JPH08225454A - マイクロスフェア製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒトまたは動物の疾患の治療、予防に使用さ
れる生理活性ポリペプチドまたはタンパク質と水溶性高
分子とを含む微粉末を、生体分解性重合体の壁物質中
へ、分散させたマイクロスフェア製剤。但し、この分散
は実質上水を使用しない条件で行われる。 【効果】 生理活性ポリペプチドまたはタンパク質の変
性を伴わず、失活を著しく抑制したマイクロスフェア製
剤が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒトまたは動物の疾患の
治療、予防に使用される生理活性ポリペプチドまたはタ
ンパク質を、生体内へ注射したのちに長期間に亘って薬
理作用を持続させるための生体分解性マイクロスフェア
製剤およびその製造方法に関し、更に詳しくは、生体分
解性重合体の壁物質で被覆する際の生理活性ポリペプチ
ドまたはタンパク質の変性、失活を著しく抑制したマイ
クロスフェア製剤およびその製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年のバイオテクノロジーの進歩によ
り、生理活性ポリペプチドまたはタンパク質が工業的に
生産され、ヒトまたは動物の種々の疾患の治療、予防に
広く利用されつつある。

【０００３】これら生理活性ポリペプチドまたはタンパ
ク質は、殆どの場合が毎日注射にて投与されるが、これ
には以下の問題点があった。

【０００４】ａ）治療効果：内因性の生理活性物質ある
いはその誘導体であるために、一過的に多量の薬物を体
内に入れるよりも必要量を持続的に投与した方が効果が
高まる場合がある。

【０００５】ｂ）副作用： 一過的な体内薬物濃度の上
昇により、副作用を引き起こす恐れがある。

【０００６】ｃ）人的負担：患者の通院の負担、連日の
注射による苦痛 医師、看護婦の投薬の煩雑さ この様な背景から、生理活性ポリペプチドまたはタンパ
ク質を持続的に生体内に投与する有用性が認められ、そ
のための様々な方法が試みられている。

【０００７】その一つが生体分解性重合体を用いたマイ
クロスフェアであり、例えば、前立腺癌治療剤の酢酸リ
ュープロレリンを配合したマイクロスフェアが開発さ
れ、臨床使用されるに至っている。

【０００８】このマイクロスフェアは、一般的には以下
の二通りの方法で作成される。

【０００９】ａ）まず、生理活性物質の水溶液を生体分
解性重合体の良溶媒（塩化メチレン、酢酸エステル等）
溶液に加え、撹拌機あるいは超音波ホモジナイザー等で
乳化し、ｗ／ｏエマルジョンを調製する。次にこれを撹
拌下で水中で乳化して（ｗ／ｏ）／ｗエマルジョンとし
たのち、減圧下で有機溶媒を留去させて生体分解性重合
体を析出させ、マイクロスフェアを得る方法。

【００１０】（例えば、特公平１−５７０８７、特開昭
６３−２３３９２６、特開平１−２２１３２８、特開平
４−２０８２３１、等） ｂ）生体分解性重合体の良溶媒溶液に生理活性物質を溶
解あるいは分散させ、これを撹拌下で水中に乳化させ、
ｏ／ｗエマルジョンとしたのち、減圧下で有機溶媒を留
去してマイクロスフェアを得る方法。

【００１１】（例えば、特公昭６３−３６２９０、特開
昭５７−９３９１２、特開平４−４６１１５、特開平４
−４６１１６、特開平４−７４１１７、等） これらの方法に共通するのは、製造工程中に水を使用
し、さらに何らかの方法で水相と有機溶媒相とを撹拌し
て乳化せねばならない点である。従って生理活性物質が
水溶性の場合には、溶液状態で有機溶媒と接触し、強い
撹拌ストレスを受けることとなる。

