TW201707715A - 用於治療her-2陽性癌症之組合免疫療法及放射線療法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供用於誘導針對Her-2/neu抗原表現性腫瘤之免疫反應的方法以及用於在人類及犬類個體中使用放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株疫苗之組合來治療該腫瘤及針對該腫瘤進行疫苗接種的方法。
Description
本申請案為2015年3月26日提交之共同申請的美國專利申請案第14/669,629號的部分連續申請案及2015年4月2日提交之國際申請案第PCT/US15/24048號的連續申請案。此等申請案特此以全文引用之方式併入本文中。
本發明提供用於誘導針對Her-2/neu抗原表現性腫瘤之免疫反應的方法以及用於在人類及犬類個體中使用放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株疫苗之組合來治療該腫瘤及針對該腫瘤進行疫苗接種的方法。
Her-2/neu(此後稱為「Her-2」)為185kDa醣蛋白,其為酪胺酸激酶之表皮生長因數受體(EGFR)家族之成員,且在25%至40%之全部乳癌及許多骨癌(骨肉瘤-OSA)、卵巢癌、肺癌、胰臟癌、腦癌及胃腸道癌中過度表現。患有過度表現Her-2之癌症的患者即使在針對Her-2之可偵測體液性CD8+T細胞及CD4+T細胞反應的情況下仍展現耐受性。
大型飼養犬自發地出現OSA,該OSA重現人類兒童OSA之許多態樣(包括組織學異質性、侵蝕性局部疾病及早期癌轉移)。在診斷時,95%之犬患有微轉移疾病,且儘管進行切除術及化
學療法,但中值存活時間為10個月,其中大多數犬由於漸進性轉移性疾病而接受安樂死。視轉移性病灶之位置及數目而定,患有轉移性骨肉瘤之人類患者的整體存活率在10%-50%範圍內。
用於破壞腫瘤細胞或改變腫瘤/基質架構之放射療法(RT)為治療許多類型之癌症的集成部分。然而,因為OSA對標準劑量之放射線療法具有抗放射性,其不用於治療OSA。
最近已有證據證明RT可與標的免疫療法協同作用。舉例而言,RT誘導免疫原性細胞死亡,其中腫瘤細胞因細胞凋亡、壞死及/或有絲分裂失敗而隨時間緩慢死亡,引起免疫系統清除將死亡之細胞。此隨後充當用於免疫療法之腫瘤抗原的潛在來源。RT亦調節細胞死亡受體、腫瘤相關抗原及黏附分子之腫瘤細胞表面表現,其使得腫瘤細胞更易受免疫介導之殺死影響。
本發明因以下出乎意料之發現而符合罹患OSA之個體的需要:放射療法在與重組李斯特菌屬-Her-2/neu疫苗(ADXS31-164)組合時針對骨肉瘤及肺部癌轉移尤其有效,該疫苗使用具有定義完善之減毒機制且不含抗生素選擇標記物之LmddA疫苗載體來產生。
在一個具體例中,本發明提供一種治療個體之Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基
因,且其中投予該放射療法包含至少兩次投予該放射療法。
在另一個具體例中,本發明提供一種在個體中引起針對Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之免疫反應增強的方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因,且其中投予該放射療法包含至少兩次投予該放射療法。
在另一個具體例中,本發明提供一種延長罹患Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之個體之存活期的方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因,且其中投予該放射療法包含至少兩次投予該放射療法。
在另一個具體例中,本發明提供一種在罹患Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之個體中延遲轉移性疾病之方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因,且其中投予該放射療法包含至少兩次投予該放射
療法。
在另一個具體例中,本發明提供一種在罹患Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之個體中破壞對Her-2/neu之耐受性的方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外佐劑融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因,且其中投予該放射療法包含至少兩次投予該放射療法。
在一個具體例中,個體為人類。在一個具體例中,人類個體為兒童。在另一個具體例中,人類個體為成人。在另一個具體例中,個體為犬類動物。
在另一個具體例中,向該個體投予該融合多肽在該腫瘤內預防逃逸突變。
在另一個具體例中,該Her-2/neu嵌合抗原包含至少5、9、13、14或17個定位之人類MHC-I類抗原決定基。在另一個具體例中,該Her-2/neu嵌合抗原包含至少5、9、13、14或17個犬類MHC-I類抗原決定基。
在一個具體例中,將核酸分子整合至李斯特菌屬基因組中。在另一個具體例中,核酸分子處於該重組李斯特菌屬疫苗菌株中之質體內,且該質體在缺乏抗生素選擇下穩定維持於該重組李斯特菌屬疫苗菌株內。
在一個具體例中,重組李斯特菌屬缺乏actA致病性基因。在一個具體例中,額外多肽係選自由以下各者組成之群:a)
非溶血性LLO蛋白質或N端片段、b)PEST序列或c)ActA片段。在一個具體例中,由該第二開讀框編碼之代謝酶為丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶。在一些本發明之具體例中,重組減毒李斯特菌屬菌株為ADXS31-164。
在一個具體例中,重組減毒李斯特菌屬菌株與獨立佐劑一起投予,在一個具體例中,該佐劑包含顆粒球/巨噬細胞群落刺激因數(GM-CSF)蛋白質、編碼GM-CSF蛋白質之核苷酸分子、皂素QS21、單磷醯基脂質A或含有未甲基化CpG之寡核苷酸。
在一個具體例中,癌症為骨肉瘤(OSA)。在另一個具體例中,癌症或腫瘤為肺部轉移性疾病。在一個具體例中,投予包含至少兩次投予該重組減毒李斯特菌屬。。在一個具體例中,投予該放射療法包含至少兩次投予該放射療法。在一個具體例中,本文提供一種組合療法,其包含放射療法及投予本文提供之ADXS31-164。在一個具體例中,在投予重組減毒李斯特菌屬菌株之前投予放射療法。
在另一個具體例中,在投予該放射療法及該重組減毒李斯特菌屬菌株之前,個體未經歷切除術。在另一個具體例中,該方法進一步包含在該個體中復發或癌轉移後投予該放射療法及該重組減毒李斯特菌屬菌株,在一個具體例中,該復發或癌轉移為肺部轉移性疾病。
在一個具體例中,該方法引起該個體之整體存活率增加。在另一個具體例中,該方法在個體中引起轉移性疾病延遲。在另一個具體例中,該方法引起Her-2/neu特異性T細胞反應增加。在另一個具體例中,該引起免疫反應增強引起該個體之整體存活率
增加。在另一個具體例中,該引起免疫反應增強引起個體中轉移性疾病延遲。在一個具體例中,轉移性疾病為肺部轉移性疾病。在另一個具體例中,該引起免疫反應增強引起Her-2/neu特異性T細胞反應增加。
特別指出視為本發明之主題且在本說明書之結論部分處清楚地主張。然而,關於操作之組織及方法以及其對象、特徵及優點兩方面,本發明可藉由在與隨附圖式一起閱讀時參考以下實施方式來最佳瞭解,在此等隨附圖式中:圖1顯示ADXS31-164之構築。(A)pAdv164之質體圖譜,其在組成性李斯特菌屬p60啟動子控制下具有枯草芽孢桿菌(bacillus subtilis)dal基因以補充LmddA菌株中之染色體dal-dat缺失。其亦含有截短LLO(1-441)與嵌合人類HER2/neu基因之融合物,該融合物藉由直接融合HER2/neu之3個片段來構築:EC1(aa 40-170)、EC2(aa 359-518)及ICI(aa 679-808)。右側載體示意圖顯示表現嵌合HER2/neu融合蛋白之pAdv164細節,該融合蛋白由與截短LLO融合之人類HER2/neu的2個細胞外結構域及一個細胞內結構域組成。質體藉助于dal基因之營養缺陷型補充而維持在重組dal/dat/actA-李斯特菌屬菌株(LmddA)內(參見實施例)。(B)藉由對用抗-LLO抗體點樣的TCA沈澱之細胞培養物上清液進行西方墨點分析,在Lm-LLO-ChHer2(Lm-LLO-138)及LmddA-LLO-ChHer2(ADXS31-164)中偵測tLLO-ChHer2之表現及分泌。約104KD之差別條帶對應於tLLO-ChHer2。偵測到內源性LLO為58KD條帶。李斯特菌屬對照組缺乏ChHer2表現。
圖2顯示ADXS31-164之免疫原性特性。(A)使用NT-2細胞作為刺激劑及3T3/neu細胞作為目標,測試來自經免疫接種小鼠的脾細胞中藉由HER2/neu基於李斯特菌屬之疫苗引起的細胞毒性T細胞反應。Lm對照基於LmddA背景,該背景在各方面均相同,但表現不相關抗原(HPV16-E7)。(B)在使用絲裂黴素C處理之NT-2細胞活體外刺激24小時後,藉由ELISA量測來自經免疫接種FVB/N小鼠之脾細胞向細胞培養基中分泌的IFN-。(C)來自用嵌合疫苗免疫接種之HLA-A2轉殖基因小鼠之脾細胞回應於與來自蛋白質不同區域的肽一起活體外培育的IFN-分泌。如圖例中所列,重組ChHer2蛋白質用作陽性對照且不相關之肽或無肽組構成陰性對照。藉由ELISA分析法使用共同培育72小時後採集之細胞培養物上清液偵測IFN-γγ分泌。各資料點為三份資料之平均值+/-標準誤差。*P值<0.001。
圖3顯示 李斯特菌屬-ChHER2/neu疫苗之腫瘤預防研究。將HER2/neu轉殖基因小鼠用各重組李斯特菌屬-ChHer2或對照李斯特菌屬疫苗注射六次。在6週齡開始免疫接種且每3週繼續直至第21週。每週監測腫瘤外觀且表示為無腫瘤小鼠之百分比。*p<0.05,每組N=9。
圖4顯示ADXS31-164免疫接種對脾臟中Tregs%之作用。FVB/N小鼠用1×106個NT-2細胞皮下接種且以1週時間間隔用各疫苗免疫接種三次。第二次免疫接種後7天採集脾臟。分離免疫細胞之後,經染色用於藉抗CD3、CD4、CD25、及FoxP3抗體Tregs偵測。代表性實驗之Tregs的點陣圖顯示CD25+/FoxP3+T
細胞之頻率,表示為不同處理組的總CD3+或CD3+CD4+T細胞之百分比。
圖5顯示ADXS31-164免疫接種對NT-2腫瘤中腫瘤浸潤性Tregs%之作用。FVB/N小鼠用1×106個NT-2細胞皮下接種且以1週時間間隔用各疫苗免疫接種三次。第二次免疫接種後7天採集腫瘤。分離免疫細胞後,將其染色以藉由抗CD3、CD4、CD25及FoxP3抗體偵測Tregs。(A)代表性實驗之Tregs的點陣圖。(B)CD25+/FoxP3+T細胞之頻率,表示為不同處理組的總CD3+或CD3+CD4+T細胞的百分比(左圖)及瘤內CD8/Tregs比率(右圖)。資料顯示為獲自2個獨立實驗之平均值±SEM。
圖6顯示用ADXS31-164接種疫苗可延遲乳癌細胞株在大腦中之生長。Balb/c小鼠用ADXS31-164或對照李斯特菌屬疫苗免疫接種三次。EMT6-Luc細胞(5,000)顱內注射在麻醉小鼠中。(A)使用Xenogen X-100 CCD相機在指示天數進行小鼠之離體成像。(B)圖元強度作為每秒每平方公分表面積的光子數目繪圖;此顯示為平均輻射率。(C)藉由西方墨點法,使用抗-HER2/neu抗體偵測EMT6-Luc細胞、4T1-Luc及NT-2細胞株的HER2/neu表現。J774.A2細胞為鼠類巨噬細胞樣細胞株,將其用作陰性對照。
圖7顯示在切除術及化學療法後用ADXS31-164疫苗接種之前18個犬類骨肉瘤患者。
圖8顯示ADXS31-164投予不引起A)擴張型心肌症之早期跡象。B)歷經研究時程評估之連續心臟肌鈣蛋白I水準顯示該等水準在整個研究時段中對大部分犬保持在正常範圍內。應注意,
心臟肌鈣蛋白I水準暫時增加之一隻犬在此等值輕度增加時具有不明顯心動回聲圖(亦參見圖26D)。
圖9顯示A)體溫及B)收縮血壓中之ADXS31-164相關變化。在基線時及ADXS31-164投予後每2小時記錄體溫及收縮血壓。顯示各犬在各疫苗接種情況下之參數。水準條形表示在各劑量組中在各時間點時所有犬之中值。★p<0.05,★★p<0.005
圖10顯示在未進行切除術及化學療法的原發性附肢骨肉瘤之情形下組合ADXS31-164及姑息性放射療法(RT)之治療時程
圖11上圖:顯示與骨肉瘤相關聯之肱骨近端骨折之存在的放射照片及在使用兩個接骨板及一個髓內銷釘進行骨折固定之後取得的彼等放射照片。下圖:胸部CT掃描,其顯示在入選時無轉移性疾病證據。亦在基線時及在8次ADXS31-164投予之後取得放射照片。此等放射照片顯示無肺部轉移性疾病證據且骨折位點周圍存在骨痂,指示儘管存在骨肉瘤,但骨折癒合。
圖12顯示試點I期臨床試驗之時刻表,該試驗用以評估重組表現ADXS31-164之單核球增多性李斯特菌在經歷肢體切除術及後續化學療法的患有附肢骨肉瘤之犬中引起治療學上有效之抗腫瘤免疫性的安全性及功效。
圖13A-B顯示在ADXS-31-164投予後之治療相關不良事件及存活率曲線。圖13A顯示治療相關不良事件。圖13B顯示所有在試驗入選時無轉移性疾病之犬。對照組中之犬經歷肢體切除術,繼而經歷單獨卡鉑或卡鉑加阿德力黴素(Adriamycin)。已自
疫苗組刪去2隻犬,因為其死於不相關原因(1隻犬死於吸入性肺炎,另一隻死於腎母細胞瘤)。疫苗接種組紅線;對照組黑線。
圖14顯示人類(A)及犬類(B)患者中之原發性及轉移性骨肉瘤(OSA)的放射照相影像。在兩個物種中,原發性病變藉由骨骼幹骺端(A中箭頭)中增生及溶解之區域來表徵。
圖15顯示I期3+3臨床試驗之示意圖,該試驗用以評估ADXS31-164在患有HER2+骨肉瘤(OSA)之犬中的安全性及功效。患有自發性HER2+附肢OSA之私有犬經歷醫療標準之切除術及後續卡鉑化學療法。在最後卡鉑給藥之後3週時,用2×108、5×108、1×109或3.3×109CFU之ADXS31-164對犬進行靜脈內疫苗接種(間隔3週給予三次疫苗接種)。每2個月對犬進行再分級,直至死亡為止,以確定疫苗在預防轉移性疾病中之功效。
圖16顯示犬類原發性骨肉瘤中之HER2/neu表現。(A)來自顯示惡性骨母細胞及骨樣沉積巢之犬的原發性OSA之H&E染色(B)在惡性骨母細胞內顯示HER2/neu表現之犬類原發性OSA的免疫組織化學評估(C)來自5隻顯示可變HER2/neu表現之私有犬的原發性OSA樣品之西方墨點法。陽性對照為:MCF-7人類乳房癌細胞株及CAMAC2犬類乳房癌細胞株。
圖17顯示在基線(前)時及在ADXS31-164投予之後的24小時(後)之血液學值。對來自各劑量組內所有犬在各疫苗接種情況下之前及後值進行平均。★p<0.05,★★p<0.005。顯示白血球及嗜中性白血球計數(A-B)之短暫但統計學上顯著之增加,其在ADXS31-164投予之後的24小時發生且伴隨有血小板及淋巴球(C-D)之短暫減少。
圖18顯示ADXS31-164誘導與存活率相關之白血球(WBC)、嗜中性白血球及單核球計數的增加。在基線時及在疫苗接種之後的24小時量測WBC、嗜中性白血球及單核球計數。在各疫苗接種後計算增加百分比,且對各犬進行平均。(A)根據存活率(死亡或存活)顯示結果。(B)根據所接受之ADXS31-164劑量顯示結果。水準條形表示組之中值。
圖19顯示藉由IFN-γ ELISpot評估由ADXS31-164誘導之Her-2特異性T細胞反應的結果。
圖20顯示重複「加強劑」疫苗接種刺激Her-2特異性免疫性。(A)顯示患者289-003之結果。(B)顯示患者289-004之結果。EC1、EC2及IC1表示HER2/neu多肽之肽片段。
圖21顯示對(A)出現癌轉移之時間(Time To Metastasis;TTM)及(B)OSA特異性存活期的卡普蘭邁耶估算值(Kaplan Meier estimates)。
圖22顯示ADXS31-164預防轉移性疾病發展。(A及B)在卡鉑療法(A)之後3週時及在第三ADXS31-164疫苗(B)之後3週時取得的胸科放射照片,其顯示在右顱肺葉中預先存在之轉移性結節的大小增加但缺乏在剩餘肺葉中之進一步轉移性疾病發展。(C及D)在胸腔鏡檢查中鑒別之肺部結節,其在投予ICG後在近紅外光下發螢光(C)。在轉移灶切除術時移除的看上去大體正常之肺部組織在近紅外光下顯示螢光(插圖)(D)。(E及F)(E)肺部結節及(F)螢光上正常之肺部組織的H&E染色組織病理學,其顯示囊封肺部結節之顯著出血及壞死(E)以及看上去大體正常之肺部組織中的炎症病灶性區域(F)。(G及H)在低(G)及高(H)放大率下的肺部結節之
免疫組織化學,其顯示肺部結節周圍之CD3+ T細胞,其中贅生性組織內CD3+ T細胞最少。(I及J)在低(I)及高(J)放大率下的看上去正常之肺部組織的免疫組織化學,其顯示CD3+ T細胞之病灶性累積。(K)病灶性肺炎之高放大率H&E染色,其顯示具有由淋巴球包圍之有絲分裂圖(mitotic figure)的大異常細胞。(L)肺炎區之波形蛋白染色,其顯示具有由單核細胞包圍之明顯有絲分裂圖的大波形蛋白陽性細胞。
圖23顯示ADXS31-164在患有自發性HER2+骨肉瘤之犬中延遲/預防轉移性疾病且延長整體存活期。顯示經疫苗接種之犬與歷史對照組相比較的卡普蘭-邁耶存活率曲線。對照組由用切除術及後續化學療法治療但未接受ADXS31-164的患有HER2+附肢OSA之犬組成。P<0.0001。疫苗接種組紅線;對照組黑線。
圖24顯示ADXS31-164破壞對HER2/neu之耐受性。在基線時、在第3疫苗之後3週時(9週)及再2個月後(17週)收集PBMC,且藉由IFN-γ ELISpot分析對HER2/neu之高保守性IC1結構域的反應。所呈現之結果將分成較早反應者、較晚反應者及明顯非反應者。NA指示,尚未評估此等犬之第17週樣品。
圖25A-D顯示ADXS31-164不會不利地影響心臟功能。在基線時、疫苗接種時間時及此後每2個月評估各犬之心臟參數LVID(心臟舒張)(圖25A)、LVID(心臟收縮)(圖25B)及縮短分數(fractional shortening)(圖25C)。同時評估心臟肌鈣蛋白I水準(圖25D)。
圖26顯示ADXS31-164破壞對HER2/neu之高保守性細胞內結構域的免疫耐受性。
圖27A-D顯示與ADXS31-164療法結合之放射療法在個體386-002(圖27A)、個體385-005(圖27B)、個體386-003(圖27C)及個體386-007(圖27D)中延遲原發性骨肉瘤(OSA)進展。
圖28A-C顯示在具有干擾一般活動之疼痛的個體(圖28A)中、在具有干擾行走能力之疼痛的個體(圖28B)中及在具有干擾生活樂趣之疼痛的個體(圖28C)中疼痛調查表之結果。
圖29A-D顯示與ADXS31-164療法結合之姑息性放射療法減少溶解,促進腫瘤實性化(tumor consolidation)且延長個體存活期(圖29A-D)。脛骨遠端骨肉瘤病灶之側向(圖29A)及AP(圖29C)放射照相視圖,其在16Gy放射(在9.13.2014起始在連續2天以8Gy形式給予)及3次劑量之ADXS31-164(11.25.2014)後展現顯著皮質骨重構及溶解減少。橈骨遠端骨肉瘤病灶之側向(圖29B)及AP(圖29D)放射照相視圖,其用16Gy放射(在7.16.2014起始在連續2天以8Gy形式給予)及3次劑量之ADXS31-164(10.13.2014)治療。注意橈骨遠端部分內之膨脹及骨溶解顯著減少(在圖29B中比較日期為10.13.2014與7.16.2014之放射照片)。在遠端脛骨之內側方向上存在骨密度增加(在圖29D中比較日期為10.13.2014與7.16.2014之放射照片)。在圖29D中10.13.2014放射照片上發現存在橈骨遠端內側方向上較小的最低限度移位之骨折。
圖30A-B顯示與ADXS31-164結合之放射療法延長患有骨肉瘤(OSA)之犬的存活期。
應瞭解,為說明之簡單及清晰起見,圖式中所示之元件未必按比例繪製。舉例而言,為清楚起見,可相對於其他元件放
大一些元件之尺寸。另外,在認為適當時,可在圖中重複參考編號以指示對應或類似元件。
在以下實施方式中,闡述許多具體細節以便提供對本發明之透徹瞭解。然而,熟習此項技術者應瞭解,本發明可在無此等特定細節下實踐。在其他情況下,未詳細描述熟知方法、程式及組件,以免混淆本發明。
在一個具體例中,本發明提供一種治療個體之腫瘤生長或癌症之方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之腫瘤特異性抗原。
在一個具體例中,本發明提供一種在個體中預防腫瘤生長或癌症之方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之腫瘤特異性抗原。
在一個具體例中,本發明提供一種在個體中引起針對腫瘤生長或癌症之免疫反應增強的方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之腫瘤特異性抗原。
在一個具體例中,本發明提供一種延長罹患腫瘤生長或癌症之個體之存活期的方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之腫瘤特異
性抗原。
在一個具體例中,本發明提供一種在罹患腫瘤生長或癌症之個體中延遲轉移性疾病之方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之腫瘤特異性抗原。
在一個具體例中,本發明提供一種在罹患表現腫瘤特異性抗原之腫瘤生長或癌症的個體中破壞對該腫瘤特異性抗原之耐受性的方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之腫瘤特異性抗原。
在一個具體例中,腫瘤特異性抗原為Her-2/neu。
在一個具體例中,本發明提供一種治療個體之Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原。
在一個具體例中,本發明提供一種在個體中預防Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原。
在另一個具體例中,本發明提供一種在個體中引起針對Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之免疫反應增強的方法,該方
法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原。
在另一個具體例中,本發明提供一種延長罹患Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之個體之存活期的方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原。
在另一個具體例中,本發明提供一種在罹患Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之個體中延遲轉移性疾病之方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原。
在另一個具體例中,本發明提供一種在罹患Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之個體中破壞對Her-2/neu之耐受性的方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外佐劑融合之Her-2/neu嵌合抗原。
在一個具體例中,重組減毒李斯特菌屬菌株進一步包含編碼代謝酶之第二開讀框,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因。
在一個具體例中,本發明提供一種治療個體之Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編
碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因。
在一個具體例中,本發明提供一種在個體中預防Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因。
在另一個具體例中,本發明提供一種在個體中引起針對Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之免疫反應增強的方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因。
在另一個具體例中,本發明提供一種延長罹患Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之個體之存活期的方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經
突變的內源性基因。
在另一個具體例中,本發明提供一種在罹患Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之個體中延遲轉移性疾病之方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因。
在另一個具體例中,本發明提供一種在罹患Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之個體中破壞對Her-2/neu之耐受性的方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外佐劑融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因。
在一個具體例中,投予該放射療法包含至少兩次投予該放射療法。
