JP6027592B2 - 核酸−リポポリマー組成物 - Google Patents

Description

本発明は、核酸及びリポポリマーを含む、濃縮され、安定性のある製剤、その組成物、調製方法及び応用に関する。したがって、本発明は、分子生物学及び生化学の分野に関わる。

合成遺伝子送達ベクターは、より良い安全性コンプライアンス、単純な化学及び費用効果の高い製造のため、ウイルスベクターに比べ、相当な利点がある。しかし、ウイルスベクターに比べて、合成ベクターはトランスフェクション効率が低いため、合成遺伝子送達システムにおける発展の大半は、送達効率を向上することに集中してきた。結果として、製剤の安定性、スケールアップ及び投薬の柔軟性に問題が見つかっていたにもかかわらず、合成送達システムの薬学的発展には、ほとんど注意が向けられてこなかった。自己組織化してナノ粒子を形成するＤＮＡを含む薬剤は、特に製剤が水性懸濁液であるとき、しばしば低い安定性を示す。そのような製剤において、合成ベクターを有するＤＮＡは、一般に、とりわけ臨床現場で最適投薬のために必要とされる濃度では、時間の経過に伴い凝集する。そのような製剤は、ＤＮＡ濃度＞０．３ｍｇ／ｍｌでは、調製が困難であることが多く、とりわけ、容量の制約によって、柔軟な投薬が制限される局所送達では、商用的応用が限定されてしまう。ＤＮＡ凝集は、ＤＮＡの活性を減少又は除去するため、組成物を治療での使用に不適とする。

この物理的不安定性は、トランスフェクション活性の損失の根幹にある理由の１つである。脂質二重層の高い屈曲又はＤＮＡからの脂質の物理的解離を原因とする、粒子の破裂又は融合の発現も、カチオン性脂質ベースの遺伝子送達複合体の低い安定性及び凝集の潜在的な根幹的理由と仮定されている。送達ベクターの酸化的加水分解等の化学修飾も、粒子の不安定性に寄与している可能性がある。

安定性が低いため、初期の臨床試験において、ＤＮＡ製剤は臨床で調製することが要求された。最適投薬に必要とされる濃度で臨床生成物を調製及び保管することができないことは、非ウイルス性ＤＮＡ生成物の広い臨床診療及び商用化の主要な障害になっている。これでは、薬剤の処方について医師の訓練が必要となり、現場での品質管理対策が課されることになる。

凍結乾燥は、いくつかの調合薬の長期的安定性を改善するために有用な方法である。しかし、この工程は調合薬の物理化学的特性を変化させる傾向があり、再構成時にトランスフェクションの凝集及び損失に繋がるため、合成ベクターを有するＤＮＡ複合体を乾燥させるのに、通常、適さない。

凍結乾燥時の製剤の凝集及び損傷を防止するために、いくつものアプローチが試みられてきた。ある種の場合において、低分子量の糖、デキストラン及びポリエチレングリコール等の凍結保護物質の存在下でのＤＮＡ複合体の凍結乾燥は、生成物に対し、より良い安定性を提供することもできるが、このアプローチは投薬の柔軟性を改善するようには見えない。糖の添加は、この目的のために、多くの場合、最も一般的に利用されるアプローチである。試験された糖の多くは、ある程度まで、製剤の損傷及び粒子の凝集を防ぐことが判明したが、この作用の質は、糖の種類及び使用される送達ベクターによって変化する。

凍結乾燥は、製剤の貯蔵寿命においてある程度の改善をもたらすが、凍結乾燥されたＤＮＡ生成物を生産するために必要な条件は、限定された薬剤学的応用のみを可能とする。最も有効な凍結保護糖を使用した場合でさえも、安定性のためには、極めて高い糖／ＤＮＡモル比（一般に、１０００：１を超える）が必要とされる。結果として、凍結乾燥された生成物は、等張性製剤を得るためには、多くの場合、非常に大きな倍率で希釈しなければならず、事前凍結乾燥されたＤＮＡ濃縮物に対して、最終ＤＮＡ濃縮物の低下が生じる。カチオン性担体の多くにとって、最終的なＤＮＡ濃度は、一般に約０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌとすることができ、多くの場合、０．１ｍｇ／ｍｌを下回る。低濃度製剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究には十分であるが、最適投薬に大容量が要求されるため、それらの臨床応用は制限される可能性がある。例えば、安定性のために必要とされる最適糖濃度において、１ｍｇ投与量のＤＮＡは、等張性を維持するために、５〜１０ｍｌで希釈する必要がある可能性があるが、それでは、局所的ｉｎ ｖｉｖｏ投与には、容量が多すぎる。この調剤上の制約は、柔軟な投薬の妨げとなり、ヒトの臨床試験における合成遺伝子送達システムの準最適な有効性の主要な原因の１つであり、安定性及び生物学的に活性のある、より高濃度のＤＮＡ製剤が必要であるという根拠となる。

本発明は、高核酸濃度で予想外の安定性を示し、核酸トランスフェクションの有効性及び投薬の柔軟性を向上する組成物を提供する。本明細書に記載する組成物は、核酸の生物学的活性又は凝集を失うことなく、効率的に凍結乾燥し、高核酸濃度を含め、様々な核酸濃度に再構成することができる。

