ES2341578T3 - Microesferas de liberacion prolongada. - Google Patents

Abstract

Microesfera que comprende: (1) una proteína o molécula portadora seleccionada de entre el grupo consistente en IgG; IgM; insulina; hGH; lisozima; alfa-lactoglobulina; factor de crecimiento de fibroblastos básicos; VEGF; quimiotripsina; tripsina, anhidrasa carbónica; ovoalbúmina; fosforilasa b; fosfatasa alcalina; beta-galactosidasa; fibrinógeno; poli-L-lisina; ADN; inmunoglobulinas (por ejemplo, anticuerpos); caseína; colágeno; proteína de soja; y gelatina.; (2) un polímero soluble en agua; (3) un primer agente complejante que es un polisacárido polianiónico y (4) un segundo agente complejante que es un catión metálico divalente seleccionado de entre el grupo consistente en calcio y magnesio

Description

Microesferas de liberación prolongada.

Campo de la invención

La invención se refiere a métodos y composiciones para formar y utilizar microesferas de liberación prolongada. Las microesferas son porosas e incluyen múltiples orificios acanalados con un diámetro inferior a 1.000 angstroms.

Antecedentes de la invención

Las micropartículas, microesferas y microcápsulas, en conjunto denominadas aquí "micropartículas", son partículas sólidas o semisólidas que tienen un diámetro inferior a un milímetro, preferentemente inferior a 100 micras, las cuales pueden estar formadas por diversos materiales, incluyendo polímeros sintéticos, proteínas y polisacáridos. Las micropartículas han sido utilizadas en numerosas aplicaciones diferentes, principalmente separaciones, diagnósticos y suministro de medicamentos.

Los ejemplos más conocidos de micropartículas empleadas en técnicas de separación son aquellas que están formadas por polímeros de origen tanto sintético como proteico, tales como poliacrilamida, hidroxiapatita o agarosa. Estas micropartículas poliméricas normalmente se utilizan para separar moléculas, tales como proteínas, según el peso molecular y/o la carga iónica o por la interacción con moléculas químicamente acopladas a las micropartí-
culas.

En el campo del diagnóstico, las micropartículas se utilizan frecuentemente para inmovilizar una enzima, el sustrato para una enzima o un anticuerpo marcado, el cual luego se somete a la interacción con una molécula para ser detectado directa o indirectamente.

En el área del suministro controlado de medicamentos, las moléculas están encapsuladas dentro de las micropartículas o se incorporan en una matriz monolítica para su liberación posterior. Habitualmente se emplean diversas distintas técnicas para elaborar estas micropartículas a partir de polímeros sintéticos, de polímeros naturales, de proteínas y polisacáridos, incluyendo una separación de fases, la evaporación del disolvente, una emulsificación y un secado por pulverización. Generalmente los polímeros forman la estructura soporte de estas microesferas y el medicamento de interés es incorporado en la estructura polimérica. Ejemplos de polímeros empleados para la formación de microesferas incluyen homopolímeros y copolímeros de ácido láctico y de ácido glicólico (PLGA), tal como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.213.812 de Ruiz, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.417.986 de Reid y col., en la Patente de Estados Unidos Nº 4.530.840 de Tice y col., la Patente de Estados Unidos Nº 4.897.268 de Tice y col., la Patente de Estados Unidos Nº 5.075.109 de Tice y col., la Patente de Estados Unidos Nº 5.102.872 de Singh y col., la Patente de Estados Unidos Nº 5.384.133 de Boyes y col., la Patente de Estados Unidos Nº 5.360.610 de Tice y col., y en la Publicación de Solicitud de Patente Europea Número 248.531 de Southern Research Institute; copolímeros en bloque como tetronic 908 y poloxamer 407, tal como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 4.904.479 de Illum; y polifosfacenos, tal como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.149.543 de Cohen y col. Las microesferas elaboradas mediante la utilización de polímeros tales como éstos presentan poca eficacia ante la carga y, a menudo, sólo son capaces de incorporar un pequeño porcentaje del medicamento de interés en la estructura polimérica. Por ello, a menudo se deben administrar cantidades sustanciales de microesferas para conseguir un efecto terapéutico.

Las perlas o partículas esféricas han estado disponibles comercialmente durante muchos años como una herramienta para los bioquímicos. Por ejemplo, anticuerpos conjugados con perlas originan partículas relativamente grandes específicas de ligandos particulares. Normalmente se emplean grandes partículas recubiertas de anticuerpos para reticular los receptores en la superficie de una célula para la activación celular, están unidas a una fase sólida para la purificación por inmunoafinidad y pueden utilizarse para suministrar un agente terapéutico que se libera lentamente en el tiempo, utilizando anticuerpos específicos tisulares o tumorales conjugados con las partículas para dirigir el agente hacia el sitio deseado.

El método más común de unión covalente de un anticuerpo a una matriz de fase sólida consiste en derivatizar una perla con un agente químico de conjugación y entonces unir el anticuerpo a la perla activada. La utilización de una perla sintética polimérica y no de una molécula proteica permite utilizar condiciones de derivatización mucho más severas que las que puedan soportar muchas proteínas, es relativamente barato y a menudo genera un enlace que es estable en un amplio espectro de condiciones desnaturalizantes. Se dispone comercialmente de diversas perlas derivatizadas, todas con diferentes constituyentes y tamaños. Las perlas formadas a partir de polímeros sintéticos, tales como poliacrilamida, poliacrilato, poliestireno o látex, están disponibles comercialmente de numerosas fuentes, como Bio-Rad Laboratories (Richmond, Calif.) y LKB Produkter (Stockholm, Suecia). Las perlas formadas a partir de macromoléculas y partículas naturales tales como agarosa, agarosa reticulada, globulina, ácido desoxirribonucleico y liposomas están disponibles comercialmente de fuentes como Bio-Rad Laboratories, Pharmacia (Piscataway, N.J.) e IBF (Francia). Las perlas formadas a partir de copolímeros de poliacrilamida y agarosa están disponibles comercialmente de fuentes como IBF y Pharmacia. Las perlas magnéticas están disponibles comercialmente de fuentes como Dynal Inc. (Great Neck, N.Y.).

Una desventaja de las micropartículas o perlas actualmente disponibles estriba en que son difíciles y caras de producir. Las micropartículas producidas por medio de estos métodos conocidos tienen una amplia distribución de tamaños de partícula, a menudo carecen de uniformidad y no consiguen presentar una cinética de liberación a largo plazo cuando la concentración de los ingredientes activos es alta. Además, los polímeros utilizados en estos métodos conocidos se disuelven en disolventes orgánicos con el fin de formar las microesferas. Por tanto, las microesferas deben elaborarse en instalaciones especiales diseñadas para manejar disolventes orgánicos. Estos disolventes orgánicos podrían desnaturalizar las proteínas o los péptidos contenidos en las micropartículas. Los disolventes orgánicos residuales podrían ser tóxicos cuando se administran a seres humanos o animales.

Además, las micropartículas disponibles rara vez vez tienen un tamaño lo suficientemente pequeño como para justo atravesar los orificios del tamaño de una aguja comúnmente utilizados para administrar la terapéutica o como para ser útiles en la administración vía inhalación. Por ejemplo, las micropartículas preparadas empleando ácido glicólico poliláctico (PLGA) son grandes y tienden a agregarse. Es necesaria una etapa de selección de tamaño, lo que resulta en una pérdida de producto, para eliminar aquellas partículas demasiado grandes como para su inyección. Aquellas partículas de PLGA con un tamaño adecuado para su inyección deben ser administradas mediante una aguja de gran calibre para corresponderse al gran tamaño de partícula, con frecuencia causando molestias al paciente.

Generalmente, todas las microesferas actualmente disponibles están activadas para liberar su contenido en medios acuosos y, por tanto, deben ser liofilizadas para impedir su liberación prematura. Además, las partículas como aquellas preparadas mediante el sistema de PLGA presentan una cinética de liberación basada tanto en la erosión como en la difusión. En este tipo de sistema, se observa una explosión inicial o una liberación rápida del medicamento. Este efecto de explosión puede resultar en efectos secundarios no deseados en aquellos pacientes a quienes se han administrado las partículas.

Actualmente se dispone de micropartículas preparadas utilizando lípidos para encapsular medicamentos diana. Por ejemplo, para encapsular medicamentos solubles en agua con el fin de su suministro posterior, tal como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.422.120 de Sinil Kim. En general estas partículas tienen un tamaño superior a 10 \mum y están diseñadas para la administración articular, intratecal, subcutánea o epidural. Como alternativa, para el suministro intravenoso de pequeñas moléculas se han utilizado liposomas. Los liposomas son partículas esféricas compuestas por bicapas múltiples o simples de fosfolípidos y colesterol. Los liposomas tienen un tamaño de 30 \mum o superior y pueden portar una variedad de medicamentos solubles en agua o en lípidos. La tecnología de los liposomas se ha visto dificultada por problemas que incluyen la pureza de los componentes lipídicos, una posible toxicidad, la heterogeneidad y estabilidad de las vesículas, una absorción excesiva y dificultades con su fabricación o su vida
útil.

Por tanto, existe una creciente necesidad de desarrollar nuevos métodos de fabricación de micropartículas, en particular que puedan adaptarse a su utilización en separaciones, en el campo diagnóstico y de suministro de medicamentos. Preferentemente, estas micropartículas mejoradas permitirían la liberación prolongada de los agentes activos de una manera predecible y coherente.

Sumario de la invención

La invención resuelve estos y otros problemas al proporcionar métodos y composiciones para la liberación prolongada de agentes terapéuticos y/o diagnósticos in vivo e in vitro. Tal como se emplea posteriormente aquí, con el término "agente terapéutico" se pretende incluir agentes clínicos que puedan ser administrados en forma microcapsular cuando se emplean esencialmente para el tratamiento o el diagnóstico.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona una microesfera de superficie lisa que incluye múltiples orificios acanalados. Los orificios acanalados tienen un diámetro inferior a 1.000 angstroms, tal como se determina mediante la técnica de adsorción de gas para determinar el tamaño de poro. Las microesferas de la invención incluyen una macromolécula, preferentemente una proteína o un ácido nucleico, y al menos un polímero soluble en agua. En general, las microesferas se forman poniendo en contacto la macromolécula y al menos un polímero soluble en agua bajo condiciones acuosas para formar las microesferas, y entonces las microesferas se estabilizan tanto por reticulación química como por su exposición a una fuente de energía, preferentemente de calor, o por ambos, a determinada temperatura, lo que resulta en microesferas que son resistentes a tratamientos físicos y químicos tales como sonicación y a soluciones cáusticas bajo estas condiciones. Aunque no se desee una vinculación a ninguna teoría o mecanismo particular, se piensa que las microesferas se forman durante la etapa de mezcla; sin embargo, estas microesferas inicialmente formadas son transitorias y requieren de otra etapa (por ejemplo, incluir un agente de reticulación en la mezcla y/o aplicar calor u otra fuente de energía) para estabilizar tales microesferas transitoriamente formadas. Las condiciones particulares para formar las microesferas representativas de la invención se describen en los Ejemplos. En las realizaciones preferentes, la reacción de formación se lleva a cabo sin adición de aceites o disolventes orgánicos. El aceite se define como una sustancia que es grasa líquida, la cual es insoluble en agua.

El componente proteico de la microesfera puede ser una proteína portadora o una proteína terapéutica (véase, por ejemplo, la Tabla 1). Tal como se utiliza aquí, una "proteína portadora" se refiere a una proteína que tiene un peso molecular de aproximadamente al menos 1.500 y que se presenta en estructura tridimensional. La proteína portadora puede ser también una proteína terapéutica, esto es, una proteína que tiene actividad terapéutica; sin embargo, en general, la expresión "proteína portadora" se utilizará en esta solicitud para referirse a una proteína que tiene una función esencial para proporcionar una estructura tridimensional con el propósito de la formación de microesferas, incluso aunque la proteína portadora pueda tener también una función secundaria como agente terapéutico. En ciertas realizaciones preferentes, la proteína portadora es una albúmina, en particular seroalbúmina humana. Opcionalmente, las microesferas proteicas de la invención incluyen además un agente terapéutico tal como un esteroide (por ejemplo estradiol, testosterona, prednisolona, dexametasona, hidrocortisona, base de lidocaína, base de procaína) o cualquier otra entidad química conocida por unirse a la proteína, preferentemente a la albúmina, tal como GCSF o paclitaxel. En todavía otras realizaciones (expuestas más abajo), las microesferas de la invención incluyen además un agente complejante y, preferentemente, un agente terapéutico (preferentemente un péptido) que está asociado al agente complejante mediante una interacción iónica o no iónica. En ciertas realizaciones, la proteína que comprende la matriz es una proteína terapéutica (por ejemplo una hormona como insulina u hormona de crecimiento humana) y la microesfera está construida y dispuesta para proporcionar una liberación prolongada de la proteína terapéutica in vivo. Preferentemente, la microesfera está construida y dispuesta para proporcionar una liberación prolongada del agente terapéutico en ausencia de un aumento de volumen significativo de la microesfera.

Sorprendentemente, la superficie de la microesfera es diferente de su interior. Un lavado fuerte con agua de las microesferas rotas por congelación disuelve gran parte del material de la matriz de la microesfera, dejando una envoltura fina. Además, la superficie de la microesfera es lisa; los orificios (poros) acanalados tienen un diámetro inferior a 1.000 angstroms, tal como se determina mediante técnicas de adsorción de gas para la determinación del tamaño de poro, utilizando por ejemplo la tecnología BET para el análisis de datos.

En general, las microesferas de la invención se forman por mezcla de la macromolécula, preferentemente una proteína o un ácido nucleico, con al menos un polímero acuoso bajo condiciones que permiten que el polímero soluble en agua elimine agua ("deshidrate") de la macromolécula, dentro de unas proporciones específicas o preferentes entre la macromolécula y el polímero soluble en agua. Tal como se utiliza aquí, un "polímero soluble en agua" de la invención se refiere a un polímero o a una mezcla de polímeros que son capaces de eliminar el agua o deshidratar la macromolécula o que sea capaz de otro modo de provocar una exclusión de volumen. Así, el proceso preferente implica la exclusión de volumen mediante la utilización de un sistema totalmente acuoso sin involucrar ningún aceite o disolvente orgánico.

Los polímeros solubles en agua adecuados incluyen polímeros ramificados o lineales solubles, preferentemente aquellos de alto peso molecular. Los polímeros pueden ser muy solubles en agua, moderadamente solubles en agua o ligeramente solubles en agua (solubilidad en agua superior a un 2% peso/volumen). Los polímeros solubles en agua preferentes son solubles en agua o solubles en un disolvente miscible en agua. Los polímeros solubles en agua pueden solubilizarse primero mediante su disolución en un disolvente miscible en agua y después combinando la solución de polímero con un disolvente acuoso. En las realizaciones particularmente preferentes, los polímeros solubles en agua de la invención se seleccionan de entre los polímeros solubles en agua mostrados en la Tabla 2. En ciertas realizaciones, las microesferas de la invención están formadas por proteínas y polímeros solubles en agua y contienen del 40 a menos del 100% (en peso) de proteína. El producto final de microesferas que ha sido estabilizado utilizando un agente reticulante y/o por su exposición a una fuente de energía, por ejemplo calor, no se hincha notablemente en presencia de agua (es decir, no es un hidrogel). En las realizaciones particularmente preferentes, el polímero soluble en agua es un polímero basado en hidrocarburos. Así, en ciertas realizaciones preferentes, la microesfera comprende: (1) una proteína, preferentemente albúmina; y (2) un polímero soluble en agua basado en hidrocarburos, preferentemente hetalmidón, representando la proteína al menos un 40% y menos del 100% en peso de la microesfera. Preferentemente, el polímero basado en hidrocarburos representa más del 0% y menos o igual al 30% en peso de la microesfera. En esta y otras realizaciones, las microesferas preferentemente comprenden además un agente activo, preferentemente una hormona de liberación de la hormona luteinizante o un análogo de la misma. En general, las microesferas de la invención, cuando están en contacto con una solución de agente activo, son capaces de incorporar al menos el 60%, preferentemente al menos el 70%, al menos el 80% o al menos el 90%, y con especial preferencia, al menos el 95% o al menos el 98% del agente activo. Opcionalmente las microesferas que contienen el agente activo se estabilizan además poniendo en contacto las microesferas con el mismo tipo de agente reticulante y utilizando los mismos tipos de condiciones aquí descritas para la estabilización inicial de las microesferas.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una microesfera que incluye además un agente complejante. Según este aspecto, la microesfera incluye: (1) una macromolécula tal como una proteína (por ejemplo albúmina, tal como se ha descrito anteriormente); (2) al menos un polímero soluble en agua (por ejemplo, hetalmidón (hidroxietilalmidón), PEG/PVP); y (3) un agente complejante. Tal como se utiliza aquí, un agente complejante se refiere a una molécula que es capaz de interactuar con un agente terapéutico (expuesto más abajo) para facilitar la carga, retención y/o de otro modo retrasar la liberación del agente terapéutico desde la microesfera (véase por ejemplo la Tabla 3). Como con todos los aspectos de la invención, estas microesferas tienen una superficie lisa que incluye múltiples orificios acanalados cuyo diámetro es inferior a 1.000 angstroms, tal como se determina por técnicas de adsorción de gas para la determinación del tamaño de poro y, preferentemente, no contienen aceites o disolventes orgánicos detectables.

De acuerdo con un aspecto particularmente preferente de la invención, se proporciona una microesfera que incluye además al menos dos agentes complejantes. Según este aspecto, la microesfera incluye: (1) una macromolécula tal como una proteína portadora (por ejemplo albúmina, tal como se ha descrito anteriormente); (2) al menos un polímero soluble en agua (por ejemplo hetalmidón (hidroxietilalmidón), PEG/PVP); (3) un primer agente complejante que es un polisacárido aniónico; y (4) un segundo agente complejante que es un catión metálico divalente seleccionado de entre el grupo consistente en calcio, magnesio, zinc, estroncio, bario, manganeso y hierro. Una realización particularmente preferente de este aspecto de la invención se ilustra en el Ejemplo 17. El calcio y el magnesio son los cationes metálicos divalentes preferentes.

Tal como se utiliza aquí, un agente complejante se refiere a una molécula que es capaz de interactuar con un agente terapéutico (expuesto más abajo) para facilitar la carga, la retención y/o de otro modo retrasar la liberación del agente terapéutico desde la microesfera (véase por ejemplo la Tabla 3). Como con otros aspectos de la invención, estas microesferas tienen preferentemente una superficie lisa que incluye múltiples orificios acanalados cuyo diámetro es inferior a 1.000 angstroms, tal como se determina por técnicas de adsorción de gas para la determinación del tamaño de poro y, preferentemente, no contienen aceites o disolventes orgánicos detectables.

Un método preferente para incorporar el(los) agente(s) complejante(s) consiste en combinar el(los) agente(s) complejante(s) con un polímero soluble en agua en solución acuosa, luego añadir la macromolécula y estabilizar las microesferas con calor y/o con agentes reticulantes.

En general, el agente complejante es un agente complejante iónico (es decir, el agente complejante es capaz de una interacción iónica con un agente terapéutico (expuesto más abajo)) o un agente complejante no iónico (es decir, el agente complejante es capaz de una interacción no iónica (por ejemplo hidrofóbica, iónica/no iónica mixta) con un agente terapéutico o con otro agente complejante). Ejemplos de agentes complejantes se muestran en la Tabla 3. Los agentes complejantes iónicos de la invención se clasifican además en agentes complejantes aniónicos (es decir, agentes complejantes que tienen carga negativa, como polisacáridos aniónicos, por ejemplo sulfato de dextrano, ácidos galacturónicos, alginatos, ácido manurónico, ácido gulurónico, ácido hialurónico, sulfatos de condroitina, heparina, quitina, quitosano, glicosaminoglicanos, proteoglicanos) y agentes complejantes catiónicos (es decir, agentes complejantes que tienen carga positiva). Los agentes complejantes preferentes de la invención son polisacáridos aniónicos y cationes metálicos divalentes seleccionados de entre el grupo consistente en calcio y magnesio.

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En ciertas realizaciones, el agente complejante es un agente complejante aniónico que tiene una estructura de fórmula I:

(I)POLY-[Y^{-}]_{n} X^{+}

donde

POLY representa una cadena principal del agente complejante aniónico que puede ser lineal o ramificada;

Y^{-} representa un grupo aniónico, por ejemplo sulfato, carboxilo, fosfato, nitrato, carbonato y similares, que pueden acoplarse a una o más de las ramificaciones de la cadena principal;

X^{+} representa un grupo catiónico, por ejemplo es un contraión del grupo aniónico;

n es un número entero de 1 a 10.000, preferentemente de 5 a 100 y, en especial de 5 a 1.000 y en particular de 5 a 10.000; y

cuando n es superior a 1, los n grupos Y^{-} pueden ser iguales o diferentes.

