KR101867455B1 - 나노운반체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 초음파 조영제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 나노운반체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 초음파 조영제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 pH에 따라 가스방출이 변화하는 탄산칼슘을 포함하는, 생체적합성 고분자인 플루로닉 기반의 나노운반체를 제조하고, 이를 이용하여 정맥주입에 의해서도 안정성을 부여하고, 생체 내 암종에만 선택적으로 조영효과를 나타내는 암조직 초음파 이미징을 위한 초음파 조영제로 응용할 수 있다.
Description
본 발명은 나노운반체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 초음파 조영제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 pH에 따라 가스방출이 변화하는 탄산칼슘을 포함하는, 생체적합성 고분자인 플루로닉 기반의 나노운반체를 제조하고, 이를 암조직 초음파 이미징을 위한 초음파 조영제로 응용하는 기술에 관한 것이다.
초음파 영상은 고주파 음파를 사용하는 진단 영상기법으로서, 다른 진단법이 더 나은 영상 분해능을 제공한다 하더라도, 진단과정 동안 환자의 안전에 있어서는 다른 진단법보다 더 많은 이점이 있다(비특허문헌 1.). 예를 들어, 자기공명영상(MRI)은 환자의 피부와 조직에 화상을 발생시키거나, 인공 심박 조율기 또는 폐소공포증을 보유한 환자들에게는 위험할 수 있다. 또한 컴퓨터 단층촬영(CT) 영상은 X선 투사를 사용함으로써 조직내 암종 유발 등의 내재적 위험을 갖는다. 이에 따라서, 자기공명영상 및 컴퓨터 단층촬영 영상의 위험을 최소화하기 위해 이에 대한 규격기준이 성립되었다. 이에 반해, 초음파 영상은 임신한 여성에게도 매우 안전한 방법이며, 나아가 비용측면에서 자기공명영상 또는 컴퓨터 단층촬영 영상의 사용이 제한적인 것에 비해, 초음파 영상은 저비용으로 사용할 수 있어, 대부분의 병원에서 광범위하게 사용가능하다.
초음파 영상은 조직들 사이의 서로 다른 초음파 특성에 기초하여, 조직구조로부터 초음파 신호의 반사와 굴절에 의해 인체 내부의 조직구조를 보여줄 수 있다. 그러나 종양과 같은 이상조직들이 정상조직들과 상당히 비슷한 초음파 특성을 갖는 경우, 초음파 영상 단독으로는 정상조직으로부터 이상조직을 간단하게 구별해내기 어려운 단점이 있다. 조직들 사이의 초음파 특성이 유사하기 때문에 초음파 영상의 낮은 분해능을 향상시키기 위해 유기물 또는 무기물이 포함된 초음파 적용 조영제(UECA, Ultrasound enhanced contrast agent)가 사용되었다. 일반적으로 고형 및 비고형 사이에서 초음파 특성의 차이점으로 인한 초음파 대비특성 향상을 위해, UECA는 가스 탈착특성을 가진 마이크로버블 및 나노버블 또는 중공 구조물을 기반으로 한다(비특허문헌 2.).
나아가 더욱 효율적인 UECA로써, 수성조건에서 탄산수소염 화합물, 및 탄산칼슘과 같은 가스생성 물질을 담지시킴으로써 가스를 생성할 수 있는 입자를 개발하였다. UECA의 가스생성 곁사슬의 가수분해에 의한 가스생성 UECA는 수성조건에서 안정성이 낮고, 가스 생성시간이 짧다. 이에 반해,탄산칼슘을 포함하는 UECA는 수성조건에서 비교적 안정한 성질을 보이며, 또한, pH가 낮을수록 발생되는 가스 생성양이 증가하는 탄산칼슘의 성질에 의해 다른 조직보다 낮은 pH를 지닌 종양에서 효과적인 초음파 조영 효과를 얻을 수 있으며, 이러한 특징에 의해, 탄산칼슘을 포함하는 UECA를 종양 내의 주사를 통해 주입하면 산성의 종양 조건에서의 축적된 가스 생성에 의해 향상된 안정성 및 초음파 영상을 보인다(비특허문헌 3.).
다양한 UECA 중에서, 나노크기의 UECA는 마이크로크기의 UECA가 갖는 비슷한 초음파 조영효과를 보일뿐만 아니라, 나노크기에 의한 선택적 투과 보유(EPR, Enhanced Permeability and Retention)효과로 인해 마이크로크기의 UECA보다 향상된 생체 내 종양 축적물을 보유할 수 있다(비특허문헌 4.). 이로 인해, 침투성 전달에 의한 종양 위치 감지를 기대할 수 있다. 그러나 현재까지는 정맥주입을 통한 나노크기의 UECA에 의해 다른 조직들로부터 종양을 명확하게 구별해내는 종양진단을 위한 적합한 UECA는 보고된 바가 없다. 예를 들어, 나노크기의 UECA가 정맥주입을 통해 투입될 때, 표적종양 내의 낮은 UECA 축적 때문에 초음파 이미징에 의한 종양 감지가 불가능하고, 종양위치는 나노크기의 UECA를 표적위치의 종양 내에 주입된 후에만 초음파 이미징에 의해 감지가 가능하다(비특허문헌 5). 다른 경우로, 과불화헥산(perfluorohexane)을 포함하는 ~300 nm 크기의 UECA는 B-모드(Brightness mode) 및 정맥주입 후의 출력 도플러 모드(Power doppler mode)의 사용으로, 종양에서 뿐만 아니라 간에서 더 두드러지는 증강 대비신호를 보인다(비특허문헌 6.). 이에 따라, 현재까지 초음파 이미징에 의한 선택적 종양감지는 입증된 바가 없다.
따라서 본 발명자는 플루로닉 기반의 나노운반체 내에 알지네이트(alginate)를 담지한 후, 이에 탄산칼슘을 담지시킴으로써 나노운반체를 제조할 수 있으며, 이를 이용하여 정맥주입을 통한 초음파 이미징으로 종양의 위치를 감지할 수 있는 초음파 조영제로 응용할 수 있음에 착안하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
비특허문헌 1. Taeymans O, Penninck DG, Peters RM. Vet Radiol Ultrasound. 2013. 54. 61-70.
비특허문헌 2. Goldberg BB, Liu J-B, Forsberg F. Ultrasound Med Biol. 1994. 20. 319-33.
비특허문헌 3. Min KH, Min HS, Lee HJ, Park DJ, Yhee JY, Kim K, et al. ACS Nano. 2015. 9. 134-145.
비특허문헌 4. Figueiredo M, Esenaliev R. J Drug Deliv. 2012. 2012. 1-20.
비특허문헌 5. Dㅽaz-Lㆃpez R, Tsapis N, Santin M, Bridal SL, Nicolas V, Jaillard D, et al. Biomaterials. 2010. 31. 1723-31.
비특허문헌 6. Yang P, Li D, Jin S, Ding J, Guo J, Shi W, et al. Biomaterials. 2014. 35. 2079-88.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 고려하여 안출된 것으로, 본 발명의 제1 목적은 pH에 따라 가스방출이 변화하는 나노운반체 및 그 제조방법을 제공하고자 하는 것이다.
또한, 본 발명의 제2 목적은 본 발명에 따른 나노운반체를 이용하여, 정맥주입에 의해서도 안정성을 부여하고, 생체 내 암종에만 선택적으로 조영효과를 나타내며, 빠르게 체외로 배출되는 기능을 가진 암조직 초음파 이미징을 위한 초음파 조영제를 제공하고자 하는 것이다.
상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 하기 화학식 1로 표현되는 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체; 상기 나노운반체에 담지된 알지네이트; 및 탄산칼슘 입자;를 포함하는 나노운반체를 제공한다.
[화학식 1]
상기 n은 8-540까지의 정수이고; 상기 m은 16-70까지의 정수이다.
상기 화학식 1로 표현되는 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체는 나노겔 상인 것을 특징으로 한다.
상기 탄산칼슘은 칼사이트, 바테라이트 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
상기 나노운반체의 크기는 37 ℃에서 100 내지 200 nm인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 나노운반체를 포함하는 초음파 조영제를 제공한다.