在一個具體例中,本發明提供一種治療個體之Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因,且其中投予該放射療法包含至少兩次投予該放射療法。
在另一個具體例中,本發明提供一種在個體中引起針對Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之免疫反應增強的方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因,且其中投予該放射療法包含至少兩次投予該放射療法。
在另一個具體例中,本發明提供一種延長罹患Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之個體之存活期的方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因,且其中投予該放射療法包含至少兩次投予該放射療法。
在另一個具體例中,本發明提供一種在罹患Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之個體中延遲轉移性疾病之方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因,且其中投予該放射療法包含至少兩次投予該放射療法。
在另一個具體例中,本發明提供一種在罹患Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之個體中破壞對Her-2/neu之耐受性的方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外佐劑融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因,且其中投予該放射療法包含至少兩次投予該放射療法。
在一個具體例中,個體為人類。在一個具體例中,人類個體為兒童。在另一個具體例中,人類個體為成人。
在一個具體例中,本發明提供一種在人類個體中治療Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因。
在一個具體例中,本發明提供一種在人類個體中預防Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因。
在另一個具體例中,本發明提供一種在人類個體中引起針對Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之免疫反應增強的方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因。
在另一個具體例中,本發明提供一種延長罹患Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之人類個體之存活期的方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因。
在另一個具體例中,本發明提供一種在罹患Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之人類個體中延遲轉移性疾病之方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因。
在另一個具體例中,本發明提供一種在罹患Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之人類個體中破壞對Her-2/neu之耐受性的方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合
的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外佐劑融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因。
在另一個具體例中,個體為犬類動物。在一個具體例中,犬類動物為犬。
在一個具體例中,本發明提供一種在犬類個體中治療Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因。
在一個具體例中,本發明提供一種在犬類個體中預防Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因。
在另一個具體例中,本發明提供一種在犬類個體中引起針對Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之免疫反應增強的方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之
第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因。
在另一個具體例中,本發明提供一種延長罹患Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之犬類個體之存活期的方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因。
在另一個具體例中,本發明提供一種在罹患Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之犬類個體中延遲轉移性疾病之方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因。
在另一個具體例中,本發明提供一種在罹患Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之犬類個體中破壞對Her-2/neu之耐受性的方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外佐劑融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因。
在一個具體例中,本發明提供一種在個體中延遲轉移性疾病或治療轉移性疾病之方法。在一個具體例中,轉移性疾病為肺部轉移性疾病。
因此,在一個具體例中,本發明提供一種在罹患腫瘤生長或癌症之個體中延遲肺部轉移性疾病之方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之腫瘤特異性抗原。
在另一個具體例中,本發明提供一種在罹患腫瘤生長或癌症之個體中治療肺部轉移性疾病之方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之腫瘤特異性抗原。
在一個具體例中,本文提供用於預防、治療、延長存活期、延遲轉移性疾病、破壞對Her-2/neu之耐受性、針對Her2-neu抗原表現性腫瘤進行疫苗接種、誘導免疫反應、引起針對Her2-neu抗原之亞優勢抗原決定基之免疫反應增強,同時避開突變避免(mutation avoidance)的方法。在另一個具體例中,向個體投予本發明之融合多肽在該腫瘤內預防逃逸突變。在另一個具體例中,避開突變避免歸因於抗原決定基擴散。在又另一個具體例中,突變避免歸因於抗原之嵌合性質。
在另一個具體例中,本文提供一種用於所主張之方法中的免疫原性組成物,該組成物包含融合多肽,其中該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原,且其中向患有Her-2/neu
表現性腫瘤之個體投予融合蛋白在該腫瘤內預防逃逸突變。在另一個具體例中,本文提供一種用於所主張之方法中的重組李斯特菌屬疫苗菌株,該菌株包含免疫原性組成物。
在一個具體例中,重組減毒李斯特菌屬菌株為疫苗菌株。在一個具體例中,本文所提及核酸為核酸分子。
在一個具體例中,用於本發明之方法中的重組減毒李斯特菌屬菌株進一步包含有包含編碼代謝酶之第三開讀框的核酸分子,且其中該代謝酶補充於該重組李斯特菌屬菌株之染色體中為經突變的內源性基因其。
在另一個具體例中,本文提供一種重組減毒李斯特菌屬菌株,其包含核酸分子,其中該核酸分子包含編碼多肽之第一開讀框,其中該多肽包含Her-2/neu嵌合抗原,其中該核酸分子進一步包含各自編碼代謝酶之第二及第三開讀框,且其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因。
在一個具體例中,將核酸分子整合至李斯特菌屬基因組中。在另一個具體例中,核酸處於重組李斯特菌屬疫苗菌株中之質體內。在又另一個具體例中,質體在缺乏抗生素選擇下穩定維持於重組李斯特菌屬疫苗菌株內。在另一個具體例中,質體不賦予重組李斯特菌屬以抗生素抗藥性。在另一個具體例中,重組李斯特菌屬菌株經減毒。在另一個具體例中,重組李斯特菌屬為減毒之營養缺陷型菌株。在另一個具體例中,外來抗原之表現施加于細菌(諸如本發明中之一者)上的高代謝負擔亦為重要減毒機制。
在一個具體例中,減毒菌株為LmddA。在另一個具體例中,此菌株發揮強輔助作用,此為基於李斯特菌屬之疫苗的固有
特性。此輔助作用之一個表現為由表現除人類嵌合Her-2/neu外之抗原之李斯特菌屬或ADXS-31-164(表現人類嵌合Her-2/neu)疫苗引起的瘤內Tregs之數目減少5倍(參見本文圖5)。在另一個具體例中,表現不同抗原(HPV16E7)之LmddA載體亦與腫瘤中Tregs之頻率顯著減少相關聯,很可能係由於固有免疫性反應。在另一個具體例中,LmddA載體表現前列腺特異性抗原(PSA),人類乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原(E6、E7)。在另一個具體例中,HPV菌株為HPV16、HPV18或此項技術中已知之任何菌株。
在一個具體例中,減毒之營養缺陷型李斯特菌屬疫苗菌株為ADXS-31-164菌株。ADXS-31-164係基於由於缺失致病性基因actA而減毒之李斯特菌屬疫苗載體,且活體內及活體外藉由補充dal基因而保留用於Her-2/neu表現之質體。在一個具體例中,ADXS31-164表現及分泌與李斯特菌溶胞素O(LLO)之前441個胺基酸融合的嵌合Her-2/neu蛋白。在另一個具體例中,ADXS31-164因能夠破壞轉殖基因動物中對HER2/neu之耐受性而發揮強及抗原特異性抗腫瘤反應(參見實施例)。在另一個具體例中,ADXS31-164高度減毒且具有比先前李斯特菌屬疫苗世代更佳之安全型態,因為其自經免疫接種之小鼠之脾臟更快速清除。在另一個具體例中,ADXS31-164引起轉殖基因動物中腫瘤發作之延遲比Lm-LLO-ChHer2更長,為此疫苗具有抗生素抗性且更具致病性之型式(參見圖3)。在一個具體例中,Lm-LLO-ChHer2菌株為Lm-LLO-138。
在另一個具體例中,ADXS31-164菌株具有高度免疫原性,能夠破壞對Her-2/neu自體抗原之耐受性且在Her-2/neu轉殖
基因動物中防止腫瘤形成。在另一個具體例中,ADXS31-164引起腫瘤內T調節性細胞(Tregs)顯著減少。在另一個具體例中,用LmddA疫苗處理之腫瘤中更低頻率之Tregs導致瘤內CD8/Tregs比率增加,表明在用LmddA疫苗免疫接種之後可獲得更有利之腫瘤微環境。在另一個具體例中,使用此嵌合抗原不引起逃逸突變,指示腫瘤不突變為缺乏對用此新穎抗原處理之治療有效反應(參見實施例6)。在另一個具體例中,用ADXS31-164周邊免疫接種延遲轉移性乳癌細胞株在腦中之生長(參見實施例7)。
在另一個具體例中,與未接受用ADXS31-164疫苗接種之對照個體相比較,罹患骨肉瘤且得到治療(包括切除術、化學療法及用ADXS31-164疫苗接種)之犬類個體具有延長之存活期(參見實施例9及10)。在另一個具體例中,與未接受用ADXS31-164疫苗接種之對照個體相比較,罹患骨肉瘤且得到治療(包括切除術、化學療法及用ADXS31-164疫苗接種)之犬類個體顯示癌轉移減少(參見實施例10)。在另一個具體例中,與未接受用ADXS31-164疫苗接種之對照個體相比較,罹患骨肉瘤且得到治療(包括切除術、化學療法及用ADXS31-164疫苗接種)之犬類個體顯示所誘導之特異性T細胞反應增加(參見實施例10)。在另一個具體例中,與僅接受放射療法或僅接受用ADXS31-164疫苗接種之對照個體相比較,罹患骨肉瘤且在用ADXS31-164疫苗接種之前得到放射療法之犬類個體具有延長之存活期(參見實施例11)。在另一個具體例中,與僅接受放射療法或僅接受用ADXS31-164疫苗接種之對照個體相比較,罹患骨肉瘤且在用ADXS31-164疫苗接種之前得到放射療法之犬類個體顯示癌轉移減少(參見實施例11)。
在另一個具體例中,術語「ADXS31-164」、「Lm-人類嵌合Her-2/neu」、「Lm-huHer2-neu」及「Lm-hucHer-2/neu」在本文中可互換地使用。
在一個具體例中,骨肉瘤細胞不容易藉由放射殺死,因此放射療法很少用於治療骨肉瘤。在一個具體例中,重組減毒之無抗生素李斯特菌屬表現性嵌合抗原適用於預防及治療如本文中所例示之癌症或實體腫瘤。在另一個具體例中,腫瘤為Her-2/neu陽性腫瘤。在另一個具體例中,癌症為Her-2/neu表現性癌症。在另一個具體例中,癌症為乳癌、中樞神經系統(CNS)癌、頭頸癌、骨肉瘤(OSA)、犬類骨肉瘤(OSA)、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma;ES)或此項技術中已知之任何Her-2/neu表現性癌症。在另一個具體例中,犬類骨肉瘤為附肢骨肉瘤。在另一個具體例中,腫瘤為骨肉瘤腫瘤、乳房腫瘤、頭頸腫瘤、或此項技術中已知之任何其它抗原表現性腫瘤。在另一個具體例中,癌症為或實體腫瘤為復發疾病或轉移性疾病的結果。在一個具體例中,轉移性疾病為肺部轉移性疾病。
在一個具體例中,本發明提供治療、預防或延遲癌轉移之方法。在一個具體例中,本發明提供治療、預防或延遲OSA之癌轉移的方法。在一個具體例中,癌轉移在肺中。在另一個具體例中,癌轉移在另一個組織中。在另一個具體例中,癌轉移在骨骼中,其在一個具體例中位於初始OSA位點之近端且在另一個具體例中位於初始OSA位點之遠端。在另一個具體例中,癌轉移在腎臟中。在另一個具體例中,癌轉移在心臟中。在另一個具體例中,癌轉移為分開的。在另一個具體例中,癌轉移為分開的局部復發。
在另一個具體例中,癌轉移為多位點癌轉移。
在另一個具體例中,表現嵌合Her-2/neu之重組李斯特菌屬適用作用於治療Her-2/neu過度表現性實體腫瘤之治療疫苗。在另一個具體例中,本文提供之Her-2/neu嵌合抗原適用於治療Her-2/neu表現性腫瘤及預防其逃逸突變。在另一個具體例中,術語「逃逸突變」係指突變為缺乏對治療之治療有效反應的腫瘤。
在一個具體例中,本文提供包含編碼本文提供之重組多肽之第一開讀框的核酸分子,其中該核酸分子殘基處於重組李斯特菌屬疫苗菌株內。在另一個具體例中,本文提供之核酸分子用於使李斯特菌屬轉型以獲得重組李斯特菌屬。在另一個具體例中,本文提供之核酸缺乏致病性基因。在另一個具體例中,整合至李斯特菌屬基因組中之核酸分子攜帶非功能性致病性基因。在另一個具體例中,致病性基因於重組李斯特菌屬中經突變。在另一個具體例中,核酸分子用於不活化李斯特菌屬基因組中存在的內源性基因。在又另一個具體例中,致病性基因為actA基因。在另一個具體例中,致病性基因為prfA基因。在另一個具體例中,致病性基因為inlB基因。熟練技術人員應理解,致病性基因可為此項技術中已知與重組李斯特菌屬中之致病性相關聯的任何基因。
在一個具體例中,李斯特菌屬菌株之染色體中缺乏代謝基因、致病性基因或其兩者。在另一個具體例中,李斯特菌屬菌株之染色體及任何游離型基因元件中缺乏代謝基因、致病性基因或其兩者。熟練技術人員應瞭解,術語「游離基因」、「游離型」等係指不整合至本文提供之李斯特菌屬之染色體中的質體載體或其用途。在另一個具體例中,該術語係指整合至本文提供之李斯特菌屬
之染色體中的質體載體。在另一個具體例中,李斯特菌屬菌株之基因組中缺乏代謝基因、致病性基因或其兩者。在一個具體例中,在一個具體例中,染色體中之代謝基因、致病性基因或其兩者經突變。在另一個具體例中,染色體之代謝基因、致病性基因或其兩者缺失。在另一個具體例中,染色體之代謝基因、致病性基因或其兩者被不活化。
在另一個具體例中,本文提供之核酸及質粒不賦予重組李斯特菌屬以抗生素抗性。
在一個具體例中,「核酸分子」係指質體。在另一個具體例中,該術語係指整合載體。在另一個具體例中,該術語係指非整合載體。在另一個具體例中,該術語係指包含整合載體的質體。在另一個具體例中,整合載體為位點特異性整合載體。在另一個具體例中,本發明之方法及組成物的核酸分子由此項技術中已知的任何類型之核苷酸構成。各可能性代表本發明之各別具體例。
在另一個具體例中,「代謝酶」係指合成宿主細菌所需營養所涉及的酶。在另一個具體例中,該術語係指合成宿主細菌所需營養所需的酶。在另一個具體例中,該術語係指合成宿主細菌所利用營養所涉及的酶。在另一個具體例中,該術語係指合成宿主細菌持續生長所需之營養所涉及的酶。在另一個具體例中,合成營養需要該酶。各可能性代表本發明之各別具體例。
在另一個具體例中,「穩定維持」係指在缺乏選擇(例如抗生素選擇)達10代下維持核酸分子或質體而無可偵測之喪失。在另一個具體例中,週期為15代。在另一個具體例中,週期為20代。在另一個具體例中,週期為25代。在另一個具體例中,週期
為30代。在另一個具體例中,週期為40代。在另一個具體例中,週期為50代。在另一個具體例中,週期為60代。在另一個具體例中,週期為80代。在另一個具體例中,週期為100代。在另一個具體例中,週期為150代。在另一個具體例中,週期為200代。在另一個具體例中,週期為300代。在另一個具體例中,週期為500代。在另一個具體例中,週期超過500代。在另一個具體例中,核酸分子或質體活體外穩定維持(例如在培養物中)。在另一個具體例中,核酸分子或質體活體內穩定維持。在另一個具體例中,核酸分子或質體活體外及活體內皆穩定維特。各可能性代表本發明之各別具體例。
在一個具體例中,本發明提供一種表現抗原之重組李斯特菌屬菌株。本發明亦提供包含與Her-2嵌合蛋白質或其片段融合之李斯特菌溶胞素(LLO)蛋白質片段的重組多肽,包含其之疫苗及免疫原性組成物,及包含其的誘導針對Her-2表現性腫瘤之抗-Her-2免疫反應且針對其進行治療及疫苗接種之方法。
在另一個具體例中,本發明之重組李斯特菌屬菌株已經動物宿主繼代。在另一個具體例中,繼代使菌株作為疫苗載體之功效最大。在另一個具體例中,繼代使李斯特菌屬菌株之免疫原性穩定。在另一個具體例中,繼代使李斯特菌屬菌株之致病性穩定。在另一個具體例中,繼代提高李斯特菌屬菌株之免疫原性。在另一個具體例中,繼代提高李斯特菌屬菌株之致病性。在另一個具體例中,繼代移除李斯特菌屬菌株之不穩定亞菌株。在另一個具體例中,繼代降低李斯特菌屬菌株之不穩定亞菌株的發生率。在另一個具體例中,李斯特菌屬菌株含有編碼含有抗原之重組肽的基因的染色體
組插入。在另一個具體例中,李斯特菌屬菌株攜帶包含編碼含有抗原之重組肽的基因的質體。在另一個具體例中,藉由此項技術中已知的任何其他方法進行繼代。
在一個具體例中,本文提供之多肽為包含選自由以下各者組成之群的額外多肽的融合蛋白:a)非溶血性LLO蛋白質或其N端片段,b)PEST序列或c)ActA片段,且進一步,其中該額外的多肽與Her-2/neu嵌合抗原融合。在另一個具體例中,額外多肽為功能性的。在另一個具體例中,額外多肽之片段為免疫原性的。在另一個具體例中,額外多肽為免疫原性的。
在另一個具體例中,本文提供之多肽為包含與Her-2/neu嵌合抗原融合之非溶血性LLO蛋白質或N端片段的融合蛋白。在另一個具體例中,本發明之方法及組成物的融合蛋白包含來自李斯特菌屬生物體之ActA序列。在一個具體例中,ActA蛋白質及其片段以與LLO類似之方式加強抗原呈遞及免疫性。
在本發明之方法及組成物的一個具體例中,融合蛋白包含Her-2/neu抗原及額外多肽。在另一個具體例中,與Her-2/neu抗原融合之額外多肽稱為額外佐劑多肽。在一個具體例中,額外多肽為非溶血性LLO蛋白質或其片段(本文實施例)。在另一個具體例中,額外多肽為PEST序列。在另一個具體例中,額外多肽為ActA蛋白質或其片段。
在另一個具體例中,本發明之方法及組成物的額外多肽為李斯特菌溶胞素(LLO)肽。在另一個具體例中,額外多肽為ActA肽。在另一個具體例中,額外多肽為PEST序列肽。在另一個具體例中,額外多肽為能夠增強抗原肽之免疫原性的任何其他肽。
各可能性代表本發明之各別具體例。
包含Her-2/neu嵌合抗原之融合蛋白可藉由任何適合之方法製備,包括例如,藉由下文論述之方法的適當序列之選殖及限制或直接化學合成。另外,子序列可經選殖,及使用適當限制酶裂解適當子序列。然後該等片段可經接合來生產期望的DNA序列。在一個具體例中,編碼抗原的DNA可使用DNA擴增法,例如聚合酶連鎖反應(PCR)生產。首先,在新終端任一側上的原生DNA之區段係經分開擴增。一個已擴增序列的5’端編碼肽連接子,而另一個已擴增序列的3’端也編碼肽連接子。因第一片段的5’端係與第二片段的3’端互補,故兩個片段(在部分純化後,例如於LMP瓊脂上部分純化後)可用作為第三PCR反應中的重疊範本。已擴增序列將含有密碼子,在開放位點的羧基側上的區段(現在形成胺基序列),及在開放位點的胺基側上的區段(現在形成羧基序列)。抗原接合入質體內。各方法代表本發明之各別具體例。
本發明之結果展現,投予本發明之組成物具有誘導形成辨識及殺死腫瘤細胞之抗原特異性T細胞(例如細胞毒性T細胞)的效用(本文實施例)。
在一個具體例中,本發明提供一種重組多肽,其包含與Her-2嵌合蛋白質融合或與其片段融合之LLO蛋白質的N端片段。一個具體例中,本發明提供一種重組多肽,其由與Her-2嵌合蛋白質融合或與其片段融合之LLO蛋白質的N端片段組成。
在另一個具體例中,本發明之方法及組成物的Her-2嵌合蛋白質為人類Her-2嵌合蛋白質。在另一個具體例中,Her-2蛋白質為小鼠Her-2嵌合蛋白質。在另一個具體例中,Her-2蛋白
質為大鼠Her-2嵌合蛋白質。在另一個具體例中,Her-2蛋白質為靈長類動物Her-2嵌合蛋白質。在另一個具體例中,Her-2蛋白質為犬類Her-2嵌合蛋白質。在另一個具體例中,Her-2蛋白質為此項技術中已知的人類或任何其他動物物種之Her-2嵌合蛋白質或其組合。各可能性代表本發明之各別具體例。
在另一個具體例中,Her-2蛋白質為稱為「HER-2/neu」、「Erbb2」、「v-erb-b2」、「c-erb-b2」、「neu」或「cNeu」之蛋白質。在另一個具體例中,術語Her2/neu或其文法等效語在本文中亦稱為「Her-2」、「Her-2蛋白質」、「HER2蛋白質」或「HER2」。各可能性代表本發明之各別具體例。
在一個具體例中,Her2-neu嵌合蛋白質具有顯示致癌基因之MHC-I類抗原決定基簇的Her-2/neu抗原之兩個細胞外及一個細胞內片段,其中在另一個具體例中,嵌合蛋白質具有Her-2/neu抗原的3個H2Dq及至少17個定位之人類MHC-I類抗原決定基(片段EC1、EC2及IC1)(參見圖1A)。在另一個具體例中,嵌合蛋白質具有至少13個定位之人類MHC-I類抗原決定基(片段EC2及IC1)。在另一個具體例中,嵌合蛋白質具有至少14個定位之人類MHC-I類抗原決定基(片段EC1及IC1)。在另一個具體例中,嵌合蛋白質具有至少9個定位之人類MHC-I類抗原決定基(片段EC1及IC2)。在另一個具體例中,Her2-neu嵌合蛋白質與非溶血性李斯特菌溶胞素O(LLO)融合。在另一個具體例中,Her2-neu嵌合蛋白質與截短李斯特菌溶胞素O(tLLO)融合。在另一個具體例中,Her2-neu嵌合蛋白質與單核球增多性李斯特菌李斯特菌溶胞素O(LLO)蛋白質之前441個胺基酸融合且由單核球增多性李斯特菌減毒之營養缺陷型
菌株LmddA表現及分泌。在另一個具體例中,融合蛋白tLLO-ChHer2自表現嵌合Her-2/neu抗原/LLO融合蛋白的本文提供之減毒營養缺陷型菌株之表現及分泌與Lm-LLO-ChHer2在TCA沈澱之細胞培養物上清液中活體外生長8小時後相當(參見圖1B)。
在一個具體例中,未處理之動物或用不相關李斯特菌屬疫苗注射之小鼠中未偵測到CTL活性(參見圖2A)。而在另一個具體例中,本文提供之減毒營養缺陷型菌株(ADXS31-164)能夠刺激來自野生型FVB/N小鼠之脾細胞的IFN-γγ分泌(圖2B)。
在另一個具體例中,本文提供之方法及組成物的代謝酶為胺基酸代謝酶,其中在另一個具體例中,該代謝酶為丙胺酸消旋酶。在另一個具體例中,代謝酶為D-胺基酸轉移酶。在另一個具體例中,代謝酶催化用於重組李斯特菌屬菌株中細胞壁合成的胺基酸形成,其中在另一個具體例中,代謝酶為丙胺酸消旋酶。
在另一個具體例中,編碼代謝酶之基因在李斯特菌屬p60啟動子之控制下進行表現。在另一個具體例中,使用inlA(編碼內化蛋白)啟動子。在另一個具體例中,使用hly啟動子。在另一個具體例中,使用ActA啟動子。在另一個具體例中,整合酶基因在任何其他革蘭氏陽性啟動子之控制下進行表現。在另一個具體例中,編碼代謝酶之基因在於李斯特菌屬中起作用之任何其他啟動子的控制下進行表現。熟練技術人員將瞭解,其他啟動子或多順反子表現卡匣可用于驅動基因之表現。各可能性代表本發明之各別具體例。
在另一個具體例中,Her-2嵌合蛋白質由SEQ ID NO:1中所闡述之以下核酸序列編碼:
(SEQ ID NO:1)。
在另一個具體例中,Her-2嵌合蛋白質具有以下序列:
(SEQ ID NO:2)。
以下表1分別顯示人類與犬類Her-2 EC及IC片段之胺基酸序列之間的一致性百分比(%)。
在另一個具體例中,編碼人類Her-2/neu EC1片段之胺基酸序列闡述於(SEQ ID NO:69):
(SEQ ID NO:69)。
在另一個具體例中,編碼犬類Her-2/neu EC1片段之胺基酸序列闡述於(SEQ ID NO;70):
(SEQ ID NO:70)。
在另一個具體例中,編碼人類Her-2/neu EC2片段之胺基酸序列闡述於(SEQ ID NO:71):TAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGS(SEQ ID NO:71)。