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En todavía otras realizaciones de la invención, el agente complejante es un agente complejante catiónico que tiene la estructura de fórmula II:

(II)POLY-[X^{+}]_{n} Y^{-}

donde

POLY representa una cadena principal del agente complejante catiónico que puede ser lineal o ramificada;

X^{+} representa un grupo catiónico, por ejemplo un grupo amino, que puede acoplarse a una o más de las ramificaciones de la cadena principal;

Y^{-} representa un grupo aniónico, que es un contraión del grupo catiónico;

n es un número entero de 1 a 10.000, preferentemente de 5 a 100, en especial de 5 a 1.000 y en particular de 5 a 10.000; y

cuando n es superior a 1, los n grupos X^{+} pueden ser iguales o diferentes.

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De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una microesfera que incluye además un agente activo (véase por ejemplo la Tabla 4). Las microesferas dentro de las cuales puede cargarse el agente activo pueden incluir uno o varios agentes complejantes para facilitar la carga y/o para modificar la liberación del agente activo desde la microesfera. Como alternativa, el agente activo puede cargarse dentro de las microesferas anteriormente descritas sin que exista un agente complejante, por ejemplo, la proteína y/o los polímeros solubles en agua de la invención pueden interactuar con el agente activo para facilitar la carga y/o modificar su liberación desde la microesfera. En general, aunque se pueda cargar el agente activo en una microesfera de la invención durante la preparación de la microesfera, es preferible cargar el agente activo en una microesfera preformada de la invención y, en particular cargar el agente activo en una microesfera preformada que contenga uno o más agentes complejantes para facilitar la carga y/o la liberación prolongada del agente. Contrariamente a las microesferas de hidrogel, las microesferas de la invención no se hinchan significativamente en agua y, además, las microesferas no requieren tal hinchamiento para proporcionar la liberación prolongada de la proteína terapéutica y/o del agente fisiológicamente activo desde la microesfera.

Tal como se utiliza aquí, un agente activo se refiere a un agente que posee una actividad diagnóstica o terapéutica. En consecuencia, un agente activo puede incluir una etiqueta detectable (por ejemplo radioactiva) que sirve para identificar la localización del agente liberado in vivo; los agentes activos también incluyen agentes terapéuticos, que sirven para tratar una enfermedad o condición. En ciertas realizaciones, los agentes fisiológicamente activos preferentes son proteínas o agentes peptídicos. Tales proteínas o agentes peptídicos típicamente pueden dividirse además en categorías según la actividad del agente o el tipo de enfermedad o condición que se está tratando. Las categorías de agentes fisiológicamente activos que se pueden utilizar en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, antibióticos, hematopoyéticos, agentes antiinfecciosos, agentes antidemencia, antivirales, antitumorales, antipiréticos, analgésicos, agentes antiinflamatorios, agentes antiulcerosos, antialérgicos, antidepresivos, agentes psicotrópicos, cardiotónicos, agentes antiarrítmicos, vasodilatadores, agentes antihipertensivos, tales como diuréticos para hipotensos, agentes antidiabéticos, anticoagulantes, agentes reductores del colesterol, agentes terapéuticos para la osteoporosis, hormonas, vacunas, etc... (véase por ejemplo la Tabla 4).

El péptido o la proteína fisiológicamente activa que se emplea de acuerdo con la presente invención es un péptido compuesto por dos o más aminoácidos. Preferentemente, este péptido tiene un peso molecular superior a 200, por ejemplo en el rango de aproximadamente 200 a 200.000. El rango de peso molecular especialmente preferente se sitúa entre aproximadamente 200 y 100.000. Ejemplos más específicos de agentes fisiológicamente activos, incluyendo agentes no proteicos, que pueden utilizarse en lo que respecta a los métodos y composiciones de la invención se proporcionan en la descripción detallada de la invención.

De acuerdo con todavía otro aspecto de la invención, se proporciona un método para formar una microesfera. El método implica: (1) la formación de una mezcla acuosa que contiene una macromolécula, preferentemente una proteína o un ácido nucleico, y un polímero soluble en agua, preferentemente un polímero basado en hidrocarburos, por ejemplo hetalmidón; (2) permitir que se formen las microesferas en la mezcla acuosa; (3) estabilización de las microesferas, preferentemente poniéndolas en contacto con un agente reticulante y/o exponiéndolas a una fuente de energía, preferentemente calor, bajo condiciones suficientes para estabilizar las microesferas; estando presente la macromolécula en la mezcla acuosa en una cantidad suficiente para formar una microesfera que contiene al menos el 40% y menos del 100% en peso de macromolécula. Aunque sin vincularse a una teoría o mecanismo particular, se piensa que las microesferas se forman durante la etapa de mezcla; sin embargo, estas microesferas inicialmente formadas son transitorias y requieren otra etapa (por ejemplo, la inclusión de un agente reticulante en la mezcla y/o la aplicación de calor o de otra fuente de energía) para estabilizar las microesferas formadas transitoriamente. En los Ejemplos se proporcionan métodos típicos para preparar las microesferas.

De acuerdo con todavía otro aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica del material y el método para fabricar dicha composición. En ciertas realizaciones, la composición incluye un recipiente que contiene una única dosis de microesferas que contienen un agente activo para tratar un estado que es tratable por medio de la liberación prolongada de un agente activo desde las microesferas. El número de microesferas en la dosis única depende de la cantidad de agente activo presente en cada microesfera y del período de tiempo durante el cual se desee la liberación prolongada. Preferentemente, se selecciona la dosis única para conseguir una liberación prolongada del agente activo durante un período de aproximadamente 1 a aproximadamente 180 días, seleccionándose la dosis única de microesferas de forma que se consiga el perfil de liberación deseado para tratar la condición.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una jeringuilla que contiene cualquiera de las microesferas aquí descritas. Por ejemplo, la composición puede incluir una jeringuilla que contiene una única dosis de microesferas que contienen un agente activo para tratar una condición que es tratable por medio de la liberación prolongada del agente activo desde las microesferas. Preferentemente, se sujeta una aguja a la jeringuilla, teniendo la aguja un diámetro interior de calibre 14 a 30.

En especial, las microesferas de la invención pueden prepararse para que tengan una dimensión que permita su suministro utilizando una jeringuilla sin aguja (MediJector, Derata Corporation, Minneapolis, MN 55427), eliminando así los problemas de evacuación inherentes a las agujas que deben desecharse como desperdicio biológico peligroso. Así, de acuerdo con un aspecto particularmente preferente de la invención, se proporciona una jeringuilla sin aguja que contiene una o más dosis de microesferas que contienen un agente activo para tratar una condición. Se pueden preparar las microesferas de forma que se obtenga la calidad adecuada para su suministro por otras vías parenterales y no parenterales, como por vía oral, bucal, intratecal, nasal, pulmonar, transdérmica, transmucosa y similares.

De acuerdo con todavía otras realizaciones de la invención, se proporcionan microesferas que contienen ácidos nucleicos. Las microesferas que contienen ácidos nucleicos incluyen: (1) un ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido, un vector viral, oligonucleótidos, ARN, ácidos nucleicos antisentido y sin sentido); (2) un polímero policatiónico (por ejemplo polilisina); y (3) un polímero soluble en agua (tal como se ha descrito anteriormente). Así, se proporciona un método para formar microesferas que contienen ácidos nucleicos. El método implica: (1) combinar, en una o más soluciones acuosas, un ácido nucleico, un polímero policatiónico y un polímero soluble en agua para formar una mezcla acuosa que puede ser mono- o multi-fase; y (2) someter la mezcla acuosa a un agente reticulante y/o a una fuente de energía, bajo condiciones suficientes (por ejemplo de concentración, tiempo de incubación) como para estabilizar una microesfera. En los Ejemplos se proporcionan métodos típicos para la formación de microesferas de ácidos nucleicos.

Estos y otros aspectos de la invención se describirán con más detalle a continuación. A lo largo de esta descripción, todos los términos técnicos y científicos tienen el mismo sentido que el entendido comúnmente por un especialista medio en la materia a la que pertenece esta invención, salvo que se defina de otro modo.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1: gráfico que muestra el porcentaje acumulativo de polietilenglicol (PEG) radiomarcado y de seroalbúmina bovina (BSA) radiomarcada liberados por las microesferas en función de la raíz cuadrada del tiempo en horas. El símbolo cuadrado negro representa PEG y el símbolo cuadrado blanco representa BSA.

Fig. 2 gráfico que muestra el porcentaje acumulativo de seroalbúmina bovina (BSA) radiomarcada liberado por las microesferas preparadas con tres concentraciones diferentes de polímero en función de la raíz cuadrada del tiempo en horas. El símbolo cuadrado gris representa una concentración total de polímero del 50%, el símbolo cuadrado blanco representa una concentración total de polímero del 40% y el símbolo triángulo negro representa una concentración total de polímero del 25%.

Fig. 3 gráfico que muestra el porcentaje acumulativo de polietilenglicol (PEG) radiomarcado liberado por las microesferas preparadas con tres concentraciones diferentes de polímero en función de la raíz cuadrada del tiempo en horas. El símbolo triángulo blanco representa una concentración total de polímero del 50%, el símbolo cuadrado negro representa una concentración total de polímero del 40% y el símbolo cuadrado blanco representa una concentración total de polímero del 25%.

Fig. 4 gráfico que muestra el porcentaje acumulativo de seroalbúmina bovina (BSA) radiomarcada liberado por las microesferas preparadas con tres concentraciones diferentes de polímero, a distintas temperaturas de incubación, en función de la raíz cuadrada del tiempo en horas. El símbolo cuadrado blanco representa una concentración total de polímero del 25% y una incubación a 58ºC, el símbolo cuadrado negro representa una concentración total de polímero del 25% y una incubación a 70ºC, el símbolo círculo blanco representa una concentración total de polímero del 40% y una incubación a 58ºC, el símbolo círculo negro representa una concentración total de polímero del 40% y una incubación a 70ºC, el símbolo triángulo blanco representa una concentración total de polímero del 50% y una incubación a 58ºC, el símbolo triángulo negro representa una concentración total de polímero del 50% y una incubación a 70ºC, el símbolo "X" representa una concentración total de polímero del 25% y una incubación a 37ºC y 58ºC, y el símbolo en negrita "X" representa una concentración total de polímero del 25% y una incubación a 37ºC y 70ºC.

Fig. 5 gráfico que muestra el porcentaje acumulativo de polietilenglicol (PEG) radiomarcado liberado por las microesferas preparadas con tres concentraciones diferentes de polímero a distintas temperaturas de incubación en función de la raíz cuadrada del tiempo en horas. Los símbolos son los mismos que los descritos en la Fig. 4.

Fig. 6 gráfico que muestra el porcentaje acumulativo de polietilenglicol (PEG) radiomarcado liberado por las microesferas preparadas con tres concentraciones diferentes de polímero a una temperatura de incubación que incluye 58ºC en función de la raíz cuadrada del tiempo en horas. El símbolo triángulo blanco representa una concentración total de polímero del 50% y una incubación a 58ºC, el símbolo cuadrado negro representa una concentración total de polímero del 40% y una incubación a 58ºC, el símbolo triángulo gris representa una concentración total de polímero del 25% y una incubación a 37ºC y 58ºC y el símbolo cuadrado blanco representa una concentración total de polímero del 25% y una incubación a 58ºC.

Fig. 7 gráfico de barras que muestra la cantidad de producto genético expresado por la actividad beta-galactosidasa en miliunidades en función de la formación de microesferas para ADN desnudo, para liposomas catiónicos que contienen ADN y para microesferas de ADN.

Fig. 8 gráfico de la liberación en porcentaje acumulativo de acetato de leuprolida desde las microesferas con el tiempo en días.

Fig. 9 gráfico de la liberación en porcentaje acumulativo de acetato de nafarelina en función del tiempo en horas para tres concentraciones de sulfato de zinc utilizadas durante la preparación de las microesferas. El círculo representa sulfato de zinc 0,01M; el símbolo cuadrado representa sulfato de zinc 0,1M; y el símbolo triángulo representa sulfato de zinc 1M.

Fig. 10 muestra la liberación prolongada de estradiol in vitro por las microesferas de la invención.

Fig. 11 muestra la liberación prolongada de estradiol in vivo (concentraciones de suero) por las microesferas de la invención.

Fig. 12 muestra la eficacia de la incorporación de diclofenaco sódico mediante el ajuste de las condiciones de incubación.

Fig. 13 muestra un perfil representativo de distribución de tamaño para las microesferas de la invención.

Descripción detallada

La invención proporciona los métodos y composiciones para la liberación prolongada de agentes terapéuticos y/o diagnósticos in vivo y/o in vitro. En general las microesferas tienen un tamaño y forma uniformes, oscilando el tamaño entre aproximadamente 0,5 micras y aproximadamente 20 micras, según las condiciones de fabricación. Las características de las microesferas pueden verse alteradas durante la preparación debido a la manipulación de la concentración del polímero soluble en agua, la temperatura de reacción, el pH, la concentración de proteína, el agente reticulante y/o el tiempo de exposición de la macromolécula al agente reticulante y/o a la fuente de energía.

Las microesferas sirven para una amplia variedad de separaciones, propósitos diagnósticos, terapéuticos, industriales, comerciales, cosméticos y de investigación o con cualquier propósito que requiera la incorporación y estabilización de una molécula activa, reactivo o medicamento. Así, las microesferas de la invención son útiles en aplicaciones médicas y diagnósticas tales como el suministro de medicamentos, la vacunación, la terapia genética y la formación de imágenes tumorales o de tejidos in vivo o histopatológicas. En consecuencia, las microesferas son adecuadas para su administración oral o parenteral; administración vía mucosas; oftálmica, por inyección intravenosa, subcutánea, intraarticular o intramuscular; administración por inhalación; y para la administración tópica.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona una microesfera que tiene una superficie lisa incluyendo múltiples orificios acanalados. Cada orificio acanalado tiene un diámetro inferior a 1.000 angstroms, tal como se determina por técnicas de adsorción de gas para la determinación del tamaño de poro mediante, por ejemplo, la metodología BET para análisis de datos.

Las microesferas se preparan mezclando o disolviendo macromoléculas con un polímero soluble en agua o con una mezcla de polímeros solubles en agua, tales como los polímeros lineales o ramificados de la Tabla 2, a un pH cercano al punto isoeléctrico de la macromolécula. La macromolécula y la mezcla de polímeros se exponen a un agente reticulante y/o a una fuente de energía, por ejemplo calor, bajo las condiciones suficientes como para estabilizar las microesferas. Las microesferas se separan entonces de los reactivos no incorporados por medio de métodos de separación, por ejemplo filtración o centrifugación.

En general, la macromolécula o la combinación de macromoléculas constituye al menos el 40% y menos del 100% en peso del peso final de cada microesfera. Preferentemente, la concentración de polímero en la microesfera es superior al 0% e inferior o igual al 30% en peso. Los tipos de macromoléculas que forman las microesferas incluyen, pero no se limitan a, proteínas, péptidos, hidrocarburos, ácidos nucleicos, virus o mezclas de los mismos.

Cada microesfera se compone de macromoléculas y de moléculas poliméricas, las cuales se entrelazan o entremezclan en la microesfera y que generalmente están distribuidas de forma homogénea. Aunque sin vincularse a ninguna teoría o mecanismo particular, se piensa que la matriz interna es soluble en agua y, cuando está solubilizada, la matriz interna se difunde por la superficie exterior bajo las condiciones apropiadas, tal como se explica con más detalle posteriormente. Las microesferas muestran una estrecha distribución de tamaño y en general tienen una forma uniforme. La distribución de tamaño también es ajustable mediante la modificación de las condiciones y de los reactivos utilizados durante el proceso de preparación y puede asociarse a la cinética de liberación, tal como se describirá más adelante. En general, las microesferas tienen un diámetro inferior a 10 \mum. Véase la Figura 13 para una distribución representativa de tamaño de las microesferas de la invención. La forma uniforme de las microesferas es sustancialmente esférica, razón por la cual las micropartículas se denominan también aquí como "microesferas".

La superficie exterior de cada microesfera es permeable al agua y a macromoléculas disueltas y no sólo permite que los fluidos acuosos penetren en la microesfera, sino permite también que la macromolécula solubilizada y el polímero salgan de la microesfera. Las microesferas pueden elaborarse de forma que liberen la macromolécula y el polímero del interior de la microesfera cuando están en un medio acuoso apropiado, tal como fluidos corporales o en un tampón fisiológicamente aceptable, en condiciones fisiológicas, durante un período de tiempo prolongado, proporcionando así la liberación prolongada de las macromoléculas. Además, las microesferas pueden fabricarse de forma que liberen la macromolécula sin explosión inicial o liberación rápida de la macromolécula. La liberación prolongada se define aquí como liberación de las macromoléculas durante un largo período de tiempo. El período de tiempo durante el cual la macromolécula continúa siendo liberada desde la microesfera depende de las características de la macromolécula que está liberándose y de los parámetros utilizados para formar las microesferas, pero en todos los casos es mayor que el de la difusión acuosa libre de la macromolécula. Las microesferas que contienen compuestos farmacéuticos pueden fabricarse de forma que liberen el compuesto farmacéutico con la macromolécula y el polímero, tal como se ha descrito anteriormente.

Tal como se describió brevemente anteriormente y con más detalle se hará en adelante, las características de las microesferas pueden manipularse durante la preparación mediante el ajuste del tipo de polímero, de la concentración polimérica, de la composición polimérica, de la temperatura de incubación, del pH, de la concentración de macromoléculas o del período de tiempo durante el cual la macromolécula está expuesta a la fuente de energía.

Se pueden administrar las microesferas a un ser humano o a un animal por vías de administración oral o parenteral, incluyendo la inyección intravenosa, subcutánea o intramuscular; administración por inhalación; administración intraarticular; administración vía mucosas; administración oftálmica; y administración tópica. La administración intravenosa incluye la cateterización o la angioplastia. La administración puede ser con propósitos del tipo terapéutico y diagnóstico, tal como se expondrá posteriormente.

Formación de las Microesferas

Las microesferas se obtienen mezclando las macromoléculas en una mezcla acuosa con un polímero soluble en agua o con una mezcla de polímeros para formar las microesferas y opcionalmente, a continuación, poniendo en contacto las microesferas con un agente reticulante y/o con una fuente de energía, preferentemente calor, bajo condiciones suficientes como para estabilizar las microesferas. Preferentemente, la solución es una solución acuosa. Para provocar la eliminación del agua o la deshidratación de las macromoléculas, o bien la solución de macromoléculas se añade al polímero o bien se añade la solución de polímeros a la solución de macromoléculas. Los especialistas en la materia también denominan a este proceso como "exclusión de volumen". Aunque sin vincularse a ninguna teoría o mecanismo particular, se piensa que las microesferas se forman durante la etapa de mezcla; sin embargo, estas microesferas inicialmente formadas son transitorias y requieren otra etapa (por ejemplo, la inclusión de un agente reticulante en la mezcla y/o la aplicación de calor o de otra fuente de energía) para estabilizar las microesferas formadas transitoriamente.

El pH de la solución de macromolécula-polímero se ajusta antes, después o durante la mezcla del polímero con la macromolécula a un pH cercano al punto isoeléctrico (pI) de la macromolécula, preferentemente dentro de un rango de 3 a 4 unidades de pH del pI de la macromolécula, en especial entre 1,5 y 2 unidades de pH del pI de la macromolécula.

El ajuste de pH puede llevarse a cabo mediante la adición de un ácido, de una base, bien en forma de solución o sólida, o de un tampón u otra sal o solución de ajuste del pH a la solución de macromolécula, solución de polímero, o a la mezcla de macromolécula y polímero de acuerdo con métodos bien conocidos por los especialistas en la materia. Preferentemente, el polímero se disuelve en un tampón con un pH cercano al pI de la macromolécula y entonces la solución de polímero con el pH ajustado se añade a la macromolécula, que ha sido disuelta en una solución acuosa. El pH de la solución final debe permanecer cercano al pI de la macromolécula.

Entonces se expone la solución de macromolécula y polímero a un agente reticulante y/o a una fuente de energía, por ejemplo de calor, radiación o ionización, sola o en combinación con sonicación, vórtex, mezcla o agitación, durante un período de tiempo predeterminado, para estabilizar las microesferas. Las microesferas resultantes se separan entonces de cualquier componente no incorporado presente en la solución por medio de métodos de separación física bien conocidos por los especialistas en la materia y después pueden lavarse.

La duración de la incubación depende de las concentraciones respectivas del polímero y la macromolécula y del nivel de energía de la fuente de energía. La estabilización de las microesferas puede empezar inmediatamente bajo la exposición a la fuente de energía. Preferentemente, la mezcla de macromolécula y polímero se calienta a una temperatura superior a la temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos hasta 24 horas. En especial, se mezclan el polímero y las macromoléculas mediante agitación u oscilación durante 30 minutos, a una temperatura situada aproximadamente entre 37ºC y 70ºC.

