JP6027592B2 - 核酸−リポポリマー組成物 - Google Patents
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Description
1グラムの分岐性ポリエチレンイミン(PEI)1800Da(0.56mM)を、5mlのクロロホルムに溶解し、ml丸底フラスコに入れ、室温で20分間攪拌する。クロロギ酸コレステリル(0.84mM)380ミリグラム及び活性化したメトキシポリエチレングリコール(MPEG−SPA、メトキシポリエチレングリコール−プロピオン酸N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル)(550Da)(0.91mM)500mgを5mlのクロロホルムに溶解し、PEI溶液を含有している丸底フラスコの上部に置かれた添加漏斗に移す。クロロホルム中でクロロギ酸コレステリル及びMPEG−SPAの混合物を、室温で5〜10分かけて、ゆっくりとPEI溶液に添加する。溶液をさらに室温で4時間攪拌する。溶媒をロータリーエバポレーターにより除去した後、残留している粘着物質を、酢酸エチル20mlに攪拌しながら、溶解する。n−ヘキサン20mlをゆっくりと添加することにより、生成物を溶媒から沈殿させ、液体を生成物から静かに注ぐ。生成物を酢酸エチル/n−ヘキサン(1/1;v/v)の20ml混合物を使って、2回洗浄する。液体を静かに注いだ後、10〜15分窒素ガスをパージすることにより、物質を乾燥させる。物質を10mlの0.05N HClに溶解し、アミン基の塩形態を調製する。水溶液を0.2μmの濾過紙で濾過する。最終生成物を凍結乾燥により得る。
分岐性PEI(BPEI)20グラム(11.1mmol)及び乾燥クロロホルム200mLを一緒に混合し、BPEIを溶解する。溶解後、乾燥クロロホルム200mL中にクロロギ酸コレステリル4g及び活性化したメトキシポリエチレングリコール(MPEG−SPAメトキシポリエチレングリコール−プロピオン酸N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、MPEG MW550、エステルMW719)18.7g(26mmol)を含有する溶液を、20〜30分かけて、攪拌しながら、反応混合物に滴下添加した後、3〜4時間のインキュベーション期間を置く。次いで、混合物を真空下で放置し、溶液を濃縮し、残留クロロホルムを除去する。得られた残留物を1Mの水性HCl320mLに溶解し、攪拌する。PPC塩酸塩のこの溶液を再度、真空下で濃縮し、非常に粘着性のある物質を得る。PPC塩酸塩を単離し、反応副生成物及び未反応出発物質を除去するために、濃縮した混合物をアセトン(<0.4%水)と混合して攪拌し、自由流動物質として、PPC塩酸塩の沈殿を生じさせる。沈殿の後、上澄み液を廃棄する。吸湿性のPPC塩酸塩を真空下で乾燥させる。
分岐性PEI1800(0.1mM)180ミリグラムをクロロギ酸エステル4mlに溶解し、室温で30分間攪拌する。クロロギ酸コレステリル(0.14mM)70ミリグラム及びPEG330(0.14mM)48mgをクロロギ酸エステル1mlに溶解し、シリンジを使用して、3〜10分かけて、ゆっくりとPEI溶液に添加する。混合物を室温で4時間攪拌する。沈殿のために、酢酸エチル10mlを添加した後、溶液を−20℃で一晩かけてインキュベートした後、液体をフラスコから静かに注ぐ。残留物質を酢酸エチル/n−ヘキサン(l/l;v/v)の5ml混合物を使って、2回洗浄する。10〜15分の窒素パージにより、残留物質を乾燥させ、10mlの0.05N HClに20分間溶解した後、溶液を0.2μmシリンジフィルターで濾過する。水溶液をフリーズドライ法により凍結乾燥させ、ポリマーから水分を除去する。