【００１２】一方、生理活性ポリペプチドまたはタンパ
ク質は、水溶液の状態で有機溶媒と接触すると水／有機
溶媒界面での変性を受ける場合が多く、特に撹拌下では
接触界面の面積が増加するため変性が促進されることが
知られている。事実、本発明者らの知見によれば、顆粒
球コロニー形成刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の水溶液に塩化
メチレンを加えて撹拌した場合、Ｇ−ＣＳＦが著しく変
性することを確認している。従って、上記の製造方法で
はこれら生理活性ポリペプチドまたはタンパク質をマイ
クロスフェア内に安定に封入できない場合が生じる。

【００１３】封入時の安定化を目的とした製法改良とし
て、生理活性タンパク質水溶液をステアリン酸アルミニ
ウムで増粘させた大豆油と乳化してｗ／ｏエマルジョン
とし、これを更に生体分解性重合体のアセトニトリル溶
液と乳化してｗ／ｏ（大豆油）／ｏ（アセトニトリル）
エマルジョンとしたのち、流動パラフィンで有機溶媒を
抽出してマイクロスフェアを得る方法も提案されてい
る。

【００１４】この方法はタンパク質変性作用の少ない大
豆油により水相と有機溶媒相を遮蔽して、生理活性タン
パク質と有機溶媒との接触を防止しようとするものであ
る。しかしながら、この方法は操作が煩雑であるばかり
か、マイクロスフェアの構造が生体分解性重合体中に複
数の大豆油相を含む二重構造となるため、粒子径が１０
０〜５００μｍと大きくなり、注射で投与するには問題
がある。

【００１５】このように、生体分解性重合体のマイクロ
スフェア内に生理活性ポリペプチドまたはタンパク質、
特に有機溶媒との界面接触で変性しやすいタンパク質を
安定に封入させる方法は、本発明者らの知る限り得られ
ていない。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、生理
活性ポリペプチドまたはタンパク質を、変性を伴わずに
生体分解性重合体で被覆させるマイクロスフェア製剤お
よびその製造方法を提供することにある。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記の変
性を回避する方法について鋭意研究した結果、生理活性
ポリペプチドまたはタンパク質は、凍結乾燥物等の固体
状態であれば生体分解性重合体の良溶媒に対して比較的
安定であることを見いだした。さらにはこの中に水溶性
高分子が共存すると、微粉砕化の過程で生理的ストレス
を与えても変性せず、この微粉末を実質的に水を用いな
い方法で生体分解性重合体で被覆すれば安定性を確保し
つつマイクロスフェアが製造できることを見いだし本発
明を完成するに至った。

【００１８】すなわち、本発明に従えば、生体分解性重
合体を主成分とする壁物質中に、生理活性ポリペプチド
またはタンパク質を含む微粉末を分散させた、ヒトまた
は動物に注射可能なマイクロスフェアであって、次の方
法で製造される。

【００１９】該微粉末が ａ）生理活性ポリペプチドまたはタンパク質、 ｂ）水溶性高分子 を必須成分とした、粒子径１０μｍ以下の微粉末であ
り、これを実質的に水に用いない方法で生体分解性重合
体を主成分とする壁物質中に分散させることを特徴とす
る、マイクロスフェア製剤およびその製造方法が提供さ
れる。

【００２０】本発明では上記ａ），ｂ）から得られた混
合物を、壁物質の共存下で微粉砕して、所定の微粉末を
得、これを壁物質中に分散させることもできる。

【００２１】以下本発明を更に詳述する。

【００２２】本発明で使用される生理活性ポリペプチド
またはタンパク質には特に制限はなく、例えば以下のも
のが挙げられる。

【００２３】副腎皮質刺激ホルモン、アンジオテンシ
ン、血液凝固因子、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモ
ン放出因子、細胞成長調節因子（例えば、ＥＧＦ、ＴＧ
Ｆ−α、ＴＧＦ−β、等）、エンドルフィン、エンケフ
ァリン、胃酸分泌抑制ペプチド、成長ホルモン、造血因
子（例えば、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＣＳＦ類、ＥＰＯ、
ＴＰＯ、等）、インシュリン、インターフェロン、オキ
シトシン、上皮小体ホルモン、ソマトスタチン、バソプ
レッシン、腫瘍壊死因子、スーパーオキサイドジスムタ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼ、等 これらの中で本発明では水と生体分解性重合体の良溶媒
との界面で変性を受けやすいものが特に適している。