在另一個具體例中,編碼犬類Her-2/neu EC2片段之胺基酸序列闡述於(SEQ ID NO:72):TAPLQPEQLRVFEALEEITGYLYISAWPDSLPNLSVFQNLRVIRGRVLHDGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGS(SEQ ID NO:72)。
在另一個具體例中,編碼人類Her-2/neu IC1片段之胺基酸序列闡述於(SEQ ID NO:73):
(SEQ ID NO:73)。
在另一個具體例中,編碼犬類Her-2/neu IC1片段之胺基酸序列闡述於(SEQ ID NO:74):
(SEQ ID NO:74)。
在一個具體例中,人類Her-2 EC1片段之胺基酸序列(SEQ ID NO:69)與犬類Her-2 EC1片段之胺基酸序列(SEQ ID NO:
70)具有89%一致性。在另一個具體例中,人類Her-2 EC2片段之胺基酸序列(SEQ ID NO:71)與犬類Her-2 EC2片段之胺基酸序列72)具有93%一致性。在另一個具體例中,人類Her-2 IC1片段之胺基酸序列(SEQ ID NO:73)與犬類Her-2 IC1片段之胺基酸序列(SEQ ID NO:74)具有98%一致性。
在一個具體例中,本文提供之方法及組成物的Her2嵌合蛋白質或其片段不包括其信號序列。在另一個具體例中,因為信號序列具有高疏水性,所以省略信號序列使Her2片段能夠在李斯特菌中成功地表現。各可能性代表本發明之各別具體例。
在另一個具體例中,本發明之方法及組成物的Her2嵌合蛋白質之片段不包括其跨膜結構域(TM)。在一個具體例中,因為TM具有高疏水性,所以省略TM使Her-2片段能夠在李斯特菌中成功地表現。各可能性代表本發明之各別具體例。
在一個具體例中,大鼠Her-2/neu基因之核酸序列為
(SEQ ID NO:45)。
在一個具體例中,編碼大鼠/Her-2/neu EC1片段之核酸序列為
(SEQ ID NO:46)。
在另一個具體例中,編碼大鼠Her-2/neu EC2片段之核酸序列為:
(SEQ ID NO:47)。
在另一個具體例中,編碼大鼠Her-2/neu IC1片段之核酸序列為:
(SEQ ID NO:48)。
在一個具體例中,人類Her-2/neu基因之核酸序列為:
(SEQ ID NO:49)。
在另一具體例,編碼建構至嵌合體中之人類Her-2/neu EC1片段之核酸序列跨越人類EC1區之120-510bp且闡述於(SEQ ID NO:50)。
(SEQ ID NO:50)。
在一個具體例中,完整EC1人類Her-2/neu片段跨越人類Her-2/neu基因之58-979bp且闡述於(SEQ ID NO:54)。
(SEQ ID NO:54)。
在另一個具體例中,編碼建構至嵌合體中之人類Her-2/neu EC2片段之核酸序列跨越人類Her-2/neu EC2片段之1077-1554bp且包括50bp延伸部分且闡述於(SEQ ID NO:51)。
(SEQ ID NO:51)。
在一個具體例中,完整EC2人類Her-2/neu片段跨越人類Her-2/neu基因之907-1504bp且闡述於(SEQ ID NO:55)。
(SEQ ID NO:55)。
在另一個具體例中,編碼建構至嵌合體中之人類Her-2/neu IC1片段的核酸序列闡述於(SEQ ID NO:52)。
(SEQ ID NO:52)。
在另一個具體例中,編碼完整人類Her-2/neu IC1片段之核酸序列跨越人類Her-2/neu基因之2034-3243且闡述於(SEQ ID NO:56)。
(SEQ ID NO:56)。
在一個具體例中,本文提供之方法及組成物中所用的LLO為李斯特菌屬LLO。在另一個具體例中,LLO來源於之李斯特菌屬為單核球增多性李斯特菌(LM)。在另一個具體例中,李斯特菌屬菌株為依氏李斯特菌(Listeria ivanovii)菌株。在另一個具體例
中,李斯特菌屬菌株為威氏李斯特菌(Listeria welshimeri)菌株。在另一個具體例中,李斯特菌屬菌株為斯氏 李斯特菌(Listeria seeligeri)菌株。在另一個具體例中,LLO蛋白質為非李斯特菌屬LLO蛋白質。在另一個具體例中,LLO蛋白質為合成LLO蛋白質。在另一個具體例中,其為重組LLO蛋白質。
在另一個具體例中,LLO蛋白質由(SEQ ID NO:3)中所闡述之以下核酸序列編碼:
(SEQ ID NO:3)。
在另一個具體例中,LLO蛋白質包含SEQ ID NO:4
(SEQ ID NO:4)。
對應於此序列的前蛋白之前25個胺基酸為信號序列且當由細菌分泌時自LLO裂解。因此,在此具體例中,全長活性LLO蛋白質為504個殘基長。在另一個具體例中,LLO蛋白質具有GenBank寄存編號DQ054588、DQ054589、AY878649、U25452或U25452中所闡述之序列。在另一個具體例中,LLO蛋白質為LLO蛋白質之變異體。在另一個具體例中,LLO蛋白質為LLO蛋白質之同源物。各可能性代表本發明之各別具體例。
在另一個具體例中,「截短LLO」或「tLLO」係指包含PEST結構域之LLO片段。在另一個具體例中,該等術語係指在胺基端不含活化結構域且不包括半胱胺酸484的LLO片段。在另一個具體例中,LLO片段由PEST序列組成。在另一個具體例中,LLO片段包含PEST序列。在另一個具體例中,LLO片段由529個胺基酸之全長LLO蛋白質的約前400至441個胺基酸組成。在另一個具體例中,LLO片段為LLO蛋白質的非溶血性形式。
在本發明之方法及組成物的另一個具體例中,由本發明之方法及組成物之核酸序列編碼的多肽為包含嵌合Her-2/neu抗原及額外多肽之融合蛋白,其中在另一個具體例中,該融合蛋白尤其包含單核球增多性李斯特菌非溶血性LLO蛋白質(本文實施
例)。
在另一個具體例中,LLO片段由約殘基1-25組成。在另一個具體例中,LLO片段由約殘基1-50組成。在另一個具體例中,LLO片段由約殘基1-75組成。在另一個具體例中,LLO片段由約殘基1-100組成。在另一個具體例中,LLO片段由約殘基1-125組成。在另一個具體例中,LLO片段由約殘基1-150組成。在另一個具體例中,LLO片段由約殘基1-175組成。在另一個具體例中,LLO片段由約殘基1-200組成。在另一個具體例中,LLO片段由約殘基1-225組成。在另一個具體例中,LLO片段由約殘基1-250組成。在另一個具體例中,LLO片段由約殘基1-275組成。在另一個具體例中,LLO片段由約殘基1-300組成。在另一個具體例中,LLO片段由約殘基1-325組成。在另一個具體例中,LLO片段由約殘基1-350組成。在另一個具體例中,LLO片段由約殘基1-375組成。在另一個具體例中,LLO片段由約殘基1-400組成。在另一個具體例中,LLO片段由約殘基1-425組成。各可能性代表本發明之各別具體例。
在另一個具體例中,本發明之方法及組成物的融合蛋白包含來自LLO蛋白質或來自另一種生物體(例如原核生物體)之PEST序列。
在另一個具體例中,PEST胺基酸序列具有選自SEQ ID NO:5-9中之序列。在另一個具體例中,PEST序列為來自單核球增多性李斯特菌ActA蛋白質之PEST序列。在另一個具體例中,PEST胺基酸序列為KTEEQPSEVNTGPR(SEQ ID NO:5)、KASVTDTSEGDLDSSMQSADESTPQPLK(SEQ ID NO:6)、
KNEEVNASDFPPPPTDEELR(SEQ ID NO:7)或RGGIPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR(SEQ ID NO:8)。在另一個具體例中,PEST序列來自鏈球菌屬之鏈球菌溶血素O蛋白質。在另一個具體例中,PEST序列來自化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)鏈球菌溶血素O,例如在胺基酸35-51處之KQNTASTETTTTNEQPK(SEQ ID NO:9)。在另一個具體例中,PEST序列來自似等鏈球菌(Streptococcus equisimilis)鏈球菌溶血素O,例如在胺基酸38-54處之KQNTANTETTTTNEQPK(SEQ ID NO:10)。在另一個具體例中,PEST序列為源自原核生物體的另一個PEST胺基酸序列。在另一個具體例中,PEST序列為此項技術中已知之任何其他PEST序列。各可能性代表本發明之各別具體例。
在一個具體例中,抗原與單核球增多性李斯特菌之PEST序列的融合增強抗原之細胞介導及抗腫瘤免疫性。因此,抗原與源自其他原核生物體之其他PEST序列的融合亦將增強抗原免疫原性。其他原核生物體之PEST序列可根據諸如由以下所描述之方法來鑒別:例如對單核球增多性李斯特菌,Rechsteiner and Rogers(1996,Trends Biochem.Sci.21:267-271)。或者,亦可基於此方法鑑別來自其他原核生物體之PEST胺基酸序列。其中預期PEST胺基酸序列之其他原核生物體包括(但不限於)其他李斯特菌屬物種。在另一個具體例中,PEST序列包埋於抗原蛋白質內。因此,在另一個具體例中,「融合」係指抗原蛋白質包含抗原及連接於該抗原之一端或包埋於該抗原內之PEST胺基酸序列兩者。
在另一個具體例中,本文提供一種包含本發明之重組多肽的疫苗。在另一個具體例中,本文提供一種由本發明之重組多
肽組成的疫苗。
在另一個具體例中,本文提供一種編碼本發明之重組多肽的核苷酸分子。在另一個具體例中,本文提供一種包含核苷酸分子之疫苗。
在另一個具體例中,本文提供一種編碼本發明之重組多肽的核苷酸分子。
在另一個具體例中,本文提供一種由本發明之核苷酸分子編碼的重組多肽。
在另一個具體例中,本文提供一種包含本發明之核苷酸分子或重組多肽的疫苗。
在另一個具體例中,本文提供一種包含本發明之核苷酸分子或重組多肽的免疫原性組成物。
在另一個具體例中,本文提供一種包含本發明之核苷酸分子或重組多肽的載體。
在另一個具體例中,本文提供一種包含本發明之核苷酸分子的李斯特菌屬之重組形式。
在另一個具體例中,本文提供一種包含本發明之李斯特菌屬之重組形式的疫苗。
在另一個具體例中,本文提供一種本發明之李斯特菌屬之重組形式的培養物。
在一個具體例中,用於本發明之方法中的疫苗或組成物包含呈如本文所描述之任何形式或處於如本文所描述之任何具體例中的重組單核球增多性李斯特菌。在一個具體例中,用於本發明中之疫苗或組成物由呈如本文所描述之任何形式或處於如本文
所描述之任何具體例中的本發明之重組單核球增多性李斯特菌組成。在另一個具體例中,用於本發明之方法中的疫苗或組成物基本上由呈如本文所描述之任何形式或處於如本文所描述之任何具體例中的本發明之重組單核球增多性李斯特菌組成。在一個具體例中,術語「包含」係指在疫苗或組成物中包括重組單核球增多性李斯特菌,以及包括可能在此項技術中已知之其他疫苗、組成物或治療。在另一個具體例中,術語「基本上由......組成」係指疫苗之功能性組成分為重組單核球增多性李斯特菌,然而可包括該疫苗之其他組成分,該等其他組成分不直接涉及疫苗之治療性作用且可例如係指促進重組單核球增多性李斯特菌之作用(例如穩定化、儲存等)的組成分。在另一個具體例中,術語「組成」係指疫苗含有重組單核球增多性李斯特菌。
在另一個具體例中,本文提供一種在個體中阻礙或延遲來自HER2表現性腫瘤之轉移性疾病起源的方法,其中及在另一個具體例中,該方法包含向該個體投予包含本文所描述之重組李斯特菌屬疫苗菌株之組成物的步驟。
在另一個具體例中,本發明之方法包含投予呈如本文所描述之任何形式或處於如本文所描述之任何具體例中的重組單核球增多性李斯特菌的步驟。在一個具體例中,本發明之方法由投予呈如本文所描述之任何形式或處於如本文所描述之任何具體例中的本發明之重組單核球增多性李斯特菌的步驟組成。在另一個具體例中,本發明之方法基本上由投予呈如本文所描述之任何形式或處於如本文所描述之任何具體例中的本發明之重組單核球增多性李斯特菌的步驟組成。在一個具體例中,術語「包含」係指在方法
中包括投予重組單核球增多性李斯特菌之步驟,以及包括可能在此項技術中已知之其他方法或治療。在另一個具體例中,術語「基本上由......組成」係指方法之功能性組成分為投予重組單核球增多性李斯特菌,然而可包括該等方法之其他步驟,該等其他步驟不直接涉及該等方法之治療性作用且可例如係指促進投予重組單核球增多性李斯特菌之作用(例如穩定化、儲存等)的步驟。在一個具體例中,術語「組成」係指投予重組單核球增多性李斯特菌之方法不具有其他步驟。
在另一個具體例中,本發明之方法及組成物之李斯特菌屬為單核球增多性李斯特菌。在另一個具體例中,李斯特菌屬菌株為依氏李斯特菌(Listeria ivanovii)菌株。在另一個具體例中,李斯特菌屬菌株為威氏李斯特菌(Listeria welshimeri)菌株。在另一個具體例中,李斯特菌屬菌株為斯氏 李斯特菌(Listeria seeligeri)菌株。李斯特菌屬之各類型代表本發明之各別具體例。
在另一個具體例中,本發明之方法及組成物之李斯特菌屬為ADXS31-164菌株。在另一個具體例中,ADXS31-164刺激來自野生型FVB/N小鼠之脾細胞的IFN-γγ分泌。此外,本文所呈現之資料顯示ADXS31-164能夠引起位於標靶抗原之不同結構域的人類抗原決定基之抗-Her-2/neu特異性免疫反應。
在另一個具體例中,本發明提供一種李斯特菌屬之重組形式,其包含編碼Her-2嵌合蛋白質或其片段之核苷酸分子。
在一個具體例中,融合蛋白之兩個分子(LLO、ActA片段或PEST序列及抗原)直接接合。在另一個具體例中,兩個分子由短間隔子肽接合,該間隔子肽由一或多個胺基酸組成。在一個具
體例中,除接合蛋白質或在其間保持一定最小距離或其他空間關係之外,間隔子不具有特定生物活性。在另一個具體例中,選擇間隔子之構成胺基酸以影響分子之某種特性,諸如摺疊、淨電荷或疏水性。在另一個具體例中,蛋白質之兩個分子(LLO片段及抗原)單獨合成或未融合。在另一個具體例中,蛋白質之兩個分子與同一核酸分開合成。在又另一個具體例中,兩個分子與單獨核酸分別地合成。各可能性代表本發明之各別具體例。
在一個具體例中,編碼本文提供之重組多肽的核酸亦編碼信號肽或序列。在另一個具體例中,本發明之方法及組成物的融合蛋白包含來自LLO之LLO信號序列。在一個具體例中,異源性抗原可經由使用信號序列,諸如李斯特菌屬信號序列,例如,溶血素信號序列或actA信號序列來表現。或者,例如,外源基因可在單核球增多性李斯特菌啟動子下游表現而不產生融合蛋白。在另一個具體例中,信號肽為細菌性的(李斯特菌屬的或非李斯特菌屬的)。在一個具體例中,信號肽為細菌原生。在另一個具體例中,信號肽非細菌原有。在另一個具體例中,信號肽為來自單核球增多性李斯特菌之信號肽,諸如secA1信號肽。在另一個具體例中,信號肽為來自雷特氏乳球菌(Lactococcus lactis)之Usp45信號肽或來自炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)之保護性抗原信號肽。在另一個具體例中,信號肽為secA2信號肽,注入來自單核球增多性李斯特菌之p60信號肽。另外,重組核酸分子視情況包含編碼p60之第三聚核苷酸序列或其片段。在另一個具體例中,信號肽為Tat信號肽,諸如枯草桿菌Tat信號肽(例如PhoD)。在一個具體例中,信號肽在編碼重組多肽之相同轉譯閱讀框架中。
在另一個具體例中,本文提供一種在個體中誘導抗-Her-2免疫反應之方法,其包含向該個體投予編碼重組多肽之重組核苷酸,該重組多肽包含與Her-2嵌合蛋白質融合或與其片段融合之LLO蛋白質的N端片段,藉此在個體中誘導抗-Her-2免疫反應。
在一個具體例中,本文提供一種在個體中引起針對Her-2/neu表現性腫瘤之免疫反應增強的方法,其中在另一個具體例中,該方法包含向該個體投予包含本文提供之重組李斯特菌屬疫苗菌株之組成物。在另一個具體例中,針對Her-2表現性腫瘤之免疫反應包含針對Her-2蛋白質之亞優勢(subdominant)抗原決定基的免疫反應。在另一個具體例中,針對Her-2表現性腫瘤之免疫反應包含針對Her-2蛋白質之若干亞優勢抗原決定基的免疫反應。在另一個具體例中,針對Her-2表現性腫瘤之免疫反應包含針對Her-2蛋白質之至少1-5個亞優勢抗原決定基的免疫反應。在另一個具體例中,針對Her-2表現性腫瘤之免疫反應包含針對Her-2蛋白質之至少1-10個亞優勢抗原決定基的免疫反應。在另一個具體例中,針對Her-2表現性腫瘤之免疫反應包含針對Her-2蛋白質之至少1-17個亞優勢抗原決定基的免疫反應。在另一個具體例中,針對Her-2表現性腫瘤之免疫反應包含針對Her-2蛋白質之至少17個亞優勢抗原決定基的免疫反應。
已報導當耐藥性腫瘤已由小片段基於李斯特菌屬之疫苗或曲妥珠單抗(針對位於Her-2/neu抗原之細胞外結構域處的抗原決定基之單株抗體)靶向時,致癌蛋白Her-2/neu中之點突變或胺基酸缺失介導此等耐藥性腫瘤細胞之處理。本文描述基於嵌合Her-2/neu之組成物,其具有顯示致癌基因之MHC-I類抗原決定基
簇的Her-2/neu抗原之兩個細胞外及一個細胞內片段。此具有Her-2/neu抗原之3個H2Dq及至少17個定位之人類MHC-I類抗原決定基的嵌合蛋白質與單核球增多性李斯特菌李斯特菌溶胞素O蛋白質之前441個胺基酸融合且由單核球增多性李斯特菌減毒菌株LmddA表現及分泌。
先前報導已顯示,當用分開地表現及分泌Her-2/neu抗原之小片段的基於李斯特菌屬之疫苗(其中之每一者僅具有Her-2/neu致癌基因之一個H2Dq抗原決定基)對Her-2/neu轉殖基因小鼠進行免疫接種時,Her-2/neu過度表現性腫瘤可由於Her-2/neu抗原中由各疫苗靶向之彼等抗原決定基中的突變而逃逸(參見Singh R,Paterson Y.Immunoediting sculpts tumor epitopes during immunotherapy.Cancer Res 2007;67:1887-92)。本文展現出人意料之結果,當將Her-2/neu蛋白之三個或超過三個抗原決定基併入於嵌合疫苗中時,其可消除此等腫瘤藉由逃逸突變之選擇及逃逸。用斯穎Her-2/neu嵌合李斯特菌屬疫苗免疫接種不引起任何可能與Her-2/neu抗原中之點突變或胺基酸缺失相關聯的逃逸突變(參見本文實施例4)。
在一個具體例中,本文提供一種對李斯特菌屬疫苗菌株進行工程改造以表現Her-2嵌合蛋白質或表現該嵌合蛋白質之重組多肽的方法,該方法包含用核酸分子使李斯特菌屬菌株轉型。在另一個具體例中,核酸分子包含編碼多肽之第一開讀框,其中該多肽包含Her-2/neu嵌合抗原。在另一個具體例中,核酸分子進一步包含編碼代謝酶之第二開讀框,且其中該代謝酶補充在重組李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因,藉此對李斯特菌屬進行
工程改造以表現Her-2嵌合蛋白質。
在一個具體例中,本文提供之方法及組成物進一步包含佐劑,在一個具體例中,該佐劑為獨立佐劑,其中在另一個具體例中,該佐劑或獨立佐劑包含顆粒球/巨噬細胞群落刺激因數(GM-CSF)蛋白質、編碼GM-CSF蛋白質之核苷酸分子、皂素QS21、單磷醯基脂質A或含有未甲基化CpG之寡核苷酸。在另一個具體例中,佐劑為鋁佐劑、弗氏佐劑(Freund's adjuvant)、MPL、乳液、SBAS2、編碼免疫刺激性細胞激素之核苷酸分子、細菌有絲分裂原或細菌毒素。
在一個具體例中,「佐劑」為增強針對抗原之免疫反應及/或朝向所需免疫反應對其進行調節的組成分。在一個具體例中,佐劑為免疫佐劑,在一個具體例中,其為當與特異性疫苗抗原組合使用時,起加速、延長或增強抗原特異性免疫反應之作用的物質。
在一個具體例中,「獨立」佐劑為獨立之佐劑,在一個具體例中,其與本發明之「額外佐劑多肽」不相同,該「額外佐劑多肽」與腫瘤特異性抗原一起存在于融合多肽中,在一個具體例中,該腫瘤特異性抗原為Her-2/neu。
在一個具體例中,減毒李斯特菌屬菌株,諸如單核球增多性李斯特菌delta-actA突變體(Brundage等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,90:11890-11894)、單核球增多性李斯特菌delta-plcA(Camilli等人,1991,J.Exp.Med.,173:751-754)或delta-ActA、delta INL-b(Brockstedt等人,2004,PNAS,101:13832-13837)係於本發明中使用。在另一個具體例中,一般技術者當知曉本文揭示內容時將理解,減毒李斯特菌屬菌株係藉由引
入一或多個減毒突變而構築。此等菌株之實施例包括但非僅限於芳香族胺基酸營養缺陷型李斯特菌屬菌株(Alexander等人,1993,Infection and Immunity 10 61:2245-2248)及用於脂磷壁酸之生成的突變體(Abachin等人,2002,Mol.Microbiol.43:1-14)及藉缺乏致病性基因減毒者(參考本文實施例)。
在另一個具體例中,本發明之方法及組成物之核酸分子可操作地連接於啟動子/調節序列。在另一個具體例中,本發明之方法及組成物之第一開讀框可操作地連接於啟動子/調節序列。在另一個具體例中,本發明之方法及組成物之第二開讀框可操作地連接於啟動子/調節序列。在另一個具體例中,本發明之方法及組成物之第三開讀框可操作地連接於啟動子/調節序列。在另一個具體例中,開讀框中之每一者可操作地連接於啟動子/調節序列。各可能性代表本發明之各別具體例。
當知曉本發明揭示內容及本文提供之方法時,熟練技術人員容易理解,不同的轉錄啟動子、終止子、載體質粒(carrier vector)、或特定基因序列(例如於市售選殖載體內者)可成功地用於本發明之方法及組成物中。如於本發明中預期,此等功能性例如提供於稱作pUC系列的市售載體。在另一個具體例中,非必需DNA序列(例如抗生素抗性基因)被去除。各可能性代表本發明之各別具體例。在另一個具體例中,市售載體係用於本發明。此等質體從多個來源可得,例如,Invitrogen(La Jolla,CA)、Stratagene(La Jolla,CA)、Clontech(Palo Alto,CA),或可使用技藝界眾所周知之方法組構。
在另一個具體例中,本身為帶有原核複製起點及啟動
子/調節元件之原核表現載體的質體(諸如pCR2.1(Invitrogen,La Jolla,CA))用於方便於原核生物體中表現本發明之多肽。在另一個具體例中,無關的核苷酸序列被去除以縮小質體的大小及增加可置於其中的卡匣的大小。
此類方法為業界眾所周知,且描述於例如Sambrook等人(1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)及Ausubei等人(1997,Current Protocols in Molecular Biology,Green & Wiley,New York)中。
抗生素抗性基因用於在分子生物學及疫苗製備上常見採用的習知選擇及選殖方法中。本發明中涵蓋之抗生素抗性基因包括(但不限於)賦予對安比西林(ampicillin)、青黴素(penicillin)、二甲氧苯青黴素(methicillin)、鏈黴素(streptomycin)、紅黴素(erythromycin)、康黴素(kanamycin)、四環素(tetracycline)、氯黴素(cloramphenicol,CAT)、新黴素(neomycin)、潮黴素(hygromycin)、慶大黴素(gentamicin)之抗性的基因產物及此項技術中熟知之其他基因產物。各基因代表本發明之各別具體例。
細菌之轉型方法為業界眾所周知,且包括以氯化鈣勝任細胞為基礎的方法、電穿孔法、噬菌體介導的轉導、化學、及物理轉型技術(de Boer等人,1989,Cell 56:641-649;Miller等人,1995,FASEB J.,9:190-199;Sambrook等人1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York;Ausubel等人,1997,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York;Gerhardt等人編輯,1994,Methods for General and Molecular Bacteriology,American Society for
Microbiology,Washington,DC;Miller,1992,A Short Course in Bacterial Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)。在另一個具體例中,本發明之李斯特菌屬疫苗菌株係藉電穿孔轉型。各方法代表本發明之各別具體例。
在另一個具體例中,結合用於將遺傳物質及/或質體引入細菌中。用於結合之方法為此項技術中所熟知且描述於例如Sambrook等人(A second generation snp-derived Escherichia coli-Streptomyces shuttle expression vector that is generally transferable by conjugation.Plasmid.2006年11月;56(3):223-7)及Auchtung JM等人(Regulation of a Bacillus subtilis mobile genetic element by intercellular signaling and the global DNA damage response.Proc Natl Acad Sci U S A.2005年8月30日;102(35):12554-9)中。各方法代表本發明之各別具體例。
在一個具體例中,「轉型」與術語「轉染」相同地使用,且係指工程改造細菌細胞以接受質體或其他異源DNA分子。在另一個具體例中,「轉型」係指工程改造細菌細胞以表現質體之基因或其他異源DNA分子。各可能性代表本發明之各別具體例。
