ES2267637T3

ES2267637T3 - Revestimiento de pequeñas particulas.

Info

Publication number: ES2267637T3
Application number: ES01117830T
Authority: ES
Inventors: Nils-Ove Gustafsson; Peter Fyhr; Timo Laakso; Monica Jonsson
Original assignee: Jagotec AG
Current assignee: Jagotec AG
Priority date: 1995-10-19
Filing date: 1996-09-03
Publication date: 2007-03-16
Anticipated expiration: 2016-09-03
Also published as: AU699080B2; ATE228826T1; SE9503672D0; NO320392B1; EP1142569A2; HUP9901205A2; DE69636177D1; JP2000501380A; NO981558D0; NO981558L; DE69636177T2; WO1997014408A1; HK1011182A1; CZ117398A3; PT869774E; ATE326953T1; ES2125209T1; EP0869774B1; DE869774T1; DE69625240T2

Abstract

Procedimiento de preparación de micropartículas de liberación sostenida administrables parenteralmente que contienen una sustancia biológicamente activa que es inestable en presencia de un solvente orgánico; comprendiendo dicho procedimiento aplicar una emulsión de un polímero formador de película biodegradable controlador de la liberación, o una mezcla de dos o más de estos polímeros, mediante la técnica de suspensión en aire sobre partículas nucleares biodegradables con dicha sustancia biológicamente activa encapsulada en las mismas; en el que dichas partículas nucleares se forman a partir de almidón o de un almidón química o físicamente modificada que puede disolverse con a-amilasa, y en el que una fase de dicha emulsión es un líquido de dicho polímero controlador de la liberación o una mezcla de dos o más de dichos polímeros en un solvente inorgánico, y la otra fase es agua.

Description

Revestimiento de pequeñas partículas.

Campo de la invención

La presente invención se encuentra dentro del campo de las partículas de liberación sostenida para la administración parenteral de sustancias biológicamente activas, especialmente fármacos. Más específicamente, se refiere a un procedimiento de preparación para estas partículas, que contienen una sustancia biológicamente activa, así como a partículas de liberación sostenida obtenibles de esta manera.

Antecedentes de la invención

Muchos fármacos necesitan administrarse mediante inyección debido a que resultan degradados o absorbidos de manera no eficaz cuando se administran, por ejemplo, oral o nasalmente o por vía rectal. Una formulación de fármaco destinada a la utilización parenteral debe cumplir varios requisitos con el fin de ser autorizada por las autoridades reguladoras para su utilización en el ser humano. De esta manera, debe ser biocompatible y biodegradable y todas las sustancias utilizadas y sus productos de degradación deben ser no tóxicos. Además de esto, los fármacos particulados destinados a la inyección deben ser suficientemente pequeños para pasar por la aguja de inyección, lo que preferentemente significa que deben ser inferiores a 200 \mum. El fármaco no debe degradarse sustancialmente en la formulación durante la producción o almacenamiento de la misma, o tras la administración, y debe liberarse en una forma biológicamente activa con una cinética reproducible.

Una clase de polímeros que cumple los requisitos de biocompatibilidad y de biodegradación en productos finales inocuos son los poliésteres lineales basados en ácido láctico, ácido glicólico y mezclas de los mismos. En el texto posteriormente dichos polímeros se denominan PLGA. Los PLGA resultan degradados por hidrólisis de ésteres a ácido láctico y ácido glicólico y se ha demostrado que muestran una biocompatibilidad excelente. La naturaleza inocua de PLGA queda adicionalmente ejemplificada por la autorización de varias formulaciones parenterales de liberación sostenida basadas en estos polímeros por parte de autoridades reguladoras, por ejemplo la US Food and Drug Administration.

Entre los productos de liberación sostenida parenteralmente administrables presentes en el mercado actualmente basados en los PLGA se incluyen Decapeptyl^{TM} (Ibsen Biotech.), Prostap SR^{TM} (Lederle), Decapeptyl® Depot (Ferring) y Zoladex® (Zeneca). Todos los fármacos de estas formulaciones son péptidos. En otras palabras, consisten de aminoácidos condensados en un polímero con un grado de polimerización relativamente reducido y no presentan ninguna estructura tridimensional bien definida. Esto, a su vez, generalmente permite la utilización de condiciones bastante duras durante la preparación de dichos productos. Por ejemplo, puede utilizarse la extrusión y consiguiente reducción de tamaño, técnicas que no resultarían permisibles con proteínas, debido a que éstas generalmente no resisten condiciones tan duras.

En consecuencia, también existe una necesidad de formulaciones de liberación sostenida para proteínas. Las proteínas son similares a los péptidos en que también consisten de aminoácidos, pero las moléculas son de mayor tamaño y la mayoría de las proteínas dependen de una estructura tridimensional bien definida para la conservación de muchas de sus propiedades, incluyendo las actividades biológicas y la inmunogenicidad. Sus estructuras tridimensionales pueden resultar destruidas con relativa facilidad, por ejemplo por altas temperaturas, por desnaturalización inducida en superficie y, en muchos casos, por la exposición a solventes orgánicos. De esta manera, una desventaja muy seria en la utilización de PLGA, que per se es un material excelente, para la liberación sostenida de proteínas, es el requisito de utilizar
solventes orgánicos para disolver dichos PLGA, con el riesgo asociado de comprometer la estabilidad de la proteína.

