JP4632664B2 - 非ペプチド結合ストレス応答性ポリペプチドによる免疫応答の調節 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

本出願の関連出願
この出願は、２００２年２月１３日出願の米国仮出願番号６０／３５６，２９３に基づき、およびその優先権を主張するものである。その文献は引用によりすべて本願明細書に含める。

認可についての陳述
この成果は、米国国立衛生研究所の認可番号DK53058によりサポートされた。そのため、米国政府は本発明の一定の権利を有する。

技術分野
本発明は、抗原結合ドメインのないストレス応答性ポリペプチドによる免疫応答の調節に関する組成物および方法に関係する。好ましい実施態様では、本発明は、抗原結合ドメインのない組み換え体GRP94ポリペプチド、およびそれに関連する治療方法に関係する。

略語の表

背景技術
免疫応答の調節は、感染および疾患と闘うための重要なストラテジーとなる。ワクチンおよび治療の設計においてかなりの労力が、腫瘍細胞および病原体感染細胞中に選択的に存在する抗原の同定へと向けられている。腫瘍免疫性を供与するストレス応答性ポリペプチド(シャペロンタンパク質および熱ショックタンパク質とも呼ばれる)の役割は、シャペロンタンパク質の役割と関連し、そのタンパク質に結合するペプチドの抗原性と関連する。

細胞内において、ストレス応答性タンパク質は、種々のペプチド抗原に結合し、それ故、もとの細胞と同一の免疫的性質を生ずる(Udono & Srivastava, 1993; Blachere & Srivastava, 1995; Nieland et al., 1996; Lammert et al., 1997; Spee & Neefjes, 1997; Breloer et al., 1998)。細胞からのその放出後、シャペロンペプチド複合体は、レセプターを仲介する方法によって、専門の抗原提示細胞(ＡＰＣ)により内部移行される(Arnold-Schild et al., 1999; Wassenberg et al., 1999; Binder et al., 2000a;Castellino et al., 2000; Singh-Jasuja et al., 2000b; Basu et al., 2001)。内部移行後、結合ペプチドは再提示のため主要組織適合遺伝子分子へと移され、その後、Ｔリンパ球が活性化する(Arnold et al., 1995; Suto & Srivastava, 1995; Arnold et al., 1997; Blachere et al., 1997; Schild et al., 1999)。

抗腫瘍応答を誘発する抗原ペプチドの重要性にもかかわらず、免疫の要因となり得る単一のまたは小さなペプチド群の性質は不明のままである。癌(化学的発現物質または紫外線照射および自然発生の癌により誘発される癌を含む)から調製されるワクチンは、同系宿主において免疫原となる。しかし、免疫性は、ワクチン由来の癌に限られるように思われる。

現在、これらのデータの解釈により以下ように結論づけられる：(１)癌の免疫原性は、１または２、３の癌特異的ペプチドから生ずるのではなくて、それらのペプチドの巨大で複雑なアレイから生ずる；(２)連続細胞分裂および癌細胞のゲノムの不安定性により、変異したペプチド(ＭＨＣ対立遺伝子による提示によって抗原性となる)の蓄積が加速する；(３)ランダムな遺伝的変異により、それぞれの癌に個々に特異的な「抗原性フィンガープリント」が生ずる；および(４)免疫原性となる変異のレパートリーは形質転換プロセスに関係する。例えば、Basu & Srivastava (2000) Cell Stress Chaperones 5: 443-451参照。

ペプチド結合タンパク質としての機能に加えて、ＣＴＬ応答の誘発に必要である、樹状細胞の共刺激性分子の発現をもストレス応答性タンパク質は活性化し得ることを最近の結果は示唆する(Chen et al., 1999; Todryk et al., 1999; Asea et al., 2000b; Basu et al., 2000; Binder et al., 2000b; Kol et al., 2000; Ohashi et al., 2000; Singh- Jasuja et al., 2000a)。その活性化は結合ペプチド抗原の性質に依存するわけではない。そのため、シャペロンペプチド複合体の作用機構には、先天性および適応免疫応答の両方が含まれる。

上記の所見により、抗腫瘍性および抗感染性免疫を誘発する免疫アプローチには、組織ホモジネートから精製したシャペロン−ペプチド複合体を用いる。このストラテジーを用い、ヒト臨床試験の予備的結論が見込まれる。Janetzki et al.(2000) Int J Cancer 88: 232-238; Amato et al. (1999) ASCO Meeting abstract; Amato et al. (2000) ASCO Meeting abstract; and Eton et al. (2000) Proc Am Assoc Canc Res 41: 543参照。

また、当分野には、安全で汎用性のある免疫活性化治療を開発する必要性が長い間あった。この必要性を満たすため、本発明は、抗原結合ドメインのないストレス応答性ポリペプチドを提供する。ここで開示するように、対象へのストレス応答性ポリペプチドの投与(ストレス応答性ポリペプチドには抗原結合ドメインがない)により、非特異的および特異的免疫応答の両方を誘発し得る。

本発明の要約
本発明は、抗原結合ドメインのない組み換え体ストレス応答性ポリペプチドを提供する。宿主細胞中で発現するとき、該組み換え体ストレス応答性ポリペプチドは細胞外に輸送される。更に、本発明の組み換え体ストレス応答性ポリペプチドは、治療を必要とする細胞に細胞外から提供され得る。

本発明の組み換え体ストレス応答性ポリペプチドは、Ｈｓｐ６０ポリペプチド、Ｈｓｐ７０ポリペプチド、Ｈｓｐ９０ポリペプチドまたはカルレティキュリンポリペプチドの配列に基づき調製され得、任意の生体から得られ得る。本発明の好ましい実施態様では、組み換え体ストレス応答性ポリペプチドには、組み換え体ＧＲＰ９４ポリペプチドまたは組み換え体ＨＳＰ９０ポリペプチドが含まれる。

本発明の組み換え体ＧＲＰ９４ポリペプチド(組み換え体ＧＲＰ９４ポリペプチドは抗原結合部位を欠いている)は、(ａ)配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、(ｂ)実質的に配列番号２と同一のポリペプチド、(ｃ)配列番号１の核酸によりコードされるポリペプチド、または(ｄ)配列番号１と実質的に同一の核酸によりコードされるポリペプチドを含み得る。

本発明の組み換え体ＧＲＰ９４ポリペプチドはまた、(ａ)塩濃度約２００ｍＭ未満の洗浄溶液および約４５℃よりも高い洗浄温度が典型例である洗浄ストリンジェンシー条件下で配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズし、抗原結合ドメインのないＧＲＰ９４ポリペプチドをコードする単離核酸分子；および(ｂ)遺伝コードの縮重により、上記(ａ)の単離核酸分子と機能的に等価の少なくとも１つのコドンが異なり、かつ上記(ａ)の単離核酸によりコードされるＧＲＰ９４ポリペプチドをコードする単離核酸を含み得る。

本発明は更に、対象において免疫応答を誘発する組成物を提供する。好ましい実施態様では、当該組成物は、(ａ)免疫活性化量の、抗原結合ドメインのないストレス応答性ポリペプチド、および(ｂ)医薬的に許容される担体を含む。

抗原性ペプチド結合部位のない組み換え体ストレス応答性ポリペプチドを対象に投与することによる、対象において免疫応答を誘発する方法をも提供する。

本発明の組み換え体ストレス応答性ポリペプチドにより誘発された免疫応答には、先天性免疫応答、適応免疫応答、またはそれらの組合せが含まれ得る。好ましくは、先天性免疫応答には樹状細胞の成熟が含まれ、適応免疫応答には抗腫瘍または抗感染応答が含まれる。

本発明は、対象における腫瘍増殖を阻害する方法であって、(ａ)健常細胞の培養物を、ストレス応答性ポリペプチドをコードする構成物でトランスフェクトすること、ここで該ストレス応答性ポリペプチドには、健常細胞中で発現すると、細胞外に輸送されるポリペプチドが含まれる、および(ｂ)トランスフェクトした健常細胞の培養物を対象に投与し、それにより、該対象中の腫瘍増殖を阻害することを含む、該方法を提供する。

また、対象における腫瘍転移を阻害する方法であって、(ａ)健常細胞の培養物を、ストレス応答性ポリペプチドをコードする構成物でトランスフェクトすること、ここで、該ストレス応答性ポリペプチドには、健常細胞中で発現すると、細胞外に輸送されるポリペプチドが含まれる、および(ｂ)トランスフェクトした健常細胞の培養物を対象に投与し、それにより、該対象中の腫瘍転移を阻害することを含む、該方法を提供する。

そのため、本発明はまた、抗原結合部位のない組み換え体ストレス応答性ポリペプチドを対象に投与することにより、腫瘍増殖を阻害する方法を提供する。また、抗原ペプチド結合部位のない組み換え体ストレス応答性ポリペプチドを対象に投与することにより腫瘍転移を阻害する方法を提供する。

本発明の組成物および方法は、哺乳類およびヒトを含む、治療を必要とする任意の対象への投与に適当である。

従って、本発明は、対象での免疫応答の誘発に有用である組み換え体ストレス応答性ポリペプチドを含む新規組成物を提供することが目的である。該目的は、本発明により完全にまたは部分的に達成される。

上記の本発明の目的、他の目的は、添付の図面および以下で最善の形態で記載したような実施例と合わせると、詳細な説明を進むにつれて明らかとなるであろう。

図面の簡単な説明
図１Ａ−１Ｊは、ＧＲＰΔＫＤＥＬを分泌する４Ｔ１乳癌細胞またはＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞によるワクチン接種により、腫瘍増殖速度は遅延し、腫瘍転移は減少する。

図１Ａは、トランスフェクトされ、放射線照射された細胞がＧＲＰΔＫＤＥＬを分泌する様子を示したポリアクリルアミドゲルの写真である。４Ｔ１細胞は、ＧＲＰΔＫＤＥＬでトランスフェクトするか(ＴおよびＴ，Ｉ)、またはｍｏｃｋトランスフェクト(Ｍｏｃｋ)した。トランスフェクト２４時間後、細胞を１０，０００ｒａｄｓで照射(Ｔ，Ｉ)するか、または照射せずに放置(ＭｏｃｋおよびＴ)するか何れかであった。トランスフェクト７２時間後、細胞は代謝的に標識されており、ＧＲＰ９４を、免疫沈降により培地から回収した。免疫沈降タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。

図１Ｂ−１Ｉは、ワクチン接種および腫瘍誘発後の腫瘍体積(ｍｍ^３)または肺重量を示すグラフである。雌ＢＡＬＢ／ｃマウスをＰＢＳ(陰性対照)、ｍｏｃｋトランスフェクトした４Ｔ１細胞、ＧＲＰΔＫＤＥＬトランスフェクトした４Ｔ１細胞、ｍｏｃｋトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞、またはＧＲＰΔＫＤＥＬトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞の皮内注射により、４週連続、毎週、ワクチン接種した。５週目で、それぞれのグループの動物を、別の部分に皮内注射することにより、１×１０^６非放射線照射４Ｔ１細胞で誘発した。屠殺後、それぞれのグループのマウスから肺を切除し、腫瘍転移の測定として重量を測定した。腫瘍体積および肺重量は実施例５に記載のように測定した。

図１Ｂは、ＰＢＳ(陰性対照)でワクチン接種した後の腫瘍体積(ｍｍ^３)を示すグラフである。腫瘍体積は、示したように、トランスフェクション後、毎日測定した。それぞれの線は、個体対象での増大曲線を示す。

図１Ｃは、２−４×１０^６ｍｏｃｋトランスフェクトした４Ｔ１細胞でワクチン接種した後の腫瘍体積(ｍｍ^３)を示すグラフである。腫瘍体積は、示したように、トランスフェクション後、毎日測定した。それぞれの線は、個体対象での増大曲線を示す。

図１Ｄは、２−４×１０^６ＧＲＰΔＫＤＥＬトランスフェクトした４Ｔ１細胞でワクチン接種した後の腫瘍体積(ｍｍ^３)を示すグラフである。腫瘍体積は、示したように、トランスフェクション後、毎日測定した。それぞれの線は、個体対象での増大曲線を示す。

図１Ｅは、ＰＢＳ(ＰＢＳ、実線)、ｍｏｃｋトランスフェクトした４Ｔ１細胞(４Ｔ１−Ｍｏｃｋ、波線)、またはＧＲＰΔＫＤＥＬトランスフェクトした４Ｔ１細胞(４Ｔ１−ΔＫＤＥＬ、丸(●)で印を付けた波線)でワクチン接種した後の平均腫瘍体積(ｍｍ^３)を示すグラフである。腫瘍体積は、示したように、トランスフェクション後、毎日測定した。

図１Ｆは、２−４×１０^６ｍｏｃｋトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞でワクチン接種した後の腫瘍体積(ｍｍ^３)を示すグラフである。腫瘍体積は、示したように、トランスフェクション後、毎日測定した。それぞれの線は、個体対象での増大曲線を示す。

図１Ｇは、２−４×１０^６ＧＲＰΔＫＤＥＬトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞でワクチン接種した後の腫瘍体積(ｍｍ^３)を示すグラフである。腫瘍体積は、示したように、トランスフェクション後、毎日測定した。それぞれの線は、個体対象での増大曲線を示す。

図１Ｈは、ＰＢＳ(ＰＢＳ、実線)、ｍｏｃｋトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞(ＮＩＨ−Ｍｏｃｋ、波線)、またはＧＲＰΔＫＤＥＬトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞(ＮＩＨ−ΔＫＤＥＬ、丸(●)で印を付けた波線)でワクチン接種した後の平均腫瘍体積(ｍｍ^３)を示すグラフである。腫瘍体積は、示したように、トランスフェクション後、毎日測定した。

図１Ｉは、ワクチン接種および腫瘍誘発した後の平均肺重量(ｇ)を示す棒グラフである。アスタリスクは、対照と比較して、ＧＲＰΔＫＤＥＬトランスフェクトした４Ｔ１細胞またはＧＲＰΔＫＤＥＬトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞によるワクチン接種後の平均肺重量は有意に減少したことを示す(ウィルコクソン順位和検定により、４Ｔ１-ΔＫＤＥＬではｐ＝０．００１２、ＮＩＨ−ΔＫＤＥＬではｐ＝０．０２５)。

図１Ｊは、４Ｔ１とＮＩＨ−３Ｔ３細胞による、ＧＲＰΔＫＤＥＬ分泌の相対量の比較を示す。同数(１０^６細胞)の４Ｔ１またはＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＧＲＰΔＫＤＥＬ(ΔＫＤＥＬサンプル)でトランスフェクトするか、またはｍｏｃｋトランスフェクトした(ｍｏｃｋサンプル)。トランスフェクションして２４時間後、細胞を[^３５Ｓ]Ｐｒｏｍｉｘで代謝的に標識し、ＧＲＰΔＫＤＥＬを、免疫沈降により培地から回収した。タンパク質は、６％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、PhosphorImager分析により視覚化した。

図２Ａ−２Ｆは、ＧＲＰ(１−３３７)を分泌する４Ｔ１乳癌細胞によるワクチン接種群によって、腫瘍増大速度が遅延し、腫瘍転移が減少することを示す。

図２Ａは、抗ＧＲＰ９４抗体で免疫沈降したタンパク質のポリアクリルアミドゲルの写真である。４Ｔ１細胞は、示したように、ＧＲＰ(１−３３７)またはＧＲＰΔＫＤＥＬでトランスフェクトするか、またはｍｏｃｋトランスフェクトした(Ｍｏｃｋ)。トランスフェクトして２４時間後、細胞を代謝的に標識し、調整追跡培地を回収し、ＧＲＰ９４ドメインを免疫沈降により回収した。

図２Ｂ−２Ｆは、ワクチン接種および腫瘍誘発した後の腫瘍体積(ｍｍ^３)および肺重量を示すグラフである。雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ｍｏｃｋトランスフェクトした４Ｔ１細胞、ＧＲＰ(１−３３７)トランスフェクトした４Ｔ１細胞、またはＰＢＳ(陰性対照)の皮内注射により、４週連続、毎週、ワクチン接種した。５週目で、それぞれのグループの動物を、別の部分に皮内注射することにより、１×１０^６非放射線照射４Ｔ１細胞で誘発した。屠殺後、それぞれのグループのマウスから肺を切除し、腫瘍転移の測定として重量を測定した。腫瘍増大の体積および肺重量は実施例５に記載のように測定した。

図２Ｂは、ＰＢＳ(陰性対照)でワクチン接種した後の腫瘍体積(ｍｍ^３)を示すグラフである。腫瘍体積は、示したように、トランスフェクション後、毎日測定した。それぞれの線は、個体対象での増大曲線を示す。

図２Ｃは、２−４×１０^６ｍｏｃｋトランスフェクトした４Ｔ１細胞でワクチン接種した後の腫瘍体積(ｍｍ^３)を示すグラフである。腫瘍体積は、示したように、トランスフェクション後、毎日測定した。それぞれの線は、個体対象での増大曲線を示す。

図２Ｄは、２−４×１０^６ＧＲＰ(１−３３７)トランスフェクトした４Ｔ１細胞でワクチン接種した後の腫瘍体積(ｍｍ^３)を示すグラフである。腫瘍体積は、示したように、トランスフェクション後、毎日測定した。それぞれの線は、個体対象での増大曲線を示す。

図２Ｅは、ＰＢＳ(ＰＢＳ、実線)、ｍｏｃｋトランスフェクトした４Ｔ１細胞(４Ｔ１−Ｍｏｃｋ、波線)、またはＧＲＰΔＫＤＥＬトランスフェクトした４Ｔ１細胞(４Ｔ１−ＧＲＰ(１−３３７)、点線)でワクチン接種した後の平均腫瘍体積(ｍｍ^３)を示すグラフである。腫瘍体積は、示したように、トランスフェクション後、毎日測定した。

図２Ｆは、ワクチン接種および腫瘍誘発した後の平均肺重量(ｇ)を示す棒グラフである。アスタリスクは、対照と比較して、ＧＲＰ(１−３３７)トランスフェクトした４Ｔ１細胞によるワクチン接種後の平均肺重量は有意に減少したことを示す(ウィルコクソン順位和検定により、４Ｔ１-ＧＲＰ(１−３３７)ではＰ＝０．０００３１)。

図３Ａ−３Ｃは、ＧＲＰ９４ΔＫＤＥＬおよびＧＲＰ(１−３３７)は、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞からの分泌後に樹状細胞を成熟させることを示す。調整培地は、ｍｏｃｋトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＧＲＰΔＫＤＥＬでトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞から調製した。調整培地は、トランスフェクションして７２時間後回収し、６日目の樹状細胞(ＤＣ)と共にインキュベーションした。７日目、ＤＣを回収し、ＰＥ結合抗ＣＤ８６抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。相対的な細胞数を、実施例７に記載するように、FACSCAN(商標)ソフトウェア(Becton, Dickinson & Company of Franklin Lakes, New Jersey, United States of America)およびCELLQUEST(商標)ソフトウェア(Becton, Dickinson & Company of Franklin Lakes, New Jersey, United States of America)を用い、測定した。

図３Ａは、培地のみ(波線)または培地＋１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ(実線)中でインキュベーションしたＤＣの相対的細胞数のｌｏｇプロットである。

図３Ｂは、ｍｏｃｋトランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞から調製した調整培地(波線)またはＧＲＰΔＫＤＥＬトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞から調製した調整培地(実線)中でインキュベーションしたＤＣの相対的細胞数のｌｏｇプロットである。

図３Ｃは、ｍｏｃｋトランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞から調製した調整培地(波線)またはＧＲＰ(１−３３７)トランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞から調製した調整培地(実線)中でインキュベーションしたＤＣの相対的細胞数のｌｏｇプロットである。

図４Ａ−４Ｅは、同系ＫＢＡＬＢ線維芽細胞により分泌されるＧＲＰΔＫＤＥＬおよびＧＲＰ９４ ＮＨ２−末端ドメインが４Ｔ１腫瘍増大および転移を抑制することを示す。雌ＢＡＬＢ／ｃマウスは、示したように、ＰＢＳで、または放射線照射した、ｍｏｃｋトランスフェクトしたＫＢＡＬＢ線維芽細胞、ＧＲＰΔＫＤＥＬトランスフェクトしたＫＢＡＬＢ線維芽細胞、またはＧＲＰ９４ＮＴＤトランスフェクトしたＫＢＡＬＢ線維芽細胞で免疫した。次いで、動物を、実施例で記載したように放射線照射していない４Ｔ１細胞で誘発し、腫瘍体積を経時的に追跡した。それぞれのグループのそれぞれのマウスの腫瘍増大曲線を図４Ａ−４Ｄに示し、標準誤差を有する平均腫瘍体積を図４Ｅに示す。