【００２４】これらの生理活性物質の微粉末中の配合量
は、所望とする治療効果の強度と、生体内に投与されて
からの持続期間とから任意に設定されるが、通常は０．
００１〜９９．５％、好ましくは０．０１〜９９％の範
囲である。９９．５％を越えると水溶性高分子の配合比
率が低下し、安定化効果が損なわれるので好ましくな
い。

【００２５】また、本発明では、生理活性ポリペプチド
またはタンパク質の微粉末を調製する際の変性を防止す
るために水溶性高分子が配合されるが、この水溶性高分
子には特に制限はなく、例えば以下のものが挙げられ
る。

【００２６】タンパク質：アルブミン、ゼラチン、コラ
ーゲン、等 多 糖 類：アルギン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫
酸、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸およびこれらの塩
類、ならびにデキストラン、アルギン酸プロピレングリ
コール、ペクチン、アラビアガム、等 セルロース誘導体：メチルセルロース、ヒドロキシエチ
ルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ならび
にカルボキシメチルセルロースおよびその塩類、等 ビニル系重合体：ポリビニルアルコール、ポリビニルピ
ロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリヒドロキシ
（メタ）アクリレート、ポリアクリルアミドならびにカ
ルボキシビニルポリマー、ポリ（メタ）アクリル酸およ
びその塩類、 多価アルコール：ポリエチレングリコール、ポリプロピ
レングリコール、等 これらの微粉末中での配合量は、０．５〜３０％、好ま
しくは１〜１５％である。０．５％未満では本発明の安
定化効果が得られず、３０％を越えると安定化効果が頭
打ちとなるばかりか、生体内に投与したのち生体液によ
り水溶性高分子が膨潤し、膨潤圧によりマイクロスフェ
アが破壊される恐れがあるため好ましくない。

【００２７】また、生理活性物質と水溶性高分子とから
成る粉末に壁物質を混合し、微粉砕することもできる。
微粉砕時の粉末に対する壁物質の混合比は１：１〜１：
１０００程度である。

【００２８】本発明の微粉末中には、生理活性ポリペプ
チドまたはタンパク質および水溶性高分子以外に、目的
に応じて公知の補助成分の１種または２種以上を添加で
きる。補助成分としては以下のものが挙げられ、その配
合量は適宜決定される。

【００２９】賦形剤：糖類：ソルビトール、マンニトー
ル、マルトース、ラクトース、ラフィノース、サッカロ
ース、トレハロース、等 アミノ酸：グリシン、メチオニン、ヒスチジン、アルギ
ニン、アスパラギン、グルタミンならびにアスパラギン
酸、グルタミン酸およびこれらの塩類、等 ｐＨ調整剤： 塩類、水酸化ナトリウム、ならびに酢
酸、乳酸、クエン酸、マレイン酸、リン酸およびこれら
の塩類、等 浸透圧調整剤：塩化ナトリウム、塩化カリウム、等 界面活性剤： ポリソルベート２０、ポリソルベート８
０、等 次に、本発明で使用される生体分解性重合体としては、
以下のものが挙げられる。