１つの態様において、本発明は、カチオン性リポポリマーと少なくとも約０．５ｍｇ／ｍｌの核酸との混合物を含み、その混合物が水溶液に懸濁される組成物、好ましくは医薬組成物を提供する。該カチオン性リポポリマーは、コレステロール及びポリエチレングリコール基が独立に、共有結合されている、カチオン性ポリマー骨格を有する。コレステロール対カチオン性ポリマー骨格のモル比は、約０．１から約１０の範囲内であり、ポリエチレングリコール対カチオン性ポリマー骨格のモル比は、約０．１から約１０の範囲内である。該組成物は、さらに、フィラー賦形剤を含むこともある。ある種の態様において、核酸とリポポリマーとの混合物は、複合体を形成する。ある種の態様において、該組成物は、縮合核酸を含む。縮合される核酸の量は、一般に、核酸の組成的構造と組成物を調製する条件に依存する。

本発明は、さらに、前述の組成物を作製する方法も提供する。

もう１つの態様において、本発明は、核酸とリポポリマーとの凍結乾燥された組成物を提供する。本発明の凍結乾燥された組成物、好ましくは、凍結乾燥された医薬組成物は、フィラー賦形剤、縮合核酸及びカチオン性リポポリマーの混合物を含む。前述のとおり、カチオン性リポポリマーは、コレステロール及びポリエチレングリコールが共有結合され、コレステロール対カチオン性ポリマー骨格のモル比が、約０．１から約１０の範囲内であり、ポリエチレングリコール対カチオン性ポリマー骨格のモル比が、約０．１から約１０の範囲内である、カチオン性ポリマー骨格を有する。

本発明は、さらに、例えば、種々の細胞及び組織をトランスフェクトすることにより、本明細書に記載の組成物を、疾患及び／又は障害の治療に使用するための方法も提供する。

本発明の製造工程を示す概略図である。 濃縮状態及び非濃縮状態での核酸の粒径を示すグラフである。 核酸の縮合を示すために、電気泳動実験の結果を示す図である。 本発明のさらなる実施形態に従うトランスフェクション活性を示すグラフである。 ＩＬ−１２を使用しない、リポポリマーによる治療結果を示す神経スライスの写真である。 ＩＬ−１２を使用した、リポポリマーによる治療結果を示す神経スライスの写真である。 対照と比較した、リポポリマーによるＩＬ−１２の抗がん効果を示す２つのグラフである。 種々の核酸／カチオン性ポリマー混合物の粒径を示すグラフである。 種々の核酸／カチオン性ポリマー混合物の粒径を示すグラフである。 種々の核酸／カチオン性ポリマー混合物から生じるルシフェラーゼ発現を示すグラフである。 種々の核酸／カチオン性ポリマー混合物から生じるルシフェラーゼ発現を示すグラフである。 長期保管後の核酸／カチオン性リポポリマー組成物の生物活性を示すグラフである。

本発明が開示及び記載される前に、本発明は、本明細書に開示される特定の構造、工程ステップ又は材料に限定されるものではなく、関連技術分野の当業者により認識される、それらに相当するものにも拡大されるものであることを理解されるべきである。さらに、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲及びそれに相当するものによってのみ制限されるため、本明細書中で用いられる用語は、具体的な実施形態のみを記述する目的に使用されるものであり、範囲を制限する意図はないことも理解されるべきである。

本明細書及び付属の特許請求の範囲で用いられているように、単数の表現「１つの」、「ある」（ａ，ａｎ）及び「この」（ｔｈｅ）には、そうでない旨が明確に断られていない限り、複数も含まれることに留意される必要がある。

本明細書で用いられる用語「縮合した核酸」及び「部分的に縮合した核酸」は、本発明のカチオン性リポポリマーによって接触させた核酸を指すために用いられる。ある種の態様において、縮合した核酸は、カチオン性リポポリマーと接触したままの状態を維持する。縮合した核酸は、一般に、縮合していない核酸よりも、著しく少ない容積を占める。しかし、縮合した核酸の量は、局所的な環境（例えば、脂質は水性環境に抵抗する等）によって変動し得ることが認識されている。本発明の種々の態様において、縮合した核酸は、約５０ｎｍから約３００ｎｍ、より好ましくは、約５０〜２００、さらにより好ましくは約５０〜１５０ｎｍの大きさを有する、核酸及びカチオン性リポポリマーのナノ粒子形態のものである。「部分的に縮合した核酸」は、本発明のカチオン性リポポリマーによって接触されている核酸であって、その核酸が完全に縮合された状態には達していないが、それでも縮合されていない核酸よりも占める容積が著しく少ないものを指す。

本明細書で用いられる用語「複合体」は、リポポリマー、好ましくはカチオン性リポポリマーに結合されている核酸を意味する。縮合した核酸及びカチオン性リポポリマーを含む複合体は、通常、粒子、好ましくはナノ粒子として存在する。

