ES2625685T3 - Composiciones de ácido nucleico-lipopolímero - Google Patents

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Jason Fewell
Danny H. Lewis
Khursheed Anwer
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Clsn Laboratories Inc
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Abstract

Una composición que comprende: (a) una mezcla de un lipopolímero catiónico y al menos 0,5 mg/mL de un ácido nucleico suspendido en una solución acuosa, donde el lipopolímero catiónico comprende una cadena principal de polietilenimina (PEI) unida covalentemente independientemente a grupos colesterol y polietilenglicol, y la relación molar de colesterol a polietilenimina es de 0,1 a y la relación molar de polietilenglicol a polietilenimina es de 0,1 a 10; y (b) un excipiente de relleno.

Description

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DESCRIPCION
Composiciones de acido nucleico-lipopoffmero Campo de la invencion
La invencion se refiere a formulaciones concentradas y estables que comprenden acido nucleico y lipopoffmero y a composiciones, metodos de preparacion y aplicaciones de los mismos. En consecuencia, esta invencion implica los campos de la biologfa molecular y la bioqmmica.
Antecedentes de la invencion
Los vectores de suministro de genes sinteticos tienen una ventaja considerable sobre los vectores virales debido a un mejor cumplimiento relacionado con la seguridad, una qmmica sencilla y una fabricacion rentable. Sin embargo, debido a la baja eficiencia de transfeccion de los vectores sinteticos en comparacion con la de los vectores virales, la mayor parte del desarrollo en los sistemas de suministro de genes sinteticos se ha centrado en mejorar la eficacia del suministro. Por consiguiente, se ha prestado poca atencion al desarrollo farmaceutico de sistemas de suministro sinteticos, aunque se han identificado problemas en la estabilidad de la formulacion, el escalado y la flexibilidad de la dosificacion. Los farmacos que contienen ADN que se autoensamblan en nanoparffculas presentan a menudo una pobre estabilidad, particularmente cuando la formulacion es una suspension acuosa. En tales formulaciones, el ADN con vectores sinteticos ffpicamente se agregara con el tiempo, especialmente en las concentraciones requeridas para una dosificacion optima en un entorno clmico. Tales formulaciones son a menudo diffciles de preparar en concentraciones de ADN > 0,3 mg/mL, lo que limita sus aplicaciones comerciales, especialmente para la administracion local, donde las limitaciones de volumen limitaffan una dosificacion flexible. La agregacion de ADN reduce o elimina la actividad del ADN y por lo tanto hace que la composicion no sea adecuada para su uso en un tratamiento.
Esta inestabilidad ffsica es una de las razones subyacentes para la perdida de actividad de transfeccion. La manifestacion de la ruptura o fusion de las parffculas debido a la alta curvatura de la bicapa lipfdica o la disociacion ffsica del ffpido del ADN tambien se han postulado como posibles razones subyacentes para la pobre estabilidad y la agregacion de complejos de suministro de genes basada en ffpidos cationicos. La modificacion qmmica, tal como la hidrolisis oxidativa de los vectores de suministro, puede tambien contribuir a la inestabilidad de las parffculas.
Debido a la escasa estabilidad, los ensayos clmicos iniciales requeffan que las formulaciones de ADN se prepararan al lado de la cama. No tener la capacidad de preparar y almacenar el producto clmico en las concentraciones necesarias para una dosificacion optima es un obstaculo importante en la practica clmica general y la comercializacion de los productos de ADN no virales. Esto requeriffa que los medicos entrenaran en la formulacion de farmacos y plantearan medidas de control de calidad en el sitio.
La liofilizacion es un metodo util para mejorar la estabilidad a largo plazo de una cantidad de compuestos farmaceuticos. Sin embargo, este proceso no es normalmente adecuado para secar complejos de ADN con vectores sinteticos ya que tiende a alterar sus propiedades fisicoqmmicas y da como resultado la agregacion y la perdida de transfeccion tras la reconstitucion.
Se han intentado varios enfoques para evitar la agregacion de la formulacion y el dano durante la liofilizacion. En algunos casos, la liofilizacion de complejos de ADN en presencia de un crioprotector tal como azucares de bajo peso molecular, dextranos y polietilenglicol puede proporcionar una mejor estabilidad al producto, pero este enfoque no parece mejorar la flexibilidad de dosificacion. La adicion de azucares es a menudo el enfoque mas utilizado para este proposito. Se ha encontrado que muchos de los azucares de ensayo previenen hasta cierto punto el dano a la formulacion y la agregacion de parffculas, pero la calidad de este efecto vaffa con el tipo de azucar y el vector de suministro utilizado.
Aunque la liofilizacion proporciona alguna mejora en la vida util de la formulacion, las condiciones requeridas para producir productos de ADN liofilizados permiten solo aplicaciones farmaceuticas limitadas. Incluso con los azucares lioprotectores mas eficaces, se requiere una relacion molar azucar/ADN muy alta (ffpicamente mayor de 1.000:1) para la estabilidad. Como resultado, el producto liofilizado a menudo debe diluirse por un factor muy grande para obtener una formulacion isotonica, lo que da como resultado una disminucion de la concentracion final de ADN para la concentracion de ADN previamente liofilizada. Para muchos portadores cationicos, la concentracion final de ADN puede ser ffpicamente de aproximadamente 0,1-0,2 mg/mL, y a menudo inferior a 0,1 mg/mL. Aunque las formulaciones de baja concentracion son suficientes para los estudios in vitro, su aplicacion clmica puede estar limitada debido al alto volumen requerido para la dosificacion optima. Por ejemplo, a la concentracion optima de azucar necesaria para la estabilidad, puede ser necesario diluir una dosis de 1 mg de ADN en 5-10 mL para mantener la isotonicidad, que es un volumen demasiado grande para la administracion local in vivo. Esta limitacion farmaceutica, prohibitiva para una dosificacion flexible, es uno de los principales contribuyentes para una eficacia por debajo del optimo de sistemas de administracion
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de genes sinteticos en ensayos cffnicos en humanos y justifica la necesidad de formulaciones de ADN mas concentradas que sean estables y biologicamente activas.
El documento WO02/22174 de EXPRESSION GENETICS INC describe un lipopoffmero cationico biodegradable que comprende polietilenimina ramificada (PEI), un ancla lipfdica derivada de colesterol y un enlazador biodegradable que enlaza covalentemente la PEI ramificada y el ancla lipfdica derivada de colesterol. Los lipopoffmeros cationicos se usan en el suministro de acido nucleico a diversos organos o tejidos despues de la administracion local o sistemica. Se menciona el polietilenglicol (PEG) para uso como un enlazador para conjugar ligandos dirigidos a grupos amina de la PEI.
El documento WO 2005/560934 de EXPRESSION GENETICS INC describe un lipopoffmero cationico biodegradable que comprende una polietilenimina (PEI), un ffpido y un poffmero hidrofflico biocompatible. El ffpido y el poffmero hidrofflico biocompatible estan directamente enlazados a la cadena principal de PEI. Alternativamente, el ffpido esta enlazado a la cadena principal de PEI a traves del poffmero hidrofflico biocompatible. Estos lipopoffmeros hidrofflicos pueden usarse para suministrar acidos nucleicos a diversos organos y tejidos despues de la administracion local o sistemica.
Sumario de la invencion
La invencion proporciona composiciones que demuestran una estabilidad inesperada con una alta concentracion de acido nucleico y que aumentan la eficacia y la flexibilidad de la dosificacion de la transfeccion de acido nucleico. Las composiciones descritas en la presente memoria pueden ser liofilizadas y reconstituidas eficientemente a varias concentraciones de acido nucleico, incluyendo altas concentraciones de acido nucleico, sin perder actividad biologica o agregacion de acido nucleico.
En un aspecto, la invencion proporciona composiciones, preferiblemente composiciones farmaceuticas, que comprenden una mezcla de un lipopoffmero cationico y al menos aproximadamente 0,5 mg/mL de un acido nucleico, donde la mezcla se suspende en una solucion acuosa. El lipopoffmero cationico comprende una estructura principal de polietilenimina (PEI) que tiene grupos colesterol y polietilenglicol unidos independientemente covalentemente entre sr La relacion molar de colesterol con respecto a la cadena principal de polietileno esta dentro de un intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 y la relacion molar de polietilenglicol con respecto a la cadena principal del poffmero cationico esta dentro de un intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10. La composicion incluye un excipiente de relleno. En ciertos aspectos, la mezcla de acido nucleico y lipopoffmero forma un complejo. En ciertos aspectos, la composicion comprende acido nucleico condensado. La cantidad de acido nucleico que se condensa dependera generalmente de la composicion del acido nucleico y de las condiciones bajo las cuales se prepara la composicion. Las composiciones opcionales o preferidas se exponen en las reivindicaciones 2 y 11.
La invencion tambien proporciona un procedimiento para fabricar una composicion farmaceutica segun se expone en la reivindicacion 12.
La invencion proporciona adicionalmente una composicion de acuerdo con la reivindicacion 13, que es una composicion farmaceutica seca de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
En el presente documento se describen composiciones liofilizadas de un acido nucleico y un lipopoffmero. Una composicion liofilizada, preferiblemente una composicion farmaceutica liofilizada de la invencion comprende una mezcla de un excipiente de relleno, un acido nucleico condensado y un lipopoffmero cationico. Como se ha indicado anteriormente, el lipopoffmero cationico incluye una cadena principal de poffmero cationico que tiene colesterol y polietilenglicol unidos covalentemente al mismo y en donde la relacion molar de colesterol con respecto a la cadena principal de poffmero cationico esta dentro de un intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 y la relacion molar de polietilenglicol con respecto a la cadena principal de poffmero cationico esta dentro de un intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10.
La invencion proporciona adicionalmente composiciones para uso en el tratamiento de enfermedades y/o trastornos por ejemplo transfectando diversas celulas y tejidos, como se expone en la reivindicacion 14 y en la reivindicacion 15.
Breve descripcion de los dibujos
La FIG. 1 es un esquema de un proceso de fabricacion de la invencion.
La FIG. 2 muestra graficos del tamano de parffcula de acidos nucleicos en estados concentrado y no concentrado.
La FIG. 3 muestra los resultados de un experimento electroforetico para mostrar la condensacion de acido nucleico.
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La FIG. 4 muestra graficos de la actividad de transfeccion de acuerdo con una realizacion adicional de la invencion.
La FIG. 5A y la FIG. 5B son fotograffas de cortes neurales que muestran los resultados del tratamiento con lipopoKmero con y sin IL-12.
La FIG. 6 muestra dos graficos de la eficacia anticancengena de IL-12 con lipopolfmero en comparacion con los controles.
La FIG. 7A y la FIG. 7B son graficos del tamano de partfcula de diversas mezclas de acido nucleico/polfmero cationico.