Macromoléculas

Las macromoléculas que componen la microesfera consisten en cualquier molécula que tenga una estructura terciaria y cuaternaria o que sea capaz de tener una estructura terciaria y cuaternaria. Con más preferencia, la macromolécula es una biomolécula tal como una proteína, incluidas las enzimas y proteínas recombinantes, un péptido, un hidrocarburo, un polisacárido, un conjugado hidrocarburo- o polisacárido-proteína, un ácido nucleico, un virus, una partícula vírica, un conjugado de una molécula pequeña (tal como un hapteno) y una proteína, o sus mezclas. En las microesferas puede incorporarse un compuesto farmacéutico natural o sintético, orgánico o inorgánico o un medicamento mediante la sujeción del medicamento a una macromolécula, tal como una proteína, y luego mediante la formación de las microesferas a partir del complejo o conjugado macromolécula-medicamento. Los especialistas en la materia entenderán que puede formarse dentro de una microesfera un compuesto incapaz de tener una estructura terciaria y cuaternaria, mediante la incorporación o acoplamiento del compuesto dentro de una molécula portadora que posea una estructura terciaria y cuaternaria. Los especialistas en la materia entenderán, además, que la macromolécula puede ser una parte de una molécula, por ejemplo un péptido, un segmento de una sola hebra de una molécula de ácido nucleico de doble hebra, que tenga una estructura terciaria y cuaternaria. Se entenderá también que el término "macromolécula" incluye una pluralidad de macromoléculas e incluye combinaciones de distintas macromoléculas, tal como una combinación de un compuesto farmacéutico y una molécula con afinidad para dirigir el compuesto farmacéutico hacia un tejido, órgano o tumor que necesita el tratamiento. Se entenderá además que una molécula con afinidad puede ser la parte del receptor o la parte del ligando de una interacción receptor-ligando. Ejemplos de ligandos que interactúan con otras biomoléculas incluyen virus, bacterias, polisacáridos o toxinas que actúan como antígenos para generar una respuesta inmune cuando se administra a un animal y provoca la producción de anticuerpos.

Compuestos o macromoléculas adecuados incluyen, pero sin limitarse a, Betaxolol^{TM}, Diclofenaco^{TM}, doxorrubicina, Rifampin^{TM}, acetato de leuprolida, hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH), (D-Tryp6)-LHRH, acetato de nafarelina, insulina, insulina sódica, insulina de zinc, protamina, lisozima, alfa-lactoalbúmina, factor de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF), beta-lactoglobulina, tripsina, anhidrasa carbónica, ovalbúmina, seroalbúmina bovina (BSA), seroalbúmina humana (HSA), fosforilasa b, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, IgG, fibrinógeno, poli-L-lisina, IgM, ADN, acetato de desmopresina^{TM}, factor de liberación de la hormona del crecimiento (GHRF), somatostatina, antida, Factor VIII, G-CSF/GM-CSF, hormona del crecimiento humano (hGH), beta interferón, antitrombina III, alfa interferón, alfa interferón 2b.

Las condiciones de incubación se optimizan normalmente para incorporar aproximadamente el 100% de la macromolécula en la mezcla de reacción ajustando el pH, la temperatura, la concentración de macromolécula o la duración de la reacción o incubación. En general, se necesita menos energía para formar microesferas con altas concentraciones de macromolécula.

Preferentemente, las microesferas compuestas por ácidos nucleicos se preparan mezclando primero el ácido nucleico bien con una proteína, tal como seroalbúmina bovina, o, como los ácidos nucleicos son aniones, con la adición de un catión, tal como polilisina, lo cual ayuda mucho a la formación de microesferas.

Tal como se ha mencionado anteriormente, una pequeña molécula o compuesto incapaz de tener una estructura terciaria y cuaternaria, por ejemplo un péptido o un compuesto farmacéutico, puede formarse dentro de una microesfera mediante la incorporación o el acoplamiento del compuesto dentro de una molécula portadora que posee una estructura terciaria y cuaternaria. Esto puede conseguirse de distintas maneras. Por ejemplo, se pueden formar las microesferas tal como se describe aquí, mediante la utilización de una macromolécula que tiene una estructura terciaria y cuaternaria, por ejemplo una proteína, y luego la pequeña molécula o compuesto se une dentro y/o en la superficie de la microesfera. Como alternativa, la molécula pequeña o el compuesto se une a la macromolécula de estructura terciaria y cuaternaria utilizando interacciones hidrofóbicas o iónicas y luego se forman las microesferas a partir del complejo macromolécula-molécula pequeña por medio del método descrito aquí. Una tercera forma de obtener microesferas a partir de moléculas pequeñas consiste en preparar microesferas utilizando una macromolécula que tiene una estructura terciaria y cuaternaria de modo tal que la microesfera tenga una carga neta y luego añadir una pequeña molécula o compuesto que tenga una carga neta opuesta para que la molécula pequeña esté atraída físicamente hacia la microesfera y permanezca unida a la misma, pero que pueda liberarse con el tiempo bajo condiciones apropiadas. Como alternativa, pueden utilizarse distintos tipos de interacciones no covalentes, tales como interacciones hidrofóbicas o de afinidad, para permitir la fijación y liberación posterior de las moléculas pequeñas.

Cuando se preparan microesferas que contienen proteínas, antes de la adición de los polímeros durante la formación de las microesferas puede añadirse un estabilizador de proteína, tal como glicerol, ácidos grasos, azúcares como sacarosa, iones por ejemplo de zinc, cloruro de sodio o cualquier otro estabilizador de proteína conocido por los especialistas en la materia, para minimizar la desnaturalización de las proteínas.

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Macromolécula Marcada

Antes de ser incorporada en una microesfera, la macromolécula puede marcarse con una etiqueta detectable. Los distintos tipos y métodos de marcado de las proteínas y moléculas de ácidos nucleicos son bien conocidos por los especialistas en la materia. Éstos entenderán que una sustancia magnética, tal como un metal, se incluye dentro de la definición del término marca. Por ejemplo, se puede marcar la macromolécula con una sustancia metálica, por ejemplo con un metal, para que las microesferas puedan separarse de otras sustancias en solución con la ayuda de un dispositivo magnético.

Se exponen más adelante varias otras etiquetas específicas o grupos de marcadores. Por ejemplo, la etiqueta puede ser una radiomarca tal como, pero no limitada a, ^{[32]}P, ^{[3]}H, ^{[14]}C, ^{[35]}S, ^{[125]}I o ^{[131]}I. Puede conjugarse una marca ^{[32]}P a una proteína con un reactivo de conjugación o puede incorporartse en la secuencia de una molécula de ácido nucleico mediante nick-translation (corte y cambio), por marcado final o por incorporación de un nucleótido marcado. Por ejemplo, una marca ^{[3]}H, ^{[14]}C, ^{[35]}S puede incorporarse en una secuencia de nucleótidos incorporando un precursor marcado o por modificación química, mientras que una marca, ^{[125]}I o ^{[131]}I generalmente se incorpora en una secuencia de nucleótidos por modificación química. La detección de una marca puede llevarse a cabo por métodos tales como recuento de escintilación, espectrometría de rayos gamma o autorradiografía.

La etiqueta también puede ser una marca de Resonancia Magnética Nuclear (NMR) o de Masas, por ejemplo, ^{[13]}C o ^{[15]}N o ^{[19]}O. La detección de tales marcas puede realizarse por Espectrometría de Masas o NMR. Se pueden utilizar también tinciones, agentes quimioluminiscentes, agentes bioluminiscentes y fluorógenos para marcar la macromolécula. Ejemplos de tinciones que sirven para marcar los ácidos nucleicos incluyen bromuro de etidio, de acridina, de propidio y otros tintes intercalantes, y 4',6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.) u otros tintes para ácidos nucleicos. Ejemplos de fluorógenos incluyen fluoresceína y derivados, ficoeritrina, aloficocianina, rodamina, Rojo de Texas u otros fluorógenos. Los fluorógenos generalmente se unen por modificación química. Las marcas de tinción pueden detectarse en un espectrofotómetro y las de fluorógenos en un detector de fluorescencia.

La macromolécula puede marcarse también con un cromógeno (sustrato enzimático) para proporcionar una enzima o marca de afinidad, o con una enzima. Como alternativa, la macromolécula puede ser biotinilada para que pueda emplearse en una reacción biotina-avidina, que puede acoplarse también a una marca tal como una enzima o un fluorógeno. La macromolécula puede marcarse con peroxidasa, fosfatasa alcalina o con otras enzimas que producen una reacción cromogénica o fluorogénica cuando se añaden al sustrato.

También puede llevarse a cabo el etiquetado por incorporación de cualquier base modificada, aminoácido o precursor que contenga cualquier marca, incorporando una base modificada o un aminoácido que contenga un grupo químico reconocible por anticuerpos específicos, o mediante la detección de cualquier complejo de anticuerpos enlado, por diversos medios, incluyendo reacciones de inmunofluorescencia o inmunoenzimáticas. Estas marcas pueden detectarse por inmuoensayos de unión a enzimas (ELISA) o mediante la detección de un cambio de color con la ayuda de un espectrofotómetro.

Microesferas Recubiertas

A la superficie exterior de las microesferas pueden unirse otras moléculas, distintas de las macromoléculas de las que están compuestas las microesferas, según métodos conocidos por los especialistas en la materia, para "recubrir" o "decorar" las microesferas. La capacidad de las moléculas de unirse a la superficie exterior de la microesfera se debe a la alta concentración de la macromolécula en la microesfera. Estas moléculas se unen con el objetivo de, por ejemplo, facilitar el targeting (localización de la diana), mejorar la mediación del receptor y poder escapar de la endocitosis o de la destrucción. Por ejemplo, biomoléculas tales como fosfolípidos pueden unirse a la superficie de la microesfera para impedir la endocitosis por endosomas; receptores, anticuerpos u hormonas pueden unirse a la superficie para promover o facilitar el targeting de la microesfera hacia el órgano, tejido o células deseados del cuerpo; y polisacáridos, por ejemplo glucanos, pueden unirse a la superficie exterior de la microesfera para aumentar o para evitar ser ingeridas por macrofagos.

Además, a la superficie exterior o dentro de las microesferas pueden unirse una o más moléculas segmentables. Las moléculas segmentables están diseñadas para que las microesferas se dirijan primero hacia un sitio predeterminado bajo condiciones biológicas apropiadas y luego, a su exposición a un cambio en las condiciones biológicas, por ejemplo un cambio de pH, las moléculas se segmenten, provocando la liberación de la microesfera desde el sitio diana. De esta manera, las microesferas están unidas o son ingeridas por las células debido a la presencia de moléculas unidas a la superficie de las microesferas. Cuando se segmenta la molécula, las microesferas permanecen en el sitio deseado, por ejemplo dentro del citoplasma o del núcleo celular, y pueden liberar las macromoléculas de las cuales están compuestas. Esto es particularmente útil para el suministro de medicamentos, conteniendo las microesferas un medicamento que se dirige hacia un sitio específico necesitado de tratamiento, pudiendo el medicamento liberarse lentamente en dicho sitio. El sitio de segmentación preferente es un enlace diéster.

Las microesferas también pueden estar recubiertas de una o más sustancias estabilizantes, las cuales pueden ser particularmente útiles para un almacenamiento a largo plazo en administración parenteral o para el suministro oral, permitiendo el paso de las microesferas por el estómago o intestino sin que se disuelvan. Por ejemplo, las microesferas destinadas al suministro oral pueden estabilizarse con un recubrimiento de una sustancia tal como mucina, una secreción que contiene mucopolisacáridos producidos por las células caliciformes intestinales, glándulas submaxilares y demás células glandulares mucosas.

Además, las partículas pueden estar recubiertas de forma no covalente con compuestos tales como ácidos grasos o lípidos. El recubrimiento puede aplicarse a las microesferas mediante su inmersión en la sustancia de recubrimiento solubilizada, mediante pulverización de las microesferas con la sustancia o por otros métodos bien conocidos por los especialistas en la materia.

En algunas de las realizaciones preferentes, las microesferas de la invención incluyen una proteína y al menos un polímero soluble en agua. Tal como se ha expuesto anteriormente, las microesferas se forman al poner en contacto la proteína y al menos un polímero soluble en agua en condiciones acuosas para formar las microesferas, y las microesferas se estabilizan entonces mediante reticulación química o por su exposición a una fuente de energía, preferentemente calor, o por ambos, en condiciones (por ejemplo, concentración, temperatura) que resultan en microesferas resistentes a tratamientos físicos y químicos, tales como soluciones caústicas y de sonicación. En los Ejemplos se describen las condiciones particulares para formar las microesferas representativas de la invención. En las realizaciones preferentes, la reacción de formación se lleva a cabo sin añadir aceites o disolventes orgánicos.

El componente proteico de la microesfera puede ser una proteína portadora o una proteína terapéutica (véase por ejemplo la Tabla 1) que representa desde aproximadamente el 40 hasta menos del 100% (% en peso) de la microesfera.

Tal como se utiliza aquí, una "proteína portadora" se refiere a una proteína que tiene un peso molecular de al menos aproximadamente 1.500 y que existe como una estructura tridimensional. La proteína portadora puede ser también una proteína terapéutica, es decir una proteína que posee una actividad terapéutica; sin embargo, en general, la expresión "proteína portadora" se utilizará en esta solicitud para referirse a una proteína que tiene la función principal de proporcionar una estructura tridimensional, con el propósito de la formación de microesferas, aunque la proteína portadora pueda tener también una función secundaria como agente terapéutico. En ciertas realizaciones preferentes, la proteína portadora es albúmina, en particular seroalbúmina humana. Opcionalmente, las microesferas de proteína de la invención incluyen además un agente terapéutico, tal como un esteroide (por ejemplo estradiol, testosterona, prednisolona, dexametasona, hidrocortisona, base de lidocaína, base de procaína) o cualquier otra entidad química conocida por unirse a la albúmina, como GCSF o paclitaxel. En todavía otras realizaciones (expuestas más adelante), las microesferas de la invención incluyen además un agente complejante (preferentemente un agente complejante iónico) y, en especial un agente terapéutico (preferentemente un péptido) que se asocia al agente complejante a través de una interacción iónica o no iónica. En algunas otras realizaciones, la proteína que comprende la matriz es una proteína terapéutica (por ejemplo una hormona como insulina u hormona del crecimiento humano) y la microesfera se construye y dispone para proporcionar la liberación prolongada de la proteína terapéutica in vivo sin que se produzca un aumento de volumen significativo de la microesfera.

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TABLA 1

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En general, las microesferas de la invención se forman mediante mezcla de la proteína junto con al menos un polímero soluble en agua bajo condiciones adecuadas, las cuales, preferentemente, permiten al polímero soluble en agua eliminar el agua ("deshidratar") de la proteína (véase por ejemplo la Tabla 2) dentro de unas proporciones especificadas o preferentes (peso/peso) entre la proteína y el polímero soluble en agua (por ejemplo, rango de proporciones proteína:polímero desde aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente 1:1.000). La proporción preferente proteína:polímero soluble en agua en la reacción de formación de microesferas se sitúa en el rango de aproximadamente 1:5 a 1:30. Tal como se ha observado anteriormente, un "polímero soluble en agua" de la invención se refiere a un polímero o a una mezcla de polímeros que, preferentemente, son capaces de interactuar con la macromolécula (por ejemplo, con la proteína o con otra molécula) para provocar la exclusión de volumen. Así, el proceso preferente implica la utilización de un sistema totalmente acuoso sin involucrar ningún aceite o disolvente orgánico.

Los polímeros solubles en agua adecuados incluyen polímeros solubles lineales o ramificados, preferentemente de alto peso molecular. Los polímeros pueden ser muy solubles en agua, moderadamente solubles en agua o ligeramente solubles en agua (solubles en agua en un porcentaje superior al 2% peso/volumen). Los polímeros solubles en agua preferentes son solubles en agua o solubles en un disolvente miscible en agua. Los polímeros solubles en agua pueden solubilizarse primero mediante su disolución en un disolvente miscible en agua y luego combinando la solución de polímero con un disolvente acuoso. En las realizaciones particularmente preferentes, los polímeros solubles en agua de la invención se seleccionan de entre aquellos mostrados en la Tabla 2. En las realizaciones particularmente preferentes, el polímero soluble en agua es un polímero basado en un hidrocarburo.

Polímeros preferentes son polivinilpirrolidona, polietilenglicol, dextrano, copolímero polioxietileno-polioxipropileno, alcohol polivinílico, almidón, hetalmidón, o mezclas de los mismos, cuyas características se describen con más detalles más adelante. El polímero o la mezcla de polímeros puede prepararse de acuerdo con los métodos mencionados en la Patente de Estados Unidos Nº 5.525.519 de James E. Woiszwillo, o en la Solicitud de Patente PCT Nº US93-00073 (Solicitud Internacional Nº WO 93/14110), presentada el 7 de enero de 1993 y publicada el 22 de julio de 1993, de James E. Woiszwillo, incorporándose ambas aquí como referencia), donde se disuelve el polímero en agua o en una solución acuosa, tal como un tampón, en una concentración situada entre 1 y 50 g/100 ml, según el peso molecular del polímero. La concentración total de polímero preferente en la solución polimérica se encuentra entre el 10% y el 80%, expresada en porcentaje en peso/volumen. La concentración preferente de cada polímero en la solución polimérica se sitúa entre el 5% y el 50%. Tal como se ha expuesto anteriormente, el pH de la solución polimérica puede ajustarse antes de combinarse con la macromolécula para que la adición del polímero provoque un ajuste del pH de la solución de la macromolécula, preferentemente dentro de una unidad de pH del pI. El pH puede ajustarse durante la preparación de la solución polimérica, preparando el polímero en un tampón con un pH predeterminado. Como alternativa, el pH puede ajustarse con un ácido o una base después de la preparación de la solución polimérica.

El copolímero de polioxietileno-polioxipropileno, también conocido como poloxámero, es vendido por BASF (Parsippany, N.J.) y está disponible en una variedad de formas con distintos porcentajes relativos de polioxietileno y polioxipropileno dentro del copolímero.

El PVP es un polímero no ionógeno, hidrofílico, con un peso molecular medio que oscila entre aproximadamente 10.000 y 700.000 y una fórmula química (C_{6}H_{9}NO)[n]. El PVP se conoce también como poli[1-(2-oxo-1-pirrolidinil)etileno], Povidone^{TM}, Polyvidone^{TM}, RP 143^{TM}, Kollidon^{TM}, Peregal ST^{TM}, Periston^{TM}, Plasdone^{TM}, Plasmosan^{TM}, Protagent^{TM}, Subtosan^{TM}, y Vinisil^{TM}. El PVP es no tóxico, altamente higroscópico y se disuelve inmediatamente en agua o en disolventes orgánicos.

El polietilenglicol (PEG), también conocido como poli(oxietilen)glicol, es un polímero de condensación de óxido de etileno y agua de fórmula química general HO(CH_{2}CH_{2}O)[n]H.

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TABLA 2

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Dextrano es un término aplicado a los polisacáridos producidos por bacterias que crecen en un sustrato de sacarosa. Los dextranos nativos producidos por bacterias como Leuconostoc mesenteroides y Lactobacteria dextranicum tienen normalmente un peso molecular alto. Los dextranos están normalmente disponibles y se utilizan en forma inyectable como expansores de plasma en los seres humanos.

El alcohol de polivinilo (PVA) es un polímero preparado a partir de acetatos de polivinilo por sustitución de los grupos acetato con grupos hidroxilo y tiene la fórmula (CH_{2}CHOH)[n]. La mayoría de los alcoholes de polivinilo son solubles en agua.

Proveedores químicos tales como Sigma Chemical Company (St. Louis, Mo.) disponen comercialmente de PEG, dextrano, PVA y PVP.

Preferentemente, el polímero es una mezcla de polímeros que contiene una solución acuosa de una PVP con un peso molecular situado entre 10.000 y 360.00, en particular de 40.000, y un PEG con un peso molecular entre 200 y 35.000. Son preferentes una PVP con un peso molecular de 40.000 y un PEG con un peso molecular de 3.500. Preferentemente, el PVP se disuelve en un tampón de acetato y se añade PEG a la solución acuosa de PVP. La concentración de cada polímero se sitúa preferentemente entre 1 y 40 g/100 ml, según el peso molecular de cada polímero. Generalmente concentraciones iguales de PVP y PEG proporcionan la mezcla de polímeros más favorable para la formación de microesferas.

El polímero alternativo preferente es un dextrano con un peso molecular entre aproximadamente 3.000 y 500.000 dalton.

El volumen de polímero añadido a la macromolécula varía según el tamaño, la cantidad y la concentración de la macromolécula. Preferentemente, a un volumen de solución que contiene la macromolécula se añaden dos volúmenes de la mezcla de polímeros con un concentración total de polímeros del 5-50%. El polímero está presente en fase líquida durante la reacción con la macromolécula.

En algunas de las realizaciones y, en particular en las realizaciones de las microesferas que no contienen además un agente complejante, el polímero soluble en agua preferentemente no es PEG, PVP, dextrano, nonilfenol-etoxilatos y/o alcohol de polivinilo.