本明細書で用いられる用語「トランスフェクトする」及び「トランスフェクション」は、特に細胞質及び／又は細胞核に関係して、核酸を細胞にとって外部の環境から、細胞の内部環境へと移送することを指す。いかなる特定の理論にも制約されることなく、核酸は、１つ又は複数のカチオン性ポリマー／核酸複合体の中に封入されるか、そこに粘着するか、又はそれに同伴させた後、細胞に送達され得ることを理解されるべきである。特定のトランスフェクトインスタンスは、核酸を細胞核に送達する。

本明細書で用いられる「被験者」は、本発明の医薬組成物の投与又は方法から利益を得ることのできる哺乳動物を指す。被験者の例には、ヒトが含まれ、さらに、その他にも、ウマ、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、ウサギ及び水棲哺乳類等の動物が含まれることがある。

本明細書で用いられる「組成物」は、２つ又はそれ以上の化合物、元素又は分子の混合物を指す。いくつかの態様において、用語「組成物」は、核酸及び送達システムの混合物を指して用いられることもある。

本明細書で用いられる「Ｎ：Ｐ比」は、官能性カチオン性リポポリマー中のアミン窒素及び核酸中のリン酸基のモル比を指す。

本明細書で用いられる「物理化学的特性」は、以下に制限されるものではないが、カチオン性ポリマーを有する核酸複合体の粒径及び表面電荷、粒子解のｐＨ及びオスモル濃度等の様々な特性を指す。

本明細書で用いられる用語「投与」、「投与する」及び「送達する」は、組成物を被験者に提供する方法を指す。投与は、経口、非経口、経皮、吸入、植込み等の様々な当技術分野で周知の経路により達成することができる。したがって、経口投与は、該組成物を含む経口剤形の嚥下、咀嚼、吸引によって達成することができる。非経口投与は、組成物を静脈内、動脈内、筋肉内、関節内、髄腔内、腹腔内、皮下等で注入することにより、達成することができる。このような用途のための注入物質は、液状溶液若しくは懸濁液のいずれかとしての従来の形、又は注入に先立って、液体中溶液又は懸濁液として調製するのに適した固体の形で、又は乳剤として調製することができる。さらに、経皮投与は、経皮組成物を皮膚表面に塗布する、貼る、ロールする、接着する、注ぐ、押し付ける、擦り付ける等により、達成することができる。これら及び追加の投与方法は、当技術分野でよく知られている。１つの特定の態様において、投与には、組成物が全身的に循環し、エンドサイトーシスにより摂取されるように、標的細胞に結合するように、組成物を被験者に送達することも含むことができる。

本明細書で用いられる用語「核酸」は、ＤＮＡ及びＲＮＡ並びにそれらの合成コンジナーも指す。核酸の例としては、以下に限定されないが、タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ又はヌクレオチド配列、一本鎖若しくは二本鎖の合成配列、ミスセンス、アンチセンス、ナンセンス並びにオン及びオフを生成する阻害性ＲＮＡ、並びにタンパク質、ペプチド及び核酸の産生を制御する速度調節ヌクレオチドを挙げることができる。さらに、核酸は、以下に限定されないが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ハイブリッド配列又は合成若しくは半合成配列、及び天然由来及び人工由来の配列を含むことができる。１つの態様において、ヌクレオチド配列には、治療タンパク質の合成又は阻害をコードするものも含むことができる。このような治療タンパク質の例としては、以下に限定されないが、抗がん剤、成長因子、低血糖剤、抗血管新生薬、細菌抗原、ウイルス抗原、腫瘍抗原又は代謝酵素を含むことができる。抗がん剤の例としては、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−７、インターロイキン−１２、インターロイキン−１５、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ刺激因子、抗血管新生薬、腫瘍抑制遺伝子、チミジンキナーゼ、ｅＮＯＳ、ｉＮＯＳ、ｐ５３、ｐ１６、ＴＮＦ−α、Ｆａｓリガンド、突然変異したがん遺伝子、腫瘍抗原、ウイルス抗原又は細菌抗原を挙げることができる。別の態様において、プラスミドＤＮＡは、腫瘍細胞又はその他の過剰増殖細胞の成長又は維持に関与するタンパク質（単数又は複数）を阻害するように設計されたｓｈＲＮＡ分子をコードすることができる。さらに、いくつかの態様において、プラスミドＤＮＡは、治療タンパク質及び１つ又は複数のｓｈＲＮＡを同時にコードすることもできる。他の態様において、核酸は、プラスミドＤＮＡと、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム等も含む、合成ＲＮＡとの混合物とすることもできる。さらに、核酸は、大きさを可変とすることができ、オリゴヌクレオチドから染色体まで及ぶ。これらの核酸は、ヒト、動物、野菜、細菌、ウイルス又は合成に由来するものとすることができる。これらは、当業者に知られている任意の技法により得ることができる。

本明細書に用いられる用語「濃縮された」は、その希釈が減った組成物を指す。本発明のいくつかの態様において、「濃縮された」組成物は、縮合されたＤＮＡを好ましくは、等張液で含有する。本発明の特定の態様において、濃縮された組成物は、等張液に懸濁された、縮合されたＤＮＡを少なくとも約０．５ｍｇ／ｍｌ含む。