図４Ｆは、Ｋ−ＢＡＬＢ線維芽細胞からのＧＲＰΔＫＤＥＬまたはＧＲＰ９４ ＮＨ２−末端ドメイン分泌により、腫瘍転移が減少することを示す。動物を殺した後、図４Ａ−４Ｅに示したようにマウスから肺を切除し、重量を測定した。アスタリスクで示したＰＢＳ対照とは有意に異なるグループと共に、標準誤差を含む平均重量を示す(ＫＢＡＬＢΔＫＤＥＬではＰ＜０．０００３であり、ＫＢＡＬＢＮＴＤではＰ＜０．０００２である)。

図４Ｇは、４Ｔ１およびＫＢＡＬＢ細胞によるＧＲＰΔＫＤＥＬおよびＧＲＰ９４ＮＴＤの比較を示す。同数(１０^６細胞)の４Ｔ１ ＫＢＡＬＢ細胞を、ＧＲＰΔＫＤＥＬ(ΔＫＤＥＬサンプル)、ＧＲＰ９４ ＮＨ２−末端ドメイン(ＮＴＤサンプル)でトランスフェクトするか、またはｍｏｃｋトランスフェクトした(ｍｏｃｋサンプル)。トランスフェクションして２４時間後、細胞を[^３５Ｓ]Ｐｒｏｍｉｘで代謝的に標識し、ＧＲＰ９４を、免疫沈降により培地から回収した。タンパク質は、１２．５％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、PhosphorImager分析により視覚化した。

配列表の配列の簡単な説明
配列番号１−２１の奇数番号は表１に記載のヌクレオチド配列である。

配列番号２−２２の偶数番号は、すぐ上のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の配列であり、例えば、配列番号２は、配列番号１のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質であり、配列番号４は、配列番号３のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質である。

配列番号２３は、小胞体残留シグナルを含むポリペプチド配列である。

配列番号２４−２７はＰＣＲプライマーである。
表１

配列表の要約

本発明の詳細な説明
Ｉ．ストレス応答性ポリペプチド
本発明は、抗原結合部位のない組み換え体ストレス応答性ポリペプチドを提供する。また、組み換え体ストレス応答性ポリペプチドを含む組成物を開示する。当該開示したポリペプチドは、更に以下で記載するように、先天性および適応免疫応答を含む、免疫応答の誘発に有用である。

用語「組み換え体」とは、通常、非天然環境下で複製可能な単離核酸をいう。そのため、組み換え体核酸は、複製できない核酸と、宿主細胞中で複製が可能な付加的な核酸、例えば、ベクター核酸とを合わせて含み得る。

本明細書で使用する用語「組み換え体」とはまた、修飾されたストレス応答性ポリペプチドをいい、ここで、当該修飾により、ストレス応答性ポリペプチドの１以上の抗原結合ドメインが除かれ、および／または宿主細胞から当該ポリペプチドの分泌が指図されることとなる。

用語「ストレス応答性ポリペプチド」、「ストレス応答性タンパク質」、「シャペロンタンパク質」、「シャペロンポリペプチド」、「熱ショックタンパク質」、および「熱ショックポリペプチド」は互換的に使用し、新規に合成したタンパク質のホールディングおよび輸送(trafficking)を適当に指図し、および熱ショック、酸化ストレス、低酸素／無酸素状態、栄養枯渇(nutrient deprivation)、他の生理学的ストレス、および異常または精神的外傷(そのストレス状態を助長するもの、例えばストロークおよび心筋梗塞)の条件下で細胞を保護する、ポリペプチドをいう。例えば、Santoro (2000) Biochem Pharmacol 59 : 55-63; Feder & Hofmann (1999) Annu Rev Physiol 61 : 243-282; Robert et al. (2001) Adv Exp Med Biol 484: 237-249; およびWhitley et al. (1999) J Vasc Surg 29 : 748-751参照。

本発明の組み換え体ストレス応答性ポリペプチドは、任意の生体のストレス応答性タンパク質の配列に基づき調製し得、それらのタンパク質には、以下に限らないが、ＧＲＰ９４ポリペプチド、Ｈｓｐ９０ポリペプチド、Ｈｓｐ７０ポリペプチド、Ｈｓｐ６０ポリペプチドが含まれる。本発明の組み換え体ストレス応答性ポリペプチドはまた、カルレティキュリンポリペプチドから得られ得る。本発明の好ましい実施態様では、該組み換え体ストレス応答性ポリペプチドには組み換え体ＧＲＰ９４ポリペプチドが含まれる。

用語「Ｈｓｐ９０タンパク質」とは、以下に記載するように、Ｈｓｐ９０クラスの任意の分子シャペロンおよびＨｓｐ９０ポリペプチドと実質的に同一のポリペプチドをいう。用語「Ｈｓｐ９０」にはまた、以下に記載するように、小胞体に見られるＧｒｐ９４クラスの任意の分子シャペロンおよびＧｒｐ９４ポリペプチドと実質的に同一のポリペプチドが含まれる。

用語「ＨＳＰ９０タンパク質」とは、ヒトＨＳＰ９０が典型である、Ｈｓｐ９０クラスの各メンバーをいい、それらは、配列番号８に開示しており、配列番号７の核酸によりコードされている。

用語「ＧＲＰ９４タンパク質」とは、イヌＧＲＰ９４が典型である、Ｇｒｐ９４クラスの各メンバーをいい、それらは、配列番号６に開示しており、配列番号５の核酸によりコードされている。

用語「Ｈｓｐ７０タンパク質」は、以下に記載するように、Ｈｓｐ７０クラスの任意の分子シャペロンおよびＨｓｐ７０ポリペプチドと実質的に同一のポリペプチドを指すことを意味する。典型的なＨｓｐ７０ポリペプチドを配列番号１０に開示し、それは、配列番号９によりコードされている。

用語「Ｈｓｐ６０タンパク質」は、以下に記載するように、Ｈｓｐ６０クラスの任意の分子シャペロンおよびＨｓｐ６０ポリペプチドと実質的に同一のポリペプチドを指すことを意味する。典型的なＨｓｐ６０ポリペプチドを配列番号１２に開示し、それは、配列番号１１によりコードされている。

用語「カルレティキュリン」は、以下に記載するように、カルレティキュリンポリペプチドまたはカルレティキュリンポリペプチドと実質的に同一のポリペプチドを含む、該グラスの任意の小胞体タンパク質をいう。典型的なカルレティキュリンポリペプチドを配列番号４に開示する。

I.A. 抗原結合ドメイン
本発明は、ストレス応答性ポリペプチドの投与による治療のメカニズムに関する分野において現在認知されているものとは顕著に異なるものである。現在の知見では、ストレス応答性ポリペプチドの治療作用は、ストレス応答性タンパク質による抗原結合の役割に依存すると考えられている。例えば、Basu & Srivastava (2000) Cell Stress Chaperones 5: 443-451参照。最近の研究は、抗原結合を必要とせず、ＨＳＰ抗原複合体の抗原特異的な免疫活性化機能を向上すると思われる、ストレス応答性タンパク質の機能について為されているわけではない。しかし、これらの研究では、抗原結合ドメインを欠くストレス応答性ポリペプチドの治療上の利点は示されておらず、また示唆されていない。

そのため、本発明は、抗原結合ドメインのないストレス応答性ポリペプチドを含む新規組成物を提供する。予期せぬことに、本発明の組成物は、先天性免疫応答ならびに腫瘍増殖および転移の進行を低減する他の応答を誘発し得る。発明者は、任意の特定の操作に限定することを意図するわけではないが、その他の応答には適応免疫応答が含まれ得る。

用語「抗原」とは、Ｔ細胞またはＢ細胞レセプターとの相互作用によりリンパ球を活性化(プラス方向にまたはマイナス方向に)する物質をいう。プラス方向への活性化により、免疫応答が生じ、マイナス方向への活性化により免疫寛容を生ずる。抗原には、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸、またはそれらの組合せが含まれ得る。抗原には異種性または自家性抗原(autologous antigen)(自己抗原)が含まれ得る。

用語「異種性抗原」とは、宿主対象には典型的に見られない抗原をいう。例えば、病原体から生ずる抗原は、健常なヒト対象には異種的である。

用語「自己抗原」("self antigen" or "autoantigen")とは、ここでは互換的に使用され、何れも、抗原として挙動する自家性物質をいう。例えば、壊死細胞は自家性抗原を含み得る。

異種性および自家性抗原には更に、免疫複合体、例えば、インビボ(例えば、感染細胞または前癌組織または癌組織)でストレス応答性タンパク質と内因的に関連するペプチドが含まれ得る。用語「抗原」は外因性抗原／免疫原をも含み得る(すなわち、インビボではＧＲＰ９４またはＨＳＰ９０と複合体とならない)。

用語「抗原結合ドメイン」とは、抗原分子に特異的に結合するストレス応答性ポリペプチドの一部をいう。ストレス応答性ポリペプチドの抗原結合活性を測定する方法は当分野に既知である。

抗原結合活性をアッセイするため、ストレス応答性タンパク質を、標準的方法により生体サンプルから精製し得る。例えば、Whitley et al. (1999) J Vasc Surg 29: 748-751; Walter & Blobel (1983) Methods Enzymol 96: 84-93参照。更には、ストレス応答性タンパク質は、ストレス応答性タンパク質をコードする核酸を宿主細胞中で異種的に発現させることにより、組み換え的に産生し得る。

単離ストレス応答性タンパク質のペプチド結合活性は、任意の適当な方法を用い結合抗原を検出することにより測定され得る。例えば、精製ストレス応答性タンパク質に結合したペプチド抗原を酸抽出(Li & Srivastava, 1993)により抽出し得、溶出したペプチドは質量分析により測定し得る。Chapman (2000) Mass Spectrometry of Protein and Peptides. Humana Press, Totowa, New Jersey, United States of America参照。結合アッセイに用いる抗原をまた標識し、ストレス応答性タンパク質に結合した抗原を検出しやすくし得る。典型的な方法が、Wearsch & Nicchitta (1997) J Biol Chem 272: 5152-5156 および Suto & Srivastava (1995) Science 269: 1585-1588に記載されている。

ストレス応答性ポリペプチドの抗原結合ドメインはまた、上記要約したペプチド結合アッセイを用い組み換え体ストレス応答性ポリペプチド変異体の分析によりマッピングし得る。例えば、ストレス応答性ポリペプチドフラグメントは、ストレス応答性ポリペプチドをコードする核酸の発現により作成し得る。そのような修飾には、以下に限らないが、トランケーション、欠失および変異誘発が含まれる。標準的な組み換え体ＤＮＡおよび分子クローニング技術を使用し、ポリペプチド変異体をコードする核酸を調製するが、それらの技術は当分野に既知である。例として、限定されない方法が、Sambrook et al. (eds. ) (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor; Silhavy et al. (1984) Experiments with Gene Fusions. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Glover & Hames (1995) DNA Cloning : A Practical Approach, 2nd ed. IRL Press at Oxford University Press, Oxford/New York; Ausubel (ed.) (1995) Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed.Wiley, New Yorkに記載されている。

ストレス応答性タンパク質の抗原結合ドメインはまた、抗原に結合するストレス応答性タンパク質の結晶学的データに基づきモデルを構成することにより、マッピングし得る。RASMOL (Biomolecular Structures Group, Glaxo Welcome Research & Development Stevenage, Hertfordshire, United Kingdom Version 2.6, August 1995, Version 2.6. 4, December 1998, Copyright(C) Roger Sayle 1992-1999)のようなプログラムは、本発明の実施により作成した結晶の原子構造座標と共に用いるか、または三次元モデルの作成および／または抗原結合を含む該構造の決定による本発明の実施に用い得る。

上記の方法を用い、幾つかのストレス応答性タンパク質の抗原結合ドメインを決定した。例えば、ＧＲＰ９４のペプチド結合ドメインを、該タンパク質(配列番号１６)(Linderoth et al., 2000)のカルボキシル末端付近の領域に対してマッピングした。高度に保存された領域がまた、Ｈｓｐ９０ストレス応答性タンパク質(例えば、配列番号１８)で同定された。

Ｈｓｐ７０タンパク質および細菌性ＤｎａＫの抗原結合ドメインを、該タンパク質のカルボキシル末端の半分に対して、同様にマッピングする(Chappell et al., 1987; Wang et al., 1993; Gragerov et al., 1994; Zhu et al., 1996)。典型的なＨｓｐ７０抗原結合ドメインを配列番号２０に示す。

ストレス応答性タンパク質の高度に保存された性質に基づき、抗原結合ドメインがまた、既知抗原結合ドメインと実質的に同一のポリペプチドドメインを決定することにより決定され得る。そのため、本発明の組み換え体ストレス応答性ポリペプチドは、抗原結合ドメインを特異的に欠いており、ここで、抗原結合ドメインは、抗原と結合し、更に、(ａ)偶数番号の配列番号１６−２２のうちの何れか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド；(ｂ)偶数番号の配列番号１６−２２のうちの何れか１つと実質的に同一のポリペプチド；(ｃ)奇数番号の配列番号１５−２１のうちの何れか１つの核酸によりコードされるポリペプチド；または(ｄ)奇数番号の配列番号１５−２１のうちの何れか１つと実質的に同一の核酸によりコードされるポリペプチドを含む。本明細書で核酸およびポリペプチドを述べる際に用いる用語「実質的に同一」とは、以下のように定義される。

同様に、本発明のストレス応答性ポリペプチドはまた、抗原結合ドメインのないポリペプチドを含み得(ここで、抗原結合ドメインは、抗原と結合する)、更に、(ａ)塩濃度約２００ｍＭ未満の洗浄溶液および約４５℃よりも高い洗浄温度が典型例である洗浄ストリンジェンシー条件下、奇数の配列番号１５−２１のうちの何れか１つの核酸を含む核酸にハイブリダイズし、そして抗原結合ドメインのないＧＲＰ９４ポリペプチドをコードする、単離核酸分子；および(ｂ)遺伝コードの縮重により、上記(ａ)の該単離核酸によりコードされる抗原結合ドメインをコードする核酸配列中の上記(ａ)の該単離核酸分子と機能的に等価の少なくとも１つのコドンが異なっている単離核酸を含むポリペプチドを含む。

I.B. 細胞外輸送
ストレス応答性タンパク質は、細胞外環境で存在するときに免疫活性化応答し得るか、該細胞表面で発現し得る。例えば、腫瘍誘導化ＨＳＰペプチド複合体の免疫化により、腫瘍組織量を減少する強力なＣＴＬ(ＣＤ８＋)およびＴヘルパー(ＣＤ４＋)細胞仲介応答の誘発が見られた(Tamura et al., 1997)。加えて、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、またはＧＲＰ９４による、抗原提示細胞の処理により、マクロファージで強力なサイトカイン合成が生じた(Chen et al., 1999; Kol et al., 1999; Asea et al., 2000a)。更に、内在性ストレス応答性タンパク質はまた、ＮＫ細胞仲介死滅に対し感受性が高まることと関係する(Botzler et al., 1996a; Botzler et al., 1996b; Multhoff et al., 1997)。

正当に認められていない以前のアプローチにおいて、本発明は、宿主細胞内で発現すると、細胞外に輸送される組み換え体ストレス応答性ポリペプチドを提供する。宿主細胞は、インビボ細胞、例えば、処理を必要とする細胞または処理を必要とする細胞内で該処理をアシストし得る細胞を含み得る。宿主細胞はまた、異種性発現系の細胞、例えば、単離し、その後、治療を必要とする対象に投与し得る、ストレス応答性ポリペプチドをインビトロで産生し続ける細胞を含み得る。ストレス応答性ポリペプチドの発現方法を以下に記載する。

用語「細胞外輸送」とは、細胞外部分での組み換え体ストレス応答性ポリペプチドの局在をいう。そのため、用語「細胞外輸送」とは、細胞膜への挿入、膜性アンカーを介する細胞膜へのテザー、外細胞膜との任意の他の関係、および／または宿主細胞からの分泌を含む。

用語「異種性発現系」とは、異種性核酸および該異種性核酸によりコードされるポリペプチドを含む宿主細胞をいう。例えば、異種性発現系は、組み換え核酸を含む構成でトランスフェクトした宿主細胞、または異種性核酸を宿主細胞ゲノムに導入することにより作成した細胞系を含み得る。

異種性ストレス応答性ポリペプチドの組み換え体発現は、任意の適当な構成を用いることにより、いろいろ行い得る。典型的なアプローチを以下に記載する。

用語「組み換え体」とは、非天然環境下で複製可能である単離核酸をいう。そのため、組み換え体核酸は、複製できない核酸と、宿主細胞中で複製が可能な付加的な核酸、例えば、ベクター核酸とを合わせて含み得る。

用語「ベクター」とは、宿主細胞中で複製可能なヌクレオチド配列を有する核酸分子をいう。ベクターはまた、該ベクター内でヌクレオチド配列をライゲーションし得るヌクレオチド配列を含み得、ここで、そのヌクレオチド配列はまた、宿主細胞中で複製される。典型的なベクターにはプラスミド、コスミド、およびウイルスベクターが含まれる。ベクターはまた、以下で更に記載するように、ストレス応答性ポリペプチドの組み換え体作成を仲介し得る。

本明細書で発現構成物を述べる際に使用する用語「構成物」とは、ベクター内に作動可能なように挿入されたヌクレオチド配列を更に含むベクターをいい、それにより、該ヌクレオチド配列は発現される。発現を可能とするべく、発現される該ヌクレオチド配列を作動可能ようにプロモーター領域に連結する。

本明細書で使用する用語「作動可能なように連結」とは、プロモーター領域とヌクレオチド配列との間の機能的な組合せをいい、それにより、該ヌクレオチド配列の転写は該プロモーター領域により調節され、制御される。プロモーター領域をヌクレオチド配列に作動可能なように連結する技術は当分野に既知である。

ストレス応答性ポリペプチドは、任意の適当なプロモーター(構造プロモーター(constitutive promoter)、誘導性プロモーター、および組織特異的プロモーターの何れも含まれる)の指図の下、発現され得る。典型的な誘導性プロモーターには、化学的に制御されるプロモーター(例えば、テトラサイクリン誘導性発現系(Gossen & Bujard, 1992; Gossen & Bujard, 1993; Gossen et al., 1995)、放射線感受性プロモーター(例えば、egr-1プロモーター(Weichselbaum et al., 1994; Joki et al., 1995))、および熱応答性プロモーター(Csermely et al., 1998; Easton et al., 2000; Ohtsuka & Hata, 2000)が含まれる。インビボでの宿主細胞でのストレス応答性ポリペプチドの発現の場合、組織特異的プロモーターも使用でき、それは、例えば、癌細胞内で選択的に発現するCEAプロモーター(Hauck & Stanners, 1995; Richards et al., 1995)である。

本発明のストレス応答性ポリペプチドの発現のための構成物はまた、該ストレス応答性ポリペプチドが細胞外輸送されるように設計する。これは、当分野に既知の任意の適当な方法により行い得る。典型的なアプローチを以下に記載する。

分泌は、細胞中に熱ショックタンパク質を保持する役割をする熱ショックタンパク質部分を変異するかまたは除去することにより、促進され得る。例えば、ＫＤＥＬ(配列番号２３)のような小胞体内に残留するための配列またはｅｒｄ−２レセプターにより認識される機能的に類似の配列は、実施例１に記載のように欠失し得る。更に、小胞体中でのストレス応答性ポリペプチドの残留は、ｅｒｄ−２へのストレス応答性ポリペプチドの結合を妨げる試薬を供給することにより、または残留シグナル配列をマスキングすることにより阻止し得る。例えば、Munro & Pelham (1987)Cell 48 : 899-907参照。

ストレス応答性ポリペプチドはまた、コード化ポリペプチドとシグナルペプチドドメインとの融合により細胞外輸送をターゲットとし得る(von Heijne, 1990; Martoglio & Dobberstein, 1998; von Heijne, 1998)。例えば、ストレス応答性ポリペプチドと免疫グロブリンＦｃ領域との融合は、ポリペプチド分泌を指図し得る。例えば、Yamazaki et al. (1999)J Immunol 163 : 5178-5182参照。更に、シグナルペプチドは更に、細胞膜でのポリペプチドの挿入を指図する膜貫通ドメインを含み得る。例えば、Simonova etal. (1999) Biochem Biophys Res Commun 262: 638-642 and Zheng et al. (2001) J Immunol 167 : 6731-6735参照。

