ES2307779T3

ES2307779T3 - Formulaciones de microparticulas a base de propelentes.

Info

Publication number: ES2307779T3
Application number: ES02761411T
Authority: ES
Inventors: Larry R. Brown; Terrence L. Scott; Julia Rashba-Step; John K. Mcgeehan
Original assignee: Baxter Healthcare SA; Baxter International Inc
Current assignee: Baxter Healthcare SA; Baxter International Inc
Priority date: 2001-08-16
Filing date: 2002-08-16
Publication date: 2008-12-01
Anticipated expiration: 2022-08-16
Also published as: WO2003015750A1; ATE395042T1; EP1418890B1; DE60226613D1; DK1418890T3; PT1418890E; EP1418890A1; US20030064033A1

Abstract

Composición para la administración pulmonar que comprende. a) múltiples microesferas sólidas o semisólidas que contienen una proteína o un péptido, b) un propelente; caracterizada porque la que la composición no comprende un agente tensioactivo y porque las microesferas se pueden producir mezclando una solución acuosa de dicha proteína o péptido y un polímero, siendo dicho polímero soluble en agua o soluble en un disolvente miscible en agua.

Description

Formulaciones de micropartículas a base de propelentes.

Campo de la invención

En general, esta invención se refiere a composiciones de micropartículas, incluyendo composiciones de micropartículas tales como microesferas en un propelente, por ejemplo un propelente hidrofluoroalcano (HFA), o microesferas para su administración por métodos de inhalación de polvo seco, así como a métodos para elaborar y utilizar dichas composiciones.

Antecedentes de la invención

La preparación y administración de proteínas terapéuticas de interés es un área de actividad de intenso y continuado estudio y desarrollo en la industria farmacéutica. Es muy deseable formular proteínas con características de liberación selectiva en el paciente con el máximo de eficacia clínica y fáciles de elaborar. Para la administración transalveolar es preferente la preparación de la proteína en forma de microesferas discretas, que son partículas sólidas o semisólidas con un diámetro de entre 0,5 y 5,0 micras. También es deseable que las partículas tengan un contenido en proteínas lo más alto posible para facilitar la máxima eficacia terapéutica, así como para eliminar excipientes no terapéuticos.

Durante muchos años las microesferas se han comercializado las microesferas para aplicaciones bioquímicas y bioterapéuticas. Por ejemplo, los anticuerpos conjugados en perlas producen partículas relativamente grandes que son específicas para un determinado ligando. Dichas partículas grandes recubiertas de anticuerpos son utilizadas para unir receptores en la superficie de una célula para la activación celular, para unirse a una fase sólida para la purificación por inmunoafinidad y para la administración de agentes terapéuticos en un blanco utilizando anticuerpos específicos contra tumores o tisulares. Las perlas pueden estar formadas a partir de polímeros sintéticos o de proteínas, aunque a veces se prefieren los polímeros sintéticos debido a su durabilidad y coste.

Con frecuencia, las micropartículas producidas por los métodos convencionales tienen una distribución del tamaño de partícula amplia, carecen de uniformidad, no proporcionan una cinética de liberación suficiente y son difíciles y costosas de producir. A menudo, los polímeros utilizados para preparar estas micropartículas son básicamente solubles en disolventes orgánicos, lo que requiere la utilización de salas especiales diseñadas para manejar disolventes orgánicos. Los disolventes orgánicos pueden desnaturalizar las proteínas o los péptidos contenidos en las microesferas y también pueden ser tóxicos para el medioambiente, representan un peligro al inflamarse y son potencialmente tóxicos cuando se administran a humanos o animales. Además, las micropartículas pueden ser grandes y tienden a formar agregados, lo que requiere un proceso de selección del tamaño para eliminar aquellas partículas que se consideran demasiado grandes para su administración al paciente vía inyección o inhalación. Esto implica un cribado y una pérdida del producto resultante.

Las patentes US 5.981.719, US 5.849.884 y US 6.090.925 describen microesferas formadas por combinación de una macromolécula, tal como una proteína o un péptido, con un polímero, en una solución acuosa, a un pH de o próximo al punto isoeléctrico de la proteína. La solución se calienta para preparar microesferas con un contenido de proteína superior al 40%. Las microesferas así formadas comprenden una matriz de proteínas sustancialmente homogénea y cantidades variables de polímeros, lo que permite al medio acuoso entrar y solubilizar los componentes de las microesferas. Las microesferas se pueden diseñar para que muestren una cinética de liberación a corto y a largo plazo, lo que proporciona tanto características de liberación rápida como controlada.

La patente US 6.051.256 se refiere a procedimientos para la preparación de polvos de proteínas biológicas atomizando soluciones líquidas de proteínas, secando las gotitas y recogiendo las partículas resultantes. Entre las proteínas biológicas que parece se pueden utilizar en este procedimiento se incluyen la insulina y la calcitonina.

El documento WO 00/00215 describe la formación de partículas huecas, perforadas o porosas que comprenden al menos un agente bioactivo, el cual se puede formar por atomización, secado a vacío, extracción de disolvente, emulsificación o liofilización.

El documento WO 96/1919 describe una formulación en aerosol que comprende HFA, un polipéptido farmacéuticamente activo dispersable en el propelente y un agente tensioactivo que es un ácido graso C8-C16 o una sal del mismo, una sal biliar, un fosfolípido o un alquil sacárido.

El documento WO 94/07514 describe una composición para inhalación que comprende fragmentos activos de hormona paratiroidea y una carga de polvo seco farmacéuticamente aceptable.

La US 2001/1007853 describe una composición de polvo seco que comprende un análogo de insulina monomérico que se puede obtener por atomización y que, preferiblemente, contiene un agente tensioactivo.

La US 3.219.533 describe un medicamento sólido en aerosol que contiene etanol en un propelente, que puede prepararse moliendo el medicamento sólido en etanol y añadiéndole después el propelente.

En Brown Alan R. y col, "Tetrafluoroethane (HFC 134A) propellant-driven aerosols of proteins", Pharmaceutical Research (Nueva York), vol. 14, nº 11, noviembre de 1997 (1.997-11), páginas 1542-1547, se describe la formación de un aerosol de partículas de proteína que se forman utilizando un agente tensioactivo.

En Lee S-W y col., "Development of an aerosol dosage form containing insulin", Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 65, nº 4, 1976, páginas 567-572, se describe la formación de partículas que contienen insulina cristalina y un agente tensioactivo.

Se ha de observar que existe una necesidad continua de procedimientos para la preparación y administración de agentes biológicos como microesferas a fin de maximizar su eficacia y optimizar la dosificación del agente terapéutico.

Por tanto, existe una necesidad continua de desarrollar nuevos y mejores métodos para elaborar microesferas que sean útiles en aplicaciones terapéuticas y diagnósticas y, en particular, que sean útiles para elaborar y utilizar formulaciones pulmonares. Preferentemente, tales métodos y formulaciones mejoradas harían posible un método de producción rentable y permitirían la liberación de los agentes activos de un modo previsible y constante.

Sumario de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporciona una composición para la administración pulmonar según la reivindicación 1 y una composición para la administración pulmonar según la reivindicación 6. También se proporciona un método de fabricación según la reivindicación 25, un dispositivo de la administración pulmonar según la reivindicación 26 y una composición que comprende un envase según la reivindicación 27. También, se proporciona un método para la preparación de microesferas según la reivindicación 28 y métodos para la preparación de una composición según las reivindicaciones 36 y 38.

Aquí se describen métodos y composiciones para elaborar y utilizar micropartículas, por ejemplo microesferas, que contienen agentes terapéuticos y/o diagnósticos proteicos o peptídicos in vivo e in vitro. Las microesferas son especialmente útiles como componentes terapéuticos activos en inhaladores para la administración transalveolar a pacientes humanos.

Existen al menos cuatro áreas en las que la presente invención puede contrarrestar las limitaciones en este campo: a) la formación de microesferas de proteína inherentemente estables, b) la formación de estas microesferas en un rango de tamaño de partícula capaz de llegar al pulmón profundo, c) formular las microesferas de tal modo que puedan suspenderse eficaz y homogéneamente en un propelente HFA, de forma que se puedan administrar desde un dispositivo MDI (inhalador dosificador) o de tipo MDI con una distribución del rango de tamaño de partícula que no se acumule y que se supone puedan llegar al pulmón profundo y d) formular microesferas de modo que permanezcan bioquímicamente estables en los dispositivos MDI o de tipo MDI y los propelentes.

De acuerdo con la invención, se proporciona una composición que incluye: una gran variedad de micropartículas (por ejemplo microesferas), donde dichas partículas contienen una proteína o un polipéptido, y un propelente (por ejemplo un propelente hidrofluoroalcano HFA. La composición puede tener una "fracción de partícula fina" (FPF) del orden del 25% al 100%. La "fracción de partícula fina" (anteriormente denominada "fracción respirable") es un término de la técnica que se define del siguiente modo:

La "fracción de partícula fina" (FPF) se refiere a la cantidad total de medicamento depositado en las etapas de los estudios de impacto en cascada de Andersen, dentro de un rango de tamaño de partícula apropiado para que se pueda ensayar el medicamento, dividido entre la cantidad total de medicamento administrado desde la boquilla del inhalador del impactador.

La FPF para un MDI y una partícula que sea inferior o igual a 4,7 \mum; la FPF para un DPI y una partícula que sea inferior o igual a 4,4 \mum: Inhalador de polvo seco: para DPI (60 1 pm) un tamaño de partícula en un rango inferior o igual a 4,4 \mum. Se define Fracción de Partícula Fina de Polvo Seco (4,4) al porcentaje de la suma de la masa de partículas inferior o igual a 4,4 micras de diámetro dividido entre la dosis total emitida desde el dispositivo y la boquilla del dispositivo.

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Inhalador dosificador (Metered dose Inhaler): para MDI (28,3 1 pm) un rango de tamaño de partícula \leq 4,7 \mum. Se define la Fracción de Partícula Fina del Inhalador Dosificador (4,7) como el porcentaje de la suma de las masas de las partículas inferiores o iguales a 4,7 micras de diámetro dividida entre la dosis total emitida desde el dispositivo y la boquilla del dispositivo.

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Por convención, la FPF se expresa en porcentaje (véase RSP 24/NF19, United States Pharmacopeial Convention, Rockville, MD, páginas 1895-1912, enero de 2000). Esta referencia describe también la utilización del Impactador de Cascada Andersen (aparato 1) para determinar los valores FPF. En el presente documento se utilizan indistintamente los términos \mu, \mum y micra(s).

Las micropartículas biocompatibles que se pueden utilizar de acuerdo con los métodos de la invención se seleccionan tal como se describe en el presente documento, con un tamaño, una densidad y unas propiedades físico-químicas que den lugar a una formulación micropartícula-propelente (por ejemplo microesfera-HFA) con una fracción de partícula fina en el rango del 25% al 100%. En general, las micropartículas, tales como microesferas, que son útiles para la distribución pulmonar de una proteína o de un péptido terapéuticos en los pulmones tienen un diámetro en el rango de aproximadamente 0,2 \mu a aproximadamente 10 \mu y una densidad en el mismo rango aproximadamente que la del propelente, por ejemplo de aproximadamente 0,5 gm/cc a aproximadamente 1,6 gm/cc. Preferentemente, las micropartículas son microesferas que contienen al menos un 40% (en peso) de proteína. En especial, las microesferas se dispersan en un propelente hidrofluoroalcano. Ejemplos de propelentes hidrofluoroalcanos son HFA P134a y HFA P227.

Preferentemente, las micropartículas son microesferas con una estrecha distribución de tamaño de partícula, por ejemplo al menos el 90% de las microesferas tienen un diámetro en el rango de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 \mu. En especial, al menos el 95% de las microesferas tienen un diámetro en el rango de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 \mu (con especial preferencia en el rango de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5 \mu; en particular en el rango de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 3 \mu); con más preferencia, al menos el 99% de las microesferas tienen un diámetro en el rango de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 \mu (en especial wen el rango de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5 \mu; con con especial preferencia en el rango de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 3 \mu).

En las realizaciones especialmente preferentes, las micropartículas son microesferas que se obtienen utilizando polietilenglicol, polivinilpirrolidona o una combinación o un copolímero de los mismos. En otras realizaciones especialmente preferentes, las microesferas están formadas por albúmina y otros componentes (por ejemplo sulfato de dextrano, heta-almidón). Las microesferas de albúmina son especialmente útiles para portar moléculas de bajo peso molecular.

Las microesferas contienen una proteína o un péptido terapéutico o diagnóstico. Para facilitar el debate, el término "proteína", tal como se utiliza aquí, abarca a los péptidos. De acuerdo con los métodos de la invención, las proteínas preferentes a utilizar incluyen insulina, hormona paratiroidea, hormona de crecimiento humano, interferón, GCSF, calcitonina, acetato de leuprolida y cualquiera de las moléculas terapéuticas identificadas en la Tabla 1. Otras proteínas que pueden utilizarse de acuerdo con las composiciones y métodos de la invención se facilitan en la descripción detallada de la invención.

Las composiciones de la invención no contienen agentes tensioactivos. Las microesferas de la invención permanecen en suspensión durante un tiempo de al menos 10 segundos, preferentemente de al menos 20, 30, 40, 50 segundos, de al menos 2, 5, 10, 30 minutos, de al menos 1, 2, 5, 10 horas, de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 28 días, después de agitarse.

Se ha de entender que cualquier limitación opcional que representen las realizaciones preferentes de la invención es aplicable a otros aspectos de la misma. Por tanto, la invención proporciona composiciones y métodos en los que cada una de las limitaciones que represente una realización preferente de la invención puede utilizarse sola o en combinación con otro aspecto de la misma.

También se describe aquí una composición que comprende una gran variedad de micropartículas (preferiblemente microesferas), donde las micropartículas contienen una proteína o un polipéptido, y un propelente, tal como un propelente hidrofluoroalcano (HFA); la composición no contiene agente tensioactivo alguno. Preferentemente, la composición tiene una fracción de partícula fina en el rango del 25% al 100%.

También se describe aquí un método para la preparación de un preparado pulmonar. El método implica:

1) seleccionar un propelente, tal como un propelente hidrofluoroalcano de densidad conocida, \rho_{propelente} (por ejemplo \rho_{hidrofluoroalcano}); 2) seleccionar una micropartícula (por ejemplo una microesfera) con una densidad \rho_{micropartícula} (por ejemplo \rho_{microesfera}) tal que la proporción \rho_{micropartícula}/\rho_{propelente} esté en el rango de 0,05 a 30 y en especial en el rango de 0,5 a 3,0; y 3) poner en contacto una gran variedad de micropartículas con un propelente para formar el preparado pulmonar. Preferentemente, el propelente es un propelente HFA, tal como HFA P134a, HFA P227, o una mezcla de éstos. En ésta y otras descripciones, preferentemente la composición no contiene agentes tensioactivos.

También se describe aquí un método para la administración de una proteína al sistema pulmonar de un sujeto (por ejemplo mediante un inhalador dosificador o un inhalador de polvo seco u otro dispositivo de inhalación). El método comprende administrar una cantidad eficaz de una composición de la invención en el tracto respiratorio de un sujeto que requiere tratamiento para tratar una enfermedad. Las composiciones de la invención pueden ser administradas.