A pesar de los grandes esfuerzos centrados en modificar la tecnología de los PLGA con el fin de evitar esta problema inherente de inestabilidad de las proteínas durante el procedimiento de preparación, el progreso en este campo ha sido muy lento y hasta el momento no han aparecido productos proteicos en el mercado basados en tecnología de PLGA. El motivo principal para ello probablemente es que las estructuras tridimensionales de la mayoría de proteínas son demasiado sensibles para resistir los procedimientos de preparación utilizados y/o su almacenamiento en una matriz de PLGA.

La técnica utilizada con más frecuencia en la actualidad para encapsular sustancias solubles en agua, tales como proteínas y péptidos, es la utilización de múltiples sistemas de emulsión. La sustancia farmacológica se disuelve en una solución de agua o tamponadora y después se mezcla con un solvente orgánico, inmiscible con agua, que contiene el polímero disuelto. Se crea una emulsión que presenta la fase agua como fase interna. Con frecuencia se utilizan diferentes tipos de emulsionantes y mezcla vigorosa para crear esta primera emulsión. A continuación, dicha emulsión se transfiere, bajo agitación, a otro líquido, típicamente agua, que contiene otro polímero, por ejemplo alcohol polivinílico, proporcionando una triple emulsión w/o/w. El modo utilizado más frecuentemente es utilizar un solvente orgánico con un punto de ebullición bajo, típicamente diclorometano, y evaporar el solvente. Si el solvente orgánico no es completamente inmiscible con agua, puede utilizarse un procedimiento continuo de extracción mediante la adición de más agua a la triple emulsión. También se describen en la literatura varias variaciones de este procedimiento general. En algunos casos la emulsión principal se mezcla con una fase no acuosa, por ejemplo aceite de silicona. También pueden utilizarse materiales farmacológicos sólidos y no fármacos disueltos.

Los perfiles de liberación de proteínas desde microesferas preparadas mediante dicho procedimiento con frecuencia muestran una liberación inicial rápida seguido de una etapa más lenta. A dicha etapa más lenta puede seguir una tercera etapa de liberación más rápida.

Se dan a conocer microesferas de PLGA que contienen proteínas en la patente WO No. A1-9013780, la característica principal de la cual es la utilización de temperaturas muy bajas durante la preparación de las microesferas con el fin de conservar una actividad biológica elevada de las proteínas. Se midió la actividad de la superóxido dismutasa encapsulada, aunque sólo en la parte liberada de las partículas. Este procedimiento se ha utilizado para producir microesferas de PLGA que contienen hormona de crecimiento humana en la patente WO No. A1-9412158 mediante la dispersión de hormona de crecimiento humana en PGLA que contiene cloruro de metileno, la pulverización de la dispersión obtenida en un recipiente con etanol congelado con una capa de nitrógeno líquido sobre el mismo con el fin de congelar las gotas y permitir que sedimenten a través del nitrógeno hasta el etanol. El etanol seguidamente se descongela y las microesferas empiezan a sedimentar en el etanol, donde el cloruro de metileno se extrae hacia el interior del etanol y se endurecen las microesferas. Este enfoque puede conservar la estabilidad de las proteínas mejor que la mayoría de otros procedimientos para encapsular proteínas en microesferas de PLGA. Sin embargo, esto todavía no se ha demostrado inequívocamente para otras proteínas.

Sin embargo, en los procedimientos anteriormente mencionados basados en la encapsulación con PLGA, las sustancias activas se someten a un solvente orgánico y esto generalmente resulta perjudicial para la estabilidad de la proteína. Además de lo anterior, los procedimientos de emulsión a los que se ha hecho referencia anteriormente son complicados y probablemente resulta problemático aumentarlos hasta una escala industrial. Además, muchos de los solventes orgánicos utilizados en muchos de estos procedimientos presentan muchos problemas ambientales y sus elevadas afinidades para el polímero PLGA dificultan su eliminación.

Una formulación de liberación sostenida administrable parenteralmente debe poder controlar la liberación del fármaco atrapado de una manera precisa. En muchos de los sistemas basados en PLGA, la liberación del ingrediente activo depende en gran medida de la cantidad de sustancia farmacológica incorporada dentro de la micropartícula, debido a la formación de canales en las micropartículas a cargas de fármaco más altas. Esto también contribuye a una explosión inicial elevada a cargas de fármaco elevadas.

Una manera bien conocida de controlar la liberación de moléculas pequeñas desde un núcleo sólido es aplicar un recubrimiento que produzca una película controladora de tasa sobre la superficie del núcleo. Éste es un procedimiento general para controlar la tasa de liberación de fármacos que deben administrarse por la vía oral. Una manera de aplicar recubrimientos similares es mediante la utilización de tecnología de suspensión en aire. Por ejemplo, la patente EP No. A-0347024 A2 da a conocer una composición de recubrimiento para un fármaco que puede aplicarse utilizando la técnica de suspensión en aire. La composición de recubrimiento comprende un copolímero de acrilato de alquilo inferior-metacrilato de alquilo inferior en el que el grupo de alquilo inferior comprende 1 a 7 átomos de carbono y una dispersión polimérica acuosa de etil celulosa. La patente US No. A-5296219 da conocer un procedimiento para recubrir por lo menos un principio activo medicinal y/o alimentario que resulta útil para rumiantes en los que se sintetiza un polímero sensible al pH en una emulsión de aceite-en-agua y, sin aislamiento, se recubre sobre el principio activo, por ejemplo de acuerdo con la técnica de lecho fluidizado de Worster, tal como se describe en la patente US No. A-2799241 y en la patente EP No. A-0188953. De acuerdo a la patente US No. A-5296219, la emulsión de recubrimiento preferentemente contiene el polímero sensible al pH, junto con uno o más polímeros insolubles en
agua.