La FIG. 8A y la FIG. 8B son graficos de la expresion de luciferasa como resultado de diversas mezclas de acido nucleico/polfmero cationico.
La FIG. 9 es un grafico que muestra la actividad biologica de una composicion de acido nucleico/lipopolfmero cationico despues de un almacenamiento a largo plazo.
Descripcion detallada
Antes de divulgar y describir la invencion, debe entenderse que esta invencion no esta limitada a las estructuras particulares, etapas de proceso o materiales descritos en la presente memoria, sino que se extiende a sus equivalentes como senan reconocidos por los expertos en las materias pertinentes. Tambien debe entenderse que la terminologfa empleada en la presente memoria se utiliza con el fin de describir unicamente realizaciones particulares y no pretende ser limitativa puesto que el alcance de la invencion estara limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes.
Debe observarse que, tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Tal como se usa en la presente memoria, los terminos "acido nucleico condensado" y "acido nucleico parcialmente condensado" se usan para referirse a un acido nucleico que ha sido puesto en contacto con un lipopolfmero cationico de la invencion. En ciertos aspectos, el acido nucleico condensado permanece en contacto con el lipopolfmero cationico. Los acidos nucleicos condensados normalmente ocupan un volumen significativamente menor que los acidos nucleicos no condensados. Sin embargo, se reconoce que la cantidad de acido nucleico condensado puede variar con el entorno local (por ejemplo, medio lipfdico en oposicion al medio acuoso). En diversos aspectos de la invencion, los acidos nucleicos condensados son aquellos en nanopartfculas de acido nucleico y lipopolfmero cationico que tienen un tamano de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 300 nm, mas preferiblemente de aproximadamente 50-200, e incluso mas preferiblemente de aproximadamente 50-150 nm. "Acido nucleico parcialmente condensado" se refiere a un acido nucleico que ha sido puesto en contacto con un lipopolfmero cationico de la invencion en el que el acido nucleico no esta totalmente condensado, pero todavfa ocupa un volumen significativamente menor que el acido nucleico no condensado.
Tal como se usa en la presente memoria, el termino "complejo" significa acido nucleico que esta asociado con lipopolfmero, preferiblemente, lipopolfmero cationico. Un complejo que incluye acido nucleico condensado y lipopolfmero cationico normalmente existira como partfculas, preferiblemente como nanopartfculas.
Tal como se usa en la presente memoria, los terminos "que se transfecta" y "transfeccion" se refieren al transporte de acidos nucleicos desde el entorno externo a una celula al entorno celular interno, con particular referencia al citoplasma y/o al nucleo celular. Sin estar limitado por ninguna teona en particular, debe entenderse que los acidos nucleicos pueden ser suministrados a las celulas bien despues de ser encapsulados dentro o adhiriendose a uno o mas complejos de polfmero cationico / acido nucleico o de ser arrastrados con ellos. Los casos particulares de transfeccion suministran un acido nucleico a un nucleo celular.
Tal como se usa en la presente memoria, "sujeto" se refiere a un mairnfero que puede beneficiarse de la administracion de una composicion farmacologica o metodo de esta invencion. Ejemplos de sujetos incluyen humanos, y pueden incluir tambien otros animales tales como caballos, cerdos, ganado, perros, gatos, conejos y mai^eras acuaticos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, "composicion" se refiere a una mezcla de dos o mas compuestos, elementos o moleculas. En algunos aspectos, el termino "composicion" puede usarse para referirse a una mezcla de un acido nucleico y un sistema de administracion.
Tal como se usa en la presente memoria, la "relacion N:P" se refiere a la relacion molar de nitrogenos ammicos en el lipopolfmero cationico con grupos funcionales y los grupos fosfato en el acido nucleico.
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Tal como se usa en la presente memoria, las "propiedades fisicoqmmicas" se refieren a diversas propiedades tales como, sin limitacion, el tamano de partmula y la carga superficial de complejos de acido nucleico con un polfmero cationico, pH y osmolaridad de la solucion de partmulas, etc.
Tal como se usa en la presente memoria, los terminos "administracion", "que se administra" y "suministro" se refieren a la manera en que se presenta una composicion a un sujeto. La administracion se puede llevar a cabo mediante diversas vfas conocidas en la tecnica tales como oral, parenteral, transdermica, inhalacion, implantacion, etc. Por lo tanto, se puede lograr una administracion oral al tragar, masticar, succionar una forma de dosificacion oral que comprende la composicion. La administracion parenteral se puede conseguir inyectando una composicion por via intravenosa, intraarterial, intramuscular, intraarticular, intratecal, intraperitoneal, subcutanea, etc. Los inyectables para tal uso se pueden preparar en formas convencionales, ya sea en forma de una solucion o suspension lfquida, o en una forma solida que sea adecuada para la preparacion como una solucion o suspension en un lfquido antes de la inyeccion, o como una emulsion. Adicionalmente, la administracion transdermica se puede lograr aplicando, pegando, laminando, uniendo, vertiendo, presionando, frotando, etc., una composicion transdermica sobre una superficie de la piel. Estos y otros metodos de administracion son bien conocidos en la tecnica. En un aspecto espedfico, la administracion puede incluir suministrar una composicion a un sujeto de manera que la composicion circule sistematicamente y se una a una celula diana para ser absorbida por endocitosis.
Tal como se usa en la presente memoria, el termino "acido nucleico" se refiere a ADN y ARN, asf como a congeneres sinteticos de los mismos. Ejemplos no limitantes de acidos nucleicos pueden incluir ADN plasirndico que codifica protemas o secuencias de nucleotidos productoras de ARN inhibidor, secuencias sinteticas de nucleotidos de hebras sencillas o dobles, de sentido erroneo, antisentido, sin sentido, asf como reguladores de activacion y desactivacion que controlan protemas, peptidos, y la produccion de acido nucleico. Ademas, los acidos nucleicos tambien pueden incluir, sin limitacion, ADN genomico, ADNc, ARNpi, ARNph, ARNm, ARNt, ARNr, secuencias tubridas o secuencias sinteticas o semisinteticas, y de origen natural o artificial. En un aspecto, una secuencia de nucleotidos tambien puede incluir aquellas que codifican para la smtesis o inhibicion de una protema terapeutica. Ejemplos no limitativos de tales protemas terapeuticas pueden incluir agentes anticancengenos, factores de crecimiento, agentes hipoglucemicos, agentes antiangiogenicos, antfgenos bacterianos, antfgenos virales, antfgenos tumorales o enzimas metabolicas. Ejemplos de agentes anticancengenos pueden incluir interleuquina 2, interleuquina 4, interleuquina 7, interleuquina 12, interleuquina 15, interferon a, interferon p, interferon y, factor estimulante de colonias, factor estimulante granulocitos- macrofagos, agentes antiangiogenicos, genes supresores de tumores, timidina quinasa, eNOS, iNOS, p53, p16, TNF-a, ligando Fas, oncogenes mutados, antfgenos tumorales, antfgenos virales o antfgenos bacterianos. En otro aspecto, el ADN plasirndico puede codificar para una molecula de ARNph disenada para inhibir la protema o protemas implicadas en el crecimiento o mantenimiento de celulas tumorales u otras celulas hiperproliferativas. Ademas, en algunos aspectos un ADN plasirndico puede codificar simultaneamente para una protema terapeutica y uno o mas ARNph. En otros aspectos, un acido nucleico tambien puede ser una mezcla de ADN plasirndico y ARN sintetico, incluyendo ARN sentido, ARN antisentido, ribozimas, etc. Ademas, el acido nucleico puede ser de tamano variable, desde oligonucleotidos hasta cromosomas. Estos acidos nucleicos pueden ser de origen humano, animal, vegetal, bacteriano, viral o sintetico. Pueden obtenerse por cualquier tecnica conocida por un experto en la tecnica.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "concentrado" se refiere a una composicion cuya dilucion se ha reducido. En algunos aspectos de la invencion, una composicion "concentrada" comprende aDn condensado, preferiblemente en una solucion isotonica. En un aspecto particular de la invencion, una composicion concentrada comprende al menos aproximadamente 0,5 mg/mL de ADN condensado suspendido en una solucion isotonica.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "cadena principal polimerica" se utiliza para referirse a una coleccion de moleculas de una cadena principal polimerica que tienen un peso molecular medio ponderado dentro del intervalo designado. Como tal, cuando se describe que una molecula tal como colesterol esta unida covalentemente a la misma dentro de un intervalo de proporciones molares, debe entenderse que tal relacion representa un numero medio de moleculas de colesterol unidas a la coleccion de moleculas de cadena principal polimerica. Por ejemplo, si se describe que el colesterol esta unido covalentemente a una cadena principal polimerica en una relacion molar de 0,5, entonces, en promedio, la mitad de las moleculas de cadena principal polimerica tendra colesterol unido. Como otro ejemplo, si se describe que el colesterol esta unido covalentemente a una cadena principal polimerica en una relacion molar de 1,0, entonces, en promedio, una molecula de colesterol se unira a cada una de las moleculas de cadena principal polimerica. En realidad, sin embargo, debe entenderse que en este caso algunas moleculas de cadena principal polimerica pueden no tener moleculas de colesterol unidas, mientras que otras moleculas de cadena principal polimerica pueden tener multiples moleculas de colesterol unidas, y que es el numero medio de moleculas de colesterol unidas a partir del cual se deriva la relacion. El mismo razonamiento se aplica a la relacion molar de polietilenglicol con respecto a la cadena principal polimerica.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "peptido" puede usarse para referirse a una molecula natural o sintetica que comprende dos o mas aminoacidos enlazados por el grupo carboxilo de un aminoacido al grupo alfa amino de otro. Un peptido de la invencion no esta limitado por la longitud, y por lo tanto "peptido" puede incluir polipeptidos y protemas.
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Tal como se usa en la presente memoria, los terminos "covalente" y "covalentemente" se refieren a enlaces qmmicos a traves de los cuales se comparten los electrones entre pares de atomos.
Como se usa aqm, una pluralidad de items, elementos estructurales, elementos de composicion y/o materiales pueden presentarse en una lista comun por conveniencia. Sin embargo, estas listas deben ser interpretadas como si cada miembro de la lista se identificara individualmente como un miembro separado y unico. Por lo tanto, ningun miembro individual de dicha lista debe interpretarse como un equivalente de hecho de cualquier otro miembro de la misma lista basandose unicamente en su presentacion en un grupo comun sin indicaciones en contrario.