También se describe un método de elaboración. El método implica dispersar una o más dosis terapéuticas en un dispositivo de suministro pulmonar, cada una de ellas conteniendo una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de la invención.

También se describe aquí un envase que contiene un recipiente (por ejemplo una cápsula, un canister) que contiene una o más dosis terapéuticas de una composición de la invención. Preferentemente, el envase facilita las instrucciones de uso del recipiente para liberar su contenido en un dispositivo de administración pulmonar y posteriormente administrar una dosis terapéuticamente eficaz de las microesferas al paciente.

También se describe un dispositivo inhalador que contiene una, dos o más dosis terapéuticas que contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de micropartículas. Entre los dispositivos se incluyen inhaladores de polvo seco, inhaladores dosificadores y otros dispositivos de inhalación.

En el presente documento se describe la utilización de los compuestos y composiciones anteriormente mencionados para la elaboración de un medicamento.

Éstos y otros aspectos de la invención se describirán con más detalle posteriormente. En toda esta descripción, todos los términos técnicos y científicos tienen el mismo significado que el habitual conocido por cualquier experto en la materia a la que pertenece esta invención, a menos que se especifique de otra manera.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: muestra el tamaño de partícula determinado por difusión de luz láser Coutler LS230. El 95% de las microesferas de insulina están entre 0,95 y 1,20 micras.

Figura 2: representa el diámetro aerodinámico determinado mediante un aerocalibrador TSI (Modelo 322500, St. Paul, MN.).

Figura 3: muestra estudios con el Impactador de Cascada Andersen con 10 mg de insulina administrada desde un Aerolizer DPI (JM032701C).

Figura 4: muestra los estudios de impacto en cascada Andersen in vitro con insulina administrada desde viales que contienen HFA P134a y HFA P227.

Figura 5: representa la bajada de glucosa después de una inyección subcutánea de microesferas de insulina en ratas SC.

Figura 6: representa la bajada de glucosa después de una instilación intratraqueal de microesferas de insulina.

Figura 7: compara la estabilidad de la suspensión.

Figura 8: muestra la distribución en los pulmones de insulina TC-99m en pulmones de perro.

Figura 9: muestra un ensayo de los contenidos y sustancias relacionadas (USP).

Figura 10: es una comparación de la actividad del MDI 1 semana y 4 meses después de la carga.

Figura 11: representa la administración de microesferas de insulina a perros mediante el inhalador de polvo seco.

Figura 12: muestra el porcentaje de dosis de microesferas de insulina emitidas desde el MDI.

Figura 13: representa la estabilidad de la insulina en HFA P134a.

Descripción detallada de la invención

Se describen aquí métodos y composiciones para elaborar y utilizar micropartículas, tales como microesferas, que contienen agentes terapéuticos y/o diagnósticos, in vivo e in vitro. Las composiciones son especialmente útiles como formulaciones pulmonares. A diferencia de las formulaciones del estado de la técnica anterior, las formulaciones de micropartículas en propelente (por ejemplo hidrofluoroalcano) descritas en este documento presentan propiedades sorprendente e inesperadamente mejores como formulaciones pulmonares. En particular, los ejemplos ilustran las propiedades de las formulaciones (que contienen insulina) de microesferas HFA que se prepararon de acuerdo con los métodos descritos en este documento. A diferencia de los esfuerzos sin éxito del estado de la técnica anterior de preparar formulaciones pulmonares que contienen proteínas, los resultados descritos aquí ponen en evidencia que las composiciones de la invención muestran valores de fracción de partícula fina sorprendentes y favorables y con la capacidad de permanecer en suspensión durante un período de tiempo adecuado. Cualquier experto en la materia entenderá que son preferentes aquellas suspensiones estables para garantizar la uniformidad de la dosis cuando se utiliza cualquier dispositivo de inhalación. Las microesferas de proteína descritas aquí también mostraron una mayor e inusitada estabilidad en presencia de los propelentes, tanto en los sustitutos basados en freón como en los sustitutos de freón, habitualmente utilizados en los dispositivos de inhalación para la administración pulmonar. Por tanto, ventajosamente, la invención proporciona composiciones que presentan características sustancialmente mejores en comparación con las formulaciones pulmonares proteicas propuestas en el estado de la técnica anterior, en especial con aquellas que contienen agentes tensioactivos y métodos de emulsión para incorporar los medicamentos. Además, las microesferas de la invención se pueden preparar sin necesidad de atomización ni procedimientos de
molienda.

En el presente documento se describe una composición que incluye una gran variedad de micropartículas (por ejemplo microesferas), donde dichas micropartículas contienen una proteína o un polipéptido (en conjunto denominado "proteína") y un propelente (por ejemplo un propelente hidrofluoroalcano (HFA)). La composición tiene una fracción de partícula fina en el rango del 25% al 100%. Las micropartículas biocompatibles (por ejemplo microesferas) que se pueden utilizar de acuerdo con los métodos de la invención son aquellas que tienen un tamaño y una densidad tales que resulten en una formulación pulmonar con una fracción de partícula fina en el rango del 25% al 100%. En las realizaciones especialmente preferentes, las micropartículas son microesferas con un contenido en proteína en el rango del 20% al 100% del peso total de la microesfera. En general, las micropartículas (por ejemplo microesferas) que son útiles para la administración pulmonar de la proteína o del péptido terapéutico en los pulmones tienen un diámetro de aproximadamente 0,1 \mu a aproximadamente 10 \mu (en algunas aplicaciones de 0,1 \mu a 5 \mu; y en otras aplicaciones, de 0,1 \mu a 3 \mu); y una densidad en el rango de aproximadamente 0,6 gm/cc a aproximadamente 2,5 gm/cc (en especial, 0,6 gm/cc a 1,8 gm/cc; y en particular, 1,2 gm/cc a 1,7 gm/cc). En algunas realizaciones preferentes, las microesferas tienen un contenido en proteínas de al menos el 40% en peso del de la microesfera (en especial, de al menos el 50%, 60%, 70%, u 80%; y en particular, de al menos el 90%, 95% o 100%).

Tal como se utiliza aquí, el término "micropartícula" se refiere a micropartículas, microesferas y microcápsulas, que son partículas sólidas o semisólidas con un diámetro geométrico o aerodinámico inferior a 100 micras, en especial inferior a 100 micras, en particular inferior a 10 micras, que pueden estar formadas por varios materiales, entre los que se incluyen polímeros sintéticos, proteínas y polisacáridos. Habitualmente se utilizan diferentes técnicas para elaborar dichas micropartículas a partir de polímeros sintéticos, polímeros naturales, proteínas y polisacáridos, entre las que se incluyen la separación de fases, evaporación del disolvente, emulsificación y atomización. Los polímeros utilizados para la formación de las microesferas incluyen homopolímeros y copolímeros de ácido láctico y de ácido glicólico (PLGA), tal como se describen en US 5.213.812 de Ruiz, US 5.417.86 de Reid y col., US 4.530.840 de Tice y col., US 4.897.268 de Tice y col., US 5.075.109 de Tice y col., US 5.102.872 de Singh y col., US 5.384.133 de Boyes y col., US 5.360.610 de Tice y col., y en la Solicitud de Patente Europea con número de publicación 248.531 del Southern Research Institute; y copolímeros en bloque, tales como tetronic 908 y poloxamer 407, tal como se describen en US 4.904.479 de Illum; y los polifosfacenos descritos en US 5.149.543 de Cohen y col.

Tal como se utiliza aquí, el término "microesferas" se refiere a micropartículas que son sustancialmente esféricas en forma y que, en general, tienen unas dimensiones de entre aproximadamente 0,1 micras y 10,0 micras de diámetro. Las microesferas aquí descritas normalmente muestran una estrecha distribución de tamaños y están formadas por partículas discretas. Métodos ilustrativos de formación de microesferas se describirán posteriormente.

En una realización preferente, las microesferas se forman mezclando una solución polimérica acuosa o miscible con agua y una solución de proteínas acuosa, y aplicando una fuente de energía, por ejemplo calor, para formar las microesferas (véanse los Ejemplos). En general, tales procedimientos implican calentar estas soluciones a una temperatura en el rango de aproximadamente 37ºC a aproximadamente 95ºC durante un período de tiempo de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 24 horas. Tal como se utiliza aquí, el término "solución acuosa" se refiere a soluciones de agua sola o de agua mezclada con uno o más disolventes miscibles en agua, por ejemplo etanol, DMSO, acetona, N-metilpirrolidona y 2-pirrolidona; no obstante, las soluciones acuosas preferentesd no contienen disolventes orgánicos apreciables.

Preferentemente, el polímero se selecciona de entre el grupo consistente en polímeros de carbohidratos, alcoholes polialifáticos, polímero poli(vinílicos), ácidos poliacrílicos, ácidos poliorgánicos, poliaminoácidos, poliéteres, polímeros naturales, poliimidas, poliésteres, polialdehídos, copolímeros, copolímeros de bloque, tertpolímeros, agentes tensioactivos, polímeros ramificados, ciclopolímeros y mezclas de los mismos. En especial, el polímero es dextrano, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, copolímeros de polietilenglicol y polivinilpirrolidona, alcohol polivinílico, o copolímeros de polioxietileno y polioxipropileno, y mezclas de los mismos. en particular, el polímero es un copolímero de polietilenglicol y polivinilpirrolidona o un copolímero de polioxietileno y polioxipropileno.

En las realizaciones preferentes, el polímero es un polímero soluble en agua. Tal como se utiliza aquí, el término "polímero soluble en agua" se refiere a un polímero o a una mezcla de polímeros que, preferentemente, son capaces de causar una exclusión volumétrica o una agrupación macromolecular.

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Los polímeros solubles en agua adecuados para la formación de las microesferas pulmonares incluyen polímeros lineales o ramificados solubles, preferentemente aquellos de bajo peso molecular. Tal como se utiliza aquí con referencia a las microesferas pulmonares, los polímeros de bajo peso molecular son aquellos polímeros que tienen un peso molecular adecuado para ser eliminados adecuadamente por el pulmón. Los polímeros pueden ser altamente solubles en agua, moderadamente solubles en agua o poco solubles en agua (más del 2% peso/vol solubles en agua). Los polímeros solubles en agua preferentes son aquello solubles en agua o solubles en un disolvente miscible en agua. Los polímeros solubles en agua pueden solubilizarse primero disolviéndose en agua, en una solución tampón acuosa o en un disolvente miscible en agua y ser combinada luego la solución de polímeros con un disolvente acuoso. En una realización, el polímero soluble en agua es un polímero basado en carbohidratos.

El polímero preferente es polivinilpirrolidona, polietilenglicol, dextrano, copolímero polioxietileno-polioxipropileno, alcohol polivinílico, almidón, heta-almidón o mezclas de los mismos, sus características se describirán más detalladamente posteriormente. El polímero o la mezcla de polímeros se puede preparar de acuerdo con los métodos publicados en la US 5.525.519 de James E. Woiszwillo, o en la Solicitud de Patente PCT US 93/00073 (Nº de Publicación Internacional WO 93/14110), presentada el 7 de enero de 1993 y publicada el 22 de julio de 1993, de James E. Woiszwillo), donde el polímero se disuelve en agua o en una solución acuosa, tal como una solución tampón, a una concentración aproximada entre 1 y 50 g/100 ml, dependiendo del peso molecular del polímero. La concentración total de polímero preferente en la solución de polímeros está entre el 5% y el 80%, expresado en porcentaje peso/volumen. La concentración preferente de cada polímero en la solución de polímeros está entre el 0,5% y el
25%.

El copolímero poloxietileno-polioxipropileno, también conocido como poloxamer, es vendido por BASF (Parsippany, N.J.) y se comercializa en varias formas con diferentes porcentajes relativos de polioxietileno y polioxipropileno dentro del copolímero.

El PVP es un polímero noxi-ionómico hidrofílico con un peso molecular promedio de entre aproximadamente 2.000 y 700.000 (preferentemente, desde aproximadamente 2.000 a 40.000) y de fórmula química (C_{6}H_{9}NO)[_{n}]. El PVP también es conocido como poli[1-(2-oxo-1-pirrolidinil)etileno], Povidone^{TM}, Polyvidone^{TM}, RP 143^{TM}, Kolli-
don^{TM}, Peregal ST^{TM}, Periston^{TM}, Plasdone^{TM}, Plasmosan^{TM}, Protagent^{TM}, Subtosan^{TM} y Vinisil^{TM}. PVP es no tóxico, altamente higroscópico y se disuelve fácilmente en agua o en disolventes orgánicos.

El polietilenglicol (PEG), también conocido como poli(oxietilen)glicol, es un polímero de condensación de óxido de etileno y agua de fórmula química general HO(CH_{2}CH_{2}O)[_{n}]H.

Dextrano es un término aplicado a los polisacáridos producidos por bacterias que crecen en un sustrato de sacarosa. Los dextranos nativos producidos por las bacterias, tales como Leuconostoc mesenteroides y Lactobacteria dextranicum normalmente tienen un alto peso molecular. Habitualmente los dextranos se comercializan y utilizan en forma inyectable como expansores plasmáticos en humanos.

El alcohol polivinílico (PVA) es un polímero preparado a partir de acetatos de polivinilo por sustitución de los grupos acetato por grupos hidroxilo y tiene la fórmula (CH_{2}CHOH)[_{n}]. La mayor parte de los alcoholes polivinílicos son solubles en agua.

Proveedores químicos tales como Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) comercializan el PEG, dextrano, PVA y PVP.

Preferentemente, el polímero es una mezcla de polímeros que contiene una solución acuosa de PVP con un peso molecular de entre 2.000 y 360.000, en especial de 2.000 a 40.000, y el PEG tiene un peso molecular de entre 200 y 35.000. Es preferente que el PVP tenga un peso molecular de 2.000 y el PEG tenga un peso molecular de 3.500. Preferentemente, el PVP se disuelve en una solución tampón y el PEG se añade a la solución acuosa de PVP. Preferentemente, la concentración de cada polímero está entre 0,5 y 50 g/100 ml, dependiendo del peso molecular de cada polímero.

Un polímero alternativo preferente es un dextrano con un peso molecular de entre aproximadamente 3.00 a 500.000 dalton.

Los polímeros adecuados incluyen, además de los mencionados, polímeros de cadena lineal o ramificada de alto peso molecular solubles en agua o en un disolvente miscible en agua o en ambos. Ejemplos de polímeros solubles en agua que son útiles en esta invención están también descritos en US 6.090.925; 5,981.719 y 5.578.709; y en la Solicitud de Patente Estadounidense en tramitación, comúnmente cedida Nº 09/420.361, presentada el 18 de octubre de 1999 y la Solicitud de Patente Estadounidense Nº 60/244.098, presentada el 27 de octubre de 2000.

