端上，该分子(捕获分子，如进一步的抗体)能够结合复合物中的抗体，该分子进一步包含至少一种可检测的标记部分；(c)将样本(例如，包含表1列出的可能的蛋白质生物标志物的唾液样本)加载在固体支持物的第一端上，当样本在沿着固体支持物的第一方向上沿着固体支持物朝向第二端行进时，其接触所述结合剂，和(d)在与分子相邻的固体支持物的第二端上加载缓冲剂，使得当缓冲溶液在与第一方向相反的第二方向上沿着固体支持物行进时溶解分子，其中在固体支持物上形成的复合物的存在可以通过分子的标记部分检测到。可检测的标记部分可以是金缀合物。
这样的方法可以进一步被提供给一种吸收垫，该吸收垫被放置为与固体支持物的第一端相邻或紧邻，该吸收垫和固体支持物通过分隔物分开，其中移除该分隔物使得吸收垫和固体支持物之间可以接触以增强缓冲剂沿固体支持物在第二方向上的流动，例如增加缓冲剂的流速。
可以使用免疫测定技术人员已知的任何此类结合方法。
上述侧向流层析检测可以被制成试剂盒(例如，POCT试剂盒)的形式。该试剂盒可以具有一个或更多个反应室，使得多个样本可以在单个反应中彼此并列运行。
在不同的实施方案中，所述至少一种蛋白质生物标志物以0.1ug至1mg的量存在时指示存在HFMD感染。
优选地，可检测部分是稳定的同位素或放射性部分。然后使用高分辨率质谱检测至少一种蛋白质生物标志物。
在本发明的另一方面，提供了一种帮助对HFMD患者进行分类、诊断或确定预后的方法，该方法包括在唾液样本中检测至少一种选自表1中定义的组的蛋白质生物标志物的存在，其中唾液样本中所述蛋白质生物标志物的存在指示HFMD。
在本发明的另一方面，提供了选自表1中定义的组的一种或多种蛋白质生物标志物作为用于确定人类个体中的HFMD的生物标志物的用途。
在本发明的又一方面，提供了一种用于诊断人类个体中的HFMD的试剂盒，该试剂盒包括用于检测唾液样本中至少一种选自表1中定义的组的蛋白质生物标志物的存在的测定。
试剂盒可进一步包括水和杂交缓冲剂，以促进结合剂与样本中可能存在的蛋白质生物标志物的杂交。
试剂盒的组分可以包装在水性介质中或以冻干形式包装。试剂盒的容器手段通常将包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器手段，组分可以被放置于其中，并且优选适当地等分。在试剂盒中有多于一种成分(标记试剂和标签可以包装在一起)的情况下，试剂盒通常还将包含第二、第三或其他额外容器，其他组分可以被单独放入其中。然而，小瓶中可以包含组分的各种组合。本发明的试剂盒通常还包括用于容纳核酸的手段，以及可以用于商业销售的密闭限定空间中的任何其他试剂容器。这样的容器可以包括将期望的小瓶保留在其中的注射或吹塑成型的塑料容器。当试剂盒的组分以一种和/或更多种液体溶液形式提供时，所述液体溶液是水溶液，尤其优选无菌水溶液。
然而，试剂盒的组分可以干燥粉末的形式提供。当试剂和/或组分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来重建粉末。可以设想，溶剂也可以在另一个容器手段中提供。
容器手段通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器和/或其他容器手段，核酸制剂被放置在其中，优选地被适当地分配。试剂盒还可包含第二容器手段装置，用于容纳无菌的、药学上可接受的缓冲剂和/或其他稀释剂。
本发明的试剂盒通常还将包括用于在密闭限定空间中容纳小瓶以进行商业销售的手段，诸如例如将期望的小瓶保留在其中的注射和/或吹塑成型塑料容器。
此类试剂盒还可包括保存或维持寡核苷酸或防止其降解的组分。此类组分可以是无RNA酶的或保护免受RNA酶降解的。此类试剂盒通常将以合适的方式包含用于每种单独的试剂或溶液的不同容器。试剂盒还将包括使用试剂盒组分以及使用试剂盒中未包含的任何其他试剂的使用说明。使用说明可包括可以实现的变化形式。
预期此类试剂是本发明试剂盒的实施方案。然而，此类试剂盒不限于上面鉴定的特定物品，并且可以包括用于操纵或表征蛋白质标志物的任何试剂。在不同的实施方案中，本发明的试剂盒和测定方法可包括US 6316205中公开的那些。