膜局在(membrane localization)にはまた、ストレス応答性ポリペプチドの設計(細胞膜中に埋め込まれている脂質リガンドに結合するドメイン、例えば、プレクストリン相同性ドメイン、タンパク質キナーゼＣホモロジー−１または−２ドメイン、およびＦＹＶＥドメインを含む)が関係する。Lemmon & Ferguson (2000) Biochem J 350 Pt 1: 1-18; Johnson et al. (2000) Biochemistry 39: 11360-11369; および Hurley & Misra (2000) Annu Rev BiophysBiomol Struct 29: 49-79参照。

I.C. ポリペプチド
１つの実施態様では、本発明は、抗原結合ドメインのないストレス応答性ポリペプチドをコードする構成物を提供する。本発明はまた、組み換え的に発現および単離した、抗原結合ドメインのないストレス応答性ポリペプチドを提供する。典型的な、抗原結合ドメインのないストレス応答性ポリペプチドを配列番号２および４に開示する。

ストレス応答性ポリペプチドと、ストレス応答性ポリペプチドと実質的に同一のタンパク質との間での類似性のレベルを述べる際に、本明細書で使用する用語「実質的に同一」とは、偶数番号の配列番号１６−２２のうちの何れか１つと少なくとも３５％同一であり、抗原結合ドメインを欠く配列をいう。好ましくは、ストレス応答性ポリペプチドに実質的に同一タンパク質には、偶数番号の配列番号１６−２２のうちの何れか１つと少なくとも約３５％から約４５％同一、より好ましくは偶数番号の配列番号１６−２２のうちの何れか１つと少なくとも約４５％から約５５％同一、および更により好ましくは偶数番号の配列番号１６−２２のうちの何れか１つと少なくとも約５５％から約６５％同一であるアミノ酸配列が含まれ、ここで、該ポリペプチドには抗原結合ドメインがない。同一性の割合を測定する方法は、以下の標題「ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の比較」に記載する。

実質的に同一のポリペプチドはまた、保存された三次元構造を有する２以上のポリペプチドを含む。コンピューターを用いて構造的描写を比較し得、構造モデルが作成され、重要な活性部位またはリガンド結合部位周囲の類似を容易に同定し得る。Saqi et al. (1999) Bioinformatics 15: 521-522; Barton(1998) Acta Crystallogr D BiolCrystallogr 54 : 1139-1146; Henikoff et al. (2000) Electrophoresis 21: 1700-1706; およびHuang et al. (2000) Pac SympBiocomput 230-241参照。

実質的に同一のタンパク質にはまた、偶数番号の配列番号１６−２２のうちの何れか１つのアミノ酸と機能的に等価であるアミノ酸を含むタンパク質が含まれる。アミノ酸配列の文脈における用語「機能的に等価」は、当業者に既知であり、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性に基づく。Henikoff & Henikoff (2000) Adv Protein Chem 54: 73-97参照。考慮するときに関係する要因には、側鎖の疎水性、親水性、電荷、および大きさが含まれる。例えば、アルギニン、リシン、およびヒスチジンは、全て陽性荷電残基であり、アラニン、グリシン、およびセリンは全てサイズが小さく、そして、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは全て一般的に似た形をしている。これらの分析により、以下に更に記載するように、アルギニン、リシンよびヒスチジン；アラニン、グリシン、およびセリン；およびフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、ここでは、生物学的には機能的に等価であるといえる。

生物学的に等価なアミノ酸置換基の作成において、アミノ酸の疎水性親水性指標(hydropathic index)を考慮し得る。それぞれのアミノ酸には、それらの疎水性および荷電性特性に基づく疎水性親水性指標があてがわれ、すなわち、イソロイシン(+ 4.5); バリン(+ 4.2); ロイシン(+ 3.8); フェニルアラニン(+ 2.8); システイン(+ 2.5); メチオニン(+ 1.9); アラニン(+ 1.8); グリシン(-0.4); トレオニン(-0.7); セリン(-0.8); トリプトファン(- 0.9); チロシン(-1.3); プロリン(-1.6); ヒスチジン(-3.2); グルタミン酸(-3.5); グルタミン(-3.5); アスパラギン酸(-3.5); アスパラギン(-3.5); リシン(-3.9); およびアルギニン(-4.5)がある。

タンパク質における相互作用的な生物学的機能の供与につき、疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は当分野に一般的に理解されている(Kyte & Doolittle, 1982)。特定のアミノ酸が、同様な疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸と置換され得、また、類似の生物学的活性を保持している。疎水性親水性指標に基づく変更において、疎水性親水性指標が元の値の±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、元の値の±１のアミノ酸の置換が特に好ましく、および元の値の±０．５のアミノ酸の置換更に特に好ましい。

また、アミノ酸などの置換は、親水性に基づき効率的に行われ得ると、当分野では理解される。米国特許番号4,554,101では、タンパク質の最も局所的な平均親水性(その隣接するアミノ酸の親水性に支配されるため)は、そのタンパク質の免疫原性および抗原性、例えば、該タンパク質の生物学的特性と相関することが開示されている。アミノ酸は、類似の親水性値を有する他のものと置換され得、また、それにより生物学的に等価なタンパク質が得られると理解される。

米国特許番号4,554,101で詳細に開示されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基にあてがわれている；アルギニン(+3.0); リシン(+3.0); アスパラギン酸(+3.01); グルタミン酸(+3.01); セリン(+0.3); アスパラギン(+0.2); グルタミン(+0.2); グリシン(0); トレオニン(-0.4); プロリン(-0.51); アラニン(-0.5); ヒスチジン(-0.5); システイン(-1.0); メチオニン(-1.3); バリン(-1.5); ロイシン(-1.8); イソロイシン(-1.8); チロシン(-2.3); フェニルアラニン(-2.5); トリプトファン(- 3.4)。

類似の親水性値に基づく変更において、親水性値が元の値の±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、元の値の±１のアミノ酸の置換が特に好ましく、および元の値の±０．５のアミノ酸の置換更に特に好ましい。

用語「実質的に同一」とは、生物学的に機能的等価であるポリペプチドをも含む。用語「機能的」とは、以下に記載のような、免疫応答または抗癌応答の誘発における、抗原結合ドメインのないストレス応答性ポリペプチドの活性を含む。免疫応答または抗原応答を評価する方法は実施例に記載する。

本発明はまた、抗原結合ドメインのないストレス応答性ポリペプチドの機能的フラグメントをも提供する。例えば、機能的部分は、偶数番号の配列番号１６−２２のうちの何れか１つのアミノ酸配列のすべてまたは実質的にすべてを含む必要はない。

本発明はまた、抗原結合ドメインのないストレス応答性ポリペプチドよりも長い配列である機能的ポリペプチド配列を含む。例えば、１以上のアミノ酸が、ストレス応答性ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に加えられ得る。そのタンパク質を作成する方法は当分野に既知である。

I.D. 核酸
用語「核酸分子」および「核酸」とは、それぞれ、一本鎖、二本鎖、または三本鎖型のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーをいう。特に限定しない限り、該用語には、参照の天然核酸と同様の特性を有する天然ヌクレオチドの既知類似体を含む核酸が含まれる。用語「核酸分子」および「核酸」はまた、「遺伝子」、「ｃＤＮＡ」、または「ｍＲＮＡ」の代わりに使用され得る。核酸は、合成されるか、または任意の生体を含む、任意の生物源から得られ得る。

ヌクレオチド配列間での類似性の程度を述べる際に用いる用語「実質的同一」とは、配列比較アルゴリズム(以下の標題「ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の比較」で記載した)を用いるか外観検査による測定で最大一致となるよう比較しアライメントしたとき、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは約９０％から約９９％、またより好ましくは約９５％から約９９％、および最も好ましくは約９９％のヌクレオチド同一性を有する２以上の配列をいう。好ましくは、実質的な同一性は、少なくとも約１００残基のヌクレオチド配列に、より好ましくは少なくとも約１５０残基のヌクレオチド配列に、および最も好ましくは全長コーディング配列を含むヌクレオチド配列ににおいて生ずる。本明細書で使用する用語「全長」とは、抗原結合ドメインのない機能的ストレス応答性ポリペプチドをコードする完全オープンリーディングフレームをいう(典型的な実施態様は配列番号２および４として開示する)。抗原結合部位のないストレス応答性ポリペプチドをコードする好ましい全長核酸は配列番号１および３に開示する。

１つの態様では、実質的に同一の配列には、多形配列が含まれ得る。用語「多形」とは、ある群において、遺伝学的に決定された別の配列または対立遺伝子が２以上生ずることをいう。対立遺伝子の相違は僅かであり、１塩基対ぐらいである。

他の態様では、実質的に同一の配列には、変異誘発した配列(サイレント変異を含む配列を含む)が含まれ得る。変異には一塩基変異が含まれる。

他に、２つのヌクレオチド配列が実質的に同一であるという目印には、ストリンジェント条件下で２つの分子が特異的にまたは実質的に互いにハイブリダイズすることが挙げられる。核酸ハイブリダイゼーションの文脈において、比較する２つの核酸配列は、「プローブ」および「標的」と呼ぶことができる。「プローブ」は参照核酸配列であり、「標的」は試験核酸分子であり、しばしば、種々の核酸分子からなる群内で見られる。「標的配列」は「試験配列」と同義である。

ハイブリダイゼーションの研究またはアッセイに用いる好ましいヌクレオチド配列には、本発明の核酸分子の少なくとも約１４から４０ヌクレオチド配列に相補的であるかまたはその疑似物であるプローブ配列が含まれる。好ましくは、プローブは１４から２０ヌクレオチド、または更により長いヌクレオチドを含み、それは、望ましくは、３０、４０、５０、６０、１００、２００、３００、または５００ヌクレオチド、または奇数番号の配列番号１−２１のうちの何れか１つの全長までである。そのプローブは、例えば、該フラグメントの化学的合成により、核酸増幅技術の適用により、または組み換え体作成のために選択配列を組み換え体ベクターに導入することにより、容易に作成され得る。

用語「特異的にハイブリダイズする」とは、特定のヌクレオチド配列が雑多な核酸混合物(例えば、トータルの細胞性ＤＮＡまたはＲＮＡ)中に存在するとき、ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下、該配列に対してのみ、ある分子が結合し、二本鎖となり、ハイブリダイズすることをいう。

用語「実質的にハイブリダイズする」とは、プローブ核酸分子と標的核酸分子との間での完全にハイブリダイゼーションすることをいい、そして僅かなミスマッチを含むが、そのミスマッチは、望ましいハイブリダイゼーションを行うべくハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを低下することにより調整し得る。

サザンおよびノーザンブロット分析のような核酸ハイブリダイゼーション実験の文脈において、「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列および環境の両方に依存する。より長い配列は、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの広範囲の手引き書には、Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, part I chapter 2, Elsevier, New York, New Yorkがある。一般に、高いストリンジェントハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、特定のイオン強度およびｐＨにおける特定配列の熱融解点(Ｔｍ)よりも約５℃低くなるように選択される。典型的に、「ストリンジェント条件」下、プローブは、その標的配列に特異的にハイブリダイズするが、他の配列にはしない。

該Ｔｍは、完全にマッチするプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度(特定のイオン強度およびｐＨの下)である。非常にストリンジェントな条件は、特定プローブのＴｍと等しくなるように選択される。約１００を超える相補性残基を有する相補的核酸のサザンまたはノーザンブロット分析におけるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、ヘパリン１ｍｇを含む５０％ホルムアミド中、４２℃で一夜行うハイブリダイゼーションである。高ストリンジェントな洗浄条件は、０．１×ＳＳＣ中、６５℃で１５分である。ストリンジェントな洗浄条件は、０．２×ＳＳＣ緩衝液中、６５℃で１５分である。ＳＳＣ緩衝液についての詳細についてはSambrook et al., eds (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York for参照。高ストリンジェンシーな洗浄前に、バックグラウンドプローブシグナルを除くべく低ストリンジェンシーな洗浄を行う場合もある。約１００ヌクレオチドを超える二重鎖用の中程度のストリンジェンシーな洗浄条件の例は、１×ＳＳＣ中、４５℃で１５分である。約１００ヌクレオチドを超える二重鎖用の低ストリンジェンシー洗浄の例は、４×から６×ＳＳＣ中、４０℃で１５分である。短いプローブ(例えば、約１０から５０ヌクレオチド)の場合、ストリンジェント条件は、典型的にはｐＨ７．０−８．３で約１Ｍ未満のＮａ^＋イオン、典型的には約０．０１から１ＭのＮａ^＋イオン濃度(または他の塩)を含み、温度は典型的には少なくとも約３０℃である。ストリンジェント条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加により為し得る。一般的に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおける、無関係のプローブの２倍(またはそれよりも高い）のノイズに対するシグナル比により特異的ハイブリダイゼーションが示される。

以下は、本発明の参照ヌクレオチド配列に実質的に同一なヌクレオチド配列の同定に使用し得るハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の例である：プローブヌクレオチド配列は、好ましくは、７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０．５Ｍ ＮａＰＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、５０℃で標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、その後、５０℃で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で洗浄する；より好ましくは、プローブおよび標的配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０．５Ｍ ＮａＰＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、５０℃でハイブリダイズし、その後、５０℃で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で洗浄する；より好ましくは、プローブおよび標的配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０．５Ｍ ＮａＰＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、５０℃でハイブリダイズし、その後、５０℃で０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で洗浄する；より好ましくは、プローブおよび標的配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０．５Ｍ ＮａＰＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、５０℃でハイブリダイズし、その後、５０℃で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で洗浄する；より好ましくは、プローブおよび標的配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０．５Ｍ ＮａＰＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、５０℃でハイブリダイズし、その後、６５℃で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で洗浄する。

２つの核酸配列が実質的に同一であるという目印には、該核酸によりコードされるタンパク質が実質的に同一であり、全体的に共通の三次元構造を有し、または生物学的に機能的に等価であることが挙げられる。これらの用語は、上記の標題「ポリペプチド」に更に記載している。対応するタンパク質が実質的に同一であるならば、ストリンジェント条件下では互いにハイブリダイズしない核酸分子もまた実質的に同一となる。これは、例えば、２つのヌクレオチド配列が、遺伝コードにより許容される、大きく縮重したことにより生じ得ることによる。

用語「保存置換された変異体」とは、縮重コドン置換を有する核酸配列をいい、ここで、１以上の選択した(または全ての)コドンの三番目の位置は、混合性の塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている。Batzer et al. (1991) Nucleic Acids Res 19: 5081; Ohtsuka et al. (1985) J Biol Chem 260: 2605-2608; およびRossolini et al. (1994) Mol Cell Probes 8: 91-98参照。

用語「部分配列」(subsequence)とは、より長い核酸配列の一部を含む核酸の配列をいう。典型的な部分配列とはプローブ(上記)、またはプライマーである。本明細書で使用する用語「プライマー」は、選択した核酸分子の約８以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、好ましくは１０−２０のヌクレオチド、およびより好ましくは２０−３０ヌクレオチドを含む連続配列をいう。本発明のプライマーには、本発明の核酸分子の重合化の開始に十分長さで適当な配列のオリゴヌクレオチドが含まれる。

用語「伸張配列」とは、核酸中に組み込まれ、および／または核酸の何れかの末端に組み込まれた追加的なヌクレオチド(または他の類似分子)を含む配列をいう。例えば、ポリメラーゼ(例えば、ＤＮＡポリメラーゼ)は、核酸分子の３’末端に配列を加え得る。加えて、ヌクレオチド配列は、プロモーター、プロモーター領域、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、イントロン配列、付加的な制限酵素部位、マルチクローニングサイト、および他のコーディングセグメントのような、他のＤＮＡ配列と組み合わされ得る。

本明細書で使用する用語「相補的配列」は、塩基対間での水素結合の形成において、互いに対となり得る逆平行ヌクレオチド配列を含む２つのヌクレオチド配列を示す。本明細書で使用する用語「相補的配列」は、上記開示の同一ヌクレオチドの比較により評価され得るように、実質的に相補的であるか、または本明細書に記載のような比較的ストリンジェントな条件下で当の核酸フラグメントにハイブリダイズし得るように定義されるヌクレオチド配列を意味する。相補的核酸セグメントの例は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。

用語「遺伝子」とは、広くは、生物学的機能と関連する任意のＤＮＡセグメントをいう。遺伝子は、以下に限らないが、コーディング配列、プロモーター領域、シス-調節配列、調節タンパク質に特異的な認識配列である非発現ＤＮＡセグメント、遺伝子発現に寄与する非発現ＤＮＡセグメント、望ましいパラメーターを有するように設計したＤＮＡセグメント、またはそれらの組合せを含む、配列を含む。遺伝子は、種々の方法似より得られ得、その方法には、生物サンプルからのクローニング、既知または予測される配列情に基づく合成、および存在配列の組み換え誘導が含まれる。

本発明の核酸は、クローニングされ、合成され、組み換え的に変更され、変異誘発され、またはそれらの組合せが行われ得る。核酸の単離に使用される、標準的な組み換え体ＤＮＡおよび分子のクローニング技術は、当分野に既知である。部位特異的変異誘発により、塩基対変更、欠失、または僅かな挿入が生じ、その変異誘発はまた、刊行物に例示されるように当分野に既知である。例えば、Sambrook et al. (eds. ) (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor; Silhavy et al. (1984) Experiments with Gene Fusions. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Glover & Hames (1995) DNA Cloning : A Practical Approach, 2nd ed. IRL Press at Oxford University Press, Oxford/New York; およびAusubel (ed. ) (1995) Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed.Wiley, New York参照。

I.E. ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の比較
２以上のヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈において、用語「同一」または「同一性」の割合とは、本明細書に開示の配列比較アルゴリズムの１つを用いるか外観検査による測定で最大一致となるよう比較しアライメントしたとき、２以上の配列または部分配列が同一であるか、または一定の割合のアミノ酸残基またはヌクレオチドが同一であることをいう。

ヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関し、用語「実質的に同一」とは、特定の配列が、１以上の欠失、置換、または付加により、天然配列とは異なっていることを意味し、その全体的な作用は、目的の遺伝子、遺伝子産物、または配列の生物学的活性を保持することである。

配列比較の場合、典型的に１つの配列は、試験配列を比較する際の参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験および参照配列をコンピュータープログラムに入れ、必要ならば、部分配列座標を設定し、そして配列アルゴリズムのプログラムパラメーターを選択する。次いで、該配列比較アルゴリズムは、選択したプログラムパラメーターに基づき、設計した試験配列の、参照配列に対する配列同一性の割合を算出する。

比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Smith & Waterman (1981) Adv Appl Math 2: 482-489の局所ホモロジーアルゴリズムにより、Needleman & Wunsch (1970) JMol Biol 48 : 443-453のホモロジーアライメントアルゴリズムにより、Pearson & Lipman (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85: 2444-2448の類似性方法の研究により、これらのアルゴリズムのコンピューター機器(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WisconsinのGAP, BESTFIT, FASTA, および TFASTA)により、または外観検査により、構成され得る。一般に、Ausubel (ed. ) (1995) Short Protocols in MolecularBioloav, 3rd ed. Wiley, New York参照。

配列同一性および配列類似性の割合を決定する好ましいアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、それは、Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215 : 403-410により開示されている。ＢＬＡＳＴ分析するソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通じて公然として利用可能である。このアルゴリズムは、クエリー配列中の長さＷの短いワードを同定する(それは、データベース配列で同じ長さのワードとアライメントするとき、マッチするかまたは陽性値であるスレショルドスコアＴを満たすか何れかである)ことにより高いスコアリング配列対(ＨＳＰ)を最初に同定することを含む。Ｔは、ネーバフードワードスコアスレショルド(neighborhood word score threshold)を示す。これらの出発ネーバフードワードのヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを発見するための最初の核となる。次いで、該ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加する限り、それぞれの配列の両方向に伸展する。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメーターＭ(マッチする残基の対のリワードスコア；常に０を超える)およびＮ(ミスマッチの残基の対のペナルティースコア；常に０より小さい)を用い、算出する。アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリクスを用い、累積スコアを算出する。両方向へのワードヒットの伸展は、累積アライメントスコアが最大到達値(maximum achieved value)から一定値Ｘ落ち込んだとき、累積スコアが１以上の陰性スコアリング残基アライメントの蓄積により零かまたはそれ未満となったとき、または何れか配列で端に到達したとき、終了する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸにより、アライメントの感度およびスピードが決定される。ＢＬＡＳＴＮプログラム(ヌクレオチド配列の場合)は、デフォルトとして、ワード長さＷ＝１１、期待値Ｅ＝１０、カットオフ値１００、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長さ(Ｗ)３、期待値(Ｅ)１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを使用する。Henikoff & Henikoff (1992)Proc Natl Acad Sci U S A 89: 10915-10919参照。