En las realizaciones especialmente preferentes, las microesferas se forman utilizando polietilenglicol, polivinilpirrolidona o una combinación o copolímero de los mismos. En otras realizaciones especialmente preferentes, las microesferas están compuestas por albúmina y otros componentes (por ejemplo sulfato de dextrano, heta-almidón). Las microesferas de albúmina son especialmente útiles para portar péptidos de bajo peso molecular.

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Entre los ejemplos de realización preferentes de microesferas que se pueden obtener conforme a los métodos y composiciones de la invención se incluyen aquellas que tienen aproximadamente las siguientes composiciones:

A.: Proteína (40-100%); PEG (1-60%); PVP (1-60%);

B.: Proteína (40-100%); sulfato de dextrano (1-60%); heta-almidón (0- 60%);

C.: Albúmina (40-90%); acetato de leuprolida (3-50%); sulfato de dextrano (1-60%); heta-almidón (0-60%);

D.: Proteína (por ejemplo insulina, MW 5700) (95-100%); PBG/PVP (0- 5%);

E.: Proteína (por ejemplo seroalbúmina humana (HSA)) (30%); sulfato de dextrano (20%); acetato de leuprolida (50%);

F.: Proteína (por ejemplo caseína) (95-100%); PBG/PVP (0-5%);

G.: Proteína (por ejemplo ADNasa) (95-100%); PEG/PVP (0-5%);

H.: Proteína (por ejemplo persoxidasa de rábano, MW 44,000) (95-100%); PEG/PVP (0-5%);

I.: Proteína (por ejemplo catalasa (95-100%); PEG/PVP (0-5%);

J.: Proteína (por ejemplo lisozima, MW 14,300) (95-100%); PEG/PVP (0- 5%);

K.: Proteína (por ejemplo cristalino) (95-100%); PEG/PVP (0-5%);

L.: Proteína (tiroglobulina, MW 670,000) (95-100%); PEG/PVP (0-5%);

M.: Proteína (ribonucleasa A, MW 13,700) (95-100%); PEG/PVP (0-5%).

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Posteriormente se describen más en detalle otros ejemplos de proteínas que se pueden incorporar a las composiciones de la invención. Así, por ejemplo, entre las microesferas de la invención que se pueden hacer y utilizar conforme a los métodos y a las composiciones de la invención se incluyen aquellas que tienen del 95 al 100% de cualquiera o más de una de las proteínas terapéuticas de la Tabla 1 y del 0 al 5% de PEG/PVP.

El volumen de polímero añadido a la proteína varía dependiendo del tamaño, de la cantidad y de la concentración de proteína. Preferentemente, se añaden dos volúmenes de la mezcla polimérica en una concentración de polímeros total del 0,5 al 50% a un volumen de una solución que contiene la proteína, normalmente en una concentración de 0,1 a 250 mg/ml. Durante la reacción con la proteína, el polímero está presente en una fase líquida.

El procedimiento se puede llevar a cabo de modo continuo o discontinuo. Cada uno de estos métodos está ilustrado en los ejemplos.

La fuente de energía preferente es el calor. No obstante, cualquier persona experta en la materia ha de tener en cuenta que otras fuentes de energía incluyen radiación, ionización, fuerzas osmóticas y fuerzas eléctricas, solas o en combinación con calor, sonicación, vorticidad, mezcla o agitación. La formación de microesferas puede tener lugar inmediatamente cuando se exponen a la fuente de energía o puede requerir una exposición prolongada a la fuente de energía, dependiendo de las características de los componentes y de las condiciones. Preferentemente, se incuba la solución proteína-polímero en un baño de agua a una temperatura superior o igual a 37ºC e inferior o igual a 99ºC durante aproximadamente 1 minuto a 24 horas. En especial, la mezcla se incuba durante 5-30 minutos a una temperatura comprendida entre 50ºC y 90ºC. La temperatura máxima de incubación viene determinada por las características de la proteína y la función principal de la microesfera.

Las microesferas formadas son separadas de los componentes no incorporados de la mezcla de incubación por métodos de separación convencionales bien conocidos de los expertos en la materia. La mezcla de incubación se puede centrifugar o someter a filtración o diafiltración para separar las microesferas de los componentes solubles no incorporados. Alternativamente, la suspensión que contiene las microesferas formadas se filtra, de modo que dichas microesferas quedan en el filtro y los componentes no incorporados lo atraviesan.

Las microesferas se pueden purificar aún más por lavado con un volumen adecuado de una solución de lavado. La solución de lavado preferente es agua o un disolvente miscible en agua capaz de eliminar los polímeros solubles en agua. Se pueden repetir los lavados tanto como sea necesario y separar las microesferas de la solución de lavado tal como se ha describe anteriormente.

Tal como se ha mencionado anteriormente, se pueden alterar las características de las microesferas manipulando las condiciones de incubación. Por ejemplo, se puede retardar la cinética de liberación de las microesferas aumentando la temperatura de reacción o incrementando el tiempo de reacción durante la formación de las mismas. La cinética de liberación también se puede manipular mediante la selección de diferentes polímeros, diferentes concentraciones de polímeros, diferentes concentraciones de proteínas o diferentes proporciones de los polímeros utilizados en la formación de las microesferas.

El tamaño y forma de las microesferas y la cinética de liberación se puede controlar ajustando las condiciones de formación de las microesferas. Por ejemplo, se pueden optimizar las condiciones de formación de las microesferas de forma que se obtengan microesferas más grandes o más pequeñas, o se puede aumentar el tiempo total de incubación o la temperatura de incubación, dando lugar a microesferas que tienen una cinética de liberación más prolongada.

Tal como se utiliza aquí, el término "distribución homogénea" se refiere a una población de microesferas en las que más del 90% de las mismas tienen un diámetro ern el rango mencionado anteriormente. Preferentemente, las microesferas tienen una distribución homogénea con al menos un 95% de éstas de un diámetro en el rango mencionado anteriormente. En algunas realizaciones, más del 95% de las microesferas tienen un diámetro en el rango de 0,1 a 10 micras (en promedio, superficie total media y volumen medio), según el analizador granulométrico por difracción con luz láser Coulter. Preferentemente, estas poblaciones de microesferas con una distribución homogénea muestran pocos o ningún signo de agregación (véase por ejemplo la Figura 2).

Las proteínas y los péptidos que son útiles en la práctica de esta invención incluyen tanto agentes terapéuticos como agentes diagnósticos. En general, las proteínas se caracterizan por su capacidad para formar microesferas discretas e intactas con un alto contenido en proteína en presencia de una fuente de energía, tal como calor, en presencia de los polímeros citados anteriormente. Preferentemente, la proteína comprende al menos aproximadamente el 90% del peso de las microesferas, en especial al menos aproximadamente el 95% del peso y en particular al menos aproximadamente el 99%. En las realizaciones especialmente preferentes, la proteína liberada de la microesfera tiene una estructura o una función que no se puede distinguir de la proteína inicial.

Para facilitar el debate, el término "proteína" tal como se utiliza aquí incluye a los péptidos.

El componente proteínico de la microesfera puede ser una proteína transportadora o una proteína terapéutica (véase por ejemplo la Tabla 1), la cual representa desde aproximadamente el 20 al 100% (en peso) de la microesfera.

Tal como se utiliza aquí, el término "proteína transportadora" se refiere a una proteína que tiene un peso molecular de al menos aproximadamente 1.500 y que puede existir como una estructura tridimensional. La proteína transportadora también puede ser una proteína terapéutica; esto es, una proteína que tiene actividad terapéutica; no obstante, en general, el término "proteína transportadora" se utilizará en esta solicitud con referencia a una proteína cuya función principal es proporcionar una estructura tridimensional con el fin de formar microesferas, aúun cuando la proteína transportadora pueda tener una función secundaria como agente terapéutico. En determinadas realizaciones preferentes, la proteína transportadora es albúmina, en concreto seroalbúmina humana. Opcionalmente, las microesferas de la invención incluyen además un agente terapéutico, por ejemplo un esteroide (por ejemplo estradiol, testosterona, prednisolona, dexametasona, hidrocortisona, lidocaína base, procaína base) o cualquier otra entidad química conocida por unirse a la albúmina, tal como GCSF o paclitaxel.

En otras realizaciones (tal como se discute abajo), las microesferas de la invención incluyen además un agente terapéutico (preferentemente un péptido). En otras determinadas realizaciones, la proteína que comprende la matriz es una proteína terapéutica (por ejemplo una hormona, tal como insulina u hormona de crecimiento humana) y la microesfera está construida y dispuesta para proporcionar una determinada cinética de liberación de la proteína terapéutica in vivo. En especial, la microesfera está construida y dispuesta para proporcionar una determinada cinética de liberación de la proteína terapéutica en ausencia de un aumento de volumen significativo de la microesfera.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Proteínas

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Las proteínas fisiológicamente activas preferentes incluyen hormonas peptídicas, citoquinas, factores de crecimiento, factores que actúan sobre el sistema cardiovascular, factores que actúan sobre el sistema nervioso central y periférico, factores que actúan sobre los electrolitos humorales y sustancias hemales, factores que actúan sobre los huesos y el esqueleto, factores que actúan sobre el sistema gastrointestinal, factores que actúan sobre el sistema inmunitario, factores que actúan sobre el sistema respiratorio, factores que actúan sobre los órganos genitales y enzimas.

Ejemplos de hormonas y moduladores de hormona incluyen insulina, proinsulina, péptido C de insulina, una mezcla de insulina y péptido C de insulina, cocristales de insulina híbridos (Nature Biotechnology, 20, 800-804, 2002), hormona de crecimiento, hormona paratiroidea, hormona liberadora de la hormona luteinizante (LH-RH), hormona adrenocorticotrópica (ACTH), amilina, oxitocina, hormona luteinizante, (D-Trip6)-LHRH, acetato de nafarelina, acetato de leuprolida, hormona folículo-estimulante, glucagón, prostaglandinas, esteroides, estradioles, dexametazona, testosterona y otros factores que actúan sobre los órganos genitales y sus derivados, análogos o congéneres. Como análogos de la citada LH-RH se pueden mencionar sustancias conocidas tales como las descritas en las patentes US 4.008.209, 4.086.219, 4.124.577, 4.317.815 y 5.110.904.

Ejemplos de factores hematopoyéticos o trombopoyéticos incluyen, entre otros, eritropoyetina, factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulador de macrófagos-granulocitos (GM-CSF) y factor estimulador de colonias de macrófagos (M-CSF), preparación del factor de proliferación de leucocitos (Leucoprol, Morinaga Milk), trombopoyetina, factor estimulador de la proliferación de plaquetas, factor (estimulador) de la proliferación de los megacariocitos y factor VIII.

Ejemplos de factores terapéuticos que actúan sobre los huesos y el esqueleto y agentes para tratar la osteoporosis incluyen calcio, alendronato, péptido GLa óseo, hormona paratiroidea y sus fragmentos activos (osteostatina, Endocrinology 129, 324, 1991), histona H4 relacionada con la formación de huesos y péptidos de proliferación (OGP, The EMBO Journal 11, 1867, 1992) y sus muteínas, derivados y análogos.

Ejemplos de enzimas y enzimas-cofactores incluyen pancreasa, L-asparaginasa, hialuronidasa, quimotripsina, tripsina, tPA, estreptoquinasa, uroquinasa, pancreatina, colagenasa, tripsinógeno, quimotripsinógeno, plasminógeno, estreptoquinasa, adenilciclasa y superóxido-dismutasa (SOD).

Ejemplos de vacunas incluyen Hepatitis B, SPR (sarampión, paperas y rubeola) y vacunas contra la polio.

Ejemplos de factores de crecimiento incluyen factores de crecimiento del tejido nervioso (NGF, NGF-2/NT-3), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento fibroblástico (FGF), factor de crecimiento tipo insulina (IGF), factor de crecimiento transformante (TGF), factor de crecimiento celular derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), etc.

Ejemplos de factores que actúan sobre el sistema cardiovascular incluyen aquellos factores que controlan la presión arterial, arteriosclerosis, etc., tales como endotelinas, inhibidores de endotelina, los antagonistas de endotelina descritos en los documentos EP 436189, 457195, 496452 y 528312, JP [Abierta a Consulta Pública] nº H-3-94692/1991 y 130299/1991, los inhibidores de la enzima productora de la endotelina vasopresina, renina, angiotensina I, angiotensina II, angiotensina III, inhibidor de angiotensina I, antagonista del receptor de angiotensina II, péptido natiurético atrial (ANP), péptido antiarrítmico, etc.

Ejemplos de factores que actúan sobre el sistema nervioso central y periférico incluyen péptidos opiáceos (por ejemplo encefalinas, endorfinas), factor neurotrópico (NTF), péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), hormona liberadora de la hormona tiroidea (TRH), sales y derivados de TRH [JP [Abierta a Consulta Pública] nº 50-121273/1975 (Patente US 3.959.247), JP [Abierta a Consulta Pública] nº 52-116465/1977 (Patente US 4.100.152)], neurotensina, etc.

Ejemplos de factores que actúan sobre el sistema gastrointestinal incluyen secretina y gastrina.

Ejemplos de factores que actúan sobre los electrolitos humorales y las sustancias hemales incluyen los factores que controlan la hemoaglutinación, el nivel de colesterol plasmático o las concentraciones de iones metálicos, tales como calcitonina, apoproteína E e hirudina. La laminina y la molécula de adherencia intercelular 1 (ICAM 1) representan ejemplos de factores de adherencia celular.

Ejemplos de factores que actúan sobre el riñón y las vías urinarias incluyen las sustancias que regulan la función renal, tales como péptido natriurético cerebral (BNP), urotensina, etc.

Ejemplos de factores que actúan sobre los órganos de los sentidos incluyen los factores que controlan la sensibilidad de los diferentes órganos, tales como la sustancia P.

Ejemplos de agentes quimioterapéuticos son paclitaxel, mitomicina C, BCNU y doxorubicina.

Ejemplos de factores que actúan sobre el sistema inmunitario incluyen los factores que controlan los tumores inflamatorios y los tumores malignos y los factores que atacan a microorganismos infecciosos, tales como péptidos quimiotácticos y bradiquininas.

Ejemplos de factores que actúan sobre el sistema respiratorio incluyen los factores asociados a respuestas asmáticas, por ejemplo albuterol, fluticazona, bromuro de ipratropio, beclametasona y otros beta-antagonistas y esteriodes.

También se incluyen los péptidos o proteínas naturales, lo sintetizados químicamente o recombinantes, que pueden actuar como antígenos, tales como polen de cedro o polen de ambrosía. Dichos factores se administran independientemente, unidos a haptenos o junto con un adyuvante en las formulaciones según la presente invención.