適用於本發明中之質體及其他表現載體描述於本文其他地方,且可包括諸如以下各者之特徵:啟動子/調節序列、用於革蘭氏陰性及革蘭氏陽性細菌之複製起點、編碼融合蛋白之經分離核酸及編碼胺基酸代謝基因之經分離核酸。又,編碼融合蛋白質之分離核酸及編碼胺基酸代謝基因之分離核酸將具有適用於驅動此種分離核酸表現的啟動子。驅動在細菌性系統表現有用的啟動子為業界眾所周知,及包括噬菌體λ、pBR322之β-內醯胺酶基因的bla
啟動子、及pBR325之氯黴素乙醯轉移酶基因的CAT啟動子。原核啟動子的進一步實施例包括5噬菌體λ之主要右啟動子及左啟動子(PL及PR)、大腸桿菌之trp、recA、lacZ、lad、及gal啟動子、α-澱粉酶(Ulmanen et al,1985.J.Bacteriol.162:176-182)及枯草桿菌之S28-特異性啟動子(Gilman et al,1984 Gene 32:11-20)、芽孢桿菌之噬菌體的啟動子(Gryczan,1982,In:The Molecular Biology of the Bacilli,Academic Press,Inc.,New York)、及鏈絲菌(Stroptomyces)啟動子(Ward et al,1986,Mol.Gen.Genet.203:468-478)。本發明中涵蓋之其他原核啟動子綜述於例如Glick(1987,J.Ind.Microbiol.1:277-282);Cenatiempo,(1986,Biochimie,68:505-516);及Gottesman,(1984,Ann.Rev.Genet.18:415-442)。本發明中涵蓋之啟動子/調節元件的其他實例包括(但不限於)李斯特菌屬prfA啟動子、李斯特菌屬hly啟動子、李斯特菌屬p60啟動子及李斯特菌屬actA啟動子(GenBank寄存No.NC_003210)或其片段。
在另一個具體例中,本發明之方法及組成物的質體包含編碼融合蛋白之基因。在另一個具體例中,子序列經選殖,及適當子序列使用適當限制酶裂解。在另一個具體例中,然後該等片段接合而產生期望的DNA序列。在另一個具體例中,編碼抗原之DNA使用DNA擴增方法,例如聚合酶連鎖反應(PCR)來產生首先,在新終端任一側上的原生DNA之區段係經分開擴增。一個已擴增序列的5’端編碼肽連接子,而另一個已擴增序列的3’端也編碼肽連接子。因第一片段的5’端係與第二片段的3’端互補,故兩個片段(在部分純化後,例如於LMP瓊脂上部分純化後)可用作為第三PCR反應中的重疊範本。已擴增序列將含有密碼子,在開放位點的羧基側
上的區段(現在形成胺基序列),及在開放位點的胺基側上的區段(現在形成羧基序列)。抗原接合入質體內。各方法代表本發明之各別具體例。
在另一個具體例中,本發明進一步包含供臨床應用的基於噬菌體之染色體整合系統。將使用對必需酶包括(但非僅限於)d-丙胺酸消旋酶為營養缺陷型的宿主菌株,例如Lmdal(-)dat(-)。在另一個具體例中,為避免「噬菌體固化步驟」,使用基於PSA之噬菌體整合系統(Lauer,et al.,2002 J Bacteriol,184:4177-4186)。在另一個具體例中,此需要藉由抗生素連續選擇以維持整合基因。因此,在另一個具體例中,本發明能夠不需要使用抗生素選擇即形成以噬菌體為主之染色體整合系統。實際上,營養缺陷型宿主菌株將獲得補充。
在另一個具體例中,本發明之重組蛋白係使用重組DNA方法合成。在一個具體例中,此涉及產生編碼融合蛋白之DNA序列,在特定啟動子/調節元件之控制下,將DNA置於表現卡匣(諸如本發明之質體)內,及表現蛋白質。在另一個具體例中,本發明的編碼融合蛋白(例如,非溶血性LLO/抗原)之DNA係藉任何適合之方法製備,包括例如,適當序列之選殖及限制,或藉由下列方法直接化學合成,諸如Narang等人之磷酸三酯方法(1979,Meth.Enzymol.68:90-99);Brown等人之磷酸二酯方法(1979,Meth.Enzymol 68:109-151);Beaucage等人之亞磷酸二乙酯一醯胺方法(1981,Tetra.Lett.,22:15 1859-1862);及U.S.Pat.No.4,458,066之固體支援體方法。
在另一個具體例中,化學合成係用來產生單股寡核苷
酸。在各種具體例中,此種單股寡核苷酸藉與互補序列雜交,或藉使用單股作範本與DNA聚合酶聚合而被轉成雙股DNA。熟諳技藝人士將瞭解雖然DNA之化學合成受限於約100鹼基的序列,但藉接合較短序列可獲得更長的序列。在另一個具體例中,子序列經選殖,及適當子序列使用適當限制酶裂解。然後該等片段經接合而生產期望的DNA序列。
在另一個具體例中,本發明的編碼融合蛋白或重組蛋白之DNA係使用DNA擴增法(諸如聚合酶連鎖反應(PCR))選殖。因此,對用於非溶血性LLO之基因使用包含適合之限制位點的有義引子及包含另一個限制位點(例如促進選殖之不相同限制位點)的反義引子進行PCR擴增。對編碼抗原之經分離核酸重複相同過程。非溶血性LLO與抗原序列接合及插入至質體或載體中產生編碼接合於抗原一端之非溶血性LLO的載體。兩個分子直接接合或藉由限制位點引入之短間隔子接合。
在另一個具體例中,藉由一或多個胺基酸組成之肽間隔子分開分子,一般而言,除接合蛋白質或在其間保持一定最小距離或其他空間關係之外,間隔子將不具有特定生物活性。在另一個具體例中,選擇間隔子之構成胺基酸以影響分子之某種特性,諸如摺疊、淨電荷或疏水性。在另一個具體例中,將編碼融合或重組蛋白之核酸序列轉型至多種宿主細胞中,包括大腸桿菌;其他細菌宿主,諸如李斯特菌屬;酵母及各種高等真核細胞,諸如COS、CHO及HeLa細胞株及骨髓瘤細胞株。重組融合蛋白基因將可操作地連接於各宿主之適當表現控制序列。啟動子/調節元體係於本文中容後詳述。在另一個具體例中,質體進一步包含其他啟動子調節元件以
及核糖體結合位點及轉錄終止信號。用於真核細胞,控制序列將包括衍生自例如免疫球蛋白基因、SV40、細胞巨病毒等的啟動子及強化子,及多腺苷酸化序列。在另一個具體例中,該等序列包括剪接給予者序列及接受者序列。
在另一個具體例中,術語「可操作地連接」係指並列位置,其中如此描述之組成分係呈允許其以預期方式發揮作用的關係。「可操作地連接」至編碼序列之控制序列的接合方式使得在與該等控制序列可相容的條件下達成編碼序列之表現。
在另一個具體例中,為了選擇包含質體之營養缺陷型細菌,使經轉型營養缺陷型細菌成長在將對胺基酸代謝基因之表現進行選擇的培養基上。在另一個具體例中,對於D-麩胺酸合成而言為營養缺陷之細菌用包含用於D-麩胺酸合成之基因的質體轉型,且營養缺陷型細菌將在無D-麩胺酸存在下生長,而未使用質體轉型或不表現編碼用於D-麩胺酸合成之蛋白質的質體之營養缺陷型細菌將不生長。在另一個具體例中,當經轉型且表現本發明之質體時,若質體包含編碼用於D-丙胺酸合成之胺基酸代謝酶的分離核酸,則對於D-丙胺酸合成而言為營養缺陷之細菌將在無D-丙胺酸存在下生長。此類用於製備包含或缺乏必要生長因數、補充劑、胺基酸、維生素、抗生素及其類似物的適當培養基之方法為此項技術中所熟知,且可購得(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,NJ)。各方法代表本發明之各別具體例。
在另一個具體例中,一旦已基於適當培養基選擇包含本發明之質體之營養缺陷型細菌,則細菌在選擇性壓力存在下繁殖。此類繁殖包含在無營養缺陷型因數之培養基中生長細菌。營養缺陷
型細菌中表現胺基酸代謝酶之質體的存在確保質體將與細菌一起複製,因此持續選擇含有質體之細菌。熟練技術人員當知曉本文之本發明揭示內容及方法時將能夠容易地藉由調整生長有包含質體之營養缺陷型細菌的培養基體積來按比例擴大重組李斯特菌屬菌株的產量。
在另一個具體例中,熟練技術人員將瞭解,在另一個具體例中,其他營養缺陷型菌株及補充系統用於與本發明一起使用。
在一個具體例中,本文提供一種在個體中阻礙Her-2表現性腫瘤之生長的方法,其中及在另一個具體例中,該方法包含向該個體投予包含本文所描述之重組李斯特菌屬疫苗菌株之組成物的步驟。
在另一個具體例中,本文提供一種在個體中引起針對Her-2/neu表現性腫瘤之免疫反應增強的方法,其中及在另一個具體例中,該方法包含向該個體投予包含本文所描述之重組李斯特菌屬疫苗菌株之組成物的步驟。在又另一個具體例中,針對Her-2/neu表現性癌症之免疫反應包含針對Her-2/neu蛋白之至少一個亞優勢抗原決定基的免疫反應。
在一個具體例中,本文提供一種在處理Her-2/neu過度表現性腫瘤中預防逃逸突變之方法,其中及在另一個具體例中,該方法包含向該個體投予包含本文提供之重組李斯特菌屬疫苗菌株之組成物的步驟。
在另一個具體例中,本文提供一種在個體中預防Her-2/neu抗原表現性腫瘤發作之方法,其中及在另一個具體例中,
該方法包含向該個體投予包含本文提供之重組李斯特菌屬疫苗菌株之組成物的步驟。
在一個具體例中,本文提供一種減低腫瘤內T調節細胞之頻率的方法,其中及在另一個具體例中,該方法包含向該個體投予包含本文提供之重組李斯特菌屬疫苗菌株之組成物的步驟。
在一個具體例中,本文提供一種減低腫瘤內骨髓源性抑制細胞之頻率的方法,其中及在另一個具體例中,該方法包含向該個體投予包含本文提供之重組李斯特菌屬疫苗菌株之組成物的步驟。
在另一個具體例中,本文提供一種減低骨髓源性抑制細胞(MDSC)之頻率的方法,其中及在另一個具體例中,該方法包含向該個體投予包含本文提供之重組李斯特菌屬疫苗菌株之組成物的步驟。
在一個具體例中,本文提供一種在個體中預防Her-2/neu表現性腫瘤發展之方法,其中及在另一個具體例中,該方法包含向該個體投予包含本文提供之重組李斯特菌屬疫苗菌株之組成物的步驟。
在另一個具體例中,本文提供一種在個體中預防來自Her-2/neu表現性腫瘤之轉移性疾病形成的方法,其中及在另一個具體例中,該方法包含向該個體投予包含本文提供之重組李斯特菌屬疫苗菌株之組成物的步驟。
在另一個具體例中,本文提供一種治療個體之源自Her-2/neu表現性腫瘤之轉移性疾病的方法,其中及在另一個具體
例中,該方法包含向該個體投予包含本文提供之重組李斯特菌屬疫苗菌株之組成物的步驟。
在一個具體例中,本文提供一種投予本發明之組成物的方法。在另一個具體例中,本文提供一種投予本發明之疫苗的方法。在另一個具體例中,本文提供一種投予本發明之重組多肽或重組核苷酸的方法。在另一個具體例中,投予本發明之組成物、疫苗、重組多肽或重組核苷酸的步驟使用包含該組成物、疫苗、重組核苷酸或該表現重組多肽之李斯特菌屬減毒重組形式來進行,其各自處於其自身之分立具體例中。在另一個具體例中,投予係使用不同的減毒細菌性載體進行。在另一個具體例中,投予係使用DNA疫苗(例如裸DNA疫苗)進行。在另一個具體例中,投予本發明之重組多肽係藉由重組地產生蛋白質,隨後向個體投予該重組蛋白來進行。各可能性代表本發明之各別具體例。
在另一個具體例中,由本發明之方法及組成物引起的免疫反應包含CD8+ T細胞介導的反應。在另一個具體例中,免疫反應主要由CD8+ T細胞介導的反應組成。在另一個具體例中,唯一可偵測的免疫反應之組成分為CD8+ T細胞介導的反應。
在另一個具體例中,由本文提供之方法及組成物引起的免疫反應包含CD4+ T細胞介導的反應。在另一個具體例中,免疫反應主要由CD4+ T細胞介導的反應組成。在另一個具體例中,唯一可偵測的免疫反應之組成分為CD4+ T細胞介導的反應。在另一個具體例中,CD4+ T細胞介導的反應係伴隨有可量測的針對抗原之抗體反應。在另一個具體例中,CD4+ T細胞介導的反應係不伴隨有可量測的針對抗原之抗體反應。
在另一個具體例中,本發明提供一種在個體中誘導針對抗原之亞優勢CD8+ T細胞抗原決定基的CD8+ T細胞介導之免疫反應的方法,其包含以下步驟:(a)使編碼Her2-neu嵌合抗原或其片段之核苷酸分子與編碼LLO蛋白質之N端片段的核苷酸分子融合,藉此產生編碼LLO-抗原融合蛋白之重組核苷酸;及(b)向該個體投予該重組核苷酸或LLO-抗原融合物;藉此誘導針對抗原之亞優勢CD8+ T細胞抗原決定基的CD8+ T細胞介導之免疫反應。
在一個具體例中,本文提供一種提高CD8+/T調節細胞的瘤內比之方法,其中及在另一個具體例中,該方法包含向個體投予包含本發明之重組多肽、重組李斯特菌屬或重組載體之組成物的步驟。
在另一個具體例中,本文提供一種減低腫瘤內T調節細胞之頻率的方法,其中及在另一個具體例中,該方法包含向該個體投予包含本文提供之重組李斯特菌屬疫苗菌株之組成物的步驟。
在另一個具體例中,由本文提供之方法及組成物引起的免疫反應包含針對抗原之至少一個亞優勢抗原決定基的免疫反應。在另一個具體例中,免疫反應不包含對亞優勢抗原決定基的免疫反應。在另一個具體例中,免疫反應主要係由對至少一個亞優勢抗原決定基的免疫反應組成。在另一個具體例中,唯一可量測的免疫反應之組成分為對至少一個亞優勢抗原決定基的免疫反應。免疫反應之各類型代表本發明之各別具體例。
在一個具體例中,本發明之方法在個體中破壞對該個體中Her-2/neu表現性腫瘤或癌症之耐受性,其中及在另一個具體
例中,該方法包含向該個體投予包含本文提供之重組李斯特菌屬疫苗菌株之組成物的步驟。
量測免疫反應之方法為此項技術中所熟知,且包括例如量測腫瘤生長之抑制、流動式細胞量測術、目標細胞溶解分析(例如鉻釋放分析)、使用四聚體及其他。各方法代表本發明之各別具體例。
在另一個具體例中,本發明提供一種在個體中阻礙Her-2表現性腫瘤之生長的方法,其中及在另一個具體例中,該方法包含向該個體投予放射療法與重組多肽或編碼該重組多肽之重組核苷酸的組合,該重組多肽包含與Her-2嵌合蛋白質或其片段融合之LLO蛋白質的N端片段,其中該個體安裝針對Her-2表現性腫瘤之免疫反應,藉此在個體中阻礙Her-2表現性腫瘤之生長。
在另一個具體例中,本發明提供一種在個體中延遲或抑制源自Her-2表現性腫瘤之轉移性疾病的方法,其中及在另一個具體例中,該方法包含向該個體投予放射療法與重組多肽或編碼該重組多肽之重組核苷酸的組合,該重組多肽包含與Her-2嵌合蛋白質或其片段融合之LLO蛋白質的N端片段,其中該個體安裝針對Her-2表現性腫瘤之免疫反應,藉此在個體中延遲或抑制源自Her-2表現性腫瘤之轉移性疾病。
在另一個具體例中,本發明提供一種改良Her-2嵌合蛋白質之抗原性的方法,其中及在另一個具體例中,該方法包含使編碼LLO蛋白質之N端片段的核苷酸與編碼Her-2蛋白質或其片段之核苷酸融合以產生重組核苷酸的步驟,藉此改良Her-2嵌合蛋白質之抗原性。
在另一個具體例中,本文提供一種改良Her-2嵌合蛋白質之抗原性的方法,其中及在另一個具體例中,該方法包含對李斯特菌屬菌株進行工程改造以表現重組核苷酸。在另一個具體例中,不同細菌性載體用於表現重組核苷酸。在另一個具體例中,細菌性載體經減毒。在另一個具體例中,DNA疫苗(例如裸DNA疫苗)用於表現重組核苷酸。在另一個具體例中,投予由核苷酸編碼之LLO-Her-2嵌合體融合肽藉由重組地產生蛋白質,隨後向個體投予該重組蛋白來進行。各可能性代表本發明之各別具體例。
在一個具體例中,本發明提供一種誘導腫瘤之「抗原決定基擴散」的方法。在另一個具體例中,使用本文提供之組成物及方法的免疫接種誘導抗原決定基擴散至攜載除本發明疫苗中載有之抗原以外之抗原的其它腫瘤上。
在另一個具體例中,優勢抗原決定基或亞優勢抗原決定基在接受治療之個體中分別為優勢或亞優勢。在另一個具體例中,優勢抗原決定基或亞優勢抗原決定基在接受治療的族群為優勢或亞優勢。
在一個具體例中,本文提供一種藉由抗原決定基擴散來在個體中針對癌症或腫瘤生長預防、治療、遏制、抑制、誘導針對亞優勢抗原決定基之免疫反應,或引起針對亞優勢抗原決定基之免疫反應增強的方法,其中及在另一個具體例中,該癌症係與包含於本發明組成物中之抗原或其片段的表現有關。在另一個具體例中,該方法包含對該個體投予包含本發明之重組多肽、重組李斯特菌屬、或重組載體的組成物。在又另一個具體例中,個體安裝針對抗原表現性癌症或抗原表現性腫瘤的免疫反應,藉此於個體體內治療、遏
制、或抑制癌症或腫瘤生長。
在一個具體例中,「優勢CD8+ T細胞抗原決定基」係指由超過30%之抗原特異性CD8+T細胞所辨識的抗原決定基,該等細胞藉由蛋白質或含有該蛋白質之病原體或癌細胞的疫苗接種、感染或惡性生長引起。在另一個具體例中,該術語係指由超過35%藉此被提引出的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由超過40%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由超過45%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由超過50%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由超過55%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由超過60%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由超過65%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由超過70%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由超過75%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由超過80%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由超過85%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由超過90%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由超過95%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由超過96%的抗原特異性CD8+ T細
胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由超過97%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由超過98%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。
「亞優勢CD8+ T細胞抗原決定基」係指由少於30%之抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基,該等細胞藉由蛋白質或含有該蛋白質之病原體或癌細胞的疫苗接種、感染或惡性生長引起。在另一個具體例中,該術語係指由少於28%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由超過26%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由少於24%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由超過22%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由少於20%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由超過18%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由少於16%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由超過14%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由超過12%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由少於10%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由超過8%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由少於6%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定
基。在另一個具體例中,該術語係指由少於5%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由超過4%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由少於3%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由少於2%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由少於1%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。在另一個具體例中,該術語係指由少於0.5%的抗原特異性CD8+ T細胞所辨識的抗原決定基。
優勢抗原決定基及亞優勢抗原決定基之各類型代表本發明之各別具體例。
在一個具體例中,本發明之方法及組成物中的抗原在個體之非腫瘤細胞上以可偵測量表現。在另一個具體例中,抗原係以可偵測濃度在個體的至少某個百分比(例如0.01%、0.03%、0.1%、0.3%、1%、2%、3%,或5%)的非腫瘤細胞上表現。在一個具體例中,「非腫瘤細胞」係指腫瘤本體外部的細胞。在另一個具體例中,「非腫瘤細胞」係指非惡性細胞。在另一個具體例中,「非腫瘤細胞」係指非轉型細胞。在另一個具體例中,非腫瘤細胞為體細胞。在另一個具體例中,非腫瘤細胞為生殖細胞。各可能性代表本發明之各別具體例。
在一個具體例中,「可偵測量」係指在使用標準分析時可偵測之量。在一個具體例中,檢定分析為免疫檢定分析。在一個具體例中,檢定分析為酶聯結免疫檢定分析(ELISA)。在另一個具體例中,檢定分析為西方墨點。在另一個具體例中,檢定分析為
FACS。熟練技術人員應理解,此項技術中可獲得之任何其他分析可用於本文提供之方法中。在另一個具體例中,可偵測濃度係相對於特定檢定分析之背景濃度確定。用於進行此等技術中之每一者的方法為熟習此項技術者熟知,且各技術代表本發明之各別具體例。
在一個具體例中,使用重組抗原表現性單核球增多性李斯特菌疫苗接種誘導抗原決定基擴散。在另一個具體例中,即使在無Her2之情形下,用LLO-抗原融合物進行疫苗接種亦誘導抗原決定基擴散。各可能性代表本發明之各別具體例。
在另一個具體例中,本發明提供一種在個體中阻礙Her-2表現性腫瘤之生長的方法,其包含向該個體投予包含與Her-2嵌合抗原融合之LLO蛋白質之N端片段的重組多肽,其中該抗原具有一或多個亞優勢CD8+ T細胞抗原決定基,其中該個體安裝針對抗原表現性腫瘤之免疫反應,藉此在個體中阻礙Her-2表現性腫瘤之生長。在另一個具體例中,抗原不含有任何優勢CD8+ T細胞抗原決定基。在另一個具體例中,本文提供一種在個體中阻礙Her-2表現性腫瘤之生長的方法,其包含向該個體投予包含編碼本文提供之重組多肽之重組核苷酸的李斯特菌屬之重組形式。
在另一個具體例中,本發明提供一種在患有癌症之宿主中誘導細胞毒性T細胞之形成的方法,其包含對該宿主投予本發明之組成物,藉此在患有癌症之宿主中誘導細胞毒性T細胞之形成。
在另一個具體例中,本發明提供一種降低癌症發生率之方法,其包含投予本發明之組成物。在另一個具體例中,本發明提供一種改善癌症之方法,其包含投予本發明之組成物。各可能性
代表本發明之各別具體例。
在一個具體例中,組成物係向個體之細胞離體投予;在另一個具體例中,組成物係向給予體之細胞離體投予;在另一個具體例中,組成物係向給予體之細胞活體內投予,隨後轉移至個體。各可能性代表本發明之各別具體例。
在一個具體例中,藉由本發明之方法治療的癌症為乳癌。在另一個具體例中,癌症為含有Her2之癌症。在另一個具體例中,癌症為黑色素瘤。在另一個具體例中,癌症為胰臟癌。在另一個具體例中,癌症為卵巢癌。在另一個具體例中,癌症為胃癌。在另一個具體例中,癌症為胰臟之癌性病變在另一個具體例中,癌症為肺腺癌。在另一個具體例中,癌症為結腸直腸腺癌。在另一個具體例中,癌症為肺鱗狀腺癌。在另一個具體例中,癌症為胃腺癌。在另一個具體例中,癌症為卵巢表面上皮細胞贅瘤(例如其良性、增生或惡性變體)。在另一個具體例中,癌症為口腔鱗狀細胞癌。在另一個具體例中,癌症為非小細胞肺癌。在另一個具體例中,癌症為CNS癌。在另一個具體例中,癌症為子宮內膜癌。在另一個具體例中,癌症為膀胱癌。在另一個具體例中,癌症為間皮瘤。在另一個具體例中,癌症為惡性間皮瘤(MM)。在另一個具體例中,癌症為頭頸部癌。在另一個具體例中,癌症為前列腺癌。
在一個具體例中,癌症為骨肉瘤,在一個具體例中,其為癌性骨腫瘤。在一個具體例中,骨肉瘤為以下次型中之任一者:骨母細胞OSA、軟骨母細胞OSA、纖維母細胞OSA、毛細管擴張性OSA、小細胞OSA、低級中樞OSA、骨膜OSA、骨膜外OSA、繼發性OSA、高級骨膜OSA或骨外OSA。
在另一個具體例中,癌症為Her-2/neu表現性骨肉瘤。在一個具體例中,骨肉瘤為犬類骨肉瘤。在另一個具體例中,骨肉瘤為局部骨肉瘤。在另一個具體例中,骨肉瘤為轉移性骨肉瘤。在另一個具體例中,骨肉瘤為高級骨肉瘤。在另一個具體例中,骨肉瘤為犬類附肢骨肉瘤。在另一個具體例中,癌症為肺部轉移性疾病。各可能性代表本發明之各別具體例。
在本發明方法之另一個具體例中,個體安裝針對抗原表現性腫瘤或標靶抗原的免疫反應,藉此介導抗腫瘤效果。
在另一個具體例中,本發明提供一種用於治療癌症之免疫原性組成物,該組成物包含截短LLO與Her-2嵌合蛋白質之融合物。在另一個具體例中,免疫原性組成物進一步包含表現該融合物之李斯特菌屬菌株。各可能性代表本發明之各別具體例。在另一個具體例中,本發明提供一種用於治療癌症之免疫原性組成物,該組成物包含表現Her-2嵌合蛋白質之李斯特菌屬菌株。
在另一個具體例中,本文提供一種包含本發明之李斯特菌屬之重組形式的免疫原性組成物。