Sin embargo, con referencia al recubrimiento de partículas para la utilización en la administración parenteral, en la que las partículas generalmente presentan un tamaño inferior a 200 \mum, y con frecuencia presentan un tamaño todavía inferior, se producen problemas generalmente severos. Estos problemas pueden ser una tendencia incrementada a que las partículas se aglomeren y problemas de alteración del procedimiento de fabricación por la electricidad
estática.

Algunas maneras diferentes de recubrir partículas de estos tamaños reducidos son la dispersión del fármaco en una solución del material de recubrimiento y el posterior secado por pulverización, y varios procedimientos de coacervación en los que se utiliza un polímero disuelto para encapsular el material del núcleo de diferentes maneras. Sin embargo, todos estos procedimientos exponen la proteína al solvente orgánico utilizado para disolver el PLGA. Un procedimiento en el que se utiliza un lecho fluidizado en el recubrimiento de micropartículas se da a conocer en la patente US No. 4.568.559. En ésta, se prepara una mezcla de compuesto seco sólido a partir de una dispersión uniforme de un ingrediente activo de un polímero formador de película, moliendo después la mezcla y tamizando las partículas resultantes para obtener una distribución de tamaños de 1 a 150 \mum. Las partículas de núcleo seguidamente se recubren en un lecho fluidizada, siendo un prerrequisito, sin embargo, que se utiliza el mismo material polímero formador de película, o sustancialmente el mismo, tanto para la preparación del núcleo de compuesto como el recubrimiento, para permitir la unión del recubrimiento de pared del polímero formador de película al material del núcleo. De esta manera, este procedimiento tampoco elimina el problema de exposición de la proteína a solventes orgánicos si el polímero formador de película es PLGA, o cualquier otro polímero que no sea soluble en
agua.

\newpage

De esta manera, un procedimiento para producir formulaciones de liberación sostenida parenteralmente administrables para sustancias sensibles, por ejemplo proteínas, con las propiedades siguientes resultaría altamente deseable:

: que pueda controlar la tasa de liberación de las sustancias encapsuladas dentro de amplios márgenes, típicamente de un día o de unos cuantos días hasta por lo menos aproximadamente un mes;

: que permita llevar a cabo la producción con equipos farmacéuticos convencionales y que puedan utilizarse en la fabricación a escala reducida y en la producción a gran escala;

: que permita eliminar, o minimizar, la exposición del ingrediente activo a solventes orgánicos; y

: que resulte completamente biodegradable y presente una superficie de un material biocompatible.

Descripción de la invención

De acuerdo con la presente invención, se ha descubierto que resulta posible preparar una formulación de liberación sostenida parenteralmente administrable con las características indicadas anteriormente. El nuevo procedimiento reivindicado, de esta manera, permite aprovechar las excelentes propiedades de biocompatibilidad y de control de la tasa del PLGA, evitando o minimizando simultáneamente la exposición de, por ejemplo, una proteína que debe formularse, a solventes orgánicos. Sin embargo, la invención no se limita a la utilización de PLGA únicamente como material de recubrimiento, o la utilización de una proteína únicamente como el ingrediente activo. Por el contrario, la invención resulta aplicable a la utilización de cualquier polímero que sea formador de película, biodegradable y controlador de la liberación, especialmente un polímero para el que se hayan utilizado solventes orgánicos con anterioridad. Otro prerrequisito para un polímero es, evidentemente, que sea farmacéuticamente aceptable, requisito que resulta aplicable también a todos los demás materiales o ingredientes utilizados en la formulación. Además, la invención resulta útil para todas las sustancias activas que pueden utilizarse en la administración parenteral. Principalmente, sin embargo, la invención presenta una solución al problema anteriormente descrito con sustancias activas sensibles a solventes orgánicos, o inestables en los mismos.

Brevemente, la invención se basa en la idea de encapsular el ingrediente activo en micropartículas sin utilizar ningún solvente orgánico, tratando las micropartículas hasta el estado seco y posteriormente recubriendo las micropartículas con un polímero biodegradable utilizando una técnica de suspensión en aire para eliminar, muy rápidamente, cualquier solvente orgánico utilizado para el recubrimiento de polímero con el fin de evitar cualquier exposición sustancial de la sustancia activa al solvente orgánico.

Más específicamente, de acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento según la reivindicación 1 posteriormente, para preparar micropartículas de liberación sostenida administrables parenteralmente, preferentemente mediante inyección, que contiene una sustancia biológicamente activa que sea inestable en presencia de un solvente orgánico.

Debido a que el procedimiento está destinado principalmente a la preparación de micropartículas adaptadas para la administración mediante inyección, las micropartículas preferentemente presentan un diámetro medio comprendido en el intervalo entre 10 y 200 \mum, más preferentemente entre 20 y 100 \mum, y todavía más preferentemente inferior a 60 \mum, por ejemplo de entre 10 y 60 \mum o de entre 40 y 60 \mum.