Las concentraciones, cantidades y otros datos numericos pueden expresarse o presentarse aqm en un formato de intervalo. Debe entenderse que tal formato de intervalo se utiliza meramente por conveniencia y brevedad y por lo tanto debe ser interpretado de manera flexible para incluir no solo los valores numericos explfcitamente mencionados como los lfmites del intervalo, sino tambien para incluir todos los valores numericos individuales o subgrupos comprendidos dentro de ese intervalo como si cada valor numerico y subintervalo estuviera explfcitamente mencionado. Como ilustracion, un intervalo numerico de "aproximadamente 1 a aproximadamente 5" debe interpretarse para incluir no solo los valores expresamente mencionados de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, sino que tambien incluye valores individuales y subintervalos dentro del intervalo indicado. Asf, se incluyen en este intervalo numerico valores individuales tales como 2, 3 y 4 y subintervalos tales como 1-3, 2-4 y 3-5, etc., asf como 1, 2, 3, 4 y 5, individualmente. Este mismo principio se aplica a los intervalos que mencionan un valor numerico mmimo o maximo. Ademas, dicha interpretacion debena aplicarse con independencia de la amplitud del intervalo o de las caractensticas que se describen.
La invencion proporciona tecnicas por medio de las cuales las composiciones de acido nucleico de baja concentracion (por ejemplo, 0,15 mg/mL) pueden estar altamente concentradas sin afectar las propiedades fisicoqmmicas o biologicas del acido nucleico o las composiciones del acido nucleico. En un aspecto, las composiciones de acido nucleico pueden concentrarse 33 veces o mas sin afectar estas propiedades. Estas composiciones de acido nucleico altamente concentradas permiten una amplia gama de regfmenes de dosificacion in vivo, que anteriormente han sido tremendamente desafiantes debido a problemas de estabilidad deficiente asociados con intentos previos de alcanzar concentraciones por encima de ~0,3 mg/mL.
Mas espedficamente, la invencion proporciona composiciones farmaceuticas concentradas y estables, incluyendo metodos para preparar y usar tales composiciones. En un aspecto, por ejemplo, se proporciona una composicion farmaceutica que incluye al menos aproximadamente 0,5 mg/mL de un acido nucleico, donde el acido nucleico esta formando un complejo con un lipopolfmero cationico y el complejo se suspende en una solucion acuosa. El complejo suspendido en la solucion acuosa comprende moleculas de acido nucleico parcial o totalmente condensadas. El lipopolfmero cationico comprende una cadena principal de polietilenimina (PEI) que tiene grupos colesterol y polietilenglicol (es decir, moleculas) unidos covalentemente a la misma. La relacion molar de las moleculas de colesterol con respecto a la cadena principal de PEI esta dentro de un intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10, y la relacion molar de moleculas de polietilenglicol con respecto a PEI esta dentro de un intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10. La composicion comprende ademas un excipiente de relleno. En otro aspecto, la relacion molar de las moleculas de polietilenglicol con respecto a la cadena principal de PEI en el lipopolfmero cationico esta dentro de un intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 10. En otro aspecto, la relacion molar de moleculas de polietilenglicol con respecto a la cadena principal de PEI en el lipopolfmero cationico esta dentro de un intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 5. En un aspecto adicional, la relacion molar de moleculas de colesterol con respecto a la cadena principal de PEI en el lipopolfmero cationico esta dentro de un intervalo de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 5. En un aspecto incluso adicional, la relacion molar de moleculas de colesterol con respecto a la cadena principal de PEI en el lipopolfmero cationico esta dentro de un intervalo de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 1,5.
La composicion resultante es adecuada para la administracion del acido nucleico a una celula diana para provocar, inhibir o modificar una respuesta biologica dependiendo de la funcion del acido nucleico.
En un aspecto, las moleculas de colesterol y polietilenglicol pueden estar unidas independiente y directamente covalentemente a la cadena principal de PEI. En otro aspecto, las moleculas de colesterol y polietilenglicol estan cada una unidas covalentemente indirectamente a la cadena principal de PEI. Por ejemplo, la molecula de colesterol puede estar acoplada, directa o indirectamente a traves de un enlazador o espaciador, a la molecula de polietilenglicol, que a su vez esta unida covalentemente a la cadena principal de PEI. Alternativamente, la molecula de colesterol puede estar directamente unida a la cadena principal de PEI mientras que la molecula de polietilenglicol esta indirectamente unida al lipopolfmero a traves de un enlazador o espaciador.
Un enlazador particular entre el polietilenglicol y la cadena principal de PEI es un grupo alquileno que porta un grupo carboxilo terminal, preferiblemente un grupo alquileno de cadena lineal de 1 a 20 atomos de carbono y mas preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 atomos de carbono. El grupo carboxilo terminal en el enlazador, cuando esta unido a un grupo amino de la cadena principal de PEI, forma un enlace amida entre el lipopolfmero cationico y el polietilenglicol. Un polietilenglicol de partida adecuado para reaccionar con la molecula de la
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cadena principal de PEI es un polietilenglicol que porta una molecula enlazadora que termina en un grupo activador, por ejemplo, un ester de N-hidroxisuccinimidilo. Un ejemplo de tal polietilenglicol es el ester de N-hidroxisuccinimidilo del acido metoxipolietilenglicol-propionico.
Un ejemplo de una portion de una estructura de lipopolimero cationico resultante de la reaction entre una polietilenimina, cloroformiato de colesterilo (estereoqmmica omitida) y ester de N-hidroxisuccinimidilo del acido metoxipolietilenglicol-propionico es la siguiente estructura. La convention grafica refleja la distribution aproximada de grupos amino primarios, secundarios y terciarios en polietilenimina y, para fines de claridad aqm, asume una regularidad no existente de la cadena de polietilenimina.
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En varios aspectos de la invention, n es tfpicamente de aproximadamente 8 a aproximadamente 20, mas particularmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 15, e incluso mas particularmente de aproximadamente 12; x es tfpicamente de aproximadamente 2 a aproximadamente 3, mas particularmente aproximadamente 2,5; y es tfpicamente de aproximadamente 6 a aproximadamente 10, mas particularmente de aproximadamente 7 a aproximadamente 9, e incluso mas particularmente de 7,5; z tfpicamente es aproximadamente 0,4 a aproximadamente 0,8, mas particularmente aproximadamente 0,5 a aproximadamente 0,7, e incluso mas particularmente aproximadamente 0,6.
Ademas, en algunos aspectos, los acidos nucleicos que se han condensado previamente usando un sistema de condensacion secundario pueden condensarse adicionalmente utilizando las tecnicas presentadas en la presente memoria para conseguir una mayor estabilidad del acido nucleico a altas concentraciones. Como tal, antes de la condensation de acuerdo con aspectos de la invencion, el acido nucleico puede estar en una forma parcialmente condensada o no condensada. El sistema de condensacion secundario puede incluir cualquier material o tecnica de condensacion conocido por un experto en la tecnica, incluyendo, pero sin limitation, lipidos cationicos, peptidos cationicos, ciclodextrinas, gelatina cationizada, dendrimeros, quitosano y combinaciones de los mismos.
Se pueden conseguir diversos grados de condensacion de un acido nucleico para la composition de acuerdo con aspectos de la invencion. En un aspecto, todos los acidos nucleicos o una porcion sustancial de los acidos nucleicos en la composicion se condensan formando complejos con el polimero cationico. En otro aspecto, aproximadamente el 30% en peso de los acidos nucleicos en la composicion se condensan. En aun otro aspecto, aproximadamente el 50% en peso del acido nucleico en la composicion se condensa. En un aspecto adicional, aproximadamente el 70% en peso del acido nucleico en la composicion se condensa. Todavia en otro aspecto, el 90% en peso del acido nucleico se condensa.
Adicionalmente, la concentracion de acido nucleico en la composicion variara dependiendo de los materiales utilizados en la composicion, los metodos de concentration y el uso previsto del acido nucleico. En un aspecto, sin embargo, la concentration del acido nucleico es de al menos aproximadamente 0,5 mg/mL. En otro aspecto, la concentracion del acido nucleico es al menos aproximadamente de 1 mg/mL. En aun otro aspecto, la concentracion del acido nucleico es al menos aproximadamente de 3 mg/mL. En un aspecto adicional, la concentracion del acido nucleico puede ser de al menos aproximadamente 5 mg/mL. Todavia en otro aspecto, la concentracion del acido nucleico puede ser de al menos aproximadamente 10 mg/mL. En otro aspecto, la concentracion del acido nucleico puede ser de al menos aproximadamente 20 mg/mL. En aun otro aspecto, la concentracion del acido nucleico puede ser de aproximadamente 10 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL.
Pueden utilizarse diversos metodos para determinar el grado de condensacion de una composicion de acido nucleico. Por ejemplo, en un aspecto, la composicion puede ser sometida a electroforesis para determinar el grado en el que los acidos nucleicos en la composicion han formado complejos con el polimero cationico anadido a la composicion. La atraccion electrostatica del acido nucleico cargado negativamente al lipopolimero cationico cargado positivamente inhibe el movimiento del acido nucleico a traves de un gel de agarosa. Por consiguiente, despues de la electroforesis, los acidos nucleicos que se condensan mediante la formation de complejos con el polimero cationico permanecen inmoviles en el gel, mientras que los acidos nucleicos no condensados, acidos nucleicos no asociados con el polimero cationico, habran recorrido una distancia relativa a la fuerza de la corriente electrica en el gel. En otro ejemplo, la condensacion de acido nucleico puede determinarse por los tamanos de partfcula dentro de la composicion. El tamano de partfcula se puede medir por dispersion dinamica de la luz. Tipicamente, los acidos nucleicos condensados tendran
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un tamano de partfcula mas pequeno que los acidos nucleicos no condensados. Los acidos nucleicos condensados preferidos son aquellos en nanopartfculas de acido nucleico y lipopolfmero cationico que tienen un tamano de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 300 nm, mas preferiblemente de aproximadamente 50-200, e incluso mas preferiblemente de aproximadamente 50-150 nm.
Cualquier acido nucleico conocido puede ser utilizado en las composiciones y metodos de acuerdo con aspectos de la invencion, incluyendo los ejemplos descritos anteriormente. Como tal, los acidos nucleicos descritos en el presente documento no deben considerarse limitantes. En un aspecto, por ejemplo, el acido nucleico puede incluir un plasmido que codifica para una protema, polipeptido o peptido. Se sabe que numerosos peptidos resultanan beneficiosos cuando se formularan como composiciones farmaceuticas de acuerdo con aspectos de la invencion. Ejemplos no limitativos de algunos de tales peptidos pueden incluir interleuquina 2, interleuquina 4, interleuquina 7, interleuquina 12, interleuquina 15, interferon a, interferon p, interferon y, factor estimulante de colonias, factor de estimulacion de colonias de macrofagos-granulocitos, agentes angiogenicos, factores de coagulacion, agentes hipoglucemicos, factores de apoptosis, agentes antiangiogenicos, timidina quinasa, p53, IP10, p16, TNF-a, ligando Fas, antigenos tumorales, neuropeptidos, antigenos virales, y combinaciones de los mismos. En un aspecto espedfico, el acido nucleico puede ser un plasmido que codifica para interleuquina 12. En otro aspecto, el acido nucleico puede ser un plasmido que codifica para un acido ribonucleico inhibidor. En aun otro aspecto, el acido nucleico puede ser un acido ribonucleico interferente corto sintetico. En un aspecto adicional, el acido nucleico es una molecula antisentido disenada para inhibir la expresion de un peptido terapeutico.