本明細書で用いられる用語「ポリマー骨格」は、指定範囲内の重量平均分子量を有するポリマー骨格分子の集合を指して用いられる。したがって、コレステロール等の分子がモル比の範囲内でそこに共有結合されていることを記述しているとき、そのような比は、ポリマー骨格分子の集合に結合しているコレステロール分子の平均数を表すことを理解されるべきである。例えば、コレステロールが、モル比０．５で、ポリマー骨格に共有結合していると記述されている場合、平均で、ポリマー骨格分子の２分の１に、コレステロールが結合される。もう１つ例を挙げれば、コレステロールが、モル比１．０で、ポリマー骨格に共有結合していると記述されている場合、平均で、１つのコレステロール分子が、ポリマー骨格の各々に結合される。しかし、現実には、この場合、一部のポリマー骨格分子には、コレステロール分子が１つも結合しない一方、他のポリマー骨格分子には、複数のコレステロール分子が結合している可能性もあり、値はその比を導き出すもととなる結合したコレステロール分子の平均数であることを理解されるべきである。同じ論理が、ポリマー骨格に対するポリエチレングリコールのモル比にも当てはまる。

本明細書で用いられる用語「ペプチド」は、１つのアミノ酸のカルボキシル基によって、別のアミノ酸のα−アミノ基に結合されるアミノ酸を２つ以上含む、天然又は合成の分子を指すために用いることができる。本発明のペプチドは、長さによって制限されず、したがって、「ペプチド」には、ポリペプチド及びタンパク質も含むことができる。

本明細書で用いられる用語「共有（ｃｏｖａｌｅｎｔ）」及び「共有で（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ）」は、電子が原子対の間で共有されることになる化学結合を指す。

本明細書で用いられる複数の項目、構造要素、組成要素及び／又は物質は、便宜のために、共通した列挙の形で提示される可能性がある。しかし、その種の列挙では、列挙された各々の要素が、別個で独自の要素として個別に識別されるものと解釈されるべきである。したがって、そうでないと断られていない限り、その種の列挙の個々の要素は、共通のグループで提示されていることのみを根拠として、同じグループで列挙されている任意の他の要素に事実上、相当しているものと解釈されるべきではない。

濃度、量及びその他の数値データは、本明細書において、範囲形式で表現又は提示される場合がある。このような範囲形式は、単に便宜上及び簡潔さのために用いられているということを理解されるべきであり、したがって、範囲の上限及び下限として明示的に挙げられた数値のみならず、その範囲内に含有される、個々の数値又は部分範囲のすべてが、明示的に列挙されているのと同様に含まれているものとして柔軟に解釈されるべきである。例えば、「約１から約５」という数値範囲は、明示的に挙げられた約１から約５の値のみならず、指示された範囲内の個々の値及び部分範囲も含むものとして解釈されるべきである。したがって、この数値範囲には、２、３及び４等の個々の値並びに１〜３、２〜４及び３〜５等の部分範囲、さらには１、２、３、４及び５も個別に含まれている。同じ原則が、最小又は最大として１つの数値だけが挙げられている範囲にも適用される。さらに、このような解釈は、記載されている範囲の幅又は特性に関係なく、適用されるものとする。

本発明は、低濃度の核酸組成物（例えば、０．１５ｍｇ／ｍｌ）を、その核酸又は核酸組成物の物理化学的特性又は生物学的特性に影響を及ぼすことなく、高度に濃縮することのできる手法を提供する。１つの態様において、核酸組成物は、これらの特性に影響を及ぼすことなく、３３倍又はそれ以上に濃縮することができる。このように高度に濃縮された核酸組成物は、約０．３ｍｇ／ｍｌを超える濃度を達成しようとした過去の試みでは、低い安定性の問題が生じたために極めて困難であった、ｉｎ ｖｉｖｏでの広範囲の投与レジメンを可能にする。

より具体的には、本発明は、濃縮され、安定性のある医薬組成物を、このような組成物の調製及び使用のための方法も含めて提供する。例えば、１つの態様において、核酸がカチオン性リポポリマーと複合体を形成し、その複合体が等張液に懸濁されている、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍｌの核酸を含む、医薬組成物が提供される。等張液に懸濁される複合体は、部分的又は完全に縮合された核酸分子を含む。カチオン性リポポリマーは、コレステロール及びポリエチレングリコール基（即ち、分子）がそこに共有結合される、カチオン性ポリマー骨格を含む。コレステロール分子対カチオン性ポリマー骨格のモル比は、約０．１から約１０の範囲内であり、ポリエチレングリコール分子対カチオン性ポリマー骨格のモル比は、約０．１から約１０の範囲内である。別の態様において、カチオン性リポポリマー中のポリエチレングリコール分子対カチオン性ポリマー骨格のモル比は、約１から約１０の範囲内である。さらに別の態様において、カチオン性リポポリマー中のポリエチレングリコール分子対カチオン性ポリマー骨格のモル比は、約１から約５の範囲内である。さらなる態様において、カチオン性リポポリマー中のコレステロール分子対カチオン性ポリマー骨格のモル比は、約０．３から約５の範囲内である。さらに別の態様において、カチオン性リポポリマー中のコレステロール分子対カチオン性ポリマー骨格のモル比は、約０．４から約１．５の範囲内である。