25kDa直鎖状PEI(0.02mM)500ミリグラムを30mlに溶解し、30分間、65℃で攪拌する。三口フラスコに縮合及び添加漏斗を装備する。クロロホルム5ml中のmPEG−NHS1000(0.2mM)200mgとクロロギ酸コレステリル(0.08mM)40mgとの混合物を、3〜10分かけて、PEI溶液にゆっくりと添加する。溶液をさらに4時間、65℃で絶えず攪拌し、容積をロータリーエバポレーターで約5mlに減少する。溶液をエチルエーテル50mlに沈殿させ、遊離コレステロールを除去し、液体をフラスコから静かに注ぎ、エチルエーテル20mlを使って、残留物質を2回洗浄する。純窒素で乾燥させた後、物質を2.0N HCl10ml及びトリフルオロ酢酸2mlの混合物に溶解する。溶液をMWCO 15000透析管を使って、脱イオン水に対して48時間透析し、12時間ごとに新鮮な水に交換する。溶液を凍結乾燥し、水分を除去する。
PEI(MW:1200ダルトン)1グラムを、無水メチレンクロリド15mLとトリエチルアミン(TEA)100μlとの混合物に溶解する。30分間、氷の上で攪拌後、クロロギ酸コレステリル溶液1.2gをPEI溶液にゆっくりと添加し、混合物を氷の上で一晩攪拌する。得られた生成物を、エチルエーテルを添加して沈殿させた後、遠心分離し、続いて追加のエチルエーテル及びアセトンを使って洗浄する。非水溶性リポポリマーをクロロホルムに溶解し、最終濃度0.08g/mLを得る。合成及び精製に続き、MALDI−TOFF MS及び1H NMRを使って、非水溶性リポポリマーの特性を求める。
PEI(MW:1800ダルトン)3グラムを、無水エチレンクロリド10mlとトリエチルアミン100μlとの混合物中で、氷の上で30分間攪拌する。クロロギ酸コレステリル1グラムを、氷のように冷たい無水メチレンクロリド5mlに溶解した後、30分かけて、PEI溶液にゆっくりと添加する。混合物を氷の上で12時間攪拌し、得られた生成物をロータリーエバポレーターで乾燥する。粉末を0.1N HCl50mlに溶解する。メチレンクロリド100mLを使って、水溶液を3回抽出した後、ガラスマイクロファイバフィルターで濾過する。生成物を溶媒蒸発により濃縮し、大過剰なアセトンで沈殿させ、真空下で乾燥させる。MALDI−TOFマススペクトロフォトメトリー及び101H NMRを使って、生成物を分析する。水溶性リポポリマー1800のNMR結果は、PEIに共役したコレステロールの量が約47%と示される。PEACEのMALDI−TOFF質量分光分析では、その分子量が約2200と示される。これは、一部は共役していない又はモル比2/1(コレステロール/PEI)で共役しているが、PEACE1800の大多数では、コレステロールとPEIとのモル比は1/1であることを示唆する。
50ミリグラムのPEI1800を、氷の上で無水メチレンクロリド2mLに溶解する。次に、クロロギ酸ベンジル200μLを反応混合物にゆっくりと添加し、溶液を氷の上で4時間攪拌する。攪拌の後、メチレンクロリド10mLを添加し、飽和NH4Cl15mLを使って、溶液を抽出する。硫酸マグネシウムを使って、メチレンクロリド相から水を除去する。溶液の容積を真空下で減少させ、エチルエーテルを使って、生成物である、CBZで保護されたPEIを沈殿させる。一級アミンCBZ保護されたPEI50ミリグラムを、メチレンクロリドに溶解し、クロロギ酸コレステロール10mgを添加し、溶液を12時間、氷の上で攪拌する。エチルエーテルを使って、生成物である、CBZで保護されたリポポリマーを沈殿させ、アセトンで洗浄した後、水素供与体としてのH2のもとで、触媒としてパラジウム活性化炭素を含むDMF中で溶解する。混合物を室温で15時間攪拌し、CELITE(登録商標)で濾過し、溶液の容積をロータリーエバポレーターで減少させる。エチルエーテルによる沈殿から、最終生成物を得る。