De acuerdo con la invencion, el lipopolfmero cationico comprende una cadena principal de polietilenimina que tiene colesterol y polietilenglicol unidos covalentemente al mismo. La cadena principal de polfmero cationico puede comprender ademas cualquier polfmero cationico conocido por un experto en la tecnica que se pueda usar para condensar y concentrar un acido nucleico de acuerdo con los diversos aspectos de la invencion. El lipopolfmero cationico que comprende polietilenimina, puede comprender ademas poli(trimetilenimina), poli(tetrametilenimina), polipropilenimina, aminoglicosido-poliamina, didesoxi-diamino-b-ciclodextrina, espermina, espermidina, metacrilato de poli(2-dimetilamino)etilo, poli(lisina), poli(histidina), poli(arginina), gelatina cationizada, dendnmeros, quitosano y combinaciones de los mismos.
En un aspecto particular, el lipopolfmero consiste en polietilenimina (PEI) enlazada covalentemente independientemente a colesterol y polietilenglicol. En este aspecto, la relacion molar PEG:PEI:colesterol promedio en el lipopolfmero cationico es de aproximadamente 2-3:1:0,25-1, y preferiblemente aproximadamente 2,25-2,75:1:0,4-0,8, y mas preferiblemente aproximadamente 2,5:1:0,6. En un aspecto particular, dicho lipopolfmero tiene un peso molecular (como la base libre) de aproximadamente 3-4 kD, preferiblemente de aproximadamente 3,25-3,75 kD, y mas preferiblemente aproximadamente 3,54 kD; la sal de acido clorfudrico correspondiente tiene un peso molecular de aproximadamente 4-5 kD, preferiblemente aproximadamente 4,5 kD.
Ademas, el peso molecular de una cadena principal de PEI puede variar, dependiendo de numerosos factores incluyendo las propiedades del acido nucleico, el uso pretendido de la composicion, etc. En un aspecto, sin embargo, la cadena principal de PEI puede tener un peso molecular de aproximadamente 100 a aproximadamente 500.000 Dalton. Ademas, el peso molecular de los otros diversos componentes del lipopolfmero cationico tambien puede variar. En un aspecto, por ejemplo, el polietilenglicol puede tener un peso molecular de aproximadamente 50 a aproximadamente 20.000 Dalton.
En la construccion de las composiciones farmaceuticas de la invencion, se ha descubierto que la relacion molar entre el nitrogeno de la amina en el lipopolfmero cationico con grupos funcionales y el fosfato en el acido nucleico (relacion N:P) puede afectar el grado en que el al acido nucleico puede condensarse y/o concentrarse. Aunque la relacion N:P optima puede variar algo dependiendo de las caractensticas qrnmicas del acido nucleico, en un aspecto la relacion de nitrogeno de la amina en la cadena principal del polfmero cationico con respecto al fosfato en el acido nucleico es de aproximadamente 0,1:1 a aproximadamente 100:1. En otro aspecto, la relacion de nitrogeno de amina en la cadena principal de polfmero cationico con respecto al fosfato en el acido nucleico es de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 20:1. En aun otro aspecto, la proporcion de nitrogeno de amina en la cadena principal de polfmero cationico con respecto al fosfato en el acido nucleico es de aproximadamente 6:1 a aproximadamente 15:1. En otros aspectos, la relacion de nitrogeno de amina con respecto al fosfato en el acido nucleico es de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 100:1, o de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 100:1, o de aproximadamente 7:1 a aproximadamente 100:1. En otro aspecto mas, la relacion es de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 100:1, o mas preferiblemente de 10:1 a aproximadamente 20:1. En un aspecto espedfico, la relacion de nitrogeno de amina en la cadena principal del polfmero cationico con respecto al fosfato en el acido nucleico es de aproximadamente 11:1.
El excipiente de relleno puede proporcionar una variedad de propiedades beneficiosas a la formulacion, tales como crioproteccion durante la liofilizacion y reconstitucion, union, equilibrio isotonico, estabilizacion, etc. Debe entenderse que el material de relleno puede variar entre las composiciones y el relleno particular utilizado no debe considerarse limitante. En un aspecto, por ejemplo, el excipiente de relleno puede incluir diversos azucares, alcoholes de azucar, almidones, celulosas y combinaciones de los mismos. En otro aspecto, el excipiente de relleno puede incluir lactosa, sacarosa, trehalosa, dextrosa, galactosa, manitol, maltitol, maltosa, sorbitol, xilitol, manosa, glucosa, fructosa,
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polivinilpirrolidona, glicina, maltodextrina, hidroximetil almidon, gelatina, sorbitol, ficol, cloruro de sodio, fosfato de calcio, carbonato de calcio, polietilenglicol y combinaciones de los mismos. En otro aspecto mas, el excipiente de relleno puede incluir lactosa, sacarosa, trehalosa, dextrosa, galactosa, manitol, maltitol, maltosa, sorbitol, xilitol, manosa, glucosa, fructosa, polivinilpirrolidona, glicina, maltodextrina y combinaciones de los mismos. En un aspecto espedfico, el excipiente de relleno puede incluir sacarosa. En otro aspecto espedfico, el excipiente de relleno puede incluir lactosa.
La concentracion del excipiente de relleno en la composicion puede ser de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 5%, mas particularmente de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 3,0%, e incluso mas particularmente de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,3%.
En algunos aspectos, puede ser beneficioso agregar grupos funcionales al lipopolfmero cationico para permitir el direccionamiento de celulas o tejidos espedficos en un sujeto o cultivo. Dicho direccionamiento es bien conocido, y los ejemplos aqu descritos no deben considerarse limitantes. En un aspecto, por ejemplo, el lipopolfmero cationico puede incluir una fraccion de direccionamiento unida covalentemente al lipopolfmero cationico o a la molecula de polietilenglicol. Tal fraccion de direccionamiento puede permitir que el lipopolfmero cationico circule sistemicamente en un sujeto para localizar y dirigir espedficamente un cierto tipo de celula o tejido. Ejemplos de tales fracciones de direccionamiento pueden incluir transferrina, asialoglicoprotema, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, lipoprotemas de baja densidad, receptores celulares, receptores del factor de crecimiento, receptores de citoquinas, folato, transferrina, insulina, asialoorosomucoide, manosa-6-fosfato, manosa, interleuquinas, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, factores de celulas madre, eritropoyetina, factor de crecimiento epidermico (EGF), insulina, asialoorosomucoide, manosa-6-fosfato, manosa, LewisX y sialil LewisX, N-acetil-lactosamina, folato, galactosa, lactosa y trombomodulina, agentes fusogenicos tales como polimixina B y hemaglutinina HA2, agentes lisosomotroficos, senales de localizacion del nucleo (NLS) tales como antfgeno T y combinaciones de los mismos. La seleccion y union de una fraccion de direccionamiento en particular esta dentro del conocimiento de un experto en la tecnica.
La invencion tambien proporciona composiciones farmaceuticas liofilizadas que pueden almacenarse durante largos periodos de tiempo y reconstituirse antes de su uso. En un aspecto, una composicion farmaceutica liofilizada puede incluir una mezcla liofilizada de un excipiente de relleno y al menos 0,5 mg/mL de acido nucleico condensado con un lipopolfmero cationico, en donde el lipopolfmero cationico comprende una cadena principal de PEI que tiene colesterol y polietilenglicol unido covalentemente al mismo y en donde la relacion molar de colesterol con respecto a la cadena principal de PEI esta dentro de un intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 y la relacion molar de polietilenglicol con respecto a la cadena principal de polfmero cationico esta dentro de un intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10. La composicion farmaceutica liofilizada puede estar en una variedad de formas, que van desde polvos secos hasta mezclas parcialmente reconstituidas.
La invencion tambien incluye metodos para fabricar diversas composiciones farmaceuticas que contienen acidos nucleicos condensados. En un aspecto, por ejemplo, se proporciona un metodo para preparar una composicion farmaceutica que tiene un acido nucleico condensado concentrado en una solucion isotonica de al menos 0,5 mg/mL. Tal metodo puede incluir mezclar un acido nucleico y un lipopolfmero cationico en un excipiente de relleno, donde el lipopolfmero cationico comprende una cadena principal de PEI que tiene colesterol y polietilenglicol unido covalentemente al mismo y en donde la relacion molar de colesterol con respecto a la cadena principal de polfmero cationico esta dentro de un intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 y la relacion molar de polietilenglicol con respecto a la cadena principal de polfmero cationico esta dentro de un intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10. La mezcla puede liofilizarse hasta un polvo para concentrar la mezcla de acido nucleico y posteriormente reconstituirse con un diluyente para formar una solucion que incluye al menos aproximadamente 0,5 mg/mL de acido nucleico condensado en una solucion isotonica.
Generalmente, la composicion puede obtenerse mezclando una solucion de acido nucleico con una solucion de lipopolfmero cationico en presencia de un azucar disacarido seguido por liofilizacion y reconstitucion en una solucion isotonica. Este proceso es escalable, produciendo desde unos pocos miligramos (escala de laboratorio) hasta varios miles de miligramos (escala GMP) de las formulaciones de acido nucleico altamente concentradas con vida util prolongada. Como se ha descrito, el lipopolfmero cationico tiene una cadena principal de polfmero cationico a la que se unen polietilenglicol y colesterol mediante enlaces covalentes. En el caso de una cadena principal de polietilenimina, en un aspecto la estequiometna entre polietilenglicol y polietilenimina y entre colesterol y polietilenimina esta en el intervalo de 0,5-10 y 0,1-10, respectivamente. La composicion qrnmica del polfmero cationico puede ser importante para obtener formulaciones altamente concentradas de acidos nucleicos estables. Los polfmeros cationicos que no presentan colesterol y union al PEG no tienden a producir formulaciones estables y altamente concentradas, como se muestra en la seccion de Ejemplos mas adelante.
Las composiciones de acuerdo con aspectos de la invencion pueden combinarse tambien con otros complejos condensados de acido nucleico para conseguir una mayor estabilidad de los complejos a concentraciones de acido nucleico elevadas. Por ejemplo, pueden anadirse diversas cantidades de PEG-PEI-colesterol para aumentar la estabilidad de otros sistemas de suministro de acido nucleico que son generalmente inestables a altas concentraciones de acido nucleico.