【００３０】ポリ脂肪酸エステル：ポリ乳酸、ポリグリ
コール酸、ポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体、ポリ
−ε−カプロラクトン、ポリ（乳酸／カプロラクトン）
共重合体、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリ−β−ヒ
ドロキシ酪酸、ポリ（β−ヒドロキシ酪酸／吉草酸）共
重合体、等 ポリ酸無水物：ポリカルボキシフェノキシ酢酸、ポリカ
ルボキシフェノキシ吉草酸、ポリカルボキシフェノキシ
オクタン酸、ポリ（ビスカルボキシフェノキシプロパン
／セバシン酸）共重合体、等 ポリアルキル−α−シアノアクリレート：ポリブチル−
２−シアノアクリレート等 ポリアルキレンオキサレート：ポリテトラメチレンオキ
サレート、等 ポリオルソエステル：ポリ（３，９−ビス−（エチリデ
ン−２，４，８，１０−テトラオキソスピロ［５，５］
ウンデカン）／１，６−ヘキサンジオール）共重合体、
ポリ（３，９−ビス−（エチリデン−２，４，８，１０
−テトラオキソスピロ［５，５］ウンデカン）／シクロ
ヘキサンジメタノール）共重合体、等 ポリカーボネート：ポリエチレンカーボネート、ポリエ
チレンプロピレンカーボネート、等 これらの分子量は１，０００〜２００，０００、好適に
は５，０００〜１００，０００のものが使用される。

【００３１】生理活性物質を含む微粉末は、生体分解性
重合体から成る壁物質中に分散されるが、微粉末と生体
分解性重合体との配合比率は、１：１〜１：１０００、
好適には３０：７０〜１：９９である。微粉末の配合比
率が１：１０００を下まわると製造中の容器への付着ロ
スの割合が大きく、逆に１：１を越えるとマイクロスフ
ェアの成形性が悪くなったり、微粉末の凝集によりマイ
クロスフェア内での分布が不均一となるので好ましくな
い。

【００３２】次に、本発明によるマイクロスフェアの製
造方法を説明する。

【００３３】本発明では、まず生理活性ポリペプチドま
たはタンパク質と水溶性高分子を必須成分とする粉末を
調製し、これを単独もしくは壁物質の共存下で微細粉砕
したのち、実質的に水を用いない従来公知の方法で生体
分解性重合体を被覆させてマイクロスフェアを得る。

【００３４】粉末の調製法としては、生理活性ポリペプ
チドまたはタンパク質と水溶性高分子とを水溶液中で混
合し、これを生理活性を保ったまま粉末化できる方法で
あれば特に制限はないが、好ましくは凍結乾燥法であ
る。なお、生理活性ポリペプチドまたはタンパク質の粉
末と水溶性高分子の粉末とを、物理的に混合したのみで
は本発明の効果は得られない。

【００３５】微細化の方法も特に制限はないが、好まし
い例としては、凍結乾燥品または凍結乾燥品と生体分解
性重合体との混合物をジェットミルで微細化するか、あ
るいは生体分解性重合体の有機溶媒溶液中に凍結乾燥品
を加え、これをポリトロンカッターまたは超音波ホモジ
ナイザー等で粉砕する方法が挙げられる。

【００３６】微粒子の径は１０μｍ以下、好ましくは５
μｍ以下である。注射での投与に適したマイクロスフェ
アの粒子径は約２００μｍ以下、好ましくは１５０μｍ
以下である。微粉末の径が大きいとマイクロスフェア内
での分散が不均一となり、生理活性物質が投与後初期に
放出されてしまう（初期バースト）ため好ましくない。

【００３７】生理活性物質と水溶性高分子との水溶液を
スプレードライ法により微粉末とすることも考えられ
る。しかし、スプレードライ法では粉末の収率を上げる
ためには乾燥温度を高めるか乾燥路の距離を長くせねば
ならない。乾燥温度の上昇はタンパク質のように熱的に
不安定な物質に対しては好ましくなく、乾燥路を長くす
るのは生産性の面から問題がある。

【００３８】生理活性物質を含有する固体粉末を工程中
に水を用いずに生体分解性重合体のマイクロスフェア内
に封入する処理は一般には以下に述べる相分離法により
行われる。すなわち、 （ａ）生体分解性重合体の非水良溶媒溶液中に生理活性
物質の粉末を分散する工程。

【００３９】（ｂ）該分散液に、いわゆる非溶媒（また
はコアセルベーション剤）、すなわち生体分解性重合体
に対して貧溶媒の有機液体を添加する工程。これにより
コアセルベーション（または相分離）が起こり、生体分
解性重合体は分散した生理活性物質に付着し、未発達
（硬化前）のマイクロスフェアが形成される。