在一個具體例中,本發明之治療方案為治療性的。在另一個具體例中,方案為預防性的。在另一個具體例中,本發明之疫苗用於保護如熟練技術人員將理解,因為家族性遺傳或使其易患此等類型之病痛的其他情況而處於癌症(諸如乳癌或其他類型之含Her2腫瘤)風險下的人。在另一個具體例中,疫苗用作藉由手術、習知化學療法或輻射治療進行的腫瘤生長減積手術之後的癌症免疫療法。在另一個具體例中,疫苗與輻射治療及手術、習知化學療法中之一或兩者組合。在此類治療之後,投予本發明之疫苗使得對
疫苗之腫瘤抗原的CTL反應破壞剩餘癌轉移及延長自癌症緩解。在另一個具體例中,組成物係與手術、習知化學療法、輻射治療或其任何組合組合用作癌症免疫療法。在另一個具體例中,此類組合治療用於無法經歷切除術之個體中。在另一個具體例中,此類組合治療用於無法經歷切除術的患有原發性骨肉瘤之個體中。在另一個具體例中,本發明之疫苗用於影響先前產生的腫瘤之生長及殺死現有腫瘤細胞。各可能性代表本發明之各別具體例。
在另一個具體例中,用於上文所描述之任何方法中的疫苗及免疫原性組成物具有本發明之疫苗及免疫原性組成物的任何特徵。各特徵代表本發明之各別具體例。應理解,在本發明之組成物及用途的情形下所描述的組成物可稱為免疫原性組成物,且反之亦然。
本發明預期涵蓋劑量範圍之各種具體例。在一個具體例中,以疫苗載體為例,劑量係於0.4 LD50/劑之範圍。在另一個具體例中,劑量為約0.4-4.9 LD50/劑。在另一個具體例中,劑量為約0.5-0.59 LD50/劑。在另一個具體例中,劑量為約0.6-0.69 LD50/劑。在另一個具體例中,劑量為約0.7-0.79 LD50/劑。在另一個具體例中,劑量為約0.8 LD50/劑。在另一個具體例中,劑量為0.4 LD50/劑至0.8 LD50/劑。
在另一個具體例中,劑量為107細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為1.5 x 107細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為2 x 107細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為3 x 107細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為4 x 107細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為6 x 107細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為8 x 107細菌/劑。在另
一個具體例中,劑量為1 x 108細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為1.5 x 108細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為2 x 108細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為3 x 108細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為4 x 108細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為6 x 108細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為8 x 108細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為1 x 109細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為1.5 x 109細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為2 x 109細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為3 x 109細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為5 x 109細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為6 x 109細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為8 x 109細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為1 x 1010細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為1.5 x 1010細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為2 x 1010細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為3 x 1010細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為5 x 1010細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為6 x 1010細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為8 x 1010細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為8 x 109細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為1 x 1011細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為1.5 x 1011細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為2 x 1011細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為3 x 1011細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為5 x 1011細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為6 x 1011細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為8 x 1011細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為5.0 x 108細菌/劑。在另一個具體例中,劑量為3.3 x 109細菌/劑。在另一個具體例中,用於本文提供之方法中的組成物包含3.3 x 109李斯特菌屬/劑量。各可能性代表本發明之各別具體例。
在一個具體例中,本發明之疫苗或免疫原性組成物係單獨向個體投予。在另一個具體例中,疫苗或免疫原性組成物與另一種癌症療法一起投予,在一個具體例中,該另一種癌症療法為放射療法。各可能性代表本發明之各別具體例。
在一個具體例中,本發明之方法及組成物的重組李斯特菌屬用編碼Her-2嵌合抗原或LLO-Her-2嵌合抗原融合物之構築體穩定轉型。在一個具體例中,構築體含有多酶切點接頭(polylinker)以便於進一步次選殖。用於產生重組李斯特菌屬之若干技術為已知的。
在另一個具體例中,構築體或核酸分子使用同源重組整合至李斯特菌屬染色體中。用於同源重組之技術為此項技術中所熟知且描述於例如Baloglu S,Boyle SM等人(Immune responses of mice to vaccinia virus recombinants expressing either Listeriamonocytogenespartial listeriolysin or Brucella abortus ribosomal L7/L12 protein.Vet Microbiol 2005,109(1-2):11-7);及Jiang LL,Song HH等人(Characterization of a mutant Listeriamonocytogenes strain expressing green fluorescent protein.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)2005,37(1):19-24)。在另一個具體例中,同源重組如美國專利第6,855,320號中所述進行。在此情況下,表現E7之重組單核球增多性李斯特菌菌株藉由在hly啟動子控制下且在包括hly信號序列下進行E7基因之染色體整合,確保基因產物之分泌來製備,產生稱為Lm-AZ/E7之重組。在另一個具體例中,溫度敏感性質體用於選擇重組體。各技術代表本發明之各別具體例。
在另一個具體例中,構築體或核酸分子使用轉座子插入整合至李斯特菌屬染色體中。用於轉座子插入之技術為此項技術中所熟知且在DP-L967之構築中尤其由Sun等人(Infection and Immunity 1990,58:3770-3778)描述。在另一個具體例中,轉座子突變誘發具有可形成穩定之基因組插入突變體的優點,但具有異源基因插入其中之基因組中的位置未知的缺點。
在另一個具體例中,構築體或核酸分子使用噬菌體整合位點整合至李斯特菌屬染色體中(Lauer P,Chow MY等人,Construction,characterization,and use of two Listeria monocytogenes site-specific phage integration vectors.J Bacteriol 2002;184(15):4177-86)。在此方法之某些具體例中,細菌噬菌體(例如U153或PSA李斯特菌噬菌體)之整合酶基因及連接位點用於將異源基因插入至相應連接位點,該位點可為基因組中之任何適當位點(例如arg tRNA基因之comK或3'端)。在另一個具體例中,內源性原噬菌體在整合構築體或異源基因之前自所利用的連接位點固化。在另一個具體例中,此方法產生單複本整合體。各可能性代表本發明之各別具體例。
在另一個具體例中,各種啟動子中之一者用於表現抗原或含有該抗原之融合蛋白。在一個具體例中,使用單核球增多性李斯特菌啟動子,例如基因hly、actA、plca、plcB及mpl之啟動子,其分別編碼李斯特菌屬蛋白質溶血素、actA、磷脂醯肌醇特異性磷脂酶、磷脂酶C及金屬蛋白酶。各可能性代表本發明之各別具體例。
在另一個具體例中,本發明之方法及組成物利用本發
明之Her-2嵌合蛋白質或LLO序列的同源物。在另一個具體例中,本發明之方法及組成物利用來自非人類哺乳動物之Her-2嵌合蛋白質。在一個具體例中,當提及任何蛋白質或肽時,術語「同源性」、「同源」等係指在比對序列及視需要引入空位以達成最大同源性百分比且不將任何保守性取代視為序列一致性之部分之後,候選序列中與對應原生多肽之殘基一致之胺基酸殘基的百分比。用於比對之方法及電腦程式為此項技術中所熟知。
在另一個具體例中,術語「同源性」當提及任何核酸序列時類似地指示候選序列中與對應原生核酸序列之核苷酸一致之核苷酸的百分比。
在另一個具體例中,本發明提供一種編碼本發明之信號肽或重組多肽或融合蛋白的經分離核酸。在一個具體例中,經分離核酸包含與編碼本發明之信號肽或重組多肽或融合蛋白的核酸共用至少65%同源性之序列。在另一個具體例中,經分離核酸包含與編碼本發明之信號肽或重組多肽或融合蛋白的核酸共用至少75%同源性之序列。在另一個具體例中,經分離核酸包含與編碼本發明之信號肽或重組多肽或融合蛋白的核酸共用至少85%同源性之序列。在另一個具體例中,經分離核酸包含與編碼本發明之信號肽或重組多肽或融合蛋白的核酸共用至少90%同源性之序列。在另一個具體例中,經分離核酸包含與編碼本發明之信號肽或重組多肽或融合蛋白的核酸共用至少95%同源性之序列。在另一個具體例中,經分離核酸包含與編碼本發明之信號肽或重組多肽或融合蛋白的核酸共用至少97%同源性之序列。在另一個具體例中,經分離核酸包含與編碼本發明之信號肽或重組多肽或融合蛋白的核酸共用至
少99%同源性之序列。
在一個具體例中,藉由此項技術中充分描述之方法,藉由用於序列比對之電腦演算法測定同源性。舉例而言,核酸序列同源性之電腦演算法分析可包括利用多種可獲得之軟體套件,諸如BLAST、DOMAIN、BEAUTY(BLAST Enhanced Alignment Utility)、GENPEPT及TREMBL套裝。
在另一個具體例中,「同源」係指與選自本文提供之序列(核酸或胺基酸序列)之序列的一致性超過65%。在另一個具體例中,「同源」係指與選自本文提供之序列之序列的一致性超過70%。在另一個具體例中,一致性超過75%。在另一個具體例中,一致性超過78%。在另一個具體例中,一致性超過80%。在另一個具體例中,一致性超過82%。在另一個具體例中,一致性超過83%。在另一個具體例中,一致性超過85%。在另一個具體例中,一致性超過87%。在另一個具體例中,一致性超過88%。在另一個具體例中,一致性超過90%。在另一個具體例中,一致性超過92%。在另一個具體例中,一致性超過93%。在另一個具體例中,一致性超過95%。在另一個具體例中,一致性超過96%。在另一個具體例中,一致性超過97%。在另一個具體例中,一致性超過98%。在另一個具體例中,一致性超過99%。在另一個具體例中,一致性為100%。各可能性代表本發明之各別具體例。
在另一個具體例中,經由測定候選序列雜交來確定同源性,測定序列雜交之方法為此項技術中充分描述(參見例如「Nucleic Acid Hybridization」Hames,B.D.,及Higgins S.J.編輯(1985);Sambrook等人,2001,Molecular Cloning,A Laboratory
Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.;及Ausubel等人,1989,Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y)舉例而言,可在中等至嚴格條件下進行與編碼原生卡斯蛋白酶肽之DNA的補體雜交之方法。雜交條件為例如在42℃下,在包含以下之溶液中培育隔夜:10%-20%甲醯胺、5X SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7.6)、5X登哈特溶液(Denhardt’s solution)、10%硫酸葡聚糖及20μg/ml變性修剪鮭魚精子DNA。
在本發明之一個具體例中,「核酸」係指一串至少兩個鹼基-糖-磷酸酯組合。在一個具體例中,該術語包括DNA及RNA。在一個具體例中,「核苷酸」係指核酸聚合物之單體單元。在一個具體例中,RNA可呈tRNA(轉移RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖體RNA)、mRNA(信使RNA)、反義RNA、小抑制RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)及核糖核酸酶形式。已描述siRNA及miRNA之用途(Caudy AA等人,Genes & Devel 16:2491-96及其中引用之參考文獻)。DNA可呈質體DNA、病毒DNA、線性DNA或染色體DNA或此等基團之衍生物形式。另外,此等形式之DNA及RNA可呈單股、雙股、三股或四股。在另一個具體例中,該術語亦包括可含有其他類型之主鏈但鹼基相同之人工核酸。在一個具體例中,人工核酸為PNA(肽核酸)。PNA含有肽主鏈及核苷酸鹼基且在一個具體例中能夠結合DNA與RNA分子兩者。在另一個具體例中,核苷酸經氧雜環丁烷修飾。在另一個具體例中,核苷酸藉由用一個硫代磷酸酯鍵置換一或多個磷酸二酯鍵來修飾。在另一個具體例中,人工核酸含有此項技術中已知之原生核酸之磷酸酯主鏈的任何其他變異
體。硫代磷酸酯核酸及PNA之用途為熟習此項技術者已知且描述於例如Neilsen PE,Curr Opin Struct Biol 9:353-57;及Raz NK等人Biochem Biophys Res Commun。297:1075-84中。核酸之產生及使用為熟習此項技術者已知,且描述於例如Molecular Cloning,(2001),Sambrook及Russell編輯及Methods in Enzymology:Methods for molecular cloning in eukaryotic cells(2003)Purchio及G.C.Fareed。各核酸衍生物代表本發明之各別具體例。
在一個具體例中,本文中列出之任何胺基酸序列的蛋白質及/或肽同源性藉由此項技術中充分描述之方法,包括免疫墨點分析確定,或經由胺基酸序列之電腦演算法分析,利用可獲得之許多軟體套件中之任一者,經由已確立方法來確定。此等套件中之一些可包括FASTA、BLAST、MPsrch或Scanps套件,且可採用例如史密斯(Smith)及沃特曼(Waterman)演算法,及/或全域/局部或BLOCKS比對用於分析。各確定同源性之方法代表本發明之各別具體例。
在另一個具體例中,本發明提供一種包含用於進行本發明方法之試劑的套組。在另一個具體例中,本發明提供一種包含本發明之組成物、工具或儀器的套組。
在一個具體例中,術語「接觸」或「投予」係指使癌細胞或腫瘤與本發明之組成物直接接觸。在另一個具體例中,該等術語係指使癌細胞或腫瘤與本發明之組成物間接接觸。在另一個具體例中,本發明之方法包括以下方法,其中使個體與本發明之組成物接觸,其後藉由擴散或此項技術中已知之任何其他主動輸送或被動輸送過程(藉此使化合物在身體內迴圈)使該組成物與癌細胞或腫
瘤接觸。
在另一個具體例中,本發明之方法可包括至少單次投予本發明之組成物,其中在另一個具體例中,本發明之方法可包括多次投予本發明之組成物。各可能性代表本發明之各別具體例。
在一個具體例中,本發明提供以下方法,其中投予重組李斯特菌屬僅一次。在另一個具體例中,投予李斯特菌屬兩次。在另一個具體例中,投予李斯特菌屬三次。在另一個具體例中,投予李斯特菌屬四次。在另一個具體例中,投予李斯特菌屬超過四次。在另一個具體例中,投予李斯特菌屬多次。在另一個具體例中,以規律間隔投予李斯特菌屬,在一個具體例中,其可為每日、每週、每2週、每3週或每月。各可能性代表本發明之各別具體例。
在一個具體例中,本發明提供以下方法,其中投予放射療法僅一次。在另一個具體例中,投予放射療法兩次。在另一個具體例中,投予放射療法三次。在另一個具體例中,投予放射療法四次。在另一個具體例中,投予放射療法超過四次。在另一個具體例中,投予放射療法多次。在另一個具體例中,以規律間隔投予放射療法,在一個具體例中,其可為每日、每週、每2週、每3週或每月。各可能性代表本發明之各別具體例。
在一個具體例中,在投予重組減毒李斯特菌屬之前投予放射療法。在另一個具體例中,在首次投予重組減毒李斯特菌屬之前投予放射療法兩次。在另一個具體例中,在首次投予重組減毒李斯特菌屬之前投予放射療法三次。
在另一個具體例中,在投予放射療法之前投予重組減毒李斯特菌屬。在另一個具體例中,在首次投予放射療法之前投予
重組減毒李斯特菌屬兩次。在另一個具體例中,在首次投予放射療法之前投予重組減毒李斯特菌屬三次。
在另一個具體例中,術語「基因」及「重組基因」係指包含編碼本發明之多肽之開讀框的核酸分子。此類天然對偶基因變異可典型地在所給基因之核苷酸序列中導致1%-5%變異性。可藉由對多種不同個體或生物體中之相關基因進行定序來鑒別替代性對偶基因。此可容易地藉由使用雜交探針在多種個體或生物體中鑒別相同遺傳基因座來進行。任何及所有此類核苷酸變異及由天然對偶基因變化造成且並不改變功能活性之所得胺基酸多形現象或變異意欲處於本發明之範疇內。
醫藥組成物
熟練技術人員應瞭解,術語「免疫原性組成物」、「組成物」及「醫藥組成物」可互換地使用。亦應理解,如本文進一步提供,此類組成物之投予增強免疫反應,或提高T效應細胞與調節性T細胞比率或引起抗腫瘤免疫反應。
在另一個具體例中,本文提供之免疫原性組成物包含本文提供之重組李斯特菌屬。
在一個具體例中,「組合療法」係指本文所描述之放射療法與投予包含本文提供之重組李斯特菌屬的組成物結合或在投予該組成物之前投予的組合。
在另一個具體例中,含有本發明之疫苗及組成物的醫藥組成物藉由熟習此項技術者已知之任何方法向個體投予,諸如非經腸、癌旁、經黏膜、經皮、肌肉內、靜脈內、皮內、皮下、腹膜內、心室內、顱內、陰道內或瘤內。
在本文提供之方法及組成物的另一個具體例中,疫苗或組成物係經口投予,且因此調配成適於經口投予之形式,亦即固體或液體製劑。適合固體經口調配物包括錠劑、膠囊、丸劑、顆粒、球粒及其類似物。適合液體經口調配物包括溶液、懸浮液、分散液、乳液、油及其類似物。在本發明之另一個具體例中,活性成分調配成膠囊。根據此具體例,本發明之組成物除活性化合物及惰性載劑或稀釋劑之外亦包含硬明膠膠囊。
在另一個具體例中,藉由靜脈內、動脈內或肌肉內注射液體製劑投予疫苗或組成物。適合液體調配物包括溶液、懸浮液、分散液、乳液、油及其類似物。
在一個具體例中,醫藥組成物靜脈內投予,且因此以適用於靜脈內投予之形式調配。在另一個具體例中,醫藥組成物動脈內投予,且因此以適用於動脈內投予之形式調配。在另一個具體例中,醫藥組成物肌肉內投予,且因此以適用於肌肉內投予之形式調配。
在一個具體例中,本發明之組成物的重複投予(加強劑量)可緊隨第一治療時程進行或在數天、數週或數月之時間間隔之後進行以實現腫瘤消退。在另一個具體例中,重複劑量可緊隨第一治療時程進行或在數天、數週或數月之時間間隔之後進行以實現腫瘤生長抑制。評定可藉由此項技術中已知之任何技術測定,包括診斷方法,諸如成像技術、血清腫瘤標記物分析、生檢,或腫瘤相關症狀之存在、不存在或改善。
在一個具體例中,每1-2週、每2-3週、每3-4週、每4-5週、每6-7週、每7-8週或每9-10週向個體投予加強劑量以
便達成預期抗腫瘤反應。在一個具體例中,每1-2個月、每2-3個月、每3-4個月、每4-5個月、每6-7個月、每7-8個月或每9-10個月向個體投予加強劑量以便達成預期抗腫瘤反應。
在一個具體例中,術語「治療」係指治癒疾病。在另一個具體例中,「治療」係指預防疾病。在另一個具體例中,「治療」係指降低疾病發生率。在另一個具體例中,「治療」係指改善疾病症狀。在另一個具體例中,「治療」係指提高患者之無效能存活率或整體存活率。在另一個具體例中,「治療」係指穩定疾病進展。在另一個具體例中,「治療」係指誘發緩解。在另一個具體例中,「治療」係指減緩疾病進展。在另一個具體例中,術語「減少」、「遏制」及「抑制」係指減輕或降低。各可能性代表本發明之各別具體例。
如本文所用之術語「約」意謂在定量方面加或減5%,或在另一個具體例中,加或減10%,或在另一個具體例中,加或減15%,或在另一個具體例中,加或減20%。
熟練技術人員應瞭解,術語「個體」可涵蓋需要治療病狀或其後遺症之療法或對病狀或其後遺症敏感的哺乳動物,包括成人或人類兒童、少年或青年;且亦可包括非人類哺乳動物,諸如犬、貓、豬、牛、綿羊、山羊、馬、大鼠及小鼠。亦應瞭解術語可涵蓋家畜。術語「個體」不排除所有方面均正常之個體。
在一個具體例中,術語「個體」亦涵蓋無法經歷切除術之犬。在另一個具體例中,術語「個體」亦涵蓋無法經歷手術之人類。在另一個具體例中,術語「個體」亦涵蓋無法經歷切除術之人類。
熟練技術人員應瞭解,出於治療之目的,術語「哺乳
動物」係指歸類為哺乳動物之任何動物,包括(但不限於)人類、家禽家畜及農場動物、及動物園、運動、或寵物動物,諸如犬類,包括犬、及馬、貓、牛、豬、綿羊等。
在述及腫瘤之治療的情況下,「治療有效量」係指能夠引起下列效果中之一或多者的用量:(1)抑制腫瘤生長至某個程度,包括減緩生長或完全停止生長;(2)減少腫瘤細胞數目;(3)縮小腫瘤大小;(4)抑制(亦即減少、減慢或完全停止)腫瘤細胞浸潤入周邊器官;(5)抑制(亦即減少、減慢或完全停止)轉移;(6)提升抗腫瘤免疫反應,其可以但非必要導致腫瘤的消退或剔除;及/或(7)緩解病症相關的一或多種症狀至某個程度。處於治療腫瘤之目的,「治療有效量」的本文提供之疫苗可憑經驗確定且以例行方式確定。
在一個具體例中,用於本發明之方法中的組成物包含編碼代謝酶之第二開讀框,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因。在另一個具體例中,代謝酶補充重組李斯特菌屬菌株之染色體中缺乏的內源性基因。
在一個具體例中,「經突變」或「突變體」描述缺失。在另一個具體例中,「經突變」或「突變體」描述不活化。在另一個具體例中,「經突變」或「突變體」描述截短。在另一個具體例中,「經突變」或「突變體」描述添加。在另一個具體例中,「經突變」或「突變體」描述取代。在另一個具體例中,「經突變」或「突變體」描述插入過早終止密碼子。在另一個具體例中,「經突變」或「突變體」描述干擾基因表現的基因內一或多個核酸之變化。
在一個具體例中,「放射療法」或「放射線療法」係指在醫療上使用電離放射作為癌症治療之部分以控制或根除惡性
細胞。放射線療法可用於治癒、輔助或緩解性治療。適合類型之放射線療法包括習知外部射線放射線療法、立體定位放射療法(例如Axesse、Cyberknife、Gamma Knife、Novalis、Primatom、Synergy、X-Knife、TomoTherapy或Trilogy)、強度調節放射療法、粒子療法(例如質子療法)、近接療法(brachytherapy)、放射性同位素遞送、手術中放射線療法、歐傑療法(Auger therapy)、體積調節弧形療法(VMAT)、虛擬模擬、3維共形放射療法及強度調節放射療法等。應理解,此列表不欲為限制的。