NH2−PEG−COOH3400(0.15mM)500ミリグラムを、室温で30分間、無水クロロホルム5mlに溶解した。無水クロロホルム1ml中クロロギ酸コレステロール(1.5mM)676mgの溶液を、PEG溶液にゆっくりと添加した後、さらに4時間、室温で攪拌する。混合物を1時間、氷の上でエチルエーテル500ml中に沈殿させた後、エチルエーテルを使って3回洗浄し、共役していないコレステロールを除去する。窒素パージで乾燥させた後、粉末を0.05N HCl5mlに溶解し、PEG上のカルボキシル基を酸性化させる。物質をフリーズドライヤーで乾燥させる。PEI1800(0.056mM)100ミリグラム、DCC50mg及びNHS50mgを室温でクロロホルム5mlに溶解し、混合物を20分間攪拌した後、クロロホルム1ml中chol−PEG−COOH380mgの溶液をPEI溶液にゆっくりと添加する。室温で6時間攪拌した後、ロータリーエバポレーターを使って、有機溶媒を除去した。残留物質を脱イオン水10mlに溶解し、FPLCで精製した。
カチオン性リポポリマーを有する縮合された核酸の濃縮液体製剤の調製
この例では、ベンチスケール産生での完全に縮合された核酸の高度に濃縮された製剤の調製を説明する。これは、カチオン性ポリマーを有する核酸複合体の調製の後、凍結乾燥し、等張液に再構成することを含む。使用される核酸は、IL−12又はルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドDNAであり、ポリマーは、ポリエチレングリコール(PEG)及びコレステロール(Chol)に共有結合したポリエチレンイミン(PEI)骨格を含んでいた(PEG−PEI−Chol又はPPC)。PEGとPEIとの間及びコレステロールとPEIとの間のモル比は、それぞれ0.5〜10、0.1〜10である。まず、DNA及びPPC溶液を、注入用の水中で、5mg/mlで別々に調製し、その後、3%ラクトースで0.15mg/ml(DNA)及び0.554mg/ml(PPC)に希釈する。マイクロピペットを使って、窒素対リン酸塩比(N:P比)11:1で、ラクトース溶液中DNAを、ラクトース溶液中PPCに添加し、製剤を室温で15分間インキュベートし、複合体が形成できるようにする。3%ラクトース中PPC/DNA複合体を、ミズーリ州カンザスシティのLABCONCO社のFREEZONEフリーズドライシステムを使って、凍結乾燥する。調製した製剤500μlを2mlのホウケイ酸ガラス瓶に添加し、次に以下のセグメントからなるフリーズドライプログラムを使って凍結乾燥した:
1)凍結セグメント(0.25℃/分でランプ、34℃で4時間保持)
2)1次乾燥セグメント(34℃で24時間保持)
3)2次乾燥セグメント(20℃にランプし、24時間保持)及び
4)0.25℃/分で4℃にランプ。
上記の実施例1で概要を記した手順に基本的に従って、11:1のN:P比で、カチオン性リポポリマー及びIL−12核酸を使って、核酸/カチオン性リポポリマー製剤を調製する。カチオン性リポポリマーは、PEG:PEI:コレステロールのモル比約2.5:1:0.6及び分子量(遊離塩基)約3.54kDを有する。ラクトースを含有する、得られた製剤は凍結乾燥され、核酸の凝集又は大幅なトランスフェクション活性の損失を伴わずに、少なくとも約0.5mg/mlの核酸濃度に再構成することができる。
カチオン性リポポリマーを有する縮合された核酸の濃縮液体製剤の調製
この例では、図1に示すように、縮合された核酸の高度に濃縮された製剤の調製を説明する。このプロトコルは、(実施例1に記載の小規模調製から産生される100〜200mgのDNAとは対照的に)6000mgを超える完全に製剤化されたDNAを産生し、さらに高い産生量にまで拡大することが可能である。スケールアップした方法は、蠕動ポンプを使って、大量のDNA及びポリマー溶液を混合し、オンライン混合シナリオを達成し、複合体を形成した後、大容量に対応可能なフリーズドライサイクルを実施することを伴った。