配列同一性の割合の算出に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムではまた、２つの配列間での類似性の統計的分析を行った。例えば、Karlin & Altschul (1993)Proc Natl Acad Sci U S A 90: 5873-5877参照。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより供される類似性の測定の１つには、最少の累積確率(sum probability)(Ｐ(Ｎ))があり、それは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間で偶然にマッチする確率を示すものである。例えば、試験核酸配列は、参照核酸配列に対する該試験核酸配列の比較において、最少の累積確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満であるならば、該参照配列と類似すると考えられる。

II. 治療適用
本発明は、抗原結合ドメインのない組み換え体ストレス応答性ポリペプチドを含む治療組成物を提供する。抗原結合ドメインを欠く組み換え体ストレス応答性ポリペプチドの作成により、実施例７に記載のように、先天性免疫応答が誘発し得る。組み換え体ストレス応答性ポリペプチドの対象への投与によっても、対象に適応免疫応答が誘発し得、該応答は、対象中に存在する抗原に対して特異的であるか、外因の抗原に対して特異的である(実施例６)。

本発明の組成物をまた使用し、対象にストレス応答性ポリペプチドを投与することにより、該対象に抗癌応答を誘発し得る。出願人は、任意の特定の操作原理と結びつけるつもりはないが、「抗癌応答」は、免疫応答、抗脈管形成応答、またはそれらの組合せを含み得る。実施例６参照。

本発明の方法は、ストレス応答性ポリペプチドの細胞外投与を含む。本発明の１つの実施態様では、該投与は、ストレス応答性ポリペプチドをコードする遺伝子治療構成物を投与することを含み、ここで、該ストレス応答性ポリペプチドは、上記のように、細胞外輸送できるように設計されている。本発明の他の実施態様では、ストレス応答性ポリペプチドは、異種性発現系で産生され、該発現系から精製され、そして投与用に製剤される。異種性発現および製剤の典型的な方法もまた上記している。

用語「免疫系」は、以下に限らないが、腫瘍、病原体、および自己応答性細胞が含まれる抗原分子を含む細胞に防御を供する、すべての細胞、組織、系、構造およびプロセスを含み、非特異的および特異的カテゴリーを含む。そのため、免疫応答には、先天性免疫応答、適応免疫応答、またはそれらの組合せが含まれ得る。

用語「先天性免疫系」には、好中球、単球、組織マクロファージ、星細胞、肺胞性マクロファージ、樹状細胞、およびミクログリアのような食細胞が含まれる。該先天性免疫系は、非特異的免疫応答を仲介する。該先天性免疫系は、適応免疫系の応答を開始しガイドする重要な役割をする。例えば、Janeway (1989)Cold Spring Harb Symp Quant Biol 54 : 1-13; Romagnani (1992) Immunol Today 13: 379-381; Fearon &Locksley (1996) Science 272: 50-53; およびFearon (1997) Nature 388: 323-324参照。先天性応答には、例えば、樹状細胞成熟、マクロファージ活性化、サイトカインまたはケモカイン分泌、および／またはＮＦκＢシグナリングの活性化が含まれ得る。

用語「適応免疫系」とは、宿主内に特異的免疫を供与する細胞および組織をいう。これらの細胞の中には、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞およびリンパ球(例えば、Ｂ細胞リンパ球およびＴ細胞リンパ球)が含まれる。用語「適応免疫系」にはまた、抗体産生細胞および該抗体産生細胞により産生された抗体が含まれる。

用語「適応免疫応答」とは、以下に記載するような、体液性免疫応答(例えば、抗原特異的抗体の産生)および細胞性免疫応答(例えば、リンパ球増加)を含む抗原に対する特異的な応答をいう。適応免疫応答には更に、全身性免疫および体液性免疫が含まれ得る。

用語「細胞性免疫」および「細胞性免疫応答」は、犠牲となる細胞に近づきＴ細胞リンパ球により供される防御のような、リンパ球により供される免疫学的防御をさすことを意味する。細胞性免疫応答はまた、リンパ球増加を含む。「リンパ球増加」を測定するとき、特異的抗原に対する応答におけるリンパ球の増加能を測定する。リンパ球増加は、Ｂ細胞、Ｔヘルパー細胞またはＣＴＬ細胞増加をさすことを意味する。

用語「ＣＴＬ応答」は、特定抗原を発現する細胞を溶解および死滅させる抗原特異的細胞の能力をさすことを意味する。以下に記載するように、標準的な、当分野に認識されているＣＴＬアッセイを行い、ＣＴＬ活性を測定する。

用語「全身性免疫応答」は、リンパ節−、脾臓−、または消化管−関連のリンパ組織における免疫応答をさすことを意味し、それらの組織では、免疫系のＢリンパ球のような細胞が発達している。例えば、全身性免疫応答には、血清ＩｇＧの産生が含まれ得る。更に、全身性免疫応答物とは、血流中を循環する抗原特異的抗体をいい、脾臓およびリンパ節のような全身コンパートメントのリンパ組織中の抗原特異的細胞をいう。

用語「体液性免疫」または「体液性免疫応答」は、抗体分子が抗原の刺激に応答して分泌される獲得免疫型をさすことを意味する。

そのため、本発明の組成物は、対象の免疫適格性を向上し、以下に限らないが、癌、感染、脈管形成疾患および細胞性ネクローシスを含む疾患および異常に関連する抗原に対する特異的免疫を誘発し得る。本発明はまた、家族歴または環境因子により上記疾患および異常のうちの何れかが進行していると疑われる対象への、抗原結合ドメインのないストレス応答性ポリペプチドの投与に適している。

本発明の組み換え体ストレス応答性ポリペプチドは更に、先天性免疫系の細胞のエキソビボ調製を含む任意の養子免疫療法のアプローチを含む、細胞性免疫治療に有用である。

本発明の組み換え体ストレス応答性ポリペプチドは更に、外因性抗原に対する特異的免疫応答を誘発するアジュバントとして有用である。

II.A. 対象
本明細書で使用する用語「対象」は、任意の脊椎種、好ましくは哺乳類および鳥類のような温血脊椎動物を含む。より特に、本発明の方法は、ヒトのような哺乳類ならびに危険にさらされているため重要である哺乳類(シベリアンタイガーのような)の腫瘍治療、ヒトにとって経済的な重要性(ヒトの消費のための農場で飼育する生物)および／または社会的な重要性(ペットとしてまたは動物園内で飼う動物)のある動物、例えば、ヒト以外の肉食動物(ネコおよびイヌのような)、ブタ(子ブタ、食用ブタおよびイノシシ)、反芻動物および家畜(畜牛、ウシ、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソンおよびラクダ)、およびウマでの腫瘍の治療を想定している。また、危険にさらされ、動物園で飼われている特定種の鳥ならびに家禽、およびより好ましくはシチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、ガン、ホロホロチョウのような飼い慣らされた家禽または飼鳥類を含む鳥の治療もまた想定している(それらの鳥はまたヒトにとって経済的に重要であるから)。

II.B. 免疫応答のモニタリング
対象における免疫応答をモニタリングする方法は当業者に既知である。免疫活性化応答の一般的な指標として使用され得る典型的な方法を以下に記載する。特定の治療または応用での評価に適当な更なる方法をもまた使用し得る。

遅延型過敏症皮膚試験
遅延型過敏症皮膚試験は、抗原に対する全面的な免疫適格および細胞性免疫に非常に価値がある。一連の共通皮膚抗原に対して応答することができないことをアネルギーと称する(Sato et al. (1995) Clin Immunol Pathol 74:35-43)。皮膚試験の適当な技術では、抗原は無菌状態、4℃で保存され、光から保護され、そして使用直前に再構成されるということが必要となる。25-または27-ゲージの針により、皮下というよりむしろ皮内に抗原が確実に投与される。抗原の皮内投与24時間および48時間後、紅斑および硬結部の両方の最大寸法をルーラーで測定する。ある特定の抗原または抗原群に対する機能低下は、より高濃度の抗原による試験によって、または不明確な状況では、中程度濃度による繰り返しの試験によって、確認される。

インビトロでの細胞崩壊性Tリンパ球の活性
フィコール-ハイパック比重遠心技術によって単離された8×10⁶末梢血誘導化Tリンパ球は、10% ウシ胎仔血清を含む3ml RPMI培地中の4×10⁴マイトマイシンC処理腫瘍細胞で再刺激される。幾つかの実験では、33%の二次混合リンパ球培養物上清またはIL-2が、T細胞増殖因子のソースとして培養培地に含まれている。

免疫後の細胞崩壊性Tリンパ球による一次応答を測定するために、T細胞をスティミュレーター腫瘍細胞なしで培養する。他の実験では、T細胞を、抗原性的に別個の細胞で再刺激する。6日後、当該培養物を、⁵¹Cr-放出アッセイにおいて細胞毒性について4時間試験する。標的の自然発生的⁵¹Cr-放出のレベルは、20%未満となる。抗MHCクラスIブロッキング活性の測定のために、W6/32ハイブリドーマの10倍濃度の上清を、最終濃度約12.5%で当該試験に加える(Heike et al. (1994) J Immunotherapy 15:165-174)。

腫瘍特異的抗原のレベル
疾患および感染のモニタリングは、抗原のレベルをアッセイ(該抗原の存在によって疾患または感染が示される)する種々の生物化学的技術のうち何れか１つを用い、行い得る。

例えば、癌胚抗原(ＣＥＡ)は、ヒトの大腸癌(colon cancer)細胞で見られるが、健常な成人の大腸では見られない糖タンパク質である。膵臓癌および乳癌のような他の腫瘍を有する対象ではまた、ＣＥＡの血清レベルが上昇している。そのため、治療を行っている癌患者のＣＥＡレベルの上昇・下降をモニタリングすることにより、治療すべき腫瘍の進行および応答の予測に有用であることが証明される。同様に、前立腺特異抗原(ＰＳＡ)の血清レベルにより、前立腺癌の進行の危険性がわかる。

免疫診断法を用い、感染細胞中に存在する病原体上にある抗原を検出し得る。例えば、病原体特異的抗原には、疾患進行を仲介するポリペプチド、すなわち、毒性ショック症候群トキシン−１またはエンテロトキシンが含まれ得る。

遺伝子発現
疾患および感染はまた、疾患または感染に特徴的である核酸の存在または量の検出によりモニターされ得る。遺伝子発現をアッセイする形態は、以下に限らないが、標的核酸のＰＣＲ増幅および核酸検出のハイブリダイゼーションに基づく方法が含まれ得る。これらのアッセイでは、例えば、マイクロアレイ分析により、単一の標的核酸または複数の標的核酸の存在および／またはレベルが検出し得る。

標的特異的プローブは、公の配列の貯蔵場所(例えば、Sanger Centre(ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/tb/sequences)およびGenBank(http://ncbi.nlm.nih.gov)のヌクレオチド配列(ｃＤＮＡ、発現配列タグ(ＥＳＴ)、配列タグ化部位(ＳＴＳ)、繰り返し配列、およびゲノム配列を含む)に基づき設計され得る。

核酸の典型的な検出方法および適当な標的遺伝子の選択は、例えば、Quinn (1997) in Lee et al., eds. , Nucleic Acid Amplification Technologies : Application to Disease Diagnostics, pp. 49-60, Birkhauser Boston, Cambridge, Massachusetts, United States of America; Richardson & Warnock (1993) Fungal Infection : Diagnosis and Management, Blackwell Scientific Publications Inc., Boston, Massachusetts, United States of America; Storch (2000) Essentials of Diagnostic Virology, Churchill Livingstone, New York, New York; Fisher & Cook (1998) Fundamentals of Diagnostic Mycology, W.B. Saunders Company, Philadelphia, Pennsylvania; White & Fenner (1994) Medical Virology, 4^th Edition, Academic Press, San Diego, California; およびSchena (2000) Microarray Biochip Technology. Eaton Publishing, Natick, Massachusetts, United States of Americaに記載されている。

II.C. 癌および他の増殖異常の治療
本発明は、抗原結合ドメインのないストレス応答性ポリペプチドの投与による癌の増殖を阻害する方法を提供する。実施例６参照。

本明細書で使用する用語「癌」は、一般的に、腫瘍、新生細胞および新生細胞前細胞(preneoplastic cell)、および細胞増殖性の他の異常をいう。

用語「腫瘍」には、対象の任意の組織の原発性および転移性の固形癌および癌腫が含まれ、その組織には、以下に限らないが、乳；大腸；直腸；肺；口咽頭；下咽頭；食道；胃；膵臓；肝臓；胆嚢；胆管；小腸；腎臓、膀胱および尿道内皮(urothelium)を含む尿路；子宮頸部、子宮、卵巣を含む女性の生殖器官(例えば、絨毛膜癌および妊娠性絨毛疾患)；前立腺、精嚢、精巣および生殖細胞腫瘍を含む男性の生殖器官；甲状腺、副腎、および下垂体を含む内分泌腺；皮膚(例えば、血管腫および黒色腫)、骨または軟組織；血管(例えば、カポジ肉腫)；脳、神経、目、および髄膜(例えば、星細胞腫、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、網膜芽腫、神経腫、神経芽細胞腫、神経鞘腫および髄膜腫)が含まれる。用語「腫瘍」にはまた、白血病のような造血器悪性腫瘍から生ずる固形癌が含まれ、緑色腫、形質細胞腫、菌状息肉腫および皮膚Ｔ細胞リンパ腫／白血病のプラークおよび腫瘍、およびホジキンおよび非ホジキンリンパ腫の両方を含むリンパ腫が含まれる。

用語「新生細胞」とは、新規であり、異常である細胞をいう。用語「新生物」には腫瘍が含まれる。

用語「新生細胞前細胞」とは、正常型から新生型への移行途中にある細胞をいう。

本発明の組成物はまた、過形成、異形成、および形成異常のような非新生細胞増殖の治療または予防に使用され得る。Kumar et al. (1997) Basic Pathology, 6th ed. W.B. Saunders Co., Philadelphia, Pennsylvania, United States of America参照。

用語「過形成」とは、構造または機能には顕著な変化がない、組織または器官での細胞数の増加を含む異常な細胞増殖をいう。１つの例として、子宮内膜過形成は子宮内膜癌となる場合もある。

用語「異形成」とは、成人細胞または完全分化細胞の型が他の型(成人細胞)に変化する異常な細胞増殖をいう。異形成は、上皮細胞または結合組織細胞で生じ得る。典型的な異形成は、異常な異形成上皮で生じ得る。

用語「形成異常」とは、各細胞の均一性および細胞の構造的定位(architectural orientation)の喪失を含む異常な細胞増殖をいう。形成異常細胞ではしばしば、異常に広範囲において濃く染色された核を有し、多形態性が見られる。形成異常は癌の前触れである場合があり、子宮頚部、気道、口腔、および胆嚢を含む炎症を起こした(irritated or inflamed)組織の上皮で主に見られる。

抗原結合部位のない組み換え体ストレス応答性ポリペプチドの投与は、通常の癌治療と組み合わされ得る。例えば、本発明の組成物を投与し、免疫抑制から生ずる感染および他の合併症を最小化し得る。本明細書に開示の治療方法はまた、転移、例えば、腫瘍の外科的除去のときに循環する血液(circulation)に混入した腫瘍細胞によって生ずる転移、の制御に有用である。

用語「腫瘍増殖」は、一般的に、癌内の変化であって、より進行した癌への変化を示唆する多くの指標のうちの何れか１つをいう。そのため、腫瘍増殖の阻害を測定するための指標には、以下に限らないが、癌細胞の残存(survival)の減少、腫瘍体積の減少または形態(例えば、コンピューター断層撮影(ＣＴ)、ソノグラフィー、または他の画像化法を用い測定するといったもの)、遅延型腫瘍増殖、腫瘍性脈管構造の崩壊、遅延型過敏症皮膚試験のパフォーマンスの向上、細胞融解性Ｔリンパ球の活性化の増大、および腫瘍特異的抗原のレベルの低下が含まれる。

用語「遅延型腫瘍増殖」とは、腫瘍が特定の量にまで増殖するのに必要な時間が短くなることをいう。例えば、治療により、腫瘍が、測定開始日(０日目)での体積に対して３倍体積に増大するのに必要な時間または１ｃｍ^３増大するのに必要な時間が延長され得る。

II.D. 感染の治療
本発明の組成物はまた、抗原に感染した細胞の免疫応答の促進に使用し得る。そのため、本発明は、対象で免疫応答を誘発する方法を提供し、ここで、該免疫応答には、抗原結合ドメインのないストレス応答性ポリペプチドの投与による抗病原体応答が含まれる。

用語「病原体」および「感染病原体」は本明細書では互換的に使用し、細菌、ウイルス、真菌類、原虫類、寄生生物、他の感染病原体、または有害もしくは寄生の可能性のある生物をいう。通常の微生物性の叢もまた病原体となる可能性がある。

本発明の方法を使用し治療するかまたは予防し得る、典型的な細菌性感染症には、以下に限らないが、Salmonella、Shigella、Actinobacillus、Porphyromonas、Staphylococcus、Bordetella、Yersinia、Haemophilus、Streptococcus、Chlamydophila、Alliococcus、Campylobacter、Actinomyces、Neisseria、Chlamydia、Treponema、Ureaplasma、Mycoplasma、Mycobacterium、Baffonella、Legionella、Ehrlichia、Escherichia、Listeria、Vibrio、Clostridium、Tropheryma、Actinomadura、Nocardia、Streptomyces、およびSpirochaeta属の種が原因の感染症が含まれる。

本発明の方法により治療するかまたは予防し得る、典型的なウイルス性感染症には、以下に限らないが、Poxviridae、Herpesviridae、Adenoviridae、Papoviridae、Hepadnaviridae、およびParvoviridaeのようなＤＮＡウイルスが原因の感染症が含まれる。ＲＮＡウイルスはまた、開示の方法により検出されると考えられ、それには、Paramyxoviridae、Orthomyxoviridae、Coronaviridae、Arenaviridae、Retroviridae、Reoviridae、Picomaviridae、Caliciviridae、Rhabdoviridae、Togaviridae、Flaviviridae、およびBunyaviridaeが含まれる。

典型的なウイルスには、以下に限らないが、肝炎ウイルス、フラビウイルス、胃腸炎ウイルス、ハンタウイルス、ラッサ熱ウイルス、リッサウイルス、ピコルナウイルス、ポリオウイルス、エンテロウイルス、非ポリオエンテロウイルス、ライノウイルス、アストロウイルス(astrovirus)、風疹ウイルス、ＨＩＶ−１(ヒト免疫不全症ウイルス１型)、ＨＩＶ−２(ヒト免疫不全症ウイルス２型)、ＨＴＬＶ−１(ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型)、ＨＴＬＶ−２(ヒトＴリンパ球向性ウイルス２型)、ＨＳＶ−１(単純ヘルペスウイルス１型)、ＨＳＶ−２(単純ヘルペスウイルス２型)、ＶＺＶ(水痘帯状疱疹ウイルス)、ＣＭＶ(サイトメガロウイルス)、ＨＨＶ−６(ヒトヘルペスウイルス６型)、ＨＨＶ−７(ヒトヘルペスウイルス７型)、ＥＢＶ(エプスタイン・バーウイルス)、インフルエンザＡおよびＢウイルス、アデノウイルス、ＲＳＶ(呼吸器合胞体ウイルス)、ＰＩＶ−１(パラインフルエンザ１、２および３型)、パピローマウイルス、ＪＣウイルス、ポリオーマウイルス、ＢＫウイルス、フィロウイルス、コルチウイルス(coltivirus)、オルビウイルス、オルトレオウイルス(orthoreovirus)、レトロウイルス、およびスプマウイルス(spumavirus)が含まれる。