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Agentes Complejantes

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una microesfera que incluye además un agente complejante. Tal como se utiliza aquí, un agente complejante se refiere a una molécula que es capaz de facilitar la carga, retención y/o de otro modo retrasar la liberación del agente terapéutico desde la microesfera (véase por ejemplo la Tabla 3). En algunas realizaciones, la microesfera según este aspecto incluye: (1) una macromolécula tal como una proteína (por ejemplo albúmina, tal como se ha descrito anteriormente); (2) al menos un polímero soluble en agua (por ejemplo hetalmidón, PEG/PVP, tal como se ha descrito anteriormente); y (3) un agente complejante.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3

3

En algunas realizaciones particularmente preferentes de este aspecto de la invención, las microesferas incluyen: (1) una proteína portadora; (2) un polímero soluble en agua; (3) un primer agente complejante que es un polisacárido polianiónico tal como sulfato de dextrano, ácidos galacturónicos, alginatos, ácido manurónico, ácido gulurónico, ácido hialurónico, sulfatos de condroitina, heparina, quitina, quitosano, glicosaminoglicanos, proteoglicanos y agentes complejantes catiónicos (es decir agentes complejantes que tienen una carga positiva); y (4) un segundo agente complejante que es un catión metálico divalente seleccionado de entre el grupo consistente en calcio, magnesio, zinc, estroncio, bario, manganeso e hierro. En las realizaciones preferentes según este aspecto, la proteína portadora es una albúmina o una inmunoglobulina u otra proteína seleccionada de entre el grupo consistente en las proteínas portadoras de la Tabla 1. En general, las microesferas según este aspecto de la invención contienen aproximadamente del 40 a menos del 100% de proteína. En las realizaciones preferentes según este aspecto, el polímero soluble en agua se selecciona de entre el grupo consistente en los polímeros solubles en agua de la Tabla 2, preferentemente un polímero basado en un hidrocarburo, en particular un hidroxietilalmidón.

Como con otros aspectos de la invención, preferentemente estas microesferas tienen una superficie lisa que incluye múltiples orificios acanalados que son inferiores a 1.000 angstrom, tal como se determina por técnicas de adsorción de gas para la determinación del tamaño de poro y, preferentemente, no contienen aceites o disolventes orgánicos detectables.

Un método preferente para la incorporación de uno o más agentes complejantes consiste en combinar el o los agentes complejantes con un polímero soluble en agua en solución auosa y con la proteína en solución auosa y estabilizar las microesferas con calor o con agentes reticulantes.

En general, el agente complejante es un agente complejante iónico (es decir, el agente complejante es capaz de una interacción iónica) o un agente complejante no iónico (es decir, el agente complejante es capaz de una interacción no iónica (por ejemplo hidrofóbica)) o un agente que interactúa tanto de forma iónica como no iónica (por ejemplo IgG). En la Tabla 3 se muestran los agentes complejantes no iónicos y los agentes complejantes iónicos, tales como agentes complejantes aniónicos (es decir, agentes complejantes que tienen una carga negativa) y agentes complejantes catiónicos (es decir, agentes complejantes que tienen una carga positiva) típicos.

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En ciertas realizaciones, el agente complejante es un agente complejante aniónico que tiene la estructura de fórmula I:

(I)POLY-[Y^{-}]_{n} X^{+}

en la cual

POLY representa una cadena principal del agente complejante aniónico que puede ser lineal o ramificada;

Y^{-} representa un grupo aniónico, por ejemplo sulfato, carboxilo, fosfato, nitrato, carbonato y similar, que puede acoplarse a una o más de las ramificaciones de la cadena principal;

X^{+} representa un grupo catiónico, por ejemplo un contraión del grupo aniónico;

n es un número entero de 1 a 10.000, preferentemente de 5 a 100, en especial de 5 a 1.000 y en particular de 5 a 10.000; y

cuando n es superior a 1, los n grupos Y^{-} pueden ser iguales o diferentes.

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En todavía otras realizaciones de la invención, el agente complejante es un agente complejante catiónico que tiene la estructura de fórmula II:

(II)POLY-[X^{+}]_{n} Y^{-}

en la cual

POLY representa una cadena principal del agente complejante catiónico que puede ser lineal o ramificada;

X^{+} representa un grupo catiónico, por ejemplo un grupo amino, que puede acoplarse a una o más de las ramificaciones de la cadena principal;

Y^{-} representa un grupo aniónico que es un contraión del grupo catiónico;

n es un número entero de 1 a 10.000, preferentemente de 5 a 100, en especial de 5 a 1.000 y en particular de 5 a 10.000; y

cuando n es superior a 1, los n grupos X^{+} pueden ser iguales o diferentes.

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Agentes Activos

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una microesfera que incluye además un agente activo. En la Tabla 4 se muestran las categorías típicas de agentes activos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 4

4

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Las microesferas en las cuales puede cargarse el agente activo pueden incluir un agente complejante para facilitar la carga y/o modificar la liberación del agente activo desde la microesfera. Como alternativa, el agente activo puede cargarse en las microesferas descritas anteriormente, las cuales carecen de un agente complejante, por ejemplo, la proteína y/o los polímeros solubles en agua de la invención pueden interactuar con el agente activo para facilitar la carga y/o modificar su liberación desde la microesfera. En general, aunque el agente activo pueda cargarse en una microesfera de la invención durante su preparación, es preferible cargar el agente activo en una microesfera preformada de la invención y, con más preferencia, cargar el agente activo en una microesfera preformada que contiene uno o más agentes complejantes para facilitar la carga y/o la liberación prolongada del agente. Contrariamente a las microesferas de hidrogel, las microesferas de la invención no aumentan significativamente de volumen en agua y, además, las microesferas estabilizadas no necesitan aumentar de volumen con el fin de proporcionar la liberación prolongada de la proteína terapéutica y/o del agente fisiológicamente activo desde la microesfera.

Tal como se utiliza aquí, un agente activo se refiere a un agente que posee actividad diagnóstica o terapéutica. En consecuencia, un agente activo incluye, opcionalmente, una marca detectable (por ejemplo, una marca radioactiva) que sirve para identificar la localización del agente liberado in vivo; los agentes activos incluyen también agentes terapéuticos que sirven para tratar una enfermedad o condición. En ciertas realizaciones, los agentes fisiológicamente activos preferentes son agentes proteicos o peptídicos. Estos agentes proteicos o peptídicos típicamente pueden dividirse además en categorías según la actividad del agente o el tipo de enfermedad o condición que se está tratando. El agente fisiológicamente activo que puede utilizarse en la presente invención incluye, pero sin limitarse a, las categorías de antibióticos, hematopoyéticos, agentes antiinfecciosos, agentes antidemencia, agentes antivirales, agentes antitumorales, antipiréticos, analgésicos, agentes antiinflamatorios, agentes antiúlcera, agentes antialérgicos, antidepresivos, agentes psicotrópicos, cardiotónicos, agentes antiarrítmicos, vasodilatadores, agentes antihipertensivos como diuréticos para hipotensos, agentes antidiabéticos, anticoagulantes, agentes reductores del colesterol, agentes terapéuticos para la osteoporosis, hormonas, vacunas, etc. (véase por ejemplo la Tabla 4). Aunque los ejemplos específicos de agentes activos (por ejemplo, agentes peptídicos y no peptídicos) para su uso de acuerdo con esta invención se mencionen más adelante, esto no significa que se excluyan otros agentes peptídicos o no peptídicos. Estos agentes activos pueden ser sustancias naturales, recombinantes o sintetizadas químicamente.

Los agentes fisiológicamente activos de la invención incluyen agentes proteicos o peptídicos, así como agentes no proteicos o no peptídicos. Para una exposición más fácil, estos agentes proteicos o peptídicos se denominan en conjunto aquí agentes peptídicos; los agentes no proteicos y no peptídicos se denominarán en conjunto aquí agentes no peptídicos. Los agentes no peptídicos típicos incluyen las siguientes categorías no limitativas de agentes: a) nucleótidos y ácidos nucleicos; b) hidrocarburos y polisacáridos; c) virus y partículas víricas; d) conjugados o complejos de pequeñas moléculas y proteínas o mezclas de los mismos; y e) medicamentos farmacéuticos naturales o sintéticos, orgánicos o inorgánicos. Otra descripción de estos y otros agentes que pueden utilizarse de acuerdo con los métodos y composiciones de la presente invención se describe en las Patentes de Estados Unidos Nºs 5.482.706; 5.514.670 y 4.357.259, cuyo contenido en su totalidad se incorpora aquí como referencia.

Los agentes peptídicos fisiológicamente activos preferentes incluyen hormonas peptídicas, citoquinas, factores de crecimiento, factores que actúan sobre el sistema cardiovascular, factores que actúan sobre los sistemas nerviosos central y periférico, factores que actúan sobre los electrolitos humorales y sustancias orgánicas hemales, factores que actúan sobre los huesos y esqueleto, factores que actúan sobre el sistema gastrointestinal, factores que actúan sobre el sistema inmune, factores que actúan sobre el sistema respiratorio, factores que actúan sobre los órganos genitales y enzimas.

Hormonas típicas incluyen insulina, hormona del crecimiento, hormona paratiroide, hormona liberadora de la hormona luteinizante (LH-RH), hormona adrenocorticotrópica (ACTH), amilina, oxitocina, hormona luteinizante, (D-Tryp6)-LHRH, acetato de nafarelina, acetato de leuprolida, hormona estimulante del folículo, glucagón, prostaglandinas, PGE1, PGE2 y demás factores que actúan sobre los órganos genitales y sus derivados, análogos y congéneres. Como análogos de dicha LH-RH se pueden mencionar las sustancias conocidas, por ejemplo aquellas descritas en las Patentes de Estados Unidos Nºs 4.008.209, 4.086.219, 4.124.577, 4.317.815 y 5.110.904,

Antibióticos típicos incluyen tetraciclina, aminoglicósidos, penicilinas, cefalosporinas, medicamentos de sulfonamida, succinato de cloranfenicol-sodio, eritromicina, vancomicina, lincomicina, clindamicina, nistatina, anfotericina B, amantidina, idoxuridina, ácido p-aminosalicílico, isoniazida, rifampina, antinomicina D, mitramicina, daunomicina, adriamicina, bleomicina, vinblastina, vincristina, procarbazina, imidazolcarboxamida.

Los factores hematopoyéticos o trombopoyéticos típicos incluyen, entre otros, eritropoyetina, factor estimulante de las colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de macrófagos-granulocitos (GM-CSF) y factor estimulante de la colonia de macrófagos (M-CSF), preparación del factor de proliferación de leucocitos (Leucoprol, Morinaga Milk), trombopoyetina, factor estimulante de proliferación plaquetaria, factor (estimulante) de proliferación de megacariocitos y factor VIII.

Los agentes antidemencia típicos incluyen selegeleno.

Los agentes antivirales típicos incluyen amantidina e inhibidores de proteasas.

Los agentes antitumorales típicos incluyen doxorrubicina, Daunorrubicina, taxol y metotrexato. Los antipiréticos y analgésicos típicos incluyen aspirina, Motrina, Ibuprofina, naprosina, Indocin y acetaminofeno.

Los agentes antiinflamatorios típicos incluyen NSAIDS, aspirina, esteroides, dexametasona, hidrocortisona, prednisolona y diclofenaco sódico.

Los agentes antiúlcera típicos incluyen famotidina, cimetidina, nizatidina, ranitidina y sucralfato.

Los agentes antialérgicos típicos incluyen antihistaminas, difenildramina, loratadina y clorfeniramina.

Los agentes antidepresivos y psicotrópicos típicos incluyen litio, amitriptalina, antidepresivos tricíclicos, fluoxetina, Prozac y paroxetina.

Ejemplos de cardiotónicos incluyen digoxina.

Los agentes antiarrítmicos típicos incluyen metoprolol y procainamida.

Los vasodilatadores típicos incluyen nitroglicerina, nifedipina y dinitrato de Isosorbide.

Los diuréticos típicos incluyen hidroclorotiazida y furosemida.

Los agentes antihipertensivos típicos incluyen captopril, nifedipina y atenolol.

Los agentes antidiabéticos típicos incluyen gucozida, cloropropamida, metformina e insulina.

Los anticoagulantes típicos incluyen warfarina, heparina e hirudina.

Los agentes reductores del colesterol típicos incluyen lovastatina, colestiamina y clofibrato.

Los agentes terapéuticos típicos para tratar la osteoporosis y demás factores que actúan sobre los huesos y el esqueleto incluyen calcio, alendronato, péptido GLa óseo, hormona paratiroidea y sus fragmentos activos (osteostatina, Endocrinology 129, 324, 1991), péptido de proliferación y formación ósea asociadas a histonas H4 (OGP, The EMBO Journal 11, 1867, 1992) y sus muteínas, derivados y análogos de los mismos.

Enzimas y cofactores enzimáticos típicos incluyen pancreasa, L-asparaginasa, hialuronidasa, quimiotripsina, tripsina, tPA, estreptoquinasa, uroquinasa, pancreatina, colagenasa, tripsinógeno, quimiotripsinógeno, plasminógeno, estreptoquinasa, ciclasa de adenilo y superóxido-dismutasa (SOD).

Las vacunas típicas incluyen de hepatitis B, MMR (sarampión, paperas y rubeola) y vacunas contra la polio.

Los adyuvantes inmunológicos típicos incluyen adyuvante de Freund, dipéptidos de muramilo, concanavalina A, BCG y levamisole.

Las citoquinas típicas incluyen linfoquinas, monoquinas, factores hematopoyéticos, etc. Las linfoquinas y citoquinas útiles en la práctica de la invención incluyen interferones (por ejemplo interferón alfa, beta y gama), interleuquinas (por ejemplo interleuquina 2 a 11), etc. Las monoquinas útiles en la práctica de la invención incluyen interleuquina-1, factores de necrosis tumoral (por ejemplo, TNF alfa y beta), factor inhibidor de leucocitos malignos (LIF), etc.

Los factores de crecimiento típicos incluyen factores de crecimiento nervioso (NGF, NGF-2/NT-3), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento análogo de insulina (IGF), factor de crecimiento transformante (TGF), factor de crecimiento celular derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), etc.

Los factores típicos que actúan sobre el sistema cardiovascular incluyen aquellos factores que controlan la presión sanguínea, arterioesclerosis, etc., como las endotelinas, inhibidores de endotelinas, antagonistas de endotelinas descritos en EP 436189, 457195, 496452 y 528312, JP [Abierta] Nº H-3-94692/1991 y 130299/1991, inhibidores de la enzima que produce la endotelina, vasopresina, renina, angiotensina I, angiotensina II, angiotensina III, inhibidor de la angiotensina I, antagonista del receptor de la angiotensina II, péptido natriurético atrial (ANP), péptido antiarrítmico, etc.

Los factores típicos que actúan sobre los sistemas nerviosos central y periférico incluyen péptidos opioides (por ejemplo encefalinas, endorfinas), factor neurotrópico (NTF), péptido asociado al gen de calcitonina (CGRP), hormona de liberación de la hormona tiroidea (TRH), sales y derivados de TRH [JP [Abierta] Nº 50-121273/1975 (Pat. de Estados Unidos Nº 3.959.247), JP [Abierta] Nº 52-116465/1977 (Pat. de Estados Unidos Nº 4.100.152)], neurotensina, etc.

Los factores típicos que actúan sobre el sistema gastrointestinal incluyen secretina y gastrina.

Los factores típicos que actúan sobre los electrolitos humorales y sustancias orgánicas hemales incluyen los factores que controlan la hemaglutinación, nivel de colesterol en plasma o concentraciones de iones metálicos, como la calcitonina, apoproteína E e hirudina. La laminina y la molécula de adhesión intercelular-I (ICAM I) representan los factores de adhesión celular típicos.

Los factores típicos que actúan sobre el riñón y el tracto urinario incluyen sustancias que regulan la función renal, como el péptido natriurético derivado del cerebro (BNP), urotensina, etc.

Los factores típicos que actúan sobre los órganos sensoriales incluyen los factores que controlan la sensibilidad de los distintos órganos, como la sustancia P.

Los factores típicos que actúan sobre el sistema inmune incluyen los factores que controlan la inflamación y neoplasmas malignos y los factores que atacan los microorganismos infecciosos, como péptidos quimiotácticos y bradiquininas.

Los factores típicos que actúan sobre el sistema respiratorio incluyen los factores asociados a las respuestas asmáticas.

Se incluyen también proteínas o péptidos recombinantes o sintetizados químicamente o naturales que pueden actuar como antígenos, como polen de cedro y polen de ambrosía. Estos factores son administrados bien por separado, combinados a haptenos o junto con un adyuvante en las formulaciones de acuerdo con la presente invención.

Formación, Estabilización y Caracterización de las Microesferas

El método para formar las microesferas de la invención implica: (1) la combinación, en una o más soluciones acuosas, de una macromolécula tal como una proteína, un polímero soluble en agua (por ejemplo, un polímero basado en un hidrocarburo) y uno o más agentes complejantes, para formar una mezcla acuosa (como sistema de fase única o múltiple); y, preferentemente (2) someter la mezcla acuosa a un agente reticulante (por ejemplo EDC [1-etil-3-(3-dimetilaminopropilcarbodiimida]) y/o a una fuente de energía, durante un tiempo suficiente para formar una microesfera, en particular una microesfera que tiene una superficie lisa que incluye múltiples orificios acanalados, de diámetro inferior a 1.000 angstroms, tal como se determina por técnicas de adsorción de gas para la determinación del tamaño de poro. En los ejemplos se proporcionan los métodos típicos para preparar las microesferas.

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Las realizaciones particularmente preferentes son microesferas que incluyen:

(1)

una proteína portadora;

(2)

un polímero soluble en agua;

(3)

un primer agente complejante que es un polisacárido polianiónico; y

(4)

un segundo agente complejante que es un catión metálico divalente, preferentemente calcio o magnesio. Los agentes activos, tales como agentes terapéuticos o diagnósticos, pueden introducirse en estas microesferas después de su formación. El método preferente para la formación de estas realizaciones particularmente preferentes de la invención implica: (1) la combinación, en esencia simultánea, en una o más soluciones acuosas, de la proteína portadora, el polímero soluble en agua, el primer agente complejante y el segundo agente complejante, para formar una mezcla acuosa; y (2) dejar que las microesferas se formen. Opcionalmente, las microesferas pueden someterse además a un agente reticulante para su estabilización. Por "en esencia simultánea" se entiende que el segundo agente complejante (preferentemente calcio o magnesio) se añade aproximadamente a los 30 minutos de la adición de los demás componentes de la formación. Los solicitantes han descubierto que la adición de calcio o magnesio a la mezcla acuosa, que no es una adición en esencia simultánea, resulta en la formación de agregados y otras formas amorfas de partículas más que en microesferas de forma esférica, las cuales se forman cuando se combina el calcio o el magnesio de manera en esencia simultánea junto con los demás componentes durante el proceso de formación de las microesferas.

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Las microesferas pueden estabilizarse mediante incubación de las microesferas formadas en presencia de un agente reticulante y/o de una fuente de energía (por ejemplo calor), durante un período de tiempo predeterminado. Los agentes reticulantes típicos incluyen dialdehídos, aminas, iones multivalentes, moléculas multifuncionales que tienen afinidad por los grupos reactivos específicos de la macromolécula que se está reticulando, N-maleimidas sustituidas, haluros de alquilo bifuncionales, haluros de arilo, isocianatos, ácidos dicarboxílicos alifáticos o aromáticos, ácidos disulfónicos alifáticos o aromáticos, imidoésteres bifuncionales y vinilsulfonas. Agentes de reticulación adicionales y su utilización para estabilizar las microesferas se describen en U.S. 5.578.709 de J. Woiszwillo, cuyo contenido entero se incorpora aquí como referencia. La fuente de energía preferente es calor. Sin embargo, los especialistas en la materia entenderán que otras fuentes de energía incluyen calor, radiación e ionización, por separado o combinadas con sonicación, vórtex, mezcla o agitación. La formación y/o estabilización de las microesferas puede llevarse a cabo inmediatamente, exponiéndolas a la fuente de energía, o pueden necesitar una larga exposición a la fuente de energía, dependiendo de las características de los componentes y las condiciones. Preferentemente, se incuba la mezcla de la solución macromolécula-polímero en un baño de agua a una temperatura superior o igual a 37ºC e inferior o igual a 90ºC durante 5 minutos a 2 horas aproximadamente. En especial, se incuba la mezcla durante 5-30 minutos a una temperatura entre 50ºC y 90ºC. Se debe observar que las microesferas pueden formarse a temperaturas más bajas si se utiliza una concentración mayor de macromolécula. La temperatura máxima de incubación viene determinada por las características de la macromolécula y por la función esencial de la microesfera. Por ejemplo, para una microesfera en la que la macromolécula es una proteína, es preferente una temperatura inferior a aproximadamente 70ºC para conservar la actividad de la proteína.

Las microesferas formadas se separan de los componentes no incorporados de la mezcla de incubación por métodos convencionales de separación, bien conocidos por los especialistas en la materia. Preferentemente, la mezcla de incubación se centrifuga para que las microesferas se sedimenten en el fondo del tubo de centrifugación y los componentes no incorporados queden en el sobrenadante, el cual se elimina luego por decantación. Como alternativa, una suspensión que contiene las microesferas formadas se filtra para que las microesferas queden retenidas en el filtro y los componentes no incorporados lo atraviesen.