簡単に言うと、DNA及びPPC溶液を、3%ラクトース中で、それぞれ0.3mg/ml、1.1mg/mlで調製する。シリコン管(WATSON MARLOW、Z982−0088)の内径が0.89mmの蠕動ポンプ(WATSON MARLOW、SCI400)を使って、流量225±25ml/分で、2つの成分を、一定の流量で結合させる。2つの混合物を、各管の端でポリプロピレンTコネクターを使って接合する。ポリマー及びDNA溶液の混合により、ナノ粒子が即座に形成された。製剤された複合体40ミリリットルを100mlのガラス瓶に入れ、次のセグメントからなるフリーズドライプログラムを使って凍結乾燥する:
1)最大720分間−50℃で予備凍結し、
2)65μmHgで、最大180分間−40℃で、次に最大1980分間−34℃で1次乾燥し、
3)65μmHgで、最大720分間−25℃で、最大3180分間−15℃で、最大1500分間−10℃で、そして最大1440分間4℃で2次乾燥する。
カチオン性リポポリマーを有する縮合された核酸の濃縮液体製剤の粒径の測定
カチオン性リポポリマーを有するプラスミドDNA、即ちPPC、の高度に濃縮された製剤を、実施例1及び2に記載されているとおりに調製する。ポリマー/核酸の粒径の測定のために、ニューヨーク州ホルツビルのBROOKHAVEN INSTRUMENTS社の90Plus/BI−MAS Particle Sizerを使って、一定分量の液体製剤を分析する。具体的には、分析のために、製剤50μlを、ポリスチレンキュベットに入れたミリQ水950μlに添加する。
カチオン性リポポリマーを有する核酸の濃縮液体製剤の核酸縮合体の分析
この例では、PPCポリマーがプラスミドDNAを縮合する能力を評価する。カチオン性リポポリマーを有するプラスミドDNAの高度に濃縮された製剤、即ちPPC、を、実施例1及び2に記載されているとおりに調製する。1%のアガロースゲルを使って、核酸/ポリマー複合体を電気泳動させる。正に帯電したPPCポリマーに対する負に帯電したプラスミドDNAの静電気引力により、DNAはアガロースゲルの中を移動することができない。図3に示すように、高度に濃縮された製剤中に存在するDNAはすべて縮合される。
カチオン性リポポリマーを有する核酸の濃縮液体製剤の核酸濃度の測定
AGILENT 8453分光光度計(カリフォルニア州サンタクララのAGILENT TECHNOLOGIES社)を使って、DNA及びPPC複合体中の高度に濃縮された製剤中の核酸の量を測定する。クオーツキュベット中の注入用の水(WFI)950μlを使って、製剤50μlを希釈し、波長260nmを使って、吸光速度を測定する。(260nmにおいて)1光学密度=DNA 50μg/mlと仮定して、DNA濃度を測定する。
カチオン性リポポリマーを有する核酸の濃縮液体製剤のトランスフェクション活性の測定
DNA及びPPC複合体の高度に濃縮された製剤のトランスフェクション活性をin vitroで測定する。濃縮されていない製剤との直接的な比較を実施する。実施例1及び2に記載の方法により、ルシフェラーゼ又はIL−12プラスミドを含むトランスフェクション複合体を調製し、0.15mg/mlから10mg/mlまでのDNA濃度で再構成する。Cos−1細胞(1.5×105細胞/ウェル)を、10%のウシ胎仔血清(FBS)中で、12ウェルの組織培養プレートに播種する。合計容積500μlのDulbecco/Vogt Modified EagleのMinimal Essential Medium(DMEM)で、FBSの非存在下で、複合体DNA4μgを使って、各ウェルを6時間、インキュベートする。インキュベーション期間が終了したら、さらに40時間、10%FBSを補給して、培地を1mlの新鮮DMEMに交換する。インキュベーション期間の終了時に、トランスフェクション活性を細胞培養培地(IL−12)又は細胞溶解物(ルシフェラーゼ)で測定した。