En diversos aspectos, los sistemas de suministro sinteticos incluyen un acido nucleico y un vehnculo cationico que puede prepararse mediante diversas tecnicas disponibles en la tecnica. Se conocen varios portadores cationicos para acidos nucleicos: por ejemplo, polietilenimina, poli(trimetilenimina), poli(tetrametilenimina), polipropilenimina, aminoglicosido-poliamina, didesoxi diamino-b-ciclodextrina, espermina, espermidina, metacrilato de poli(2- 5 dimetilamino)etilo, poli(lisina), poli(histidina), poli(arginina), gelatina cationizada, dendnmeros, quitosano, Kpidos cationicos tales como 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP), cloruro de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N- trimetilamonio (DOTMA), cloruro de 1-[2-(oleoiloxi)etil]-2-oleil-3-(2-hidroxietil)imidazolinio (DOTIM), trifluoroacetato de 2,3-dioleoxi-N-[2(espermincarboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio (DOSPA), clorhidrato de 3p-[N-(N',N'-dimetil- aminoetano)-carbamoil]colesterol (DC-Colesterol HCl), diheptadecilamidoglicil espermidina (DOGS), bromuro de N,N- 10 diestearil-N,N-dimetilamonio (DDAB), bromuro de N-(1,2-dimiristiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DMRIE), cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamonio (DODAC) y combinaciones de los mismos. Cuando estos sistemas de suministro se combinan con PEG-PEI-colesterol, se aumenta la estabilidad del sistema de suministro de acido nucleico.
Aspectos de la invencion tambien proporcionan metodos de uso de composiciones farmaceuticas. Por ejemplo, en un aspecto, un metodo de transfectar una celula de mairnfero puede incluir el contacto de la celula de mairnfero con una 15 composicion como la descrita aqrn, e incubar la celula de mairnfero en condiciones para permitir que la composicion entre en la celula y provocar la actividad biologica del acido nucleico. Dichas tecnicas de transfeccion son conocidas por los expertos en la tecnica. Adicionalmente, en otro aspecto puede transfectarse un tejido diana suministrando la composicion a un organismo o sujeto de sangre caliente. Tal administracion puede ser por una forma de administracion tal como intratumoral, intraperitoneal, intravenosa, intraarterial, intratraqueal, intrahepatica portal, oral, intracraneal, 20 intramuscular, intraarticular y combinaciones de los mismos. Dicho tejido diana puede incluir cualquier tejido o subconjunto de tejido que se beneficiaria de la transfeccion. Por ejemplo, y sin limitacion, dicho tejido diana puede incluir ovario, utero, estomago, colon, recto, hueso, sangre, intestino, pancreas, mama, cabeza, cuello, pulmones, bazo, hngado, rinon, cerebro, tiroides, prostata, vejiga urinaria, tiroides, piel, cavidad abdominal, cavidad toracica y combinaciones de los mismos.
25 Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan para promover una comprension mas clara de ciertas realizaciones de la invencion, y no se entienden en modo alguno como limitacion de la misma.
Preparacion A
Se disuelve un gramo de polietilenimina ramificada (PEI) 1.800 Da (0,56 mM) en 5 mL de cloroformo y se coloca en un 30 matraz de fondo redondo y se agita durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se disuelven trescientos ochenta miligramos de cloroformiato de colesterilo (0,84 mM) y 500 mg de metoxipolietilenglicol activado (MPEG-SPA, N- hidroxisuccinimidil ester del acido metoxipolietilenglicol-propionico) (550 Da) (0,91 mM) en 5 mL de cloroformo y se transfieren a un embudo de adicion que esta situado en la parte superior del matraz de fondo redondo que contiene la solucion de PEI. La mezcla de cloroformiato de colesterilo y MPEG-SPA en cloroformo se anade lentamente a la 35 solucion de PEI durante 5-10 minutos a temperatura ambiente. La solucion se agita durante 4 horas mas a temperatura ambiente. Despues de eliminar el disolvente mediante un evaporador rotatorio, el material pegajoso restante se disuelve en 20 mL de acetato de etilo con agitacion. El producto se precipita del disolvente anadiendo lentamente 20 mL de n- hexano; el lfquido se decanta del producto. El producto se lava dos veces con una mezcla de 20 mL de acetato de etilo / n-hexano (1/1; v/v). Despues de decantar el lfquido, se seca el material mediante purga con gas nitrogeno durante 1040 15 minutos. El material se disuelve en 10 mL de HCl 0,05 N para preparar la forma salina de los grupos amina. La
solucion acuosa se filtra a traves de papel de filtro de 0,2 p m. El producto final se obtiene por liofilizacion.
La proporcion molar de este ejemplo de preparacion es 3,0 moles de MPEG-SPA y 1,28 moles de colesterol conjugado con una mol de moleculas de PEI.
Preparacion B
45 Se mezclan veinte gramos (11,1 mmol) de PEI ramificada (BPEI) y 200 mL de cloroformo seco para disolver la BPEI. Despues de la disolucion, se anade gota a gota una solucion que contiene 4 g de cloroformiato de colesterilo y 18,7 g (26 mmol) de metoxipolietilenglicol activado (MPEG-SPA N-hidroxisuccinimidil ester del acido metoxipolietilenglicol- propionico, MPEG PM 550, ester PM 719) en 200 mL de cloroformo seco a la mezcla de reaccion con agitacion durante 20-30 min seguido de un penodo de incubacion de 3-4 horas. La mezcla se pone despues al vacfo para concentrar la 50 solucion y eliminar el cloroformo residual. El residuo resultante se disuelve en 320 mL de HCl acuoso 1 M y se agita. Esta solucion de clorhidrato de PPC se concentra de nuevo bajo vacfo, produciendo un material altamente viscoso. Para aislar el clorhidrato de PPC y eliminar los subproductos de la reaccion y los materiales de partida sin reaccionar, se combina la mezcla concentrada con acetona (<0,4% de agua) y se agita lo que conduce a la precipitacion con clorhidrato de PPC como material de flujo libre. Despues de la precipitacion, el liquido sobrenadante es desechado. El 55 clorhidrato de PPC higroscopico se seca al vacfo.
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Los complejos de ADN-poUmero se generan primero preparando PPC y ADN a las concentraciones apropiadas en lactosa al 10%. Las soluciones madre de polfmero cationico (5 mg/mL) y de ADN (3 mg/mL) en agua para inyeccion se diluyen en una solucion de lactosa que oscila entre 0,3 y 3%: estas son necesarias para alcanzar una concentracion final de lactosa al 10% tras la reconstitucion. A continuacion, se anade gota a gota el ADN con agitacion a la solucion de PPC y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente para formar los complejos.
Se anaden 500 pl de la composicion preparada a viales de vidrio de borosilicato de 2 mL y se colocan en un secador. Los viales se enfnan a -34°C durante 4 horas antes del comienzo del secado primario. Despues de 24 horas, se eleva la temperatura del estante hasta 20°C y se mantiene al vado durante otras 24 horas. Finalmente, la temperatura de la estantena se eleva a 4°C y los viales se tapan al vado.
Preparacion C
Se disuelven ciento ochenta miligramos de PEI 1800 ramificada (0,1 mM) en 4 mL de cloroformiato y se agita durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se disuelven 70 miligramos de cloroformiato de colesterilo (0,14 mM) y 48 mg de PEG 330 (0,14 mM) en 1 mL de cloroformiato, y se anade lentamente a la solucion de PEI durante 3-10 minutos usando una jeringa. La mezcla se agita durante 4 horas a temperatura ambiente. Despues de la adicion de 10 mL de acetato de etilo para la precipitacion, la solucion se incuba durante la noche a -20°C, y luego el lfquido se decanta del matraz. El material restante se lava 2 veces con una mezcla de 5 mL de acetato de etilo/n-hexano (1/1; v/v). El material restante se seca mediante purga de nitrogeno durante 10-15 minutos, se disuelve en 10 mL de HCl 0,05 N durante 20 minutos y despues la solucion se filtra a traves de un filtro de jeringa de 0,2 pm. La solucion acuosa se liofiliza mediante secado por congelacion para eliminar el agua de los polfmeros.
La relacion molar de esta preparacion es de 0,85 moles de PEG y 0,9 moles de colesterol conjugados con una mol de moleculas de PEI.
Preparacion D
Se disuelven quinientos miligramos de PEI lineal de 25 kDa (0,02 mM) en 30 mL y se agita a 65°C durante 30 minutos. El matraz de tres bocas esta equipado con un embudo de condensacion y adicion. Se anade lentamente una mezcla de 200 mg de mPEG-NHS 1000 (0,2 mM) y 40 mg de cloroformiato de colesterilo (0,08 mM) en 5 mL de cloroformo a la solucion de PEI durante 3-10 minutos. La solucion se agita constantemente durante 4 horas adicionales a 65°C, y despues se reduce el volumen hasta aproximadamente 5 mL en un evaporador rotatorio. La solucion se precipita en 50 mL de eter etflico para eliminar el colesterol libre, se decanta el lfquido del matraz y el material restante se lava dos veces con 20 mL de eter etflico. Despues de secar con nitrogeno puro, el material se disuelve en una mezcla de 10 mL de HCl 2,0 N y 2 mL de acido trifluoroacetico. La solucion se dializa contra agua desionizada utilizando un tubo de dialisis MWCO 15000 durante 48 horas con cambio de agua fresca cada 12 horas. La solucion se liofiliza para eliminar el agua.
La relacion molar de esta preparacion es 12,0 moles de PEG y 5,0 moles de colesterol conjugados a una mol de moleculas de PEI.
Preparacion E
Se disuelve un gramo de PEI (PM: 1200 Dalton) en una mezcla de 15 mL de cloruro de metileno anhidro y 100 pl de trietilamina (TEA). Despues de agitar sobre hielo durante 30 minutos, se anaden lentamente 1,2 g de solucion de cloroformiato de colesterilo a la solucion de PEI y la mezcla se agita durante la noche sobre hielo. El producto resultante se precipita anadiendo eter etflico seguido de centrifugacion y posterior lavado con eter etflico y acetona adicionales. El lipopolfmero insoluble en agua se disuelve en cloroformo para hasta una concentracion final de 0,08 g/mL. Despues de la smtesis y purificacion, el lipopolfmero insoluble en agua se caracteriza usando MALDI-TOFF MS y RMN 1H.
La medicion por RMN del lipopolfmero 1200 insoluble en agua muestra que la cantidad de colesterol conjugado con la PEI es de aproximadamente 40%. El analisis por espectrometna de masas MALDI-TOF del lipopolfmero insoluble en agua muestra que su peso molecular es aproximadamente 1.600.