本発明の方法を使用し治療するかまたは予防し得る、典型的な真菌感染症には、以下に限らないが、Aspergillus、Trichophyton、Microsporum、Epidermaophyton、Candida、Malassezia、Pityrosporum、Trichosporon、Exophiala、Cladosporium、Hendersonula、Scytalidium、Piedraia、Scopulariopis、Acremonium、Fusarium、Curvularia、Penicillium、Absidia、Pseudallescheria、Rhizopus、Cryptococcus、MuCunninghamella、Rhizomucor、Saksenaea、Blastomyces、Coccidioides、Histoplasma、Paraoccidioides、Phialophora、Fonsecaea、Rhinocladiella、Conidiobolu、Loboa、Leptosphaeria、Madurella、Neotestudina、Pyrenochaeta、Colletotrichum、Altemaria、Bipolaris、Exserohilum、Phialophora、Xylohypha、Scedosporium、Rhinosporidium、およびSporothrix属の種が原因の感染症が含まれる。

本発明の方法により治療するかまたは予防し得る、典型的な原虫感染には、以下に限らないが、Toxoplasma、Giardia、Cryptosporidium、Trichomonas、およびLeishmania属の種が原因の感染症が含まれる。本発明の方法により治療するかまたは予防し得る、他の感染症には、以下に限らないが、Rickettsiae属の寄生性の種およびTrichinellaおよびAnisakis属の種のような線虫が原因の感染症が含まれる。

II.E. 脈管形成異常の治療
本発明は、脈管形成異常の治療または予防に有用な組成物および方法を更に提供する。該方法は、抗原結合ドメインのないストレス応答性ポリペプチドの有効量を対象に投与することを含み、それにより、血管増加が阻害される。

用語「脈管形成」とは、新しい血管が形成される過程をいう。本明細書で使用する用語「抗脈管形成応答」および「抗脈管形成活性」はそれぞれ、新しい血管の形成が阻害される生物学的な過程をいう。

脈管形成のレベルをアッセイする方法には、血管の長さおよび微細血管密度を測定することが含まれる。典型的な方法が、Hironaka et al. (2002) Clin Cancer Res 8: 124-130; Starnes et al. (2000) J Thorac Cardiovasc Surg 120: 902-907; およびEl-Assal et al. (1998) Hepatology 27: 1554-1562に開示されている。

脈管形成はまた、血流を測定することによりモニターされ得る。例えば、Power Dopplerソノグラフィーでは、微小血管系での流れの測定に振幅を用いる。組織は、HDI(登録商標) 5000診断超音波システム(Advanced Technology Laboratories, Inc. of Bothell, Washington, United States of America)に接続した10-5 MHz ENTOS(登録商標)直線状プローブ(Advanced Technology Laboratories, Inc. of Bothell, Washington, United States of America)で画像化し得る。

II.F. 細胞性ネクローシスの治療
細胞性創傷、疾患、または虚血／再潅流によるような他の症状から生ずる細胞性ネクローシスを治療する方法をも提供する。該方法は、抗原結合ドメインのないストレス応答性ポリペプチドの有効量を対象に投与することを含み、それにより、細胞性ネクローシスは妨げられる。

用語「細胞性ネクローシス」とは、疾患、物理的または化学的創傷、または虚血が原因となる細胞死をいう。

用語「虚血」とは、組織への血流の喪失をいう。失血(blood loss)は、酸素およびグルコースの両方の欠乏を特徴とし、虚血性ネクローシスまたは梗塞が生ずる。そのため、用語「虚血性」とは、酸素欠乏および栄養分欠乏の両方の状態をいう。特定血管領域への血流の喪失を「局所性虚血(focal ischemia)」という。組織全体または体全体への血流の喪失は「全体的虚血(global ischemia)」という。

本発明は、以下に限らないが、心停止、不全収縮および持続性心室不整脈、心臓手術、心肺バイパス手術、器官移植、脊髄損傷、頭部外傷、ストローク、血栓塞栓症ストローク、出血性ストローク、脳血管攣縮、低血圧症、低血糖症、てんかん発作重積症(status epilepticus)、てんかん発作、不安、統合失調症、神経変性障害、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)または新生児ストレス、および虚血性脳損傷を予防または改善する神経保護(neuroprotectant)組成物により示され該組成物が有用であり推奨されまたは処方される任意の病状を含む、虚血／再潅流による症状から生ずる細胞性損傷を改善する治療組成物および方法を提供する。

II.G. 細胞性免疫治療
本発明は、細胞性免疫治療のための組成物および方法を更に提供する。用語「細胞性免疫治療」とは、対象への投与のため細胞を調製し、それにより、抗腫瘍応答を含む免疫応答を誘発することをいう。

本発明の１つの実施態様では、組成物および方法が、可溶性のストレス応答性タンパク質を発現する健常細胞の対象への投与に供される。免疫治療用の細胞性キャリアを述べる際に本明細書で使用する用語「健常」には、治療する細胞以外の細胞が含まれる。典型的な健常細胞には、以下に限らないが、癌性ではない細胞(non-cancerous cell)、病原ではない細胞、およびネクローシス性ではない細胞(non-necrotic cell)が含まれる。該細胞は、治療の必要な対象にとっては、自己由来であるかまたは異種由来(例えば、異質遺伝性)であり得る。

例えば、分泌ストレス応答性タンパク質をコードする構成物は上記のように調製し得る。典型的な分泌ストレス応答性ポリペプチドを配列番号２２に開示する。該構成物を健常細胞にトランスフェクトし、次いで、対象に該細胞を投与し、それにより、感染症または疾患を治療する。本発明の好ましい実施態様では、該治療応答には、実施例５に記載のように抗腫瘍応答および／または抗転移性応答が含まれる。

本発明の他の実施態様では、組成物および方法が、養子免疫療法に有用な抗原提示細胞(ＡＰＣ)の調製に供される。本明細書で使用する用語「養子免疫療法」とは、抗原提示細胞をエクソビボで調製し、次いで治療の必要な対象に投与する治療アプローチをいう。実施例７参照。

以下に限らないが、マクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞が含まれる抗原提示細胞は、ヒトの末梢血および骨髄に見られる幹細胞および前駆細胞からインビトロで産生することにより得られ得る。Inaba (1992) J Exp Med 176: 1693-1702参照。好ましくは、感作したＡＰＣを注入する対象は、該ＡＰＣをもともと単離した対象である(自己由来型の実施態様)。

本発明は、抗原結合ドメインのないストレス応答性ポリペプチドおよび目的の危険シグナルにＡＰＣがさらされることにより、感作したＡＰＣを調製する方法を提供する。例えば、感作したＤＣは、本発明のストレス応答性ポリペプチドおよび特異的免疫応答が調査されている抗原に未成熟ＤＣをさらすことにより、調製され得る。

感作したＡＰＣを、通常の臨床的方法により、全身的に、好ましくは静脈注射で、対象に再注射する。対象は、一般的に、該対象の状態および治療する病状により、感作したＡＰＣを約１０^６から約１０^１２受け入れることとなる。ある療法では、対象は、所望により、以下に限らないが、サイトカインIFN-a、IFN-y、IL-2、IL-4、IL-6、TNFまたは他のサイトカイン増殖因子を含む生物応答修飾物質を更に適当用量受け入れることができる。

II.H. アジュバント作用
抗原結合ドメインのないストレス応答性ポリペプチドはアジュバントとしても使用でき、外因性抗原に対する特異的免疫応答を促進し得る。例えば、本発明の外因性および組み換え体ストレス応答性ポリペプチドが対象に共投与されると、対象の適応免疫応答の特異性は該抗原へと向く。

用語「アジュバント作用」とは、抗原に対する脊椎動物対象の免疫系の応答を高めるかまたは他に調節する能力を有する分子をさすことを意味する。

アジュバントを使用し、免疫応答を調節すること、(１)体液性および細胞性免疫を刺激すること、(２)ＡＰＣによりサイトカインおよびケモカイン産物を誘発すること、および(３)誘導される獲得免疫応答型を制御すること(Yip et al., 1999)を含む、によりワクチン抗原の活性を向上し得る。O'Hagan et al. (2001) Biomol Eng 18: 69-85参照。

抗原は、使用するために当分野に既知のものから選択し得るか、またはイムノアッセイにより抗原性または免疫原性を測定し得る。用語「抗原性」とは、抗体またはＭＨＣ分子への結合特性をいう。用語「免疫原性」とは、免疫応答を誘発する特性をいう。

候補抗原の抗原性は、以下に限らないが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ(酵素結合免疫吸着検定)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル内沈降応答、免疫拡散アッセイ、インビボイムノアッセイ(例えば、コロイド金、酵素または放射性同位元素標識)、ウェスタンブロット、免疫沈降応答、凝集アッセイ(例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ)、補体結合アッセイ(complement fixation assay)、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイを含む当分野に既知の種々のイムノアッセイにより測定され得る。

免疫原性は、例えばＴ仲介応答を検出することにより、測定され得る。Ｔ細胞応答を測定する典型的な方法には、上記のように、インビトロ細胞毒性アッセイまたはインビボ遅延型過敏症アッセイが含まれる。免疫原性はまた、対象血清中の抗原特異的抗体の検出、および／または抗血清または抗原に特異的な免疫細胞の保護作用の証明により、評価され得る。

候補免疫原性または抗原性ペプチドは、開示のように内在性ストレス応答性タンパク質−抗原複合体、または抗原分子として後に使用するための内在性ＭＨＣ−ペプチド複合体の何れかから単離され得る。ＭＨＣ分子からの潜在的免疫原性ペプチドの単離は当分野に既知である。Falk et al. (1990) Nature 348: 248-251;Rotzschke et al. (1990)Nature 348 : 252-254;Falk et al. (1991) Nature 351: 290-296; Elliott et al. (1990) Nature 348: 195-197; Demotz et al. (1989) Nature 342: 682-684; and Rotzschke et al. (1990) Science 249: 283-287参照。

有用な可能性がある抗原がまた、病原の伝染性の中和における抗原の関与のような種々の基準により同定され得る(ここで、その病原体による感染の治療または予防が望まれている)。Norrby & Cold Spring Harbor Laboratory. (1994) Vaccines 94: Modern Approaches to New Vaccines Including Prevention of Aids. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York参照。

恐らく、癌の治療または予防が望まれる場合、既知の腫瘍特異的抗原またはそれらのフラグメントもしくは誘導体を使用する。例えば、その腫瘍特異的または腫瘍関連抗原には、以下に限らないが、KS1/4全身性癌抗原(pan-carcinoma antigen)(Bumol et al., 1988; Perez & Walker, 1989); 卵巣癌抗原(CA125)(Yu & Lian, 1991); 前立腺酸性燐酸塩(prostatic acid phosphate)(Tailor et al., 1990); 前立腺特異的抗原(Henttu & Vihko, 1989; Israeli et al., 1993); メラノーマ関連抗原p97(Estin et al., 1989); メラノーマ抗原gp75(Vijayasaradhi et al., 1990); 高分子量メラノーマ抗原(Natali et al., 1987); および前立腺特異的膜抗原(Mai et al., 2000)が含まれる。

好ましくは、ウイルス性疾患の治療または予防が望まれる場合、既知ウイルスのエピトープを含む分子を使用する。例えば、そのような抗原性エピトープは、上記のウイルスの何れかを含むウイルスから調製し得る。

好ましくは、細菌性感染症の治療または予防が望まれる場合、既知細菌(上記の細菌の何れか(これらに限らない)を含む)のエピトープを含む分子を用いる。

好ましくは、原虫類または寄生生物による感染症の治療または予防が望まれる場合、既知の原虫類または寄生生物のエピトープを含む分子を使用する。例えば、その抗原性エピトープは任意の原虫類または寄生生物(上記の何れかのものをふくむ)から調製され得る。

本発明のストレス応答性ポリペプチドと共投与する抗原にはまた、免疫応答が望ましい任意の他の抗原が含まれ得る。抗原結合ドメインのないストレス応答性ポリペプチドは、特に、免疫原性抗原に対する弱い免疫応答の誘発に有用となり得る。

III. 治療組成物および方法
本発明の方法により、対象で免疫応答を誘発させるべく投与する組成物には、(ａ)免疫活性化量の、抗原結合ドメインのないストレス応答性ポリペプチド、および(ｂ)医薬的に許容されるキャリアが含まれる。

III.A. キャリア
薬物調製および／または投与をし易くする任意の適当なキャリアを使用し得る。該キャリアは、ウイルス性ベクターまたは非ウイルス性ベクターであり得る。適当なウイルス性ベクターには、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス(ＡＡＶ)、レトロウイルス、疑似型レトロウイルス(pseudotyped retrovirus)、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、セムリキ森林ウイルス、およびバキュロウイルスが含まれる。本発明の好ましい実施態様では、該キャリアには、ストレス応答性タンパク質をコードするアデノウイルス遺伝子治療構成物が含まれる。

ストレス応答性タンパク質の送達に使用し得る適当な非ウイルス性ベクターには、以下に限らないが、プラスミド、ナノスフェア(nanosphere)(Manome et al., 1994; Saltzman & Fung, 1997)、ペプチド(米国特許番号6,127,339および5,574,172)、グリコサミノグリカン(米国特許番号6,106,866)、脂肪酸(米国特許番号5,994,392)、脂肪性エマルジョン(fatty emulsion)(米国特許番号5,651, 991)、脂質または脂質誘導体(米国特許番号5,786,387)、コラーゲン(米国特許番号5,922,356)、ポリサッカライドまたはその誘導体(米国特許番号5,688,931)、ナノサスペンジョン(nanosuspension)(米国特許番号5,858,410)、ポリマー性ミセルまたは結合体(conjugate)(Goldman et al., 1997および米国特許番号4,551,482、5,714,166、5,510,103、5,490,840、および5,855,900)、およびポリソーム(米国特許番号5,922,545)が含まれる。

適当な場合、２以上の型のキャリアを同時に使用し得る。例えば、プラスミドベクターはリポソームと共に使用し得る。現在、本発明の好ましい実施態様としてアデノウイルスの使用が想定される。

治療の必要な部位に、組み換え体ストレス応答性ポリペプチドの持続性バイオアベイラビリティーが作用するようにキャリアを選択し得る。本明細書で使用する用語「持続性バイオアベイラビリティー」とは、免疫応答の誘発に十分な、抗原結合ドメインのないストレス応答性ポリペプチドのバイオアベイラビリティーをいう。用語「持続性バイオアベイラビリティー」はまた、腫瘍内の血管増加を阻害するのに十分な、本発明のストレス応答性ポリペプチドのバイオアベイラビリティーをいう。用語「持続性バイオアベイラビリティー」には、以下に限らないが、キャリアからのストレス応答性ポリペプチドの徐放性、ストレス応答性ポリペプチドの代謝安定性、ストレス応答性ポリペプチドを含む組成物の全身輸送、およびストレス応答性ポリペプチドの有効用量を含むファクターが含まれる。

ストレス応答性ポリペプチドの持続性バイオアベイラビリティー用の典型的な組成物には、以下に限らないが、ポリマーマトリクス(膨張および生物分解性ポリマーマトリクスを含む)(米国特許番号6,335,035; 6,312,713; 6,296,842; 6,287,587; 6,267,981; 6,262,127; および6,221,958)、ポリマー被覆微粒子(米国特許番号6,120,787および6,090,925)、ポリオール：オイル懸濁液(米国特許番号6,245,740)、多孔性粒子(米国特許番号6,238,705)、ラテックス／ワックス被覆顆粒(米国特許番号6,238,704)、キトサンマイクロカプセル、およびミクロスフェアエマルジョン(米国特許番号6,190,700)が含まれ得る。

ストレス応答性ポリペプチドの持続性バイオアベイラビリティーに好ましい組成物には、遺伝子治療ベクター、例えば、以下に記載するような遺伝子治療ベクターを含む遺伝子治療構成物が含まれる。

ウイルス性遺伝子治療ベクター
本発明のウイルス性ベクターは、好ましくは無力化されており、例えば、複製欠損である。すなわち、制御できない複製をインビボで阻止し、ウイルス感染の望ましくない副作用を避けるため、複製に必要な１以上の機能性遺伝子を欠いている。好ましくは、ウイルス性ゲノムすべてが、治療遺伝子を組み込んだウイルス性ゲノムをウイルスコートまたはキャプシドにパッケージするのに必要な最低限度のゲノムエレメントを除き、除かれる。以下、(ａ)長端末反復(ＬＴＲ)または開発端末反復(Invented Terminal Repeat)(ＩＴＲ)、および(ｂ)パッケージシグナルを除き、ウイルス性ゲノムはすべて欠失するのが望ましい。アデノウイルスの場合、Ｅ１領域および所望によりＥ２、Ｅ３および／またはＥ４領域のうちの１以上で典型的に欠失が生ずる。他のウイルス性ベクターは、同様に、複製に必要な遺伝子を欠失させ得る。配列の欠失は、例えば、適当な制限酵素による消化、その後の再ライゲーションを含む、組み換え手段により行い得る。複製能を自己制御または自己破壊するウイルス性ベクターもまた使用し得る。

本発明の核酸構成物は、当分野に既知の任意の適当な手段によりウイルスゲノムに組み込み得る。典型的に、その組み込みは、該ウイルスの該ゲノムの適当な制限酵素部位に該構成物をライゲーションすることにより行う。次いで、ウイルスゲノムは、任意の適当な方法を用いウイルスのコートまたはキャプシド中にパッケージし得る。特に、任意の適当なパッケージング細胞系を使用し、本発明のウイルスベクターを作成し得る。これらのパッケージング系は、本発明の複製欠損ウイルスゲノムを相補する。そのパッケージング系は、例えば、そのゲノム中への組み込みにより、複製欠損ゲノムで欠失している該遺伝子を含んでいるからである。そのため、パッケージング系の使用により、本発明のウイルスベクターを培養物中で作成することができる。

レトロウイルスに適当なパッケージング系には、PA317細胞、Ψ-2細胞、CRE細胞、CRIP細胞、E-86-GP細胞、および293GP細胞の誘導体が含まれる。２９３系細胞が、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスの使用に好ましい。

プラスミド遺伝子治療ベクター
抗原結合ドメインのないストレス応答性タンパク質がまたプラスミドにコードされ得る。プラスミドキャリアの利点は、毒性が低く、ラージスケールでの産生が容易であることである。ポリマーコート化プラスミドは、Fewell et al. (2001) Mol Ther3 : 574-583に開示のようなエレクトロポレーションを用い送達され得る。更に、プラスミドは、送達を容易にする更なるキャリア、例えば、陽イオン性ポリアミン、デンドリマー、または脂質と組み合わし得る。例えば、Baher et al. (1999) Anticancer Res 19: 2917-2924; Maruyama-Tabata et al. (2000) Gene Ther 7: 53-60; およびTam et al. (2000) Gene Ther7: 1867-1874参照。

リポソーム
本発明のストレス応答性ポリペプチドはまた、リポソームを用い送達され得る。例えば、組み換え的に産生されるストレス応答性ポリペプチドがリポソーム中にカプセル化され得る。リポソームは、当分野に既知の種々の技術の何れかにより調製され得る。例えば、----- (1997). Current Protocols in Human Genetics on CD-ROM. John Wiley & Sons, New York; Lasic & Martin (1995)STEALTH(登録商標) Liposomes. CRC Press, Boca Raton, Florida, United States of America; Janoff (1999) Liposomes: Rational Design. M. Dekker, New York; Gregoriadis (1993) Liposome Technology, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, Florida, United States of America; Betageri et al. (1993) Liposome Drug Delivery Systems. Technomic Pub., Lancaster; Pennsylvania, United States of America.; および米国特許番号4,235,871; 4,551,482; 6,197,333; および6,132,766参照。温度感受性リポソームもまた使用し得、例えば、米国特許番号6,200,598に開示のようなTHERMOSOMES(商標)である。本発明のリポソーム内へのストレス応答性ポリペプチドの捕捉は、当分野の任意の通常の方法を用い行い得る。リポソーム組成物の調製には、酸化防止剤のような安定化剤および他の添加剤が使用され得る。

脂質微粒子、ミセル、脂質懸濁液、および脂質エマルジョンのような他の脂質キャリアもまた、特許請求の範囲の本発明に基づき使用し得る。例えば、Labat-Moleur et al. (1996) Gene Therapy 3: 1010-1017; および米国特許番号5,011,634; 6,056,938; 6,217,886; 5,948,767; および6,210,707参照。