상기 조영제는 정맥 주사제 형태인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 (a) 하기 화학식 1로 표현되는 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체를 수득하는 단계; (b) 상기 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체 및 알지네이트 수용액을 혼합하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 혼합액 및 염화칼슘 수용액을 혼합하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계의 혼합액에 탄산나트륨 수용액을 첨가하여 반응시키는 단계;를 포함하는 나노운반체의 제조방법을 제공한다.
[화학식 1]
상기 n은 8-540까지의 정수이고; 상기 m은 16-70까지의 정수이다.
상기 제조방법은 (e) 상기 (d) 단계의 반응용액을 정제한 후, 정제용액을 동결건조시키는 단계;를 더욱 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 (b) 단계의 혼합액, 염화칼슘 수용액 및 탄산나트륨 수용액의 부피비는 1:0.5-1.5:1-2인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, pH에 따라 가스방출이 변화하는 나노운반체 및 그 제조방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 나노운반체를 이용하여, 정맥주입에 의해서도 안정성을 부여하고, 생체 내 암종에만 선택적으로 조영효과를 나타내며, 빠르게 체외로 배출되는 기능을 가진 암조직 초음파 이미징을 위한 초음파 조영제를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 제조예 1, 제조예 2 및 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 형성과정을 도식화한 이미지이다.
도 2는 (A) 본 발명의 제조예 1로부터 제조된 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(Bare NC), 제조예 2로부터 제조된 알지네이트가 담지된, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(AlgNC), 및 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 온도별 크기를 비교한 그래프 및 37 ℃에서의 CaCO3AlgNC의 투과전자현미경(TEM) 이미지, (B) 본 발명의 제조예 1로부터 제조된 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(Bare NC), 통상의 알지네이트(Alginate), 제조예 2로부터 제조된 알지네이트가 담지된, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(AlgNC), 및 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 표면전하를 비교한 그래프이다[스케일 바: 200 nm].
도 3은 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 37 ℃ 및 혈청 10%를 포함하는 배지 조건에서의 크기 안정성을 나타낸 그래프이다[n=3].
도 4는 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC) 및 다른 샘플들의 (A) 적외선분광분석(FT-IR) 특성 비교 그래프, (B) x-선 회설(XRD) 특성 비교 그래프이다[CaCO3: 15 시간 동안 Ca2+ 및 CO3 2-의 직접 반응에 의해 제조된 CaCO3, CaCO3(15 min): 15분 동안 Ca2+ 및 CO3 2-의 직접 반응에 의해 제조된 CaCO3, CaCO3(3 sec): 3 초 동안 Ca2+ 및 CO3 2-의 직접 반응에 의해 제조된 CaCO3].
도 5는 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 열중량 분석(TGA) 및 DMMB(1,9-메틸 메틸렌 블루) 분석을 통해 나노운반체가 포함하는 탄산칼슘(CaCO3), 알지네이트 (Algnate) 및 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(Bare NC)의 양을 나타낸 그래프 및 조성표이다[n=3].
도 6은 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 pH에 따른 CO2 발생 정도를 나타낸 이미지이다.
도 7은 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC) 및 다른 샘플들이 각기 다른 pH의 1 중량% 아가로오스 겔에 주입된 후의 초음파 이미지이다[Scale bar = 5 mm, 빨간색 원: 아가로오스 겔].
도 8은 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)가 각기 다른 pH의 1 중량% 아가로오스 겔에 주입된 후의 시간 경과에 따른 (A) 초음파 이미지, (B) 초음파 조영 증강비((I-I0 )/I0, I0: PBS(phosphate buffered saline, 인산완충식염수) 주입 강도)를 나타낸 그래프이다[Scale bar = 5 mm, 빨간색 원: 아가로오스 겔, n=3].
도 9는 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)가 낮은 pH 의 1 중량% 아가로오스 겔에 주입된 후의 장기간 초음파 이미지이다[Scale bar = 5 mm, 빨간색 원: 아가로오스 겔].
도 10은 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 셀 카운팅 키트-8(CCK-8) 및 편평상피암종(SCC7)을 이용하여 세포 활성에 의한 독성을 분석한 그래프이다[n=3].
도 11은 (A) 본 발명의 제조예 2로부터 제조된 알지네이트가 담지된, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(AlgNC), 및 (B) 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 정맥주입 전과 후의 생체 내 초음파 이미지, (C) 본 발명의 제조예 2로부터 제조된 알지네이트가 담지된, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(AlgNC), 및 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 조영 증강비(I주입후/I주입초)를 비교한 그래프이다[스케일 바: 5 mm, #: p>0.05].
도 12는 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 정맥주입 전과 후의 종양을 가진 쥐의 간 초음파 이미지이다[n=3, Scale bar = 5mm].
도 13은 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 정맥주입 후의 (A) 종양을 가진 쥐, (B) 탈체(ex vivo)로 외식된 종양 및 주요 기관 의 근적외선(NIR) 형광 이미지, (C),(D) 형광 강도의 정량적 비교를 나타낸 그래프이다[n=3, 검은색 원: 종양 부위, *: p<0.05].
도 14는 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 정맥주입 후의 (A) 종양을 가진 쥐, (B) 탈체(ex vivo)로 외식된 종양 및 주요 기관의 근적외선(NIR) 형광 이미지이다[n=3, 검은색 원: 종양 부위, Scale bar = 5 mm].
도 15는 (A) PBS(phosphate buffered saline, 인산완충식염수)(pH7.4), (B) 본 발명의 제조예 2로부터 제조된 알지네이트가 담지된, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(AlgNC), 및 (C) 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 정맥주입 후 1 시간 경과 후의 알리자린 레드 S 염색 이미지, (D),(E), 및 (F): (A), (B), 및 (C) 각각의 확대 이미지이다[(A),(B),(c): 스케일 바 1 mm, (D),(E),(F): 스케일 바: 100 μm].
도 2는 (A) 본 발명의 제조예 1로부터 제조된 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(Bare NC), 제조예 2로부터 제조된 알지네이트가 담지된, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(AlgNC), 및 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 온도별 크기를 비교한 그래프 및 37 ℃에서의 CaCO3AlgNC의 투과전자현미경(TEM) 이미지, (B) 본 발명의 제조예 1로부터 제조된 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(Bare NC), 통상의 알지네이트(Alginate), 제조예 2로부터 제조된 알지네이트가 담지된, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(AlgNC), 및 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 표면전하를 비교한 그래프이다[스케일 바: 200 nm].
도 3은 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 37 ℃ 및 혈청 10%를 포함하는 배지 조건에서의 크기 안정성을 나타낸 그래프이다[n=3].
도 4는 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC) 및 다른 샘플들의 (A) 적외선분광분석(FT-IR) 특성 비교 그래프, (B) x-선 회설(XRD) 특성 비교 그래프이다[CaCO3: 15 시간 동안 Ca2+ 및 CO3 2-의 직접 반응에 의해 제조된 CaCO3, CaCO3(15 min): 15분 동안 Ca2+ 및 CO3 2-의 직접 반응에 의해 제조된 CaCO3, CaCO3(3 sec): 3 초 동안 Ca2+ 및 CO3 2-의 직접 반응에 의해 제조된 CaCO3].
도 5는 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 열중량 분석(TGA) 및 DMMB(1,9-메틸 메틸렌 블루) 분석을 통해 나노운반체가 포함하는 탄산칼슘(CaCO3), 알지네이트 (Algnate) 및 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(Bare NC)의 양을 나타낸 그래프 및 조성표이다[n=3].
도 6은 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 pH에 따른 CO2 발생 정도를 나타낸 이미지이다.
도 7은 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC) 및 다른 샘플들이 각기 다른 pH의 1 중량% 아가로오스 겔에 주입된 후의 초음파 이미지이다[Scale bar = 5 mm, 빨간색 원: 아가로오스 겔].
도 8은 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)가 각기 다른 pH의 1 중량% 아가로오스 겔에 주입된 후의 시간 경과에 따른 (A) 초음파 이미지, (B) 초음파 조영 증강비((I-I0 )/I0, I0: PBS(phosphate buffered saline, 인산완충식염수) 주입 강도)를 나타낸 그래프이다[Scale bar = 5 mm, 빨간색 원: 아가로오스 겔, n=3].
도 9는 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)가 낮은 pH 의 1 중량% 아가로오스 겔에 주입된 후의 장기간 초음파 이미지이다[Scale bar = 5 mm, 빨간색 원: 아가로오스 겔].