有利地，本发明的简单直接的采集方法省去了样本处理，并且不需要任何专业技术就可以操作，从而促进实现医院和实验室外部的即时检验。由于仅需要唾液进行诊断，因此我们提出的诊断试剂盒可能潜在地用于其中没有现成的实验室基础设施和支持的家庭、日托中心、学校、社区、机构和门诊场所。该测试所需的唾液输入量低至5μl，这使得该测试具有发展潜力。
当在权利要求书和/或说明书中与术语“包括(comprising)”结合使用时，使用词语“一(a)”或“一(an)”可以表示“一个(one)”，但它也与“一个或更多个(one or more)”、“至少一个(at least one)”，“和”一个或多于一个(one or more than one)的含义一致。
可预期的是，本文所讨论的任何实施方案可以对本发明的任何方法或组合物实施，反之亦然。此外，本发明的组合物和试剂盒可用于实现本发明的方法。
在整个申请中，术语“约”用于表示某个值包括用于确定该值的装置或方法的误差的标准偏差。
除非明确指出仅指替代方案或替代方案是相互排斥的，权利要求中的术语“或”的使用于表示“和/或”，尽管本公开支持意为仅仅是替代方案和“和/或”的定义。
如在说明书和权利要求书中所用，词语“包含(comprising)”(和包含(comprising)的任何形式，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)，“具有(having)”(和具有(having)的任何形式，例如“具有(have)”和“具有(has)”)，“包括(including)”(以及包括(including)的任何形式，例如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(以及含有(containing)的任何形式，例如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包含性的或开放式的，并且不排除另外未列举的元素或方法步骤。
从以下详细描述中，本发明的其他目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应该理解，详细描述和具体实施例虽然表明了本发明的具体实施方案，但仅以举例说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员而言从本详细描述中将变得显而易见。
为了使本发明可以被充分理解并容易地付诸实施，现在将通过非限制性实施例的方式仅描述本发明的优选实施方案，该描述是参照附图进行的。
附图说明
图1是HFMD唾液生物标志物候选物的火山图(volcano plot)。
图2是显示在HFMD和219例健康例中调节异常的唾液蛋白的归一化点强度的图。每个图的左侧框代表“肠道病毒阴性”，而每个图的右侧框代表“肠道病毒阳性”。使用每个印迹中包含的标准化物220对每个病例的斑点强度进行归一化，用于后续印迹间的比较。进行221次Mann-Whitney非参数检验，以比较222例HFMD和健康例中唾液PRX-IV、豆荚蛋白、SIL和CREG1的斑点强度。***p值<0.001。
图3是用于预测HFMD 226状态的调节异常的唾液蛋白的ROC曲线。唾液PRX-IV、豆荚蛋白、SIL1和CREG1的AUC分别为0.775、0.755、0.550、227和0.518。这表明对PRX-IV和228豆荚蛋白的相对较好的鉴别测试，但对SIL1和CREG1无鉴别测试。
图4显示表1显示本发明的19种上调(阴影)蛋白和51种下调(非阴影)蛋白的列表。HFMD病例(相对于健康例归一化)中唾液蛋白的相对表达被记录。基于从三组生物重复样本(D64、D66和D68)获得的数据计算平均倍数变化和p值。表中显示了平均倍数变化≥1.5(p值≤0.05)的唾液蛋白。
图5是用于基于实验室的HFMD病例的验证性16诊断的示意性工作流程。
图6是用于筛选HFMD唾液20生物标志物的示意图。使用二甲基标记无凝胶质谱(MS)处理等量的合并的患者唾液蛋白(n＝3)和合并的来自志愿者的健康21唾液蛋白(n＝3)，22检测两组之间差异表达的蛋白(即，HFMD vs.健康)。
图7是使用斑点印迹测定(dotblot assay)验证HFMD候选26唾液生物标志物的示意图。
图8显示了表2：候选唾液生物标志物的评估。
图9显示了表3：使用径向基236函数核函数分析对组合候选唾液生物标志物的评估。
