CN103285375A

CN103285375A - 藻蓝蛋白微球制剂及其制备方法

Info

Publication number: CN103285375A
Application number: CN2013101668167A
Authority: CN
Inventors: 欧瑜; 李克鹏
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2013-05-09
Filing date: 2013-05-09
Publication date: 2013-09-11

Abstract

本发明属于生物制药领域，具体涉及藻蓝蛋白微球制剂及其制备方法。将藻蓝蛋白和可生物降解天然高分子材质海藻酸钠，经过乳化、固化、分离、冷冻干燥等微球制备工艺制成海藻酸钠藻蓝蛋白微球，在模拟胃环境下释放小于5％，模拟肠环境下释放大于80％，可实现藻蓝蛋白的肠定向释放。本发明将藻蓝蛋白制备成蛋白微球制剂，不仅容易保存，还可以增加口服时的生物利用度。

Description

藻蓝蛋白微球制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种以海藻酸钠为主要材料包被藻蓝蛋白，制备载藻蓝蛋白微球的方法。

背景技术

藻蓝蛋白(Phycocyanin，PC)主要存在于蓝藻(Cyanophyta)、红藻(Rhodophyta)、隐藻(Cryptophyta)和少数甲藻(Pyrrophyta)中，是这些藻类进行光合作用的捕光色素之一。分离纯化的藻蓝蛋白在溶液中呈亮蓝色，并发出紫色荧光，在波长620nm具有特异吸收峰，可以A₆₂₀/A₂₈₀表示其纯度。藻蓝蛋白既可以作为天然色素广泛应用于食品、化妆品、染料等工业，同时也具有强烈荧光可制成荧光试剂、荧光探针、荧光示踪物等，用于临床医学诊断、免疫化学及生物工程等研究领域中。藻蓝蛋白的药理活性非常广泛，具有抗癌、抗氧化、治疗脑缺血损伤、治疗糖尿病等多种生物活性。这为藻蓝蛋白在功能性食物和医药领域的开发提供了重要的决策依据，因此藻蓝蛋白具有广阔的应用前景和较高的市场经济价值，但因其对光、热和酸碱敏感，稳定性差，易失活，限制了其大规模的开发应用。

微球是指药物分子分散或吸附在高分子聚合物中而形成的球形微粒，可以避免药物在口服途径中被消化道水解酶降解以及胃酸环境对药物的破坏，并能实现缓释、控释和靶向释药的目的，从而显著提高疗效，降低毒副作用。微球是蛋白类药物的一类重要的给药系统，因为蛋白从这类载体中的释放能够得到良好的控制，并可以避免在口服途径中被胃酸破坏以及被消化道酶的降解。目前主要的蛋白类微球制备技术是乳化-溶剂挥发法和喷雾干燥法，乳化-溶剂挥发法制备通常需要二氯甲烷、三氯甲烷等溶剂，存在残留问题，且易引起蛋白类药物变性，而喷雾干燥法制备工艺条件之一就是温度较高，一般在105℃以上，高温容易引起蛋白变性。本发明专利制备微球条件温和，设备简单，成本低廉。

发明内容

本发明目的在于提供一种海藻酸钠包被的藻蓝蛋白微球制剂及其制备方法。它采用藻蓝蛋白为包裹物，制备出适合肠道靶向给药的微球制剂，该方法工艺简单、制备过程易控、制备的微球质量稳定。

本发明的具体技术方案为：将海藻酸钠溶解于藻蓝蛋白溶液，通过磁力搅拌混匀，作为内水相。外油相采用液体石蜡，内加司盘80和吐温80作为复合乳化剂，氯化钙溶液作为固化剂。制备时，将外油相缓缓加入内水相中，室温下磁力搅拌子搅拌30min，形成油包水乳剂，固化剂氯化钙溶液通过恒流泵恒速滴入油包水乳剂，滴完后继续搅拌30min固化，然后加入5％吐温20，搅拌2min，抽滤，蒸馏水洗涤至无油星，冷冻干燥后获得微球。

海藻酸钠终浓度为2％-6％(w/v)；藻蓝蛋白终浓度为4mg/ml-16mg/ml；氯化钙终浓度为2.5％-10％(w/v)；油水相比为1∶1-4∶1(v/v)；司盘80∶吐温80为8∶3-8∶1(w/w)；复合乳化剂用量为1％-6％(w/v)。

微球的包埋率和载药量的测定

取一定质量的干燥微球，置于0.2mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)中，振荡，直至微球完全溶解，离心后吸取上清，经稀释后测定释放液的A₆₅₂和A₆₂₀，根据以下公式计算藻蓝蛋白含量、微球的包埋率和载药量。

其中，A₆₅₂、A₆₂₀表示释放溶液在652nm和620nm下的吸光度。

本发明选取的海藻酸钠是从海藻中提取的一种天然高分子钠盐，相对分子质量7～15万，不仅具有可调节性、生物相容性、缓释性、安全性等诸多特点，并且将其作为主要材料制备口服蛋白微球具有以下优点：在口服药物中加入可增大粘度，延长药物的释放时间，减少不良反应；利用微球的溶胀对pH值的依赖性，使得该制剂在胃中不溶胀，不崩解，而在肠道的中性或稍碱性环境中崩解，适用于肠道给药系统。