도 10은 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 셀 카운팅 키트-8(CCK-8) 및 편평상피암종(SCC7)을 이용하여 세포 활성에 의한 독성을 분석한 그래프이다[n=3].
도 11은 (A) 본 발명의 제조예 2로부터 제조된 알지네이트가 담지된, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(AlgNC), 및 (B) 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 정맥주입 전과 후의 생체 내 초음파 이미지, (C) 본 발명의 제조예 2로부터 제조된 알지네이트가 담지된, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(AlgNC), 및 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 조영 증강비(I주입후/I주입초)를 비교한 그래프이다[스케일 바: 5 mm, #: p>0.05].
도 12는 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 정맥주입 전과 후의 종양을 가진 쥐의 간 초음파 이미지이다[n=3, Scale bar = 5mm].
도 13은 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 정맥주입 후의 (A) 종양을 가진 쥐, (B) 탈체(ex vivo)로 외식된 종양 및 주요 기관 의 근적외선(NIR) 형광 이미지, (C),(D) 형광 강도의 정량적 비교를 나타낸 그래프이다[n=3, 검은색 원: 종양 부위, *: p<0.05].
도 14는 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 정맥주입 후의 (A) 종양을 가진 쥐, (B) 탈체(ex vivo)로 외식된 종양 및 주요 기관의 근적외선(NIR) 형광 이미지이다[n=3, 검은색 원: 종양 부위, Scale bar = 5 mm].
도 15는 (A) PBS(phosphate buffered saline, 인산완충식염수)(pH7.4), (B) 본 발명의 제조예 2로부터 제조된 알지네이트가 담지된, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(AlgNC), 및 (C) 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 정맥주입 후 1 시간 경과 후의 알리자린 레드 S 염색 이미지, (D),(E), 및 (F): (A), (B), 및 (C) 각각의 확대 이미지이다[(A),(B),(c): 스케일 바 1 mm, (D),(E),(F): 스케일 바: 100 μm].
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
본 발명은, 하기 화학식 1로 표현되는 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체; 상기 나노운반체에 담지된 알지네이트; 및 탄산칼슘 입자;를 포함하는 나노운반체를 제공한다.
[화학식 1]
상기 n은 8-540까지의 정수이고; 상기 m은 16-70까지의 정수이다.
본 발명에 따른 나노운반체는 생체적합성 고분자인, 상기 화학식 1로 표현되는 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체 내부에 탄산칼슘을 담지함으로써, 생체 내의 산성 pH를 띠는 암조직에서 탄산칼슘으로부터 무독성 이산화탄소 기포가 발생되어 낮은 pH를 가진 암조직에서만 조영효과를 발휘할 수 있다. 특히, 상기 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체의 경우 말단이 디아크릴화되지 않은 플루로닉 기반의 나노운반체에 비해서 더욱 소수성을 띠기 때문에, 생체 내 또는 생체 외에서 더욱 안정성을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.
상기 화학식 1로 표현되는 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체는 나노겔 상인 것을 특징으로 한다. 나노겔 상의 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체는 종래 본 발명자들에 의해 간단한 광-가교결합에 의해서 제조할 수 있음을 보고한 바 있고(W. I. Choi, G. Tae, Y. H. Kim, One pot, single phase synthesis of thermo-sensitive nano-carriers by photo-crosslinking of a diacrylated pluronic, J. Mater. Chem., 2008, 18, 2769-2774.), 해당 내용은 전체로서 본 명세서에 통합된다. 특히, 나노겔 상의 경우, 생체 내 또는 생체 외의 환경에서 더욱 안정성을 나타내므로 초음파 조영제로서 안정성을 보일 수 있다.
상기 탄산칼슘은 칼사이트, 바테라이트 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다. 탄산칼슘은 칼사이트(Calcite), 아라고나이트(Aragonite), 및 바테라이트(Vaterite)의 3 가지 형태로 존재하며, 본 발명에 따른 나노운반체 내의 탄산칼슘은 칼사이트 및 바테라이트의 혼합물로써 존재한다. 이 중 바테라이트는 그 열역학적 불안정성 때문에 물에서 뛰어난 용해성을 가지고 수 마이크로의 다공성 구 형태의 입자 상태로 존재하므로 높은 표면적과 작은 비중을 나타낸다. 이에 따라서, 본 발명의 나노운반체는 칼사이트와 바테라이트가 모두 존재하는 불안정한 상태로서, 수성조건에서 또는 초음파 진동에 의해서 가스를 생성하는 효과를 나타낼 수 있다.
상기 나노운반체의 크기는 37 ℃에서 100 내지 200 nm인 것을 특징으로 한다. 기존의 마이크로 크기의 기체버블이 초음파 조영제로 상용화되어 있지만, 큰 입자크기로 인해서 암조직으로의 침투가 어려워 암조직의 진단 및 치료에 한계가 있는 반면에, 본 발명에 따른 나노운반체의 경우, 작은 나노크기의 기체버블이 형성되어 암조직 침투에 용이성을 제공하며, 생체 내와 같은 37 ℃ 온도에서 나노입자의 크기는 암종 침투를 위해선 바람직하게는 150 내지 160 nm일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 나노운반체를 포함하는 초음파 조영제를 제공하며, 상기 조영제는 정맥 주사제 형태일 수 있다. 상기 초음파 조영제는 생체 내 정맥주사를 통하여 간을 포함하는 다른 생체 내 장기보다는 암조직에서 축적이 용이하며, 생체 내로 빠른 축적, 및 생체 외로 빠른 배출이 이루어지기 때문에 초음파 이미징에 매우 적합하다는 장점을 보인다.
본 발명의 나노운반체를 제공하기 위하여, 본 발명에서는 (a) 하기 화학식 1로 표현되는 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체를 수득하는 단계; (b) 상기 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체 및 알지네이트 수용액을 혼합하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 혼합액 및 염화칼슘 수용액을 혼합하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계의 혼합액에 탄산나트륨 수용액을 첨가하여 반응시키는 단계;를 포함하는 나노운반체의 제조방법을 제공한다.
[화학식 1]
상기 n은 8-540까지의 정수이고; 상기 m은 16-70까지의 정수이다.
염화칼슘 수용액과 탄산칼슘 수용액의 Ca2+와 CO3 2-의 반응에 의해 생성된 탄산칼슘의 경우, 나노운반체 내에 작은 다수 입자의 탄산칼슘으로 포함되어, 유연한 상태의 탄산칼슘을 포함하는 나노운반체를 생성시키기 때문에 불특정의 간과 같은 다른 장기들에 비해 암조직과 같은 낮은 pH에서 특히 많은 이산화탄소 발생과 더 장시간의 조영효과를 보이므로, 보다 쉽고 효율적인 암조직 초음파 진단을 위한 초음파 조영제로서 기능을 나타낼 수 있다.
또한, 바람직하기로, 본 발명에 따른 나노운반체의 제조방법은 (e) 상기 (d) 단계의 반응용액을 정제한 후, 정제용액을 동결건조시키는 단계;를 더욱 포함할 수 있다. 정제용액을 동결건조시킴으로써 완전한 나노운반체를 제조할 수 있다.
상기 (b) 단계의 혼합액, 염화칼슘 수용액 및 탄산나트륨 수용액의 부피비는 1:0.5-1.5:1-2일 수 있다. 만일 상기 (b) 단계의 혼합액, 염화칼슘 수용액 및 탄산나트륨 수용액의 부피비가 상기 범위를 벗어나면 상기 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체 내에 상기 탄산칼슘을 포함하지 않는 형태로 생성되거나, 탄산칼슘만의 생성에서 그치는 문제가 발생할 수 있다.
이하에서는 본 발명에 따른 제조예 및 실시예를 첨부된 도면과 함께 구체적으로 설명한다.