Entre las moléculas terapéuticas particularmente preferentes se incluyen, sin limitarse a, betaxolol®, diclofenaco®, doxorubicina, rifampina®, acetato de leuprolida, hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH), (D-Tryp6)-LHRH, acetato de nafarelina, insulina, insulina sódica, insulina de cinc, proinsulina, péptido C de insulina, una mezcla de insulina y péptido C de insulina, cocristales de insulina híbridos, protamina, lisozima, alfa-lactoalbúmina, factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF), beta-lactoglobulina, tripsina, anhidrasa carbónica, ovoalbúmina, seroalbúmina bovina (BSA), seroalbúmina humana (HSA), fosforilasa b, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, IgG, fibrinógeno, moléculas de ácido nucleico (por ejemplo complejadas con poli-L-lisina), IgM, ADNasa, acetato de desmopresina®, factor liberador de la hormona del crecimiento (GHRF), somatostatina, antida, Factor VIII, GCSF/GM-CSF, hormona de crecimiento humano (hGH), interferón beta, antitrombina III, interferón alfa, interferón 2b alfa, hormona paratiroidea, calcitonina, alfa-antitripsina y formoterol.

La insulina o análogo de insulina es una proteína especialmente preferente para su utilización con los métodos y composiciones de la invención. Tal como se utiliza aquí, el término "insulina" se refiere a insulina de mamífero, tal como insulina bovina, porcina o humana, cuyas secuencias y estructuras son conocidas en la técnica. La secuencia de aminoácidos y la estructura espacial de la insulina humana son bien conocidas. La insulina humana consta de una cadena de veintiún aminoácidos A y una cadena de treinta aminoácidos B reticulados por enlaces disulfuro. Una insulina humana adecuadamente reticulada contiene tres puentes disulfuro: uno entre la posición 7 de la cadena A y la posición 7 de la cadena B, uno entre la posición 20 de la cadena A y la posición 19 de la cadena B y un tercero entre las posiciones 6 y 11 de la cadena A.

El término "análogo de insulina" significa proteínas que tienen una cadena A y una cadena B con sustancialmente las mismas secuencias de aminoácidos que la cadena A y la cadena B de la insulina humana, respectivamente, pero que difieren de la cadena A y la cadena B de la insulina humana en tener una o más deleciones de aminoácidos, una o más sustituciones de aminoácidos y una o más adiciones de aminoácidos que no destruyen la actividad insulínica del análogo de insulina.

Un tipo de análogo de insulina, el "análogo de insulina monomérica" es bien conocido en la técnica. Supuestamente es un análogo de la insulina humana que actúa rápidamente, que incluyen, por ejemplo, análogos de insulina monomérica donde: a) el residuo aminoácido de la posición B28 es sustituido por Asp, Lys, Leu, Val o Ala, y el residuo aminoácido de la posición 8,29 es Lys o Pro; b) los residuos aminoácidos de las posiciones B28, B29 y B30 son eliminados; o c) el residuo aminoácido de la posición B27 es eliminado. Un análogo de insulina monomérica preferente es Asp^{B28}. Un análogo de insulina monomérica incluso más preferente es LysB^{28}Pro^{B29}.

Los análogos de insulina monomérica están descritos en los siguientes documentos: Patente US 5.514.646 de Chance y col.; Solicitud de Patente US 08/255.297 de Chance y col.; Brems y col., Protein. Engineering, 5:527-533 (1992); en la Publicación EPO 214.826 de Brange y col. (publicada el 18 de marzo de 1987) y en Brange y col., Current Opinion in Structural Biology, 1: 934-940 (1991).

Los análogos de insulina también pueden tener sustituciones de los aminoácidos amidados con formas ácidas. Por ejemplo, Asn puede ser sustituido por Asp o Glu. De igual modo, Gln puede ser sustituido por Asp o Gln. En concreto, Asn(A,18), Asn(A21) o Asp(B3), o cualquier combinación de estos residuos, puede ser sustituida por Asp o Glu. También, Gln(A15) o Gln(B4) o ambos pueden ser sustituidos por Asp o Glu.

Las microesferas de la invención se producen mediante mezcla de las proteínas en una mezcla acuosa con un polímero soluble en agua o con una mezcla de polímeros, posteriormente poniendo en contacto la solución con una fuente de energía, preferentemente calor, bajo condiciones suficientes para formar las microesferas. Preferentemente, la solución es una solución acuosa. O bien se añade la solución de proteínas al polímero o bien se añade la solución de polímeros a la solución de proteínas. Aunque sin vincularnos a ninguna teoría o mecanismo en particular, se cree que el polímero provoca la eliminación del agua o la deshidratación de la proteína. Este procedimiento también es conocido por los expertos en la materia como exclusión volumétrica o agrupación molecular.

Entonces, se expone la solución de polímeros y proteínas a una fuente de energía, tal como calor, radiación, incluida radiación por microondas o ionización, solas o en combinación con sonicación, vorticidad, mezcla o agitación, durante un período de tiempo predeterminado, para formar y estabilizar la microesferas. A continuación, las microesferas resultantes son separadas de cualquier componente no incorporado presente en la solución por métodos de separación física bien conocidos por el experto en la materia y luego pueden lavarse o exponerse a otras soluciones que contengan medicamentos, para añadirles medicamentos adicionales a éstas.

El tiempo de incubación depende de las concentraciones respectivas de polímero y proteína y del nivel de energía de la fuente de energía. La estabilización de las microesferas puede comenzar inmediatamente después de su exposición a la fuente de energía. Preferentemente, la mezcla de proteínas y polímeros se calienta a una temperatura superior a la temperatura ambiente durante aproximadamente 1 minuto a 24 horas. En especial, el polímero y las proteínas se calientan durante 30 minutos o menos a una temperatura comprendida entre aproximadamente 37ºC y 99ºC.

A las microesferas se les puede incorporar un compuesto o un medicamento farmacéutico orgánico o inorgánico, natural o sintético, uniendo el medicamento a la proteína y formando luego las microesferas a partir del complejo o conjugado proteína-medicamento. Los expertos en la materia han de tener en cuenta que se puede formar un compuesto incapaz de tener una estructura terciaria dentro de una microesfera, incorporando o uniendo el compuesto a una molécula portadora que tenga una estructura terciaria. También han de tener en cuenta que el término "proteína" incluye una gran variedad de proteínas y combinaciones de diferentes proteínas, tales como una combinación de un compuesto farmacéutico y una molécula de afinidad para dirigir el compuesto farmacéutico a un tejido, órgano o tumor que deba ser tratado. Además, se ha de tener en cuenta que una molécula de afinidad puede ser la parte receptora o la parte ligando de una interacción receptor-ligando. Ejemplos de ligandos que interactúan con otras biomoléculas incluyen virus, bacterias, polisacáridos o toxinas que pueden actuar como antígenos para generar una respuesta inmunitaria cuando se administran a un animal y causar la producción de anticuerpos.

Compuestos adecuados que se pueden unir a las proteínas o proteínas que se pueden utilizar de acuerdo con los métodos y composiciones de la invención incluyen, aunque sin limitarse a, betaxolol®, diclofenaco®, doxorubicina, rifampina®, acetato de leuprolida, hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH), (D-Tryp6)-LHRH, acetato de nafarelina, insulina, insulina sódica, insulina de cinc, protamina, péptido C de insulina, una mezcla de insulina y péptido C de insulina, cocristales de insulina híbridos, protamina, lisozima, alfa-lactoalbúmina, factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF), beta-lactoglobulina, tripsina, calcitonina, hormona paratiroidea, anhidrasa carbónica, ovoalbúmina, seroalbúmina bovina (BSA), seroalbúmina humana (HSA), fosforilasa b, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, IgG, fibrinógeno, poli-L-lisina), IgM, ADN, acetato de desmopresina, factor liberador de la hormona del crecimiento (GHRF), somatostatina, antida, Factor VIII, GCSF/GM-CSF, hormona del crecimiento humano (hGH), interferón beta, antitrombina III, interferón alfa, interferón 2b alfa, véase también la lista anterior de agentes portadores de proteína y agentes terapéuticos de proteína.

Las condiciones de incubación se optimizan para maximizar la incorporación de la proteína a las microesferas y la retención de la actividad, ajustando el pH, la temperatura, la fuerza iónica, la concentración de proteína y/o polímero o la duración de la reacción o de la incubación.

Como se ha mencionado anteriormente, se puede formar una pequeña molécula o compuesto en una microesfera, tal como un péptido o un compuesto farmacéutico, incorporando o uniendo el compuesto a una proteína que tenga una estructura terciaria. Esto se puede lograr de varias maneras. Por ejemplo, se pueden formar las microesferas tal como se describe en este documento, utilizando una proteína que tenga una estructura terciaria, y luego la pequeña molécula o compuesto se une dentro de y/o en la superficie de la microesfera. Alternativamente, la molécula pequeña o el compuesto se une a la proteína que tiene una estructura terciaria mediante interacciones hidrofóbicas o iónicas, y luego se forman las microesferas a partir del complejo proteína-pequeña molécula utilizando el método descrito en este documento. Esta categoría de realización incluye la complejación de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo ADN o una molécula anti-sentido) con un poliaminoácido (por ejemplo una polilisina, poliarginina). Un tercer modo de fabricar las microesferas a partir de moléculas pequeñas es preparar las microesferas utilizando una proteína que tenga una estructura terciaria, de modo que la microesfera tenga una carga neta, y luego añadir una molécula pequeña o un compuesto que tenga una carga neta opuesta, de modo que la molécula sea atraída físicamente y permanezca unida a la microesfera, pero que pueda liberarse con el tiempo bajo condiciones apropiadas. Como alternativa se utilizan diferentes tipos de interacciones covalentes o no covalentes, tales como interacciones hidrofóbicas o de afinidad, que permiten la unión y posterior liberación de pequeñas moléculas.

Cuando se preparan microesferas que contienen una proteína, se puede añadir un estabilizador proteico, tal como glicerol, ácidos grasos, azúcares como sacarosa, iones como cinc, cloruro sódico, cloruro cálcico, o cualquier otro estabilizador de proteínas conocido por los expertos en la materia, antes de añadir los polímeros durante la formación de las microesferas, con el fin de minimizar la desnaturalización de las proteínas.

Para "recubrir" o "guarnecer" las microesferas, se pueden unir a la superficie externa de las microesferas otras moléculas distintas de las proteínas de las que las microesferas están compuestas por métodos conocidos por los expertos en la materia. Las microesferas pueden tener una molécula unida a su superficie externa. Dichas moléculas se unen para fines tales como facilitar la focalización, mejorar la mediación del receptor y evitar la endocitosis o la destrucción y para alterar la cinética de liberación. Por ejemplo, biomoléculas tales como los fosfolípidos se pueden unir a la superficie de la microesfera para evitar la degradación en circulación y/o para acelerar o inhibir la interacción con membranas biológicas, endocitosis por endosomas; se pueden unir receptores, anticuerpos u hormonas a la superficie para promover y facilitar la focalización de la microesfera al órgano deseado, al tejido o a las células del cuerpo; y se pueden unir polisacáridos como glucanos u otros polímeros como polivinilpirrolidona y PEG a la superficie externa de la microesfera para mejorar o evitar la absorción por macrófagos.

Además, se pueden unir una o más moléculas disociables, erosionables o solubles a la superficie externa de la microesfera o en el interior de la microesfera. Las moléculas disociables están diseñadas de tal modo que las microesferas son las que primero son focalizadas en un sitio predeterminado bajo condiciones biológicas adecuadas y luego, al exponerlas a un cambio de condiciones biológicas, tales como un cambio de pH, las moléculas se disocian, provocando una liberación de la microesfera desde el sitio diana. De este modo, las microesferas se unen o son absorbidas por las células debido a la presencia de las moléculas unidas a la superficie de las microesferas. Cuando la molécula se disocia, las microesferas permanecen en el lugar deseado, por ejemplo dentro del citoplasma o del núcleo de una célula, y pueden liberar las proteínas de las que las microesferas están compuestas. Esto es especialmente útil para la administración de medicamentos, donde las microesferas contienen un medicamento que va dirigido a un sitio concreto a tratarse y el medicamento se puede liberar lentamente en ese sitio.

Con respecto a las aplicaciones no pulmonares, las microesferas se pueden recubrir con una o más sustancias estabilizadoras, lo que puede ser especialmente útil para el depósito a largo plazo en la administración vía parenteral o para la administración oral, ya que se permite el paso de las microesferas a través del estómago o del aparato digestivo sin que se disuelvan. Por ejemplo, las microesferas diseñadas para la administración oral se pueden estabilizar con una capa protectora de una sustancia tal como mucina, que es una secretina que contiene mucopolisacáridos producidos por las células globet del intestino, los ganglios submaxilares y otras células ganglionares mucosas.

Además, las microesferas se pueden recubrir covalente o no covalentemente con compuestos tales como ácidos grasos, lípidos o polímeros. El recubrimiento se puede aplicar a las microesferas por inmersión en una sustancia de recubrimiento solubilizada, atomizando las microesferas con la sustancia o por otros métodos bien conocidos por los expertos en la materia.

Las composiciones pulmonares de la invención se pueden preparar poniendo en contacto las microesferas con un propelente (por ejemplo un propelente hidrofluoroalcano) hasta formar una suspensión y agitando después la suspensión durante un tiempo suficiente para que las partículas se suspendan en el propelente. Preferentemente, las composiciones de la invención se caracterizan porque las microesferas permanecen suspendidas un mínimo de 10 segundos a 10 minutos, preferentemente al menos de 1 a 10 horas y en particular de 1 a 7 días después de su agitación.

En las realizaciones preferentes, las composiciones pulmonares tienen una relación densidad \rho_{micropartícula}:\rho_{propelente} en el rango de 0,05 a 30, en particular en el rango de 0,5 a 3,0. A continuación, se describe más detalladamente la relación de densidad. Preferentemente, el propelente es un propelente HFA (hidrofluoroalcano), por ejemplo HFA P134a, HFA P227, o una mezcla de éstos u otros propelentes.

En las formulaciones pulmonares comparativas aquí descritas, si se desea se puede añadir un agente tensioactivo. Tal como se utiliza aquí, un agente tensioactivo es un término de la técnica que se refiere a un agente que preferentemente se absorbe en una interfaz entre dos fases inmiscibles, tales como la interfaz agua y una solución de polímeros orgánicos, una interfaz agua/aire, una interfaz disolvente orgánico/aire o una interfaz micropartícula/propelente.

Los agentes tensioactivos poseen un grupo hidrofílico y un grupo lipofílico de tal modo que, al absorber las microesferas, tienden a presentar grupos en el entorno externo que no atraen las partículas igualmente recubiertas y, con ello, reducen la aglomeración de partículas. Los agentes tensioactivos también pueden estimular la absorción de un agente terapéutico o diagnóstico e incrementar la biodisponibilidad del mismo.

Entre los agentes tensioactivos sintéticos o naturales conocidos en la técnica se incluyen los fosfoglicéridos. Algunos ejemplos de fosfoglicéridos son fosfatidilcolinas, tales como el agente tensioactivo natural, dipalmitoil L-\alpha-fosfatidilcolina ("DPPC"). La utilización de agentes tensioactivos endógenos en el pulmón puede evitar la necesidad de utilizar agentes tensioactivos no fisiológicos. Otros ejemplos de agentes tensioactivos incluyen difosfatidil glicerol (DPPG); dodecilsulfato de sodio (SDS), polietilenglicol (PEG) y sus derivados; polivinilpirrolidona (PVP) y sus derivados; polioxietilen-9-lauril éter, ácidos grasos tensioactivos como ácido palmítico o ácido oleico; trioleato de sorbitano (Span 85); glicocolato; surfactina; poloxámeros; ésteres de ácidos grasos de sorbitano tales como trioleato de sorbitano; tiloxapol y fosfolípidos; y azúcares alquilados tales como octilglucósido.