【００４０】（ｃ）未発達のマイクロスフェアから残っ
ている有機溶媒を抽出し、該分散液に、良溶媒および非
溶媒を併せた容量に対して過剰量のいわゆる硬化液体を
添加することにより、それらを硬化する工程。

【００４１】（ｄ）当該技術部分野で一般的に知られて
いる任意の方法によって、硬化したマイクロスフェアを
洗浄し、そして該マイクロスフェアを乾燥する工程を含
む。

【００４２】が開示されている。

【００４３】本発明において使用できる溶媒は次の通り
である。

【００４４】生体分解性重合体の良溶媒：トルエン、キ
シレン、クロロホルム、塩化メチレン、酢酸メチル、酢
酸エチル、アセトン、テトラヒドロフラン、ジオキサ
ン、アセトニトリル、ヘキサフルオロイソプロパノー
ル、等 非溶媒（コアセルベーション剤）： 非相溶性高分子 ：ポリブタジエン、ポリジメチルシロ
キサン、等 植物油 ：大豆油、アマニ油、キリ油、綿実
油、オリーブ油、ツバキ油、ヒマシ油、トウモロコシ
油、ナタネ油、ヤシ油、小麦油、ケシ油、シイタケ油、
エゴマ油、ミカン油、レモン油、等 硬化液体： アルカン炭化水素：ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサ
ン、等 フルオロ炭化水素：１，１，２−トリクロロトリフルオ
ロエタン、トリクロロフルオロメタン、等 アルコール、多価アルコール、多価アルコールエステル Ｃ１２〜１８脂肪酸のエチルまたはイソプロピルエステ
ル：ステアリン酸エチル、ステアリン酸イソプロピル、
オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミ
チン酸イソプロピル、等 植物油：大豆油、ゴマ油、ヒマシ油、等 非相溶性高分子：ポリブタジエン、ポリジメチルシロキ
サン、等 本発明の効果の作用機序は未だ明確ではないが、恐らく
は粉末内の生理活性ポリペプチドまたはタンパク質が水
溶性高分子中に均一分散するため有機溶媒との接触が阻
害され、さらには水溶性高分子との何らかの相互作用に
より、微粉砕化の物理的ストレスに対して生理活性ポリ
ペプチドまたはタンパク質の構造変化が生じにくくなる
ためと推察される。

【００４５】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を更に詳述する
が、本発明が以下の実施例に限定されるものではないこ
とは言うまでもない。

【００４６】実施例１ １０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解した５００μｇ
／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ水溶液５０ｍｌ、１５％マンニトー
ル水溶液６．９ｍｌ、９．３８％ゼラチン水溶液２．０
ｍｌ、１％ Ｔｗｅｅｎ−２０水溶液０．２５ｍｌを混
合し、全量を５９．１５ｍｌとした。この溶液をガラス
製バイアルに充填し、凍結乾燥（バーチス社製凍結乾燥
機Ｍｏｄｅｌ １５−ＳＲＣ−３Ｘ−ＣＲ）してＧ−Ｃ
ＳＦおよびゼラチン含有の凍結乾燥品を得た。この凍結
乾燥品をジェットミル（セイシン企業製Ｍｏｄｅｌ Ａ
−０）を用いて圧力６０ｐｓｉで粉砕した。

【００４７】次に、ポリ（乳酸／グリコール酸）共重合
体（乳酸：グリコール酸＝５０：５０モル、平均分子量
２０，０００）２００ｍｇをガラス製試験管に入れ、塩
化メチレン４ｍｌを加えて溶解した。これに前記のＧ−
ＣＳＦおよびゼラチン含有の微粉末６ｍｇを入れ、ボル
テックスミキサーで撹拌して分散させた。