실험재료
아크릴로일 클로라이드, 트리메틸아민, 톨루엔 무수화물, 염화칼슘, 1,9-다이메틸 메틸렌 블루(DMMB), 아가로오스 타입 V, 탄산나트륨, 제2인산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 제1인산칼륨, 디에틸에테르 무수화물, 알긴산나트륨(A2158, 마이크로시스티스 피리페라(macrocystits pyrifera)로부터 글루로닉산에 대한 만누로닉산의 비율=1.67, MW=50 kDa)을 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 함수구연산은 Junsei Chemical (Tokyo, Japan)로부터 구입하였다. 플루로닉 F127 (PF 127, PEO100-PPO65-PEO100, MW 12.6 kDa)은 BASF (Seoul, Korea)로부터 기부 받았다. 무수에탄올은 Merck KgaA (Darmstadt, Germany)로부터 구입하였다. 4-(2-히드록시에톡시)-페닐-(2-히드록시-2-프로필) 케톤(Irgacure 2959)은 Ciba Specialty Chemicals (Basel, Switzerland)로부터 구입하였다. 합성 샘플들의 정제를 위해서, 0.45 μm 및 0.2 μm 실린지 필터를 Whatman International (Florham Park, NJ, USA)로부터 구입하였다. Nanosep® 원심여과 장치(MWCO 300 kDa)는 Pall Life Sciences (Ann Arbor, MI, USA)로 구입하였다.
제조예 1: 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(Bare NC)의 제조
말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체는 종래 보고된 바에 따라서, 희석조건에서 디아크릴화 플루로닉의 광가교결합을 통해 제조하였다(Choi WI, Tae G, Kim YH. One pot, single phase synthesis of thermo-sensitive nano-carriers by photo-crosslinking of a diacrylated pluronic, J. Mater. Chem., 2008, 18, 2769.; Kim J-Y, Choi WI, Kim YH, Tae G, Lee S-Y, Kim K, et al. In-vivo tumor targeting of pluronic-based nano-carriers, J. Controlled Release. 2010. 147. 109??17.; Choi WI, Kim YH, Tae G. Controlled release of proteins from pluronic-based nano-carrier, Macromol Res 2011. 19. 639-42.). 요약하면, 건조 플루로닉 F127(PF 127) 5 g, 아크릴로일 클로라이드 644.8 μl, 및 트리메틸아민 744.6 μl을 무수톨루엔 100 ml에 투입하여 아르곤 분위기 하에서 하룻밤 동안 혼합한 후, 반응 고분자는 냉각 디에틸에테르에서 침전시켜 수집하고, 유리필터로 정제하였다. 여과된 고분자 용액은 진공에서 건조시켜 디아크릴화 플루로닉 F127(DA-PF127)을 수득하였다. 아크릴 양성자(5.80-6.40 ppm) 및 메틸 양성자(1.10 ppm)로부터 피크강도 비교를 통한 1H-NMR 분광계(D2O, JNM-ECX-400P, JEOL, Japan) 분석을 통해 플루로닉 F127(PF 127)의 아크릴화 정도는 98% 이상임을 확인하였다. 10중량% 디아크릴화 플루로닉 F127(DA-PF-127) 용액을 탈이온수(DIW)에서 용해하고, 0.2 μm 실린지 필터에서 여과하였다. 희석 디아크릴화 플루로닉(0.77 중량%) 수용액 2 ml를 광개시제(Irgacure 2959, 0.057 중량%)로 제조하였다. 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(Bare NC)를 제조하기 위해서 1.3 mW/cm2 강도로 15 분 동안 자외선 조사(VL-4.LC, 8W, Viber Lourmat, France)를 실시하였다. 그 다음, 탈이온수에서 2 일 동안 투석에 의해 정제하고, 감압 하에 동결건조하여 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(Bare NC) 분말을 제조하였다.
제조예 2: 알지네이트가 담지된, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(AlgNC)의 제조
알지네이트가 담지된, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체를 종래 보고된 바에 따라서 제조하였다(Kim J-S, Kim M, Won D-A, Tae G. Preparation of nanosize alginate gel using pluronic-based nano-carrier as a template. Eur Polym J. 2015. DOI:10.1016/j.eurpolymj.2015.03.002.). 요약하면, 상기 제조예 1로부터 제조된 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(Bare NC) 분말 14 mg을 10 mg/ml 알긴산나트륨 용액 1 ml에 투입하고, 4 ℃에서 24 시간 동안 회전식 진동기(Barnstead International, Dubuque, IA, USA)를 사용하여 부드럽게 회전시켜 용해하였다. 용해한 혼합용액에 탈이온수 1 ml를 첨가한 후, 37 ℃에서 30 분 동안 두었다. 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(Bare NC) 내에 담지되지 않은 알지네이트를 제거하기 위해, 배양된 혼합용액을 37 ℃에서, 10 분 동안 Nanosepㄾ 원심여과 장치(MWCO 300 kDa)를 이용하여 12,000 rpm의 회전속도로 여과하여 알지네이트가 담지된, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(AlgNC) 용액을 제조하였다.
실시예 1: 나노운반체(CaCO
3
AlgNC)의 제조
상기 제조예 2로부터 제조된 알지네이트가 담지된, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(AlgNC) 용액 1 ml를 500 rpm의 회전속도로 혼합 하에 37 ℃에서 20 mM 염화칼슘 용액 1 ml에 드롭방식으로 첨가하고, 혼합용액을 3 시간 동안 배양하였다. 배양된 용액을 0.45 μm 실린지 필터로 여과한 후, AlgNC 내로 탄산칼슘을 무기화시키기 위해, 37 ℃에서 800 rpm의 회전속도로 혼합 하에 15 시간 동안 20 mM 탄산나트륨 1.5배 부피 용액에 드롭방식으로 첨가하였다. 최종생성물을 37 ℃에서 11,000 rpm의 회전속도로 10 분 동안 원심여과 장치로 여과하고, 0.45 μm 실린지 필터로 정제한 후, 정제용액을 동결건조기를 이용하여 감압하게 동결건조하여, 나노운반체(CaCO3AlgNC)를 제조하였다.
도 1에는 본 발명의 제조예 1, 제조예 2 및 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 형성과정을 도식화한 이미지를 나타내었다. 초음파 적용 조영기능을 가진 가스생성 시스템을 합성하기 위해, 생리학적 환경에서 우수한 안정성을 띠고, 조영 기능을 갖는 탄산칼슘(CaCO3)을 사용하여 탄산칼슘-담지 나노시스템을 제조하였다. 먼저, 종래 보고된 바에 따라서 Ca2+-알지네이트 겔로 채워진 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체를 제조하였다(Kim J-S, Kim M, Won D-A, Tae G. Preparation of nanosize alginate gel using pluronic-based nano-carrier as a template. Eur Polym J. 2015. DOI:10.1016/j.eurpolymj.2015.03.002.). 나노운반체 내에 사전 포집된 Ca2+는 나노운반체 내에 탄산칼슘(CaCO3)을 형성하기 위해 이용하였다. 먼저, 디아크릴화 플루로닉 F127(DA-PF-127) 용액의 광가교결합을 통해, 온도민감성의 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(Bare NC)를 제조하였다. 그 다음, 4 ℃에서 37 ℃까지의 온도 변화에 따른, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체의 가역적 부피변화에 통해, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체 내에 알지네이트를 담지하였다. 37 ℃에서 12000 rpm의 회전속도로 10 분 동안 회전 여과기를 이용하여 비담지 알지네이트를 제거하여 알지네이트가 담지된, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(AlgNC) 용액을 제조하였다. 알지네이트가 담지된, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체 내에 Ca2+-알지네이트 겔을 형성하기 위해, AlgNC 용액을 염화칼슘(CaCl2) 용액에 드롭방식으로 떨어뜨렸다. 그 다음, 탄산나트륨(Na2CO3) 용액을 첨가하여 Ca2+와 CO3 2-의 반응을 통해, 나노운반체(CaCO3AlgNC)를 제조하였다.