組成物は、さらに、フィラー賦形剤を含む。得られる組成物は、核酸を標的細胞に送達し、核酸の機能に応じて、生体応答の引き出し、阻害又は修正を行うのに適している。

１つの態様において、コレステロール及びポリエチレングリコール分子は、カチオン性ポリマー骨格に独立して、直接に共有結合することができる。別の態様において、コレステロール及びポリエチレングリコール分子は、それぞれ、カチオン性ポリマー骨格に間接的に共有結合される。例えば、コレステロール分子は、リンカー又はスペーサーを介して、ポリエチレングリコール分子に直接的又は間接的に結合することができ、そのポリエチレングリコール分子がカチオン性ポリマー骨格に共有結合する。或いは、コレステロール分子がカチオン性リポポリマー骨格に直接結合し、ポリエチレングリコール分子がリンカー又はスペーサーを介して、間接的に、リポポリマーに結合することもできる。

ポリエチレングリコールとカチオン性ポリマー骨格との間の特定のリンカーは、末端カルボキシ基を有するアルキレン基、好ましくは、炭素原子数１から２０、より好ましくは、炭素原子数約２から約４の直鎖アルキレン基である。リンカー上の末端カルボキシ基は、カチオン性ポリマー骨格のアミノ基に結合すると、カチオン性リポポリマーとポリエチレングリコールとの間にアミド結合を形成する。カチオン性ポリマー骨格分子と反応するのに適した開始ポリエチレングリコールは、活性化基、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルにより終端されるリンカー分子を有するポリエチレングリコールである。このようなポリエチレングリコールの例の１つは、メトキシポリエチレングリコール−プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルである。

ポリエチレンイミン、クロロギ酸コレステリル（立体化学は省略）及びメトキシポリエチレングリコール−プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルの間の反応から生じるカチオン性リポポリマー構造体の一部の例は、以下の構造体である。図形的表現法は、ポリエチレンイミンにおける一級、二級及び三級アミノ基の近似分布を反映し、ここでは、明確にするために、実在していないが、ポリエチレンイミン鎖に規則性があるものと仮定している。

本発明の様々な態様において、ｎは、通常、約８から約２０、より限定すると、約１０から約１５、さらにより限定すると、約１２であり、ｘは、通常、約２から約３、より限定すると、約２．５であり、ｙは、通常、約６から約１０、より限定すると、約７から約９、さらにより限定すると、７．５であり、ｚは、通常、約０．４から約０．８、より限定すると、約０．５から約０．７、さらにより限定すると、約０．６である。

さらに、いくつかの態様において、２次的な縮合システムを使用して、既に縮合されている核酸を、本明細書に提示した技法を使用してさらに縮合し、高濃度での核酸の安定性をより高めることもできる。したがって、本発明の態様に従う縮合に先立って、核酸は部分的に縮合された形又は縮合されていない形とすることができる。２次的な縮合システムには、これに限定されないが、カチオン性脂質、カチオン性ペプチド、シクロデキストリン、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン及びそれらの組合せを含め、当業者に知られている任意の縮合用物質又は技法が含まれ得る。

本発明の態様に従う組成物のために、核酸の様々な縮合度を達成することができる。１つの態様において、組成物中のすべての核酸又は核酸の大部分は、カチオン性ポリマーを有する複合体を形成することにより、縮合される。もう１つの態様において、組成物中の約３０重量％の核酸が縮合される。さらにもう１つの態様において、組成物中の約５０重量％の核酸が縮合される。さらなる態様において、組成物中の約７０重量％の核酸が縮合される。さらにもう１つの態様において、９０重量％の核酸が縮合される。

さらに、組成物中の核酸の濃度は、組成物で使用される物質、濃縮方法及び核酸の意図された用途に応じて、変化する。しかし、１つの態様において、核酸の濃度は、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍｌである。もう１つの態様において、核酸の濃度は、少なくとも約１ｍｇ／ｍｌである。さらにもう１つの態様において、核酸の濃度は、少なくとも約３ｍｇ／ｍｌである。さらなる態様において、核酸の濃度は、少なくとも約５ｍｇ／ｍｌとすることができる。さらにもう１つの態様において、核酸の濃度は、少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌとすることができる。もう１つの態様において、核酸の濃度は、少なくとも約２０ｍｇ／ｍｌとすることができる。さらにもう１つの態様において、核酸の濃度は、約１０ｍｇ／ｍｌから約４０ｍｇ／ｍｌとすることができる。

様々な方法を利用して、核酸組成物の縮合度を決定することができる。例えば、１つの態様において、組成物中の核酸が、組成物にカチオン性ポリマーを添加された複合体を形成している程度を判定するために、組成物を電気泳動することができる。正に帯電したカチオン性リポポリマーに対する負に帯電した核酸の静電気引力により、核酸はアガロースゲルの中を移動することが阻害される。したがって、電気泳動に従って、カチオン性ポリマーと複合体を形成することにより縮合された核酸は、ゲルの中で不動のまま留まるのに対し、縮合されていない核酸、即ちカチオン性ポリマーと対応付けられていない核酸は、ゲル内の電流の力に相当する距離を移動する。別の例では、核酸の縮合は、組成物内の粒径により判定することができる。粒径は、動的光散乱により測定することができる。通常、縮合された核酸は、縮合されていない核酸に比べて、粒径が小さくなる。好ましい縮合された核酸は、核酸及びカチオン性リポポリマーのナノ粒子が、約５０ｎｍから約３００ｎｍ、より好ましくは、約５０〜２００、さらにより好ましくは約５０〜１５０ｎｍの大きさを有するものである。