IL−12レベルの測定には、IL−12 ELISA分析により、細胞培養培地を直接分析する。ルシフェラーゼ測定には、リン酸緩衝食塩水を使って、細胞を洗浄し、TENT緩衝液(50mM Tris−Cl[pH8.0]2 Mm EDTA、150mM NaCl、1%Triton X−100)を使って溶解する。Orion Microplate Luminometer(テネシー州オークリッジのBERTHOLD DETECTION SYSTEMS)を使って、細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性を相対的な光強度値(RLU)として測定する。ルシフェラーゼの最終的な値は、RLU/総タンパク質量(mg)の単位で報告される。合計タンパク質レベルは、BCAタンパク質分析キット(イリノイ州ロックフォードのPIERCE BIOTECHNOLOGY社)を使って測定する。IL−12及びルシフェラーゼプラスミド/PPC複合体の高度に濃縮された製剤からのIL−12及びルシフェラーゼ発現のレベルを、それぞれ図4A及び4Bに示す。データは、高度に濃縮された形態での核酸複合体のトランスフェクション活性が保存されることを示している。
カチオン性リポポリマーを有する核酸の濃縮液体製剤の調製物における様々な賦形剤の糖及びその特性の評価
2つの一般に用いられている糖、ラクトース及びスクロースを、高度に濃縮された製剤の調製物の凍結乾燥工程中に利用可能な膨化剤又はフィラー剤の候補として評価する。PPC/DNA複合体を、各々、ラクトース及びスクロースで、3%、1.5%及び0.3%で調製する。実施例1のプロトコルを使って、製剤を凍結乾燥する。フリーズドライ工程後、WFIを使って、製剤を再構成し、最終的なDNA濃度を0.5mg/ml、1mg/ml及び5mg/mlとして再構成する。粒径及びin vitro遺伝子導入をこれらの種々の製剤について評価する。表1に示すように、凍結防止フィラーがスクロースとラクトースのいずれであっても、粒径及びトランスフェクション活性はどちらも保存される。これらの結果は、カチオン性ポリマーを有する核酸の物理化学的及び生物学的に安定な高濃縮物を調製する目的に、2種類以上の糖が利用できることを示している。
表1
カチオン性リポポリマーを有する核酸の濃縮された等張製剤の調製物における賦形剤の糖の評価
カチオン性リポポリマーを有する核酸の濃縮液体製剤の頭蓋内発現後の正常脳実質におけるIL−12発現
核酸及びカチオン性リポポリマーの高度に濃縮された製剤がin vivoで生物学的に活性であるかどうかを判断するために、カチオン性ポリマーを有するIL−12プラスミド、即ち、PPCの正常脳組織への直接投与を調べる。治療後、14日後又は1カ月後に安楽死させた動物から得た脳のスライスに、IL−12の免疫組織化学染色を施す。PPCのみで治療した動物の脳実質は、IL−12染色を一切示さなかった(図5A)。対照的に、pmIL−12/PPCを注入したマウスの脳実質は、頭蓋内でIL−12にポジティブな染色を示した(図5B)。この実験は、カチオン性ポリマーを有する核酸複合体の生物活性が、濃縮工程中に保存されることを実証している。加えて、注入後、サイトカインが少なくとも1カ月間、存在し続けると結論づけることもできる。さらに、安楽死させるまで生存していた動物の脳内にこのサイトカインが存在していることは、IL−12の実際の発現は、脳に致命的な有毒性を引き起こさないことを示唆する。
マウスの神経膠腫モデルにおけるカチオン性リポポリマーを有する核酸の濃縮液体製剤の有効性