또한, 도 2는 (A) 본 발명의 제조예 1로부터 제조된 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(Bare NC), 제조예 2로부터 제조된 알지네이트가 담지된, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(AlgNC), 및 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 온도별 크기를 비교한 그래프 및 37 ℃에서의 CaCO3AlgNC의 투과전자현미경(TEM) 이미지, (B) 본 발명의 제조예 1로부터 제조된 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(Bare NC), 통상의 알지네이트(Alginate), 제조예 2로부터 제조된 알지네이트가 담지된, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(AlgNC), 및 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 표면전하를 비교한 그래프이다[스케일 바: 200 nm]. 나노운반체의 크기 및 표면전하는 전기영동 광산란기(ELS-8000, Otsuka Electonics Co., LTD, Tokyo, Japan)를 이용하여 3 회 측정하였다. CaCO3AlgNC와 AlgNC는 25 ℃ 및 37 ℃에서 비슷한 크기를 보였고, Bare NC의 크기보다는 컸다. 반면에 모든 나노운반체는 5 ℃에서 ~ 400 nm의 크기로 비슷했다. 이에 따라, 탄산칼슘의 추가 생성은 나노운반체의 크기 변화를 초래하지 않는 반면, Bare NC 내의 알지네이트 담지는 높은 온도에서, 온도로 유발되는 사이즈 감소를 저하시켰다. 그 결과, 37 ℃에서 ~160 nm 크기를 갖는 CaCO3AlgNC를 수득하였고, 이는 선택적 투과 보유(EPR, Enhanced Permeability and Retention) 효과를 보여주기에 충분히 작은 크기이다[도 2(A) 참조]. CaCO3AlgNC의 형태는 200 kV 가속전압에서 투과전자현미경(TEM)(JEM-2100, JEOL, Tokyo, Japan)으로 분석하였다. TEM 분석을 위한 CaCO3AlgNC 샘플을 제조하기 위해, 1mg/ml의 CaCO3AlgNC 20 μl를 200-메쉬 탄소 코팅 구리 그리드에 떨어뜨린 후, 하룻밤동안 37 ℃에서 배양하였다. TEM 이미지는 나노운반체 내에 큰 하나의 입자 대신에 다수의 탄산칼슘 나노입자들이 채워져 있음을 보여준다[도 2(A) 참조]. 나노운반체의 표면전하 측정 결과, AlgNC 및 CaCO3AlgNC가 Bare NC와 비슷하였으며, 통상의 알지네이트의 높은 음전하 상태보다 유의미하게 높고, 중성에 더 가깝게 나타났다. 또한 37 ℃에서 CaCO3AlgNC의 표면전하는 ~-10 mV로 나타났다[도 2(B) 참조]. 이 결과는 탄산칼슘 나노입자뿐만 아니라 Ca2+-알지네이트 겔도 생성되어 나노운반체 표면이 아닌, 나노운반체 내에 존재한다는 것을 나타낸다. 이에 따라, 상대적으로 중성적이고, 37 ℃에서 ~160 nm 크기를 갖고, 다수의 탄산칼슘 입자들로 채워진 유연한 나노운반체를 확인할 수 있었다.
도 3은 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 37 ℃ 및 혈청 10%를 포함하는 배지 조건에서의 크기 안정성을 나타낸 그래프이다. CaCO3AlgNC의 안정성은 37 ℃에서 입자크기의 측정에 의해 평가하였다. 1 mg/ml CaCO3AlgNC 1 ml를 10%의 FBS(Fetal Bovine Serum, 소태아혈청) 및 1% 페니실린 스테레오마이신을 함유하는 세포배양배지에서 37 ℃, 100 rpm 조건으로 배양하여 생리적 환경에서 분석하였다. CaCO3AlgNC의 입자크기는 전기영동 광산란기를 사용하여, 정해진 시점에서 3 회 분석하였다. 초기 미소한 증가 후에, CaCO3AlgNC의 크기는 응집없이, 2 일 동안 변화하지 않았다. 그러므로 CaCO3AlgNC는 생리학적 조건에서 우수한 분산안전성을 보였다[도 3 참조]. 이는 나노입자들의 생물학적 분류(biodistribution)가 입자들의 크기에 의해 가장 중요하게 영향을 받는 점이라는 것을 고려하면, CaCO3AlgNC의 정맥주입 및 체내 생물학적 분류에 있어서 중요한 특성이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1로부터 나노운반체(CaCO3AlgNC) 및 다른 샘플들의 (A) 적외선분광분석(FT-IR) 특성 비교 그래프, (B) x-선 회설(XRD) 특성 비교 그래프이다[CaCO3: 15 시간 동안 Ca2+ 및 CO3 2-의 직접 반응에 의해 제조된 CaCO3, CaCO3(15 min): 15분 동안 Ca2+ 및 CO3 2-의 직접 반응에 의해 제조된 CaCO3, CaCO3(3 sec): 3 초 동안 Ca2+ 및 CO3 2-의 직접 반응에 의해 제조된 CaCO3]. 나노운반체(CaCO3AlgNC) 내에 탄산칼슘의 존재를 확인하기 위해, 적외선분광분석기(FT-IR)(SPECTRUM 2000, Perkin-Elmer, city, USA)를 사용하였다. 감압 하에 동결건조된 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(Bare NC), 알지네이트가 담지된, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(AlgNC), 및 나노운반체(CaCO3AlgNC)를 분쇄하여 분말로 제조하고, 브롬화칼륨 필름 내에 놓았다. 각각의 샘플의 IR 스펙트럼은 400 ~ 4000 cm-1 파상수 범위에서 20 회 주사로 0.2 cm-1의 해상도에서 측정하였다. 순수한 탄산칼슘(CaCO3)의 특징적인 피크로, 710 cm-1, 880 cm-1에서 낮은 피크뿐만 아니라 1430 cm-1에서 매우 강한 피크를 보였다. 알지네이트는 1370 및 1125 cm-1에서 피크를 보이며 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(Bare NC)와 겹치지 않았다. 또한, 알지네이트가 담지된, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(AlgNC)는 알지네이트 및 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(Bare NC) 모두의 피크를 보였다. 20 mM Ca2+가 알지네이트가 담지된, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(AlgNC)에 첨가되었을 때(Ca2+ added AlgNC), 알지네이트 피크는 약해져서 사라지는데, 이는 아마도 알지네이트와 Ca2+ 사이의 상호작용 때문일 것이다. 그러나 AlgNC 내에 탄산칼슘의 형성을 유도한 후에, 나노운반체(CaCO3AlgNC)에서 알지네이트의 특징적인 피크는 회복되었다. 이는 아마도 Ca2+와 알지네이트 사이의 상호작용이 감소했기 때문일 것이다. 그리고 탄산칼슘의 특징적인 피크(~1430 cm-1)는 순수한 탄산칼슘의 강도보다는 약하지만, 나노운반체(CaCO3AlgNC)에서 확연히 나타났다[도 4(A) 참조]. 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 결정성을 확인하기 위해, 나노운반체(CaCO3AlgNC), 알지네이트가 담지된, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(AlgNC), 및 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(Bare NC)의 구조를 Cu-Κα 방사선으로, X-선 회절(XRD)(Rigaku RINT 2000, Rigaku Co., Tokyo, Japan)을 사용하여 분석하였다. 먼저, CaCO3AlgNC의 구조를 비교하기 위해서, 37 ℃에서 800 rpm의 속도로 교반 하에, 3 초 반응, 15 분 반응, 및 15 시간(하룻밤 동안) 반응의 각기 다른 배양시간 동안 20 mM 염화칼슘 및 20 mM 탄산나트륨을 혼합하여 탄산칼슘을 제조하고, 비반응 물질을 제거하기 위해 탈이온수로 3 회 세척하였다. 그 후, 감압 하에 동결건조한 샘플 각각의 XRD 패턴을 10 ~ 50°에서 측정하였다. 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(Bare NC)와 알지네이트가 담지된, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(AlgNC)의 경우에는,동일한 XRD 신호를 보이는데, 이는 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(AlgNC)의 XRD 패턴은 알지네이트가 담지된 후에도 영향을 받지 않°는다는 것을 나타낸다. 그러나 Ca2 +가 담지된 AlgNC(Ca2+ added AlgNC)의 경우에는, 추가적으로 30 ~ 32.5° 및 45 ~ 47.5°에서 XRD 패턴이 발생했는데, 이는 Ca2 +와의 상호작용에 의해 발생한 AlgNC의 내부에 알지네이트의 전위를 나타낸다. 게다가 AlgNC 내에 탄산칼슘의 형성을 유도한 후의 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 XRD 스펙트럼은 다양한 반응시간에서 제조된 탄산칼슘의 피크뿐만 아니라 Ca2+가 담지된 AlgNC의 피크를 보였다. 또한, 탄산칼슘 샘플들은 반응 시간에 따라 다른 결정 상태를 보였다. 15 시간 동안 반응시킨 탄산칼슘은 27 ~ 30°에서 XRD 피크를 갖는 가장 안정된 무수화물 상태의 탄산칼슘인 칼사이트(Calcite)로 고려될 수 있다. 반면, 25°, 27°, 및 32° 사이의 세 피크를 갖는 CaCO3(3 sec(초)) 및 CaCO3(15 min(분))는 상당히 불안정한 무수화물 상태의 탄산칼슘인 바테라이트(Vaterite)로 고려될 수 있다. 나아가 XRD 결과를 통해, 나노운반체(CaCO3AlgNC)는 형태상으로 탄산칼슘 나노입자들의 집합체이므로[도 2(A) 참조], 나노운반체(CaCO3AlgNC)는 칼사이트 및 바테라이트 상태를 가진 탄산칼슘 나노입자들의 혼합으로써 고려할 수 있다. 게다가, CaCO3AlgNC 내의 칼사이트와 바테라이트 모두의 존재는 CaCO3AlgNC 내에 형성된 탄산칼슘이 매우 불안정한 상태라는 것을 나타낸다. 이를 통해, CaCO3AlgNC는 생리학적 조건을 포함하는 수성조건에서 또는 초음파 진동에 의해 가스를 생성할 수 있음을 확인하였다[도 4(B) 참조].