前述した例も含め、本発明の態様に従う組成物及び方法において、既知の任意の核酸を利用することができる。したがって、本明細書に記載する核酸は、限定の意図があるものと解釈されるべきではない。例えば、１つの態様において、核酸は、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードするプラスミドを含むことができる。本発明の態様に従う医薬組成物として形成されたとき、有益性が示される多くのペプチドがよく知られている。これに限定するものではないが、そのようなペプチドの例をいくつか挙げれば、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−７、インターロイキン−１２、インターロイキン−１５、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、血管形成剤、凝固因子、血糖降下薬、アポトーシス因子、抗血管新生薬、チミジンキナーゼ、ｐ５３、ＩＰ１０、ｐ１６、ＴＮＦ−α、Ｆａｓリガンド、腫瘍抗原、神経ペプチド、ウイルス抗原、細菌抗原及びそれらの組合せがあり得る。１つの具体的な態様において、核酸は、インターロイキン−１２をコードするプラスミドとすることができる。もう１つの態様において、核酸は、阻害リボ核酸をコードするプラスミドすることができる。さらに１つの態様において、核酸は、合成の短い干渉リボ核酸とすることができる。さらなる態様において、核酸は、治療ペプチドの発現を阻害するように設計されたアンチセンス分子である。

前述のとおり、カチオン性リポポリマーには、コレステロール及びポリエチレングリコールが共有結合されているカチオン性ポリマー骨格が含まれ得る。カチオン性ポリマー骨格には、本発明の様々な態様に従って、核酸を縮合及び濃縮するために使用することのできる、当業者に知られている任意のカチオン性ポリマーが含まれ得る。但し、１つの態様において、カチオン性ポリマー骨格には、ポリエチレンイミン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド−ポリアミン、ジデオキシ−ジアミノ−ｂ−シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、ポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ポリ（リシン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（アルギニン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン及びそれらの組合せを含むことができる。１つの具体的な態様において、カチオン性ポリマー骨格は、ポリエチレンイミンとすることができる。

特定の態様において、リポポリマーは、コレステロール及びポリエチレングリコールに独立に共有結合されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）からなる。この態様において、カチオン性リポポリマーのＰＥＧ：ＰＥＩ：コレステロールの平均モル比は、約２〜３：１：０．２５〜１、好ましくは、約２．２５〜２．７５：１：０．４〜０．８、より好ましくは約２．５：１：０．６である。特定の態様において、このようなリポポリマーの分子量は、（遊離塩基として）約３〜４ｋＤ、好ましくは約３．２５〜３．７５ｋＤ、より好ましくは約３．５４ｋＤであり、対応する塩酸塩の分子量は、約４〜５ｋＤ、好ましくは約４．５ｋＤである。

さらに、核酸の特性、組成物の意図した用途等を含め、多くの要因に応じて、カチオン性ポリマー骨格の分子量は変化する可能性がある。但し、１つの態様において、カチオン性ポリマー骨格の分子量は、約１００から約５００，０００ダルトンになり得る。さらに、カチオン性リポポリマーの他の様々な成分の分子量も変化する可能性がある。例えば、１つの態様において、ポリエチレングリコールの分子量は、約５０から約２０，０００ダルトンになり得る。

本発明の医薬組成物を構成する際、官能性カチオン性リポポリマー中のアミン窒素と核酸中のリン酸塩とのモル比（Ｎ：Ｐ比）は、核酸を縮合及び／又は濃縮することのできる程度に影響を及ぼす可能性があることが発見されている。最適なＮ：Ｐ比は、核酸の化学的特性に応じて多少変動する可能性があるが、１つの態様において、カチオン性ポリマー骨格中のアミン窒素対核酸中のリン酸塩の比は、約０．１：１から約１００：１である。もう１つの態様において、カチオン性ポリマー骨格中のアミン窒素対核酸中のリン酸塩の比は、約３：１から約２０：１である。さらに１つの態様において、カチオン性ポリマー骨格中のアミン窒素対核酸中のリン酸塩の比は、約６：１から約１５：１である。他の態様において、核酸中のアミン窒素対リン酸塩の比は、約３：１から約１００：１、又は約５：１から約１００：１、又は約７：１から約１００：１である。さらに別の態様において、この比は、約１０：１から約１００：１、又はより好ましくは１０：１から約２０：１である。１つの具体的な態様において、カチオン性ポリマー骨格中のアミン窒素対核酸中のリン酸塩の比は、約１１：１である。