Preparacion F
Se agitan tres gramos de PEI (PM: 1.800 Dalton) durante 30 minutos sobre hielo en una mezcla de 10 mL de cloruro de etileno anhidro y 100 pl de trietilamina. Se disuelve un gramo de cloroformiato de colesterilo en 5 mL de cloruro de metileno anhidro enfriado con hielo y luego se anade lentamente durante 30 minutos a la solucion de PEI. La mezcla se agita durante 12 horas sobre hielo y el producto resultante se seca en un evaporador rotatorio. El polvo se disuelve en 50 mL de HCl 0,1 N. La solucion acuosa se extrae tres veces con 100 mL de cloruro de metileno y despues se filtra a traves de un filtro de microfibra de vidrio. El producto se concentra por evaporacion con disolvente, se precipita con un gran exceso de acetona y se seca al vado. El producto se analiza usando espectrofotometna de masas MALDI-TOF y
10 RMN 1H. Los resultados de RMN del lipopoUmero 1800 soluble en agua muestran que la cantidad de colesterol conjugado con PEI es de aproximadamente 47%. El analisis espectrometrico de masas MALDI-TOFF de PEACE muestra que su peso molecular es de aproximadamente 2.200. Esto sugiere que la mayona de PEACE 1800 tiene una relacion molar 1/1 de colesterol y PEI, aunque algunas no estaban conjugadas o conjugadas en una relacion molar de 5 2/1 (colesterol/PEI).
Preparacion G
Se disuelven cincuenta miligramos de PEI 1800 en 2 mL de cloruro de metileno anhidro sobre hielo. A continuacion, se anaden lentamente 200 pl de cloroformiato de bencilo a la mezcla de reaccion y la solucion se agita durante cuatro horas sobre hielo. Despues de agitar, se anaden 10 mL de cloruro de metileno y la solucion se extrae con 15 mL de 10 NH4Cl saturado. Se retira agua de la fase de cloruro de metileno usando sulfato de magnesio. El volumen de la solucion
se reduce al vado y el producto, PEI protegida con CBZ, se precipita con eter etflico. Se disuelven cincuenta miligramos de PEI protegida con amina primaria CBZ en cloruro de metileno, se anaden 10 mg de cloroformiato de colesterol y la solucion se agita durante 12 horas sobre hielo. El producto lipopolfmero protegido con CBZ, se precipita con eter etflico, se lava con acetona, y luego se disuelve en DMF que contiene carbon activado con paladio como catalizador bajo
15 atmosfera de H2 como donador de hidrogeno. La mezcla se agita durante 15 horas a temperatura ambiente, se filtra a
traves de CELITE® y se reduce el volumen de la solucion mediante un evaporador rotatorio. El producto final se obtiene a partir de la precipitacion con eter etflico.
Preparacion H
Se disolvieron quinientos miligramos de NH2-PEG-COOH 3400 (0,15 mM) en 5 mL de cloroformo anhidro a temperatura 20 ambiente durante 30 minutos. Se anade lentamente una solucion de 676 mg de cloroformiato de colesterol (1,5 mM) en 1 mL de cloroformo anhidro a la solucion de PEG y despues se agita durante 4 horas mas a temperatura ambiente. La mezcla se precipita en 500 mL de eter etflico sobre hielo durante 1 h, y despues se lava tres veces con eter etflico para eliminar el colesterol no conjugado. Despues de secar con purga de nitrogeno, el polvo se disuelve en 5 mL de HCl 0,05 N para acidificar los grupos carboxilo en el PEG. El material se seca mediante un liofilizador. Se disuelven cien
25 miligramos de PEI 1800 (0,056 mM), 50 mg de DCC y 50 mg de NHS en 5 mL de cloroformo a temperatura ambiente,
se agita la mezcla durante 20 minutos y despues se anade una solucion de 380 mg de col-PEG-COOH en 1 mL de cloroformo a la solucion de PEI. Despues de agitar durante seis horas a temperatura ambiente, se separo el disolvente organico con un evaporador rotatorio. El material restante se disolvio en 10 mL de agua desionizada y se purifico mediante FPLC.
30 Ejemplo 1
Preparacion de formulaciones lfquidas concentradas de acido nucleico condensado con un lipopolfmero cationico
Este ejemplo ilustra la preparacion de formulaciones altamente concentradas de acido nucleico totalmente condensado en la produccion a escala de laboratorio. Esto implica la preparacion de complejos de acidos nucleicos con un polfmero cationico seguido por liofilizacion y reconstitucion a soluciones isotonicas. El acido nucleico utilizado es un ADN 35 plasirndico que codifica para el gen de IL-12 o luciferasa, y el polfmero comprendfa una cadena principal de
polietilenimina (PEI) enlazada covalentemente a polietilenglicol (PEG) y colesterol (Col) (PEG-PEI-Col o PPC). La relacion molar entre PEG y PEI y entre colesterol y PEI es de 0,5-10 y 0,1-10, respectivamente. En primer lugar, las disoluciones de ADN y PPC se preparan por separado a razon de 5 mg/mL en agua para inyeccion y posteriormente se diluye a 0,15 mg/mL (ADN) y 0,554 mg/mL (PPC) al 3% de lactosa. El ADN en solucion de lactosa se anade al PPC en 40 solucion de lactosa usando una micropipeta con una relacion de nitrogeno a fosfato (relacion N:P) de 11:1, y la formulacion se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente para permitir que los complejos se formen. Los complejos de PPC/ADN en lactosa al 3% se liofilizan utilizando un sistema liofilizador FREEZONE de LABCONCO Corp. Kansas City, MO. Se anaden 500 pl de formulacion preparada a viales de vidrio de borosilicato de 2 mL que despues se liofilizan usando un programa de liofilizacion que consiste en los siguientes segmentos:
45 1) segmento de congelacion (rampa 0,25°C/min, mantener a 34°C durante 4 horas),
2) segmento de secado primario (mantener a 34°C durante 24 horas),
3) segmento de secado secundario (rampa a 20°C y retencion durante 24 horas), y
4) rampa hasta 4°C a 0,25°C/min.
El polvo liofilizado resultante se reconstituye con agua para inyeccion a diversas concentraciones que van desde 0,1 50 mg/mL hasta 20 mg/mL de ADN. Un lote tfpico de preparacion a pequena escala ascendio a 100-200 mg de ADN completamente formulado.
Ejemplo 1A
Se prepara una formulacion de acido nucleico / lipopoKmero cationico esencialmente de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en el Ejemplo 1 usando un lipopoKmero cationico y acido nucleico de IL-12 a una relacion N:P de 11:1. El lipopolfmero cationico tiene una relacion molar PEG:PEI:colesterol de aproximadamente 2,5:1:0,6, y un peso 5 molecular (como la base libre) de aproximadamente 3,54 kD. La formulacion resultante que contiene lactosa se liofiliza y se puede reconstituir a concentraciones de acido nucleico de al menos aproximadamente 0,5 mg/mL sin aglomeracion del acido nucleico o perdida de actividad de transfeccion significativa.
Ejemplo 2
Preparacion de formulaciones lfquidas concentradas de acido nucleico condensado con un lipopolfmero cationico
10 Este ejemplo ilustra una preparacion de formulaciones altamente concentradas de acido nucleico condensado, como se muestra en la Fig. 1. Este protocolo ha producido mas de 6.000 mg de ADN completamente formulado (en comparacion con 100-200 mg de ADN producido a partir de la preparacion a pequena escala descrita en el Ejemplo 1) y se puede expandir hasta cantidades de produccion aun mayores. El metodo escalado implico mezclar el aDn a granel y las soluciones de polfmero con una bomba peristaltica que logro un escenario de mezcla en lmea para formar los complejos 15 seguido por ciclos de liofilizacion compatibles para una carga grande. Brevemente, las disoluciones de ADN y PpC se preparan a razon de 0,3 mg/mL y 1,1 mg/mL en lactosa al 3%, respectivamente. Los dos componentes se combinan a una velocidad de flujo constante usando una bomba peristaltica (WATSON MARLOW, SCI 400) con un diametro interno de 0,89 mm de tubo de silicio (WATSON MARLOW, Z982-0088) a un caudal de 225 ± 25 mL / min. Las dos mezclas estan unidas por un conector en T de polipropileno en el extremo de cada tubo. La mezcla de polfmero y soluciones de 20 ADN dio lugar a la formacion instantanea de nanopartfculas. Se colocan 40 mililitros de los complejos formulados en viales de vidrio de 100 mL y se liofilizan usando un programa de liofilizacion que consiste en los siguientes segmentos:
1) congelar previamente a -50 C durante hasta 720 minutos,
2) secado primario a -40°C durante hasta 180 minutos y a continuacion a -34°C durante hasta 80 minutos a 65 pm de Hg y
25 3) secado secundario a -25°C durante hasta 720 minutos, -15°C durante hasta 3180 minutos, -10°C durante hasta 1500
minutos y 4°C durante hasta 1440 minutos a 65 pm de Hg.
El polvo liofilizado resultante se reconstituye con agua para inyeccion a diversas concentraciones que van desde 0,1 mg/mL hasta 20 mg/mL de ADN. Un lote tfpico de esta escala asciende a 6.000 mg de ADN completamente formulado.
Ejemplo 3
30 Medicion del tamano de partfcula de formulaciones lfquidas concentradas de acido nucleico condensado con un lipopolfmero cationico
Se preparan formulaciones altamente concentradas de ADN de plasmido con lipopolfmero cationico, PPC, como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Para la medicion del tamano de partfcula polfmero / acido nucleico, se analiza una parte alfcuota de la formulacion lfquida utilizando 90PlusBI-MAS Particle Sizer de BROOKHAVEN INSTRUMENTS Corp., 35 Holtsville, NY. Espedficamente, se anaden 50 pl de formulacion a 950 pl de agua milli-Q en cubetas de poliestireno para su analisis.
La Fig. 2 ilustra el tamano de partfcula de los complejos de ADN / PPC en formulaciones previamente liofilizadas o no concentradas (0,15 mg/mL de ADN) y despues de la reconstitucion a concentraciones mas altas que vanan de 0,5 mg/mL a 10 mg/mL con el plasmido de lL-12 (Fig. 2A) o el plasmido de luciferasa (Fig. 2B). La reconstitucion a 40 concentraciones mas altas no influye significativamente en el tamano de partfcula, lo que sugiere que los complejos son estables.
Ejemplo 4
Analisis de la condensacion de acido nucleico de formulaciones lfquidas concentradas de acido nucleico con un lipopolfmero cationico
45 En este ejemplo se evalua la capacidad del polfmero PPC para condensar el ADN del plasmido. Se preparan formulaciones altamente concentradas de ADN plasmfdico con iipopolfmero cationico, PPC, como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Los complejos acido nucleico / polfmero son sometidos a electroforesis usando gel de agarosa al 1%. La atraccion electrostatica del ADN de plasmido cargado negativamente con respecto al polfmero de PPC cargado
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positivamente impide que el ADN se desplace a traves del gel de agarosa. Como se muestra en la Fig. 3, se condensa todo el ADN presente en las formulaciones altamente concentradas.