III.B. ターゲッティングリガンド
望ましいならば、本発明の組成物には、特定の細胞性マーカーに対し親和性を有する１以上のリガンドが含まれ得、それによって、対象における治療の必要な部位にストレス応答性ポリペプチドを容易に送達することができる。リガンドには、抗体、細胞表面マーカー、ペプチドなどが含まれ、ストレス応答性ポリペプチドを特定の細胞、例えば、腫瘍細胞に届ける機能を有する。

対象に投与後のインビボのリガンドの機能を述べる際に本明細書で使用する用語「ターゲッティング」および「ホーミング」は、何れも、対照組織よりも優先的な、標的組織(例えば、腫瘍)へのリガンドの移動および／または該組織での蓄積をいう。

本明細書で使用する用語「標的組織」とは、対象への投与後、リガンドの蓄積が意図される部位をいう。例えば、本発明の方法は、腫瘍を含む標的組織を用いる。

本明細書で使用する用語「対照組織」とは、投与したリガンドの結合および／または蓄積が実質的にないと思われる部位をいう。例えば、本発明の方法により、癌性でない組織が対照組織となる。

本明細書で使用する用語「選択的ターゲッティング」または「選択的ホーミング」は、何れも、対照組織中のリガンド量の約２倍を超える量、より好ましくは約５倍以上の量、および最も好ましくは約１０倍以上の量のリガンドを標的組織に生ずる、リガンドの優先的な局在化をいう。用語「選択的ターゲッティング」および「選択的ホーミング」はまた、対照組織に対してはターゲッティングせず、好ましくはすべての対照組織に対してはターゲッティングしない標的組織中のリガンドの結合または蓄積をもいう。

本明細書で使用する用語「ターゲッティングリガンド」および「ターゲッティング分子」は、何れも、ターゲッティング活性を有するリガンドをいう。好ましくは、ターゲッティングリガンドは選択的ターゲッティングである。典型的なターゲッティングリガンドにはペプチドおよび抗体が含まれる。

用語「ペプチド」には、任意の種々の形態のペプチド誘導体が含まれ、それには、アミド、タンパク質との結合体、環状化ペプチド、ポリマー化ペプチド、保存置換変異体、類似体、フラグメント、ペプチド、化学的修飾ペプチド、およびペプチド疑似体が含まれる。腫瘍結合活性が見られる典型的なペプチドリガンドには、例えば、米国特許番号6,180,084および6,296,832に開示されているものが含まれている。

用語「抗体」は、免疫グロブリンタンパク質、またはその機能的部分をいい、それには、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ハイブリッド抗体、一本鎖抗体(例えば、ファージライブラリーに代表される一本鎖抗体)、変異誘発抗体、ヒト化抗体、および抗原結合部位を含む抗体フラグメント(例えば、ＦａｂおよびＦｖ抗体フラグメント)が含まれる。本発明の方法により使用され得る典型的な抗体リガンドには、腫瘍特異的抗原Her2/neu(v-erb-b2 鳥類赤芽球性白血病ウイルス性腫瘍遺伝子相同体(avian erythroblastic leukemia viral oncogene homologue)2)(Kirpotin et al., 1997; Becerril et al., 1999)に結合する抗体およびCEA(癌胚抗原)(Ito et al., 1991)に結合する抗体が含まれる。また、米国特許番号5,111,867; 5,632,991; 5,849,877; 5,948,647; 6,054,561およびPCT国際公開番号WO98/10795参照。

複数の腫瘍型をターゲッティングし得るリガンドを同定するための労力により、腫瘍脈管構造に存在する標的分子に結合するようなターゲッティングリガンドが、開発されている(Baillie et al., 1995; Pasqualini & Ruoslahti, 1996; Arap et al., 1998; Burg et al., 1999; Ellerby et al., 1999)。

抗体、ペプチドまたは他のリガンドは、当分野に既知の方法(以下に限らないが、カルボジイミド結合、エステル化、過ヨウ素酸ナトリウム酸化後の還元性アルキル化、およびグルタルアルデヒド架橋が含まれる)を使用し、薬物(例えば、抗原結合ドメインのないストレス応答性ポリペプチド)または薬物キャリアに結合し得る。例えば、Bauminger & Wilchek (1980) Methods Enzymol70 : 151-159; Goldman et al. (1997) Cancer Res 57: 1447-1451; Kirpotin et al. (1997) Biochemistry 36: 66-75 ;----- (1997). Current Protocols in Human Genetics on CD-ROM. John Wiley & Sons, New York; Neri et al. (1997) Nat Biotechnol 15 : 1271-1275; Park et al. (1997) Cancer Lett 118: 153-160; およびPasqualini et al.(1997) Nat Biotechnol 15: 542-546; 米国特許番号6,071,890; および欧州特許番号0 439 095参照。または、シュードタイピング(pseudotyping)のレトロウイルを使用し、特定細胞に対しウイルスを標的とし得る(Marin et al., 1997)。

III.C. 製剤
本発明の組成物には、好ましくは、抗原結合ドメインのないストレス応答性ポリペプチドおよび医薬的に許容される担体が含まれる。適当な製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、殺菌性抗生物質、および製剤を対象レシピエントの体液と等張にする溶液；ならびに懸濁剤および濃化剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁剤を含み得る水性および非水性滅菌注射溶液が含まれる。該製剤は、単位用量または複数用量のコンテナー中に存在し得、例えば、アンプルおよびバイアルに密封され得、そして使用直前に滅菌液性キャリア、例えば、注射用の水を添加するのみでよい、凍結状態またはフリーズドライ状態(凍結乾燥)に保存し得る。好ましい成分うちの幾つかに、例えば、０．１から１０ｍｇ／ｍｌの範囲、好ましくは約２．０ｍｇ／ｍｌの硫酸ドデシルナトリウム(ＳＤＳ)；および／または例えば１０から１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約３０ｍｇ／ｍｌのマンニトールまたは他の糖；リン酸緩衝性生理食塩水(ＰＢＳ)、ならびに当分野で通常の任意の他の製剤化剤(formulation agent)がある。

本発明の治療方法(therapeutic regimens)および医薬組成物は、以下に限らないが、サイトカインインターフェロンα(IFN-α)、インターフェロンγ(IFN-γ)、インターロイキン２(IL2)、インターロイキン４(IL4)、インターロイキン６(IL6)、腫瘍ネクローシス因子(TNF)、または免疫細胞に影響を与える他のサイトカインが含まれる、更なるアジュバントまたは生物応答修飾物質と共に使用し得る。

II.D. 用量および投与
本発明の組成物の投与に適当な方法には、以下に限らないが、静脈注射、皮下注射、または腫瘍内投与が含まれる。複数経路での組成物の送達の場合、組成物は、エアロゾルスプレーまたは粗いスプレー(coarse spray)で投与され得る。送達方法は、キャリアまたはベクターの型、ストレス応答性ポリペプチドの治療効果、および治療する病状などを考慮して選択する。本発明の好ましい実施態様では、血管内投与を用いる。

好ましくは、本発明の有効量の組成物を対象に投与する。例えば、「有効量」は、免疫応答の誘発に十分な、抗原結合ドメインのないストレス応答性ポリペプチドを含む組成物の量である。これはまた、本明細書では「免疫活性化量」と称する。更なる実施例の方法により、腫瘍治療の有効量には、測定可能な抗腫瘍応答を生ずるのに十分な量が含まれる(例えば、抗脈管形成応答、細胞毒性応答、および／または腫瘍緩解)。

本発明の治療組成物中の作用成分の実際の用量レベルは、特定の対象において望ましい治療応答を有効に生じさせる作用化合物量を投与するべく、変化し得る。選択した用量レベルは、治療組成物の作用、製剤、投与経路、他の薬物または治療との組合せ、治療すべき疾患または異常、および治療する対象の体調および先の病歴を含む種々の要因に依存する。有効量または用量の決定および調節、およびその調節をいつ・どのようにするかという評価は、医薬の分野の当業者に既知である。

ウイルス性ベクターの局所投与の場合、先の臨床的研究により、１０^１３ｐｆｕ(プラーク形成単位)までのウイルスの注入ならば毒性は最少となることが示されている。ヒト患者では、１×１０^９−１×１０^１３ｐｆｕを通常使用する。Habib et al. (1999) Hum Gene Ther 10:2019-2034参照。この範囲内で適当な用量を決定するため、予備的治療を１×１０^９ｐｆｕで開始し、そして用量制限毒性が生じない範囲で該用量レベルを徐々に上げていくことができる。毒性は、National Cancer Instituteにより開示されている基準を用い評価し得、１週間を超えて持続する任意のグレード４毒性または任意のグレード３毒性として適当に定義される。用量はまた、抗腫瘍および／または抗脈管形成の作用が最大となるように調節する。抗腫瘍および／または抗脈管形成の作用を評価する典型的な基準および方法を以下に記載する。

本発明のストレス応答性ポリペプチドの可溶性製剤の場合、ネズミモデルに投与する用量に基づきヒトの用量に外挿する通常の方法は、マウスの用量をヒトの用量に変換するための換算係数：ｋｇあたりのヒトの用量＝ｋｇあたりのマウスの用量×１２(Freireich et al., 1966)を用い行い得る。薬物用量は、平方メーター(体表面積)あたりミリグラムで示す。体重ではない、この方法は、特定の代謝および排泄機能と良好な相互関係を有するからである。更に、体表面積は、Freireich et al. (1966) Cancer Chemother Rep 50:219-244に開示のように、成人および小児ならびに種々の動物種での薬物用量の一般基準として使用され得る。端的には、任意の所定の種で用量ｍｇ／ｋｇを等価の用量ｍｇ／ｍ^２で表すためには、該用量に適当なｋｍ係数をかける。ヒトの成人では、１００ｍｇ／ｋｇは、１００ｍｇ／ｋｇ×３７ｋｇ／ｍ^２＝３７００ｍｇ／ｍ^２となる。

細胞治療の目的の場合、細胞、例えば、エクソビボ治療用の細胞を、皮内または皮下投与により送達することが好ましい。当業者は、この方法では、投与され得る液体の体積は制限されるという事実のみを考慮して、適当な用量(例えば、細胞の数および濃度)を選択することができるだろう。

更なる投薬技術が当分野で開示されている。例えば、米国特許番号5,326,902および5,234,933、およびPCT国際公開番号WO 93/25521参照。

以下の実施例は、本発明の好ましい形態を解説するために含まれている。以下の実施例の特定の態様は、発明者により創作されまたは想定された技術および手順について、本発明の実施において十分機能するように記載されている。これらの実施例は、発明者の標準的な試験実施基準(laboratory practice)を用い例示する。本発明の開示および当業者の一般レベルを考慮すると、当業者は、以下の実施例は例示のみを目的とし、多くの改変、修飾および変更が本発明の精神および範囲を逸脱することなく可能であると認識するだろう。

実施例１
ＧＲＰ９４ΔＫＤＥＬの調製
本発明により、この実施例は、免疫活性化ストレス応答性ポリペプチドを生物化学的に精製する更なるアプローチである。このアプローチは、本明細書に記載するように、ＧＲＰ９４およびＧＲＰ９４構造ドメインの分泌型を用いる。ＧＲＰ９４は、そのＣ末端のLys-Asp-Glu-Leu(KDEL; SEQ ID NO : 23)配列(Munro & Pelham, 1987)により、小胞体(ＥＲ)内腔に残留する。そのため、ＧＲＰ９４の分泌型を、そのＫＤＥＬ配列が欠損するように作成し、ＧＲＰ９４ΔＫＤＥＬとした。

イヌのＧＲＰ９４ ｃＤＮＡを、ＰＣＲ応答すべてにおいて鋳型として使用した。ＧＲＰ９４ΔＫＤＥＬの作成のため、５’センスプライマー(配列番号２４)および３’アンチセンスプライマー(配列番号２５)を使用し、５’ＳａｌＩと３’ＮｏｔＩ制限部位との間にある５’２４０３塩基対に相当するＧＲＰ９４コーディング領域のＰＣＲ産物を作成した。該ＰＣＲ産物を、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩで消化し、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ消化したｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏベクター(INVITROGEN(商標) Life Technologies of Carlsbad, California, United States of America)にライゲーションした。ＧＲＰ９４(１−３３７)の作成のため、５’センスプライマー(配列番号２６)および３’アンチセンスプライマー(配列番号２７)を使用し、５’ＳａｌＩと３’ＮｏｔＩ制限部位との間にある５’１１１１塩基対に相当するＧＲＰ９４コーディング領域のＰＣＲ産物を調製した。該ＰＣＲ産物を、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩで消化し、次いでＳａｌＩ／ＮｏｔＩ消化したｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏベクターにライゲーションした。組み換え体発現のためのＧＲＰ９４ＮＴＤは、５’センスプライマー(5'GGAATTCCATATGGACGATGAAGTCGATGTG3')および３’アンチセンスプライマー(5'CGGATCCTCAATTCATAAGCTCCCAATCCCA3')を用い作成し、それにより５’ＮｄｅＩと３’ＢａｍＨＩ制限部位との間にある６４−１，００８ｂｐに相当するＧＲＰ９４コーディング配列のＰＣＲ産物を得た。該ＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで消化し、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ消化したｐＧＥＸベクター(D. Gewirth, Duke University Medical Center, Durham, North Carolina, United States of Americaにより提供)にライゲーションした。プレプロラクチン(preprolactin)構成物をまた調製し、対照として使用した(Haynes et al., 1997)。

実施例２
４Ｔ１乳癌細胞におけるＧＲＰ９４ΔＫＤＥＬの発現
実施例１で記載したように調製した、ＧＲＰ９４ΔＫＤＥＬ ｃＤＮＡ構成物を４Ｔ１乳癌細胞にトランスフェクトした。４Ｔ１細胞(Ｈ−２^ｄ)およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを加えたダルベッコ変法イーグル培地(ＤＭＥＭ)中で培養した。

トランスフェクションはすべて、Lipofectamine(商標)試薬(Gibco BRL、Rockville, Maryland, United States of America)を用い、その製造者の指示に従って行った。ｍｏｃｋトランスフェクションは、血清のないＤＭＥＭか、またはｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏベクター＋Lipofectamine(商標)試薬を用い行った。樹状細胞(ＤＣ)成熟実験のため、細胞を、血清のないＤＭＥＭ＋ＤＮＡおよびLipofectamine(商標)試薬中で５時間トランスフェクトした。次いで、細胞を、滅菌したリン酸緩衝性生理食塩水(ＰＢＳ)で、ゆるやかにリンスし、ＤＣ培養培地に移した。調整培地を７２時間で回収し、次いで、低速度の遠心分離により細胞破砕物を沈降させた。次いで、これらの培地を、以下に記載するように、６日目の樹状細胞に適用した。

蛍光顕微鏡用にトランスフェクトした細胞を調製するため、細胞を、６ウェルプレートのカバーガラス上で一夜、５０％コンフルエンスとなるまで増殖させた。次いで、細胞を、氷上で、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定化した。固定化細胞を、氷上で１５分間、ＰＢＳ中の０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１０中で透過性にした。ブロッキングは、ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)中で３０分間、室温で行った。ブロックした細胞を、０．１％ＢＳＡのＰＢＳ中の抗ｍｙｃ抗体の１：２００希釈物中、１時間室温でインキュベーションした。よく洗浄した後、細胞を、０．１％ＢＳＡのＰＢＳ中のTEXAS RED(登録商標)蛍光色素(Molecular Probes, Inc.、Eugene, Washington, United States of America)-結合ヤギ抗マウス抗体結合(Cappel Laboratories、Westchester, Pennsylvania, United States of America)の１：２００希釈物中、１時間室温でインキュベーションした。細胞を再度洗浄し、マウンティング培地(Difco Laboratories, Inc.、 Detroit, Michigan, United States of America)を用いガラススライドにマウントした。蛍光標識した細胞を、Zeiss LSM-410スキャンニングレーザー共焦点顕微鏡(Carl Zeiss Microimaging, Inc.、Thronwood, New York, United States of America)で視覚化した。画像は全て、PHOTOSHOPO Version 6.0ソフトウェア(Adobe Systems, Inc.、San Jose, California, United States of America)で処理した。

４Ｔ１細胞へのトランスフェクション後、ＧＲＰΔＫＤＥＬは、発現ベクターにより供与されたｍｙｃエピトープタグにより、内在性全長ＧＲＰ９４と区別した。ＧＲＰ９４(ＤＵ−１２０)に対する抗ペプチド抗血清は、Cocalico Biologicals of Reamstown, Pennsylvania, United States of Americaで産生した抗体を用い、Harlow and Lane(Harlow & Lane, 1988)のプロトコールに従い調製した。ｍｙｃエピトープに対するモノクローナル抗体９Ｅ１０は、Zymed Laboratories of South San Francisco, California, Unites States of Americaから購入した。典型的に、トランスフェクション効率は２５％であり、ｍｙｃ陽性細胞では標準的なＥＲ染色パターンが見られた。プラスミドＤＮＡの非存在下またはベクターのみの存在下でのトランスフェクションではｍｙｃ染色は生じなかった。

実施例３
４Ｔ１乳癌細胞によるＧＲＰ９４ΔＫＤＥＬの分泌およびプロセッシング
ＧＲＰ９４ΔＫＤＥＬが分泌しているか否か決定するために、ＧＲＰ９４ΔＫＤＥＬトランスフェクト４Ｔ１細胞およびｍｏｃｋトランスフェクトコントロール細胞由来の上清で免疫沈降を行った。４Ｔ１細胞を、カバーガラス上で増殖させ、固定化し、透過性とし、抗ｍｙｃ抗体(９Ｅ１０)と共にインキュベーションした。ｍｙｃタグを、TEXAS RED(登録商標)蛍光色素(Molecular Probes, Inc.、Eugene, Washington, United States of America)と結合した二次抗体を用い検出した。

上清はトランスフェクト細胞から得、抗ｍｙｃ抗体で免疫沈降し、１００および１１０ｋＤａのタンパク質をダブレット(doublet)で得た。ｍｏｃｋトランスフェクトした細胞の上清では何れのタンパク質も生じなかった。同様のパターンが細胞ライゼートの抗ｍｙｃ免疫沈降で見られたが、予期したように、抗ＧＲＰ９４抗体による免疫沈降では、ｍｏｃｋトランスフェクト細胞において内在性ＧＲＰ９４を示す顕著なバンドが生じた。タンパク質バンドの相対的な移動度を比較すると、ＧＲＰ９４ΔＫＤＥＬは、内在性ＧＲＰ９４よりも僅かに分子量が大きく、それはｍｙｃタグが存在するためであることが判明した。

ゴルジ体を介するポリペプチド運搬の間のオリゴサッカライド修飾により、ＧＲＰ９４ΔＫＤＥＬはダブレットとして生ずる。この可能性を調査するため、追跡培地(chase media)またはＧＲＰ９４ΔＫＤＥＬトランスフェクト細胞由来の細胞ライゼートの免疫沈降物を、エンドグリコシダーゼＨ(Endo H; Boehringer Mannheim of Indianapolis, Indiana, United States of Americaから入手可能)またはペプチドＮ−グリコシダーゼＦ(PNGase-F; New England Biolabs of Beverly, Massachusetts, United States of Americaから入手可能)で消化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。

トランスフェクトまたはｍｏｃｋトランスフェクトして２４時間後、細胞を、血清なし、メチオニンなし、およびシステインなしのＤＭＥＭ中で３７℃２０分間インキュベーションすることにより、飢餓状態とする。パルス標識は、１００μＣｉ／ｍｌ ^３５Ｓ標識Ｐｒｏ−Ｍｉｘ(Amersham Biosciences of Piscataway, New Jersey, United States of America)を加えた血清なし、メチオニンなし、およびシステインなしのＤＭＥＭ中で３７℃３０分間インキュベーションすることにより、行った。次いで、細胞を洗浄し、追跡培地(１ｍＭ非標識Ｌ−メチオニンを加えた増殖培地)中、３７℃で、提示した時間インキュベーションした。追跡培地のサンプルを回収し、微量遠心管中、１３，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により透明化した。細胞を、氷冷した溶解緩衝液(150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7.5, 0.05% SDS, 1% NP-40)中で溶解した。細胞破砕物を含むライゼートは、微量遠心管中、１３，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により透明化した。サンプルすべてを、通常のマウス血清およびPansorbin細胞(Calbiochem of La Jolla, California, United States of America)と共に事前に透明化した。