さらに、フィラー賦形剤を医薬組成物に含有することも検討される。このようなフィラーは、凍結乾燥及び再構成中の凍結保護、結合、等張性均衡、安定化等、製剤に種々の有益な特性を与えることができる。フィラー材料は、組成物間で変えることもでき、使用される特定のフィラーは、それだけに限定されるものとして見られるべきでないことを理解されるべきである。例えば、１つの態様において、フィラー賦形剤は、様々な糖、糖アルコール、デンプン、セルロース及びそれらの組合せを含むことができる。もう１つの態様において、フィラー賦形剤は、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストロース、ガラクトース、マンニトール、マルチトール、マルトース、ソルビトール、キシリトール、マンノース、グルコース、フルクトース、ポリビニルピロリドン、グリシン、マルトデキストリン、ヒドロキシメチルデンプン、ゼラチン、ソルビトール、フィコル（ｆｉｃｏｌ）、塩化ナトリウム、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ポリエチレングリコール及びそれらの組合せを含むことができる。さらに１つの態様において、フィラー賦形剤は、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストロース、ガラクトース、マンニトール、マルチトール、マルトース、ソルビトール、キシリトール、マンノース、グルコース、フルクトース、ポリビニルピロリドン、グリシン、マルトデキストリン及びそれらの組合せを含むことができる。１つの具体的な態様において、フィラー賦形剤は、スクロースを含むことができる。もう１つの具体的な態様において、フィラー賦形剤は、ラクトースを含むことができる。

本組成物中のフィラー賦形剤の濃度は、約０．０１％から約５％、より厳密には、約０．１％から約３．０％、さらにより厳密には、約０．１％から約０．３％とすることができる。

いくつかの態様において、被験者又は培養物中の特定の細胞又は組織の標的化を可能にするように、カチオン性リポポリマーを官能化することが有益となる可能性がある。このような標的化はよく知られており、本明細書に記載する例は、それだけに制限するものと見られるべきではない。例えば、１つの態様において、カチオン性リポポリマーは、カチオン性リポポリマー又はポリエチレングリコール分子のいずれかに共有結合している標的部分を含むことができる。このような標的部分は、カチオン性リポポリマーが、被験者の体内を全身的に循環し、特定の細胞の種類又は組織を見つけて、特異的に標的とすることを可能にすることができる。このような標的部分の例としては、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質、抗体、抗体フラグメント、低比重リポタンパク質、細胞受容体、成長因子受容体、サイトカイン受容体、葉酸塩、トランスフェリン、インシュリン、アシアロオロソムコイド、マンノース−６−リン酸塩、マンノース、インターロイキン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、幹細胞因子、エリスロポエチン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インシュリン、アシアロオロソムコイド、マンノース−６−リン酸塩、マンノース、Ｌｅｗｉｓ^Ｘ及びシアリルＬｅｗｉｓ^Ｘ、Ｎ−アセチルラクトサミン、葉酸塩、ガラクトース、ラクトース及びトロンボモジュリン、ポリミキシンＢ及びヘマグルチニンＨＡ２等の融合誘導因子、ライソソモトロフィック因子（ｌｙｓｏｓｏｍｏｔｒｏｐｈｉｃ ａｇｅｎｔ）、Ｔ−抗原等の核局在シグナル（ＮＬＳ）及びそれらの組合せを含むことができる。特定の標的化部分の選択及び結合は、十分に当業者の知識の範囲内である。

本発明は、また、長期間保管し、使用前に再構成することのできる凍結乾燥された医薬組成物を提供する。１つの態様において、凍結乾燥された医薬組成物は、カチオン性リポポリマーが、コレステロール及びポリエチレングリコールがそこに共有結合されているカチオン性ポリマー骨格を含み、コレステロール対カチオン性ポリマー骨格のモル比が、約０．１から約１０の範囲内であり、ポリエチレングリコール対カチオン性ポリマー骨格のモル比が、約０．１から約１０の範囲内である、カチオン性リポポリマーと縮合されたフィラー賦形剤及び核酸の凍結乾燥混合物を含むことができる。凍結乾燥された医薬組成物は、乾燥粉末から部分的に再構成された混合物に至るまで、多種多様な形を取ることができる。

本発明には、また、縮合された核酸を含む様々な医薬組成物を作製する方法も含まれる。例えば、１つの態様において、等張液中で少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌに濃縮された、縮合された核酸を有する医薬組成物を作製する方法が提供される。このような方法は、カチオン性リポポリマーが、コレステロール及びポリエチレングリコールが共有結合されているカチオン性ポリマー骨格を含み、コレステロール対カチオン性ポリマー骨格のモル比が、約０．１から約１０の範囲内であり、ポリエチレングリコール対カチオン性ポリマー骨格のモル比が、約０．１から約１０の範囲内である、フィラー賦形剤中で核酸及びカチオン性リポポリマーを混合することも含むことができる。該混合物は、核酸混合物を濃縮するために、粉末に凍結乾燥しておき、後で希釈剤を使用して、等張液中に少なくとも約０．５ｍｇ／ｍｌの縮合された核酸を含む溶液を形成するように再構成することができる。