도 5는 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 열중량 분석(TGA) 및 DMMB(1,9-메틸 메틸렌 블루) 분석을 통해 나노운반체가 포함하는 탄산칼슘(CaCO3), 알지네이트 (Algnate) 및 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(Bare NC)의 양을 나타낸 그래프 및 조성표이다[n=3]. 열중량 분석기(TGA4000, Perkin Elmer, city, USA)를 이용하여 나노운반체(CaCO3AlgNC) 내의 탄산칼슘의 유기/무기 질량비를 측정하였다. 질소 분위기하에 10 ℃/min으로 승온시켰고, 나노운반체(CaCO3AlgNC) 3 mg 또는 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(Bare NC)를 열중량 분석기에 투입하여, CaCO3AlgNC와 Bare NC의 질량손실을 비교하기 위해 3 회에 걸쳐, 20 ℃에서 800 ℃까지 가열하였다. 또한, DMMD(1,9-다이메틸 메틸렌 블루) 정량분석을 이용하여 CaCO3AlgNC 내의 알지네이트의 양을 측정하였다. 농도를 알고있는 알지네이트 또는 농도를 모르는 샘플 500 μl를 상온에서 10 분 동안 2.25 M 구연산 60 μl와 혼합하였다. 그 후, 96-well 플레이트에 놓은 200 μl의 혼합용액을 0.3 mM DMMB와 15 분 동안 반응시켰다. 그 후, 샘플에서 알지네이트의 양은 525 nm에서 반응용액의 흡광도에 의해 3 회 계산하였다. 탄산칼슘이 열중량 분석에서 800 ℃까지 우수한 열안정성을 보이기 때문에, CaCO3AlgNC의 열열화는 유기적 부분의 열화로써 고려할 수 있다. 열중량 분석으로부터, 탄산칼슘과 유기적 부분의 구성은 각각 41±5중량% 및 59±5중량%였다. 또한, 알지네이트의 구성은 DMMB 분석에 의해 12±2중량%로 분석되었다. 이러한 데이터 통해, CaCO3AlgNC의 구성은 알지네이트 12±2중량% , 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체, 47±7중량%, 및 탄산칼슘 41±5중량%임을 확인하였다.
도 6은 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 pH에 따른 이산화탄소(CO2) 발생 정도를 나타낸 이미지이다. CaCO3AlgNC의 기포생성 특성을 분석하기 위해, CaCO3AlgNC 샘플들을 양면접착테이프를 이용하여 깔유리에 부착하였다. 그 다음, 6.5 ~ 7.4 범위의 다양한 pH를 가진 PBS 완충제를 샘플위에 떨어뜨리고, 광학현미경으로 관측하여 분석하였다. 초기에 탄산칼슘은 pH7.4에서 약간의 거품을 보였고, pH6.5에서 훨씬 더 많은 기포가 생성되는 것을 확인할 수 있었다. 기포생성의 정도는 시간이 경과에 따라 감소하였고, 모든 시점에서 pH7.4보다 pH6.5에서 기포가 더 많이 발생하였다. 이러한 결과는 CaCO3AlgNC가 가스 생성에 의해 수성조건에서 초음파 신호를 향상시킬 수 있고, 이는 탄산칼슘의 향상된 용해에 의해 산성조건에서 더 많은 이산화탄소를 형성하기 때문에 pH가 낮아짐에 따라 가스 생성이 더욱 유도된다는 점을 나타낸다. 이를 통해서, CaCO3AlgNC가 종양의 작은 산성 미세환경에서 종양 위치를 이미징하기에 유리하다는 것을 확인할 수 있다.
도 7은 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC) 및 다른 샘플들이 각기 다른 pH의 1 중량% 아가로오스 겔에 주입된 후의 초음파 이미지이다[스케일 바: 5 mm, 빨간색 원: 아가로오스 겔]. 또한, 도 8은 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)가 각기 다른 pH의 1 중량% 아가로오스 겔에 주입된 후의 시간 경과에 따른 (A) 초음파 이미지, (B) 초음파 조영 증강비((I-I0 )/I0, I0: PBS(phosphate buffered saline, 인산완충식염수) 주입 강도)를 나타낸 그래프이다[스케일 바: 5 mm, 빨간색 원: 아가로오스 겔]. 또한, 도 9는 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)가 낮은 pH 의 1 중량% 아가로오스 겔에 주입된 후의 장기간 초음파 이미지이다[스케일 바: 5 mm, 빨간색 원: 아가로오스 겔].
생체 외 CaCO3AlgNC의 초음파 이미징 기능을 확인하기 위해, 샘플을 포함하기 위한 몰드(mold)로써, pH7.4, pH6.5 PBS 완충제, 및 pH5.0 아세테이트 완충제의 각각 다른 pH 완충제로 1중량% 아가로오스 겔을 제조하였다. 그 다음, 대조 샘플로써, PBS(pH7.4) 30 mg/ml의 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(Bare NC), 알지네이트가 담지된, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(AlgNC) 또는 나노운반체(CaCO3AlgNC) 각각 20μl를 상기 세 가지의 다른 pH의 아가로오스 겔에 주입하였다. 주입된 아가로오스 겔은 37 ℃에서 같은 완충제에 투입하였고, 샘플들의 초음파 신호를 10 MHrz 선형 변형기를 내장하는 초음파진단장치(LOGIQ7, GE Healthcare, Waukesha, WI, USA)의 B-모드(normal brightness mode)를 사용하여 감지하였다. CaCO3AlgNC의 초음파 이미징은 같은 장치에서 시간 경과에 따라서 수집하였다. 초음파 신호의 강도는 이미징 프로그램(Adobe Photoshop, Adobe system, San Jose, CA, USA)을 사용하여 PBS 주입 경우를 기반으로 하여 3 회 계산하였다.
pH7.4부터 pH5.0까지의 모든 pH 조건에서, CaCO3AlgNC는 초음파 신호 향상을 나타내 이미징에 의해 감지된 반면에, 모든 다른 대조 샘플들은 pH7.4부터 pH5.0까지의 모든 pH 조건에서, 어떠한 초음파 신호도 보이지 않았다. 이는 PBS 주입 후 초음파 이미징과 유사하다. 이를 통해, CaCO3AlgNC 내의 탄산칼슘의 존재는 가스 생성으로부터 야기된 초음파 신호에 의해 감지하고, 이미지화 하는 데에 필수적이며, 다른 유기적 부분은 초음파 신호화에 전혀 관여하지 않는다는 것을 확인하였다[도 7 참조]. 이후, CaCO3AlgNC의 초음파 적용 조영제의 특징을 더 분석하기 위해서, 각기 다른 pH조건(pH7.4, pH6.5, 및 pH5)에서, 아가로오스 겔로 주사된 입자의 초음파 신호를 시간 경과에 따라 관측하였다. pH7.4에서 CaCO3AlgNC는 1 시간까지는 주입지점에서 초음파 조영제 이미지를 확인할 수 있었으나, 주입 3 시간 후에는 초음파 이미지를 더 이상 확인할 수 없었다[도 8(A) 참조]. 대조적으로, CaCO3AlgNC의 주입지점은 pH6.5에서 12 시간, pH5.0에서 24시간 동안 관측할 수 있었다[도 9 참조]. 이를 통하여, CaCO3AlgNC가 초음파로 이미지화할 수 있는 충분한 양의 이산화탄소를 생성할 수 있으며, 낮은 pH는 장시간 동안 CaCO3AlgNC 내의 무기화된 탄산칼슘의 가속 용해에 의해, 가스 생성에 더욱 유리하다는 점을 확인하였다. 이는 도 6에서 확인한 바와 일치한다. 또한, 생체 외에서의 분석 결과는 CaCO3AlgNC 내에 형성된 탄산칼슘의 다소 불안정한 상태의 존재가 pH7.4에서도 가스를 생성시킬 수 있지만, pH7.4에서 CaCO3AlgNC로부터 생성된 가스는 초음파 이미징에 사용할 만큼 충분히 길게 지속되지 않으며, CaCO3AlgNC에 의한 초음파 조영제는 종양과 같은 낮은 산성조건에서 초음파 이미징에 사용할 만큼 충분히 긴 시간 동안 지속된다는 것을 확인하였다.