El material del núcleo de partícula es un almidón o un almidón química o físicamente modificado. Estos materiales ya son conocidos per se en el presente campo técnico, y por lo tanto, puede hacerse referencia a la técnica anterior con referencia a los detalles sobre estos almidones. Las micropartículas preparadas a partir de almidón pueden diseñarse de manera que sean disueltas por la \alpha-amilasa, un enzima presente en el suero y en el líquido extracelular, y debido a que el producto final de degradación es glucosa, las micropartículas de almidón pueden cumplir el requisito de biodegradabilidad.

Los polímeros preferentes para la cubierta son poliésteres alifáticos (por ejemplo homopolímeros) o copolímeros de \alpha-hidroxiácidos o dímeros cíclicos de \alpha-hidroxiácidos.

Dicho \alpha-hidroxiácido preferentemente se selecciona de entre el grupo que consiste en ácido láctico y ácido glicólico. En otras palabras, un homopolímero preferente puede ser, por ejemplo, ácido poliláctico o ácido poliglicólico, mientras que un copolímero preferente puede ser un copolímero de ácido láctico/ácido glicólico.

Los dímeros cíclicos preferentemente se seleccionan de entre el grupo que consiste en glicólidos y lácticos.

Sin embargo, tal como se ha indicado anteriormente, también podrían utilizarse otros polímeros biodegradables con la condición de que el polímero sea capaz de formar una película con las propiedades deseadas respecto a estabilidad mecánica y propiedades de control de la liberación, tales como la permeabilidad al ingrediente activo o la formación de poros. Estas propiedades podrían ser cumplidas por el polímero mismo o mediante la inclusión de otras sustancias en el recubrimiento. El material de recubrimiento utilizado evidentemente también podría ser una mezcla de dos o más de los polímeros indicados. Además, dichos polímeros también pueden utilizarse en la forma de sus sales.

La sustancia biológicamente activa puede encapsularse en las micropartículas, sin utilizar solvente orgánico, de varias maneras. Una manera especialmente preferente es la utilización de una técnica denominada de sistema acuoso de dos fases, que se conoce con anterioridad per se. Dicho procedimiento se da a conocer, por ejemplo, en la patente US No. 4.822.535, lo que implica que pueden encontrarse detalles sobre dicha técnica en la misma. Otra manera implica la preparación de micropartículas nucleares que sean capaces de absorber agua en un procedimiento separado, la eliminación de cualquier solvente orgánico utilizado y la carga de las micropartículas obtenidas con la sustancia activa mediante la exposición de las micropartículas secas a una solución de dicha sustancia activa para que la solución resulte absorbida por las micropartículas, que seguidamente se secan.

El secado de las partículas nucleares puede conseguirse mediante cualquier medio apropiado, por ejemplo mediante secado por pulverización, secado por congelación o secado al vacío. Con el fin de eliminar el exceso de sustancia activa, las micropartículas o núcleos también podrían lavarse previamente a la etapa de secado.

Las partículas nucleares que contienen la sustancia activa posteriormente se recubren mediante una técnica de suspensión de aire que permite la creación de una cubierta de polímero sobre las partículas nucleares sin ninguna exposición sustancial o perjudicial de la sustancia activa a solvente orgánico. Dicha técnica de suspensión en aire puede ser cualquier procedimiento que se clasifique como procedimiento de suspensión en aire y sea capaz de aplicar un recubrimiento satisfactorio. Entre los ejemplos preferentes de estos procedimientos se encuentran los procedimientos en los que se utiliza un lecho fluidizado o un denominado lecho en surtidor, o el denominado procedimiento Wurster, todos los cuales se conocen con anterioridad per se y no requieren ser descritos en detalle en la presente memoria. De esta manera, la expresión "procedimiento de suspensión en aire" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier procedimiento en el que se suspenden partículas sólidas en un flujo que se mueve hacia arriba de gas. Dicho gas podría ser cualquier gas capaz de evaporar el solvente utilizado y no es necesario que sea aire, a pesar de que se utiliza la expresión "suspensión en aire".

Sin embargo, en relación a la técnica de suspensión en aire, se ha descubierto que los problemas con las sustancias activas sensibles y su exposición a solventes orgánicos se eliminan, o se reducen esencialmente, utilizando preferentemente un caudal elevado de aire, o de gas, suficiente para conseguir el resultado deseado.

De acuerdo con el procedimiento reivindicado, el polímero se aplica sobre las partículas nucleares desde una emulsión de las mismas. A este respecto debe indicarse que puede utilizarse un solvente orgánico para el polímero, debido a que inesperadamente se ha descubierto que, mediante el nuevo procedimiento de acuerdo con la invención, la sustancia activa no se ve influida en grado sustancial por la presencia de dicho solvente.

Dicha emulsión es una emulsión en la que una de las fases es una fase agua. En el caso de una mezcla de diferentes polímeros, pueden encontrarse presentes en diferentes fases de una emulsión. De esta manera, se ha descubierto que la presencia de agua puede eliminar, o reducir sustancialmente, la acumulación de electricidad estática durante el procedimiento de recubrimiento, y una realización especialmente preferente a este respecto es la utilización de una emulsión en la que una de las fases es un líquido del polímero en un solvente para dicho polímero y la otra fase es agua. La última emulsión indicada además resulta útil en un aspecto más general, tal como se describe más específicamente después y que también representa otro aspecto de la invención.