IL−12遺伝子を発現している、完全に複合化された核酸の高度に濃縮された製剤の抗がん効果を、マウスの神経膠腫モデルで調べる。5mg/mlのIL−12プラスミドDNAの高度に濃縮された製剤からの3μlのIL−12/PPC複合体の同時注入と一緒に、1×105のGL261神経膠腫細胞の頭蓋内注入を行い、マウスの大脳皮質に腫瘍を植え込む。神経毒性の兆候の有無について動物を監視し、可能なときは、死亡の原因が頭蓋内腫瘍であることを確認するために、死体を解剖する。カプラン−マイヤー生存分析法を使って、生存をプロットする。プラスミド投与量15μgで投与されるpmIL−12/PPC複合体の単回頭蓋内注入は、有意な有害事象は観察されていないため、十分に許容される。プラスミド投与量15μgでのpmIL−12/PPC複合体の単回注入は、動物の生存を有意に向上する結果を示した(図6)。
卵巣がん患者におけるカチオン性リポポリマーを有する核酸の濃縮液体製剤の生物活性
IL−12遺伝子を発現している、完全に縮合された核酸の高度に濃縮された製剤の生物活性を、再発性卵巣がん患者で調べる。IL−12プラスミド及びPPCの高度に濃縮された等張性製剤を、再発性卵巣がんを罹患している女性に、毎週1回の腹腔内投与を4回実施した結果、治療患者の腹水において、IL−12の代理マーカー、IFN−γの有意なレベルが生じた。IFN−γレベルは、腹水1ml当たり20から275pgまで変動する。これらのデータは、IL−12核酸の高度に濃縮された製剤は、臨床応用に適していることを実証している。
カチオン性リポポリマーを有する核酸の濃縮液体製剤の特性におけるカチオン性ポリマーの化学組成の影響の評価
脂質又はポリマー等のカチオン性遺伝子担体を有する核酸製剤の濃縮は、濃縮工程の結果、安定性が低く、トランスフェクションが失われるため、極めて困難であることが、これまでの試みで明らかにされてきた。物理化学的及び生物学的に安定した、高濃度の完全に縮合された核酸の製造に成功したのは、テストカチオン性ポリマー、PEG−PEI−コレステロール(PPC)の化学組成に固有であるかを判定するために、遊離PEI、コレステロールに結合したPEI又はPEGに結合したPEI及びカチオン性リポソームDOTAPを含めて、他のカチオン性ポリマーをテストする。実施例1に記載されているとおりに、DNA複合体を0.15mg/mlで調製した後、0.5及び5mg/mlに濃縮する。実施例3及び6に記載されているとおりに、粒径及びトランスフェクション活性を測定する。図7及び8に示すように、遊離PEI(PEI1800、PEI15000、PEI25000)又はPEI−コレステロール、PEI−PEG又はカチオン性脂質DOTAPを使って調製したDNA複合体は、凍結乾燥し、0.5mg/ml又は5mg/mlに再構成した後、凝集し、トランスフェクション活性を失ったため、安定した複合体を産生しなかった。不安定化作用は、0.5mg/mlよりも5mg/mlでより顕著である。対照的に、PEG−PEI−コレステロール(PPC)を使って調製されたDNA複合体は、凍結乾燥中及び高いDNA濃度での再構成中も物理化学的特性及びトランスフェクション特性を維持する(図7及び8)。これらの結果は、コレステロール及びPEGによるカチオン性ポリマーの共有結合修飾は、濃縮工程中の活性保存に不可欠であることを示唆する。
カチオン性ポリマーを有する核酸の凍結乾燥又は濃縮した液体製剤の長期安定性
凍結乾燥したIL−12/PPC複合体の大規模ロットを、実施例2に概要を示した方法を使って、cGMPのもとで調製し、安定性評価のために、−80℃、−20℃、4℃及び25℃(60%RH)で保管する。分析時に、瓶を保管場所から取り出し、2.4mLのWFIを添加する。試料ごとに、pH、DNA濃度、オスモル濃度、粒径及び生物活性を測定した。図9に示すように、IL−12/PPC複合体のDNA濃度、pH、オスモル濃度及び粒径は、指示温度で2年間、保存される。pIL−12/PPCの遺伝子導入活性は、実施例6に記載されているとおりに、COS−1細胞で定量化する。COS−1細胞に、DNA4μgで生物由来物質を使ってトランスフェクトする。細胞培養培地のIL−12のレベルを、市販されているELISAキットを使って、トランスフェクションの48時間後、定量化する。2年間の安定性研究から得た生物活性結果を図9に示す。−80℃又は−20℃での保管期間中、生物学的生成物の生物活性に有意な変化はない。0時間で、活性は151±130pg/mLであり、時間の経過に従い、常に低下を示す25℃を除き、残りのデータは、この標準偏差の範囲内で変動する。4℃では、トランスフェクション活性の低下が360日後に観察されるが、試料の不足のため、結論的な評価に到達できるだけの追跡時点がない。