Se ha de tener en cuenta que cualquiera de las realizaciones preferentes con respecto a un aspecto de la invención son aplicables a otros aspectos de la misma; no obstante, por razones de concisión, no se repiten las distintas realizaciones preferentes para cada aspecto de la invención. La invención proporciona composiciones y métodos en los que cada una o todas las limitaciones que representan una realización preferente se pueden utilizar en combinación con cualquier otra limitación en cada aspecto de la invención.

En este documento se describe una composición que comprende: una gran variedad de micropartículas (por ejemplo microesferas), donde dichas partículas contienen una proteína, y un propelente (por ejemplo un propelente hidrofluoroalcano (HFA)); la composición no contiene agentes tensioactivos. Preferentemente, la composición tiene una fracción de partícula fina en el rango del 25% al 100%.

También se describe aquí un método para preparar un preparado pulmonar. El método implica: 1) seleccionar un propelente, tal como un propelente hidrofluoroalcano, de densidad conocida \rho_{propelente} (por ejemplo \rho_{hidrofluoroalcano}); 2) seleccionar una micropartícula (por ejemplo una microesfera) con una densidad de micropartícula \rho_{micropartícula} (por ejemplo \rho_{microesfera}) de tal modo que la relación \rho_{micropartícula}:\rho_{propelente} esté en el rango de 0,50 a 30, en especial en el rango de 0,5 a 3,0; y 3) poner en contacto múltiples microesferas con el propelente para formar el preparado pulmonar. Preferentemente, el propelente es un propelente HFA tal como HFA P134a, HFA P227, o una mezcla de éstos. En éstas y otras descripciones la composición no incluye agentes tensioactivos.

Tal como se utiliza aquí, el término \rho_{propelente}" se refiere a la densidad del propelente. En general, tales densidades están publicadas por parte de los agentes que los comercializan. De igual forma, el término "densidad de la microesfera, "\rho_{microesfera}", se refiere a la densidad de las microesferas. Los valores de la densidad de las microesferas que se comercializan se publican y/o se pueden determinar de acuerdo con métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia. Así, la densidad de las microesferas se selecciona tal como se ha indicado anteriormente de forma que tenga una relación comprendida en los márgenes establecidos anteriormente. Preferentemente, el propelente hidrofluoroalcano es un propelente HFA, tal como HFA P134a, HFA P227 o una mezcla de éstos. En algunas descripciones la composición no incluye agentes tensioactivos.

En el presente documento se describe también un método de administración de una proteína al sistema pulmonar de un sujeto. El método implica la administración de una cantidad eficaz de una composición de la invención en el tracto respiratorio de un sujeto que requiera tratamiento para tratar una enfermedad.

En una disposición especialmente preferente, las micropartículas (por ejemplo microesferas) contienen insulina. La siguiente descripción proporciona métodos generales para elaborar y utilizar microesferas de insulina; no obstante, se ha de tener en cuenta que estos métodos son solamente ilustrativos y que se pueden utilizar otras proteínas en lugar de insulina para preparar las composiciones de la invención. En los ejemplos se facilitan procedimientos específicos para elaborar microesferas de insulina.

Preferentemente la insulina se administra por inhalación en una dosis eficaz para incrementar los niveles circulantes de la proteína insulina y/o para reducir los niveles de glucosa circulante. Dicha administración tiene que ser eficaz para tratar enfermedades tales como la diabetes o la hiperglucemia. Para lograr dosis eficaces de insulina es necesario administrar una dosis inhalada de más de aproximadamente 0,5 \mug/kg a aproximadamente 500 \mug/kg de insulina, preferentemente de aproximadamente 3 \mug/kg a aproximadamente 50 \mug/kg y en particular de aproximadamente 7 \mug/kg a aproximadamente 25 \mug/kg. Un médico especialista puede determinar la cantidad terapéuticamente eficaz teniendo en cuenta factores tales como el nivel de insulina, los niveles de glucosa en sangre, la salud del paciente, el estado pulmonar del paciente, etc.

Según la presente descripción, la insulina se administra por inhalación para lograr tanto una absorción rápida como lenta, así como ambas, gracias a la liberación controlada de esta proteína. La administración de insulina por inhalación puede dar lugar a una farmacocinética comparable o superior a la administración subcutánea. La inhalación de insulina resulta en un rápido incremento del nivel de insulina circulante, seguido de una rápida bajada de los niveles de glucosa en sangre. Normalmente los distintos inhaladores proporcionan una farmacocinética similar cuando se comparan tamaños de partícula similares y niveles similares de depósitos en el pulmón.

Las composiciones de la invención que contienen insulina se pueden administrar mediante cualquiera de los dispositivos de inhalación conocidos en la técnica para la administración de agentes terapéuticos por inhalación. Estos dispositivos incluyen inhaladores dosificadores, nebulizadores, generadores de polvo seco, atomizadores, etc. Hay varias características que son deseables en un dispositivo de administración de insulina por inhalación. Por ejemplo, la administración mediante un dispositivo de inhalación tiene la ventaja de ser estable, reproducible y exacta. El dispositivo de inhalación debería liberar pequeñas microesferas, por ejemplo inferiores a aproximadamente 10 \mum, preferentemente de aproximadamente 0,2-5 \mum, para permitir una buena posibilidad de respiración. Algunos ejemplos concretos de dispositivos de inhalación comercializados adecuados para la práctica de la presente invención son Turbuhaler® (Astra, Wilmington. DE), Rotahaler® (Glaxo, Research Triangle Park, NC), Diskus® (Glaxo, Research Triangle Park, NC), inhalador Spiros® (Dura, San Diego, CA), dispositivos comercializados por Inhale Therapeutics (San Carlos, CA), AERx® (Aradigm, Hayward, CA), nebulizador Ultravent® (Mallinckrodt, Hazelwood, MO), nebulizador Acorn II® (Marquest Medical Products, Totowa, NJ), inhalador dosificador Ventolin® (Glaxo, Research Triangle Park, NC), inhalador de polvo Spinhalero® (Aventis, Bridgewater, NJ) y inhaladores dosificadores distribuidos por Bespak (Londres, Reino Unido); 3M (Minneapolis, MN); Valois (Francia), etc.

La microesfera de insulina en la formulación administrada por el dispositivo de inhalación es crítica en cuanto a la capacidad de la proteína de introducirse en los pulmones, preferentemente en las vías aéreas inferiores o en los alvéolos, para su administración sistémica. Preferentemente, las microesferas de insulina se formulan de tal modo que al menos de aproximadamente el 10% al 40% de la insulina administrada se deposite en el pulmón, en especial de aproximadamente el 40% a aproximadamente el 50% o más y en particular del 70% al 80% o más. Se sabe que la máxima eficacia del depósito pulmonar para humanos que respiran por la boca se obtiene con partículas que tienen diámetros aerodinámicos de aproximadamente 0,1 \mum a aproximadamente 10 \mum. Cuando los tamaños de partícula están por encima de aproximadamente 5 \mum, el depósito pulmonar disminuye sustancialmente. Así, las microesferas de insulina administradas por inhalación tienen un tamaño de partícula preferente inferior a aproximadamente 10 \mum, en especial en el rango de aproximadamente 0,1 \mum a aproximadamente 5 \mum y en particular en el rango de aproximadamente 0,1 \mum a aproximadamente 3 \mum. La formulación de las microesferas de insulina se selecciona de forma que se obtenga el tamaño de partícula deseado en el dispositivo de inhalación elegido.

Para una administración conveniente, la insulina se prepara en una microesfera con un tamaño inferior a aproximadamente 10 \mum, preferentemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5 \mum y en especial de aproximadamente 0,1 \mum a aproximadamente 3 \mum. El tamaño preferiente de la microesfera es eficaz para su administración en los alvéolos pulmonares del paciente. Preferentemente, la formulación está compuesta en su mayor parte por microesferas producidas de modo que la mayoría de las partículas tenga el tamaño deseado. Ventajosamente, al menos aproximadamente el 90% de la formulación está formada por partículas de un diámetro inferior a aproximadamente 10 \mum. Dichas formulaciones se pueden conseguir utilizando los métodos de la invención y los ya descritos en los siguientes documentos: Patentes US 6.090.925; 5.981.719; 5.578.709; Solicitud de Patente en tramitación, comúnmente cedida US 09/420.361, presentada el 18 de octubre de 1999; y Solicitud de Patente US 60/244.098, presentada el 27 de octubre de 2000; o seleccionando la distribución de tamaño preferente a partir de una distribución mayor de partículas (por ejemplo de microesferas).

Normalmente, las formulaciones de insulina para su administración por inhalación incluyen las microesferas de insulina de la invención y, opcionalmente, un agente de carga, un agente tensioactivo, un vehículo, excipiente, otros aditivos, etc. Los aditivos se pueden incluir en la formulación de las microesferas de insulina, por ejemplo, para diluir las microesferas como se requiera para su administración por inhalación, para facilitar la preparación de la formulación, para proporcionar propiedades beneficiosas a la formulación, para facilitar la dispersión de la formulación desde el dispositivo de inhalación, para estabilizar la formulación (por ejemplo con antioxidantes o soluciones tampón), para darle sabor a la formulación, etc. Las microesferas de insulina se pueden mezclar con un aditivo a nivel molecular o la formulación sólida puede incluir microesferas de insulina mezcladas con o recubiertas con las partículas del aditivo. Los aditivos característicos incluyen mono-, di- y polisacáridos, alcoholes azúcares y otros polioles, por ejemplo lactosa, glucosa, rafinosa, melecitosa, lactitol, maltitol, trehalosa, sacarosa, manitol, almidón o combinaciones de los mismos; agentes tensioactivos tales como sorbitoles, difosfatidilcolina o lecitina; etc. Normalmente los aditivos, tal como un agente de carga, está presente en una cantidad eficaz para los fines anteriormente descritos, a menudo de aproximadamente el 50% a aproximadamente el 90% del peso de la formulación. En la formulación se pueden incluir más agentes conocidos en la técnica para la formulación de proteínas.

La administración de una formulación de microesferas de insulina por inhalación es un método preferente para el tratamiento de la diabetes.

Se puede producir un pulverizador que incluya microesferas de insulina haciendo pasar una suspensión de microesferas de insulina suspendidas en un propelente o en otros agentes líquidos de suspensión a través de una boquilla bajo presión. El tamaño y la configuración de la boquilla, la presión aplicada y la velocidad de alimentación del líquido se pueden elegir para lograr la salida y el tamaño de la gotita deseados utilizando cualquier dispositivo de inhalación conocido por los expertos en la materia. Se puede producir una electro-pulverización o una piezoelectro-pulverización, por ejemplo empleando un campo eléctrico en conexión con un alimentador capilar o de boquilla. Ventajosamente, las microesferas de insulina administradas mediante un nebulizador tienen un tamaño de partícula inferior a aproximadamente 10 \mum, preferentemente en el rango de aproximadamente 0,1 \mum a aproximadamente 5\mum y en particular de aproximadamente 0,1 \mum a aproximadamente 3 \mum.

Normalmente, las formulaciones de microesferas de insulina adecuadas para su utilización con un nebulizador incluyen las suspensiones acuosas de microesferas a una concentración de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 20 mg de insulina por ml de suspensión. La formulación puede incluir agentes tales como excipientes, una solución tampón, un agente de isotonicidad, conservantes, agentes tensioactivos, polímeros (por ejemplo polietilenglicol) e iones metálicos, tal como cinc o calcio. La formulación también puede incluir un excipiente o agente de estabilización de insulina, tal como una solución tampón, un agente reductor, una proteína a granel o un carbohidrato. Proteínas a granel útiles para las formulaciones de insulina incluyen albúmina, protamina, etc. Carbohidratos útiles para las formulaciones de insulina incluyen sacarosa, manitol, lactosa, trehalosa, glucosa, etc. En general, las formulaciones de microesferas de insulina no contienen agentes tensioactivos, ya que las microesferas de insulina no tienen tendencia a agregarse.

Las microesferas de insulina se pueden administrar mediante un nebulizador, tal como un nebulizador de chorro o un nebulizador ultrasónico. Normalmente, en un nebulizador de chorro se utiliza una fuente de aire comprimido para crear un chorro de aire a alta velocidad a través de un orificio. A medida que se expande el gas más allá de la boquilla, se crea una región de baja presión, que atrae la suspensión de microesferas de insulina a través de un tubo capilar conectado a un recipiente de líquido. El chorro de líquido de los tubos capilares se divide en filamentos inestables y gotitas a medida que sale del tubo, creando el aerosol. Para conseguir las características de funcionamiento deseadas para un nebulizador de chorro dado, se pueden emplear diversas configuraciones, velocidades de flujo y tipos de deflectores. En un nebulizador ultrasónico se utiliza energía eléctrica de alta frecuencia para crear una energía vibracional y mecánica, normalmente utilizando un transductor piezoeléctrico. Dicha energía se transmite a la formulación de microesferas de insulina bien directamente o bien a través de un fluido de unión, creando un aerosol que incluye las microesferas de insulina. Ventajosamente, las microesferas de insulina administradas con el nebulizador tienen un tamaño de partícula inferior a aproximadamente 10 \mum, preferentemente en el rango de aproximadamente 0,1 \mum a aproximadamente 5 \mum y en particular de aproximadamente 0,1 \mum a aproximadamente 3 \mum.

Normalmente, las formulaciones de microesferas de insulina adecuadas para su utilización con un nebulizador de chorro o ultrasónico, incluyen las microesferas de insulina en una suspensión a una concentración de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 20 mg de insulina por ml de suspensión. La formulación también puede incluir otros agentes, tales como los mencionados anteriormente (por ejemplo excipientes, soluciones tampón, etc.).

En un inhalador dosificador (MDI), el propelente, las microesferas de insulina y cualquier excipiente u otros aditivos están contenidos en un recipiente en forma de mezcla que incluye un gas comprimido licuado. La acción de la válvula dosificadora libera la mezcla en forma de aerosol, el cual preferentemente contiene microesferas de un tamaño inferior a aproximadamente 10 \mum, en especial de aproximadamente 0,1 \mum a aproximadamente 5 \mum y en particular de aproximadamente 0,1 \mum a aproximadamente 3 \mum. El tamaño deseado de microesferas se puede obtener empleando una formulación de insulina producida por los métodos descritos en el presente documento. Los inhaladores dosificadores preferentes incluyen aquellos fabricados por Bespak, Valois, 3M o Glaxo y aquellos que emplean un propelente.