Ejemplo 5
Medicion de la concentracion de acido nucleico en una formulacion lfquida concentrada de acido nucleico con un lipopolfmero cationico
La cantidad de acido nucleico en formulaciones altamente concentradas de complejos de ADN y PPC se cuantifica usando un espectrofotometro AGILENT 8453 (AGILENT TECHNOLOGIES, Inc. Santa Clara, CA). Se diluyen 50 pl de la formulacion con 950 pl de agua para inyeccion (WFI) en una cubeta de cuarzo y se mide la absorbancia usando una longitud de onda de 260 nm. La concentracion de ADN se determina asumiendo una densidad optica 1 (a 260 nm) = 50 pg / mL de ADN.
Ejemplo 6
Medicion de la actividad de transfeccion de formulaciones lfquidas concentradas de acido nucleico con un lipopolfmero cationico
La actividad de transfeccion de formulaciones altamente concentradas de complejos de ADN y PPC se determina in vitro. Se hace una comparacion directa con la de una formulacion no concentrada. Los complejos de transfeccion que contienen luciferasa o plasmido de IL-12 se preparan mediante los metodos descritos en los Ejemplos 1 y 2 y se reconstituyen hasta concentraciones de ADN que vanan entre 0,15 mg/mL y 10 mg/mL. Se siembran celulas Cos-1 (1,5 x 105 celulas / pozo) en placas de cultivo de tejidos de 12 pozos en suero bovino fetal al 10% (FBS). Cada pozo se incuba durante 6 horas con 4 pg de ADN complejado en ausencia de FBS en un volumen total de 500 pl de medio esencial mmimo de Eagle modificado por Dulbecco/Vogt (DMEM). Cuando se concluye el penodo de incubacion, se reemplaza el medio por 1 mL de DMEm fresco suplementado con FBS al 10% durante otras 40 horas. Al final del penodo de incubacion, se midio la actividad de transfeccion en el medio de cultivo celular (IL-12) o lisado celular (luciferasa). Para medir los niveles de IL-12, se analiza el medio de cultivo celular directamente mediante un ensayo de ELISA para IL-12. Para la medicion de luciferasa, las celulas se lavan con solucion salina amortiguada con fosfato y se lisan con amortiguador TENT (Tris-Cl 50 mM [pH 8,0] EDTA 2 Mm, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1%). La actividad de luciferasa en el lisado celular se mide como unidades de luz relativas (RLU) usando un luminometro de microplaca Orion (BERTHOLD DETECTION SYSTEMS, Oak Ridge, TN). Los valores finales de luciferasa se reportan en terminos de RLU/mg de protema total. El nivel de protema total se determina usando un kit de ensayo de protema BCA (PIERCE BIOTECHNOLOGY, Inc., Rockford, IL). Los niveles de expresion de IL-12 y luciferasa a partir de formulaciones altamente concentradas de IL-12 y complejos de plasmido de luciferasa / PPC se muestran en la Fig. 4A y Fig. 4B, respectivamente. Los datos muestran que la actividad de transfeccion de los complejos de acido nucleico en forma altamente concentrada se conserva.
Ejemplo 7
Evaluacion de diversos azucares excipientes en la preparacion de formulaciones lfquidas concentradas de acido nucleico con lipopolfmero cationico y su caracterizacion
Se evaluan dos azucares comunmente usados, lactosa y sacarosa, como potenciales agentes de relleno o carga durante el proceso de liofilizacion para la preparacion de formulaciones altamente concentradas. Los complejos de PPC / ADN se preparan en lactosa y sacarosa cada uno al 3%, 1,5% y 0,3%. Las formulaciones se liofilizan usando el protocolo como en el Ejemplo 1. Despues del proceso de liofilizacion, las formulaciones se reconstituyen con WFI hasta una concentracion final de ADN de 0,5 mg/mL, 1 mg/mL y 5 mg/mL. El tamano de partmula y la transferencia genica in vitro se evaluan para estas diversas formulaciones. Como se muestra en la Tabla 1, se conserva tanto el tamano de partmula como la actividad de transfeccion, ya sea que el relleno crioprotector sea sacarosa o lactosa. Estos resultados muestran que se puede usar mas de un tipo de azucar para preparar concentraciones fisicoqmmica y biologicamente
estables de acido nucleico con polfmero cationico.
Tabla 1
Evaluacion de azucares excipientes en la preparacion de formulaciones isotonicas concentradas de acido nucleico con polfmero cationico.
Lactosa (p/v)
ADN (mg/m) Tamano de partmula (nm) Expresion de Luc (RLU/mg de protema)
5
10
15
20
25
30
Pre-Lio.
Post-Lio. Pre-Lio. Post-Lio. Pre-Lio. Post-Lio. Pre-Lio. Post-Lio.
10,0%
N/A 0,15 N/A 117,00 N/A 8.160.748
3,0%
10,0% 0,15 0,50 123,00 200,00 9.484.771.98
1,5%
10,0% 0,15 1,0 121,00 135,00 7.492.002.47
0,3%
10,0% 0,15 5,00 150,00 209,00 6.442.482.87
Sacarosa (p/v)
DNA (mg/m) Tamano de partfcula (nm) Expresion de Luc (RLU/mg de protema)
Pre-Lio.
Post-Lio. Pre-Lio. Post-Lio. Pre-Lio. Post-Lio. Pre-Lio. Post-Lio.
10,0%
N/A 0,15 N/A 160,00 N/A 12.698.431
3,0%
10,0% 0,15 0,50 137,00 154,00 5.995.053
1,5%
10,0% 0,15 1,00 125,00 206,00 8.004.970
0,3%
10,0% 0,15 5,00 131,00 244,00 9.066.137
Ejemplo 8
Expresion de IL-12 en el parenquima cerebral normal despues de la expresion intracraneal de formulaciones Kquidas concentradas de acido nucleico con lipopoUmero cationico
Se examina la administracion directa de plasmido de IL-12 con polfmero cationico, PPC, en tejido cerebral normal para determinar si la formulacion altamente concentrada de acido nucleico y lipopolfmero cationico es biologicamente activa in vivo. La tincion inmunohistoqmmica de la IL-12 se realiza en rebanadas de cerebros de animales sacrificados 14 dfas o 1 mes despues del tratamiento. El parenquima cerebral de los animales tratados con PPC solo no mostro ninguna tincion con lL-12 (Figura 5A). En contraste, parenquima cerebral de los ratones inyectados con pmIL-12/PPC se tino intracranealmente positivamente para IL-12 (Figura 5B). Este experimento demuestra que la actividad biologica de los complejos de acido nucleico con un polfmero cationico se conserva durante el proceso de concentracion. Ademas, se puede concluir que la citoquina sigue presente durante al menos un mes despues de la inyeccion. Ademas, la presencia de esta citoquina en los cerebros de animales que permanecieron vivos hasta la eutanasia sugiere que la expresion real de IL-12 no causa toxicidad letal en el cerebro.
Ejemplo 9
Eficacia de formulaciones lfquidas concentradas de acido nucleico con lipopolfmero cationico en un modelo de glioma de raton
La eficacia anticancengena de formulaciones altamente concentradas de acido nucleico completamente complejado que expresa el gen de IL-12 se examina en un modelo de glioma de raton. Se implantan tumores en la corteza cerebral de ratones mediante inyeccion intracraneal de 1 x 105 celulas de glioma GL261 junto con la inyeccion conjunta de 3 pl de complejos de IL-12 / PPC a partir de una formulacion altamente concentrada de 5 mg/mL de ADN plasmfdico de IL-12. Se hace seguimiento a los animales para detectar cualquier signo de neurotoxicidad y se les realiza autopsia, cuando sea posible, para confirmar que la muerte se debe al tumor intracraneal. La supervivencia se representa mediante un analisis de supervivencia de Kaplan-Meier. Una sola inyeccion intracraneal de los complejos de pmIL-12/PPC administrados a razon de 15 pg de la dosis del plasmido es bien tolerada ya que no se observan efectos adversos significativos. Una sola inyeccion de los complejos de pmIL-12/PPC a razon de 15 pg de la dosis del plasmido produjo un aumento significativo en la supervivencia animal (Figura 6).
Ejemplo 10
Actividad biologica de formulaciones lfquidas concentradas de acido nucleico con lipopolfmero cationico en pacientes con cancer de ovario
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
La actividad biologica de la formulacion altamente concentrada de acido nucleico totalmente condensado que expresa el gen de IL-12 se examina en pacientes con cancer de ovario recurrente. Cuatro administraciones intraperitoneales semanales de formulaciones isotonicas altamente concentradas de plasmido de IL-12 y PPC en mujeres con cancer de ovario recurrente produjeron niveles significativos de IFN-y, un marcador sustituto de IL-12, en el fluido peritoneal de pacientes tratados. Los niveles de IFN-y varian de 20 a 275 pg/mL de fluido peritoneal. Estos datos demuestran que la formulacion altamente concentrada de acido nucleico de IL-12 es adecuada para la aplicacion clmica.
Ejemplo 11
Evaluacion del efecto de la composicion qmmica del polfmero cationico sobre las propiedades de formulaciones lfquidas concentradas de acido nucleico con lipopolfmero cationico
Los intentos previos han demostrado que la concentracion de formulaciones de acido nucleico con portadores genicos cationicos tales como Kpidos o polfmeros, es altamente desafiante debido a la escasa estabilidad y perdida de transfeccion como resultado del proceso de concentracion. Para determinar si el exito en la produccion de concentraciones fisicoqmmica y biologicamente estables de acido nucleico completamente condensado es unico para la composicion qmmica del polfmero cationico de ensayo, PEG-PEI-Colesterol (PPC), se someten a prueba otros polfmeros cationicos, incluyendo el de PEI libre, PEI ligado al colesterol o PEI ligado a PEG y un liposoma cationico DOTAP. Los complejos de ADN se preparan a razon de 0,15 mg/mL y luego se concentran hasta 0,5 y 5 mg/mL como se describe en el Ejemplo 1. El tamano de partfcula y la actividad de transfeccion se determinan como se describe en los Ejemplos 3 y 6. Como se muestra en las Figs. 7 y 8, los complejos de ADN preparados con PEI libre (PEI1800, PEI15oo0, PEI 25000) o PEI-Colesterol, PEI-PEG o lfpido cationico DOTAP no produjeron complejos estables ya que estos complejos se agregaron y perdieron la actividad de transfeccion despues de liofilizacion y reconstitucion para 0,5 mg/mL o 5 mg/mL. Los efectos desestabilizadores son mas prominentes a 5 mg/mL que a 0,5 mg/mL. En comparacion, los complejos de ADN preparados con PEG-PEI-colesterol (PPC) mantienen sus propiedades fisicoqmmicas y de transfeccion durante la liofilizacion y reconstitucion a altas concentraciones de ADN (Figuras 7 y 8). Estos resultados sugieren la modificacion covalente del polfmero cationico con colesterol y el PEG es cntico para la preservacion de la actividad durante el proceso de concentracion.