タンパク質は、抗ＧＲＰ９４(ＤＵ−１２０)または抗ｍｙｃ(９Ｅ１０)抗体およびタンパク質Ａセファロースビーズを用い事前に透明化した追跡培地およびライゼートから免疫沈降させた。免疫沈降物にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、６％、１０％、または１２．５％ポリアクリルアミドゲルで分離した。更に、免疫沈降物を以下のようにグリコシダーゼ消化した。サンプルを変性緩衝液(0.5% SDS, 1% 2-メルカプトエタノール)中、１００℃、１０分間インキュベーションした。

ＥｎｄｏＨ消化のため、変性タンパク質を、５ｍＵ ＥｎｄｏＨを有するかまたは有しないＧ５緩衝液(50 mM クエン酸ナトリウム, pH 5.5)中、３７℃、２．５時間インキュベーションした。ＰＮＧａｓｅ−Ｆ消化のため、変性タンパク質を、０．８ｍＵ ＰＮＧａｓｅ−Ｆを有するかまたは有しないＧ７緩衝液(50 mM リン酸ナトリウム, pH 7.5)＋１％ＮＰ−４０中、３７℃、２．５時間インキュベーションした。次いで、サンプルにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、６％アクリルアミドゲルで分離した。放射標識タンパク質を、リン(phoshpor)イメージングのＢＡＳ(商標)システムおよびＭＡＣＢＡＳ(商標)-２．０ソフトウェア(Fuji Medical Systems USA, Inc. of Stamford, Connecticutt, United States of America)を用い視覚化した。

追跡培地および細胞ライゼートの両方において、該ダブレットを、ＰＮＧａｓｅ−Ｆによる消化によって単一のタンパク質に分離した。細胞ライゼート中の内在性ＧＲＰ９４は、ＰＮＧａｓｅ−Ｆ消化によって、より大きく移動したが、ＧＲＰ９４ΔＫＤＥＬとは区別できた。ＥｎｄｏＨ(ＥＲ残留タンパク質に存在する、マンノースオリゴサッカライドを非常に切断する酵素)は、追跡培地中に存在する該ダブレットには影響しなかったが、細胞ライゼート中に存在するダブレットをシングルに分離した。これらの実験により、ＧＲＰ９４ΔＫＤＥＬは単一のタンパク質であり、それは、外細胞性(exocytic)経路において異種性オリゴサッカライド修飾を行うことが判明した。

実施例４
ＧＲＰ９４ΔＫＤＥＬ分泌動力学
ＥＲに残留する内腔タンパク質のＫＤＥＬ保持／修復配列が欠失することにより、ＧＲＰ９４ΔＫＤＥＬは分泌するが、その速度は、しばしば真正の分泌タンパク質よりも相当遅い。

ＧＲＰ９４ΔＫＤＥＬ分泌の相対速度を評価するため、ＧＲＰ９４ΔＫＤＥＬまたは分泌ホルモンプレプロラクチンの何れかをコードする構成物でトランスフェクトした４Ｔ１細胞にパルス−追跡研究を行った。４Ｔ１乳癌細胞を３０分間代謝的に標識した。追跡期間の初期後、細胞および培地サンプルを回収し、ＧＲＰＤＫＤＥＬまたはプロラクチンを免疫沈降により回収し、ＧＲＰ９４をＰＮＧａｓｅ−Ｆで処理した。タンパク質を、ＧＲＰΔＫＤＥＬについては６％ゲル、またはプロラクチンについては１０％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。タンパク質のバンドを、リン(phoshpor)イメージングのＢＡＳ(商標)システムおよびＭＡＣＢＡＳ(商標)-２．０ソフトウェア(Fuji Medical Systems USA, Inc. of Stamford, Connecticutt, United States of America)を用い分析した。それぞれのバンドにおいて定量したタンパク質量を用い、それぞれの時点での該培地または細胞ライゼート中に存在するトータルのＧＲＰΔＫＤＥＬまたはプロラクチンの割合を決定した。

これらの実験により、ＧＲＰΔＫＤＥＬ分泌は効率がよく、半減期は天然のプロラクチンでは６０分であるのに対して、１２０分である。興味あることに、内在性ＧＲＰ９４は、細胞ライゼートの免疫沈降物中で明瞭なバンドとして見られ、一定時間、相当な一定量で保持されており、これは、全長ＧＲＰ９４とＧＲＰΔＫＤＥＬとのヘテロ二量化がアセンブリ応答の競争に重要ではないことを示す。

実施例５
４Ｔ１乳癌細胞またはＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞から分泌するＧＲＰΔＫＤＥＬは４Ｔ１腫瘍のチャレンジを防御する。
ＧＲＰ９４仲介腫瘍拒絶における抗原独立性作用の重要性を評価するため、４Ｔ１マウス腫瘍進行モデルを研究した。４Ｔ１乳癌細胞を腫瘍細胞系モデルとして選択した。それらは非常に活動的であり、広範囲に転移し、治療に対する応答が非常に小さいためである(Coveney et al., 1996; Lohr et al., 2001)。免疫フェーズ(immunization phase)で使用する細胞が腫瘍にならないようにするため、動物への注射前に細胞を放射線に暴露した。その放射線照射はＧＲＰΔＫＤＥＬ発現または分泌の量に影響しなかった(図１Ａ)

トランスフェクトした４Ｔ１およびＮＩＨ３Ｔ３(Ｈ−２^ｑ)細胞(American Type Culture Collection of Manassas, Virginia, United States of America)を実施例２に記載のように調製した。細胞は、トランスフェクトして２４時間後に放射線照射した(１０，０００ｒａｄ)。

雌ＢＡＬＢ／ｃマウス(Ｈ−２^ｄ)をCharles River Laboratories (Raleigh, North Carolina, United States of America)から入手した。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(Ｈ−２^ｂ)をNCI Frederick Cancer Research and Development Center (Frederick, Maryland, United States of America)から入手した。動物は、American Association for Laboratory Animal ScienceのInstitutional Animal Care and Use Committee(IACUC)の適用可能なガイドラインに沿って所持し、取り扱った。

トランスフェクトし、放射線照射した細胞を滅菌ＰＢＳで大量に洗浄し、次いで、ＢＡＬＢ／ｃマウスの左後ろ足の皮膚に動物あたり２−４×１０^６細胞を注射した。免疫は４週間連続して毎週行った。５週間目、マウスを、右後ろ足の皮膚への注射により滅菌ＰＢＳ中の１×１０^６４Ｔ１細胞でチャレンジした。腫瘍の長さ、幅および高さは、そのチャレンジ後２−３日おきに測定し、腫瘍体積を以下の式を用い算出した。
体積＝(π／６)×長さ×幅×高さ
研究の最後に動物を屠殺し、肺を切除し重さを測定した。腫瘍体積および肺重量のデータでは、グループ間での顕著な相違がウィルコクソン順位和検定で分析できた。

１連の研究では、ＧＲＰΔＫＤＥＬトランスフェクトするかまたはｍｏｃｋトランスフェクトした４Ｔ１細胞をワクチン接種フェーズに用い、その後、生きている４Ｔ１細胞でチャレンジした。予想されるように、ＰＢＳでワクチン接種した対照マウスおよびｍｏｃｋトランスフェクトした４Ｔ１細胞(４Ｔ１−ｍｏｃｋ)でワクチン接種したマウスの両方において、急速な腫瘍進行が見られた(図１Ｂ、１Ｃおよび１Ｅ)。ｍｏｃｋトランスフェクトした４Ｔ１細胞はＰＢＳと比較して抗腫瘍免疫応答を適度に生じたが、これら２つのグループの間での腫瘍体積の相違は統計的には有意ではなかった(ｐ＝０．３３)。注目すべきは、ＧＲＰΔＫＤＥＬ分泌４Ｔ１細胞(４Ｔ１−ΔＫＤＥＬ)でワクチン接種したマウスでは、対照動物と比較すると腫瘍進行が著しく遅延した(図１Ｄ−１Ｅ)。このグループと対照グループとの間の腫瘍体積の相違は統計的に有意であった(ＰＢＳと４Ｔ１-ΔＫＤＥＬではＰ＝０．００００５であり、４Ｔ１−ｍｏｃｋと４Ｔ１-ΔＫＤＥＬではＰ＝０．００２１である)。

第二の研究では、ＧＲＰ９４ΔＫＤＥＬトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞またはｍｏｃｋトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を、ワクチン接種フェーズに使用し、その後、４Ｔ１細胞でチャレンジした。再び、ＰＢＳでワクチン接種した対照マウスおよびｍｏｃｋトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞(ＮＩＨ−ｍｏｃｋ)でワクチン接種したマウスの両方において、急速な腫瘍進行が見られた(図１Ｂ、１Ｆ、および１Ｈ)。これらのグループの間での腫瘍体積の相違は統計学的に有意ではなかった(ｐ＝０．５７)。興味あることに、ＧＲＰΔＫＤＥＬ分泌ＮＩＨ３Ｔ３細胞(ＮＩＨ−ΔＫＤＥＬ)で免疫化した動物では、腫瘍進行が著しく遅延した(図１Ｇ−１Ｈ；ＰＢＳとＮＩＨ−ΔＫＤＥＬではｐ＝０．００１３であり、ＮＩＨ−ｍｏｃｋとＮＩＨ−ΔＫＤＥＬではｐ＝０．００２２)。

屠殺後、それぞれのグループの動物から肺を切除し、腫瘍転移の測定として重量を測定した。ＧＲＰΔＫＤＥＬ分泌４Ｔ１細胞でワクチン接種した動物由来の肺の重量は対照動物の肺よりも有意に軽かった(図１ｌ；ＰＢＳと４Ｔ１-ΔＫＤＥＬではｐ＝０．００１２であり、４Ｔ１−ｍｏｃｋと４Ｔ１-ΔＫＤＥＬではＰ＝０．０１０)。ＧＲＰΔＫＤＥＬ分泌ＮＩＨ３Ｔ３細胞でワクチン接種した動物の肺はまた、対照マウスの肺よりも有意に軽かった(図１ｌ；ＰＢＳとＮＩＨ−ΔＫＤＥＬとではｐ＝０．０２５であり、ＮＩＨ−ｍｏｃｋとＮＩＨ−ΔＫＤＥＬとではｐ＝０．０２６である)。ｍｏｃｋトランスフェクトした４Ｔ１細胞の免疫を受けた動物は、ＰＢＳワクチン接種した対照と比較して肺の重量が僅かに軽かったが、この相違は統計的には顕著ではなかった(ｐ＝０．０７)。これらのデータにより、放射線照射した腫瘍細胞によるＧＲＰ９４の分泌が腫瘍の増殖および転移の進行を顕著に抑制することがわかる。更に、これらのデータは予測し得なかった。なぜならば、ＧＲＰ９４の組織源は腫瘍増殖および転移進行のＧＲＰ９４依存抑制の誘導において本質的な決定因子とはならないことが示されたためである。

４Ｔ１およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞によるＧＲＰΔＫＤＥＬ分泌の相対量を比較するべく、パルス−追跡実験を行った(図１Ｊ)。両細胞型によるＧＲＰΔＫＤＥＬ分泌量は同等であった。これは、ＧＲＰ９４分泌４Ｔ１細胞による場合と比較すると、ＧＲＰ９４分泌線維芽細胞による免疫後に観察される腫瘍抑制はＧＲＰ９４増加から生ずるわけではないことを示す。

実施例６
ＧＲＰ９４のアミノ末端調節ドメインは腫瘍のチャレンジを防御する
ＮＩＨ３Ｔ３細胞から分泌するＧＲＰ９４が４Ｔ１腫瘍のチャレンジを保護することから、抗原独立性の機構はＧＲＰ９４が仲介する腫瘍拒絶で重要な役割をすることが示唆される。あるいは、４Ｔ１およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞系は、観察結果を導く要因となる共有の免疫優性(immunodominant)抗原を有する。これらの説明を区別するため、ペプチドを結合する能力は欠いているが、免疫応答を直接活性化する能力は保持しているＧＲＰ９４型を調製した。

ＧＲＰ９４のペプチド結合部位は、該分子のＣ末端領域に位置することが先にわかっている(Linderoth et al., 2000)。非ペプチド結合ＧＲＰ９４ポリペプチドを作成するため、ＧＲＰ９４のアミノ末端調節ドメイン(該タンパク質のアミノ酸１−３３７に相当する)、ＧＲＰ(１−３３７)(配列番号２)をコードするように構成物を調製した。ＧＲＰ９４のこの領域には、抗腫瘍化合物およびアデノシンヌクレオチドの結合部位としての役割をする不連続の構造ドメインが含まれている(Prodromou et al., 1997b; Prodromou et al., 1997a; Stebbins et al., 1997; Rosser & Nicchitta, 2000)。重要なことに、構造モチーフは、ＭＨＣクラスＩ分子へのアセンブリに適当な長さのペプチドの結合で機能するこのドメイン中には存在しない。Stebbins et al. (1997) Cell 89: 239-250参照。ＧＲＰ(１−３３７)ｃＤＮＡの４Ｔ１細胞中へのトランスフェクションにより、３６ｋＤａタンパク質が発現し、ＧＲＰ９４のＮ末端ドメインに対し生じたポリクローナル抗体により認識された。ＧＲＰ９４(１−３３７)は、抗ＧＲＰ９４免疫沈降物中シングルで生じたが、それは、ＧＲＰΔＫＤＥＬでは観察された広範囲の異種性グリコシル化は生じていないことを示す。

インビトロ腫瘍拒絶の研究は、ワクチン接種フェーズで、ＧＲＰ(１−３３７)でトランスフェクトした４Ｔ１細胞を用い行った(図２Ａ−２Ｄ)。ＧＲＰ(１−３３７)トランスフェクトした４Ｔ１細胞の免疫を受けたマウスでは、ＰＢＳまたはｍｏｃｋトランスフェクトした細胞でワクチン接種したマウスと比較すると、腫瘍の大きさは実質的に小さくなり、腫瘍の増大速度は全体的に遅くなった(ＰＢＳと４Ｔ１−ＧＲＰ(１−３３７)とではｐ＝０．０００２であり、４Ｔ１−ｍｏｃｋと４Ｔ１−ＧＲＰ(１−３３７)とではｐ＝０．０００６)。

屠殺のとき、全グループの動物から肺を切除し、重量を測定した(図２Ｄ)。ＧＲＰ(１−３３７)分泌４Ｔ１細胞でワクチン接種した動物の肺は、対照動物よりも顕著に軽かった(ＰＢＳと４Ｔ１−ＧＲＰ(１−３３７)とではｐ＝０．００３１であり、４Ｔ１−ｍｏｃｋと４Ｔ１−ＧＲＰ(１−３３７)とではｐ＝０．０００８である)。これらの観察から、ＧＲＰ９４のアミノ末端ドメインは、後に起こる４Ｔ１腫瘍のチャレンジの保護に作用し、抗原独立性の機構がＧＲＰ９４の免疫調節機能において重要な役割をすることが示された。

実施例７
ＧＲＰ９４ΔＫＤＥＬおよびＧＲＰ９４(１−３３７)は樹状細胞変異を生ずる
骨髄由来樹状細胞(ＤＣ)は、少し修正したInaba et al. (1992) J Exp Med 176: 1693-1702の方法により骨髄原種細胞から増殖させた。骨髄前駆体は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脛骨および大腿骨から採取し、顆粒白血球マクロファージコロニー刺激性因子(ＧＭ−ＣＳＦ；マウスＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡで安定してトランスフェクトしたＸ６３細胞からの５％培養上清)を加えたＤＣ培養培地(ＲＰＭＩ１６４０＋５％熱不活性化ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、５０μＭ ２−メルカプトエタノール)中に１×１０^６cell/mlでプレートした。培養物を２日目および４日目に洗浄した。

成熟アッセイのため、６日目のＤＣを回収し、短時間の遠心分離によりペレットとし、適当な対照培地または調整培地で懸濁後、新しい６ウェルプレートに５×１０^５cell/mlで移した。ＤＣ成熟の研究では、細胞を７日目に回収し、Ｆｃレセプターは免疫グロブリンでブロックし、フィコエリトリン(ＰＥ)結合ラット抗マウスＣＤ８６抗体(BD PharMingen of San Diego, California, United States of America)で染色した。次いで、固定化後、細胞は、FACSCAN(商標)ソフトウェア(Becton, Dickinson & Company of Franklin Lakes, New Jersey, United States of America)およびCELLQUEST(商標)ソフトウェア(Becton, Dickinson & Company of Franklin Lakes, New Jersey, United States of America)を用いるフローサイトメトリーにより分析した。

未成熟樹状細胞をＧＲＰ９４にさらすことにより、主要組織適合遺伝子クラスＩおよびクラスIIのアップレギュレーション、Ｂ７−２(ＣＤ８６)のような共刺激性分子の発現、およびサイトカインの分泌(Basu et al., 2000; Binder et al., 2000b; Singh-Jasuja et al., 2000a)が生ずる。免疫応答を調節する非ペプチド結合ストレス応答性ポリペプチドの能力を試験するため、樹状細胞成熟を顕在化する分泌ＧＲＰΔＫＤＥＬおよびＧＲＰ(１−３３７)の能力をインビトロでアッセイした。

６日目の培養物で単離した樹状細胞は、ＣＤ１１ｃの発現(ＣＤ１１ｃ^＋)、中程度の量のＭＨＣクラスIIポリペプチド(ＭＨＣクラスII^中程度)、ＧＲ−１発現の欠失(ＧＲ−１⁻)、少量のＣＤ８０ポリペプチド(ＣＤ８０^少量)、および少量のＣＤ８６ポリペプチド(ＣＤ８６^少量)の特徴を有する未成熟な表現型を典型的に示す。Inaba et al. (1992) J Exp Med 176: 1693-1702参照。

リポポリサッカライド(ＬＰＳ)のような刺激分子にさらすことにより、樹状細胞は、ＣＤ１１ｃの発現(ＣＤ１１ｃ^＋)、多量のＭＨＣクラスIIポリペプチド(ＭＨＣクラスII^多量)、ＧＲ−１発現の欠失(ＧＲ−１⁻)、多量のＣＤ８０ポリペプチド(ＣＤ８０^多量)、および多量のＣＤ８６ポリペプチド(ＣＤ８６^多量)の特徴を有する成熟表現型へと変化する。Brinker et al. (2001) Am JPhysiol Lung Cell Mol Physiol 281: L1453-1463参照。

ＧＲＰ９４は、樹状細胞におけるＣＤ８６発現をアップレギュレーションする能力(Basu et al., 2000; Singh-Jasuja et al., 2000a)に基づきＧＲＰΔＫＤＥＬおよびＧＲＰ(１−３３７)に対するＤＣ応答をモニターするマーカーとして選択した。予想されるように、ＧＭ−ＣＳＦのない培地中で樹状細胞をインキュベーションすることにより、大多数の細胞ではＣＤ８６発現が低下する(図３Ａ)。対照的に、ＬＰＳ含有培地で、細胞表面ＣＤ８６での強力なアップレギュレーションが得られる(図３Ａ)。培地のみで培養した細胞と比較すると、ｍｏｃｋトランスフェクトした４Ｔ１細胞、ＧＲＰΔＫＤＥＬトランスフェクトした４Ｔ１細胞、またはＧＲＰ(１−３３７)トランスフェクトした４Ｔ１細胞から作成した調整培地にさらしたＤＣでは、ＣＤ８６発現のアップレギュレーションが見られた。ＧＲＰΔＫＤＥＬおよびＧＲＰ(１−３３７)トランスフェクトした４Ｔ１の上清に樹状細胞をさらした後のＣＤ８６の量は、ｍｏｃｋトランスフェクトした４Ｔ１上清に樹状細胞をさらした後の量よりも多かった。ｍｏｃｋトランスフェクトした４Ｔ１細胞から作成した調整培地のＤＣを成熟させる能力により、この細胞型は、このアップレギュレーション応答を顕在化することができるＧＲＰ９４以外の因子を分泌するようであることがわかった。他方、ｍｏｃｋトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞から作成した調整培地中で未成熟ＤＣをインキュベーションすることにより、培地のみと比較してＣＤ８６発現の僅かなアップレギュレーションが得られた(図３Ｂ−３Ｃ)。注目すべきは、ＧＲＰΔＫＤＥＬトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞またはＧＲＰ(１−３３７)トランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞から作成した調整培地により、ＣＤ８６の強力なアップレギュレーションが生じた(図３Ｂ−３Ｃ)。これらのデータは、分泌ＧＲＰ９４およびそのアミノ末端ドメインは両方とも、元々の細胞型にかかわらず、樹状細胞成熟を顕在化できることを示す。