【００４８】この分散液を容量２０ｍｌのガラスビーカ
ーに移し、室温でマグネチックスターラにて撹拌しつつ
シリコン油（信越シリコン、ＫＦ−９６−３５０ｃｓ）
１６ｍｌを滴下した。シリコン油の滴下に伴い凍結乾燥
品微粉末を内包したコアセルベートが形成された。

【００４９】次に、容量５００ｍｌのガラスビーカーに
ミリスチン酸イソプロピル３００ｍｌを入れ、室温でプ
ロペラ撹拌機にて１５０ｒｐｍの速度で撹拌しながら、
これにコアセルベート液を加えてコアセルベートを硬化
させ、マイクロスフェアを形成させた。約１０分後に撹
拌を止めてマイクロスフェアを沈殿させ、室温で一晩放
置したのち、ミリスチン酸イソプロピルをデカンテーシ
ョンした。マイクロスフェアにｎ−ヘプタン約１００ｍ
ｌを加え、ゆるく撹拌したのちｎ−ヘプタンをデカンテ
ーションし、残存するミリスチン酸イソプロピルを洗浄
した。ガラスビーカーに沈殿したマイクロスフェアを室
温で風乾し、スパーテルでガラス製試験管に回収した。
マイクロスフェアを更に洗浄するためにｎ−ヘプタン約
１０ｍｌを加えて振とうし、デカンテーションしたの
ち、室温減圧下で溶媒を蒸発させた。この時点で回収さ
れたマイクロスフェアは１５３ｍｇ、収率は７４．３％
であった。

【００５０】次にこのマイクロスフェアを約５０ｍｌの
ｎ−ヘプタンに分散させ、メッシュ隙間が３２μｍおよ
び７５μｍの篩いを用いて粒子径３２〜７５μｍの分画
を採取し、本発明のＧ−ＣＳＦ含有マイクロスフェアを
得た。

【００５１】評価例１ 実施例１で作成したマイクロスフェア２０ｍｇを容量
１．５ｍｌの蓋付きポリプロピレン製遠心チューブに取
り、これに塩化メチレン１ｍｌを加えて振とうした。マ
イクロスフェアが溶解し、凍結乾燥品微粉末の分散液が
得られた。この分散液を１０℃で１０，０００ｒｐｍ×
１０分間遠心分離し、ポリ（乳酸／グリコール酸）共重
合体の溶解した上澄を除去した。更に微粉末を洗浄する
ために、沈殿に塩化メチレン１ｍｌを加えて振とう分散
させ、遠心分離したのち上澄を除去する操作を４回繰り
返した。沈殿を室温減圧下で溶媒蒸発させたのち、０．
１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０
を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）０．５ｍｌに溶
解させ、Ｇ−ＣＳＦ量（非変性体）を高速液体クロマト
グラフィーにて定量した。結果を表−１に示す。

【００５２】実施例１のＧ−ＣＳＦおよびポリ（乳酸／
グリコール酸）共重合体の仕込み量から計算したマイク
ロスフェア２０ｍｇ中のＧ−ＣＳＦ量（計算量）に対し
て１０７．５％のＧ−ＣＳＦが検出され、本発明の調製
法ではＧ−ＣＳＦが変性を受けないことが確認された。

【００５３】

【表１】 実施例２ １０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した６６７
ｎｇ／ｍｌ腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）水溶液１０ｍｌ、１
５％マンニトール水溶液０．９ｍｌ、５％ゼラチン水溶
液０．３ｍｌを混合し、全量を１１．２ｍｌとした。こ
の溶液をガラス製バイアルに充填し、凍結乾燥してＴＮ
Ｆおよびゼラチン含有の凍結乾燥品を得た。この凍結乾
燥品９０ｍｇとポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体
（乳酸：グリコール酸＝５０：５０モル、平均分子量２
０，０００）３ｇを乳鉢で均一混合したのち、ジェット
ミル（セイシン企業製Ｍｏｄｅｌ Ａ−０）を用いて圧
力６０ｐｓｉで微粉砕した。