La purificación adicional de las microesferas se lleva a cabo mediante lavado en un volumen adecuado de una solución de lavado. La solución de lavado preferente es un tampón, en particular una solución no iónica acuosa o una solución no iónica acuosa que contiene polímeros solubles en agua. Se pueden repetir los lavados según sea necesario y las microesferas se pueden separar de la solución de lavado tal como se ha descrito anteriormente.

Tal como se ha mencionado anteriormente, las características de las microesferas pueden verse alteradas por la manipulación de las condiciones de incubación. Por ejemplo, la cinética de liberación de las microesferas puede retardarse aumentando la temperatura de reacción o ampliando el tiempo de reacción durante la formación de las microesferas. La cinética de liberación se manipula también mediante la selección de distintos polímeros, distintas concentraciones de polímeros o distintas proporciones de los polímeros utilizados en la formación de las microesferas.

El tamaño, la forma de las microesferas y la cinética de liberación pueden controlarse mediante el ajuste de las condiciones de formación de las microesferas. Por ejemplo, las condiciones de formación de las partículas pueden optimizarse de forma que se produzcan partículas más pequeñas o más grandes o se puede aumentar el tiempo total de incubación o la temperatura de incubación, lo que resulta en partículas que tienen una cinética de liberación prolongada.

Microesferas de Ácido Nucleico

De acuerdo todavía con otras realizaciones de la invención, se proporcionan microesferas en las cuales la macromolécula es un ácido nucleico. Las microesferas que contienen ácidos nucleicos incluyen: (1) un ácido nucleico (por ejemplo un plásmido, vector viral, oligonucleótido, ARN, ácidos nucleicos antisentido y sin sentido); (2) un o más polímeros policatiónicos (por ejemplo polilisina); y (3) un polímero soluble en agua (tal como se describe anteriormente). Así, de acuerdo con un aspecto asociado de la invención, se proporciona un método para formar microesferas que contienen ácidos nucleicos. El método implica: (1) combinar, en una o más soluciones acuosas, uno o más ácidos nucleicos, uno o más polímeros policatiónicos y uno o más polímeros solubles en agua, para formar una mezcla acuosa; y (2) someter la mezcla acuosa a un agente reticulante y/o a una fuente de energía, durante un tiempo suficiente, para formar una microesfera. En los ejemplos se proporcionan los métodos típicos de formación de microesferas de ácidos nucleicos.

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Composiciones Farmacéuticas

De acuerdo con todavía otro aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica de los materiales y el método para producir la misma. La composición incluye un recipiente que contiene una dosis única de microesferas que contienen un agente activo para tratar una condición que es tratable por la liberación prolongada, desde las microesferas, de un agente activo. El número de microesferas en la dosis única depende de la cantidad de agente activo presente en cada microesfera y del período de tiempo durante el cual se desea la liberación prolongada. Preferentemente, se selecciona la dosis única para conseguir la liberación prolongada del agente activo durante un período de aproximadamente 1 a aproximadamente 180 días, con el perfil de liberación deseado.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona la composición contenida en una jeringuilla. La composición incluye una jeringuilla que contiene una dosis simple de microesferas que contienen un agente activo para tratar una condición que es tratable por la liberación prolongada, desde las microesferas, del agente activo; y una aguja unida a la jeringuilla, donde la aguja tiene un diámetro interior de calibre 14 a 30.

En especial, se pueden preparar las microesferas preferentes de la invención para que tengan una dimensión tal que permita su suministro por medio de una jeringuilla sin aguja (MediJector, Derata Corporation, Minneapolis, MN 55427), eliminando así los problemas de desecho inherentes a las agujas, que deben desecharse como desperdicio biológicamente peligroso. Así, de acuerdo con un aspecto particularmente preferente de la invención, se proporciona una jeringuilla sin aguja que contiene una o más dosis de microesferas que contienen un agente activo para tratar una condición. Se pueden preparar las microesferas para que tengan una calidad adecuada para su suministro por otras vías parenterales y no parenterales, tales como vía oral, bucal, intratecal, nasal, pulmonar, transdérmica, transmucosa y similares.

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Utilidades

En resumen, se puede pensar en las composiciones de la invención como una combinación de varios componentes, tal como se ilustra en las Tablas, bajo condiciones para formar las microesferas, las cuales, preferentemente, tienen las características deseables de una superficie lisa, que sean cuantificables en términos de determinar si éstas se han formado (por ejemplo, por detección visual) y en términos de determinar el diámetro de los orificios acanalados en las microesferas. Así, en algunos de sus aspectos más amplios, las composiciones de la invención son destinadas a microesferas que tengan las dimensiones necesarias en los orificios acanalados y que comprendan una macromolécula (preferentemente una proteína de la Tabla 1) y también un polímero soluble en agua (preferentemente un polímero de la Tabla 2). En todavía otro aspecto, las microesferas comprenden una macromolécula (preferentemente una proteína de la Tabla 1), un polímero soluble en agua (preferentemente un polímero de la Tabla 2) y un agente complejante (preferentemente de la Tabla 3). En las realizaciones particularmente preferentes, las microesferas incluyen: (1) una proteína portadora; (2) un polímero soluble en agua; (3) un primer agente complejante que es un polisacárido polianiónico; y (4) un segundo agente complejante que es un catión metálico divalente seleccionado de entre el grupo consistente en calcio y magnesio. En todavía otros aspectos, la invención es destinada a cualquiera de estos aspectos en los cuales las microesferas comprenden además un agente terapéutico (preferentemente de la Tabla 4). Así, en ciertas realizaciones de estos aspectos, se combinan una o más proteínas de la Tabla 1 con uno o más polímeros solubles en agua de la Tabla 2 y con uno o más agentes activos de la Tabla 4. En todavía otras realizaciones de estos aspectos, se combinan uno o más ácidos nucleicos con uno o más policationes de la Tabla 3, con uno o más polímeros solubles en agua de la Tabla 2 y, opcionalmente, con uno o más agentes terapéuticos de la Tabla 4. En consecuencia, los métodos de la invención proporcionan diversas microesferas que pueden diseñarse para distintas aplicaciones terapéuticas y diagnósticas mediante la selección de la combinación adecuada de agentes para lograr el objetivo terapéutico o diagnóstico.

Cuando se utilizan en la terapia, las microesferas de la invención se administran en cantidades terapéuticamente eficaces. En general, una cantidad terapéuticamente eficaz es aquella cantidad de agente activo necesaria para retrasar el inicio, inhibir la progresión o detener del todo la condición particular que se está tratando. Generalmente, la cantidad terapéuticamente eficaz variará con la edad, condición y sexo del sujeto, así como con la naturaleza y el alcance de la enfermedad en el sujeto, todo ello determinado por un especialista en la materia. La dosificación puede ser ajustada por el médico o el veterinario, particularmente en caso de cualquier complicación. Una cantidad terapéuticamente eficaz de agente activo varía típicamente entre 0,01 mg/kg a aproximadamente 1.000 mg/kg, preferentemente desde aproximadamente 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 200 mg/kg y en particular desde aproximadamente 0,2 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, en una o más dosis diarias, durante uno o más días, todas las semanas, meses, cada dos o tres meses, y así sucesivamente.

Las microesferas pueden administrarse solas o en combinación con otras terapias medicamentosas como parte de una composición farmacéutica. Esta composición farmacéutica puede incluir las microesferas en combinación con cualquier soporte estándar fisiológica y/o farmacéuticamente aceptable que sea conocido en la técnica. Las composiciones deben ser estériles y contener una cantidad terapéuticamente eficaz de la microesfera en una unidad de peso o volumen adecuada para su administración a un paciente. El término "soporte farmacéuticamente aceptable", tal como se utiliza aquí, significa uno o más rellenos sólidos o líquidos compatibles, diluyentes o sustancias encapsulantes que sean apropiadas para la administración a un ser humano o animal. El término "soporte" indica un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que se combina el ingrediente activo para facilitar la aplicación. Los componentes de las composiciones farmacéuticas son capaces también de comezclarse con las moléculas de la presente invención, y entre sí, de un modo tal que no exista interacción, lo cual deterioraría sustancialmente la eficacia farmacéutica deseada. "Farmacéuticamente aceptable" significa además un material no tóxico compatible con un sistema biológico tal como una célula, un cultivo celular, un tejido o un organismo. Las características del soporte dependerán de la vía de administración. Los soportes fisiológica y farmacéuticamente aceptables incluyen diluyentes, rellenos, sales, tampones, estabilizantes, desecantes, agentes de aumento de volumen, propelentes, agentes acidificantes, agentes de recubrimiento, solubilizantes y demás materiales bien conocidos en la técnica. Las formulaciones de soportes adecuados para las administraciones orales, subcutáneas, intravenosas, intramusculares, etc., pueden encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.

Se dispone de variedad de vías de administración. El modo particular seleccionado dependerá, por supuesto, del medicamento particular seleccionado, de la gravedad de la condición que se está tratando y de la dosificación necesaria para la eficacia terapéutica. En general, los métodos de la invención pueden ponerse en práctica utilizando cualquier modo de administración que sea médicamente aceptable, lo que significa cualquier modo que genere niveles eficaces de los compuestos activos sin causar efectos adversos clínicamente inaceptables. Estos modos de administración incluyen las vías oral, rectal, tópica, nasal, intradérmica o parenteral. El término "parenteral" incluye la vía subcutánea, intravenosa, intramuscular o infusión. Se preferirá la administración oral para el tratamiento profiláctico debido a la comodidad para el paciente, así como para la programación de las dosis.

Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse por métodos bien conocidos la técnica farmacéutica. Todos los métodos incluyen la etapa de asociar la a un soporte, el cual constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las composiciones se preparan asociando uniforme e íntimamente las microesferas con un soporte líquido, un soporte sólido finamente dividido o ambos, y luego, si es necesario, dando forma al producto.

Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones estériles acuosas o no acuosas, suspensiones y emulsiones. Otros ejemplos de disolventes incluyen propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales como aceite de oliva, ésteres orgánicos inyectables como oleato de etilo. Los soportes acuosos incluyen soluciones acuosas, de sales y tampones, tales como medios salinos y tamponados, soluciones y emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas. Los vehículos parenterales incluyen una solución de cloruro de sodio, dextrosa Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, aceites fijos o de Ringer lactados. Los vehículos intravenosos incluyen cargas nutrientes y fluidas, cargas de electrolitos (como aquellos basados en dextrosa Ringer) y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, por ejemplo agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes y gases inertes y similares. En general, las microesferas pueden administrarse al sujeto (cualquier receptor mamífero) utilizando los mismos modos de administración que los que se utilizan corrientemente para la terapia con micropartículas en los seres humanos.

Las microesferas son útiles para una gran variedad de separaciones, para propósitos diagnósticos, terapéuticos, industriales, comerciales, cosméticos y de investigación, tal como se expone más detalladamente a continuación. Por ejemplo, con un propósito de diagnóstico in vivo, las microesferas pueden incluir una macromolécula tal como una inmunoglobulina o un receptor celular marcado con una marca detectable. La administración de la microesfera marcada a un paciente crea un agente de formación de imágenes diagnósticas de un trastorno proliferativo, tal como el cáncer, o una herramienta para la evaluación del éxito de un agente terapéutico en la reducción de la proliferación de células o de organismos particulares adversos.

Para el diagnóstico in vitro, las microesferas que contienen una macromolécula, tal como una inmunoglobulina, un receptor celular o una sonda con oligonucleótidos específicos de la célula u organismo bajo investigación se combinan con una muestra de prueba, las microesferas se separan de cualquier componente no unido de la muestra y las moléculas unidas son detectadas por métodos convencionales.

Las microesferas son útiles como agentes terapéuticos y pueden permitir la utilización de vías de administración alternativas cuando incluyen un medicamento terapéutico y se administran a un paciente para una liberación lenta o suministro dirigido del medicamento hacia el sitio que requiere la terapia. Las microesferas son útiles también como agentes terapéuticos o profilácticos cuando incluyen una macromolécula que es de por sí un agente terapéutico o profiláctico, por ejemplo una enzima o una inmunoglobulina. La liberación lenta de estos agentes terapéuticos es particularmente útil para los péptidos o las proteínas terapéuticas que tienen una vida media corta y que deben administrarse por inyección

Además, las microesferas son útiles para la purificación de moléculas procedentes de una mezcla compleja, como reactivo para la detección o cuantificación de una molécula específica o para la producción de moléculas tales como anticuerpos. Por ejemplo, las microesferas que contienen una macromolécula tal como una inmunoglobulina pueden fijarse a una columna de cromatografía y utilizarse en la cromatografía de inmunoafinidad para separar un ligando de una mezcla compleja. Alternativamente, las microesferas que incluyen una macromolécula marcada o una mezcla de macromoléculas marcadas específicas de distintas células o biomoléculas, tales como receptores celulares, pueden utilizarse para detectar cambios en el número de células o biomoléculas en respuesta a una condición particular de prueba por medio de técnicas tales como la citometría de flujo.

Además, las microesferas pueden utilizarse como adyuvantes para la producción de vacunas, en las cuales se inyectan a un animal a estudiar, por ejemplo a un ratón o conejo, las microesferas que contienen antígenos, para activar una respuesta inmune intensificada de la producción de anticuerpos al antígeno.

Otras utilizaciones comerciales adicionales incluyen formulaciones clínicas, tal como la formación de partículas enzimáticas para su adición a detergentes; cosméticas, tal como la formación de partículas de colágeno que deben suspenderse en una loción o crema; tintes; y pinturas.

Diagnósticos In Vitro

Ensayos In Vitro: las microesferas descritas aquí son útiles como partículas en fase sólida en un ensayo, tal como un ensayo inmunosorbente asociado con enzimas, dot-blot o Western blot, para la detección de una diana particular tal como una célula, biomolécula o medicamento en una muestra biológica. Las microesferas diseñadas para este uso se componen de moléculas con afinidades específicas por la molécula diana. Por ejemplo, la macromolécula es una inmunoglobulina, un receptor celular o una sonda con oligonucleótidos y está unida a un tubo de prueba o a una placa de microvaloración.

Para la detección o cuantificación de una molécula diana de interés, se combina una muestra con una solución que contiene las microesferas, las macromoléculas sobre las microesferas se someten a reacción con la molécula diana, se separan las microesferas de cualquier componente no unido de la muestra y las microesferas que contienen las moléculas unidas son detectadas por métodos convencionales. Las microesferas fluorescentemente coloreadas son particularmente útiles en el análisis por citometría de flujo de acuerdo con métodos bien conocidos por los especialistas en la materia.

Histopatología: las microesferas descritas aquí son útiles como sondas o marcadores visuales de patologías en una muestra histológica. Las macromoléculas de las microesferas diseñadas para esta utilización son específicas de las biomoléculas expresadas durante una condición patológica particular y están marcadas con una marca detectable. Por ejemplo, la macromolécula es una inmunoglobulina, un receptor celular o una sonda con oligonucleótidos específica de una célula anormal, tal como una célula que prolifera rápidamente, o de un organismo patológico, por ejemplo, un virus.

Para la detección de una condición patógena, se combina una muestra histológica con una solución que contiene las microesferas, las macromoléculas marcadas sobre las microesferas se someten a reacción con la molécula diana de interés y las microesferas unidas se detectan mediante la detección de la marca de acuerdo con métodos bien conocidos por los especialistas en la materia.

Formación de Imágenes de Diagnóstico In Vivo

Las microesferas descritas aquí son útiles como agentes de formación de imágenes para la localización in vivo de una molécula particular, de un tipo de célula o de una condición patológica, de forma similar a la descrita anteriormente con respecto a su utilización histopatológica. Las macromoléculas de las microesferas diseñadas para este uso son específicas de las moléculas expresadas por una célula particular o por un organismo patológico y están marcadas con una marca detectable. Por ejemplo, la macromolécula es una inmunoglobulina, un receptor celular o una sonda con oligonucleótidos específica de una célula tumoral o de un organismo patológico tal como un virus.

Las microesferas se utilizan para detectar una condición patológica o para comprobar el éxito de una terapia, por ejemplo quimioterapia o cirugía, para garantizar que el tamaño de un tumor de tejido anormal ha disminuido o ha sido eliminado completamente. Para este uso, un paciente recibe la administración de una solución de microesferas, preferentemente de forma intravenosa, a las macromoléculas marcadas de las microesferas una cantidad suficiente se les da tiempo para que se orienten hacia el órgano o la región del cuerpo afectada, la macromolécula se somete a reacción con una molécula diana expresada por la célula o por el organismo bajo investigación, y las microesferas enlazadas se detectan mediante la detección de la marca por técnicas convencionales de formación de imágenes, bien conocidas por los especialistas en la materia, por ejemplo rayos X.

Sistemas de Suministro de Fármacos

Las microesferas son útiles para la terapia o la profilaxis cuando la macromolécula es un agente terapéutico o un compuesto farmacéutico que se suministra a un paciente y se libera lentamente desde las microesferas con el tiempo. Estas microesferas son particularmente útiles para la liberación lenta de fármacos con una vida media biológica corta, por ejemplo proteínas o péptidos. Si el compuesto farmacéutico no puede formarse en una partícula, entonces se compleja en un soporte tal como albúmina, y el complejo compuesto farmacéutico-soporte se forma en una microesfera. La microesfera puede mantener la liberación lenta del agente por todo el cuerpo o puede incluir una molécula de afinidad específica por un tejido, o tumor diana, y ser inyectada en un paciente, para la liberación lenta dirigida del agente terapéutico, tal como un agente antitumoral, antiviral, antibacteriano, antiparásito o antiartrítico, una citoquina, hormona o insulina, directamente hacia el sitio que necesita la terapia. Tal como se ha expuesto anteriormente, la molécula de afinidad puede ser segmentable.

Las microesferas compuestas por proteínas antigénicas o conjugados polisacárido-proteína capaces de provocar una respuesta inmune son particularmente adecuadas para su uso como vacunas.

Las microesferas son también útiles como vehículos para la terapia genética o para la producción de "vacunas genéticas" cuando están compuestas de ácidos nucleicos, por ejemplo de ADN o ARN, que son incorporados al ADN del paciente o son transfectados en una célula diana para producir una proteína deseada. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican las proteínas del núcleo de virus como el de la gripe o de la inmunodeficiencia humana VIH pueden suministrarse como microesferas para la expresión de una proteína antigénica. Esto es ventajoso porque las nuevas vacunas no necesitan ser desarrolladas tan a menudo, ya que las proteínas del núcleo viral mutan en menor grado que los antígenos de la superficie celular actualmente utilizados en las vacunas. Las microesferas de ácido nucleico son suministradas a las células de mamíferos poco más o menos de la misma manera que es suministrado el ADN desnudo. La secuencia de ácido nucleico deseada se inserta en un vector, como un plásmido de ADN, con un promotor, tal como el promotor SV40 o el promotor de citomegalovirus, y opcionalmente puede incluir un gen reporter, tal como beta-galactosidasa. El ácido nucleico se combina preferentemente con una proteína soporte y/o un catión como polilisina para facilitar la formación de partículas, tal como se ha descrito anteriormente. Entonces las microesferas se administran directamente al paciente o son transfectadas en células de mamíferos que luego son administradas al paciente que necesita la terapia o la profilaxis. Las microesferas de ácido nucleico pueden incluir una sustancia tal como cloroquina, que permite que los ácidos nucleicos salgan de los compartimentos citoplásmicos en el citoplasma para que pueda ser transcrita y traducida más fácilmente por las células. Además, las microesferas pueden estar recubiertas de una sustancia que aumenta la eficacia de la traducción o pueden estar recubiertas de una sustancia que proporcione el direccionamiento específico de las microesferas hacia la célula.

Aplicaciones de Investigación

Las microesferas son útiles como herramientas de investigación para la purificación de biomoléculas procedentes de mezclas complejas, como reactivo para la detección o cuantificación de una biomolécula, o para la producción de biomoléculas, por ejemplo de anticuerpos.

Por ejemplo, las microesferas compuestas por una macromolécula tal como una inmunoglobulina se sujetan a una columna de cromatografía y se utilizan en la cromatografía de inmunoafinidad para separar un ligando de una mezcla compleja. Los especialistas en la materia entenderán que la microesfera, para su utilización en cromatografía de líquidos a alta presión, tendría que sujetarse primero a una esfera o perla en fase sólida no compresible para que la guarnición de la columna mantenga su estructura rígida bajo presión.

Alternativamente, se emplean microesferas que incluyen una macromolécula marcada o una mezcla de macromoléculas marcadas específicas de distintas células o receptores celulares para detectar cambios en el número de células o de receptores celulares superficiales en respuesta a una condición particular de prueba, utilizando técnicas como la citometría de flujo.

Se entenderá de forma más completa la invención con referencia a los ejemplos siguientes. Estos ejemplos, sin embargo, pretenden simplemente ilustrar las realizaciones de la invención y no deben interpretarse como una limitación del alcance de la misma.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Preparación de Microesferas que Contienen un Agente Farmacéutico

Se prepararon microesferas de seroalbúmina humana (HSA) adecuadas para su utilización como vehículo en el suministro de medicamento.