カチオン性ポリマーを有する核酸の濃縮液体製剤の再構成した物質の安定性
再構成した物質の安定性を別の研究で調べる。凍結乾燥したIL−12プラスミドDNA/PPC複合体を、実施例2に記載の方法に従って調製し、注入用の水の中で0.5mg/mlに再構成する。再構成した物質を4℃で保管する。60日後及び90日後に試料を取り出し、粒径、オスモル濃度及び遺伝子発現について分析する。密封瓶に入れ、−80℃で保管された凍結乾燥生成物を、比較のために、同時に分析する。表2に示すように、再構成したEGEN−001は、WFIによる再構成後、少なくとも90日間、4℃で安定性がある。DNA濃度、粒径、オスモル濃度又は遺伝子発現も含めて、安定性のパラメーターは、密封瓶に入れ、−80℃で保管された凍結乾燥物質と比較して、有意な変化はない。
表2
4℃でカチオン性ポリマーを有する核酸の高度に濃縮され、完全に縮合された、等張性製剤の再構成された形態の長期安定性
PEG−PEI−コレステロールを使った共製剤化による合成核酸送達システムの高度に濃縮され、安定性のあるDNA製剤の調製
PEG−PEI−コレステロールを既存の合成核酸送達システムに添加し、高い核酸濃度では、通常、不安定な核酸製剤の安定性を高める。
1)凍結セグメント(0.25℃/分でランプ、−34℃で4時間保持)、
2)1次乾燥セグメント(−34℃で24時間保持)、
3)2次乾燥セグメント(−20℃にランプし、24時間保持)及び
4)0.25℃/分で4℃にランプ。
Claims (25)
- 等張液に懸濁された0.5〜20mg/mlの核酸を含み、該核酸は50nm〜300nmの粒子径を有する医薬組成物の、以下を含む製造方法:
水性溶媒中で核酸、カチオン性リポポリマー及びフィラー賦形剤を混合すること、ここで該カチオン性リポポリマーはコレステロール及びポリエチレングリコール(PEG)基に独立に共有結合されたポリエチレンイミン(PEI)を含み、該カチオン性リポポリマー中におけるモル比PEG:PEI:コレステロールを0.1〜10:1:0.1〜10の範囲にあり、核酸とカチオン性リポポリマーの前記混合物は複合体を形成する;
前記混合物を粉末に凍結乾燥すること、及び
希釈液で前記粉末を再構成して、等張液に0.5〜20mg/mlの縮合核酸を含む溶液を形成すること。 - ポリエチレンイミン骨格中のアミン窒素対核酸中のリン酸塩のモル比が、10:1〜20:1である、請求項1に記載の方法。
- 以下を含む凍結乾燥医薬組成物:
(a)フィラー賦形剤、(b)核酸及び(c)カチオン性リポポリマーの混合物、ここで該カチオン性リポポリマーはコレステロール及びポリエチレングリコール(PEG)基に独立に共有結合されたポリエチレンイミン(PEI)を含み、
該カチオン性リポポリマー中におけるモル比PEG:PEI:コレステロールは0.1〜10:1:0.1〜10の範囲であり、及び
核酸とカチオン性リポポリマーの前記混合物は複合体を形成している。 - 核酸の凝集を伴わずに、少なくとも0.5mg/mlの核酸濃度に再構成することが可能な、請求項3に記載の凍結乾燥医薬組成物。
- 下記を含む哺乳類細胞の形質移入に用いられる医薬の調製のための請求項3に記載の凍結乾燥医薬組成物の使用:
前記哺乳類細胞を前記医薬に接触させること、及び
前記哺乳類細胞のインキュベートを、前記医薬が細胞に入り、核酸の生物活性を引き出せるようにする条件下で行うこと。 - 下記を含む標的組織の形質移入に用いられる医薬の調製のための請求項3に記載の凍結乾燥医薬組成物の使用であって、前記医薬を温血生命体に送達することを含む使用。