Ejemplo 12
Estabilidad a largo plazo de las formulaciones lfquidas liofilizadas o concentradas de acido nucleico con polfmero cationico
Se preparan lotes a gran escala de complejos de IL-12/PPC liofilizados bajo cGMP con el metodo descrito en el Ejemplo 2 y se almacenan a -80°C, -20°C, 4°C y 25°C (HR del 60%) para la evaluacion de la estabilidad. En el momento del analisis, se sacaron los viales del almacenamiento y se anaden 2,4 mL de WFI. Para cada muestra se midieron el pH, la concentracion de ADN, la osmolalidad, el tamano de partfcula y la actividad biologica. Como se muestra en la Figura 9, la concentracion de ADN, el pH, la osmolalidad y el tamano de partfcula de los complejos de IL-12 / PPC se mantienen durante el almacenamiento de dos anos a las temperaturas indicadas. La actividad de transferencia genica de pIL-12/ PPC se cuantifica en celulas COS-1 como se describe en el Ejemplo 6. Las celulas COS-1 se transfectan con el material biologico a razon de 4 |jg de ADN. Los niveles de IL-12 en medios de cultivo celular se cuantifican 48 horas despues de la transfeccion con un kit de ELISA comercialmente disponible. Los resultados de bioactividad del estudio de estabilidad de dos anos se ilustran en la Figura 9. No hay ningun cambio significativo en la bioactividad del producto biologico durante el penodo de almacenamiento a -80°C o -20°C. En el tiempo 0, la actividad es 151 ± 130 pg/mL y el resto de los datos fluctua dentro de esta desviacion estandar, excepto para 25°C donde hay una disminucion consistente en el tiempo. A 4°C se observa una cafda en la actividad de transfeccion a los 360 dfas, pero debido a muestras insuficientes no hay puntos de tiempo de seguimiento disponibles para alcanzar una evaluacion concluyente.
Ejemplo 13
Estabilidad del material reconstituido de formulaciones lfquidas concentradas de acido nucleico con polfmero cationico
La estabilidad del material reconstituido se examina en un estudio separado. Los complejos de ADN de plasmido IL-12/ PPC liofilizados se preparan de acuerdo con el metodo descrito en el Ejemplo 2 y se reconstituyen en agua para inyeccion a razon de 0,5 mg/mL. El material reconstituido se almacena a 4°C. Las muestras se retiran al dfa 60 y 90 y se analizan con respecto al tamano de partfcula, osmolalidad y expresion genica. El producto liofilizado almacenado en viales sellados a -80°C se analiza simultaneamente para comparacion. Como se muestra en la Tabla 2, el EGEN-001 reconstituido es estable a 4°C durante al menos 90 dfas despues de la reconstitucion con WFI. Ninguno de los parametros de estabilidad, incluyendo la concentracion de ADN, el tamano de partfcula, la osmolalidad o la expresion genica, se altera significativamente cuando se compara con el material liofilizado almacenado en viales sellados a - 80°C.
Tabla 2
5
10
15
20
25
30
Estabilidad a largo plazo de la forma reconstituida de formulaciones isotonicas altamente concentradas y totalmente condensadas de acido nucleico con polfmero cationico a 4°C.
Parametros de estabilidad
Dfas
0 60 90 180 270 365
Tamano de partfcula (nm)
102 98 101 97 103 98
Osmolaridad (mOsmol)
303 309 303 312 312 306
pH
2,75 2,66 2,69 2,7 2,73 2,59
ADN (mg/mL)
0,49 0,49 0,50 0,47 0,50 0,50
Expresion de IL-12 (pg/mL)
1220 1681 1164 1062 1409 476,3
Ejemplo 14
Preparacion de formulaciones de ADN estables altamente concentradas de sistemas de suministro de acido nucleico sintetico por formulacion conjunta con PEG-PEI-Colesterol.
Se anade PEG-PEI-Colesterol a sistemas de suministro de acido nucleico sintetico existentes para aumentar la estabilidad de formulaciones de acido nucleico que son generalmente inestables a altas concentraciones de acido nucleico.
En un ejemplo, se anade PEG-PEI-colesterol a formulaciones de ADN preparadas con polietilenimina lineal de 25 kDa (LPEI25kD). Las formulaciones de ADN a una concentracion de 0,15 mg/mL pueden prepararse con LPEI25kD a razon de 10:1 (relacion N:P) en presencia de lactosa al 3%. El lipopolfmero PEG-PEI-Colesterol puede anadirse entonces al complejo de LPE125kD/ADN a diversas relaciones de PPC con respecto al ADN formulado. Por ejemplo, PPC/ADN (relaciones N:P) puede ser (0:1), (1:1), (5:1), (7,5:1), (11:1) y (20:1). Se pueden anadir 500 pl de cada formulacion a 2 mL de viales de vidrio de borosilicato y luego se liofilizan en un sistema de liofilizacion. El programa de liofilizacion consta de los siguientes segmentos:
1) Segmento de congelacion (rampa de 0,25°C/min, mantener a -34°C durante 4 horas),
2) Segmento de secado primario (mantener a -34°C durante 24 horas),
3) Segmento de secado secundario (rampa a -20°C y mantener durante 24 horas), y
4) Rampa a 4°C a razon de 0,25°C/min.
Las formulaciones liofilizadas se pueden reconstituir con agua para inyeccion a razon de 0,5 mg/mL u otra concentracion adecuada.
Debe entenderse que las composiciones descritas anteriormente y los modos de aplicacion son solo ilustrativos de realizaciones preferidas de la invencion. Numerosas modificaciones y disposiciones alternativas pueden ser ideadas por los expertos en la tecnica y las reivindicaciones adjuntas estan destinadas a cubrir tales modificaciones y disposiciones. Por lo tanto, aunque la invencion se ha descrito anteriormente con particularidad y detalle en relacion con lo que actualmente se considera que son las realizaciones mas practicas y preferidas de la invencion, sera evidente para los expertos en la tecnica que pueden hacerse numerosas modificaciones, pero sin limitarse a, variaciones de tamano, materiales, aspecto, forma, funcion y modo de operacion, montaje y uso.

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    Reivindicaciones
    1. Una composicion que comprende:
    (a) una mezcla de un lipopoKmero cationico y al menos 0,5 mg/mL de un acido nucleico suspendido en una solucion acuosa, donde
    el lipopoUmero cationico comprende una cadena principal de polietilenimina (PEI) unida covalentemente independientemente a grupos colesterol y polietilenglicol, y la relacion molar de colesterol a polietilenimina es de 0,1 a 10 y la relacion molar de polietilenglicol a polietilenimina es de 0,1 a 10; y
    (b) un excipiente de relleno.
  2. 2. Una composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la composicion comprende acido nucleico condensado.
  3. 3. Una composicion de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en la que la relacion molar de nitrogeno de amina en la cadena principal de polietilenimina con respecto al fosfato en el acido nucleico es de 0,1:1 a 100:1.
  4. 4. Una composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el acido nucleico es un plasmido que codifica para un peptido seleccionado del grupo que consiste en interleuquina 2, interleuquina 4, interleuquina 7, interleuquina 12, interleuquina 15, interferon a, interferon p, interferon y, factor estimulante de colonias, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrofagos, agentes angiogenicos, factores de coagulacion, agentes hipoglucemicos, factores de apoptosis, agentes antiangiogenicos, timidina quinasa, p53, IP10, TNF-a, ligando Fas, antfgenos tumorales, neuropeptidos, antfgenos virales, antfgenos bacterianos, y combinaciones de los mismos.
  5. 5. Una composicion de acuerdo con la reivindicacion 1 anterior, en la que una relacion molar de polietilenglicol con respecto a la cadena principal de polietilenimina en el lipopolfmero cationico esta dentro del intervalo de 1 a 10.
  6. 6. Una composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el excipiente de relleno es un miembro seleccionado del grupo que consiste en azucares, alcoholes de azucar, almidones, celulosas y combinaciones de los mismos.
  7. 7. Una composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el acido nucleico es un plasmido que codifica para el gen de la interleuquina 12.
  8. 8. Una composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que al menos parte del acido nucleico forma un complejo y se condensa con el lipopolfmero cationico suspendido en medio acuoso.
  9. 9. Una composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la relacion molar PEG:PEI: colesterol en el lipopolfmero cationico esta dentro del intervalo de 2-3:1:0,25-1.
  10. 10. Una composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que al menos el 30% en peso del acido nucleico se condensa.
  11. 11. Una composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la relacion de nitrogeno de amina en la cadena principal de polietilenimina con respecto al fosfato en el acido nucleico es de 11:1 a 20:1.
  12. 12. Un metodo para preparar una composicion farmaceutica que comprende al menos 0,5 mg/mL de un acido nucleico suspendido en una solucion isotonica, comprendiendo el metodo:
    combinar un acido nucleico, un lipopolfmero cationico y un excipiente de relleno en un medio acuoso, comprendiendo el lipopolfmero cationico una polietilenimina unida covalentemente independientemente a grupos de colesterol y polietilenglicol y la relacion molar del colesterol con respecto a la cadena principal de polietilenimina es de 0,1 a 10 y la relacion molar de polietilenglicol con respecto a la cadena principal de polietilenimina es de 0,1 a 10;
    liofilizar la mezcla hasta un polvo; y
    reconstituir el polvo con un diluyente para formar una solucion que incluye al menos 0,5 mg/mL de acido nucleico condensado en una solucion isotonica.
  13. 13. Una composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que la composicion es una composicion farmaceutica seca.
  14. 14. Una composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o 13 para uso en el tratamiento de enfermedades y/o trastornos, en la que por ejemplo se transfectan varias celulas o tejidos.
    5 15. Una composicion para el uso de acuerdo con la reivindicacion 14, en la que la composicion se administra en un
    organismo de sangre caliente y, en donde la celula esta localizada en un tejido seleccionado del grupo que consiste en ovario, utero, estomago, colon, recto, hueso, sangre, intestino, pancreas, mama, cabeza, cuello, pulmones, bazo, hngado, rinon, cerebro, tiroides, prostata, vejiga urinaria, tiroides, piel, cavidad abdominal, cavidad toracica y combinaciones de los mismos.
    10
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