Preparación de Microesferas de HSA de Rifampicin TM

Se añadió carbonildiimidazol (124 mg, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) a una solución de 50 mg del antibiótico Rifampicin TM (3-[4-metilpiperaziniliminometil]rifamicina, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) en 2 ml de dimetilformamida (DMF). Se dejó reposar la mezcla resultante a temperatura ambiente durante cuatro horas. A la mezcla se añadió una mezcla de 1 ml de seroalbúmina humana (HSA, 25%, Armour Pharmaceutical Co., Collegeville, Pa.) y 2 ml de agua desionizada. Se dejó la mezcla a temperatura ambiente durante toda la noche. Se añadieron a la mezcla 14 ml de una solución polimérica que contenía un 25% de PVP (40.000 dalton) y un 25% de PEG (3.350 dalton) en NaOAc 0,1M, pH 4. Se incubó la mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente, durante 30 minutos a 37ºC y durante 30 minutos a 58ºC y luego se enfrió a temperatura ambiente. Las partículas fueron aisladas por centrifugación, se lavaron con agua desionizada tres veces y se resuspendieron en 20 ml de agua. El porcentaje de HSA incorporada en las partículas fue del 74% (sometidas al ensayo de proteína BCA TM (Pierce, Rockford, III)). El porcentaje de Rifampicin TM incorporada en las partículas era superior al 6,8%. Se determinó que el tamaño medio de partícula era de 68 nm de diámetro por medio de un clasificador celular Coulter TM.

Preparación de Microesferas de HSA de Virazole TM

Se añadió carbonildiimidazol (100 mg, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) a una solución de 36 mg del fármaco antiviral Virazole TM Registrado (ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, Calif.) en 0,2 ml de dimetilformamida (DMF). Se dejó reposar la mezcla resultante a temperatura ambiente durante cuatro horas. Se añadió a la mezcla, una mezcla de 0,2 ml de seroalbúmina humana (HSA) (25%, Armour Pharmaceutical Co., Collegeville, Pa.) y 0,4 ml de agua desionizada. Se incubó la mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente, durante 30 minutos a 37ºC y durante 30 minutos a 58ºC y luego se enfrió a temperatura ambiente. Las partículas fueron aisladas por centrifugación, se lavaron con agua desionizada tres veces y se resuspendieron en 20 ml de agua. El porcentaje de HSA incorporada en las partículas fue del 61% (sometidas al ensayo de proteína BCA TM (Pierce, Rockford, III)). El porcentaje de Virazole TM Registrado incorporado en las partículas era del 10%.

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Ejemplo 2

Fijación de Polisacárido a la Superficie Exterior de Microesferas de Proteína

Se acopló el polisacárido PRP-AH a la superficie exterior de dos microesferas de proteína distintas.

Un derivado dihidrazida de ácido adípico (AH) de fosfato de polirribosilribitol (PRP) del tipo b de Haemophilus influenza (Hib), uno de los mayores organismos causantes de la meningitis bacteriana, denominado PRP-AH, se preparó mediante el acoplamiento de PRP a ácido adípico (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) en presencia de bromuro de cianógeno (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) (se obtuvo el PRP del Massachusetts Public Health Biologic Laboratory (Jamaica Plain, Mass.)).

Acoplamiento de PRP-AH a las Microesferas de Ovalbúmina

Se prepararon microesferas de ovalbúmina mediante la adición de ovalbúmina (1%, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) a una solución polimérica que contenía un 25% de PVP (40.000 dalton) y un 25% de PEG (3.500 dalton). Se incubó la mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente, 30 minutos a 37ºC y 30 minutos a 58ºC, provocando la formación de microesferas. Las partículas fueron recogidas por centrifugación. Se determinó que el diámetro medio de partícula era de aproximadamente 0,068 \mum. Las partículas de ovalbúmina (1,5 mg) en tampón MES 1M, pH 5,0 (0,1 ml), se combinaron con el PRP-AH (1,5 mg). Posteriormente, se añadieron 2,79 mg de clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropilcarbodiimida) (EDC, Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.). Se mezcló la reacción a temperatura ambiente durante tres horas. Las partículas fueron recogidas por centrifugación y lavadas tres veces con tampón MES 1M pH 5,0 (400 mu l). Se determinó que la producción de PRP era del 25% por medio del ensayo de polisacárido libre con antrona descrito en METHODS IN IMMUNOLOGY AND IMMUNOCHEMISTRY, Vol. II, Williams, C.A. and Chase, M.W. (eds.), 1968, pp. 288-289, Academics Press, NY. Se determinó que el contenido en proteína era del 55% mediante el ensayo de proteína BCA TM (Pierce, Rockford, III). La proporción de PRP con respecto a la proteína era de 0,46. El diámetro medio de partícula resultante era de 0,067 \mum.

La recuperación del polisacárido libre y la carga de polisacárido en las partículas (proporción polisacárido:ovalbú-
mina) dependían de la proporción inicial entre las partículas de ovalbúmina y el polisacárido. Como la proporción de polisacárido con respecto a la partícula de ovalbúmina aumentó, la recuperación de polisacárido libre disminuyó y la carga de polisacárido sobre las partículas aumentó tal como se muestra en el Ejemplo de la Tabla 1 siguiente.

Ejemplo Tabla 1

Recuperación de Polisacárido y Carga en Microesferas de Ovalbúmina

5

Acoplamiento de PRP-AH a las Microesferas de Tétanos Toxoide

El tétanos toxoide (27 mg/ml, obtenido del Massachusetts Public Health Biologic Laboratory (Jamaica Plain, Mass.)) se combinó con dos volúmenes de una solución polimérica que contenía un 25% de PVP (40.000 dalton) y un 25% de PEG (3.500 dalton), pH 5,0. Se incubó la mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente, 30 minutos a 37ºC y 30 minutos a 58ºC, provocando la formación de microesferas. Las partículas fueron recogidas por centrifugación. Se determinó que el diámetro medio de partícula era de aproximadamente 0,082 \mum.

Las partículas de tétanos toxoide (0,825 mg) en tampón MES 1M, pH 5,0 (0,1 ml) fueron combinadas con PRP-AH (1,5 mg). Posteriormente, se añadieron 2,79 mg de clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropilcarbodiimida) (EDC, Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.). Se mezcló la reacción a temperatura ambiente durante tres horas. Las partículas fueron recogidas por centrifugación y lavadas tres veces con tampón MES 1M, pH 5,0 (400 mu l). Se determinó que la producción de PRP era del 16% por medio del ensayo de polisacárido libre con antrona descrito en METHODS IN IMMUNOLOGY AND IMMUNOCHEMISTRY, Vol. II, Williams, C.A. and Chase, M.W. (eds.), 1968, pp. 288-289, Academics Press, NY. Se determinó que el contenido en proteína era del 99% mediante el ensayo de proteína BCA TM (Pierce, Rockford, III). La proporción de PRP con respecto a la proteína era de 0,1. El diámetro medio de partícula resultante era de 0,080 \mum.

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Ejemplo 3

Liberación de Proteínas y Polímeros Radiomarcados desde las Microesferas

Se prepararon las microesferas utilizando una proteína radiomarcada (seroalbúmina bovina, BSA) y un polímero radiomarcado (PEG). Se midió la liberación de la radioactividad en función del tiempo.

Las microesferas se prepararon mediante la combinación de la proteína radiomarcada (10 mg/ml de ^{[14]}C-BSA, NEN, Boston, Mass.) con dos volúmenes de una solución polimérica que contenía un 25% de PVP (40.000 dalton) y un 25% de ^{[3]}H-PEG (3.500 dalton, NEN, Boston, Mass.), pH 5,0. Se incubó la mezcla durante 30 minutos a 37ºC, 30 minutos a 58ºC y 30 minutos a 70ºC, provocando la formación de microesferas. Las partículas fueron recogidas por centrifugación.

La proteína y el polímero se liberaron lentamente de las microesferas mediante la adición de 500 ml de una solución salina tamponada de fosfato (pH 7,4) e incubación de la mezcla a 37ºC, mientras se agitaba suavemente en un agitador Nutator TM. En distintos momentos, las partículas fueron precipitadas por centrifugación a 8.000 rpm durante 10 minutos, se eliminó el sobrenadante con una pipeta y se sometió a prueba la radioactividad mediante la adición de un fluido de escintilación líquida y recuento en un contador de escintilación de líquidos. Entonces se resuspendieron las partículas en 500 ml de una solución salina tamponada de fosfato (pH 7,4) y se repusieron a 37ºC con rotación suave hasta el siguiente momento. La cinética de liberación de la proteína y el polímero radiomarcados durante la incubación a 37ºC se muestra en la Fig. 1.

Las microesferas fueron preparadas y sometidas a ensayo en cuanto a su liberación tal como se ha descrito anteriormente, sin embargo, se utilizaron tres concentraciones distintas de polímero, y las microesferas se formaron por incubación a 58ºC. En la primera preparación, se utilizó un 25% de PEG y un 25% de PVP. En la segunda preparación, se utilizó un 20% de PEG y un 20% de PVP. En la tercera preparación, se utilizó un 12,5% de PEG y un 12,5% de PVP. Se muestra en la Fig. 2 la cinética de liberación de la proteína radiomarcada. La cinética de liberación del polímero radiomarcado se muestra en la Fig. 3.

Las microesferas fueron preparadas y sometidas a ensayo una vez más en cuanto a su liberación tal como se ha descrito anteriormente, se utilizaron tres concentraciones distintas de polímero y las microesferas se formaron por incubación a 58ºC, 70ºC, tanto a 37ºC como a 58ºC y tanto a 37ºC como a 70ºC. La cinética de liberación de la proteína radiomarcada se muestra en la Fig. 4. La cinética del polímero radiomarcado se muestra en la Fig. 5. La liberación de PEG radiomarcado en función de la concentración de polímero se muestra en la Fig. 6.

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Ejemplo 4

Formación de Microesferas que Contienen ADN

Las microesferas que contienen ADN fueron preparadas y transfectadas en células de fibroblastos. Las microesferas fueron analizadas en cuanto a la eficacia de transfección y expresión de la proteína.

Una parte alícuota de 0,025 ml de una solución de 1 mg/ml de un ADN de plásmido (pCMV beta Gal, Promega, Milwaukee, Wis.) fue complejada con 0,025 ml de una solución de 5,0 mg/ml de poli-L-lisina que tenía un rango de peso molecular medio situado entre 1 kDa y 40 kDa (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.).

Se añadió al complejo de ADN de plásmido-poli-L-lisina, mientras se sometía a rotación, 0,1 ml de una solución de un 25% (peso/volumen) de polivinilpirrolidona (peso molecular medio de 40 kDa, Spectrum, Gardena, Calif.) y un 25% (peso/volumen) de polietilenglicol (peso molecular medio de 3,35 kDa, Spectrum, Gardena, Calif.) en acetato de sodio 0,1M, pH 5,5.

Se incubó la mezcla a 37ºC durante 30 minutos y luego a 70ºC durante 30 minutos. Se formaron microesferas que contenían ADN. Se centrifugó la mezcla a 17.500 x g durante 10 minutos, se aspiró el sobrenadante y se lavaron tres veces las partículas con 0,3 ml de glicerol al 10% (volumen/volumen) en agua desionizada. Se resuspendieron las microesferas en 0,050 ml de agua desionizada. Las microesferas que contenían ADN se aplicaron a células fibroblastos NIH3T3 y se incubaron hasta 24 horas para permitir la captación de las microesferas por las células. La captación finalizó al lavar las células tres veces con una solución salina tamponada de fosfato (PBS/Ca[2+] + Mg[2+] -libre) (GIBCO-BRL, Gaithersburg, Md.) y la adición de Medio Mínimo Esencial de Dulbecco (DMEM, GIBCO-BRL, Gaithersburg, Md.).

La captación y expresión del ADN pCMV beta Gal fueron sometidas a ensayo en cuanto a la eficacia de la transfección y la cantidad de enzima beta-galactosidasa expresada. La eficacia de transfección fue determinada por la fijación de las células y el desarrollo del color con el substrato de la enzima beta-galactosidasa X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranósido, GIBCO-BRL, Gaithersburg, Md.). La cantidad de enzima beta-galactosidasa expresada se determinó mediante lisis de las células transfectadas y medida de la actividad enzimática total con el substrato de la enzima beta-galactosidasa CPRG (rojo de clorofenol-beta-D-galactopiranósido, Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.).

Resultados: La cantidad de enzima beta-galactosidasa expresada procedente de las células lisadas que fueron transfectadas mediante la utilización de: 1) ADN desnudo (ninguna adición); 2) liposomas catiónicos más ADN; ó 3) la microesfera que contiene el ADN, preparada tal como se ha descrito anteriormente, se muestra en la Fig. 7.

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Ejemplo 5

Formación de Microesferas que Contienen Acetato de Leuprolide

Se prepararon microesferas que contenían el péptido acetato de leuprolide y seroalbúmina humana. El acetato de leuprolide es un análogo genérico de la hormona liberadora de la hormona luteinizante, que es un péptido utilizado esencialmente en el tratamiento del cáncer de próstata.

Se añadió una parte alícuota de 0,010 ml de una solución de 10-100 mg/ml de acetato de leuprolide en agua (LHRH, TAP Pharmaceuticals, Deerfield, III) a 0,168 ml de una solución del 2-10% (peso/volumen) de sulfato de dextrano en agua (peso molecular medio 500 kDa), y se mezcló suavemente la solución. A la solución de leuprolide/dextrano se añadieron 0,856 ml de una parte alícuota de una solución que contenía un 25% (peso/volumen) de polietilenglicol con un peso molecular medio de 3,35 kDa (Spectrum, Gardena, Calif.) y un 25% (peso/volumen) de polivinilpirrolidona con un peso molecular medio de 40 kDa, en solución acuosa 0,1M de acetato de sodio, pH 5,5. Se mezcló suavemente la solución resultante y se dejó reposar hasta durante 30 minutos. Una parte alícuota de 0,25 ml de una solución al 20% (peso/volumen) de seroalbúmina humana (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) en agua se añadió entonces a la solución. Se mezcló suavemente la solución final y se colocó en un baño de agua a 70ºC hasta 90ºC durante un período de tiempo entre 30 minutos y 3 horas. Se formaron las microesferas.

Las microesferas fueron recogidas por centrifugación a 17,5 K x g durante 10 minutos, se lavaron con 0,5 ml de H_{2}O desionizada y se recogieron de nuevo mediante centrifugación.

Se prepararon partículas estériles empleando el procedimiento anteriormente mencionado y mediante filtración estéril de todas las soluciones antes de su uso y conducción de todas las manipulaciones en tubo abierto en una cabina de cultivo de tejido de flujo laminar.

La liberación in vitro del acetato de leuprolide se midió mediante centrifugación de las microesferas y la resuspensión en un medio salino de liberación tamponado con fosfato. Se muestra la cinética de liberación en la Fig. 8.

Las microesferas estaban compuestas de aproximadamente un 10% de acetato de leuprolide, un 50% de seroalbúmina humana, un 20% de sulfato de dextrano y un 20% de polietilenglicol/polivinilpirrolidona.

Se prepararon partículas similares que incluían también sulfato de zinc o ácido caprílico, los cuales retardaron la liberación de la proteína y del péptido desde las microesferas.

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Ejemplo 6

Preparación de Microesferas de Seroalbúmina Bovina Utilizando Polietilenglicol y Poloxámero 407

Se prepararon microesferas de seroalbúmina bovina por medio de una mezcla de polímeros de polietilenglicol y poloxámero 407. Se disolvieron 1,25 gramos polietilenglicol (PM 3.550, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) y poloxámero 407 (BASF, Parsippany, N.J.) en 100 ml de un tapón de acetato de sodio 0,1N, pH 5,5, para elaborar una solución al 12,5%. Se disolvió una solución de 10 mg/ml de seroalbúmina bovina (BSA, Fraction V, Sigma Chemical Co.) en H_{2}O desionizada. Una parte alícuota de 400 ml de la solución de BSA se combinó con 800 ml de la solución de polímero. Se agitó la mezcla. Se formó una solución transparente. Se calentó la solución hasta 70ºC durante 30 minutos. Se observó la formación de partículas por la presencia de una suspensión blanca lechosa.

La solución de polímero residual fue eliminada por centrifugación a 12.500 rpm durante 10 minutos y luego mediante decantación del disolvente. Se realizaron dos etapas de lavado y centrifugación con etanol al 10% en agua para eliminar el polímero residual adicional.

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Ejemplo 7

Preparación de Microesferas de Seroalbúmina Bovina Utilizando Dextrano

Se prepararon microesferas de seroalbúmina bovina mediante la utilización de dextrano.

Se disolvieron 12,5 g de dextrano (PM 500.000, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) en 100 ml de un tampón de acetato de sodio 0,1M, pH 5,0, para elaborar una solución al 12,5%. Se disolvió la seroalbúmina bovina (BSA, Sigma Chemical Co.) en H_{2}O desionizada a una concentración de 10 mg/ml. Se colocó una parte alícuota de 400 ml de la solución de BSA en un tubo de microcentrifugación de 1,5 ml. Se añadió a la solución de BSA una parte alícuota de 800 ml de la solución polimérica de dextrano. Se agitó la solución. Se formó una solución transparente. Se colocó el tubo de microcentrifugación en un baño de agua a 70ºC durante 30 minutos. Se observó una suspensión blanca lechosa que indicaba la formación de microesferas.

La solución polimérica de dextrano residual fue eliminada por centrifugación a 12.500 rpm durante 10 minutos y luego mediante decantación del disolvente. Se realizaron dos etapas de lavado y centrifugación con etanol al 10% en agua para eliminar el polímero residual adicional. Las micrografías electrónicas de exploración revelaron la formación de microesferas del tamaño de una submicra, a menudo dispuestas en una estructura parecida a una hebra.

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Ejemplo 8

Preparación de Microesferas de Seroalbúmina Bovina Utilizando Eudragit Registrado TM E100

Se prepararon microesferas de seroalbúmina bovina mediante la utilización del polímero Eudragit® E100. Este polímero es soluble en un disolvente orgánico miscible con agua.

Se disolvió el polímero Eudragit® E100 (Rohm, Malden, Mass.) en una solución 1:1 de tampón de acetato de sodio 0,1M (pH 5,0) y etanol. El pH final de la solución era de 6,5. Una parte alícuota de 400 ml de una solución de 10 mg/ml de seroalbúmina bovina (BSA, Sigma Chemical Co. St. Louis, Mo.) se combinó con 800 ml de la solución del polímero Eudragit® E100. Se formó una solución transparente. La solución BSA/polímero se incubó en un baño de agua a 70ºC durante 30 minutos. Se observó una suspensión blanca lechosa que indicaba la formación de microesferas. Las partículas se recogieron por centrifugación durante 10 minutos a 8.000 rpm y decantación del líquido.

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Ejemplo 9

Preparación de Microesferas de Insulina Utilizando Dextrano

Se prepararon microesferas de insulina mediante la utilización del polímero dextrano.

Se disolvió una solución al 20% (peso/peso) de polímero dextrano (PM 500.000, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) en un tampón de acetato de sodio pH 5,0. Se añadieron 1,9 ml de H_{2}O desionizada a 20,5 mg de insulina (Sigma Chemical Co.). Se añadieron 100 ml de HCl 0,2M para disolver la insulina. Se colocó en un tubo de prueba una parte alícuota de 400 ml de la solución de insulina. Se añadió una parte alícuota de 800 ml de la solución de dextrano a la solución de insulina. Se agitó la mezcla. Al añadir la solución de dextrano la mezcla se volvió turbia. Se calentaron los tubos hasta una temperatura final de 70ºC ó 90ºC para formar microesferas de insulina. Se centrifugaron las microesferas a 10.000 rpm durante 5 minutos y se decantó el líquido para eliminar el polímero residual. Se lavaron las microesferas con etanol al 10% en agua.

Se colocaron las microesferas en una solución salina tamponada de fosfato pH 7,4 para determinar las características de disolución. Las partículas de insulina formadas a una temperatura final de 90ºC no se disolvieron en la solución salina tamponada de fosfato, mientras que las partículas de insulina preparadas a una temperatura final de 70ºC se disolvieron en 15 minutos. Por tanto, la estabilidad de las partículas de insulina puede ajustarse variando la temperatura de incubación empleada durante la formación de partículas.

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Ejemplo 10

Preparación de Microesferas Utilizando Varios Polímeros

Se prepararon microesferas de seroalbúmina humana mediante la utilización de nueve polímeros distintos o mezclas de polímeros.

Procedimiento: Se preparó una solución proteica (1-5% de seroalbúmina humana, pH 4,5-5,5 o de seroalbúmina bovina) en un tampón. Se prepararon las siguientes soluciones poliméricas: polietilenglicol/polivinilpirrolidona (PEG 3 kDa/PEG 40 kDa en una mezcla 1:1); hetalmidón (500 kDa); polímero Pluronic L-101^{TM}; dextrano (3-500 kDa); sulfato de dextrano (3-500 kDa); polivinilpirrolidona (10-360 kDa); polietilenglicol/polivinilpirrolidona con inulina (un polisacárido); polietilenglicol/polivinilpirrolidona con el polímero Pluronic L-101^{TM}; dextrano con el polímero Pluronic L-101^{TM}. Se mezcló aproximadamente un volumen de solución proteica con dos volúmenes de solución polimérica. Se incubó la mezcla en un baño de agua a 70ºC hasta 90ºC durante treinta minutos. Luego se colocó la mezcla en un baño de hielo. Se observó la formación de microesferas.