具体实施方式
实施例1
1.材料和方法
使用还原性二甲基化化学标记方法结合基于高分辨率质谱法的定量蛋白质组学技术，对从HFMD患儿和健康儿童获得的唾液进行完整的唾液蛋白质组谱分析。
从KK妇女儿童医院招募HFMD患者和从儿童保育中心招募健康志愿者的综合方案得到SingHealth CIRB的伦理委员会(参考编号：2012/448/E)NUS-IRB(参考代码：B-14-273)的支持，并根据其指南进行。
临床医师采用用于HFMD的发烧、口腔溃疡以及手掌和足底皮肤病变的临床病例定义对患者进行评估。临床确定的HFMD病例使用病毒基因分型证实。健康志愿者的肠道病毒也被检测为阴性(参见图5)。
使用二甲基标记的无凝胶质谱，将实验室确诊的HFDM病例的合并唾液与实验室排除的健康例的合并唾液进行比较。简言之，蛋白质样本在8M尿素中变性，在5mM DTT中还原，并在10mM IAA中烷基化。随后，在强变性条件下(6M尿素)在37℃ O/N下用Lys-C(1:100)进行溶液内消化，然后在较弱变性条件(1M尿素)下在37℃下用胰蛋白酶(1:50)消化4h。然后，通过R-diMe，在测试和对照组的肽的伯胺上用不同的同位素异构体标记，以产生不同的标记肽库。将差异标记的样本以1:1的比例混合，并使用3100OFFGEL分馏器(AgilentTechnologies,USA)将其分馏为12个馏分。最后将各个馏分浓缩，并使用自-组装的C18阶段吸头进行脱盐，然后洗脱进行MS分析(参见图6)。在相同的质谱图中以无偏置方式对每个肽对(“重”vs.“轻”)的相对信号强度进行定量，以确定每种鉴定出的蛋白质的相对丰度。使用Uniprot人FASTA(Uniprot Human FASTA)数据库通过MaxQuant版本1.3.0.5分析MS数据，其中最大错误发现率设置为0.01。蛋白质的身份通过至少一种最小长度为7个氨基酸的独特肽来确认。
肽/比率计数小于2的蛋白质，常见的MS污染物以及仅通过位点鉴定的蛋白质被排除在输出列表之外。进行了三次生物学重复，并且在Mascot软件中综合输出列表，以检测HFMD期间常见的调节异常蛋白。从综合列表中选择至少1.5倍差异表达且p值小于0.05的蛋白质。
为了进行斑点印迹验证，将5μl唾液样本点样到0.2μm的硝酸纤维素膜上。将标准化物添加到每个膜上以解决印迹间的蛋白质印迹(Western blot)膜暴露差异。总共使用了36个患病和46个健康的唾液样本进行验证。使样本吸附1小时。膜用PBS冲洗三次，然后使用蛋白质印迹探测各个蛋白质候选物。使用的一抗是来自Abcam(UK)的抗-豆荚蛋白(anti-legumain)EPR14718(#ab183028)、抗-过氧化物还原酶4EPR15458(B)(#ab184167)、抗SIL1(#ab5639)和抗CREG1 AT1C6(#ab201699)。使用的二抗是来自GE Healthcare(USA)的抗兔IgG-HRP(#NA934V)和抗小鼠IgG-HRP(#NA931)，以及来自Santa Cruz Biotechnology,Inc.(USA)的抗山羊IgG-HRP(#sc-2020)。使用Image J程序(National Institutes ofHealth,USA)测量相对斑点强度，并相对于每个印迹中包含的标准化物进行归一化(参见图7)。比较HFMD患者和健康志愿者之间各自的唾液蛋白的归一化斑点强度。所有统计分析均使用GraphPad Prism 4.0版(GraphPad software,USA)，使用Mann-Whitney非参数检验(无高斯分布假设)进行。低于0.05的p值被认为是统计学上显著的。
2.结果
使用R-diMe标记结合无凝胶质谱法，将手足口病患者的唾液蛋白质组与健康的125名志愿者的唾液蛋白质组进行比较。图1中的火山图显示了手足口病期间三个生物重复过程中普遍调节异常的蛋白质。标明蛋白质身份的斑点表示显著上调的蛋白质，而没有标明蛋白质身份的斑点表示显著下调的蛋白质。发现19种上调的蛋白质和51种下调的蛋白质具有统计学显著性(列于表1中，如图4所示)。