Otra realización preferente de la invención se encuentra representada por el caso en el que se incorporan uno o más agentes estabilizantes en las partículas durante la preparación de las mismas. La naturaleza de este agente estabilizante evidentemente depende de la sustancia activa específica que debe estabilizarse y dicho agente se selecciona de acuerdo a principios conocidos.

También pueden incorporarse aditivos en la cubierta de polímero controladora de la liberación durante la aplicación del mismo. Son ejemplos preferentes de estos aditivos, agentes modificadores de las propiedades de la película y agentes controladores de la liberación. Son ejemplos de la primera categoría los plastificadores, por ejemplo trietilcitrato, triacetina, polietilenglicol, polietilenóxido, etc., mientras que los agentes controladores de la liberación pueden ser, por ejemplo, bases inorgánicas (por ejemplo hidróxido sódico, hidróxido de potasio, carbonato sódico, carbonato de potasio, etc.), bases orgánicas (por ejemplo etanolamina, dietilanolamina, trietilanolamina, lidocaína, tetracaína, etc.), ácidos inorgánicos (por ejemplo sulfato amónico, cloruro amónico, etc.), ácidos orgánicos (por ejemplo ácido cítrico, ácido láctico, ácido glicólico, ácido ascórbico, etc.) y sustancias solubles sólidas que al liberarse crean poros en el recubrimiento (por ejemplo cristales de cloruro sódico, glucosa, manitol, sacarosa, etc.).

Los aditivos que deben incluirse en el caso de que se cree una emulsión o un pseudolátex son, por ejemplo, los emulsionantes.

La cantidad necesaria de material de recubrimiento depende, por ejemplo, del tamaño de las microcápsulas, de la composición del recubrimiento y de las características de liberación deseadas. Sin embargo, son cantidades típicas 1 a 200 por ciento en peso, preferentemente 5 a 100 por ciento en peso, basado en el peso del núcleo.

Tras la aplicación del recubrimiento que controla la liberación de la sustancia activa encapsulada, también pueden aplicarse materiales adicionales, por ejemplo pulverizados, sobre las micropartículas, con el fin de modificar adicionalmente las propiedades de las mismas, o para facilitar la manipulación de las mismas. Son ejemplos de estos materiales el manitol, la sacarosa y el cloruro sódico.

Tal como ya se ha indicado anteriormente, la invención resulta especialmente interesante en relación a las proteínas, péptidos y polipéptidos, u otros fármacos o sustancias biológicamente activas que son sensibles a los solventes orgánicos o inestables en presencia de los mismos. Sin embargo, la invención generalmente no se encuentra limitada a la presencia de estas sustancias únicamente, debido a que la idea inventiva resulta aplicable a cualquier sustancia biológicamente activa que pueda utilizarse para la administración parenteral. De esta manera, además de los problemas de sensibilidad o de inestabilidad, la invención puede resultar de especial interés en casos en los que de otra manera resultaría difícil eliminar los solventes, o en los que podrían producirse problemas toxicológicos u otros problemas ambientales.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporcionan micropartículas de liberación sostenida parenteralmente administrables según la reivindicación 9 posteriormente, que pueden obtenerse de acuerdo con el procedimiento de la invención.

Ejemplos

A continuación se ejemplifica la invención mediante los ejemplos no limitativos siguientes, en los que partículas que contienen BSA, que es la proteína modelo más extensivamente utilizada para estos sistemas debido a sus bien conocidas características y coste moderado, se recubren con una capa que comprende poli(láctido-co-glicólido). Además, se recubren micropartículas que contienen insulina humana, debido a que la insulina se conoce que es una proteína sensible y la actividad biológica de la preparación final puede someterse a ensayo con facilidad in vivo. Las micropartículas se preparan, por ejemplo, de acuerdo con la técnica dada a conocer en la patente US nº 4.822.535. El recubrimiento se aplica con equipos disponibles comercialmente y los parámetros fijados en los ejemplos deben considerarse meramente como recomendaciones, debido a que pueden resultar necesarios ajustes en muchos casos para alcanzar las condiciones óptimas para el recubrimiento.

Procedimiento preliminar para la preparación de partículas nucleares

Procedimiento alternativo 1

Inmovilización de dos fases de acuerdo con la patente US No. 4.822.535.

1.: Pesar 80 g de almidón (Amioca 50, National Starch) y suspender en 320 g de tampón de bicarbonato sódico 50 mM, pH 9,8.

2.: Calentar la suspensión hasta que el almidón se haya disuelto por completo.

3.: Enfriar la solución a 50ºC.

4.: Añadir 96 ml de una solución de BSA al 9,26% (temperatura ambiente) en tampón de bicarbonato sódico 50 mM, pH 9,8, y agitar durante 10 segundos.

5.: Añadir solución de almidón-proteína a 800 ml de una solución de polietilenglicol al 20% p/p en tampón de bicarbonato sódico 50 mM, pH 9,8 (temperatura ambiente, peso molecular medio: 20.000), bajo agitación continua.

6.: Tras 2 minutos, añadir 3.200 ml de una solución de polietilenglicol al 40% p/p en tampón de bicarbonato sódico 50 mM, pH 9,8 (temperatura ambiente, peso molecular medio: 20.000), bajo agitación continua.

7.: Agitar durante 24 horas.

8.: Las micropartículas obtenidas se lavan y se secan al vacío.