Se centrifugaron las microesferas hasta que se compactaron en un gránulo, se decantó el sobrenadante y se lavó el gránulo dos veces en etanol al 10% en solución acuosa para eliminar la solución polimérica residual. Luego se lavaron tres veces las microesferas con agua desionizada. Las microesferas se utilizaron o sometieron a prueba inmediatamente o se liofilizaron para su posterior uso.

Observaciones: Las microesferas preparadas mediante la utilización de polímeros que tienen un peso molecular más alto o una concentración más alta de polímeros proporcionan un medio más viscoso, lo cual produce una distribución del tamaño de las microesferas más uniforme. La inclusión de un agente tensioactivo tal como el polímero Pluronic L-101^{TM} o de una mezcla durante la formación de las microesferas afectó al tamaño de éstas. Un incremento en la concentración de proteína durante la formación de las microesferas provocó un aumento en la incorporación de proteína en las microesferas. En general, un incremento en el tamaño del polímero provocó un aumento en la incorporación de proteína en las microesferas. La utilización de distintos polímeros afectó a la cinética de liberación. Por ejemplo, las microesferas de seroalbúmina bovina (BSA) preparadas utilizando dextrano liberaron aproximadamente un 15% menos de BSA que las microesferas preparadas utilizando PEG/PVP. Sin embargo, la liberación de polisacárido por las microesferas de proteína-polisacárido, tal como la liberación de ^{[3]}H-inulina por las microesferas de seroalbúmina humana/inulina fue más rápida cuando se empleó dextrano en lugar de PEG/PVP.

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Ejemplo 11

Preparación de Microesferas de Proteína que Contienen Acetato de Nafarelina Utilizando Varios Polímeros

Se prepararon microesferas de proteína que contenían el medicamento acetato de nafarelina.

El acetato de nafarelina se emplea para el tratamiento de la endometriosis, pubertad precoz y el cáncer de próstata.

Procedimiento: Se prepararon microesferas de seroalbúmina humana tal como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 10 utilizando nueve polímeros distintos o mezclas de polímeros. Se disolvió acetato de nafarelina (Rocher Laboratories, Nutley, N.J.) en agua desionizada para producir 10 mg/ml de una solución.

A 1 mg de acetato de nafarelina se añadieron 10 mg de las microesferas de seroalbúmina humana. Se agitó la mezcla y se mezcló durante 16 horas a 4ºC. Se añadió a la mezcla una disolución de sulfato de amonio 3M hasta una concentración final de 0,5M y se agitó y mezcló durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadió una disolución de sulfato de zinc 1M hasta una concentración final de 0,01M; 0,1M ó 1M y se agitó y mezcló durante 1 hora a temperatura ambiente.

Se centrifugaron las mezclas, se decantó el sobrenadante y se resuspendió el gránulo en agua desionizada tres veces para lavar las microesferas.

Observaciones: La adición de sulfato de zinc redujo la velocidad de liberación del acetato de nafarelina por las microesferas de seroalbúmina humana. Se muestran los resultados en la Fig. 9.

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Ejemplo 12

Preparación de Microesferas de Doxorrubicina/Albúmina

Se prepararon microesferas de seroalbúmina humana que contenían doxorrubicina, medicamento quimioterapéutico.

A 1 ml de una solución de 250 mg/ml de seroalbúmina humana (Sigma, St. Louis, Mo.) en H_{2}O desionizada se añadieron 0,05 ml de una solución de 5 mg/mL de doxorrubicina (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) en H_{2}O desionizada, se mezcló la solución combinada y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. A la solución anterior, se añadieron 3,0 ml de una solución de 200 mg/ml de sulfato de dextrano (PM 500.000, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) en H_{2}O desionizada y la solución resultante se mezcló e incubó a 37ºC durante 30 minutos. Luego se incubó la solución a 70ºC durante 30 minutos, después de lo cual se añadió 1,0 ml de acetato de sodio 3M, pH 5,0, y se mezcló la solución resultante. Luego se incubó la solución a 90ºC durante 30 minutos. Se formaron microesferas. Se lavaron dos veces las microesferas con 5,0 ml de H_{2}O desionizada.

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Ejemplo 13

Incorporación de LHRH en Microesferas de Sulfato de Dextrano/Albúmina

La hormona liberadora de la hormona luteinizante se incorporó en microesferas compuestas de seroalbúmina humana y microesferas de sulfato de dextrano.

A 0,168 ml de una solución al 10% (peso/volumen) de sulfato de dextrano (PM medio 500.000, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) en H_{2}O desionizada se añadieron 0,25 ml de una solución al 20% (peso/volumen) de seroalbúmina humana (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.) en H_{2}O desionizada. Se mezcló suavemente la solución y se añadieron 0,856 ml de una solución de polietilenglicol al 25% (peso/volumen) (PM medio 3,35 kDa, Spectrum, Gardena, Calif.) y polivinilpirrolidona al 25% (peso/volumen) (PM medio 40 kDa, Spectrum, Gardena, Calif.) en una solución acuosa de acetato de sodio 0,1M, pH 5,5.

Se mezcló suavemente la solución resultante y se colocó en un baño de agua a una temperatura entre 70ºC y 90ºC durante 30 minutos a 3 horas. Se formaron microesferas. Las microesferas se recogieron mediante centrifugación a 17,5K x g durante 10 minutos, se resuspendieron para su lavado en 0,5 ml de H_{2}O desionizada y se volvieron a recoger mediante centrifugación. Se resuspendieron las microesferas en 0,3 ml de una solución de acetato de sodio 0,1M, pH 5,5. Se añadió una parte alícuota de 0,01 ml de una solución de 10 mg/ml de una hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) en H_{2}O desionizada y se incubó durante 16 horas a temperatura ambiente para que el péptido de LHRH pudiera unirse a las microesferas. Después de la incubación de unión de 16 horas, se eliminó el péptido de LHRH no unido mediante dos ciclos de lavado con H_{2}O desionizada y se recogió por centrifugación. El rendimiento de incorporación de LHRH fue típicamente del 83 al 90%.

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Ejemplo 14

Incorporación de estradiol en Microesferas de ProMaxx®

Se formaron microesferas de seroalbúmina humana mediante la combinación del 12,5% en peso de polietilenglicol y del 12,5% en peso de polivinilpirrolidona en tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 5,3, y con un 1% (peso/volumen) de seroalbúmina humana disuelta en solución acuosa. Se colocó la solución a 70ºC durante 30 minutos. Se formaron las microesferas y precipitaron en la solución. La suspensión de microesferas se lavó 3 veces en agua desionizada. Luego se cargó estradiol en las microesferas de seroalbúmina humana a 3 porcentajes en peso distintos de carga. Se disolvió el estradiol en etanol y se incubó en presencia de las microesferas de albúmina. La afinidad del estradiol para la albúmina por medio de interacciones hidrofóbicas resultó en la capacidad de cargar el estradiol a varios porcentajes en peso de carga. Las microesferas que contenían estradiol en un 10% en peso contenían 1 mg de estradiol y 8,33 mg de seroalbúmina humana (HSA). Las microesferas que contenían estradiol en un 49% en peso contenían 8,15 mg de estradiol y 8,33 mg de HSA. Las microesferas que contenían estradiol en un 77% en peso contenían 27,68 mg de estradiol y 8,33 mg de HSA.

Las microesferas se liberaron en una solución salina tamponada de fosfato (PBS) a pH 7,4.

Todas las muestras fueron sometidas a rotación a 20 rpm a 37ºC para asegurar una mezcla constante. Se añadió un (1) ml de PBS a las microesferas, que se colocaron en tubos de centrifugación estándar de polipropileno. En cada momento, los tubos fueron centrifugados, el sobrenadante eliminado y se colocó 1ml del medio de liberación en un vial de muestras. Cada muestra de 1 ml se secó a vacío rápido y se resuspendió en 200 \mul de etanol. El estradiol liberado fue medido por HPLC.

La liberación prolongada de estradiol se muestra en la Fig. 10.

Se demostró también la liberación prolongada de estradiol in vivo. Se inyectaron las microesferas en cinco perros y las concentraciones de suero resultantes se determinaron mediante un radioinmunoensayo para estradiol. Se muestran los resultados en la Figura 11. Los tres grupos compuestos de cinco perros incluían todos un control de estradiol, que resultó en las concentraciones más bajas y la vida media más corta in vivo. El ProMaxx®, que son las microesferas de albúmina cargadas con estradiol, básicamente produjo concentraciones más altas de estradiol en plasma, con una vida media notablemente más larga. Y cuando las microesferas con estradiol fueron estabilizadas químicamente con EDC (etil dimetilaminopropil carbodiimida), se observaron mayores niveles prolongados en plasma y un aumento de la vida media del estradiol durante un período de 43 días.

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Ejemplo 15

Incorporación de Diclofenaco-Na en Microesferas de ProMaxx®

Se formaron microesferas de seroalbúmina bovina mediante la combinación de un 12,5% en peso polietilenglicol y un 12,5% en peso de polivinilpirrolidona en tampón acetato de sodio 50 mM a un pH 5,3 y con seroalbúmina bovina disuelta en solución acuosa. Se colocó la solución a 70ºC durante 30 minutos. Se formaron las microesferas y precipitaron en la solución. La suspensión de microesferas se lavó 3 veces en agua desionizada.

El medicamento antiinflamatorio no esteroideo, diclofenaco-Na, se unió a las microesferas de albúmina mediante manipulación del grado de ionización del diclofenaco-Na alterando el pH de las soluciones de incubación. La eficacia de la incorporación de diclofenaco-Na podría ser optimizada hasta la incorporación de un 65% mediante el ajuste de las condiciones de incubación a un pH que se muestra en la Fig. 12.

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Ejemplo 16

Formación de Microesferas que Contienen Acetato de Leuprolida

El acetato de leuprolida es un análogo de la hormona liberadora de la hormona luteinizante.

Se añade una solución acuosa de albúmina (por ejemplo, seroalbúmina humana, bovina, de ratón o de rata) a una solución acuosa de agente aniónico complejante (sulfato de dextrano de peso molecular (PM) 10 kDa a 500 kDa o heparina o heparan sulfato o ácidos poliglutámico o poliaspártico) con o sin una solución acuosa de cationes divalentes (calcio o magnesio o zinc) a temperatura ambiente y se agita la mezcla resultante durante un período de tiempo de 5 minutos a 3 horas. A esta mezcla se añade luego una solución acuosa de polímero (polietilenglicol (PEG) de PM 3,5 a 40 kDa; polivinilpirrolidona (PVP) de PM 6 a 40 kDa, o mezclas de ambos PEG y PVP, o almidón o hidroxietilalmidón de PM 500 kDa). La concentración de albúmina en la mezcla final es de 5-30 g/l, la de agente iónico complejante de 5-30 g/l, la de cationes divalentes de 0-30 g/l y la concentración de polímero es de 100 g/l a 400 g/l. Se agita la mezcla durante un período de 5 minutos a 6 horas a temperatura ambiente. La temperatura de la mezcla se eleva luego a una entre 37ºC y 50ºC durante un período de 5 minutos a 3 horas. Las microesferas son sometidas a estabilización mediante la adición de un estabilizante químico (EDC u otro agente enlazante) o a estabilización térmica mediante calentamiento a una temperatura situada entre 70ºC y 100ºC durante un período de 0,5 a 6 horas. La mezcla es sometida al estabilizante durante un período de 10 minutos a 16 horas o para la estabilización térmica se mantiene la temperatura al valor final durante 10 minutos a 6 horas. Luego se recogen las microesferas y se separan de los componentes no incorporados de la mezcla de reacción mediante filtración o centrifugación, con lavado posterior, o mediante diafiltración. La incorporación de acetato de leuprolida a las microesferas se lleva a cabo mediante la adición de una solución acuosa de la solución de leuprolida a una suspensión acuosa de microesferas. Las concentraciones de microesferas son de 1-50 g/l, las de acetato de leuprolida son de 1-100 g/l, en un medio acuoso tamponado 0-100 mM a un pH entre 2,5 y 10,0. Después de la incubación del acetato de leuprolida con la suspensión de microesferas durante 5 minutos hasta 8 horas a 5-50ºC, las microesferas que contienen el péptido se lavan por medio de los métodos descritos anteriormente para eliminar el péptido no unido. En algunos casos, las microesferas que contienen el péptido se someten a otra estabilización mediante la exposición reiterada a estabilizantes químicos, tal como se ha descrito anteriormente, y luego se lavan para eliminar el péptido no unido. Las microesferas finales que contienen el péptido son resuspendidas luego en agua o liofilizadas. Se determina su eficacia farmacéutica mediante la utilización de un modelo farmacodinámico, en ratas, de supresión de testosterona durante períodos de 7 a 180 días. Microesferas que contienen acetato de leuprolida fabricadas de acuerdo con el método anterior se inyectan en ratas y se detecta el acetato de leuprolida en el suero durante 7 hasta 120 días. Se suprime la testosterona del suero de rata en las ratas inyectadas con microesferas que contienen acetato de leuprolida durante 7 hasta 120 días. Estos resultados evidencian la liberación prolongada de acetato de leuprolida fisiológicamente activo durante ese período de tiempo.

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Ejemplo 17

Ejemplos de Microesferas de ProMaxx que contienen Calcio

Los ejemplos siguientes ilustran las condiciones específicas para formar las microesferas preferentes de la invención. Se debe entender que las concentraciones, tiempos y pHs pueden variar dentro de un rango experimental razonable y siguen resultando en microesferas que tienen las características descritas más adelante. Tal como se ha descrito en la descripción detallada de la invención, es preferente añadir metal divalente (preferentemente calcio o magnesio) durante el proceso de formación y que esta condición del metal tenga lugar dentro de los 30 minutos a partir de la adición de los demás componentes que se utilizan para la formación de las microesferas. Se proporcionan a continuación más detalles con respecto al procedimiento de formación de microesferas.

A 1 volumen de una solución al 25% (peso/volumen) de sulfato de dextrano (PM medio 500 kDa) se añaden aproximadamente 2 volúmenes de una solución al 25% (peso/volumen) de albúmina (humana) y se agita la mezcla suavemente durante al menos 5 minutos. En esta mezcla se agitan suavemente aproximadamente 6 volúmenes de una solución al 36% (peso/volumen) de hetalmidón en acetato de Na 63 mM acuoso y a esta solución de hetalmidón se añade agua mientras se sigue agitando suavemente. Se agita suavemente la solución resultante durante al menos 5 minutos, momento en el cual se añade lentamente la mezcla de sulfato de dextrano-albúmina. A esta mezcla, se añade un volumen adecuado de una disolución de CaCl_{2}, ZnCl_{2} ó MgCl_{2} 1,5M para elaborar una mezcla final que contiene 25 mM o 100 mM de catión metálico. Esta mezcla se agita suavemente de manera constante. La temperatura de la mezcla de reacción se aumenta entonces hasta una temperatura final de 60-90ºC durante un período de 50-60 minutos. Se mantiene la temperatura de la mezcla a 60-90ºC durante 30-120 minutos, momento en el cual se añade un igual volumen de una solución MES-Na^{+} 25 mM (ácido N-morfolinetanosulfónico) a temperatura ambiente, pH 6,0 \pm 0,5 mientras se sigue agitando. Luego las microesferas formadas se someten a diafiltración contra 1 vol de MES 25 mM, pH 6,0 \pm 0,5. Entonces, las microesferas son concentradas y diafiltradas contra 9 volúmenes de MES 25 mM, pH 6,0 \pm 0,5 a temperatura ambiente. La carga y la diafiltración se llevan a cabo a un pH de 4,5 \pm 0,5 en el caso de microesferas que contienen Zn^{2+}. Las microesferas son concentradas por diafiltración. A la suspensión de microesferas que contiene 17,1 g de albúmina (humana) se añade una solución de 3,43 g de acetato de leuprolida en MES 25 mM, pH 6,0, a una velocidad de 0,4 litros por minuto. La adición de la solución de leuprolida es seguida de la adición de la solución de MES a la suspensión de microesferas de acetato de leuprolida. Se mezcla la suspensión durante 15 minutos a temperatura ambiente, momento en el cual se concentra la suspensión mediante diafiltración. A esta suspensión se añade una solución de 17,14 g de EDC ((3,3-etildimetilaminopropil)carbodiimida) en MES 25 mM, pH 6,0 \pm 0,5, a 0,4 litros por minuto. Se incuba la suspensión a temperatura ambiente mientras se agita durante 180 minutos, después de lo cual es diafiltrada contra 10 volúmenes de agua destilada y es concentrada por diafiltración. El contenido en acetato de leuprolida de la suspensión se determina al añadir y diluir una solución al 50% (peso/volumen) de sacarosa en agua para que la suspensión final sea de aproximadamente 3,75-4,025 mg/ml de acetato de leuprolida en sacarosa al 5% (peso/volumen). Esta suspensión bruta se rellena luego en un vial en una cantidad de 2,0 ml por vial y se liofiliza.

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(1) Características Físicas

Características de carga: las microesferas que contienen Mg^{2+} y Ca^{2+} se unen al medicamento a un alto rendimiento (> 90%), mientras que las microesferas que contienen Zn^{2+} se unen al medicamento a un rendimiento inferior al 70%.

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(2) Liberación In Vitro

Las microesferas que contenían Mg^{2+} y Ca^{2+} tenían velocidades similares de liberación de leuprolida que no variaban con la concentración de catión metálico presente durante la fabricación de las microesferas. Con 25 mM de Zn^{2+}, la velocidad de liberación era similar a la de las microesferas que contenían Ca^{2+} y Mg^{2+}, pero con 100 mM de Zn^{2+}, la magnitud de la fase inicial de "explosión" era superior.

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(3) Rendimiento In Vivo

En ratas, a una dosificación idéntica de medicamento, las microesferas que contenían Ca^{2+} y Mg^{2+} suprimieron la testosterona del suero hasta niveles de castración durante al menos 4 semanas. Las microesferas que contenían Zn^{2+} no suprimieron la testosterona durante siquiera tres semanas en el modelo de rata.

Se establecen en los puntos siguientes de la descripción los aspectos preferentes de la invención.

A.

Una microesfera que comprende:

(1)

una proteína portadora;

(2)

un polímero soluble en agua;

(3)

un primer agente complejante que es un polisacárido polianiónico; y

(4)

un segundo agente complejante que es un catión metálico divalente seleccionado de entre el grupo consistente en calcio y magnesio

B.

La microesfera del punto A, caracterizada porque la proteína portadora es una albúmina o una inmunoglobulina.

C.

La microesfera según cualquiera de los puntos anteriores, caracterizada porque la proteína se selecciona de entre el grupo consistente en las proteínas portadoras de la Tabla 1.

D.

La microesfera según cualquiera de los puntos anteriores, caracterizada porque la microesfera contiene del 40 a menos del 100% de proteína.

E.

La microesfera según el punto A, caracterizada porque el polímero soluble en agua es un polímero basado en un hidrocarburo.

F.

La microesfera según el punto A, caracterizada porque el polímero soluble en agua es un hidroxietilalmidón.

G.

La microesfera según cualquiera de los puntos anteriores, caracterizada porque el polímero soluble en agua se selecciona de entre el grupo consistente en los polímeros solubles en agua de la Tabla 2, preferentemente un polímero basado en un hidrocarburo y en especial hetalmidón.

H.

La microesfera según el punto A, caracterizada porque el polisacárido polianiónico se selecciona de entre el grupo consistente en sulfato de dextrano, ácidos galacturónicos, alginatos, ácido manurónico, ácido gulurónico, ácido hialurónico, sulfatos de condroitina, heparina, quitina, quitosano, glicosaminoglicanos, proteoglicanos y agentes complejantes catiónicos (es decir agentes complejantes que tienen una carga positiva).

I.

La microesfera según el punto A, caracterizada porque el polisacárido polianiónico es sulfato de dextrano.

J.

La microesfera según el punto A, caracterizada porque el catión metálico divalente es calcio.

K.

La microesfera según el punto A, caracterizada porque el catión metálico divalente es magnesio.

L.

La microesfera según el punto A, caracterizada porque la microesfera tiene una superficie lisa que incluye múltiples orificios acanalados, teniendo cada uno de dichos orificios acanalados un diámetro que es inferior a 1.000 angstroms.

M.

La microesfera según el punto A, caracterizada porque la microesfera no contiene aceites o disolventes orgánicos detectables.

N.

La microesfera según el punto A, que comprende además un agente terapéutico.

O.

La microesfera según cualquiera de los puntos anteriores, caracterizada porque el agente activo se selecciona de entre el grupo consistente en los agentes activos de la Tabla 4, preferentemente una hormona liberadora de la hormona luteinizante (LH-RH) o un análogo de la misma, preferentemente leupro- lida.