En general, las formulaciones de microesferas de insulina para su utilización con un inhalador dosificador incluirán las microesferas como una suspensión en un medio no acuoso, por ejemplo suspendidas en un propelente. Por lo general no es necesario un agente tensioactivo, ya que las microesferas de insulina descritas en este documento tienen un tamaño uniforme y no tienden a agregarse. El propelente puede ser cualquier material convencional empleado para este fin, tal como un clorofluorocarbono, incluyendo triclorofluorometano, diclorofluorometano, diclorotetrafluoroetanol, y un hidrofluoroalcano, incluyendo HFA, P134a (1,1,1,2-tetrafluoroetano), HFA P227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano-227) o cualquier otro propelente útil para la práctica de la invención. Preferentemente el propelente es un hidrofluoroalcano. Para la formulación de proteínas, tal como la insulina, también se pueden incluir en la formulación otros agentes conocidos en la técnica.

Cualquier experto en la materia admitirá que los métodos de la presente invención se pueden lograr para la administración pulmonar de microesferas de insulina a través de dispositivos no descritos en el presente documento.

En este documento también se describe un método de fabricación. El método implica dispersar una o más dosis terapéuticas en un dispositivo de administración pulmonar, donde dichas dosis terapéuticas contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de la invención. Tal como se utiliza en este documento, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de agente activo necesaria para retrasar el comienzo, inhibir el avance o aliviar la enfermedad concreta que se esté tratando. En general, la cantidad terapéuticamente eficaz varía dependiendo de la edad, el estado y el sexo del sujeto, así como según la naturaleza y el alcance de la enfermedad en el sujeto, todo lo cual puede ser determinado por cualquier experto en la materia. El médico o veterinario particular puede ajustar la dosis, especialmente en caso de que haya complicaciones. Normalmente una cantidad terapéuticamente eficaz de agente activo varía de 1 pg/kg a aproximadamente 1.000 mg/kg, preferentemente de aproximadamente 1 \mug/kg a aproximadamente 200 mg/kg y en particular de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, en una o más adminis-
traciones diarias del medicamento, durante uno o más días, semanalmente, mensualmente, cada dos o tres meses, etc.

Las microesferas se pueden administrar solas o en combinación con otras farmacoterapias como parte de una composición farmacéutica. Dicha composición farmacéutica puede incluir las microesferas en combinación con cualquier veghículo convencional fisiológica y/o farmacéuticamente aceptable conocido en la técnica. Las composiciones pueden estar esterilizadas o pueden contener una cantidad terapéuticamente eficaz de microesferas en una unidad de peso o volumen que sea adecuada para su administración a un paciente. Tal como se utiliza en este documento, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa uno o más productos de carga, diluyentes o sustancias encapsulantes sólidas o líquidas compatibles adecuados para su administración a humanos o a otros animales. El término "vehículo" indica un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que el ingrediente activo se combina para facilitar la aplicación. Los componentes de las composiciones farmacéuticas también pueden mezclarse con las moléculas de la presente invención y con ellas mismas, de tal modo que no hay interacción que pueda empeorar sustancialmente la eficacia farmacéutica deseada. Farmacéuticamente aceptable significa además un material no tóxico que es compatible con un sistema biológico, tal como una célula, un cultivo celular, un tejido o un organismo. Las características del cardador dependerán de la vía de administración. Los vehículos fisiológica y farmacéuticamente aceptables incluyen diluyentes, productos de relleno, sales, soluciones tampón, estabilizadores, desecantes, agentes de carga, propelentes, agentes acidificadores, agentes de recubrimiento, solubilizadores y otros materiales bien conocidos en la técnica. Formulaciones de vehículos adecuadas para la administración oral, subcutánea, intravenosa, intramuscular se pueden encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.

Así, la invención proporciona diversas composiciones farmacéuticas de materiales y los métodos para producirlas. En general, las composiciones incluyen un recipiente que contiene una o más dosis de microesferas que contienen un agente activo para tratar una enfermedad tratable por liberación de un agente activo desde las microesferas. El número de microesferas de la dosis única depende de la cantidad de agente activo presente en la microesfera y del período de tiempo deseado para producir la liberación. Preferentemente, la dosis única se selecciona para conseguir una duración de la liberación del agente activo durante un período de 0,1 a 96 horas con el perfil de liberación deseado.

También se describe aquí otro método de fabricación. El método implica dispersar una o más dosis terapéuticas en un envase para su utilización con un dispositivo de administración pulmonar, donde dichas dosis terapéuticas contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de la invención.

Preferentemente, el envase contiene entre cien, doscientas y quinientas dosis terapéuticas de las microesferas para tratar una enfermedad tratable por liberación del agente activo in vivo. El número de microesferas presentes en la dosis única depende del tipo y de la actividad del agente activo. Preferentemente, la dosis única se selecciona para conseguir una duración de la liberación durante un período de tiempo que se ha optimizado para tratar una enfermedad concreta.

También se describe aquí un envase que incluye un recipiente que contiene una o más dosis terapéuticas de la composición de la invención anteriormente mencionada. Preferentemente, el envase facilita las instrucciones de uso del recipiente para introducir su contenido en un dispositivo de administración pulmonar, y opcionalmente más instrucciones para utilizar el dispositivo inhalador conforme a las instrucciones del fabricante.

Aunque la administración pulmonar de las fórmulas de microesferas es una aplicación preferente de la invención, se ha de tener en cuenta que las microesferas descritas en este documento pueden ser administradas a un sujeto de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica para la administración de microesferas a un sujeto, y en particular a un paciente humano que necesita tratamiento médico. Las vías de administración adecuadas incluyen la vía parenteral, por ejemplo intramuscular (i.m.), intravascular (i.v.) y subcutánea (s.c.), y la vía no parenteral, por ejemplo oral, bucal, intratecal, nasal, pulmonar, transdérmica, transmucosal, etc. Los dispositivos de administración incluyen jeringuillas, tanto con aguja como sin aguja, así como dispositivos de inhalación. Así, aunque es preferente la administración pulmonar, las microesferas de la invención se pueden administrar por vía oral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea y por cualquier otro método de administración adecuado para la administración de moléculas terapéuticas.

Las microesferas se pueden administrar solas o en combinación con otras farmacoterapias como parte de una composición farmacéutica. Dicha composición farmacéutica puede incluir las microesferas en combinación con cualquier vehículo convencional fisiológica y/o farmacéuticamente aceptable que sea conocido en la técnica. Las composiciones pueden estar esterilizadas o contener una cantidad terapéuticamente eficaz de microesferas en una unidad de peso o volumen que sea adecuada para su administración a un paciente.

Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas pueden presentarse en forma de dosis unitaria y se pueden preparar por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica farmacéutica. Todos los métodos pueden o no incluir el paso de asociar las microesferas a un vehículo que constituya uno o más ingredientes adicionales. Las composiciones se pueden preparar asociando uniforme e íntimamente las microesferas a un vehículo líquido, a uno sólido finamente dividido o a ambos y luego, si es necesario, dando forma al producto.

Los preparados para administración parenteral incluyen soluciones esterilizadas acuosas o no acuosas, suspensiones y emulsiones. Otros ejemplos de disolventes o agentes de suspensión incluyen propilenglicol, etanol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, sales y soluciones tampón, tales como soluciones salinas o tamponadas, soluciones alcohólicas/acuosas y emulsiones o suspensiones. Los vehículos parenterales incluyen una solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, aceites de Ringer lactados o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer), etc. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes, etc. En general, las microesferas se pueden administrar al sujeto (cualquier receptor animal) utilizando los mismos métodos de administración que se emplean actualmente en la terapia con micropartículas (por ejemplo con microesferas) en humanos.

Las microesferas son útiles como agentes terapéuticos y pueden permitir la utilización de vías alternativas de administración cuando las microesferas incluyen un medicamento y se administran al paciente para la liberación o administración dirigida de los medicamentos al sitio que requiera la terapia. Las microesferas son también útiles como agentes terapéuticos o profilácticos cuando las microesferas incluyen una proteína que es en sí misma un agente terapéutico o profiláctico, tal como una enzima o una inmunoglobulina. La liberación de dichos agentes terapéuticos es especialmente útil para las proteínas o péptidos terapéuticos que tienen vidas medias cortas, los cuales han de administrarse mediante inyección.

Las microesferas son útiles para la terapia o la profilaxis cuando la proteína es un agente terapéutico o un compuesto farmacéutico que se administra al paciente y se libera desde las microesferas con el transcurso del tiempo. Estas microesferas pueden ser especialmente útiles para la liberación lenta de medicamentos con vidas medias biológicas cortas, tales como las proteínas o los péptidos. Cuando el compuesto farmacéutico no se puede constituir en una partícula, entonces es complejado con un portador, tal como albúmina, y el complejo del compuesto farmacéutico portador se constituye en una microesfera. La microesfera puede hacer posible la liberación del agente a través del cuerpo o puede incluir una molécula de afinidad específica para un tejido diana o tumor, y ser inyectada al paciente para la liberación dirigida del agente terapéutico, por ejemplo un agente antitumoral, antiviral, antibacteriano, antiparasitario o antiartrítico, una citoquina, hormona o insulina, directamente al sitio que necesita ser tratado.

Además de las aplicaciones terapéuticas descritas anteriormente, las microesferas aquí descritas son útiles como partículas en fase sólida en ensayos, tales como en un ensayo inmunoenzimático, dot-blot o Western blot, para la detección de un objetivo concreto, por ejemplo una célula, una biomolécula o un medicamento en una muestra biológica. Las microesferas diseñadas para tal uso están compuestas por moléculas de afinidad específicas para la molécula diana. Por ejemplo, la proteína es una inmunoglobulina o un receptor celular y está unida al tubo de ensayo o placa microtitulada.

Para la detección o cuantificación de una molécula diana de interés, una muestra se combina con una solución que contiene las microesferas, se hacen reaccionar las proteínas de las microesferas con la molécula diana, se separan las microesferas de cualquier componente no unido de la muestra y se detectan las microesferas que contienen moléculas unidas por métodos convencionales. Las microesferas fluorescentes son especialmente adecuadas para la citometría de flujo de acuerdo con los métodos bien conocidos por los expertos en la materia.

Las microesferas aquí descritas son útiles como sondas visuales o indicadores de patología en una muestra histológica. Las proteínas de las microesferas diseñadas para dicho uso son específicas para las biomoléculas expresadas durante una patología concreta y están marcadas con una etiqueta detectable. Por ejemplo, la proteína es una inmunoglobulina o un receptor celular específico para una célula anormal, tal como una célula que prolifera rápidamente, o un organismo patológico, por ejemplo un virus.

Para la detección de un estado patógeno, una muestra histológica se combina con una solución que contiene las microesferas, se hacen reaccionar las proteínas marcadas de las microesferas con la molécula diana de interés y se detectan las microesferas unidas, detectando la etiqueta de acuerdo con métodos bien conocidos por los expertos en la materia.

Las microesferas aquí descritas son útiles como agentes de formación de imágenes para la localización in vivo de una molécula concreta, de un tipo de célula o de una patología, de modo similar al descrito anteriormente con respecto al uso de las microesferas para la histología patológica. Las proteínas de las microesferas diseñadas para dicho uso son específicas para las moléculas expresadas por una célula concreta o por un organismo patológico y están marcadas con una etiqueta detectable. Por ejemplo, la proteína es una inmunoglobulina específica para una célula tumoral o para un organismo patológico, tal como un virus.

Las microesferas se utilizan para detectar una patología o para controlar el éxito de una terapia, tal como la quimioterapia o la cirugía, con el fin de garantizar que el tamaño de un tumor tisular ha disminuido o se ha extirpado completamente. Para ello, se administra al paciente una formulación de microesferas y preferentemente a las proteínas marcadas de las microesferas se les da el tiempo suficiente para localizar el órgano o la región del cuerpo afectada, se hace reaccionar la proteína con una molécula diana expresada por la célula o por el organismo sometido a estudio y se detectan las microesferas, detectando la etiqueta por técnicas de formación de imágenes convencionales bien conocidas por los expertos en la materia, por ejemplo por rayos X.

Las microesferas son útiles para la terapia o la profilaxis cuando la proteína es un agente terapéutico o un compuesto farmacéutico que se administra al paciente. Estas microesferas pueden ser especialmente útiles para la liberación lenta de medicamentos con vidas medias biológicas cortas, tales como proteínas o péptidos. Cuando el compuesto farmacéutico no se puede constituir en una partícula, entonces es complejado con un portador, tal como albúmina, y el complejo del compuesto farmacéutico portador se constituye en una microesfera. La microesfera puede hacer posible la liberación lenta del agente a través del cuerpo o puede incluir una molécula de afinidad específica para un tejido diana o tumor, y ser inyectada al paciente para la liberación dirigida del agente terapéutico, por ejemplo un agente antitumoral, antiviral, antibacteriano, antiparasitario o antiartrítico, una citoquina, hormona o insulina, directamente al sitio que necesita ser tratado. La molécula de afinidad puede ser disociable.

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Las microesferas compuestas por proteínas antigénicas o conjugados polisacárido-proteína capaces de provocar una respuesta inmunitaria son especialmente adecuadas para su utilización en vacunas.

Las microesferas son útiles como herramientas de investigación para la purificación de una biomolécula a partir de una mezcla compleja, como reactivo para la detección o cuantificación de una biomolécula o para la producción de biomoléculas, tales como anticuerpos.

Por ejemplo, las microesferas compuestas por una proteína, tal como inmunoglobulina, se unen a una columna de cromatografía y se utilizan en la cromatografía de inmunoafinidad para separar un ligando de la mezcla compleja. Cualquier experto en la materia observará que las microesferas que se emplean en la cromatografía líquida de alta presión se han de unir primero a una esfera o a una perla en fase sólida no comprimible, de modo que la carga de la columna mantenga su estructura rígida bajo presión.

Alternativamente, las microesferas que incluyen una macromolécula marcada o una mezcla de macromoléculas marcadas específicas para diferentes células o receptores celulares se utilizan para detectar cambios en el número de células o de receptores de la superficie celular en respuesta a una condición de prueba concreta utilizando técnicas tales como la citometría de flujo.

Los siguientes ejemplos ilustran determinadas realizaciones de la invención y tienen por objeto describir en detalle la presente invención, sin por ello limitarla. Se podrán hacer modificaciones a estas realizaciones sin desviarse del alcance de la invención. Se ha de tener en cuenta que se podrán utilizar marcas genéricas de reactivos y de equipamientos en lugar de cualquiera de las marcas concretas seleccionadas en este documento. Los Ejemplos se refieren a e incluyen las descripciones de las figuras. Se ha de tener en cuenta que las figuras de los ejemplos no son necesarias para la habilitación de la invención reivindicada.

Ejemplos Ejemplo 1 Método de producción de microesferas de insulina pulmonares en tubo de microcentrifugación de 1,5 ml

Se preparó 1 ml de una solución de insulina a 10 mg/ml (esta solución se preparó justo antes de usarla). Se mezclaron, por mililitro de solución, 10 mg de insulina (Zn) en 0,99 ml de agua desionizada desgasificada. La suspensión era opaca. Se añadieron 10 microlitros de HCl 1N por ml de solución y se mezcló. Al mezclarla, la solución debía aclararse. Cuando la solución no se aclaraba, se añadían pequeños volúmenes de HCl 1N hasta que la insulina estaba en la solución. Se añadieron 0,8 ml de PEG/PVP (12,5%/12,5% PVP en acetato de sodio 0,1M, pH 5,65) en acetato de sodio 0,1M, pH 5,65 a 0,40 ml de una solución de insulina y se mezcló suavemente en un tubo de microcentrifugación de propileno de 1,5 ml. La solución se volvió opaca.