9.: Las partículas secas se tamizan a través de una malla de 160 \mum.

Procedimiento alternativo 2

1.: Pesar 80 g de almidón (Amioca 50, National Starch) y suspender en 420 g de agua.

3.: Enfriar la solución a 50ºC.

4.: Añadir la solución de almidón a 800 ml de una solución de polietilenglicol al 20% p/p en agua (temperatura ambiente, peso molecular medio: 20.000 D), bajo agitación continua.

5.: Tras 2 minutos, añadir 3.200 ml de una solución de polietilenglicol al 40% p/p en agua (temperatura ambiente, peso molecular medio: 20.000 D), bajo agitación continua.

6.: Agitar durante 24 horas.

7.: Las micropartículas obtenidas se lavan y se secan al vacío.

8.: Las micropartículas secas se impregnan con una solución de BSA al 5% (p/p) en agua. Se utiliza el mismo peso de partículas que de solución en BSA.

9.: Tras 3 horas, las partículas se secan por congelación.

10.: Las microesferas secas se tamizan a través de un tamiz de 160 \mum.

Procedimiento alternativo 3

3.: Enfriar la solución a 50ºC.

4.: Centrifugar 2.511 ml de Monotard®, de Novo Nordisk, correspondientes a 8,89 g de insulina. Lavar la insulina una vez con 500 ml de un tampón que contiene NaCl 0,15 M, ZnCl_{2} 1 mM y acetato sódico 10 mM con un pH de 7,3, y centrifugar nuevamente. Mezclar la insulina con la solución de almidón y agitar durante 10 segundos.

7.: Agitar durante 24 horas.

8.: Las micropartículas obtenidas se lavan y se secan al vacío.

Procedimiento para aplicar la cubierta Ejemplo 1 Procedimiento para la preparación de la solución de recubrimiento

1.: Pesar 200 g de poli(láctido-co-glicólido 75/25) Resomer RG756, de Boehringer Ingelheim.

2.: Añadir 10 g de triacetina.

3.: Disolverlos en 3.123 g de acetona.

Procedimiento para la aplicación del recubrimiento

1.: Cargar 500 g de micropartículas de almidón que contienen BSA al 3,5% en un Wurster de 6'' Glatt GPCG.

2.: Se fijan las condiciones siguientes del Wurster:

	Presión de atomización	3 barias
	Boquilla atomizadora	0,8 mm
	Temperatura de la entrada	38 a 40ºC
	Temperatura de la salida	33 a 37ºC
	Temperatura del producto	34 a 38ºC
	Velocidad del aire	3,2 a 3,4 m/s
	Flujo de solución de recubrimiento	4,4 ml/min

3.: Recuperar el producto recubierto.

Ejemplo 2 Procedimiento para la preparación de solución de recubrimiento

1.: Pesar 200 g de poli(láctico-co-glicólido 50/50) Resomer RG504H, de Boeringer Ingelheim.

2.: Disolverlo en 3.133 g de acetona.

Procedimiento para la aplicación del recubrimiento

1.: Se cargan 500 g de micropartículas de almidón que contienen BSA al 3,5% en un analizador Wurster de 6'' Glatt GPCG.

2.: Se fijan las condiciones siguientes para el Wurster:

	Presión de atomización	3 barias
	Boquilla atomizadora	0,8 mm
	Temperatura de la entrada	38 a 40ºC
	Temperatura de la salida	33 a 37ºC
	Temperatura del producto	34 a 38ºC
	Velocidad del aire	3,0 a 3,2 m/s
	Flujo de solución de recubrimiento	4,4 ml/min

3.: Recuperar el producto recubierto.

Ejemplo 3 Procedimiento para la preparación de la solución de recubrimiento

1.: Pesar 40 g de poli(D,L-láctido) Resomer R104 y 40 g de poli(láctido-co-glicólido 75/25) Resomer RG756, de Boehringer Ingelheim.

2.: Disolverla en 1.252 g de acetato de etilo.

3.: Mezclar 2.504 g de agua con 1,6 g de Tween 80.

4.: Mezclar la solución de polímero y la solución de agua utilizando un mezclador turrax Ystral a velocidad elevada.

Procedimiento para la aplicación del recubrimiento

1.: Cargar 100 g de micropartículas de almidón que contienen BSA al 2,7% en un recubridor Hüttlin Kugelcoater HKC005.

2.: Se fijan las condiciones siguientes para el recubridor kugelcoater:

	Presión de atomización	0,8 barias
	Presión del microclima	0,4 barias
	Boquilla atomizadora	0,6 mm
	Temperatura de la entrada	25 a 27ºC
	Temperatura de la salida	20 a 24ºC
	Flujo de solución de recubrimiento	5 a 7 g/min

3.: Tras el recubrimiento con PLGA, se pulverizan 200 g de una solución de agua que contiene manitol al 10% p/p y Tween 80 al 0,4% p/p sobre las partículas con un flujo de 3,5 g/min.

4.: Recuperar el producto recubierto.

Procedimiento para la liberación in vitro

Se realiza un seguimiento de la liberación in vitro pesando 70 mg de producto recubierto y añadiendo 1,5 ml de solución tampón a un tubo eppendorf de polipropileno. El tampón de liberación consistía de fosfato sódico 30 mM, pH 7,4, I-0,154 con cloruro sódico, cloruro de calcio 1 mM, \alpha-amilasa 72 U/l, y azida sódica al 0,02%. A los intervalos apropiados se retira 1 ml de tampón y se añade tampón fresco a las muestras con el fin de mantener el pH correcto. Los
tubos se mecen lentamente a 37ºC. Las concentraciones de proteína y de almidón se miden conjuntamente con el pH.