P.

La microesfera según cualquiera de los puntos anteriores, caracterizada porque la macromolécula es albúmina, preferentemente seroalbúmina humana y el polímero soluble en agua es un polímero basado en un hidrocarburo, preferentemente hetalmidón.

Q.

La microesfera según cualquiera de los puntos anteriores, que comprende además un agente complejante, preferentemente sulfato de dextrano, y un agente activo, preferentemente acetato de leuprolida.

R.

Una jeringuilla que contiene una única dosis de las microesferas según cualquiera de los puntos anteriores, caracterizada porque la jeringuilla preferentemente incluye además una aguja que tiene un tamaño de diámetro interior de calibre 14 a 30.

S.

Un método para formar una microesfera que comprende:

(1)

la formación de una mezcla acuosa que contiene:

(a)

una proteína portadora;

(b)

un polímero soluble en agua;

(c)

un primer agente complejante que es un polisacárido polianiónico; y

(d)

un segundo agente complejante que es un catión metálico divalente seleccionado de entre el grupo consistente en calcio y magnesio;

(2)

dejar que las microesferas se formen en la mezcla acuosa; y

(3)

estabilizar las microesferas, preferentemente poniendo en contacto las microesferas con un agente reticulante y/o exponiendo las microesferas a una fuente de energía, preferentemente calor, en condiciones suficientes para estabilizar las microesferas.

T.

El método según el punto S, caracterizado porque la formación de la mezcla acuosa se lleva a cabo mediante la combinación en esencia simultánea de la proteína portadora, el polímero soluble en agua, el primer agente complejante y el segundo agente complejante.

U.

El método según el punto S, que comprende además el paso de:

(4)

poner en contacto la microesfera con una solución de un agente activo, preferentemente un agente activo de la Tabla 4, en especial una hormona liberadora de la hormona luteinizante o un análogo de la misma, y, en particular leuprolida, para incorporar el agente activo en la microesfera.

V.

El método según el punto S, caracterizado porque el paso de poner en contacto la microesfera con la solución del agente activo resulta en un rendimiento de incorporación de al menos el 60%, preferentemente de al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% y en particular de al menos el 95% o al menos el 98% del agente activo.

W.

El método según los puntos S, T o U, que comprende además el paso de:

(5)

estabilizar las microesferas, preferentemente poniendo en contacto las microesferas con un agente reticulante bajo condiciones suficientes para estabilizar la microesfera.

Claims (64)

1. Microesfera que comprende:

(1)

una proteína o molécula portadora seleccionada de entre el grupo consistente en IgG; IgM; insulina; hGH; lisozima; alfa-lactoglobulina; factor de crecimiento de fibroblastos básicos; VEGF; quimiotripsina; tripsina, anhidrasa carbónica; ovoalbúmina; fosforilasa b; fosfatasa alcalina; beta-galactosidasa; fibrinógeno; poli-L-lisina; ADN; inmunoglobulinas (por ejemplo, anticuerpos); caseína; colágeno; proteína de soja; y gelatina.;

(2)

un polímero soluble en agua;

(3)

un primer agente complejante que es un polisacárido polianiónico y

(4)

un segundo agente complejante que es un catión metálico divalente seleccionado de entre el grupo consistente en calcio y magnesio

2. Microesfera según la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína o molécula portadora es inmunoglobulina.

3. Microesfera según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque la microesfera contiene del 40 a menos del 100% de proteína.

4. Microesfera según la reivindicación 1, caracterizada porque el polímero soluble en agua es un polímero basado en un hidrocarburo.

5. Microesfera según la reivindicación 1, caracterizada porque el polímero soluble en agua es un hidroxietilalmidón.

6. Microesfera según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el polímero soluble en agua se selecciona de entre el grupo consistente en los polímeros solubles en agua de la Tabla 2, preferentemente un polímero basado en un hidrocarburo y en especial hetalmidón.

7. Microesfera según la reivindicación 1, caracterizada porque el polisacárido polianiónico se selecciona de entre el grupo consistente en sulfato de dextrano, ácidos galacturónicos, alginatos, ácido manurónico, ácido gulurónico, ácido hialurónico, sulfatos de condroitina, heparina, quitina, quitosano, glicosaminoglicanos, proteoglicanos y agentes complejantes catiónicos (es decir agentes complejantes que tienen una carga positiva).

8. Microesfera según la reivindicación 1, caracterizada porque el polisacárido polianiónico es sulfato de dextrano.

9. Microesfera según la reivindicación 1, caracterizada porque el catión metálico divalente es calcio.

10. Microesfera según la reivindicación 1, caracterizada porque el catión metálico divalente es magnesio.

11. Microesfera según la reivindicación 1, caracterizada porque la microesfera tiene una superficie lisa que incluye múltiples orificios acanalados, teniendo cada uno de dichos orificios acanalados un diámetro que es inferior a 1.000 angstroms.

12. Microesfera según la reivindicación 1, caracterizada porque la microesfera no contiene aceites o disolventes orgánicos detectables.

13. Microesfera según la reivindicación 1, que comprende además un agente terapéutico.

14. Microesfera según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el agente activo se selecciona de entre el grupo consistente en los agentes activos de la Tabla 4, preferentemente una hormona liberadora de la hormona luteinizante (LH-RH) o un análogo de la misma, preferentemente leuprolida.

15. Microesfera según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un agente complejante, preferentemente sulfato de dextrano, y un agente activo, preferentemente acetato de leuprolida.

16. Jeringuilla que contiene un única dosis de las microesferas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la jeringuilla preferentemente incluye además una aguja que tiene un tamaño de diámetro interior de calibre 14 a 30.

17. Método para formar una microesfera según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que comprende:

(1)

la formación de una mezcla acuosa que contiene:

(a)

una proteína o molécula portadora seleccionada de entre el grupo consistente en IgG; IgM; insulina; hGH; lisozima; alfa-lactoglobulina; factor de crecimiento de fibroblastos básicos; VEGF; quimiotripsina; tripsina, anhidrasa carbónica; ovalbúmina; fosforilasa b; fosfatasa alcalina; beta-galactosidasa; fibrinógeno; poli-L-lisina; ADN; inmunoglobulinas (por ejemplo, anticuerpos); caseína; colágeno; proteína de soja; y gelatina.;

(b)

un polímero soluble en agua;

(c)

un primer agente complejante que es un polisacárido polianiónico; y

(d)

un segundo agente complejante que es un catión metálico divalente seleccionado de entre el grupo consistente en calcio y magnesio;

(2)

dejar que las microesferas se formen en la mezcla acuosa; y

(3)

estabilizar las microesferas, preferentemente poniendo en contacto las microesferas con un agente reticulante y/o exponiendo las microesferas a una fuente de energía, preferentemente calor, en condiciones suficientes para estabilizar las microesferas.

18. Método según la reivindicación 17, caracterizado porque la formación de la mezcla acuosa se lleva a cabo mediante la combinación en esencia simultánea de la proteína de la molécula portadora o, el polímero soluble en agua, el primer agente complejante y el segundo agente complejante.

19. Método según la reivindicación 17, que comprende además el paso de:

(4)

poner en contacto la microesfera con una solución de un agente activo, preferentemente un agente activo de la Tabla 4, en especial una hormona liberadora de la hormona luteinizante o un análogo de la misma, y, en particular leuprolida, para incorporar el agente activo en la microesfera.

20. Método según la reivindicación 19, caracterizado porque el paso de poner en contacto la microesfera con la solución del agente activo resulta en un rendimiento de incorporación de al menos el 60%, preferentemente de al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% y en particular de al menos el 95% o al menos el 98% del agente activo.

21. Método según la reivindicación 17, 18 ó 19, que comprende además el paso de:

(5)

estabilizar las microesferas, preferentemente poniendo en contacto las microesferas con un agente reticulante bajo condiciones suficientes para estabilizar la microesfera.

22. Microesfera que comprende:

(1)

una proteína portadora;

(2)

un polímero soluble en agua seleccionado de entre el grupo consistente en:

a)

polímeros basados en hidrocarburos seleccionados de entre metilcelulosa, polímeros basados en carboximetilcelulosa, dextrano, polidextrosa, quitinas derivatizadas, quitosano y derivados de los mismos;

b)

acrilatos-PEG, polietilenimina, acetato de polivinilo y derivados de los mismos;

c)

alcohol de poli(vinilo), poli(vinil)fosfato, ácido poli(vinil)fosfónico y derivados de los mismos;

d)

ácidos poliacrílicos y derivados de los mismos;

e)

ácidos poliorgánicos, como ácido polimaleico, y derivados de los mismos;

f)

poliaminoácidos como polilisina y poliiminoácidos como poli-iminotirosina, y derivados de los mismos;

g)

copolímeros y copolímeros en bloque como poloxámero 407 o el polímero Pluronic L-101 TM, y derivados de los mismos;

h)

tert-polímeros y derivados de los mismos;

i)

poliéteres como poli(tetrametilen éter glicol) y derivados de los mismos;

j)

polímeros naturales como zeína y pululano y derivados de los mismos;

k)

poliimidas como poli-n-tris(hidroximetil)metilmetacrilato y derivados de las mismas;

l)

agentes tensioactivos como polioxietilensorbitano y derivados de los mismos;

m)

poliésteres como poli(etilenglicol)(n)monometil éter mono(succinimidilsuccinato) éster y derivados de los mismos;

n)

polímeros cíclicos y ramificados como ciclodextrinas y derivados de los mismos; y

o)

polialdehídos como poli(perfluoropropilen óxido-b-perfluoroformaldehído) y derivados de los mismos.

(3)

un primer agente complejante que es un polisacárido polianiónico; y

(4)

un segundo agente complejante que es un catión metálico divalente seleccionado de entre el grupo consistente en calcio y magnesio.

23. Microesfera según la reivindicación 22, caracterizada porque la proteína portadora es una albúmina o una inmunoglobulina.

24. Microesfera según la reivindicación 22 ó 23, caracterizada porque la proteína se selecciona de entre el grupo consistente en las proteínas portadoras de la Tabla 1.

25. Microesfera según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, caracterizada porque la microesfera contiene del 40 a menos del 100% de proteína.

26. Microesfera según la reivindicación 22, caracterizada porque el polímero soluble en agua es un polímero basado en hidrocarburos.

27. Microesfera según la reivindicación 22, caracterizada porque el polisacárido polianiónico se selecciona de entre el grupo consistente en sulfato de dextrano, ácidos galacturónicos, alginatos, ácido manurónico, ácido gulurónico, ácido hialurónico, sulfatos de condroitina, heparina, quitina, quitosano, glicosaminoglicanos, proteoglicanos y agentes complejantes catiónicos (es decir agentes complejantes que tienen una carga positiva).

28. Microesfera según la reivindicación 22, caracterizada porque el polisacárido polianiónico es sulfato de dextrano.

29. Microesfera según la reivindicación 22, caracterizada porque el catión metálico divalente es calcio.

30. Microesfera según la reivindicación 22, caracterizada porque el catión metálico divalente es magnesio.

31. Microesfera según la reivindicación 22, caracterizada porque la microesfera tiene una superficie lisa que incluye múltiples orificios acanalados, teniendo cada uno de dichos orificios acanalados un diámetro que es inferior a 1.000 angstroms.

32. Microesfera según la reivindicación 22, caracterizada porque la microesfera no contiene aceites o disolventes orgánicos detectables.

33. Microesfera según la reivindicación 22, que comprende además un agente terapéutico.

34. Microesfera según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 33, caracterizada porque el agente activo se selecciona de entre el grupo consistente en los agentes activos de la Tabla 4, preferentemente la hormona liberadora de la hormona luteinizante (LH-RH) o un análogo de la misma, preferentemente leuprolida.

35. Microesfera según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 34, caracterizada porque la macromolécula es albúmina, preferentemente seroalbúmina humana, y el polímero soluble en agua es un polímero basado en hidrocarburos.

36. Microesfera según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 35, que comprende además un agente complejante, preferentemente sulfato de dextrano, y un agente activo, preferentemente acetato de leuprolida.

37. Jeringuilla que contiene un única dosis de las microesferas según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 36, caracterizada porque la jeringuilla preferentemente incluye además una aguja que tiene un tamaño de diámetro interior de calibre 14 a 30.

38. Método para formar una microesfera según se define en cualquiera de las reivindicaciones 22 a 36, que comprende:

(1)

la formación de una mezcla acuosa que contiene:

(a)

una proteína portadora;

(b)

un polímero soluble en agua seleccionado de entre el grupo consistente en:

1)

polímeros basados en hidrocarburos, como metilcelulosa, polímeros basados en carboximetilcelulosa, dextrano, polidextrosa, quitinas derivatizadas, quitosano, y almidón (incluido hetalmidón) y derivados de los mismos;

2)

acrilatos-PEG, polietilenimina, acetato de polivinilo y derivados de los mismos;

3)

alcohol de poli(vinilo), poli(vinil)fosfato, ácido poli(vinil)fosfónico y derivados de los mismos;

4)

ácidos poliacrílicos y derivados de los mismos;

5)

ácidos poliorgánicos como ácido polimaleico y derivados de los mismos;

6)

poliaminoácidos como polilisina y poliiminoácidos como poli-iminotirosina, y derivados de los mismos;

7)

copolímeros y copolímeros en bloque como poloxámero 407 o el polímero Pluronic L-101 TM, y derivados de los mismos;

8)

tert-polímeros y derivados de los mismos;

9)

poliéteres como poli(tetrametilen éter glicol) y derivados de los mismos;

10)

polímeros naturales como zeína y pululano y derivados de los mismos;

11)

poliimidas como poli-n-tris(hidroximetil)metilmetacrilato y derivados de las mismas;

12)

agentes tensioactivos como polioxietilensorbitano y derivados de los mismos;

13)

poliésteres como poli(etilenglicol)(n)monometil éter mono(succinimidilsuccinato) éster y derivados de los mismos;

14)

polímeros cíclicos y ramificados como ciclodextrinas y derivados de los mismos; y

15)

polialdehídos como poli(perfluoropropilen óxido-b-perfluoroformaldehído) y derivados de los mismos.

(c)

un primer agente complejante que es un polisacárido polianiónico; y

(d)

un segundo agente complejante que es un catión metálico divalente seleccionado de entre el grupo consistente en calcio y magnesio;

(2)

dejar que las microesferas se formen en la mezcla acuosa; y

(3)

estabilizar las microesferas, preferentemente poniendo en contacto las microesferas con un agente reticulante y/o exponiendo las microesferas a una fuente de energía, preferentemente calor, en condiciones suficientes para estabilizar las microesferas.

39. Método según la reivindicación 38, caracterizado porque la formación de la mezcla acuosa se lleva a cabo mediante la combinación en esencia simultánea de la proteína portadora, el polímero soluble en agua, el primer agente complejante y el segundo agente complejante.

40. Método según la reivindicación 38, que comprende además el paso de:

(4)

poner en contacto la microesfera con una solución de un agente activo, preferentemente un agente activo de la Tabla 4, en especial una hormona liberadora de la hormona luteinizante o un análogo de la misma, y, en particular leuprolida, para incorporar el agente activo en la microesfera.

41. Método según la reivindicación 40, caracterizado porque el paso de poner en contacto la microesfera con la solución del agente activo resulta en un rendimiento de incorporación de al menos el 60%, preferentemente de al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% y en particular de al menos el 95% o al menos el 98% del agente activo.

42. Método según la reivindicación 38, 39 ó 40, que comprende además el paso de:

(5)

estabilizar las microesferas, preferentemente poniendo en contacto las microesferas con un agente reticulante bajo condiciones suficientes para estabilizar la microesfera.

43. Microesfera que comprende:

(1)

una proteína portadora;

(2)

un polímero soluble en agua;

(3)

un primer agente complejante que es un polisacárido polianiónico seleccionado de entre el grupo consistente en ácidos galacturónicos, alginatos, ácido manurónico, ácido gulurónico, ácido hialurónico, sulfatos de condroitina, quitina, quitosano, glicosaminoglicanos, proteoglicanos; y

(4)

un segundo agente complejante que es un catión metálico divalente seleccionado de entre el grupo consistente en calcio y magnesio.

44. Microesfera según la reivindicación 43, caracterizada porque la proteína portadora es una albúmina o una inmunoglobulina.

45. Microesfera según la reivindicación 43 ó 44, caracterizada porque la proteína se selecciona de entre el grupo consistente en las proteínas portadoras de la Tabla 1.

46. Microesfera según cualquiera de las reivindicaciones 43 a 45, caracterizada porque la microesfera contiene del 40 a menos del 100% de proteína.

47. Microesfera según la reivindicación 43, caracterizada porque el polímero soluble en agua es un polímero basado en hidrocarburos.

48. Microesfera según la reivindicación 43, caracterizada porque el polímero soluble en agua es un hidroxietilalmidón.

49. Microesfera según cualquiera de las reivindicaciones 43 a 48, caracterizada porque el polímero soluble en agua se selecciona de entre el grupo consistente en los polímeros solubles en agua de la Tabla 2, preferentemente un polímero basado en hidrocarburos, y en particular, hetalmidón.

50. Microesfera según la reivindicación 43, caracterizada porque el polisacárido polianiónico se selecciona de entre el grupo consistente en ácidos galacturónicos, alginatos, ácido manurónico, ácido gulurónico, ácido hialurónico, sulfatos de condroitina, quitina, quitosano, glicosaminoglicanos, proteoglicanos y agentes complejantes catiónicos (es decir agentes complejantes que tienen una carga positiva).

51. Microesfera según la reivindicación 43, caracterizada porque el catión metálico divalente es calcio.

52. Microesfera según la reivindicación 43, caracterizada porque el catión metálico divalente es magnesio.

53. Microesfera según la reivindicación 43, caracterizada porque la microesfera tiene una superficie lisa que incluye múltiples orificios acanalados, teniendo cada uno de dichos orificios acanalados un diámetro que es inferior a 1.000 angstroms.

54. Microesfera según la reivindicación 43, caracterizada porque la microesfera no contiene aceites o disolventes orgánicos detectables.

55. Microesfera según la reivindicación 43, que comprende además un agente terapéutico.

56. Microesfera según cualquiera de las reivindicaciones 43 a 55, caracterizada porque el agente activo se selecciona de entre el grupo consistente en los agentes activos de la Tabla 4, preferentemente la hormona liberadora de la hormona luteinizante (LH-RH) o un análogo de la misma, preferentemente leuprolida.

57. Microesfera según cualquiera de las reivindicaciones 43 a 56, caracterizada porque la macromolécula es albúmina, preferentemente seroalbúmina humana, y el polímero soluble en agua es un polímero basado en hidrocarburos, preferentemente hetalmidón.

58. Microesfera según cualquiera de las reivindicaciones 43 a 57, que comprende además un agente complejante y un agente activo, preferentemente acetato de leuprolida.

59. Jeringuilla que contiene una única dosis de las microesferas según cualquiera de las reivindicaciones 43 a 58, caracterizada porque la jeringuilla preferentemente incluye además una aguja que tiene un tamaño de diámetro interior de calibre 14 a 30.

60. Método para formar una microesfera según las reivindicaciones 43 a 58, que comprende:

(1)

la formación de una mezcla acuosa que contiene:

(a)

una proteína portadora;

(b)

un polímero soluble en agua;

(c)

un primer agente complejante que es un polisacárido polianiónico seleccionado de entre el grupo consistente en ácidos galacturónicos, alginatos, ácido manurónico, ácido gulurónico, ácido hialurónico, sulfatos de condroitina, quitina, quitosano, glicosaminoglicanos, proteoglicanos; y

(d)

un segundo agente complejante que es un catión metálico divalente seleccionado de entre el grupo consistente en calcio y magnesio;

(2)

dejar que las microesferas se formen en la mezcla acuosa; y

(3)

estabilizar las microesferas, preferentemente poniendo en contacto las microesferas con un agente reticulante y/o exponiendo las microesferas a una fuente de energía, preferentemente calor, en condiciones suficientes para estabilizar las microesferas.

61. Método según la reivindicación 60, caracterizado porque la formación de la mezcla acuosa se lleva a cabo mediante la combinación en esencia simultánea de la proteína portadora, el polímero soluble en agua, el primer agente complejante y el segundo agente complejante.

62. Método según la reivindicación 60, que comprende además el paso de:

(4)

poner en contacto la microesfera con una solución de un agente activo, preferentemente un agente activo de la Tabla 4, en especial una hormona liberadora de la hormona luteinizante o un análogo de la misma, y, en particular leuprolida, para incorporar el agente activo en la microesfera.

63. Método según la reivindicación 62, caracterizado porque el paso de poner en contacto la microesfera con la solución del agente activo resulta en un rendimiento de incorporación de al menos el 60%, preferentemente de al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% y en particular de al menos el 95% o al menos el 98% del agente activo.

64. Método según la reivindicación 60, 61 ó 62, que comprende además el paso de:

(5)

estabilizar las microesferas, preferentemente poniendo en contacto las microesferas con un agente reticulante bajo condiciones suficientes para estabilizar la microesfera.