Se colocó el tubo de microcentrifigación en un baño de agua a 90ºC durante 30 minutos. Se retiró el tubo de microcentrifugación del baño de agua y se enfrió en la mesa de trabajo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se centrifugó el tubo de microcentrifugación en una microcentrifugadora durante 10 minutos a 8.000 rpm. El sobrenadante se decantó. Se añadió agua desionizada y resuspendió el gránulo. Se centrifugó el tubo de microcentrifugación en una microcentrifugadora durante 10 minutos a 6.000 rpm. El sobrenadante se decantó. Se añadió agua desionizada, se resuspendió el gránulo y se repitió el procedimiento. Se resuspendió el gránulo de microesfera en 5 ml de agua desionizada y se liofilizó el gránulo. Las esferas liofilizadas resultantes produjeron esferas de insulina de 1 micra por difusión de láser luminoso, que en el ensayo se observó contenían > 95% en peso de insulina.

Ejemplo 2 Método para la fabricación de microesferas de insulina pulmonares a través del flujo directo continuo

Se prepararon 10 ml de una solución de insulina de 10 mg/ml (esta solución se preparó justo antes de usarla). Se mezclaron, por mililitro de solución, 100 mg de insulina (Zn) en 9,8 ml de agua desionizada desgasificada. La suspensión era opaca. Se añadieron 100 microlitros de HCl 1N por ml de solución y se mezcló. La solución se aclararía al mezclarla. Si la solución no se aclaraba, se añadían pequeños volúmenes de HCl 1N hasta que la insulina estaba en la solución. Se añadieron 20 ml de PEG/PVP (12,5%/12,5%) en acetato de sodio 0,1M, pH 5,65, a 10 ml de una solución de insulina y se mezcló suavemente. La solución se volvía opaca.

Instalación del aparato de fabricación: se preparó una tubería de polipropileno de ocho pies (244 m) de 3,2 mm (1/8) de diámetro exterior, 2,4 mm (3/32) de diámetro interior. Se garantizó que 122 cm (4 pies) se sumergían en el baño de agua en un circuito cerrado de aproximadamente 15 cm (6 pulgadas) de diámetro, con el orificio de entrada conectado a una bomba peristáltica Rainin y el orificio de salida conectado a un recipiente colector. Se dejó un circuito cerrado de refrigeración de 91 cm (3 pies) entre el baño de agua y el recipiente colector. Se calentó el baño de agua a 90ºC.

Nota: Es importante no permitir que entre aire en la tubería después de comenzar a bombear las soluciones a través de la misma. Las burbujas de aire pueden causar agregación y obstrucción.

Procedimiento de producción de microesferas: se puso la velocidad de la bomba peristáltica Rainin a aproximadamente 1 ml/min de velocidad de flujo. Inmediatamente antes de comenzar a funcionar, se bombearon aproximadamente 10 ml de la solución de polímero desgasificada diluida (1 parte de agua desionizada por 2 partes de PEG/PVP (12,5%/12,5%) en acetato de sodio 0,1M, pH 5,65) a través de la tubería, para equilibrar la temperatura de la zona de enfriamiento. Se paró momentáneamente la bomba para evitar que entrara una burbuja en la tubería. Se trasladó con mucho cuidado el orificio de entrada de la tubería a la suspensión de materia prima insulina/polímero. Se conectó el recipiente colector a un recipiente vacío antes de que las microesferas salieran de la tubería. Las primeras microesferas de insulina salieron de la tubería mucho más rápidamente de lo que se esperaba debido a la velocidad de flujo existente de la bomba por el flujo laminar. Se observó pasar una línea fina de la suspensión de materia prima de insulina a través de la solución de polímero pre-cargada en el tubo, que poco a poco se hizo más grande en el diámetro interior de la tubería. Se dejó una pequeña burbuja de aire, luego la solución de polymcE/_bnBsr, que había sido diluida en un tercio (1:3) con agua desionizada, se bombeó a través de la tubería siguiendo a la solución de insulina- PEG/PVP. Se retiró el recipiente colector para continuar su preparación después de finalizar la recogida de microesferas.

Procedimiento de lavado de las microesferas: se diluyó la suspensión de microesferas con aproximadamente un volumen igual de agua desionizada para disminuir la viscosidad de la suspensión. Se hizo girar la suspensión de microesferas a 3.500 g durante 15 minutos utilizando un tubo de centrifugación de propileno de 50 ml. El sobrenadante se decantó con cuidado a partir de los pellets. Se resuspendieron los pellets de cada tubo con un volumen de agua desionizada equivalente al volumen inicial del tubo y luego se hizo girar en vortex hasta que todos los pellets volvían a estar en suspensión. Se centrífugo la suspensión a 3.000 g durante 1 minuto y medio. El sobrenadante se decantó con cuidado desde los pellets. Se resuspendieron los pellets de cada tubo con un volumen de agua desionizada equivalente al volumen inicial del tubo y luego se hizo girar en vortex hasta que todos los pellets se habían vuelto a suspender. Se centrífugo la suspensión a 3.000 g durante 15 minutos. El sobrenadante se decantó con cuidado desde los pellets. Se resuspendieron los pellets de cada tubo con un volumen de agua desionizada equivalente 2/3 del volumen del tubo y luego se hizo girar en vortex hasta que todos los pellets se habían vuelto a suspender. Se homogeneizó la suspensión con un homogenizador (por ejemplo un Homogenizador IKA a una regulación de velocidad de 3 durante 2 minutos) y se centrífugo a 3.000 g durante 15 minutos. El sobrenadante se decantó con cuidado desde los pellets. Se resuspendieron los pellts de cada tubo con un volumen mínimo de agua desionizada y luego se hizo girar en vortex hasta que todos los pellets se habían vuelto a suspender. Se homogeneizó la suspensión con el Homogenizador IKA a una regulación de velocidad de 3 durante 2 minutos o equivalente. Se transfirieron las microesferas a un recipiente debidamente esterilizado y se efectuó la diafiltración para lavar las microesferas hasta que se había eliminado todo el polímero libre. Se concentró la suspensión de microesferas utilizando el sistema de cartucho de fibras huecas antes de la liofilización. Se liofilizaron a granel las microesferas bajo condiciones higiénicas y se almacenaron en seco hasta que estuvieron listas para efectuar la carga.

Ejemplo 3 Método de producción de microesferas de insulina pulmonares en columnas de cromatografía de cristal de 61 cm (2 pies) (60 Ml) (proceso general discontinuo)

Se precalentó a 90ºC la columna de cromatografía con una camisa de agua. Se preparó una solución de insulina de 10 mg/ml en agua desionizada desgasificada tal como se describe en el Ejemplo 1. Se preparó una solución al 12,5% de PEG (3350), 12,5% de PVP (K12) en una solución tampón de acetato de sodio 0,1M. Se mezclaron 20 ml de la solución de insulina con 40 ml de la solución de polímeros (la concentración final de insulina era de 3,33 mg/ml). Estas suspensiones estaban inicialmente a una temperatura ambiente de \sim 25ºC. Se bombeó la suspensión insulina/polímero dentro de la columna para la cromatografía precalentada. Luego se incubó durante 30 minutos a 90ºC. Se bajó la temperatura a 25ºC durante 1 hora y media. Se bombeó la suspensión desde la columna a un recipiente colector. Se añadió agua desionizada.

Procedimiento de Lavado de las microesferas: se diluyó la suspensión de microesferas con aproximadamente un volumen igual de agua desionizada para diminuir la viscosidad de la suspensión. Se hizo girar la suspensión de microesferas a 3.500 g durante 15 minutos utilizando tubos de centrifugación de propileno de 50 ml. El sobrenadante se decantó con cuidado desde el gránulo. Se resuspendió el gránulo de cada tubo con un volumen de agua desionizada equivalente al volumen inicial del tubo y se hizo girar en vortex hasta que todo el gránulo se había vuelto a suspender. Se centrífugo la suspensión a 3.000 g durante 15 minutos. El sobrenadante se decantó con cuidado desde el gránulo. Se resuspendió el gránulo de cada tubo con un volumen de agua desionizada equivalente al volumen inicial del tubo y se hizo girar en vortex hasta que todo el gránulo se había vuelto a suspender. Se centrífugo la suspensión a 3.000 g durante 15 minutos. El sobrenadante se decantó con cuidado desde el gránulo. Se resuspendió el gránulo de cada tubo con un volumen de agua desionizada equivalente 2/3 del volumen del tubo y luego se hizo girar en vortrex hasta que todo el gránulo se había vuelto a suspender. Se homogeneizó la suspensión con un Homogenizador IKA a una regulación de velocidad de 6 durante 2 minutos. Se transfirieron las microesferas a un recipiente debidamente esterilizado y se efectuó la diafiltración para lavar las microesferas hasta que se había eliminado todo el polímero libre. Se concentró la suspensión de microesferas utilizando el sistema de cartucho de fibras huecas antes de la liofilización. Se liofilizaron a granel las microesferas bajo condiciones higiénicas y se almacenaron en seco hasta que estuvieron listas para efectuar la carga.

Ejemplo 4 Procedimiento de carga del recipiente MDI (inhalador dosificador)

Bajo condiciones higiénicas, se añadió el peso apropiado de microesferas en una recipiente a presión previamente agitado y se cargó el recipiente a presión con el volumen apropiado de propelente HFA. El propelente HFA puede ser P134a, P227 o una mezcla de ambos, o cualquier otro propelente(s), solo o en combinación, que sea útil para la práctica de la invención, en caso de que sea necesario. Mientras el recipiente a presión agitaba el HFA, se pasó la suspensión de microesferas de HFA a través de un circuito cerrado de homogenización hasta que se consiguió una suspensión monodispersa uniforme. Utilizando un Pamasol o una tubería de carga similar, se cargaron los vasos o viales de los inhaladores dosificadores esterilizados, prerrizados, con la suspensión de microesferas mono-
dispersas.

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Ejemplo 5 Procedimiento de carga del DPI (inhalador de polvo seco)

Dependiendo del producto en concreto, las microesferas se suministran como microesferas que fluyen libremente adecuadas para la carga por sonda o por otro método de carga de polvo apropiado en cápsulas, blísters u otros recipientes apropiados. Se añaden las microesferas con o sin el agente de carga. Se utilizan los siguientes agentes de carga: cloruro sódico, lactosa, trehalosa, sacarosa y/u otros agentes que sean conocidos por los expertos en la materia.

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Ejemplo 6 Determinación del tamaño de partícula de las microesferas

Se determinó el tamaño de las partículas por difusión luminosa y medición en un aerocalibrador TSI. Las microesferas de insulina eran monodispersas y tenían aproximadamente entre 1-1,5 micras de diámetro. Normalmente los resultados muestran una distribución homogénea de las microesferas, con un 95% de ellas entre 0,95 y 1,20 micras de diámetro por número, superficie y volumen (Figura 1). Se ha demostrado que el diámetro aerodinámico es de 1,47 micras de diámetro, tal como se muestra en la Figura 2.

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Ejemplo 7 Estudio del impacto en cascada de Andersen in vitro

Los estudios con microesferas de insulina mostraron que se administraba una alta "fracción de partícula fina" (FPD) de microesferas desde los Inhaladores de Polvo Seco (>50-60%) (Figura 3) o desde HFA (aproximadamente 40%) (Figura 4). Éstas representan las fracciones de tamaños de partícula que cabría esperar penetraran en el pulmón profundo. Dichas fracciones de partícula fina son muy altas, incluso para compuestos de bajo peso molecular. Probablemente no se han observado antes en ningún medicamento con proteína administrado desde un MDI.

"Fracción de Partícula Fina" (FPF) es un término de la técnica que se refiere a la cantidad total de medicamento depositado en las fases de los estudios del impacto en cascada de Andersen, dentro de un rango de tamaño de partícula apropiado para analizar el medicamento, dividida entre la cantidad total de medicamento administrado desde la boquilla del inhalador en el impactador. La FPF de un MDI y una partícula que sea inferior o igual a 4,7 \mum; la FPF de un DPI y una partícula que sea inferior o igual a 4,4 \mum:

Inhalador de Polvo Seco: para DPI (60 lpm) una gama de tamaño de partícula \leq4,4 \mum.

Se define como Fracción de Partícula Fina de Polvo Seco (4,4) al porcentaje de la suma de la masa de partículas inferior o igual a 4,4 micras de diámetro dividido entre la dosis total emitida desde el dispositivo y la boquilla del dispositivo.

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4

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Inhalador Dosificador: para MDI (28,3 1 pm) un rango de tamaño de partícula \leq 4,7 \mum.

Se define como Fracción de Partícula Fina del Inhalador Dosificador (4,7) al porcentaje de la suma de la masa de partículas inferior o igual a 4,7 micras de diámetro dividido entre la dosis total emitida desde el dispositivo y la boquilla del dispositivo.

5

Según la invención, la FPF se expresa en porcentaje.

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Desviación Estándar Geométrica (GSD)

Se traza un gráfico del porcentaje acumulado inferior al rango de tamaño frente al diámetro efectivo de corte. A partir de éste, se determina el diámetro al 84,13% y 15,37%. La GSD se calcula como:

GSD = (diámetro 84,13%/diámetro 15,87%)

Diámetro Aerodinámico Medio Masa (MMAD)

MMAD = Diámetro de partícula al 50% del gráfico anterior Número de Etapa – F/\Sigma Medicamento en las etapas.

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Ejemplo 8

Se demostró la actividad biológica de la insulina en las microesferas de insulina inyectando las microesferas de insulina suspendidas en soluciones acuosas. La Figura 5 compara la bajada de glucosa en sangre en ratas normales Fisher después de la inyección de insulina. Los resultados están expresados en comparación con la glucosa en sangre de las ratas control, que solamente recibieron una inyección de una solución salina de fosfato (PBS). La Figura 5 muestra que los animales control mantuvieron concentraciones normales de glucosa en sangre durante el experimento de 5 horas. Las microesferas que fueron disueltas en HCl (GR.2 y GR.3) bajaban los patrones de glucosa en sangre de un modo similar a las microesferas de insulina intacta suspendidas en PBS en la dosis unitaria (U) de 0,5 y en la dosis unitaria (U) de 2 (GR.4 y GR.5).

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Ejemplo 9

Se administraron las microesferas como solución y como microesferas instilando directamente estas formulaciones intratraquealmente en los pulmones de ratas Fisher. La Figura 6 muestra que se observó un patrón de bajada de glucosa similar tanto para la solución de insulina como para las microesferas de insulina administradas en forma de suspensión (MS YQ051401).

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Ejemplo 10 Estudios de Inhaladores Dosificadores

Las microesferas de Insulina formuladas por las técnicas descritas en la solicitud fueron luego formuladas en propelentes libres de CFCs para su utilización en Inhaladores Dosificadores (MDIs).