Procedimiento de liberación in vivo

Se utilizaron 10 ratas SPF hembra (9 a 10 semanas, 170 a 180 g) para estudiar la liberación in vivo de BSA de las microesferas recubiertas. Se inyectaron subcutáneamente en el cuello 200 \mug de una suspensión que contenía 163 mg/ml de micropartículas preparadas de acuerdo con el Ejemplo 3. El vehículo para la inyección era solución fisiológica de cloruro sódico que contenía carboximetilcelulosa sódica al 3% como adyuvante de suspensión. La inyección se llevó a cabo con una aguja 21 G.

Como grupo de control, se administraron microesferas no recubiertas a 8 animales para la comparación. La dosis de BSA era cuatro veces superior en la preparación recubierta que en la preparación no recubierta.

Se extrajeron muestras de sangre para medir BSA del plexo orbital el día 0 antes de la dosificación y por la tarde y a las mismas horas del día los días 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7. Se extrajeron quinientos \mul de sangre y se analizaron para BSA en el suero. Las concentraciones de BSA en el suero se analizaron utilizando un procedimiento ELISA basado en un anticuerpo disponible comercialmente (Dakopatts) que reacciona con albúmina bovina pero no con albúmina de rata.

Ejemplo 4

El procedimiento para preparar la solución de recubrimiento era similar al del Ejemplo 3.

Procedimiento para la aplicación del recubrimiento.

Se cargaron 100 g de micropartículas de almidón que contenía 9,3% de insulina (Monotard®, de Novo Nordisk) en un recubridor Hüttlin Kugelcoater HKC005.

El resto del procedimiento de recubrimiento es similar al del Ejemplo 3.

Procedimiento para la liberación in vivo

Se utilizaron 10 ratas SPF hembra (de 9 a 10 semanas, 170 a 180 g) para estudiar los efectos biológicos de la preparación del Ejemplo 4. Tres días antes de la inyección con la sustancia de ensayo, las ratas se trataron con 65 mg/kg de estreptozotocina con el fin de inducir diabetes. Se disolvió estreptozotocina en un tampón de citrato al 1% a pH 4,5, como máximo dos minutos antes de la inyección.

En el día de la inyección, se inyectaron subcutáneamente en el cuello 200 \mul de una suspensión que contenía 51 mg/ml de las micropartículas del Ejemplo 4. El vehículo para la inyección era solución fisiológica de cloruro sódico que contenía 3% de carboximetilcelulosa sódica como adyuvante de suspensión. La inyección se llevó a cabo utilizando una aguja 21 G. Como grupo de control, se administraron microesferas no recubiertas a 8 animales para la comparación. La dosis de insulina era 2,5 veces superior para las microesferas no recubiertas que para las microesferas recubiertas.

Se extrajeron muestras de sangre para medir la glucosa en sangre del plexo orbital el día 0 antes de la dosificación de insulina, y por la tarde y a las mismas horas del día los días 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 y por la tarde el día 9, y para los animales que recibieron microesferas recubiertas, también por la tarde del día 11. Se llevaron a cabo los análisis de glucosa en sangre utilizando un kit comercial de Roche en un analizador COBAS MIRA.

Figuras

Las liberaciones de proteína en los ensayos in vitro y las concentraciones de BSA y los niveles de glucosa en sangre de los dos ensayos in vivo se muestran en las figuras de los dibujos adjuntos, en los que:

la Fig. 1 muestra la liberación desde las partículas recubiertas del Ejemplo 1;

la Fig. 2 muestra la liberación desde las partículas recubiertas del Ejemplo 2;

la Fig. 3 muestra la liberación de las partículas recubiertas del Ejemplo 3;

la Fig. 4 muestra las concentraciones medias de BSA en suero procedente de la liberación in vivo para las partículas recubiertas del Ejemplo 3 y de las partículas de BSA no recubiertas;

la Fig. 5 muestra los niveles medios de glucosa en sangre de la liberación in vivo de insulina de las partículas del Ejemplo 4 y de las partículas de insulina no recubiertas.

Más específicamente, puede apreciarse lo siguiente en las figuras.

En la Fig. 1, puede observarse la liberación acumulativa de proteína desde las partículas recubiertas del Ejemplo 3. Las curvas representan diferentes niveles de recubrimiento (porcentaje en peso de polímero de recubrimiento añadido respecto al peso del núcleo), tal como se indica en la leyenda. El núcleo se degrada con rapidez y libera la mayor parte de la proteína en un espacio corto de tiempo. Puede apreciarse una explosión en todos los niveles de recubrimiento, pero se reduce más y más. El polímero de recubrimiento se degrada lentamente y, por lo tanto, no se libera una cantidad apreciable de proteína tras la etapa de explosión.

En la Fig. 2 se muestra la liberación de proteína desde las partículas recubiertas a un nivel de recubrimiento del 40%, tal como se ha definido anteriormente en el Ejemplo 4. El polímero se degrada con más facilidad, proporcionando inicialmente una explosión limitada de manera similar al Ejemplo 1, aunque posteriormente, tras aproximadamente 2 semanas, el resto de la proteína empieza a liberarse de las micropartículas recubiertas.