选择上调的蛋白用于下游验证。进行扩展的在线数据库文献搜索，以除去已报道的与口腔疾病(例如牙周炎和口腔癌)相关的命中蛋白。在唾液或唾液腺中低表达或无表达的蛋白质也被排除在验证列表之外。根据文献和数据库搜索排除以及新颖性，选择最终候选的命中蛋白，即过氧化物酶4(PRX-IV)、豆荚蛋白、SIL1和CREG1。
使用来自确诊HFMD患者和健康志愿者的唾液样本进行斑点印迹验证测定以评估各个生物标志物的敏感性和特异性。由于在数据分析之前进行的正态性检验表明数据不是正态分布的，因此进行Mann-Whitney非参数检验以进行后续的统计比较。
Mann-Whitney非参数检验表明，在HFMD病例中，唾液PRX-IV(p<0.001)和豆荚蛋白(p<0.001)显着增强，但SIL1(p＝0.446)和CREG1(p＝0.790)并非显着增强。在HFMD和健康例中，唾液PRX-IV的中值斑点强度分别为9927(最小值-最大值：3102-21600)和7268(最小值-最大值：2504-12550)。手足口病和健康例中，唾液豆荚蛋白的中值斑点强度分别为4965(最小值-最大值：178.2-13240)和1765(最小值-最大值：399.6-8874)。在手足口病和健康例中，唾液SIL1的中值斑点强度分别为8127(最小值-最大值：2603-28670)和9286(最小值-最大值：1518-16890)。在手足口病和健康例中，唾液CREG1的中值斑点强度分别为9176(最小值-最大值：2507-34250)和10420(最小值-最大值：1896-15510)(参见图2；和图8表2)。
在区分HFMD和健康例时，各个蛋白质的ROC曲线还证明了唾液PRX-IV和豆荚蛋白(而非SIL1和CREG1)的预后应用。唾液PRX-IV的ROC的AUC为0.775(95％CI：0.668-0.883，p<0.001)。唾液豆荚蛋白的ROC的AUC为0.775(95％CI：0.646-0.865，p<0.001)。唾液SIL1的ROC的AUC为0.550(95％CI：0.419-0.680，p＝0.444)。唾液CREG1的ROC的AUC为0.518(95％CI：0.387-0.648，p＝0.786)(参见图3；和图8表1)。径向基函数核函数分析进一步表明，与唾液SIL1组合使用时，性能最佳的单个候选物的AUC可以提高到0.813(如图9表3所示)。
3.讨论
在本研究中，筛查了HFMD患者的唾液蛋白质组中在HFMD期间调节异常的唾液蛋白。本文中，我们鉴定了70种HFMD-调节异常的唾液蛋白，其中19种上调，而其中51种下调。选择了四种蛋白质，即PRX-IV、豆荚蛋白、SIL1和CREG1，用于下游验证。PRX-IV通过调节IKK介导的抑制性IKBα的磷酸化而成为NF-KB的正调节剂。这是一项有趣的发现，因为具有各种抗病毒作用的NF-KB信号传导通常是逃避宿主免疫力的病毒靶标。许多研究报道了各种肠道病毒非结构蛋白直接或间接减弱NF-KB活性。然而，Sauter等人(2015)报道了在NF-κB中同时发挥前病毒和抗病毒作用的可能性。
豆荚蛋白是一种半胱氨酸蛋白酶，参与MHC II类呈递的内在化EGFR降解以及外源性溶酶体抗原加工途径。溶酶体中的病毒蛋白加工可能是MHC II类分子为免疫应答呈递病毒抗原的先决条件。实际上，据报道，MHC II类缺陷与肠道病毒感染的易感性增加有关。
蛋白SIL1是一种核苷酸交换因子，其可调节Hsp70 Bip分子伴侣的ATP酶活性，是ER中的蛋白质折叠和组装以及蛋白质关闭(shutting)所必需的。该蛋白可能部分参与广泛的ER重建，这是形成-病毒诱导的用于病毒复制的膜结构的先决条件。这些结构，也称为病毒RC，不仅集中了必需的宿主因子以促进有效的病毒复制，而且还包裹和屏蔽了病毒组分以抵抗宿主免疫。
蛋白CREG1是一种分泌的糖蛋白，参与细胞生长和分化的负转录调控。
验证数据表明，在HFMD病例中，唾液PRX-IV和豆荚蛋白的相对表达与筛查数据一致，显着增加。
预期的唾液蛋白的诊断敏感性和特异性也被评估尽管高灵敏度对于筛查以鉴别患病个体是必不可少的，但高特异性对于诊断以区分健康个体与患病个体也是必需的。然而，根据观察者确定的折衷标准，灵敏度和特异性可能是武断的。因此，进行了ROC曲线分析(一种流行的临床诊断测试评估方法)，以评估这些蛋白质作为HFMD生物标志物的预后应用。ROC曲线绘制真实阳性(敏感性)相对于假阳性的曲线(1-特异性)，以得出预后测试的敏感性/特异性阈值的不同可能组合。