采用本方法制备得到的微球形态圆整，大小均匀，粒径分布窄。控制优化微球制备条件(藻蓝蛋白浓度、海藻酸钠浓度、氯化钙浓度、复合乳化剂配比及用量、油水相比、搅拌速度等)，可使藻蓝蛋白微球包埋率达到75％以上，载药量14％以上，药物在模拟胃环境中累计释放少于5％，在模拟肠环境中累计释放率大于85％，可实现藻蓝蛋白的肠定向释放。

附图说明

图1海藻酸钠藻蓝蛋白微球光学显微镜下形态。

A.放大100倍，B.放大400倍

图2海藻酸钠藻蓝蛋白微球粒径分布图。

图3海藻酸钠藻蓝蛋白微球体外累计释放曲线，纵坐标为藻蓝蛋白累计释放率，横坐标为释放时间，其中0-2h为模拟胃环境(pH1.2)，2-12h为模拟肠环境(pH7.4)。

具体实施方式

下面结合一些实例对发明做进一步详细说明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

10ml内水相通过藻蓝蛋白水溶液和海藻酸钠磁力搅拌混匀获得，其中藻蓝蛋白的浓度为2mg/ml，海藻酸钠浓度为5％(w/v)。液体石蜡20ml，其中以司盘80和吐温80作为乳化剂，司盘80∶吐温80＝8∶3，乳化剂用量为5％(w/v)，磁力搅拌混匀后作为外油相。在磁力搅拌下将外油相缓缓倒入内水相，600rpm/min，搅拌20min，形成均匀的W/O乳化体系。然后将30ml，5％氯化钙溶液(w/v)通过恒流泵逐滴加入到油包水乳剂中，继续搅拌30min固化，然后加入5％吐温20(w/v)，搅拌2min后，抽滤，蒸馏水洗涤至无油星，冷冻干燥得到干燥的海藻酸钠藻蓝蛋白微球。所得微球的藻蓝蛋白包埋率为57.73％，载药量为2.26％。

实施例2

10ml内水相通过藻蓝蛋白水溶液和海藻酸钠磁力搅拌混匀获得，其中藻蓝蛋白的浓度为2mg/ml，海藻酸钠浓度为4％(w/v)。20ml液体石蜡，其中以司盘80和吐温80作为乳化剂，司盘80∶吐温80＝8∶3，乳化剂用量为5％(w/v)，磁力搅拌混匀后作为外油相。在磁力搅拌下将外油相缓缓倒入内水相，600r/min，搅拌20min后形成均匀的W/O乳化体系。然后将30ml，7.5％氯化钙溶液(w/v)通过恒流泵逐滴加入到油包水乳剂中，继续搅拌30min固化，然后加入5％吐温20(w/v)，搅拌2min后，抽滤，蒸馏水洗涤至无油星，冷冻干燥得到干燥的海藻酸钠藻蓝蛋白微球。所得微球的藻蓝蛋白包埋率为53.59％，载药量为2.44％。

实施例3

10ml内水相通过藻蓝蛋白水溶液和海藻酸钠磁力搅拌混匀获得，其中藻蓝蛋白的浓度为8mg/ml，海藻酸钠浓度为4％(w/v)。20ml液体石蜡，其中用司盘80和吐温80作为乳化剂，司盘80∶吐温80＝8∶3，乳化剂用量为5％(w/v)，磁力搅拌混匀后作为外油相。在磁力搅拌下将外油相缓缓倒入内水相，600rpm/min，搅拌20min后形成均匀的W/O乳化体系。然后将30ml，5％氯化钙溶液(w/v)通过恒流泵逐滴加入到油包水乳剂中，继续搅拌30min固化，然后加入5％吐温20(w/v)，搅拌2min后，抽滤，蒸馏水洗涤至无油星，冷冻干燥得到干燥的海藻酸钠藻蓝蛋白微球。所得微球的藻蓝蛋白包埋率为76.20％，载药量为 12.44％。

实施例4

10ml内水相通过藻蓝蛋白水溶液和海藻酸钠磁力搅拌混匀获得，其中藻蓝蛋白的浓度为2mg/ml，海藻酸钠浓度为4％(w/v)。20ml液体石蜡，其中以司盘80和吐温80作为乳化剂，司盘80∶吐温80＝8∶3，乳化剂用量为5％(w/v)，磁力搅拌混匀后作为外油相。在磁力搅拌下将外油相缓缓倒入内水相，800r/min，搅拌20min后形成均匀的W/O乳化体系。然后将30ml，5％氯化钙溶液(w/v)通过恒流泵逐滴加入到油包水乳剂中，继续搅拌30min固化，然后加入5％吐温20(w/v)搅拌2min后，抽滤，蒸馏水洗涤至无油星，冷冻干燥得到干燥的海藻酸钠藻蓝蛋白微球。所得微球的藻蓝蛋白包埋率为57.66％，载药量为2.62％。