En la Fig. 3, puede observarse la liberación de proteína desde las partículas recubiertas (nivel de recubrimiento del 80%, tal como se ha definido anteriormente) del Ejemplo 3. En este caso, la proteína se libera más continuamente que en los Ejemplos 1 y 2.

En la Fig. 4, pueden observarse las concentraciones medias de BSA de la liberación in vivo. Se muestra una liberación constante de BSA durante todo el estudio, en comparación con las microesferas no recubiertas.

En la Fig. 5 se muestran los niveles medios de glucosa en sangre de la liberación in vivo de insulina desde las partículas del Ejemplo 4 y desde las partículas no recubiertas. Para ambas preparaciones, puede observarse una rápida normalización del nivel de glucosa en sangre tras 6 horas. Tras un día, los niveles han vuelto a los niveles diabéticos, mientras que para la preparación recubierta, los niveles empiezan a bajar nuevamente, mostrando una depresión máxima del nivel de glucosa en sangre tras siete días. En el día 11, los niveles de glucosa en sangre han vuelto nuevamente al estado diabético. De esta manera, la insulina ha conservado su actividad biológica durante todo el procedimiento y durante por lo menos 9 días después de la inyección. Con las partículas no recubiertas no pudo observarse ningún efecto retrasado.

Claims

1. Procedimiento de preparación de micropartículas de liberación sostenida administrables parenteralmente que contienen una sustancia biológicamente activa que es inestable en presencia de un solvente orgánico; comprendiendo dicho procedimiento aplicar una emulsión de un polímero formador de película biodegradable controlador de la liberación, o una mezcla de dos o más de estos polímeros, mediante la técnica de suspensión en aire sobre partículas nucleares biodegradables con dicha sustancia biológicamente activa encapsulada en las mismas; en el que dichas partículas nucleares se forman a partir de almidón o de un almidón química o físicamente modificada que puede disolverse con \alpha-amilasa, y en el que una fase de dicha emulsión es un líquido de dicho polímero controlador de la liberación o una mezcla de dos o más de dichos polímeros en un solvente inorgánico, y la otra fase es agua.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho polímero se selecciona de entre los homopolímeros y copolímeros preparados a partir de \alpha-hidroxiácidos y/o dímeros cíclicos de \alpha-hidroxiácidos.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho \alpha-hidroxiácido se selecciona de entre ácido láctico y ácido glicólico.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dichos dímeros cíclicos se seleccionan de entre glicólidos y láctidos.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho solvente orgánico se selecciona de entre alcoholes superiores, ésteres, éteres, cetonas, hidrocarburos clorados, hidrocarburos alifáticos e hidrocarburos aromáticos.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicha fase comprende una mezcla de poli(D,L-láctido) y poli(láctido-co-glicólido 75/25) y dicho solvente orgánico es acetato de etilo.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha emulsión contiene un emulsionante estabilizador.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicho emulsionante es un surfactante aniónico o un surfactante no iónico o una combinación de los mismos.

9. Micropartículas de liberación sostenida administrables parenteralmente que contienen una sustancia biológicamente activa que es inestable en presencia de un solvente orgánico, micropartículas que pueden obtenerse de acuerdo con el procedimiento según la reivindicación 1; en las que dichas micropartículas comprenden partículas nucleares biodegradables con dicha sustancia biológicamente activa encapsulada en las mismas y una cubierta de un polímero formador de película biodegradable controlador de la liberación o una mezcla de dos o más de dichos polímeros sobre las mismas; formando dichas partículas nucleares a partir de un almidón o un almidón química o físicamente modificado que puede disolverse con \alpha-amilasa; seleccionando dicho polímero de entre los homopolímeros o copolímeros preparados a partir de \alpha-hidroxiácidos y/o dímeros cíclicos o \alpha-hidroxiácidos.

10. Micropartículas de liberación sostenida administrables parenteralmente según la reivindicación 9, en las que dicho \alpha-hidroxiácido se selecciona de entre ácido láctico y ácido glicólico.

11. Micropartículas de liberación sostenida administrables parenteralmente, según la reivindicación 9, en las que dichos dímeros cíclicos se seleccionan de entre glicólidos y láctidos.

12. Micropartículas de liberación sostenida administrables parenteralmente, según las reivindicaciones 9, 10 ú 11, en las que dichas micropartículas presentan un diámetro medio comprendido en el intervalo entre 10 y 200 \mum.

13. Micropartículas de liberación sostenida administrables parenteralmente, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en las que se incorporan uno o más agentes estabilizantes en dichas partículas.

14. Micropartículas de liberación sostenida administrables parenteralmente, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en las que dicha cubierta de polímero controlador de la liberación incorpora agentes modificadores de las propiedades de la película o agentes controladores de la liberación.

15. Micropartículas de liberación sostenida administrables parenteralmente, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, en las que la cantidad de dicho polímero controlador de la liberación o mezcla de dos o más de dichos polímeros recubiertos sobre dichas partículas nucleares es de 1 a 200 por ciento en peso basado en el peso de dichas partículas nucleares.

16. Micropartículas de liberación sostenida administrables parenteralmente, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, en las que dicha sustancia biológicamente activa se selecciona de entre proteínas, péptidos y polipéptidos.