在一個具體例中,放射療法使用高能放射縮小腫瘤及殺死癌細胞。在一個具體例中,X射線、γ射線及帶電粒子為可用於癌症治療之放射類型。在一個具體例中,放射療法藉由直接損傷癌細胞DNA,或藉由在細胞內產生可隨後破壞該DNA之自由基來損傷癌細胞DNA,將癌細胞殺死。
在一個具體例中,放射可藉由身體外之機器來遞送(外部射線放射療法),或在另一個具體例中,其可來自置放於身體中接近癌細胞處之放射性物質(內部放射療法,亦稱為近接療法)。
在一個具體例中,全身性放射療法使用在血液中行進之放射性物質(諸如放射性碘)來殺死癌細胞。
在一個具體例中,本發明提供一種用於伴隨治療放射不敏感性癌症(諸如骨肉瘤)之方法,該方法在需要較短放射治療時間之方案中用標準放射與免疫療法(諸如投予重組李斯特菌屬)組合來進行,因此減輕通常與放射治療相關聯之副作用。
在一個具體例中,放射根據本發明藉由標準技術用標準兆伏級設備(諸如AECL Theratron 80、Varian Clinac 4或Varian
Clinac)來投予。在一個具體例中,放射入口之最大大小應不超過300cm2。在一個具體例中,適合之劑量介於約15Gy與35Gy之間,其中特定劑量依賴於所治療身體區域。因此,對脊髓之劑量將為約35Gy,而對兩側腎臟之劑量將為約15Gy,且對整個肝臟之劑量為20Gy。療法之中斷由臨床醫師在考慮患者對放射療法之耐受性的情況下酌情處理。
在一個具體例中,放射劑量介於70-80Gy範圍內。在另一個具體例中,投予介於10-26GY範圍內之放射劑量。在另一個具體例中,對於成人男性,放射劑量為大約α/β=5.4Gy及μ=1.73Gy-1。
在一個具體例中,本發明中所描述之放射療法為姑息性放射療法。在一個具體例中,放射療法可出於姑息性意圖而給予。在一個具體例中,姑息性治療意欲減輕症狀及減少由癌症或一或多種腫瘤造成之痛苦而非治癒該癌症或腫瘤。
為了更充分說明本發明之較佳具體例,呈現以下實施例。然而,其絕不應詮釋為限制本發明之廣義範圍。
材料及方法
寡核苷酸由Invitrogen(Carlsbad,CA)合成且由Genewiz Inc,South Plainfield,NJ進行DNA定序。流動式細胞量測試劑購自Becton Dickinson Biosciences(BD,San Diego,CA)。除非指出,否則細胞培養基、補充劑及全部其他試劑均來自Sigma(St.Louise,MO)。Her-2/neu HLA-A2肽由EZbiolabs(Westfield,IN)合成。
完全RPMI 1640(C-RPMI)培養基含有2mM麩醯胺酸、0.1mM非必需胺基酸及1mM丙酮酸鈉、10%胎牛血清、青黴素/鏈黴素、Hepes(25mM)。多株抗-LLO抗體在上文描述且抗-Her-2/neu抗體購自Sigma。
小鼠及細胞株
全部動物實驗根據University of Pennsylvania或Rutgers University的IACUC批准之方案進行。FVB/N小鼠購自傑克遜實驗室(Bar Harbor,ME)。過度表現大鼠Her-2/neu致癌蛋白之FVB/N Her-2/neu轉殖基因小鼠在University of Pennsylvania之動物核心設施圈養及飼養。NT-2腫瘤細胞株表現高水準之大鼠Her-2/neu蛋白,源自此等小鼠中之自發乳房腫瘤且如上文所描述生長。DHFR-G8(3T3/neu)細胞獲自ATCC且根據ATCC建議生長。EMT6-Luc細胞株為John Ohlfest博士(University of Minnesota,MN)大方贈予的禮物且在完全C-RPMI培養基中生長。在University of Pennsylvania(Philadelphia,PA)的Small Animal Imaging Facility(SAIF)指導下進行生物發光工作。
李斯特菌屬構築體及抗原表現
Her-2/neu-pGEM7Z由University of Pennsylvania的Mark Greene博士友情提供且含有選殖至pGEM7Z質體(Promega,Madison WI)中之全長人類Her-2/neu(hHer2)基因。此質體用作範本以藉由PCR使用表1中指示之pfx DNA聚合酶(Invitrogen)及寡核苷酸擴增hHer-2/neu之三個區段(亦即EC1、EC2及IC1)。
表2:用於選殖人類her-2-嵌合體之引子
藉由SOEing PCR方法直接融合且各獨立hHer-2/neu區段作為範本產生Her-2/neu嵌合體構築體。引子顯示於表3中。
用於擴增不同區段人類Her2區域之引子序列
使用XhoI及SpeI限制酶自pAdv138切除ChHer2基因,且與Lmdd穿梭載體pAdv134中之LLO的截短非溶血性片段同框選殖。藉由DNA定序分析確認插入物LLO及hly啟動子的序列。此質體電穿孔至電勝任actA、dal、dat突變體單核球增多性李斯特菌菌株中,在含有鏈黴素之腦心浸出液(BHI)瓊脂培養盤上選擇LmddA及陽性殖株(250μg/ml)。在一些實驗中,表現hHer-2/neu(Lm-hHer2)片段之類似李斯特菌屬菌株用於比較目的。此等內容皆為先前已述。在全部研究中,包括不相關李斯特菌構築體(Lm-對照)來解釋李斯特菌對免疫系統的非抗原依賴性作用。Lm-對照係基於與ADXS31-164相同的李斯特菌屬平臺,但表現不同抗原,諸如HPV16-E7或NY-ESO-1。測試李斯特菌屬對融合蛋白之表現及分泌。各構築體活體內繼代兩次。
細胞毒性分析
3-5隻FVB/N小鼠之組以1週時間間隔用1×108菌落形成單位(CFU)之Lm-LLO-ChHer2、ADXS31-164、Lm-hHer2 ICI或Lm-對照(表現不相關抗原)免疫三次或保持未經處理。NT-2細胞活體外生長,藉由胰蛋白酶剝落且在37℃下用絲裂黴素C(無血清C-RPMI培養基中250μμg/ml)處理45分鐘。洗滌5次後,其與自經免疫接種或未處理動物採集的脾細胞以1:5之比率(刺激劑:反應劑)一起在37℃及5% CO2下培育5天。根據上述方法使用銪標記之3T3/neu(DHFR-G8)細胞作為標靶進行標準細胞毒性分析。在培育4小時後使用分光光度計(Perkin Elmer,Victor2)在590nm下量測自殺死之標靶細胞釋放的銪。比溶胞率百分比定義為(實驗組中之溶解-自發溶解)/(最大溶解-自發溶解)。
來自經免疫接種小鼠之脾細胞的幹擾素-γγ分泌
3-5隻FVB/N或HLA-A2轉殖基因小鼠之組以1週時間間隔用1×108CFU之ADXS31-164(陰性 李斯特菌屬對照,表現不相關抗原)免疫接種三次或保持未處理。在最後一次免疫之後一週自FVB/N小鼠分離脾細胞且在24孔培養盤中在絲裂黴素C處理之NT-2細胞存在下在C-RPMI培養基中以5×106個細胞/孔共同培養。來自HLA-A2轉殖基因小鼠之脾細胞在1μμM HLA-A2特異性肽或1μμg/ml重組His標記之ChHer2蛋白存在下培育,在大腸桿菌中產生且藉由基於鎳之親和性層析系統純化。24或72小時後自上清液獲得樣品且根據製造商之建議使用小鼠幹擾素-γγ(IFN-γγ)酶聯結免疫吸附分析(ELISA)套組測試IFN-γγ之存在。
INF-γ ELISpot分析
使來自各指定時間點之冷凍保存PBMC解凍,在37℃下靜置隔夜,且隨後計數。用2.5uM重疊人類Her-2/neu肽集合體(重疊5個胺基酸之11聚物,其表示存在於嵌合疫苗中之Her-2/neu的EC1、EC2及IC1結構域)及重組人類IL-2(Invitrogen,Fredrick,MD)刺激細胞持續5天。採集細胞,在1×PBS中洗滌兩次,且計數。根據製造商之方案使用商業犬類IFN-γ ELISpot分析套組(R&D Systems,Minneapolis,MN)進行IFN-γ ELISpot分析。簡言之,將0.8-2×105個經刺激之細胞與2.5uM EC1、EC2或IC1肽集合體加IL-2或單獨IL-2(測定背景計數)一起培育。所有分析一式兩份進行。根據製造商之說明書使培養盤顯影。使用CTL-Immunospot分析器(C.T.L,Shaker Heights,OH)對點進行計數。藉由減去在未經刺激之孔中計數之點數目的兩倍來對點數目進行
正規化。
Her2轉殖基因動物中之腫瘤研究
6週齡FVB/N大鼠Her-2/neu轉殖基因小鼠(9-14隻/組)用5×108CFU Lm-LLO-ChHer2、ADXS31-164或Lm-對照免疫接種6次。1週兩次觀測其自發性乳房腫瘤之出現,使用電子測徑規量測達52週。當腫瘤的平均直徑達到1cm2之尺寸時切除逃逸腫瘤且保存於RNAlater中-20°℃下。為判斷Her-2/neu蛋白中之突變對此等腫瘤逃逸之作用,使用基因組DNA分離套組提取基因組DNA且定序。
ADXS31-164對脾臟及腫瘤中之調節性T細胞的作用
向小鼠皮下植入(s.c.)1×106 NT-2細胞。在第7天、第14天及第21天,將其用1×108CFU ADXS31-164、LmddA-對照免疫接種或保持未處理。在第28天提取腫瘤及脾臟且藉由FACS分析測試CD3+/CD4+/FoxP3+ Tregs之存在。簡言之,藉由在C-RPMI培養基中的兩個蓋玻片之間均質化脾臟來分離脾細胞。使用無菌剃刀片絞碎腫瘤且用含有PBS中的DNase(12U/ml)及膠原蛋白酶(2mg/ml)之緩衝液消化。在室溫下在攪拌下培育60分鐘後,藉由劇烈吸液分離細胞。藉由RBC溶解緩衝液溶解紅血球,隨後用含有10% FBS之完全RPMI-1640培養基洗滌若干次。經尼龍篩網過濾後,將腫瘤細胞及脾細胞再懸浮於FACS緩衝液(2% FBS/PBS)中且用抗-CD3-PerCP-Cy5.5、CD4-FITC、CD25-APC抗體染色,隨後滲透及用抗Foxp3-PE染色。使用4色FACS calibur(BD)進行流式細胞量測分析且使用細胞探索軟體(BD)分析資料。
統計學分析
存活資料使用對數秩卡方測試(log-rank Chi-Squared test)且CTL及ELISA分析使用史都登氏t檢驗,CTL及ELISA分析重複進行三次。小於0.05之p值(標記為*)在此等分析中視為統計顯著。全部統計分析均使用Prism軟體,4.0a版(2006)或SPSS軟體,15.0版(2006)進行。除非另外規定,否則對於全部FVB/N大鼠Her-2/neu轉殖基因研究,吾人使用每組8-14隻小鼠,對於全部野生型FVB/N研究,吾人使用每組至少8隻小鼠。全部研究重複至少一次,但Her-2/neu轉殖基因小鼠模型中進行長期腫瘤研究。
嵌合型Her-2/neu基因(ChHer2)之構築係如先前描述。簡言之,藉由SOEing PCR方法直接融合Her-2/neu蛋白之兩個細胞外(aa 40-170及aa 359-433)及一個細胞內片段(aa 678-808)產生ChHer2基因。嵌合蛋白具有該蛋白質之大部分已知人類MHC I類抗原決定基。ChHer2基因自質體pAdv138(用於構築Lm-LLO-ChHer2)切除且選殖至LmddA穿梭質體中,產生質體pAdv164(圖1A)。此兩種質體主鏈之間存在兩種主要差異。1)雖然pAdv138使用氯黴素抗性標記物(cat)用於活體外選擇重組細菌,但pAdv164具有來自枯草芽孢桿菌之D-丙胺酸消旋酶基因(dal),其在缺乏dal-dat基因之LmddA菌株中使用代謝補充路徑用於活體外選擇及活體內質體保留。此疫苗平臺經設計及開發以解決關於工程改造之李斯特菌屬疫苗菌株的抗生素抗性之FDA問題。2)不同於pAdv138,pAdv164在質體中不具有prfA基因之複本(參看下文及圖
1A中之序列),因為此對於Lmdd菌株之活體內補充而言並非必要。LmddA疫苗菌株亦缺乏actA基因(負責李斯特菌之胞內移動及細胞至細胞擴散),因此源自此主鏈之重組疫苗菌株的毒性比源自其親本菌株Lmdd的毒性低100倍。基於LmddA之疫苗比基於Lmdd之疫苗從經免疫接種小鼠之脾臟清除起來亦快得多(小於48小時)。活體外生長8小時後,融合蛋白tLLO-ChHer2自此菌株之表現及分泌與TCA沈澱之細胞培養物上清液中的Lm-LLO-ChHer2相當(圖1B),因為使用西方墨點分析藉由抗LLO抗體偵測到約104KD之條帶。僅表現tLLO之李斯特菌屬主鏈菌株用作陰性對照。
pAdv164序列(7075個鹼基對)(參見圖1):
(SED ID NO:53)
在標準CTL分析中,ADXS31-164在產生抗-Her-2/neu特異性細胞毒性T細胞中之免疫原性特性與Lm-LLO-ChHer2疫苗比較。兩種疫苗皆引起強而相當的對3T3/neu標靶細胞表現之
Her-2/neu抗原的細胞毒性T細胞反應。因此,用僅表現與LLO融合之Her2-胞內片段之李斯特菌免疫接種之小鼠顯示溶解活性比含有更多MHC I類抗原決定基之嵌合體低。未處理動物或注射不相關李斯特菌屬疫苗之小鼠中未偵測到CTL活性(圖2A)。ADXS31-164亦能夠刺激來自野生型FVB/N小鼠之脾細胞的IFN-γγ分泌(圖2B)。此在與絲裂黴素C處理之NT-2細胞共同培養的此等細胞之培養物上清液中偵測到,該等絲裂黴素C處理之NT-2細胞表現高含量之Her-2/neu抗原(圖5C)。
在HLA-A2小鼠中測試用ADXS31-164免疫接種後人類MHC I類抗原決定基之適當處理及呈現。來自經免疫接種HLA-A2轉殖基因之脾細胞與對應於位於Her2/neu分子的細胞外(HLYQGCQVV SEQ ID NO:11或KIFGSLAFL SEQ ID NO:12)或細胞內(RLLQETELV SEQ ID NO:13)結構域之定位之HLA-A2限制抗原決定基的肽共同培育72小時(圖2C)。重組ChHer2蛋白用作陽性對照且不相關肽或無肽用作陰性對照。此實驗之資料顯示ADXS31-164能夠引起針對位於標靶抗原不同結構域之人類抗原決定基的抗-Her-2/neu特異性免疫反應。
在20-25週齡時產生緩慢生長之自發性乳房腫瘤的Her-2/neu轉殖基因動物中比較ADXS31-164之抗腫瘤作用與Lm-LLO-ChHer2之抗腫瘤作用。使用不相關李斯特菌屬對照疫苗免疫接種的全部動物均在第21週-第25週內產生乳房腫瘤且在第33
週之前處死。相比之下,李斯特菌屬-Her-2/neu重組疫苗引起乳房腫瘤形成的顯著延遲。在第45週,相較於用Lm-LLO-ChHer2免疫接種之小鼠的25%無腫瘤,超過50% ADXS31-164免疫接種小鼠(9隻中5隻)仍無腫瘤。第52週時,8隻用ADXS31-164免疫接種之小鼠中的2隻仍無腫瘤,而其他實驗組之全部小鼠已病死(圖3)。此等結果表明儘管減毒更多,但ADXS31-164比Lm-LLO-ChHer2更有效地防止Her-2/neu轉殖基因動物中自發性乳房腫瘤發作。
已認為用小片段疫苗或曲妥珠單抗(Herceptin)免疫接種後Her-2/neu之MHC I類抗原決定基的突變造成腫瘤逃逸,曲妥珠單抗為一種靶向Her-2/neu之細胞外結構域中的抗原決定基之單株抗體。為對此進行評定,自轉殖基因動物中的逃逸腫瘤提取基因組物質且將用嵌合或對照疫苗免疫接種之腫瘤中之neu基因的相應片段定序。任何疫苗接種之腫瘤樣品之Her-2/neu基因內未觀測到突變,表明另外的逃逸機制(資料未顯示)。
為說明ADXS31-164對脾臟及腫瘤中的調節性T細胞頻率之作用,向小鼠植入NT-2腫瘤細胞。在免疫接種三次後分離脾細胞及腫瘤內淋巴細胞且針對Tregs染色,Tregs定義為CD3+/CD4+/CD25+/FoxP3+細胞,不過各別分析時使用FoxP3或CD25標記物獲得相當結果。結果表明與不相關李斯特菌屬疫苗或未處理動物相比,用ADXS31-164免疫接種對脾臟中的Tregs之頻率無作
用(參見圖4)。相比之下,用李斯特菌屬疫苗免疫接種對腫瘤中Tregs之存在產生顯著影響(圖5A)。雖然未處理之腫瘤中的全部CD3+ T細胞中平均19.0%為Tregs,但不相關疫苗之此頻率降低至4.2%且ADXS31-164降低至3.4%,腫瘤內Tregs之頻率降低5倍(圖5B)。用任一LmddA疫苗處理之小鼠的腫瘤內Tregs頻率之降低可能不歸因於腫瘤尺寸之差異。在代表性實驗中,來自用ADXS31-164免疫接種之小鼠的腫瘤顯著小於[平均直徑(mm)±SD,6.71±0.43,n=5]來自未處理之小鼠的腫瘤(8.69±0.98,n=5,p<0.01)或用不相關疫苗處理之小鼠的腫瘤(8.41±1.47,n=5,p=0.04),而此後兩組之比較顯示腫瘤尺寸無統計顯著差異(p=0.73)。用LmddA疫苗處理之腫瘤中Tregs的較低頻率導致瘤內CD8/Tregs比率增加,表明用LmddA疫苗免疫接種後可獲得更有利的腫瘤微環境。然而,僅表現標靶抗原Her-2/neu之疫苗(ADXS31-164)能夠降低腫瘤生長,表明Tregs中之降低僅在腫瘤中存在抗原特異性反應下有作用。
採集用諸如Lm-LLO-138、LmddA164及不相關疫苗Lm-LLO-NY之不同疫苗免疫接種之小鼠的腫瘤樣品。自此等樣品純化DNA且擴增對應於Her-2/neu區域IC1、EC1及EC2之DNA片段且進行定序以測定是否存在任何免疫逃逸突變。使用CLUSTALW進行各DNA之序列比對。分析結果指示在自腫瘤採集之DNA序列中不存在突變。參考序列列於以下:EC2(Her-2-neu之975-1029bp)的比對
GGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTGTGA
GAAATGCAGCAAGCCCTGTGCT(SEQ ID NO:14)
CGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGAC(SEQ ID NO:15)
AATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAG(SEQ ID No:16)
AGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTG(SEQ ID No:17)
TTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCAGACAGTCTC(SEQ ID NO:18
CGTGACCTCAGTGTCTTCCAGAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGC(SEQ ID NO:19)
GCGTACTCATTGACACTGCAAGGCCTGGGGATCCACTCGCTGGGGCTGCGCTCACTGCGG(SEQ ID NO:20)
GAGCTGGGCAGTGGATTGGCTCTGATTCACCGCAACGCCCATCTCTGCTTTGTACACACT(SEQ ID NO:21)
GTACCTTGGGACCAGCTCTTCCGGAACCCACATCAGGCCCTGCTCCACAGTGGGAACCGG(SEQ ID NO:22)
CCGGAAGAGGATTGTGGTCTCGAGGGCTTGGTCTGTAACTCACTGTGTGCCCACGGGCAC(SEQ ID NO:23)
TGCTGGGGGCCAGGGCCCACCCAGTGTGTCAACTGCAGTCATTTCCTTCGGGGCCAGGAG(SEQ ID NO:24)
IC1(Her-2-neu之2114-3042bp)的比對
CGCCCAGCGGAGCAATGCCCAACCAGGCTCAGATGCGGATCCTAAAAGAGACGGAGC(SEQ ID NO:25)
TAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA(SEQ ID NO:26)
TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT(SEQ ID NO:27)
CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC(SEQ ID NO:28)
CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC(SEQ ID NO:29)
TTATGGCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC(SEQ ID NO:30)
AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC(SEQ ID NO:31)
GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA(SEQ ID NO:32)
AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG(SEQ ID NO:33)
ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA(SEQ ID NO:34)
CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG(SEQ ID NO:35)
CCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA(SEQ ID NO:36)
CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT(SEQ ID NO:37)
GGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTT(SEQ ID NO:38)
CACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTT(SEQ ID NO:39)
EC1(Her-2-neu之399-758bp)的比對
CCCAGGCAGAACCCCAGAGGGGCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGTCTCACAGAGATCCT(SEQ ID NO:40)
GAAGGGAGGAGTTTTGATCCGTGGGAACCCTCAGCTCTGCTACCAGGACATGGTTTTGTG(SEQ ID NO:41)
CCGGGCCTGTCCACCTTGTGCCCCCGCCTGCAAAGACAATCACTGTTGGGGTGAGAGTCC(SEQ ID NO:42)
GGAAGACTGTCAGATCTTGACTGGCACCATCTGTACCAGTGGTTGTGCCCGGTGCAAGGG(SEQ ID NO:43)
CCGGCTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCCGCAGGCTGCACGGGCCCCAAGCA(SEQ ID NO:44)
小鼠用ADXS31-164或不相關Lm-對照疫苗腹膜內免疫接種且隨後顱側內植入5,000個表現螢光素酶及低含量Her-2/neu之EMT6-Luc腫瘤細胞(圖6C)。接種後不同時間藉由麻醉小鼠離體成像監測腫瘤。腫瘤接種後第8天,偵測全部對照動物中之腫瘤,但ADXS31-164組中之小鼠均未顯示任何可偵測腫瘤(圖6A及B)。ADXS31-164可明確延遲此等腫瘤之發作,因為在腫瘤接種後第11
天,陰性對照中之全部小鼠均已罹患其腫瘤,但ADXS31-164組中之全部小鼠仍存活且僅顯示腫瘤生長之微小跡象。此等結果有力表明周邊投予ADXS31-164獲得之免疫反應可到達中樞神經系統且基於LmddA之疫苗可具有用於治療CNS腫瘤之可能性。
犬類骨肉瘤為長(腿)骨癌症,其為惡年齡超過10歲之大型犬的主要死因。標準治療為緊接在診斷之後進行切除術,繼而進行化學療法。然而,癌症始終向肺轉移。與在無治療的情況下存活6-12個月相比較,在用化學療法的情況下,犬存活約18個月。咸信HER2抗原存在于高達50%之骨肉瘤中。ADXS31-164在表現此抗原之細胞上產生免疫攻擊,且已經開發以治療人類乳癌。
具有骨肉瘤之組織學診斷及惡性細胞表現HER2/neu之證據的犬符合入選條件。
在第一方案中,切除肢體,繼而進行一輪化學療法治療。隨後投予3次劑量之Her-2疫苗,且投予或不投予6個月時間間隔之加強劑。
所有犬將接受4週卡鉑療法。在最後卡鉑給藥之後4週時,犬將每3週一次接受ADXS-HER2,持續總計3次劑量。第1組(3隻犬)接受每劑量1×108CFU,第2組(3隻犬)各自接受每劑量5×108CFU,且第3組(3隻犬)接受每劑量1×109CFU。若觀測到潛在劑量限制性毒性,則向組中添加額外犬以獲得更多資料。因此,在初步研究中可治療9-18隻犬。
在第二方案中,除了在化學療法之前(之前1個月時)僅投予單次劑量之疫苗,重複與第一方案相同的內容持續總計4次劑量。
此外,在兩個方案中,在化學療法之後一個月時投予單次劑量。
進行試點I期劑量遞增研究以確定可在患有骨肉瘤之犬中安全且有效地刺激腫瘤特異性免疫性的表現人類Her-2/neu重組疫苗之單核球增多性李斯特菌之劑量。常規地採集由於疑似或確認OSA而提供給PennVet進行肢體切除術之所有犬的腫瘤,且在組織病理學上進行評估以確認OSA之診斷。另外,藉由IHC及西方墨點分析評估來自所有犬之腫瘤切片以確定腫瘤是否表現Her-2/neu。僅具有OSA之組織學診斷及惡性細胞表現Her-2/neu之證據的犬符合入選條件。對在手術時取得之腫瘤組織的單細胞懸浮液進行冷凍保存,且在鉻釋放分析中用作自體腫瘤標靶以測定抗腫瘤免疫性。
高達18隻患有附肢OSA且確認表現Her2-neu之私有犬入選(圖7)。在入選(最後一次卡鉑治療後3週)時,所有犬接受基本臨床實驗室測試,包括全血球計數(CBC)、化學篩選(CS)及尿分析(UA),且藉由心動回聲圖接受基線心臟功能評估且量測心臟特異性肌鈣蛋白I(cTnI)水準。取得胸科放射照片以確定是否存在肺部癌轉移。僅無肺部癌轉移證據之犬符合包括於研究中之條件。在入
選時,收集周邊血液單核細胞(PBMC)以評定基線抗腫瘤免疫性水準(參見抗腫瘤免疫性評定)。此外,取得血液以評估基線免疫功能以確保其不再受卡鉑免疫遏制。僅具有功能完整免疫系統之犬符合接受李斯特菌屬疫苗之條件。
Lm重組給藥及資料擷取