实施例5

10ml内水相通过藻蓝蛋白水溶液和海藻酸钠磁力搅拌混匀获得，其中藻蓝蛋白的浓度为8mg/ml，海藻酸钠浓度为5％(w/v)。20ml液体石蜡，其中以司盘80和吐温80作为乳化剂，司盘80∶吐温80＝8∶3，乳化剂用量为5％(w/v)，磁力搅拌混匀后作为外油相。在磁力搅拌下将外油相缓缓倒入内水相，1000rpm/min，搅拌20min形成均匀的W/O乳化体系。然后将30ml，5％的氯化钙溶液(w/v)通过恒流泵逐滴加入到油包水乳剂中，继续搅拌30min固化，然后加入5％吐温20(w/v)，搅拌2min后，抽滤，蒸馏水洗涤至无油星。冷冻干燥得到干燥的海藻酸钠藻蓝蛋白微球。所得微球的藻蓝蛋白包埋率为68.85％，载药量为9.86％。

实施例6

10ml内水相通过藻蓝蛋白水溶液和海藻酸钠磁力搅拌混匀获得，其中藻蓝蛋白的浓度为12mg/ml，海藻酸钠浓度为6％(w/v)。20ml液体石蜡，其中以司盘80和吐温80作为乳化剂，司盘80∶吐温80＝8∶3，乳化剂用量为5％(w/v)，磁力搅拌混匀后作为外油相。在磁力搅拌下将外油相缓缓倒入内水相，800rpm/min，搅拌20min后形成均匀的W/O乳化体系。然后将30ml，5％的氯化钙溶液(w/v)通过恒流泵逐滴加入到油包水乳剂中，继续搅拌30min固化，然后加入5％吐温20(w/v)，搅拌2min后，抽滤，蒸馏水洗涤至无油星。冷冻干燥得到干燥的海藻酸钠藻蓝蛋白微球。所得微球的藻蓝蛋白包埋率为76.31％，载药量为13.08％。

实施例7

海藻酸钠藻蓝蛋白微球形态和粒径检测

微球形态的观察：取少量干燥微球均匀分散于载玻片上，光学显微镜下观察微球形态。如图1所示，微球形态圆整，大小均匀，分散性良好。

微球粒径分布测定：利用激光粒径分析仪进行测定，结果见图2。所制备微球大小均匀，粒径分布范围窄，平均粒径为204.38μm。

实施例8

体外模拟胃肠环境下微球释放实验

取优化条件下所制备干燥海藻酸钠藻蓝蛋白微球20mg，置于4ml释放介质中，于37℃±0.5℃恒温摇床中以100rpm/min下振荡，每1h或2h取样测定藻蓝蛋白含量。其中，0-2h为模拟胃液环境(0.1mol/L盐酸溶液，pH1.2)，2h后微球转移至模拟肠液环境(0.2mol/L PBS，pH 7.4)。

由图3可知，海藻酸钠藻蓝蛋白微球在模拟胃液环境中释放较低，2h累计释放率小于5％。当转移到模拟肠液环境后，微球释放迅速增加，4h微球累计释放率达到75％以上，12h微球累计释放率高于85％。由此可见，微球具有良好的耐酸性，能够有效的避免胃液对藻蓝蛋白的破坏，达到肠靶向释药的目的。

Claims

1.一种海藻酸钠藻蓝蛋白微球，其特征在于：包括藻蓝蛋白与药物上可接受的载体组成微球。

2.根据权利1所述的海藻酸钠藻蓝蛋白微球，其特征在于：载体的制备材料为可生物降解的天然高分子材料。

3.根据权利1要求所述的海藻酸钠藻蓝蛋白微球，其特征在于：本微球适合口服给药途径。

4.一种权利要求1所述的海藻酸钠藻蓝蛋白微球的制备方法，其特征在于：将海藻酸钠溶解于藻蓝蛋白溶液，通过磁力搅拌混匀作为内水相，外油相采用液体石蜡，内加司盘80和吐温80作为复合乳化剂，氯化钙溶液作为固化剂。制备时，将外油相缓缓加入内水相中，室温下磁力搅拌形成均匀的油包水乳剂，然后固化剂氯化钙溶液通过恒流泵逐滴滴入油包水乳剂中，滴加完毕后继续搅拌固化。固化完成后加入吐温20搅拌，抽滤，蒸馏水洗涤，冷冻干燥后获得载藻蓝蛋白微球。

5.根据权利4要求所述的微球制备方法，其特征在于：藻蓝蛋白溶液浓度为2～12mg/ml。

6.根据权利4要求所述的微球制备方法，其特征在于：海藻酸钠浓度为3％～6％(w/v)。

7.根据权利4要求所述的微球制备方法，其特征在于：乳化剂为司盘80和吐温80，其配比为8∶0～8∶3，用量为1％～6％(w/v)。

8.根据权利4要求所述的微球制备方法，其特征在于：搅拌速度为400～1000r/min。

9.根据权利4要求所述的微球制备方法，其特征在于：氯化钙浓度为2.5～10％(w/v)。

10.根据权利4要求所述的微球制备方法，其特征在于：外油相∶内水相为1∶1～4∶1(v/v)。