- 医薬の送達が、腫瘍内、腹腔内、静脈内、動脈内、気管内、肝内門、経口、頭蓋内、筋肉内、関節内及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項6に記載の使用。
- 標的組織、液体又は器官が、卵巣、子宮、胃、結腸、直腸、骨、血液、腸、膵臓、胸部、頭部、頚部、肺、脾臓、肝臓、腎臓、脳、甲状腺、前立腺、膀胱、皮膚、腹腔、胸腔及びそれらの組合せからなる群から選択される要素に局所化される、請求項7に記載の使用。
- カチオン性ポリマー骨格中のアミン窒素対核酸中のリン酸塩の比が10:1から20:1である、請求項3に記載の凍結乾燥医薬組成物。
- 下記を含む哺乳類細胞の形質移入に用いられる医薬の調製のための請求項9に記載の凍結乾燥医薬組成物の使用:
前記哺乳類細胞を前記医薬に接触させること、及び
前記哺乳類細胞のインキュベートを、前記医薬が細胞に入り、核酸の生物活性を引き出せるようにする条件下で行うこと。 - 核酸がインターロイキン−12遺伝子をコードするプラスミドである、請求項3に記載の凍結乾燥医薬組成物。
- 核酸が阻害リボ核酸をコードするプラスミドである、請求項3に記載の凍結乾燥医薬組成物。
- 核酸が合成の短い干渉リボ核酸である、請求項3に記載の凍結乾燥医薬組成物。
- フィラー賦形剤が、糖、糖アルコール、デンプン、セルロース及びそれらの組合せからなる群から選択される要素である、請求項3に記載の凍結乾燥医薬組成物。
- フィラー賦形剤がスクロースである、請求項3に記載の凍結乾燥医薬組成物。
- フィラー賦形剤がラクトースである、請求項3に記載の凍結乾燥医薬組成物。
- 懸濁された0.5〜20mg/mlの核酸、カチオン性リポポリマー及びフィラー賦形剤の混合物を等張液中に含む、医薬組成物:
前記核酸は50nm〜300nmの粒子径を有し、
前記カチオン性リポポリマーはコレステロール及びポリエチレングリコール(PEG)基に独立に共有結合されたポリエチレンイミン(PEI)を含み、該カチオン性リポポリマー中におけるモル比PEG:PEI:コレステロールは0.1〜10:1:0.1〜10の範囲にあり、
前記核酸及びカチオン性リポポリマーは複合体を形成している。 - 下記を含む哺乳類細胞の形質移入に用いられる医薬の調製のための請求項17に記載の再構成された医薬組成物の使用:
前記哺乳類細胞を前記医薬に接触させること、及び
前記哺乳類細胞のインキュベートを、前記医薬が細胞に入り、核酸の生物活性を引き出せるようにする条件下で行うこと。 - 下記を含む標的組織の形質移入に用いられる医薬の調製のための請求項17に記載の再構成された医薬組成物の使用であって、前記医薬を温血生命体に送達することを含む使用。
- 医薬の送達が、腫瘍内、腹腔内、静脈内、動脈内、気管内、肝内門、経口、頭蓋内、筋肉内、関節内及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項19に記載の使用。
- 標的組織、液体又は器官が、卵巣、子宮、胃、結腸、直腸、骨、血液、腸、膵臓、胸部、頭部、頚部、肺、脾臓、肝臓、腎臓、脳、甲状腺、前立腺、膀胱、皮膚、腹腔、胸腔及びそれらの組合せからなる群から選択される要素に局所化される、請求項19に記載の使用。
- 核酸がインターロイキン−12遺伝子をコードするプラスミドである、請求項17に記載の医薬組成物。
- 核酸が阻害リボ核酸をコードするプラスミドである、請求項17に記載の医薬組成物。
- 核酸が合成の短い干渉リボ核酸である、請求項17に記載の医薬組成物。
- 少なくとも0.5mg/mlの核酸濃度であり核酸の凝集を伴わない、請求項17に記載の医薬組成物。
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