因此，AUC是对预测因子作为识别疾病状态与健康状态的诊断工具的能力的有用且公正的评估。它测量前瞻性生物标志物的判别力，其中AUC为1表示完美的诊断测试，而AUC为0.5表示无差别的诊断测试[49]。分析证实了唾液PRX-IV和豆荚蛋白在区分HFMD和健康病例中的预后应用。进一步的分析还显示了使用组合生物标志物候选物用于增强诊断的潜力。
UC-ROC曲线是在各种阈值设置下针对分类问题的性能度量。ROC是概率曲线，且AUC表示可分离性的程度或度量。它告诉我们多少模型能够在类别之间进行区分。AUC越高，模型在将0s预测为0s和将1s预测为1s时越好。以此类推，AUC越高，该模型在区分有疾病和无疾病的患者方面越好。此处给出计算示例：https://towardsdatascience.com/ understanding-auc-roc-curve-68b2303cc9c5.
本发明举例说明了唾液在基于宿主蛋白质组变化的HFMD POC诊断中的潜在用途。由于主要的目标最终用户是年幼的儿童，因此该初步研究克服了现有的基于临床或分子的诊断测试所存在的局限性。收集过程的非侵入性的目的是诊断测试的可接受性。简单直接的采集方法省去了样本处理，并且不需要任何技术知识就可以操作，旨在促进实现医院和实验室外部的即时检验。由于唾液是人体的系统代表，因此其在即时检验(POCT)中的使用能够及时检测和隔离HFMD病例。
尽管在前面的描述中已经描述了本发明的优选实施方案，但是本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的情况下，可以对设计或构造的细节进行多种变化或修改。

Claims (12)

1.一种用于确定手足口病(HFMD)的方法，所述方法包括在唾液样本中检测选自表1中定义的组的至少一种蛋白质生物标志物的存在和/或量，其中所述唾液样本中的所述蛋白质生物标志物的存在和/或量指示手足口病。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种蛋白质生物标记物选自由PRX-IV、豆荚蛋白、SIL1和CREG1组成的组，并且检测所述唾液样本中所述生物标志物的任何一种或其任何组合的存在和/或量指示手足口病。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述检测至少一种蛋白质生物标志物的存在和/或量的步骤是使用能够结合所述至少一种蛋白质生物标志物以形成结合的复合体的结合剂进行的。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述结合剂是抗体或其片段。
5.根据权利要求3或4中任一项所述的方法，其中所述结合剂标记有可检测的部分。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述可检测的部分选自由：荧光部分、发光部分、化学发光部分、放射性部分和酶促部分组成的组。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测至少一种蛋白质生物标志物的存在和/或量的步骤使用侧向流层析检测进行。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种蛋白质生物标志物以0.1ug至1mg的量存在时指示手足口病感染。
9.一种用于诊断患有手足口病的患者的方法，所述方法包括检测唾液样本中选自表1中定义的组的至少一种蛋白质生物标志物的存在，其中所述唾液样本中所述蛋白质生物标志物的存在指示手足口病。
10.选自表1中定义的组的一种或更多种蛋白质生物标志物作为用于确定个体中的手足口病的生物标志物的用途。
11.一种用于诊断个体中的手足口病的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测唾液样本中至少一种蛋白质生物标志物的存在的测定法。
12.根据权利要求9所述的试剂盒，其进一步包含能够与选自表1所定义的组中的至少一种蛋白质生物标记物结合的结合剂。
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