使用單次Lm-huHer-2/neu重組疫苗對所有犬進行疫苗接種。在最後一次卡鉑給藥之後3週時給予首次Lm-huHer2-neu疫苗,且在此之後每3週給予一次,持續總計3次劑量(圖7)。
第1組(3隻犬)接受每劑量1×108CFU之ADXS31-164(Lm-hucHer-2/neu)疫苗,第2組(3隻犬)各自接受每劑量5×108CFU,第3組(3隻犬)接受每劑量1×109CFU,及每劑量3.3×109CFU(1隻犬)。以緩慢靜脈內輸注形式歷經30分鐘投予重組Lm。對第1組選擇之劑量為在小鼠中對嵌合huHer-2/neu重組體確立之安全劑量。在人類中,Lm-LLO-E7之無毒性劑量僅比在小鼠中確立之劑量高10倍,且此劑量為在此試點試驗中第3組中評估之劑量。
在Lm投予時,監測犬中全身性不良效應之證據。在輸注期間,藉由ECG監測心跳速率及節律,且記錄呼吸速率。此外,使用超聲且藉由量測肌鈣蛋白I水準來監測心臟損害(圖8)。在輸注後,密切監測犬持續48小時。在輸注後使用MiniMitter Respironics之Vital Sense連續體溫監測系統(在吾人之獸醫學臨床試驗中心(VCIC)中常規使用)連續地監測核心體溫持續<12小時。監測脈搏率、節律及品質、呼吸速率及費力程度,且每小時記錄持續最初6小時,接著此後每4小時記錄,以及監測血壓及溫度(圖9)。注意所有與免疫刺激相符之症狀,且視需要使用流體、鎮痛劑、抗
催吐藥及抗組胺藥來控制嚴重反應。一天六次觀測所有犬,且記錄重組體之毒理學效應的任何跡象,包括不適、昏睡、噁心、嘔吐及腹瀉。在首次ADXS31-164疫苗之後的24、48及72小時取得血液樣品用於培養,以評定Lm在全身性投予之後的清除率。
抗腫瘤免疫性之評定
在最後一次卡鉑劑量後3週時,犬接受例行臨床檢查及基線血液研究,包括CBC、CS、UA及cTnI水準。此時取得PBMC用於基線抗腫瘤免疫性評估。在各疫苗接種時及在最後一次疫苗接種之後3週時進行重複免疫評定。如下文所概述,藉由CFSE增殖、細胞激素產生(ELISpot及qRT-PCR)及CTL分析針對自體腫瘤標靶分析PBMC之Her-2/neu特異性T細胞反應(圖12)。
迄今為止,吾人已在16隻犬中進行總計41次ADXS31-164輸注。
ADXS31-164劑量範圍為1×108、5×108、1×109及3.3×109CFU。
疫苗投予之標準操作程序
開發出用於投予ADXS31-164之標準操作程序。在疫苗接種之前的一小時,患者經由肌肉內注射接受2mg/kg苯海拉明(diphenhydramine)且以緩慢靜脈內推送接受0.2mg/kg昂丹司瓊(ondansetron)。將疫苗保持在-80℃下,且在患者旁邊解凍。其歷經30分鐘在200ml 0.9% NaCl中投予。隨後用30ml Plasmalyte沖洗輸注管線。以三天療程之阿莫西林(amoxicillin)(在疫苗接種後的72小時起始)及7天療程之肝臟補充劑(S-腺苷-甲硫胺酸)(有助於細胞生長及修復)將犬送回家。
研究之主要終點為確定ADXS31-164之最大耐受劑量。
在體重介於25kg至67kg範圍內之犬中,高達3.3×109之劑量具有良好耐受性。所報導之所有副作用為I級別毒性,且尚未達至最大耐受劑量。副作用在疫苗投予2-4小時內常規地發生。通常用以維持速率(4毫升/公斤/小時)持續2-4小時靜脈內遞送之等滲流體使高熱消退。在其中發熱達至104.7及高於104.7之兩個情況中,單次皮下注射卡洛芬(carprofen)在1-2小時內誘導溫度正常。噁心及嘔吐通常為自限性的,但在其中注意到數次發作的情況下,投予1mg/kg止吐寧(cerenia),且此對預防進一步噁心及嘔吐極有效。總計5隻犬在疫苗投予48小時內出現輕度I級肝臟酶升高,此等升高在疫苗接種後1週內消退。
李斯特菌屬 之清除率
在對所有16隻經疫苗接種之犬進行血液培養至今之
後,在疫苗接種之後的24小時,在任何犬之周邊迴圈中不存在可偵測之李斯特菌屬。不評定李斯特菌屬在經疫苗接種之犬之尿液及糞便中的排出。
研究之次要終點為無進展存活期及整體存活期。當在肢體切除術及4次劑量之卡鉑之後投予ADXS31-164時,已在患有骨肉瘤之犬中觀測到統計學上顯著之整體存活期優勢。來自前兩個劑量組(6隻犬)之早期結果顯示,與所有者選擇不參與試驗但追蹤存活率之6隻犬相比較,在接受ADXS31-164之犬中有顯著存活期優勢(p=0.003)(圖13)。未接種疫苗之犬的平均存活時間為239.5天。經疫苗接種之犬的平均存活時間卻尚未達到。當意向治療組內之所有犬均包括于分析中時,此仍保持不變。
總之,不存在對心血管、造血、肝或腎系統具有顯著短期或長期副作用之證據。此外,在存在微小殘留病的情況下投予ADXS31-164可延遲/預防轉移性疾病及延長患有Her-2/neu陽性骨肉瘤之犬的整體存活期。
疫苗製造
設計及產生ADXS31-164。簡言之,用載有嵌合人類HER2/neu構築體之pADV質體轉染單核球增多性李斯特菌(Lm)之dal dat actA突變體菌株。構築體含有與截短李斯特菌溶胞素O構築體融合之人類HER2/neu分子中含有大部分HLA-A2受限制免疫顯性抗原決定基的2個細胞外結構域(EC1及EC2)及一個細胞內結
構域(IC1)。轉移質體亦含有芽孢桿菌屬p60 dal基因,且經由營養缺陷型補充維持在突變體Lm內。不存在細菌抗性卡匣。疫苗由Vibalogics GmbH(Cuxhaven,Germany)製造,且在使用之前儲存在-80℃下。
組織病理學、分期及免疫組織化學
由委員會註冊之獸醫病理學家(J.E.)進行所有原發性附肢骨肉瘤腫瘤之組織病理學評定。基於組織學特徵將腫瘤描述為骨母細胞、軟骨母細胞、纖維母細胞及毛細管擴張性的。基於有絲分裂指數、核多形性及基質及壞死存在量對原發性腫瘤進行評分。將組織學評分轉化成級別(I、II或III)。
對於HER2/neu染色,將經福馬林固定、脫鈣、石蠟包埋之組織的5微米厚連續切片安裝在帶負電玻璃載片上。將切片在80℃下加熱20分鐘,浸入在Pro Par(clearant)中且在乙醇中複水。藉由在檸檬酸鈉緩衝液(pH約9.0)中煮沸切片來進行抗原修復(antigen retrieval)。使用3%過氧化氫阻斷內源性過氧化酶。用兔抗人類HER2/neu抗體(Neu(c-18):sc-284,Santa Cruz Biotecnology)或兔IgG同型(通用陰性對照血清,NC498,Biocare Medical)進行染色。使用通用抗生蛋白鏈菌素-生物素2(Streptavadin-Biotin2)系統(DAKO/LSAB2,HRP)偵測經結合抗體。用3,3'-二胺基聯苯胺溶液(DAKO)對組織進行染色,且用蘇木精(hematoxylin)進行對比染色。使用Nikon E600無限校正立式顯微鏡查看載片。使用Nikon Digital Sight DS-Fil彩色相機獲得亮場影像,且使用NIS-Element BR3.0進行影像分析。由委員會註冊之病理學家(J.E.)評估組織切片且對HER2/neu陽性進行評分,該評分係基於贅生性細胞HER2/neu染色
之百分比(<10%=1,10%-50%=2,>50%=3)及HER2/neu染色強度(弱=1,中度=2,強=3)。評分係基於在10hpf內對各組織切片分析之細胞。藉由將對HER2/neu染色呈陽性之腫瘤細胞之百分比及HER2/neu染色強度給出的兩個單獨評分相乘來獲得組合HER2/neu評分。僅大於10%之腫瘤細胞對HER2/neu染色陽性的犬符合試驗入選條件。
合格準則及臨床試驗設計
已藉由肢體切除術或保肢手術(limb-sparing surgery)進行原發性腫瘤移除且已接受每3週給予一次(或若發生骨髓抑制,則每4週給予一次)之4個劑量之300mg/m2卡鉑作為輔助化學療法的組織病理學及免疫組織化學診斷為HER2/neu陽性OSA之犬符合篩選條件。在其最後一次卡鉑治療之後3週時篩選犬。進行徹底身體檢查、全血球計數(CBC)、化學篩選(CS)及尿分析(UA)來確定一般健康狀況。分別使用流動式細胞量測術嗜中性白血球氧化性破裂分析及有絲分裂原誘導之淋巴細胞增殖分析來測試基本先天性及適應性免疫功能。藉由心電描記法、心動回聲圖及血清心臟肌鈣蛋白I水準評估基線心臟狀態。進行胸科放射照片以確定肺部轉移性疾病之存在(參見圖14B)。僅發現全身健康且具有完整先天性及適應性免疫功能、無潛在心臟疾病證據且無肺部轉移性疾病證據的彼等犬符合入選條件。在研究時程期間死亡之犬經歷屍檢。記錄轉移性疾病之存在及位置,且進行組織病理學及免疫組織化學以評估轉移性病變中之HER2/neu表現。
免疫分析
嗜中性白血球氧化性破裂分析:使用0.83% NH4Cl
使肝素鈉抗凝結血液中之紅血球溶解,且在1×PBS中洗滌剩餘白血球兩次。用15ug/ml二氫若丹明123(DHR-123;Molecular Probes,Grand Island,NY)標記細胞,且在37℃下用3nM佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA,Sigma,St.Louis,MO)使其活化30分鐘。將細胞置放於冰上持續15分鐘,隨後進行流動式細胞量測分析。在FACS Canto細胞計數器(BD Biosciences,San Jose,CA)上獲得細胞,且使用FloJo軟體(Treestar,San Carlos,CA)加以分析。
淋巴細胞增殖分析:藉由密度離心自肝素鈉抗凝結全血分離周邊血液單核細胞(PBMC)。在1×PBS中洗滌PBMC兩次,且計數。在37℃下用5uM CFSE標記細胞且用1.25uM伴刀豆球蛋白A刺激5天。採集細胞,在FACS緩衝液中洗滌兩次,用APC結合之大鼠抗犬類CD4及PE結合之大鼠抗犬類CD8抗體(Serotec,Raleigh,NC)標記且藉由流動式細胞量測術來分析。對於免疫功能分析,獲自健康群落犬(IACUC #804197)之周邊血液用作陽性對照。
T細胞亞群分析:分析在基線、在各疫苗接種之前、在再分級時及在此後每2個月取得之PBMC的CD4及CD8T細胞亞群。簡言之,使冷凍保存之細胞解凍,且在FACS緩衝液(1×PBS,0.2% BSA級分V及4mM疊氮化鈉)中洗滌兩次,隨後用小鼠抗犬類CD3、PE標記之大鼠抗犬CD8或Alexa標記之大鼠抗犬CD4(Serotec,Raleigh,NC)進行表面染色。將細胞與活體染料7-ADD一起培育,隨後立即進行流動式細胞量測獲取。自流動式細胞量測百分比計算總CD4+及CD8+ T細胞數目,且使用Cell Dyn 3700CS血液學分析器測定總淋巴細胞計數。
疫苗投予
在疫苗接種之前,犬靜脈內接受5HT3拮抗劑昂丹司瓊(0.2mg/kg)且肌肉內接受H1受體阻斷劑苯海拉明(2mg/kg)以分別預防噁心及全身性過敏反應。採用標準3+3臨床試驗設計。以以下劑量投予ADXS31-164;第1組(2×108CFU),第2組(5×108CFU),第3組(1×109CFU)及第4組(3.3×109CFU)。在100ml 0.9% NaCl(第1組及第2組)及200ml 0.9% NaCl(第3組及第4組)中稀釋ADXS31-164,且歷經30分鐘靜脈內投予。在輸注後每小時監測溫度、脈搏、呼吸速率、心跳速率及節律(藉由EKG)及血壓。在其中體溫超過103℉的情況下,對犬進行4ml/kg/hr靜脈內Plasmalyte,直至其溫度下降至低於103℉為止。每小時監測犬之昏睡、噁心或嘔吐跡象。疫苗接種後24小時及1週時抽取血液樣品以評定血液學或生物化學參數中之任何變化,且在疫苗接種後的24小時進行血液培養以確定血流中活細菌之持久性。所有犬在疫苗接種之後的72小時接受短療程之阿莫西林及S-腺苷甲硫胺酸(SAMe)以殺死任何剩餘李斯特菌屬及為肝臟提供抗氧化劑支援體。
向在初始系列中在接受最後一次疫苗之後至少5個月內無轉移性疾病之犬的所有者提供以1×109CFU之標準劑量接受加強疫苗。如所描述投予加強疫苗,且如上文所描述在輸注之後監測犬。
毒性
根據獸醫合作腫瘤學組不良事件常用術語準則(VCOG-CTCAE)對毒性進行分級。在基線、在各疫苗接種時、在最後一次疫苗接種之後3週時及此後每2個月直至死亡為止經由連續
心電圖、心動回聲圖及血清心臟肌鈣蛋白I水準進行心臟毒性評定。所評定之參數包括左心室縮短分數(LVFS)及左心室心臟舒張時內部尺寸(LVIDd)及左心室心臟收縮時內部尺寸(LVIDs)。相對於體重對LVIDd及LVIDs進行正規化以考慮犬之間身體大小之廣泛範圍。
ELISpot分析
使來自各指定時間點之冷凍保存PBMC解凍,在37℃下靜置隔夜,且隨後計數。用2.5uM重疊人類HER2/Neu肽集合體(重疊5個胺基酸之11聚物,其表示存在於嵌合疫苗中之HER2/Neu的EC1、EC2及IC1結構域)及重組人類IL-2(Invitrogen,Fredrick,MD)刺激細胞持續5天。採集細胞,在1×PBS中洗滌兩次,且計數。根據製造商之方案使用商業犬類IFN-γ ELISpot分析套組(R&D Systems,Minneapolis,MN)進行IFN-γ ELISpot分析。簡言之,將0.8-2×105個經刺激之細胞與2.5uM EC1、EC2或IC1肽集合體加IL-2或單獨IL-2(測定背景計數)一起培育。所有分析一式兩份進行。根據製造商之說明書使培養盤顯影。使用CTL-Immunospot分析器(C.T.L,Shaker Heights,OH)對點進行計數。
原發性及繼發性結果量測
出現癌轉移之時間(TTM)以切除術與轉移性疾病出現之間的時間計算。OSA特異性存活期以切除術與死亡之間的時間計算。死于不相關原因之患者在其死亡時刪去。
18隻滿足合格準則之犬入選此I期臨床試驗。記錄年
齡、品種、性別、腫瘤位置、次型、級別及HER2/neu狀態(表4)。採用標準3+3臨床試驗設計。以以下劑量投予ADXS31-164;第1組:2×108CFU(n=3),第2組:5×108CFU(n=3),第3組:1×109CFU(n=9)及第4組:3×109CFU(n=3)。在篩選時鑒別出具有預先存在之肺部轉移性疾病的五隻額外犬亦基於酌情照護而接受ADXS31-164(表4)。此等犬中之四隻在來自其原發性腫瘤的>50%之贅生性細胞中具有強HER2/neu染色。在篩選時,此等犬中之三隻具有多個肺部轉移性結節,且兩隻犬具有單個轉移性結節。具有多個肺部結節之犬在疾病進展及退出研究而進行替代性治療之前各自接受一次疫苗。具有單個結節之兩隻犬各自接受三次疫苗之完整療程。具有預先存在之轉移性疾病的犬接受1×109CFU(n=3)或3 x 109CFU(n=2)ADXS31-164(表5)。
圖15顯示1期臨床試驗之時間線的示意圖,其中在切除術及後續化學療法後投予三次疫苗接種。
結果
安全性及毒性 =對所有23隻經疫苗接種之犬評估安全性。所有犬對ADXS31-164耐受良好,在疫苗接種日僅觀測到
短暫低毒性(表6)。與劑量無關,在所有組中在ADXS31-164投予之後的4小時,體溫發生統計學上顯著之增加(圖9A)。在任何時間點或在任何劑量下未觀測到低血壓(圖9B)。18隻犬(無預先存在之轉移性疾病)中的8隻及5隻犬(具有預先存在之轉移性疾病)中的3隻在疫苗接種4小時內出現>103℉之發熱,且在該時間靜脈內給予流體。三隻犬接受單次劑量之非類固醇消炎藥物以降低體溫。在所有情況下,發熱在不進行進一步干預的情況下消退。不論劑量如何,在疫苗接種4小時內發生不需要治療性干預之短暫昏睡、噁心及嘔吐。在兩隻犬中,在疫苗接種之後不久鑒別出短暫單心室或雙心室過早收縮。一隻具有預先存在之轉移性疾病的犬在疫苗接種2小時內出現心室心動過速。用利多卡因(lidocaine)、普魯卡因胺(procainamide)、索他洛爾(sotalol)及皮質類固醇治療幾乎無作用,然而,心律不整在72小時內消退。在ADXS31-164之後的24小時發生白血球及嗜中性白血球計數的短暫但統計學上顯著之增加,且伴隨有血小板及淋巴球之短暫減少(圖17)。儘管在ADXS31-164劑量與血液學變化量級之間不存在相關性,但在存活犬與死亡犬之間存在白血球、嗜中性白血球及單核球反應之量級的顯著差異(圖18A-F)。在大約一半之犬中發生肝臟酶之血清濃度的輕度短暫增加,與由親肝性李斯特菌屬造成之輕度炎症相符(表6)。在周邊血液中鑒別之所有變化無症狀,且在ADXS31-164投予1週內消退。在任何犬中均未記錄腎功能顯著變化。23隻犬中之19隻在ADXS31-164投予之後的24小時進行血液培養,且全部為陰性,與高度減毒之LmddA菌株的快速清除相符。
鑒於靶向HER2/neu之單株抗體引起心臟毒性,吾人
在基線、在各疫苗接種之前及此後每2個月評估心臟破壞之生物標記物及心動回聲描記之功能異常量測值,包括心臟肌鈣蛋白I、縮短分數(%)、LVIDd及LVIDs。在任何經疫苗接種之犬中未鑒別出心臟肌鈣蛋白I、縮短分數、LVIDd或LVIDs之顯著持續變化(圖26A-D)。第3組中之一隻犬在各疫苗接種時顯示血清心臟肌鈣蛋白I逐步增加,然而,此未伴隨有心動回聲描記之功能異常跡象。值在最後一次疫苗接種後返回至基線,且在重複評定時不升高。
在整個臨床試驗中,如圖25(A-D)中所示,量測心臟肌鈣蛋白I水準以及縮短分數、左心室心臟收縮時內徑(LVIDs)及心臟舒張時LVID(LVIDd),在投予ADXS31-164後不存在長期或短期心臟毒性之證據。
下文表6呈現顯示在臨床試驗期間報導最少治療相關不良事件的資料。
表6:在ADXS31-164疫苗接種時或48小時內發生之治療相關不良事件
結論:ADSX31-164毒性較低且短暫
對ADXS31-164之免疫反應
圖18中所呈現之結果展現,在接受疫苗之犬中對ADXS31-164之早期免疫反應預測該等犬之存活。圖18顯示,ADXS31-164誘導WBC、嗜中性白血球及單該球計數之增加,其與
存活率有關且伴隨有血小板及淋巴球之短暫減少(圖17)。
在臨床試驗期間評定ADXS31-164誘導及維持免疫反應且尤其誘導HER2/Neu特異性T細胞免疫性之能力。為了評估免疫反應及確定ADXS31-164是否誘導HER2/Neu特異性T細胞反應,藉由IFN-γ ELISpot評定HER2/Neu特異性T細胞數目。在基線(卡鉑後3週)、在每一疫苗接種時及此後每2個月取得樣品。圖19顯示ELISpot分析之結果。
HER2/neu特異性免疫反應:在基線,分別在18隻犬中之4隻、6隻及1隻中偵測針對人類HER2/neu之EC1、EC2及IC1結構域(分別與犬類HER2/neu共用89%、93%及98%一致性)的免疫反應。在第三次ADXS31-164疫苗接種之後3週時,在7隻犬中偵測針對HER2/neu結構域中之一或多者誘導的IFN-γγ反應(表7)。此等犬中之五隻出現針對高保守性IC1結構域之免疫反應。額外五隻犬在2個月後出現針對IC1結構域之IFN-γ反應。額外三隻犬在復發時出現針對單獨EC2,EC2及IC1,或EC1、EC2及EC3之IFN-γ反應(犬001、002及017)。藉由IFN-γ ELISpot歷經15至17個月評估在其初始疫苗接種系列期間出現針對HER2/neu之免疫反應的3隻犬。未維持HER2/Neu特異性IFN-γ反應,然而,犬保持在此時間期間無轉移性疾病。10隻犬接受額外加強劑疫苗接種,在可評估之6隻中,2隻犬在加強劑疫苗接種之後2個月時具有可偵測之HER2/neu特異性IFN-γ反應增加。在復發之8隻犬中,5隻在ADXS31-164之後3週時無HER2/neu特異性IFN-γγ反應增加。
加強劑疫苗接種:在初始疫苗系列之後5與10個月之間,向在入選時無轉移性疾病之18隻犬中的十隻投予單次加強疫苗。此等犬中之四隻接受額外加強疫苗,其在首次加強疫苗之後4與15個月之間給予。在加強劑疫苗接種時注意到與初始疫苗按種系列類似之低級短暫副作用。
圖20(A及B)顯示,重複加強劑疫苗接種亦刺激HER2
特異性免疫性。對動物289-003在6及10個月時及對動物289-004在8個月時投予重複加強劑疫苗接種。
臨床結果:經疫苗接種之組中的18隻犬中,8隻復發,4隻具有肺部轉移性疾病且4隻具有骨癌轉移。兩隻具有骨癌轉移之犬進展為肺部癌轉移。一隻在其骶骨中具有骨病灶之犬死於吸入性肺炎,且一隻具有孤立肺部結節之犬死於腎母細胞瘤,然而,分別來自骨骼及肺病變之屍檢樣本不可供用於在組織病理學確認轉移性骨肉瘤。自OSA特異性存活期分析刪去此兩隻犬。由主要臨床醫師酌情處理,復發之犬接受不同救護性化療及放射療法。僅用鎮痛劑(1隻犬),單獨用姑息性放射(1隻犬)或與化學療法組合用姑息性放射(2隻犬)治療具有骨癌轉移之4隻犬。兩隻犬接受阿德力黴素且1隻犬接受palladia用於治療肺部轉移性疾病。經疫苗接種之犬的中值OSA特異性存活期尚未達到。TTM及OSA特異性存活期之卡普蘭-邁耶存活率曲線顯示於圖21中。經疫苗接種之犬的1及2年整體存活率分別為71.4%及57%。在疫苗接種2個月內出現HER2/neu特異性IFN-γ反應的12隻犬中,9隻仍存活(3隻犬>900天,1隻犬>700天,3隻犬>400天且2隻犬>300天,且7隻保持至今無腫瘤(表7))。圖24中呈現之結果展現,ADXS31-164破壞對HER2/Neu之耐受性。此對治療OSA以及其他HER2/Neu腫瘤及/或癌症而言可為重要的。
屍檢發現:18隻犬中之6隻在研究時段期間死亡,且對此等犬中之4隻進行屍檢。發現三隻犬具有涉及肺(3隻犬)、骨骼(2隻犬)、縱隔(1隻犬)及腎臟(1隻犬)的多灶性II級及III級轉移性骨肉瘤。發現由於漸進性較大腎品質而安樂死的一隻犬患有腎
母細胞瘤。此犬亦具有單個肺部結節,但不幸的是此未藉由組織病理學評估。
在投予ADXS31-164後之存活率、長期存活率、腫瘤進展
在篩選時具有多個轉移性肺部結節且基於酌情照護而治療的三隻犬在疾病進展及自研究移除之前各自接受一次疫苗。在篩選時呈現有孤立轉移性肺部結節之兩隻犬接受所有三次疫苗(外部特徵描述及腫瘤特徵參見表5)。儘管進行疫苗接種,但在此等犬中之一者中發生漸進性肺部轉移性疾病。儘管預先存在之肺部結節的大小每3週倍增,但在第二隻犬中未出現額外肺部病變(圖22A及B)。在最後一次疫苗接種之後1週時的CT掃描確認不存在額外轉移性病變,且犬經歷轉移灶切除術。在手術之前,靜脈內投予用於偵測腫瘤邊際及炎症區域之染料吲哚菁綠(indocyanine green;ICG),且在手術時,在肺部結節及接近該孤立結節的看上去健康之肺部軟組織中若干其他區域中發現近紅外光下之螢光(圖22C及D)。肺部結節之組織病理學揭露具有由厚纖維囊包圍之較大出血及壞死區域的轉移性OSA(圖22E)。IHC顯示CD3+ T細胞圍繞纖維囊積聚,而結節自身內T細胞非常少(圖22G及H)。由近紅外螢光鑒別之其他區域顯示T細胞浸潤之病灶性區域(圖22F、22I及22J)。發現T細胞包圍具有明顯有絲分裂圖的異常大之波形蛋白陽性細胞(圖22K及22L)。此等發現表明,單一轉移性肉瘤細胞可藉由肺內腫瘤特異性T細胞有效靶向,且提供用於ADXS31-164預防轉移性肺部疾病之可能機制。犬自手術恢復良好,且保持無肺部轉移性疾病持續5個月,隨後在皮下組織(骨母細胞,II級及軟骨母細
胞,III級)、縱隔(骨母細胞,II級)及橫隔膜(骨母細胞,III級)中出現分佈廣泛的侵襲性HER2/neu+轉移性疾病。結果顯示,儘管誘導HER2/neu特異性T細胞反應,但未鑒別脫靶(off-tumor)副作用,因此誘導HER2/neu特異性T細胞造成HER2/neu陽性轉移性細胞消除及長期保護不受疾病復發影響。此由以下支援:HER2/Neu特異性T細胞擴增之時序,該擴增在診斷後大約8個月(此時許多犬將出現轉移性疾病)時在5隻犬中發生;及在組織病理學上發現病灶性T細胞反應,該病灶性T細胞反應在疫苗接種及轉移灶切除術後見於一隻犬之肺部軟組織內。
圖22及圖23中呈現之結果展現,投予ADXS31-164在患有自發性HER2+骨肉瘤之犬中延遲及/或預防轉移性疾病且延長整體存活期。如在兩個圖中可見,接受疫苗之犬的存活時間明顯延長,同時接受疫苗之彼等犬的中值存活期尚未達到。
雖然吾人之研究展現此方法在預防轉移性疾病中之有效性,但用ADXS31-164疫苗接種在基於酌情照護而治療之5隻犬中不能誘導預先存在之主體肺部轉移性疾病消退。在一隻犬中,此似乎與T細胞無法滲透轉移性病灶周圍之纖維囊或彼等細胞無法在確立之腫瘤微環境內存活相關聯(圖22C)。然而,在同一隻犬中,T細胞之病灶性區域浸潤周圍較大之主動分裂之間葉細胞,在大體正常之肺軟組織中鑒別出疑似轉移性OSA細胞,且出乎意料地,在轉移灶切除術後,此犬未出現進一步肺部轉移性疾病。結合在一起,此等資料表明,ADXS31-164經由其誘導強效先天性免疫反應及適應性免疫反應之能力來預防肺部轉移性疾病,該先天性免疫反應可使轉移性OSA細胞對FAS/FASL介導之細胞凋亡敏感,
該適應性免疫反應呈消除微轉移肺部疾病之HER2/Neu特異性T細胞形式。
結論:在提交本申請案時,18隻犬中之12隻未出現肺部轉移性疾病,展現當在微小殘留病環境中投予時,ADXS31-164在罹患自發性HER2+骨肉瘤之個體中預防轉移性疾病。與歷史HER2/Neu+對照組相比較,經疫苗接種之犬顯示整體存活率的統計學上顯著之增加。HER2/Neu+對照組犬(n=11)中之中值存活期為316天(p=0.032),而ADSX31-164治療之犬的中值存活期尚未達到。此外,結果指示ADXS31-164破壞對HER2/Neu之高保守性IC1結構域的周邊耐受性(圖26)。在ADXS31-164投予24小時內的白血球增加之量級(圖18)與存活率相關,表明結果部分地視犬之免疫系統對疫苗有反應的能力而定。重要的是,此研究顯示,向患有自發性OSA之犬投予至多3×109CFU ADXS31-164為安全的,且在投予時僅造成短暫低級副作用。此外,預防肺部轉移性疾病可部分地與細微轉移性疾病在肺中的CD3+ T細胞介導之消除相關聯。此工作對兒童OSA及其他表現HER2/Neu之人類癌症具有重要意義。
此外,此處吾人顯示,以至多3.3×10^9CFU之劑量投予ADXS31-164為在犬中安全的,且儘管誘導HER2/neu特異性免疫性,投予ADXS31-164並不導致短期或長期心臟毒性。對標靶之脫靶副作用(包括心臟毒性)已與投予較大數目之HER2/neu特異性T細胞或與蒽環黴素並行使用曲妥珠單抗時相關聯。吾人採用不使用小紅莓(doxorubicin)之標準化學療法方案以降低任何潛在心臟毒性風險。