【００５４】この微粉末２．０６ｇを容量２００ｍｌの
ガラスビーカーに入れ、塩化メチレン４０ｍｌを加えて
ポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体を溶解し、ＴＮＦ
およびゼラチン含有の微粉末を分散させた。これに室温
でマグネチックスターラにて撹拌しつつシリコン油（信
越シリコン、ＫＦ−９６−３５０ｃｓ）１２０ｍｌを滴
下し、凍結乾燥品微粉末を内包したコアセルベートを形
成させた。

【００５５】次に、容量１０００ｍｌのガラスビーカー
にミリスチン酸イソプロピル６００ｍｌを入れ、室温で
プロペラ撹拌機にて２００ｒｐｍの速度で撹拌しなが
ら、これにコアセルベート液を加えてコアセルベートを
硬化させ、マイクロスフェアを形成させた。約１０分後
に撹拌を止めてマイクロスフェアを沈殿させ、室温で一
晩放置したのち、ミリスチン酸イソプロピルをデカンテ
ーションした。マイクロスフェアにｎ−ヘプタン約１０
０ｍｌを加え、ゆるく撹拌したのちｎ−ヘプタンをデカ
ンテーションし、残存するミリスチン酸イソプロピルを
洗浄した。ガラスビーカーに沈殿したマイクロスフェア
を室温で風乾し、スパーテルでガラス製試験管に回収し
た。マイクロスフェアを更に洗浄するためにｎ−ヘプタ
ン約１０ｍｌを加えて振とうし、デカンテーションした
のち、室温減圧下で溶媒を蒸発させた。

【００５６】次にこのマイクロスフェアを約５０ｍｌの
ｎ−ヘプタンに分散させ、メッシュ隙間が３２μｍおよ
び７５μｍの篩いを用いて粒子径３２〜７５μｍの分画
を採取し、本発明のＴＮＦ含有マイクロスフェアを得
た。

【００５７】評価例２ 実施例２で作成したマイクロスフェア３０ｍｇを容量
１．５ｍｌの蓋付きポリブロピレン製遠心チューブに取
り、これに塩化メチレン１ｍｌを加えて振とうした。マ
イクロスフェアが溶解し、凍結乾燥品微粉末の分散液が
得られた。この分散液を１０℃で１０，０００ｒｐｍ×
１０分間遠心分離し、ポリ（乳酸／グリコール酸）共重
合体の溶解した上澄を除去した。更に微粉末を洗浄する
ために、沈殿に塩化メチレン１ｍｌを加えて振とう分散
させ、遠心分離したのち上澄を除去する操作を４回繰り
返した。沈殿を室温減圧下で溶媒蒸発させたのち、１０
０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８）１ｍｌに溶解させ、ＴＮ
Ｆ量をエンザイムノアッセイで定量した。結果を表−２
に示す。

【００５８】実施例２のＴＮＦおよびポリ（乳酸／グリ
コール酸）共重合体の仕込み量から計算したマイクロス
フェア３０ｍｇ当たりのＴＮＦ量（計算量）に対して９
０．８％のＴＮＦが検出され、本発明の調製法ではＴＮ
Ｆが変性を受けないことが確認された。

【００５９】

【表２】 実施例３ １０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した１．３
５ｍｇ／ｍｌスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯ
Ｄ）水溶液１０ｍｌ、５％ゼラチン水溶液０．３ｍｌを
混合し、全量を１０．３ｍｌとした。この溶液をガラス
製バイアルに充填し、凍結乾燥してＳＯＤおよびゼラチ
ン含有の凍結乾燥品を得た。この凍結乾燥品１２０ｍｇ
とポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体（乳酸：グリコ
ール酸＝５０：５０モル、平均分子量２０，０００）４
ｇを乳鉢で均一混合したのち、ジェットミル（セイシン
企業製Ｍｏｄｅｌ Ａ−０）を用いて圧力６０ｐｓｉで
微粉砕した。