도 10은 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 셀 카운팅 키트-8(CCK-8) 및 편평상피암종(SCC7)을 이용하여 세포 활성에 의한 독성을 분석한 그래프이다. CaCO3AlgNC의 생체 내 적용 이전에, 생체 외에서 CaCO3AlgNC의 독성을 분석하였다. CaCO3AlgNC의 세포독성을 분석하기 위해, 0.01 ~ 1 mg/ml 범위의 몇 가지 농도의 세포배양배지에서 CaCO3AlgNC를 분산시켰다. 미국 균주은행(Rockville, MD, USA)의 편평상피암종(SS7)을 10% FBS, 및 1% 페니실린 스테레오마이신을 함유하는 세포배양배지(RPMI 1640, Gibco, Grand Island, NY, USA)에서 배양하였다. 이 세포들을 각 well당 4×103의 세포의 96-well 조직배양 플레이트에서 식종하고, 37 ℃, 5% 이산화탄소 분위기하에, 24 시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포들을 PBS(pH7.4)로 세척하고, 37 ℃에서 24 시간 동안, 제조된 샘플로 처리하였다. 처리된 세포들을 PBS로 세척하고, 샘플의 세포독성은 셀 카운팅 키트-8(CCK-8))(Dojindo Molecular Technologies, Inc., Kumamoto, Japan)로 측정하였다. 세포 독성 측정 결과, 생체 내 적용에 알맞은 1 mg/ml 농도까지 SCC7 세포들에서는 독성이 발견되지 않았다.
도 11은 (A) 본 발명의 제조예 2로부터 제조된 알지네이트가 담지된, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(AlgNC), 및 (B) 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 정맥주입 전과 후의 생체 내 초음파 이미지, (C) 본 발명의 제조예 2로부터 제조된 알지네이트가 담지된, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(AlgNC), 및 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 조영 증강비(I주입후/I주입초)를 비교한 그래프이다[스케일 바: 5 mm, #: p>0.05]. 또한, 도 12는 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 정맥주입 전과 후의 종양을 가진 쥐의 간 초음파 이미지이다. CaCO3AlgNC를 광학적으로 관측하기 위해, 클로로톡신(Cy5.5)을 CaCO3AlgNC에 부착하였다. 먼저, 종래 보고된 바에 따라서 아민 기능화된 나노입자를 합성하였다(Kim J-Y, Choi WI, Kim YH, Tae G, Lee S-Y, Kim K, et al. In-vivo tumor targeting of pluronic-based nano-carriers, J. Controlled Release. 2010. 147. 109-17.). 그 다음, 같은 프로토콜을 이용하여 나노운반체를 제조하였다. CaCO3AlgNC의 클로로톡신의 양은 멀티 플레이트 리더(Molecular Devices, SpectraMaxM2e, city, NJ, USA)를 사용하여, 680 nm 여기를 갖는 700 nm에서 형광 방출에 의해 측정되어, ~0.031중량%로 측정되었다.
동물실험에서는, 생후 6 주의 누드마우스(C3H/HeN, Oriental Bio Co., Seongnam, Korea)를 GIST의 동물관리평가 위원회와 전남대 동물관리평가 위원회의 지침에 따라 다루어 이용하였다. 누드마우스 체내에 고형종양을 형성시키기 위해, PBS 50 μl당 1×106의 세포의 인슐린 주사기를 사용하여, 편평상피암종(SCC7) 세포들을 누드마우스의 오른쪽 넓적다리에 주입하였다. 주입 후, 종양을 가지고 있는 누드마우스 종양을 약 80 mm3의 크기로 키우기 위해 10 ~ 12 일 동안 방치하였다. 그 다음, Cy5.5-CaCO3AlgNC(100 μl당 2 mg의 PBS(pH 7.4)) 및 AlgNC(100 μl당 2 mg의 PBS(pH 7.4))를 종양을 갖는 누드마우스의 꼬리 정맥에 주입하였다. 주입 30 분 및 1 시간 후에, 누드마우스 생체 내 종양의 초음파 이미지를 초음파진단 장비의 B-모드를 사용하여 얻을 수 있었다.
CaCO3AlgNC 주입 전과 비교하여, 주입 30 분 후에 초음파 신호가 관측되었다. 그리고 이 초음파 신호는 종양 위치에서 1 시간 후에 약간 증가하였다. 이를 통해, CaCO3AlgNC의 생체 내 주입을 통한 초음파 이미징에 의해 종양 위치를 감지할 수 있었으며, 대조적으로 AlgNC는 생체 내 주입 전과 후 사이에 초음파 신호의 차이를 볼 수 없었다. 이를 통해, 초음파 적용 조영제는 나노운반체 내의 탄산칼슘으로부터 생성된 가스에 기인된 것임을 확인할 수 있다[도 11 참조]. 또한, 꼬리 정맥을 통한 CaCO3AlgNC 정맥주입 후에 초음파 이미징을 통해 간을 관측하였을 때, 초음파 신호의 변화는 감지되지 않았다[도 12참조]. 이를 통해, CaCO3AlgNC의 정맥주입을 통해 종양 위치의 선택적인 초음파 신호를 감지할 수 있음을 확인하였다. 이러한 CaCO3AlgNC의 선택적인 초음파 적용 조영은 간보다는 산성의 종양 위치에서 가속화된 가스 생성뿐만 아니라 EPR 효과에 의해 선택적인 표적화가 가능한 것이다. 게다가 이러한 결과는 종양 내의 CaCO3AlgNC의 국소농도가 간에서의 낮은 CaCO3AlgNC 농도에 비해서, 초음파 신호증강에 의해 감지되기 위한 탄산칼슘 농도의 한계점에 도달하기에 충분히 높다는 것을 나타낸다. 결과적으로, CaCO3AlgNC는 정맥주입 후에 B-mode에 의해 간과 같은 정상조직부터 종양을 식별하기 위한 초음파 이미징에 적용될 수 있음을 확인하였다.
도 13은 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 정맥주입 후의 (A) 종양을 가진 쥐, (B) 탈체(ex vivo)로 외식된 종양 및 주요 기관 의 근적외선(NIR) 형광 이미지, (C),(D) 형광 강도의 정량적 비교를 나타낸 그래프이다[n=3, 검은색 원: 종양 부위, *: p<0.05]. 또한, 도 14는 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 정맥주입 후의 (A) 종양을 가진 쥐, (B) 탈체(ex vivo)로 외식된 종양 및 주요 기관의 근적외선(NIR) 형광 이미지이다[n=3, 검은색 원: 종양 부위, 스케일 바: 5 mm].
시간 경과에 따른 CaCO3AlgNC의 체외 배출을 분석하기 위해, 종양의 크기가 약 80 mm3까지 성장했을 때, 20 mg/ml의 클로로톡신 100μl가 부착된 CaCO3AlgNC를 종양은 갖는 누드마우스의 꼬리 정맥에 주입하였다. 주입 후, 클로로톡신 필터를 갖춘 IVIS 100 이미징 시스템(Xenogeny Corp., Alameda, CA, USA)을 이용하여, 종양의 근적외선(NIR) 형광을 30 분, 1 시간, 3 시간, 6 시간, 12 시간 및 24 시간에 측정하였다. 또한, 누드마우스의 꼬리 정맥을 통한 Cy5.5-CaCO3AlgNC의 주입 후 1 시간 및 24 시간에, 주요기관은 추출하였고, 주입 후 1 시간 및 24 시간에서 추출된 기관 내의 CaCO3AlgNC의 존재를 비교하기 위하여, IVIS(In vivo imaging system)를 이용하여 기관들로부터의 근적외선 형광을 측정하였다.