吾人之研究展現,ADXS31-164可在患有OSA之犬中預防肺部轉移性疾病。此等結果展現在患有OSA之犬中的安全性及前所未有之存活時間,且提供研究ADXS31-164在患有HER2/neu表現性腫瘤(包括兒童骨肉瘤及乳房癌瘤)之患者中預防轉移性疾病之能力的方法。
描述與姑息性放射組合使用的表現人類嵌合Her-2/neu構築體之重組單核球增多性李斯特菌屬(ADXS31-164)在患有自發性附肢骨肉瘤之犬中預防肺部轉移性疾病及延長整體存活期。鑒於犬類與人類骨肉瘤之間的類似性,吾人認為此組合將為用於人類疾病之有效療法。
材料及方法
疫苗製備
構造ADXS31-164疫苗之細節已描述于上文。製備ADXS31-164疫苗儲備液且以1ml等分試樣形式在-70℃°下儲存於冰箱中。在注射之前,在37℃°下使疫苗儲備液解凍2-3分鐘,且隨後用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌兩次,且將其以5×108菌落形成單位(CFU)/毫升之最終濃度再懸浮於PBS中。用200μl此懸浮液對各犬進行腹膜內免疫接種。
RT及免疫療法
在組織病理學上確認具有未經治療之HER2+附肢OSA且無心臟或轉移性疾病證據之十隻全身健康犬入選。所有犬在
連續數天分兩次接受16Gy之RT,繼而每3週一次給予8次ADXS31-164靜脈內劑量(每劑量3.3×10^9CFU)中的第一次。每3週(例如在第7、28、49、70、91、112、133及154天)進行用基於李斯特菌屬之疫苗的免疫接種(圖10)。在免疫接種當天亦進行免疫分析。
在第4天及第5天,使用Siemens 6 MV線性加速器遞送8Gy之外部射線RT。在全身麻醉下給予RT。每3週在臨床上且在基線、在第四次疫苗投予(第70天)時及在第八次疫苗投予(第154天)時以放射照相方式評估腫瘤。在此等時間點,進行胸科放射照片以確定肺部轉移性疾病之存在。
在入選時進行骨活檢以確認骨肉瘤診斷。在第0天、第70天及第133天以及此後每2個月直至安樂死為止進行全血球計數(CBC)、化學篩選(CS)、尿分析(UA)、心電圖(EKG)/心動回聲圖/心臟肌鈣蛋白I血清濃度(cTnl)及受影響肢體及胸部之放射照片。在安樂死當天進行全血球計數(CBC)、化學篩選(CS)、尿分析(UA)、免疫分析、心電圖(EKG)/心動回聲圖/心臟肌鈣蛋白I血清濃度(cTnl);及屍檢。
ELISpot assay使來自各指定時間點之冷凍保存PBMC解凍,在37℃下靜置隔夜,且隨後計數。用2.0uM重疊人類HER2/Neu肽集合體(重疊5個胺基酸之11聚物,其表示存在於嵌合疫苗中之HER2/Neu的EC1、EC2及IC1結構域)及重組人類IL-2(Invitrogen,Fredrick,MD)刺激細胞持續5天。採集細胞,在1×PBS中洗滌兩次,且計數。根據製造商之方案使用商業犬類IFN-γ
ELISpot分析套組(R&D Systems,Minneapolis,MN)進行IFN-γγ ELISpot分析。簡言之,將0.1-3×105個經刺激之細胞與2.5uM EC1、EC2或IC1肽集合體或無(測定背景計數)一起培育。所有分析一式兩份進行。根據製造商之說明書使培養盤顯影。使用CTL-Immunospot分析器(C.T.L,Shaker Heights,OH)對點進行計數。
結果
如上文所描述,吾人評估ADXS31-164在患有自發性骨肉瘤之犬中輔助療法的用途。在連續兩日投予16Gy RT後,向患有自發性附肢OSA之犬投予ADXS31-164。投予高達8次劑量之ADXS31-164。此工作顯示重複投予3.3×109CFU ADXS31-164為安全的。
隨後探索放射療法與ADXS31-164之間的潛在協同作用,其用以促進抗腫瘤免疫性(尤其產生Her-2/neu特異性T細胞),延緩原發性腫瘤進展及預防/延遲肺部轉移性疾病。
圖10描述治療方案。在第0天篩選用於入選試驗之犬。篩選包括評估基線血液測試、尿分析、心臟評估、胸科及受影響肢體放射照片及確認骨肉瘤診斷之骨活檢。在入選後連續2天給予姑息性放射。在姑息性放射療法後,每3週一次給予多次劑量(至多8次)之ADXS31-164,而僅具有短暫低級副作用(資料未顯示)。在第70天及第154天重複胸科及肢體放射照片。由兩個委員會註冊之獸醫學矯形外科醫師在各時間點基於其對在各時間點取得之各犬視訊的評估來對各犬指定跛行評分。所有者亦填寫記錄所有者之生活品質感覺的驗證疼痛調查表。10隻犬中5隻仍存活,三個無
腫瘤進展或肺部轉移性疾病之證據。在寫本文時,中值存活期為285天,其比RT單獨達成的136天之歷史中值存活期有利。在供用於試驗入選的具有肱骨近端病理性骨折(其藉由2個骨板及一個髓內銷釘穩定化)之一個患者中,在放射療法及ADXS31-164投予之後三個月時,放射照片顯示骨折癒合之證據而無肺部轉移性疾病之證據(圖11)。
因此,ADXS31-164可不與化學療法一起使用;與放射組合使用及潛在地在新輔助環境中,在切除術及化學療法之前使用以預防轉移性疾病。
儘管已在本文中說明及描述本發明之某些特徵,但一般技術者現將想到多種修改、取代、變化及相等物。因此,應瞭解,所附申請專利範圍意欲涵蓋如屬於本發明之真實精神內的所有此類修改及變化。
<110> MASON,Nicola PATERSON,Yvonne
<120> 用於治療Her-2陽性癌症之組合免疫療法及放射線療法
<130> P-73423-US4
<140> US 15/999,999
<141> 2015-03-24
<150> 14/268,436
<151> 2014-05-02
<150> 14/189,008
<151> 2014-02-25
<150> 13/210,696
<151> 2011-08-16
<150> 12/945,386
<151> 2010-11-12
<150> 61/260,277
<151> 2009-11-12
<150> PCT/US15/17559
<151> 2015-02-25
<150> 62/076,411
<151> 2014-11-06
<160> 74
<170> PatentIn version 3.5
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<223> Her-2嵌合蛋白質
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<220>
<223> IC1(Her-2-neu之2114-3042bp)的比對
<400> 29
<210> 30
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IC1(Her-2-neu之2114-3042bp)的比對
<400> 30
<210> 31
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IC1(Her-2-neu之2114-3042bp)的比對
<400> 31
<210> 32
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IC1(Her-2-neu之2114-3042bp)的比對
<400> 32
<210> 33
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IC1(Her-2-neu之2114-3042bp)的比對
<400> 33
<210> 34
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IC1(Her-2-neu之2114-3042bp)的比對
<400> 34
<210> 35
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IC1(Her-2-neu之2114-3042bp)的比對
<400> 35
<210> 36
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IC1(Her-2-neu之2114-3042bp)的比對
<400> 36
<210> 37
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IC1(Her-2-neu之2114-3042bp)的比對
<400> 37
<210> 38
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IC1(Her-2-neu之2114-3042bp)的比對
<400> 38
<210> 39
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IC1(Her-2-neu之2114-3042bp)的比對
<400> 39
<210> 40
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EC1(Her-2-neu之399-758bp)的比對
<400> 40
<210> 41
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EC1(Her-2-neu之399-758bp)的比對
<400> 41
<210> 42
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EC1(Her-2-neu之399-758bp)的比對
<400> 42
<210> 43
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EC1(Her-2-neu之399-758bp)的比對
<400> 43
<210> 44
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EC1(Her-2-neu之399-758bp)的比對
<400> 44
<210> 45
<211> 3716
<212> DNA
<213> 褐家鼠
<400> 45
<210> 46
<211> 360
<212> DNA
<213> 褐家鼠
<400> 46
<210> 47
<211> 618
<212> DNA
<213> 褐家鼠
<400> 47
<210> 48
<211> 929
<212> DNA
<213> 褐家鼠
<400> 48
<210> 49
<211> 3798
<212> DNA
<213> 智人
<400> 49
<210> 50
<211> 393
<212> DNA
<213> 智人
<400> 50
<210> 51
<211> 477
<212> DNA
<213> 智人
<400> 51
<210> 52
<211> 391
<212> DNA
<213> 智人
<400> 52
<210> 53
<211> 7075
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pAdv164序列(7075個鹼基對)
<400> 53
<210> 54
<211> 921
<212> DNA
<213> 智人
<400> 54
<210> 55
<211> 597
<212> DNA
<213> 智人
<400> 55
<210> 56
<211> 1209
<212> DNA
<213> 智人
<400> 56
<210> 57
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her-2-嵌合體(F)
<400> 57
<210> 58
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HerEC1-EC2F(接合點)
<400> 58
<210> 59
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HerEC1-EC2R(接合點)
<400> 59
<210> 60
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HerEC2-ICIF(接合點)
<400> 60
<210> 61
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HerEC1-EC2R(接合點)
<400> 61
<210> 62
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her-2-嵌合體(R)
<400> 62
<210> 63
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her-2-EC1(F)
<400> 63
<210> 64
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her-2-EC1(R)
<400> 64
<210> 65
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her-2-EC2(F)
<400> 65
<210> 66
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her-2-EC2(R)
<400> 66
<210> 67
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her-2-Her-2-IC1(F)
<400> 67
<210> 68
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her-2-IC1(R)
<400> 68
<210> 69
<211> 131
<212> PRT
<213> 智人
<400> 69
<210> 70
<211> 131
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 70
<210> 71
<211> 75
<212> PRT
<213> 智人
<400> 71
<210> 72
<211> 75
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 72
<210> 73
<211> 131
<212> PRT
<213> 智人
<400> 73
<210> 74
<211> 131
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 74
Claims (81)
- 一種治療個體之Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因,且其中投予該放射療法包含至少兩次投予該放射療法。
- 如請求項1之方法,其中該個體為人類成人或兒童。
- 如請求項1之方法,其中該個體為犬類動物。
- 如請求項1之方法,其中該Her-2/neu嵌合抗原包含至少5、9、13、14或17個定位之人類MHC-I類抗原決定基。
- 如請求項1之方法,其中該Her-2/neu嵌合抗原包含至少5、9、13、14或17個犬類MHC-I類抗原決定基。
- 如請求項1之方法,其中該核酸分子係整合入李斯特菌屬基因組內。
- 如請求項1之方法,其中該核酸分子係在該重組減毒李斯特菌屬菌株中的質體內,且其中該質體係在缺乏抗生素選擇下穩定維持於該重組減毒李斯特菌屬菌株內。
- 如請求項1之方法,其中該重組李斯特菌屬包含actA致病性基因之缺失。
- 如請求項1之方法,其中該額外多肽係選自由以下各者組成之群:a)非溶血性LLO蛋白質或N端片段、b)PEST序列、或c)ActA片段。
- 如請求項1之方法,其中由該第二開讀框編碼之該代謝酶為丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶。
- 如請求項1之方法,其中該重組減毒李斯特菌屬菌株為ADXS31-164。
- 如請求項1之方法,其中該重組減毒李斯特菌屬菌株與獨立佐劑一起投予,其中該佐劑包含顆粒球/巨噬細胞群落刺激因數(GM-CSF)蛋白質、編碼GM-CSF蛋白質之核苷酸分子、皂素QS21、單磷醯基脂質A、或含有未甲基化CpG之寡核苷酸。
- 如請求項1之方法,其中該放射療法在投予該重組減毒李斯特菌屬菌株之前進行投予。
- 如請求項1之方法,其癌症為骨肉瘤。
- 如請求項1之方法,其中該腫瘤生長或癌症為復發或癌轉移。
- 如請求項15之方法,其中該癌轉移為肺部轉移性疾病。
- 一種在個體中引起針對Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之免疫反應增強的方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因,且其中投予該放射療法包含至少兩次投予該放射療法。
- 如請求項17之方法,其中該個體為人類成人或兒童。
- 如請求項17之方法,其中該個體為犬類動物。
- 如請求項17之方法,其中該Her-2/neu嵌合抗原包含至少5、 9、13、14或17個定位之人類MHC-I類抗原決定基。
- 如請求項17之方法,其中該Her-2/neu嵌合抗原包含至少5、9、13、14或17個犬類MHC-I類抗原決定基。
- 如請求項17之方法,其中該核酸分子係整合入李斯特菌屬基因組內。
- 如請求項17之方法,其中該核酸分子係在該重組減毒李斯特菌屬菌株中的質體內,且其中該質體係在缺乏抗生素選擇下穩定維持於該重組減毒李斯特菌屬菌株內。
- 如請求項17之方法,其中該重組李斯特菌屬包含actA致病性基因之缺失。
- 如請求項17之方法,其中該額外多肽係選自由以下各者組成之群:a)非溶血性LLO蛋白質或N端片段、b)PEST序列或c)ActA片段。
- 如請求項17之方法,其中由該第二開讀框編碼之該代謝酶為丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶。
- 如請求項17之方法,其中該重組減毒李斯特菌屬菌株為ADXS31-164。
- 如請求項17之方法,其中該重組減毒李斯特菌屬菌株與獨立佐劑一起投予,其中該佐劑包含顆粒球/巨噬細胞群落刺激因數(GM-CSF)蛋白質、編碼GM-CSF蛋白質之核苷酸分子、皂素QS21、單磷醯基脂質A、或含有未甲基化CpG之寡核苷酸。
- 如請求項17之方法,其中該放射療法在投予該重組減毒李斯特菌屬菌株之前進行投予。
- 如請求項17之方法,其中該癌症為骨肉瘤。
- 如請求項17之方法,其中該腫瘤生長或癌症為復發或癌轉移。
- 如請求項31之方法,其中該癌轉移為肺部轉移性疾病。
- 如請求項17之方法,其中該引起免疫反應增強引起Her-2/neu特異性T細胞反應增加。
- 一種延長罹患Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之個體之存活期的方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因,且其中投予該放射療法包含至少兩次投予該放射療法。
- 如請求項34之方法,其中該個體為人類成人或兒童。
- 如請求項34之方法,其中該個體為犬類動物。
- 如請求項34之方法,其中該Her-2/neu嵌合抗原包含至少5、9、13、14或17個定位之人類MHC-I類抗原決定基。
- 如請求項34之方法,其中該Her-2/neu嵌合抗原包含至少5、9、13、14或17個犬類MHC-I類抗原決定基。
- 如請求項34之方法,其中該核酸分子係整合入李斯特菌屬基因組內。
- 如請求項34之方法,其中該核酸分子係在該重組減毒李斯特菌屬菌株中的質體內,且其中該質體係在缺乏抗生素選擇下穩定維持於該重組減毒李斯特菌屬菌株內。
- 如請求項34之方法,其中該重組李斯特菌屬包含actA致病 性基因之缺失。
- 如請求項34之方法,其中該額外多肽係選自由以下各者組成之群:a)非溶血性LLO蛋白質或N端片段、b)PEST序列、或c)ActA片段。
- 如請求項34之方法,其中由該第二開讀框編碼之該代謝酶為丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶。
- 如請求項34之方法,其中該重組減毒李斯特菌屬菌株為ADXS31-164。
- 如請求項34之方法,其中該重組減毒李斯特菌屬菌株與獨立佐劑一起投予,其中該佐劑包含顆粒球/巨噬細胞群落刺激因數(GM-CSF)蛋白質、編碼GM-CSF蛋白質之核苷酸分子、皂素QS21、單磷醯基脂質A、或含有未甲基化CpG之寡核苷酸。
- 如請求項34之方法,其中該放射療法在投予該重組減毒李斯特菌屬菌株之前進行投予。
- 如請求項34之方法,其中該癌症為骨肉瘤。
- 如請求項34之方法,其中該腫瘤生長或癌症為復發或癌轉移。
- 如請求項48之方法,其中該癌轉移為肺部轉移性疾病。
- 一種在罹患Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之個體中延遲轉移性疾病之方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外多肽融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因,且其中投予該放射療 法包含至少兩次投予該放射療法。
- 如請求項50之方法,其中該個體為人類成人或兒童。
- 如請求項50之方法,其中該個體為犬類動物。
- 如請求項50之方法,其中該Her-2/neu嵌合抗原包含至少5、9、13、14或17個定位之人類MHC-I類抗原決定基。
- 如請求項50之方法,其中該Her-2/neu嵌合抗原包含至少5、9、13、14或17個犬類MHC-I類抗原決定基。
- 如請求項50之方法,其中該核酸分子係整合入李斯特菌屬基因組內。
- 如請求項50之方法,其中該核酸分子係在該重組減毒李斯特菌屬菌株中的質體內,且其中該質體係在缺乏抗生素選擇下穩定維持於該重組減毒李斯特菌屬菌株內。
- 如請求項50之方法,其中該重組李斯特菌屬包含actA致病性基因之缺失。
- 如請求項50之方法,其中該額外多肽係選自由以下各者組成之群:a)非溶血性LLO蛋白質或N端片段、b)PEST序列、或c)ActA片段。
- 如請求項50之方法,其中由該第二開讀框編碼之該代謝酶為丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶。
- 如請求項50之方法,其中該重組減毒李斯特菌屬菌株為ADXS31-164。
- 如請求項50之方法,其中該重組減毒李斯特菌屬菌株與獨立佐劑一起投予,其中該佐劑包含顆粒球/巨噬細胞群落刺激因數(GM-CSF)蛋白質、編碼GM-CSF蛋白質之核苷酸分子、皂素QS21、 單磷醯基脂質A、或含有未甲基化CpG之寡核苷酸。
- 如請求項50之方法,其中該放射療法在投予該重組減毒李斯特菌屬菌株之前進行投予。
- 如請求項50之方法,其中該癌症為骨肉瘤。
- 如請求項50之方法,其中該腫瘤生長或癌症為復發或癌轉移。
- 如請求項64之方法,其中該癌轉移為肺部轉移性疾病。
- 一種在罹患Her-2/neu表現性腫瘤生長或癌症之個體中破壞對Her-2/neu之耐受性的方法,該方法包含投予放射療法與重組減毒李斯特菌屬菌株之組合的步驟,該菌株包含有包含編碼融合多肽之第一開讀框及編碼代謝酶之第二開讀框的核酸,該融合多肽包含與額外佐劑融合之Her-2/neu嵌合抗原,其中該代謝酶補充在該重組減毒李斯特菌屬菌株之染色體中經突變的內源性基因,且其中投予該放射療法包含至少兩次投予該放射療法。
- 如請求項66之方法,其中該個體為人類成人或兒童。
- 如請求項66之方法,其中該個體為犬類動物。
- 如請求項66之方法,其中該Her-2/neu嵌合抗原包含至少5、9、13、14或17個定位之人類MHC-I類抗原決定基。
- 如請求項66之方法,其中該Her-2/neu嵌合抗原包含至少5、9、13、14或17個犬類MHC-I類抗原決定基。
- 如請求項66之方法,其中該核酸分子係整合入李斯特菌屬基因組內。
- 如請求項66之方法,其中該核酸分子係在該重組減毒李斯特菌屬菌株中的質體內,且其中該質體係在缺乏抗生素選擇下穩定維 持於該重組減毒李斯特菌屬菌株內。
- 如請求項66之方法,其中該重組李斯特菌屬包含actA致病性基因之缺失。
- 如請求項66之方法,其中該額外多肽係選自由以下各者組成之群:a)非溶血性LLO蛋白質或N端片段、b)PEST序列、或c)ActA片段。
- 如請求項66之方法,其中由該第二開讀框編碼之該代謝酶為丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶。
- 如請求項66之方法,其中該重組減毒李斯特菌屬菌株為ADXS31-164。
- 如請求項66之方法,其中該重組減毒李斯特菌屬菌株與獨立佐劑一起投予,其中該佐劑包含顆粒球/巨噬細胞群落刺激因數(GM-CSF)蛋白質、編碼GM-CSF蛋白質之核苷酸分子、皂素QS21、單磷醯基脂質A或含有未甲基化CpG之寡核苷酸。
- 如請求項66之方法,其中該放射療法在投予該重組減毒李斯特菌屬菌株之前進行投予。
- 如請求項66之方法,其中該癌症為骨肉瘤。
- 如請求項66之方法,其中該腫瘤生長或癌症為復發或癌轉移。
- 如請求項80之方法,其中該癌轉移為肺部轉移性疾病。
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US14/669,629 US10016617B2 (en) | 2009-11-11 | 2015-03-26 | Combination immuno therapy and radiotherapy for the treatment of Her-2-positive cancers |
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