Se añadieron microesferas de insulina a HFA P134a en varias concentraciones comprendidas entre 2 mg/ml y 10 mg/dl. Se comparó la suspensión de microesferas de insulina con el comercializado Proventil albuterol en HFA P134a.

Se cargaron aproximadamente 20 mg de insulina en un vial de cristal de 20 ml que estaba cerrado herméticamente con una válvula adecuada para dispersar los propelentes hidrofluoroalcano (HFA) P134a y P227. La adición de los HFAs dio lugar a la formación de una suspensión estable de microesferas de insulina en HFA P134a y HFA P227, tal como se ve en la Figura 7. El vial de referencia contiene Proventil albuterol comercializado y aprobado por el Organismo para el Control de los Alimentos y los Medicamentos (FDA) en HFA P134a. Tras 60 segundos el vial de referencia precipitó completamente en el fondo. Los expertos en la materia admitirán que esto representa una fuente de irreproductibilidad de la dosis para pacientes tratados con suspensiones no homogéneas. Por contrario, los dos viales que contenían insulina suspendida en HFA P134a y HFA P227 siguieron siendo suspensiones homogéneas estables durante varios minutos. Esto representa una propiedad importante para la dispersión de dosis reproducibles de medicamentos, tales como insulina en propelentes HFA. En la Figura 5, se muestra la estabilidad de las microesferas de insulina en HFA P134a, tal como se calcula por la bajada de glucosa in vivo. La bioactividad de la formulación MDA a los 4 meses era la misma que en el momento 0.

Ejemplo 11

Se marcaron las microesferas de insulina con el isótopo radioactivo Tc-99m. Luego se administró la insulina Tc-99m al pulmón de un perro sabueso. Se utilizó una cámara gamma para poder visualizar la distribución de la insulina marcada Tc-99m en el pulmón del perro. La Figura 8 muestra la distribución homogénea de las microesferas de insulina en todo el pulmón del perro. Esto indica la distribución de las microesferas en el pulmón.

Ejemplo 12

En la Figura 9, se muestra mediante HPLC (cromatografía líquida de alta resolución) la integridad y estabilidad bioquímicas de las microesferas de Insulina suspendidas en el propelente HFA P227 durante 135 días. La Figura 10 muestra la actividad biológica de las microesferas de insulina almacenadas en HFA durante 7 días y durante 130 días. Se retiró la insulina del dispositivo MDI, se resuspendió en PBS y se analizó la cantidad de insulina. Luego, se instilaron intratraquealmente en ratas Fisher dosis unitarias (U) de 0,5 y 2 en cada período de almacenamiento. La Figura 10 muestra el mantenimiento de la actividad biológica in vivo.

Ejemplo 13

Se demostró la administración de microesferas biológicamente activas en perros. Perros sabuesos fueron anestesiados y colocados en un pulmón de acero. Se mantuvo el ritmo de respiración al 75% del ritmo respiratorio antes de la anestesia. Se administraron cinco mg de microesferas de insulina al perro utilizando un Inhalador de Polvo Seco Aerolizer. La Figura 11 muestra que se observó una disminución significativa de la glucosa en sangre a los 10 a 15 minutos que mediaron desde la administración pulmonar de la insulina. Se mantuvo la concentración de glucosa hipoglucemiante durante más de 3 horas antes de administrar oralmente un carbohidrato al perro.

Ejemplo 14

Se sometieron seis MDIs a estudio para ver su estabilidad a 25ºC. Después de un tiempo inicial de acondicionamiento de cinco días a temperatura ambiente, al revés, se analizaron las muestras por el impactador en cascada Andersen y por DUSA (Dose Unit Sample Apparatus-Aparato para Muestras de Unidades de Dosis) a 28 lpm. Los experimentos DUSA se efectuaron para determinar qué cantidad de la dosis administrada prevista era realmente administrada por el dispositivo. Los datos después de un mes de almacenamiento mostraron que los resultados Andersen presentaban una mayoría de las microesferas de insulina que fueron analizadas en las etapas en las que los tamaños eran de 1 a 3 micras.

Los resultados DUSA demostraron que la dosis recuperada en el momento inicial era de 117 \pm 4,7% y en un mes se observó que la dosis recuperada era del 106% de la dosis prevista.

La Figura 12 muestra que después de un mes de almacenamiento de las microesferas de insulina en HFA P134a, las microesferas de insulina se depositaban en el filtro de manera similar en las etapas 3 y 4 en el dispositivo Impactador en Cascada Andersen. Esto indica que las propiedades aerodinámicas de las microesferas de insulina permanecen estables después de 1 mes de almacenamiento en HFA. El punto inicial de tiempo es la media de 6 viales y el punto de tiempo de un mes es el valor de un solo vial.

Ejemplo 15

Formular las microesferas de modo que permanezcan bioquímicamente estables en dispositivos tipo MDI y en los propelentes es un elemento crucial del sistema de administración de insulina basado en MDI. Los resultados que comparan la estabilidad bioquímica de las microesferas de insulina almacenadas en HFA durante 1 mes mostraron que el monómero, dímero u oligómero de insulina era comparable, así como el valor máximo y la formación de desamido-insulina después de un mes (Figura 13).

Claims

1. Composición para la administración pulmonar que comprende.

a): múltiples microesferas sólidas o semisólidas que contienen una proteína o un péptido,

b): un propelente;

caracterizada porque la que la composición no comprende un agente tensioactivo y porque las microesferas se pueden producir mezclando una solución acuosa de dicha proteína o péptido y un polímero, siendo dicho polímero soluble en agua o soluble en un disolvente miscible en agua.

2. Composición según la reivindicación 1, caracterizada porque las microesferas permanecen en suspensión durante al menos 10 segundos después de su agitación.

3. Composición según las reivindicaciones 1 o 2, que consiste esencialmente en:

a): múltiples microesferas sólidas o semisólidas que contienen una proteína o un péptido y

b): un propelente.

4. Composición según las reivindicaciones 1, 2 o 3, con una fracción de partícula fina en el rango del 25% al 100%.

5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque dichas microesferas además comprenden un polímero.

6. Composición para la administración pulmonar que comprende

b): un propelente y

c): un polímero;

donde la composición no comprende agente tensioactivo alguno.

7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque las microesferas:

a): tienen una densidad en el rango de 0,6 gm/cc a 2,5 gm/cc, preferentemente de 0,6 gm/cc a 1,8 gm/cc;

b): tienen una distribución limitada del tamaño de partícula; y/o

c): tienen un diámetro en el rango de:

i): aproximadamente 0,1 micras a aproximadamente 10,0 micras;

ii): aproximadamente 0,1 micras a aproximadamente 5,0 micras; o

iii): aproximadamente 0,1 micras a aproximadamente 3,0 micras.

8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el propelente es un propelente hidrofluoroalcano.

9. Composición según la reivindicación 8, caracterizada porque el propelente hidrofluoroalcano es HFA P134a y/o HFA P227.

10. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque dicho polímero es soluble en agua o soluble en un disolvente miscible en agua.

11. Composición según la reivindicación 1, caracterizada porque dicho polímero está en una solución polimérica acuosa o en una solución polimérica miscible en agua.

12. Composición según la reivindicación 1, caracterizada porque se aplica una fuente de energía a la mezcla de polímero y proteína o péptido.

13. Composición según la reivindicación 12, caracterizada porque dicha fuente de energía es calor.

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14. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque dicho polímero se selecciona de entre el grupo consistente en polímeros de carbohidratos, alcoholes polialifáticos, polímeros polivinílicos, ácidos poliacrílicos, ácidos poliorgánicos, poliaminoácidos, poliéteres, polímeros naturales, poliimidas, poliésteres, polialdehídos, copolímeros, copolímeros de bloque, tertpolímeros, polímeros ramificados, ciclopolímeros y mezclas de los mismos.

15. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque dicho polímero se selecciona de entre el grupo consistente en dextrano, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, copolímeros de polietilenglicol y polivinilpirrolidona, alcohol polivinílico, copolímeros de polioxietileno y polioxipropileno y mezclas de los mismos, preferentemente caracterizada porque el polímero es un copolímero de polietilenglicol y polivinilpirrolidona o un copolímero de polioxietileno y polioxipropileno.

16. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizada porque las microesferas comprenden más de aproximadamente el 90% de proteína o péptido en peso, más de aproximadamente el 95% de proteína o péptido en peso o más de aproximadamente el 99% de proteína o péptido en peso.

17. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizada porque la proteína se selecciona de entre el grupo consistente en acetato de leuprolida, hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH), (D-Tryp6)-LHRH, acetato de nafarelina, insulina, insulina sódica, insulina de cinc, proinsulina, péptido C de insulina, una mezcla de insulina y péptido C de insulina, cocristales de insulina híbridos, protamina, lisozima, alfa-lactoalbúmina, factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF), beta-lactoglobulina, tripsina, anhidrasa carbónica, ovoalbúmina, seroalbúmina bovina (BSA), seroalbúmina humana (HSA), fosforilasa b, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, IgG, fibrinógeno, poli-L-lisina, IgM, ADN, acetato de desmopresina®, factor liberador de la hormona del crecimiento (GHRF), somatostatina, antida, Factor VIII, GCSF/GM-CSF, hormona de crecimiento humana (hGH), interferón beta, antitrombina III, interferón alfa, interferón 2b alfa, hormona paratiroidea y calcitonina.

18. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que tiene una fracción de partícula fina de al menos el 40%.

19. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque las microesferas están en suspensión.

20. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizada porque las micropartículas permanecen en suspensión durante al menos 30 segundos después de su agitación.

21. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizada porque las microesferas además comprenden una molécula terapéutica, preferentemente caracterizada porque dicha molécula terapéutica se selecciona de entre el grupo consistente en:

a): albuterol, fluticazona, bromuro de ipratropio, beclametasona y otros beta-antagonistas y esteriodes; o

b): betaxolol®, diclofenaco®, doxorubicina y rifampina®.

22. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque las microesferas comprenden un polímero de carbohidrato, preferentemente caracterizada porque el polímero de carbohidrato comprende heta-almidón y/o sulfato de dextrano.

23. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizada porque las microesferas tienen una densidad, \rho_{microesfera}, y el propelente tiene una densidad, \rho_{propelente}, y la relación entre las densidades \rho_{microesfera}:\rho_{propelente} está en el rango de 0,05 a 30.

24. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 para la administración de una proteína o de un péptido en el tracto respiratorio de un sujeto.

25. Método de fabricación que comprende dispersar una, dos o más dosis terapéuticas en un dispositivo de administración pulmonar, cada una de tales dosis terapéuticas conteniendo una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23.

26. Dispositivo de administración pulmonar, preferentemente inhalador dosificador, que comprende una, dos o más dosis terapéuticas que contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23.

27. Composición que comprende un envase que incluye:

a): un recipiente que contiene el contenido, dicho recipiente comprendiendo una, dos o más dosis terapéuticas de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23; y

b): instrucciones de uso del recipiente para introducir el contenido en el dispositivo de administración pulmonar.

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28. Método para la preparación de microesferas para su utilización en una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, que comprende mezclar una solución acuosa de una proteína o de un péptido y un polímero, donde dicho polímero es soluble en agua o soluble en un disolvente miscible en agua, y donde las microesferas resultantes:

b): tienen una estrecha distribución del tamaño de partícula; y/o

c): tienen un diámetro medio en el rango de:

i): aproximadamente 0,1 micras a aproximadamente 10,0 micras;

ii): aproximadamente 0,1 micras a aproximadamente 5,0 micras; o

iii): aproximadamente 0,1 micras a aproximadamente 3,0 micras.

29. Método según la reivindicación 28, caracterizado porque se aplica una fuente de energía a la mezcla resultante.

30. Método según la reivindicación 29, caracterizado porque la fuente de energía es calor.

31. Método según las reivindicaciones 28, 29 o 30, caracterizado porque dicho polímero está en una solución polimérica acuosa o miscible en agua.

32. Método según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, caracterizado porque dicho polímero se selecciona de entre el grupo consistente en polímeros de carbohidratos, alcoholes polialifáticos, polímeros polivinílicos, ácidos poliacrílicos, ácidos poliorgánicos, poliaminoácidos, poliéteres, polímeros naturales, poliimidas, poliésteres, polialdehídos, copolímeros, copolímeros de bloque, tertpolímeros, polímeros ramificados, ciclopolímeros y mezclas de los mismos.

33. Método según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, caracterizado porque dicho polímero se selecciona de entre el grupo consistente en dextrano, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, copolímeros de polietilenglicol y polivinilpirrolidona, alcohol polivinílico, copolímeros de polioxietileno y polioxipropileno y mezclas de los mismos, preferentemente, caracterizado porque dicho polímero es un copolímero de polietilenglicol y polivinilpirrolidona o un copolímero de polioxietileno y polioxipropileno.

34. Método según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, caracterizado porque la proteína se selecciona de entre el grupo consistente en acetato de leuprolida, hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH), (D-Tryp6)-LHRH, acetato de nafarelina, insulina, insulina sódica, insulina de cinc, proinsulina, péptido C de insulina, una mezcla de insulina y péptido C de insulina, cocristales de insulina híbridos, protamina, lisozima, alfa-lactoalbúmina, factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF), beta-lactoglobulina, tripsina, anhidrasa carbónica, ovoalbúmina, seroalbúmina bovina (BSA), seroalbúmina humana (HSA), fosforilasa b, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, IgG, fibrinógeno, poli-L-lisina, IgM, ADN, acetato desmopresina®, factor liberador de la hormona del crecimiento (GHRF), somatostatina, antida, Factor VIII, G-CSF/GM-GSF, hormona de crecimiento humana (hGH), interferón beta, antitrombina III, interferón alfa, interferón 2b alfa, hormona paratiroidea y calcitonina.

35. Método según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 34 que además comprende el paso de lavar las microesferas en una solución de lavado que comprende agua o un disolvente miscible en agua capaz de eliminar el polímero.

36. Método para la preparación de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, donde dicho método comprende llevar a cabo un método según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 35 y combinar las microesferas resultantes con un propelente.

37. Método según la reivindicación 36, caracterizado porque el propelente es un propelente hidrofluoroalcano.

38. Método según la reivindicación 37, caracterizado porque el propelente hidrofluoroalcano es HFA P134a y/o HFA P227.

39. Método para la preparación de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, que comprende:

a): seleccionar un propelente de densidad conocida, \rho_{propelente};

b): seleccionar una microesfera sólida o semisólida con una densidad \rho_{microesfera}, de modo que la relación \rho_{microesfera}:\rho_{propelente} esté en el rango de 0,05 a 30; y

c): poner en contacto múltiples microesferas sólidas o semisólidas con el propelente en ausencia de un agente tensioactivo, para formar la composición.

40. Método según la reivindicación 39, caracterizado porque el propelente es un propelente hidrofluoroalcano.

41. Método según la reivindicación 40, caracterizado porque dicho propelente hidrofluoroalcano es HFA P134a y/o HFA P227.

42. Método según la reivindicación 41, caracterizado porque la relación \rho_{microesfera}:\rho_{propelente} está en el rango de 0,5 a 3,0.