実施例８
ＧＲＰ９４ΔＮＴＤとＡＰＣとの相互作用
ＧＲＰ９４ΔＮＴＤとＡＰＣとの相互作用をまた試験した。ＧＲＰ９４ＮＴＤでは、細胞表面で骨髄由来ＤＣ、顕在化腹腔内マクロファージ、およびマクロファージ由来細胞系ＲＡＷ２６４．７との結合が見られた。Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞、ＣＯＳ７腎臓細胞、またはＮＩＨ３１３線維芽細胞では、ＧＲＰ９４ＮＴＤの結合は僅かであるか、または全くなかった。蛍光標識した全長ＧＲＰ９４では、同様に、ＤＣ、腹腔内マクロファージ、およびＲＡＷ２６４．７細胞との結合が見られたが、Ｂ１６−Ｆ１０、ＣＯＳ７、またはＮＩＨ−３Ｔ３細胞との結合は僅かであるか、または全くなかった。

ＡＰＣに細胞表面が結合する結果として、ＧＲＰ９４はレセプター仲介エンドサイトーシスされる。細胞表面結合ＧＲＰ９４ＮＴＤの結末を調べるため、蛍光標識したＧＲＰ９４またはＧＲＰ９４ＮＴＤを４℃で最初に結合させ、腹腔内マクロファージを顕在化した。結合後、非結合タンパク質は洗浄により除き、該細胞を３７℃に保温した。保温前に固定化した細胞では、ＧＲＰ９４およびＧＲＰ９４ ＮＨ−２末端ドメイン、両方の細胞表面結合は優性であった(０分)。３７℃で１０分後、ＧＲＰ９４およびＧＲＰ９４ ＮＨ−２末端ドメインは両方とも、点状の細胞内ペリプラズム染色パターンにより示されるように該細胞に取り込まれた(１０分)。より長いインキュベーション間隔で、ＧＲＰ９４およびＧＲＰ９４ ＮＨ２−末端ドメインは、細胞内部全体にわたり多数の小胞構造内に広く分散した。各時点において、全長のＧＲＰ９４はＧＲＰ９４ ＮＨ−２末端ドメインと共局在化した。ＧＲＰ９４とＧＲＰ９４ ＮＨ２−末端ドメインの内部移行は相互依存しなかった。他方の非存在下で両タンパク質とも内部移行され、同様の輸送パターンが見られた。これらの様子により、ＧＲＰ９４のＮＨ２−末端ドメインは、ＡＰＣによる認識およびクリアランスに必要なパターンエレメントとなることがわかる。

実施例９
ワクチン接種試験
ワクチン接種試験は、ＧＲＰΔＫＤＥＬまたはＧＲＰ９４ＮＴＤ ｃＤＮＡでトランスフェクトした、ハプロタイプマッチしたＫＢＡＬＢ線維芽細胞で行った(上記で実質的に開示のようにトランスフェクションを行った。実施例５参照)。これらの研究の結果を図４Ａ−４Ｇに示す。その結果、ＧＲＰ９４ＮＴＤ分泌ＫＢＡＬＢ細胞で免疫した動物では、ＰＢＳまたはｍｏｃｋトランスフェクトした細胞で免疫した動物よりも原発性腫瘍組織量(primary tumor burden)は減少した(ＰＢＳとＫＢＡＬＢ−ＧＲＰΔＫＤＥＬとではｐ＜０．０００３であり、ＰＢＳとＫＢＡＬＢ−ＧＲＰ９４ＮＴＤとではｐ＜０．０００３であり、ＰＢＳとＫＢＡＬＢ−Ｍｏｃｋとではｐ＜０．２４である；図４Ａ−４Ｅ)。加えて、ＧＲＰΔＫＤＥＬまたはＧＲＰ９４ＮＴＤを分泌する同系線維芽細胞で免疫した動物では転移性腫瘍組織量(metastatic tumor burden)は減少した(ＰＢＳとＫＢＡＬＢ−ＧＲＰΔＫＤＥＬとではｐ＜０．０００３であり、ＰＢＳとＫＢＡＬＢ−ＧＲＰ９４ＮＴＤとではｐ＜０．０００２であり、ＰＢＳとＫＢＡＬＢ−Ｍｏｃｋとではｐ＜０．８である；図４Ｆ)。同時に、これらの様子により、ＧＲＰ９４のＮＨ２−末端ドメインは、腫瘍増殖および転移進行を抑制するＧＲＰΔＫＤＥＬ機能を再利用することがわかる。

４Ｔ１およびＫＢＡＬＢ細胞によるＧＲＰΔＫＤＥＬおよびＧＲＰ９４ＮＴＤの相対的な量を比較するため、パルス追跡研究を行った(図４Ｇ)。両細胞型によるＧＲＰΔＫＤＥＬおよびＧＲＰ９４ＮＴＤ分泌量は同程度であり、このことから、免疫後の腫瘍抑制はＧＲＰ９４用量の相違を反映するものでないことが示された。

実施例１０
腫瘍組織学
上記の免疫およびチャレンジプロトコールにおけるワクチン接種群の腫瘍微環境の変化について知見を得るため、対照群および試験群由来の腫瘍を屠殺時に切除し、固定化し、組織学的分析のために調製した。すべての場合において、４Ｔ１腫瘍は、過クロマチン性核を有し、高い核／細胞質比を有する悪性細胞が優性であるという特徴を有する。有糸分裂像は十分あり、典型的でない有糸分裂も見られたが、有糸分裂の割合は、種々のワクチン群では顕著な差はなかった。腫瘍は、核物質の核濃縮および核溶解が明かな広範囲のネクローシスが特徴であった。該研究の中間点では、腫瘍はマクロファージ、好中球、および僅かなリンパ球の存在が特徴的であったが、炎症性細胞の相対的な数は、種々のワクチン群で非常に相違するわけではなかった。容易にわかるように、ＰＢＳ、ｍｏｃｋトランスフェクトした４Ｔ１細胞またはｍｏｃｋトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞のワクチン接種を受けた対照動物における腫瘍の大きさは、ＧＲＰΔＫＤＥＬまたはＧＲＰ９４ＮＴＤトランスフェクトした４Ｔ１またはＮＩＨ３Ｔ３細胞のワクチン接種を受けた動物での腫瘍よりも大きくなり、ネクローシスの面積は大きかった。

参照文献
以下に列挙した参照文献および本明細書で引用した文献はすべて、本明細書で用いる方法、技術および／または組成物についてのバックグラウンドまたは教示を追加、説明、提供するという程度に、引用により本明細書に含める。

種々の詳細な本発明が、本発明の範囲を逸脱することなく、変更されると理解されるであろう。更に、上記実施例は解説目的のためのみに記載したものであり、特許請求の範囲に記載された発明を限定するために記載したものではない。

トランスフェクトされ、放射線照射された細胞がＧＲＰΔＫＤＥＬを分泌する様子を示したポリアクリルアミドゲルの写真である。 ワクチン接種および腫瘍誘発後の腫瘍体積(ｍｍ^３)または肺重量を示すグラフである。 ワクチン接種および腫瘍誘発後の腫瘍体積(ｍｍ^３)または肺重量を示すグラフである。 ワクチン接種および腫瘍誘発後の腫瘍体積(ｍｍ^３)または肺重量を示すグラフである。 ワクチン接種および腫瘍誘発後の腫瘍体積(ｍｍ^３)または肺重量を示すグラフである。 ワクチン接種および腫瘍誘発後の腫瘍体積(ｍｍ^３)または肺重量を示すグラフである。 ワクチン接種および腫瘍誘発後の腫瘍体積(ｍｍ^３)または肺重量を示すグラフである。 ワクチン接種および腫瘍誘発後の腫瘍体積(ｍｍ^３)または肺重量を示すグラフである。 ワクチン接種および腫瘍誘発後の腫瘍体積(ｍｍ^３)または肺重量を示すグラフである。 ４Ｔ１とＮＩＨ−３Ｔ３細胞による、ＧＲＰΔＫＤＥＬ分泌の相対量の比較を示す。 抗ＧＲＰ９４抗体で免疫沈降したタンパク質のポリアクリルアミドゲルの写真である。 ワクチン接種および腫瘍誘発した後の腫瘍体積(ｍｍ^３)および肺重量を示すグラフである。 ワクチン接種および腫瘍誘発した後の腫瘍体積(ｍｍ^３)および肺重量を示すグラフである。 ワクチン接種および腫瘍誘発した後の腫瘍体積(ｍｍ^３)および肺重量を示すグラフである。 ワクチン接種および腫瘍誘発した後の腫瘍体積(ｍｍ^３)および肺重量を示すグラフである。 ワクチン接種および腫瘍誘発した後の腫瘍体積(ｍｍ^３)および肺重量を示すグラフである。 培地のみ(波線)または培地＋１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ(実線)中でインキュベーションしたＤＣの相対的細胞数のｌｏｇプロットである。 ｍｏｃｋトランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞から調製した調整培地(波線)またはＧＲＰΔＫＤＥＬトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞から調製した調整培地(実線)中でインキュベーションしたＤＣの相対的細胞数のｌｏｇプロットである。 ｍｏｃｋトランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞から調製した調整培地(波線)またはＧＲＰ(１−３３７)トランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞から調製した調整培地(実線)中でインキュベーションしたＤＣの相対的細胞数のｌｏｇプロットである。 同系ＫＢＡＬＢ線維芽細胞により分泌されるＧＲＰΔＫＤＥＬおよびＧＲＰ９４ ＮＨ２−末端ドメインが４Ｔ１腫瘍増大および転移を抑制することを示す。

Claims (39)

1. 対象において免疫応答を誘発する医薬組成物であって、
   (ａ)Ｈｓｐ６０ポリペプチド、Ｈｓｐ７０ポリペプチド、Ｈｓｐ９０ポリペプチドおよびカルレティキュリンポリペプチドからなる群から選択される天然ポリペプチドの１以上の修飾を含み、さらにその非修飾天然ポリペプチドと比較して、
   (i) １以上の抗原結合ドメインを有さない；
   (ii) 宿主細胞で発現したときに細胞外輸送される；
   (iii) その存在下で未成熟な樹状細胞を培養すると未成熟な樹状細胞の成熟が誘導される、免疫活性化量の単離修飾ストレス応答性ポリペプチド、および
   (ｂ)医薬的に許容される担体
   を含む、該組成物。
2. Ｈｓｐ９０ポリペプチドがＧＲＰ９４ポリペプチドまたはＨＳＰ９０ポリペプチドである、請求項１の組成物。
3. 該ＧＲＰ９４ポリペプチドが、
   (ａ)配列番号２のアミノ酸配列を含む、または
   (ｂ)配列番号１の核酸によりコードされる
   、請求項２の組成物。
4. 該ＧＲＰ９４ポリペプチドには、
   (ａ) ０．１Ｘ ＳＳＣ中、６５℃で１５分の高ストリンジェントな洗浄条件下で配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズし、請求項２のＧＲＰ９４ポリペプチドをコードする単離核酸分子；および
   (ｂ)遺伝コードの縮重により、上記(ａ)の単離核酸分子と機能的に等価の少なくとも１つのコドンが異なり、かつ上記(ａ)の単離核酸によりコードされるＧＲＰ９４ポリペプチドをコードする単離核酸分子
   を含む、核酸分子によりコードされるポリペプチドが含まれる、請求項２または３記載の組成物。
5. 免疫活性化量には先天性免疫応答の誘発に十分な量が含まれる、請求項１〜４いずれか一項記載の組成物。
6. 該先天性免疫応答には樹状細胞の成熟が含まれる、請求項５記載の組成物。
7. 該免疫活性化量には適応免疫応答の誘発に十分な量が含まれる、請求項１〜５いずれか一項記載の組成物。
8. 該適応免疫応答には抗腫瘍応答が含まれる、請求項７の組成物。
9. 該適応免疫応答には抗感染応答が含まれる、請求項７の組成物。
10. 該対象には哺乳類が含まれる、請求項１〜９いずれか一項記載の組成物。
11. 該哺乳類にはヒトが含まれる、請求項１０の組成物。
12. (ａ)Ｈｓｐ６０ポリペプチド、Ｈｓｐ７０ポリペプチド、Ｈｓｐ９０ポリペプチドおよびカルレティキュリンポリペプチドからなる群から選択される天然ポリペプチドの１以上の修飾を含み、さらにその非修飾天然ポリペプチドと比較して、
    (i) １以上の抗原結合ドメインを有さない；
    (ii) 宿主細胞で発現したときに細胞外輸送される；
    (iii) その存在下で未成熟な樹状細胞を培養すると未成熟な樹状細胞の成熟が誘導される、単離修飾ストレス応答性ポリペプチドを含む、対象において腫瘍増殖を阻害するための組成物。
13. Ｈｓｐ９０ポリペプチドがＧＲＰ９４ポリペプチドまたはＨＳＰ９０ポリペプチドである、請求項１２の組成物。
14. 該ＧＲＰ９４ポリペプチドが、
    (ａ)配列番号２のアミノ酸配列を含む、または
    (ｂ)配列番号１の核酸によりコードされる
    、請求項１３の組成物。
15. 該ＧＲＰ９４ポリペプチドには、
    (ａ) ０．１Ｘ ＳＳＣ中、６５℃で１５分の高ストリンジェントな洗浄条件下で配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズし、請求項２のＧＲＰ９４ポリペプチドをコードする単離核酸分子；および
    (ｂ)遺伝コードの縮重により、上記(ａ)の単離核酸分子と機能的に等価の少なくとも１つのコドンが異なり、かつ上記(ａ)の単離核酸によりコードされるＧＲＰ９４ポリペプチドをコードする単離核酸分子
    を含む、核酸分子によりコードされるポリペプチドが含まれる、請求項１３または１４記載の組成物。
16. 該対象には哺乳類が含まれる、請求項１２〜１５いずれか一項記載の組成物。
17. 該哺乳類にはヒトが含まれる、請求項１６の組成物。
18. (ａ)Ｈｓｐ６０ポリペプチド、Ｈｓｐ７０ポリペプチド、Ｈｓｐ９０ポリペプチドおよびカルレティキュリンポリペプチドからなる群から選択される天然ポリペプチドの１以上の修飾を含み、さらにその非修飾天然ポリペプチドと比較して、
    (i) １以上の抗原結合ドメインを有さない；
    (ii) 宿主細胞で発現したときに細胞外輸送される；
    (iii) その存在下で未成熟な樹状細胞を培養すると未成熟な樹状細胞の成熟が誘導される、単離修飾ストレス応答性ポリペプチドを含む、対象において腫瘍転移を阻害するための組成物。
19. Ｈｓｐ９０ポリペプチドがＧＲＰ９４ポリペプチドまたはＨＳＰ９０ポリペプチドである、請求項１８の組成物。
20. 該ＧＲＰ９４ポリペプチドが、
    (ａ)配列番号２のアミノ酸配列を含む、または
    (ｂ)配列番号１の核酸によりコードされる
    、請求項１９の組成物。
21. 該ＧＲＰ９４ポリペプチドには、
    (ａ) ０．１Ｘ ＳＳＣ中、６５℃で１５分の高ストリンジェントな洗浄条件下で配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズし、請求項２のＧＲＰ９４ポリペプチドをコードする単離核酸分子；および
    (ｂ)遺伝コードの縮重により、上記(ａ)の単離核酸分子と機能的に等価の少なくとも１つのコドンが異なり、かつ上記(ａ)の単離核酸によりコードされるＧＲＰ９４ポリペプチドをコードする単離核酸分子
    を含む、核酸分子によりコードされるポリペプチドが含まれる、請求項１９の組成物。
22. 該対象には哺乳類が含まれる、請求項１８〜２１いずれか一項記載の組成物。
23. 該哺乳類にはヒトが含まれる、請求項２２の組成物。
24. 対象における腫瘍増殖を阻害するために該対象に投与する細胞を調製する方法であって、該対象から採取された、または該対象に異種的である健常細胞の培養物を、Ｈｓｐ６０ポリペプチド、Ｈｓｐ７０ポリペプチド、Ｈｓｐ９０ポリペプチドおよびカルレティキュリンポリペプチドからなる群から選択される天然ポリペプチドの１以上の修飾を含み、さらにその非修飾天然ポリペプチドと比較して、
    (i) １以上の抗原結合ドメインを有さない；
    (ii) 宿主細胞で発現したときに細胞外輸送される；
    (iii) その存在下で未成熟な樹状細胞を培養すると未成熟な樹状細胞の成熟が誘導される、
    単離修飾ストレス応答性ポリペプチドをコードする構成物でトランスフェクトすることを含む方法、ここで該単離修飾ストレス応答性ポリペプチドは該健常細胞で発現したときに細胞外輸送される。
25. Ｈｓｐ９０ポリペプチドがＧＲＰ９４ポリペプチドまたはＨＳＰ９０ポリペプチドである、請求項２４の方法。
26. 該ＧＲＰ９４ポリペプチドが、
    (ａ)配列番号２のアミノ酸配列を含む、または
    (ｂ)配列番号１の核酸によりコードされる
    、請求項２５の方法。
27. 該ＧＲＰ９４ポリペプチドには、
    (ａ) ０．１Ｘ ＳＳＣ中、６５℃で１５分の高ストリンジェントな洗浄条件下で配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズし、請求項２のＧＲＰ９４ポリペプチドをコードする単離核酸分子；および
    (ｂ)遺伝コードの縮重により、上記(ａ)の単離核酸分子と機能的に等価の少なくとも１つのコドンが異なり、かつ上記(ａ)の単離核酸によりコードされるＧＲＰ９４ポリペプチドをコードする単離核酸分子
    を含む、核酸分子によりコードされるポリペプチドが含まれる、請求項２５または２６の方法。
28. 健常細胞の培養物には、癌性ではない細胞の培養物が含まれる、請求項２４〜２７いずれか一項記載の方法。
29. 健常細胞の培養物には、対象に異種的である細胞が含まれる、請求項２４〜２７いずれか一項記載の方法。
30. 該対象には哺乳類が含まれる、請求項２４〜２９いずれか一項記載の方法。
31. 該哺乳類にはヒトが含まれる、請求項３０の方法。
32. 対象における腫瘍転移を阻害するために該対象に投与する細胞を調製する方法であって、該対象から採取された、または該対象に異種的である健常細胞の培養物を、
    Ｈｓｐ６０ポリペプチド、Ｈｓｐ７０ポリペプチド、Ｈｓｐ９０ポリペプチドおよびカルレティキュリンポリペプチドからなる群から選択される天然ポリペプチドの１以上の修飾を含み、さらにその非修飾天然ポリペプチドと比較して、
    (i) １以上の抗原結合ドメインを有さない；
    (ii) 宿主細胞で発現したときに細胞外輸送される；
    (iii) その存在下で未成熟な樹状細胞を培養すると未成熟な樹状細胞の成熟が誘導される、
    単離修飾ストレス応答性ポリペプチドをコードする構成物でトランスフェクトすることを含む方法、ここで該単離修飾ストレス応答性ポリペプチドは該健常細胞で発現したときに細胞外輸送される。
33. Ｈｓｐ９０ポリペプチドがＧＲＰ９４ポリペプチドまたはＨＳＰ９０ポリペプチドである、請求項３２の方法。
34. 該ＧＲＰ９４ポリペプチドが、
    (ａ)配列番号２のアミノ酸配列を含む、または
    (ｂ)配列番号１の核酸によりコードされる
    、請求項３３の方法。
35. 該ＧＲＰ９４ポリペプチドには、
    (ａ) ０．１Ｘ ＳＳＣ中、６５℃で１５分の高ストリンジェントな洗浄条件下で配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズし、請求項２のＧＲＰ９４ポリペプチドをコードする単離核酸分子；および
    (ｂ)遺伝コードの縮重により、上記(ａ)の単離核酸分子と機能的に等価の少なくとも１つのコドンが異なり、かつ上記(ａ)の単離核酸によりコードされるＧＲＰ９４ポリペプチドをコードする単離核酸分子
    を含む、核酸分子によりコードされるポリペプチドが含まれる、請求項３３または３４の方法。
36. 健常細胞の培養物には、癌性ではない細胞の培養物が含まれる、請求項３２〜３５いずれか一項記載の方法。
37. 健常細胞の培養物には、対象に異種的である細胞が含まれる、請求項３２〜３５いずれか一項記載の方法。
38. 該対象には哺乳類が含まれる、請求項３２〜３７いずれか一項記載の方法。
39. 該哺乳類にはヒトが含まれる、請求項３８の方法。

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