종양 위치에서, CaCO3AlgNC의 발광 신호는 샘플의 정맥주입 후 1 시간 까지 증가하였고, 빠르게 감소하여 24 시간 후에 거의 관측되지 않았다. 더 정확하게 분석하기 위해서, 정맥주입 1 시간 및 24 시간 후에 쥐를 희생시켜 탈체(ex vivo) 종양과 주요기관으로부터의 발광 신호를 분석한 결과, 1 시간 후의 간을 포함하는 다른 주요기관과 비교하여, 종양으로부터 가장 강한 신호가 관측되었다. 이를 통해서, 정맥주입을 통한 나노크기의 CaCO3AlgNC에 의해 선택적인 종양 표적화가 이루어졌음을 명백하게 확인할 수 있었다. 또한, 24 시간 후에 간을 포함하는 다른 기관뿐만 아니라 종양으로부터의 신호는 체내에서 CaCO3AlgNC가 빠르게 제거되면서 상당히 감소하였다[도 13 및 도 14 참조]. 초기 CaCO3AlgNC의 선택적 종양 표적화는 나노크기의 CaCO3AlgNC의 EPR 효과로부터 기인되었으며, 큰 하나의 탄산칼슘 입자 대신에 작은 다수의 탄산칼슘 입자들을 포함하는 CaCO3AlgNC의 유연한 상태는 불특정한 간 축적을 감소시키는 데에 도움이 되었을 것이다. 종양위치뿐만 아니라 체내로부터 CaCO3AlgNC의 상대적으로 빠른 배출은 CaCO3AlgNC의 표면변형에서 기인된 것은 아닐 것이다. 또한, 환자의 편의와 안전을 위해 촬영 후에 조영제가 제거되는 것이 바람직하기 때문에, CaCO3AlgNC의 빠른 배출은 초음파 이미징에 유리한 특성이다. 결과적으로, CaCO3AlgNC는 정맥주입을 통한 종양 이미징을 위한 나노크기의 초음파 적용 조영제(UECA)로써 적합하다는 것을 확인 할 수 있다.
도 15는 (A) PBS(phosphate buffered saline, 인산완충식염수)(pH7.4), (B) 본 발명의 제조예 2로부터 제조된 알지네이트가 담지된, 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체(AlgNC), 및 (C) 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)의 정맥주입 후 1 시간 경과 후의 알리자린 레드 S 염색 이미지, (D),(E), 및 (F): (A), (B), 및 (C) 각각의 확대 이미지이다[(A),(B),(c): 스케일 바 1 mm, (D),(E),(F): 스케일 바: 100 μm]. 꼬리 정맥을 통한 CaCO3AlgNC의 주입 1 시간 후에, 종양의 탄산칼슘의 존재를 확실히 확인하기 위해, 추출된 종양을 1% 포름알데히드로 고정하였고, 알리자린 레드S로 염색하였다. 정맥주입 1 시간 경과 후 종양의 붉은색은 PBS 또는 AlgNC에서는 관측할 수 없는 반면, CaCO3AlgNC에서만 나타났다[도 15 참조]. 이를 통해서, 나노크기의 탄산칼슘이 정맥주입을 통해 종양위치까지 우선적으로 도달하며, 이로 인해 초음파 이미징에 의한 선택적 종양감지가 가능함을 확인하였다.
즉, 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 나노운반체(CaCO3AlgNC)는 ~ 160 nm의 크기 갖고, 중성전하를 띠며, 혈청을 포함하는 배지에서 분산안정성을 보였다. CaCO3AlgNC에 포함된 탄산칼슘 나노입자들은 완벽한 결정상태가 아닌, 상대적으로 불안정한 상태의 혼합물로 존재하였으며, 수성조건, 특히 산성조건일 때, 더 많은 기포를 장시간 생성시켜 산성 조건에서 더 강하게 초음파 신호를 나타냈다. 더 중요한 것은 상기 CaCO3AlgNC를 포함하는 초음파 적용 조영제(UECA, Ultrasound enhanced contrase agent)는 간을 포함하는 주요 장기에서는 초음파 이미징 변화를 나타내지 않는 반면, 종양을 갖는 쥐의 정맥주입 후에는 초음파 이미징에 의한 선택적 종양 감지가 가능하다는 것이다. 또한, CaCO3AlgNC는 주입 1 시간 후 종양 위치에 우선적으로 도달하고, 뒤이어 몸에서 빠르게 제거되었다. 그러므로 제시된 나노크기의 초음파 적용 조영제인, CaCO3AlgNC를 종양 이미징에 대한 환자의 편의성 및 안전성을 가진, 정맥주입에 의한 생체 내 초음파 진단 시약으로써 적용할 수 있다.
Claims (9)
- 하기 화학식 1로 표현되는 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체;
상기 나노운반체에 담지된 알지네이트; 및
다수의 탄산칼슘 입자;를 포함하는 나노운반체로서,
상기 나노운반체의 크기는 37 ℃에서 100 내지 200 nm인 것을 특징으로 하는 나노운반체:
[화학식 1]
상기 n은 8-540까지의 정수이고;
상기 m은 16-70까지의 정수이다. - 제1항에 있어서,
상기 화학식 1로 표현되는 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체는 나노겔 상인 것을 특징으로 하는 나노운반체. - 제1항에 있어서,
상기 탄산칼슘은 칼사이트, 바테라이트 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 나노운반체. - 삭제
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 나노운반체를 포함하는 초음파 조영제.
- 제5항에 있어서,
상기 조영제는 정맥 주사제 형태인 것을 특징으로 하는 초음파 조영제. - (a) 하기 화학식 1로 표현되는 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체를 수득하는 단계;
(b) 상기 말단이 디아크릴화된 플루로닉 기반의 나노운반체 및 알지네이트 수용액을 혼합하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 혼합액 및 염화칼슘 수용액을 혼합하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 혼합액에 탄산나트륨 수용액을 첨가하여 반응시키는 단계;를 포함하는 나노운반체의 제조방법으로서,
상기 나노운반체는 다수의 탄산칼슘 입자를 포함하고,
상기 나노운반체의 크기는 37 ℃에서 100 내지 200 nm인 것을 특징으로 하는 나노운반체의 제조방법:
[화학식 1]
상기 n은 8-540까지의 정수이고;
상기 m은 16-70까지의 정수이다. - 제7항에 있어서,
상기 제조방법은 (e) 상기 (d) 단계의 반응용액을 정제한 후, 정제용액을 동결건조시키는 단계;를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 나노운반체의 제조방법. - 제7항에 있어서,
상기 (b) 단계의 혼합액, 염화칼슘 수용액 및 탄산나트륨 수용액의 부피비는 1:0.5-1.5:1-2인 것을 특징으로 하는 나노운반체의 제조방법.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102041246B1 (ko) * | 2018-12-21 | 2019-11-06 | 국립암센터 | 양쪽이온성 알긴산 유도체 및 이를 포함하는 조영제 조성물 |
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| KR20130067158A (ko) * | 2011-12-13 | 2013-06-21 | 경희대학교 산학협력단 | ｐＨ 감응형 탄산칼슘 복합 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 초음파 조영용 조성물 |
| KR20140014579A (ko) * | 2012-07-25 | 2014-02-06 | 광주과학기술원 | 뇌조직에 특이적으로 전달 가능한 뇌조직 표적화 펩티드와 키토산이 결합된 플루로닉 고분자를 포함하는 뇌표적 나노전달체 |
| KR101610027B1 (ko) * | 2014-02-20 | 2016-04-07 | 광주과학기술원 | 안정성이 향상된 플루로닉 기반의 수화겔 형성용 조성물 |
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2017
- 2017-03-09 KR KR1020170030097A patent/KR101867455B1/ko active IP Right Grant
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