【００６０】この微粉末２．０６ｇを容量２００ｍｌの
ガラスビーカーに入れ、塩化メチレン４０ｍｌを加えて
ポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体を溶解し、ＳＯＤ
およびゼラチン含有の微粉末を分散させた。これに室温
でマグネチックスターラにて撹拌しつつシリコン油（信
越シリコン、ＫＦ−９６−３５０ｃｓ）１２０ｍｌを滴
下し、凍結乾燥品微粉末を内包したコアセルベートを形
成させた。

【００６１】次に、容量１０００ｍｌのガラスビーカー
にミリスチン酸イソプロピル６００ｍｌを入れ、室温で
プロペラ撹拌機にて２００ｒｐｍの速度で撹拌しなが
ら、これにコアセルベート液を加えてコアセルベートを
硬化させ、マイクロスフェアを形成させた。約１０分後
に撹拌を止めてマイクロスフェアを沈殿させ、室温で一
晩放置したのち、ミリスチン酸イソプロピルをデカンテ
ーションした。マイクロスフェアにｎ−ヘプタン約１０
０ｍｌを加え、ゆるく撹拌したのちｎ−ヘプタンをデカ
ンテーションし、残存するミリスチン酸イソプロピルを
洗浄した。ガラスビーカーに沈殿したマイクロスフェア
を室温で風乾し、スパーテルでガラス製試験管に回収し
た。マイクロスフェアを更に洗浄するためにｎ−ヘプタ
ン約１０ｍｌを加えて振とうし、デカンテーションした
のち、室温減圧下で溶媒を蒸発させた。

【００６２】次にこのマイクロスフェアを約５０ｍｌの
ｎ−ヘプタンに分散させ、メッシュ隙間が７５μｍおよ
び１８０μｍの篩いを用いて粒子径７５〜１８０μｍの
分画を採取し、本発明のＳＯＤ含有マイクロスフェアを
得た。

【００６３】評価例３ 容量７ｍｌのテフロン製蓋付バイアルに実施例３で作成
したマイクロスフェア３０ｍｇと放出液（１００ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ８））１ｍｌを加え、３７℃の恒温槽
中で７０ｓｔｒｏｋｅ／分の速度で振とうした。所定の
日時に放出液を遠心分離（３，０００ｒｐｍ×３分間）
により回収し、その中に含まれるＳＯＤ量をＳＯＤ活性
から定量した。また、遠心分離後に残ったマイクロスフ
ェアには新たに放出液１ｍｌを加えて放出試験を継続し
た。試験開始後４０日目までの累積放出率を図１に示
す。約４０日後の合計放出量は９５％を越えた。

【００６４】実施例３で作成したマイクロスフェアは１
日目の放出（初期バースト）が１２％と少なく、かつ約
３０日間にわたってほぼ一定速度でＳＯＤを放出するこ
とが確認された。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明によって製造されたマイクロスフェア剤
における生理活性物質の経時的放出量を示すグラフであ
る。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の製法によって得られる生理活性ポ
   リペプチドまたはタンパク質を有効成分として含有する
   マイクロスフェア製剤。 （１）生理活性ポリペプチドまたはタンパク質、および
   水溶性高分子を混合して粉末を調製し、 （２）上記（１）で得られた粉末を、単独または生体分
   解性重合体の共存下に微粉砕し、 （３）上記（２）で得られた微粉末を生体分解性重合体
   の溶液または生体分解性重合体の良溶媒に分散させるこ
   とを特徴とするマイクロスフェア製剤。
2. 【請求項２】 生理活性ポリペプチドまたはタンパク
   質、および水溶性高分子からなる微粉末の粒径が１０μ
   ｍ以下である請求項１記載のマイクロスフェア製剤。
3. 【請求項３】 マイクロスフェア製剤の粒径が２００μ
   ｍ以下である請求項１または２記載のマイクロスフェア
   製剤。
4. 【請求項４】 生理活性ポリペプチドまたはタンパク
   質、および水溶性高分子を凍結乾燥によって粉末化しす
   ることを特徴とする請求項１記載のマイクロスフェア製
   剤。