一般に、該組成物は、二糖類の存在下で、核酸溶液をカチオン性リポポリマー溶液と混合した後、凍結乾燥し、等張液中で再構成することにより得ることができる。この工程は、スケーラブルであり、延長された保管寿命を有する、高度に濃縮された核酸製剤を数ミリグラム（ベンチスケール）から数千ミリグラム（ＧＭＰスケール）まで生産する。前述のように、カチオン性リポポリマーは、ポリエチレングリコール及びコレステロールが、共有結合によって結合されているカチオン性ポリマー骨格を有する。ポリエチレンイミン骨格の場合、１つの態様において、ポリエチレングリコールとポリエチレンイミンとの間及びコレステロールとポリエチレンイミンとの間の化学量論は、それぞれ０．５〜１０、０．１〜１０の範囲内である。カチオン性ポリマーの化学組成は、高度に濃縮された、安定した核酸製剤を得るために重要である場合もある。コレステロール及びＰＥＧ結合を示さないカチオン性ポリマーは、以下の実施例に示すように、安定した、高度に濃縮された製剤を産生しにくい。

本発明の態様に従う組成物は、高い核酸濃度で、複合体のより高い安定性を達成するために、核酸の他の縮合された複合体と組み合わせることもできる。例えば、様々な量のＰＥＧ−ＰＥＩ−コレステロールを添加することで、通常、高い核酸濃度では不安定な、他の核酸送達システムの安定性を高めることが可能である。

様々な態様において、合成送達システムには、当技術分野で利用可能な様々な技法により調製することのできる核酸及びカチオン性担体が含まれる。核酸のカチオン性担体は数多く知られている。例えば、ポリエチレンイミン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド−ポリアミン、ジデオキシ−ジアミノ−ｂ−シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、ポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ポリ（リシン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（アルギニン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、カチオン性脂質、例えば、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロールヒドロクロリド（ＤＣ−コレステロールＨＣｌ）ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリドＤＯＤＡＣ）及びそれらの組合せが挙げられる。これらの送達システムをＰＥＧ−ＰＥＩ−コレステロールと組み合わせると、核酸送達システムの安定性が高まる。

本発明の態様は、また、医薬組成物を使用する方法も提供する。例えば、１つの態様において、哺乳類細胞にトランスフェクトする方法には、哺乳類細胞を、本明細書に記載の組成物に接触させ、哺乳類細胞を、該組成物が細胞に入り、核酸の生物活性を引き出すことができるようにする条件下でインキュベートすることも含むことができる。このようなトランスフェクション技法は、当業者に知られている。さらに、もう１つの態様において、組成物を温血の生命体又は被験者に送達することにより、標的組織にトランスフェクトすることができる。このような送達は、腫瘍内、腹腔内、静脈内、動脈内、気管内、肝内門、経口、頭蓋内、筋肉内、関節内及びそれらの組合せ等の投与形態によることができる。このような標的組織には、トランスフェクションから利益を得られる任意の組織又は組織のサブセットを含むことができる。以下に制限するものではないが、このような標的組織の例には、卵巣、子宮、胃、結腸、直腸、骨、血液、腸、膵臓、胸部、頭部、頚部、肺、脾臓、肝臓、腎臓、脳、甲状腺、前立腺、膀胱、甲状腺、皮膚、腹腔、胸腔及びそれらの組合せが含まれ得る。

以下の例は、本発明の特定の実施形態のより明確な理解を促すために提供されるものであり、本発明に制限を課す意図は一切ない。

調製Ａ
１グラムの分岐性ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）１８００Ｄａ（０．５６ｍＭ）を、５ｍｌのクロロホルムに溶解し、ｍｌ丸底フラスコに入れ、室温で２０分間攪拌する。クロロギ酸コレステリル（０．８４ｍＭ）３８０ミリグラム及び活性化したメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ−ＳＰＡ、メトキシポリエチレングリコール−プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル）（５５０Ｄａ）（０．９１ｍＭ）５００ｍｇを５ｍｌのクロロホルムに溶解し、ＰＥＩ溶液を含有している丸底フラスコの上部に置かれた添加漏斗に移す。クロロホルム中でクロロギ酸コレステリル及びＭＰＥＧ−ＳＰＡの混合物を、室温で５〜１０分かけて、ゆっくりとＰＥＩ溶液に添加する。溶液をさらに室温で４時間攪拌する。溶媒をロータリーエバポレーターにより除去した後、残留している粘着物質を、酢酸エチル２０ｍｌに攪拌しながら、溶解する。ｎ−ヘキサン２０ｍｌをゆっくりと添加することにより、生成物を溶媒から沈殿させ、液体を生成物から静かに注ぐ。生成物を酢酸エチル／ｎ−ヘキサン（１／１；ｖ／ｖ）の２０ｍｌ混合物を使って、２回洗浄する。液体を静かに注いだ後、１０〜１５分窒素ガスをパージすることにより、物質を乾燥させる。物質を１０ｍｌの０．０５Ｎ ＨＣｌに溶解し、アミン基の塩形態を調製する。水溶液を０．２μｍの濾過紙で濾過する。最終生成物を凍結乾燥により得る。

この例の調製のモル比は、３．０モルのＭＰＥＧ−ＳＰＡ及び１．２８モルのコレステロールを１モルのＰＥＩ分子に共役させる。

調製Ｂ
分岐性ＰＥＩ（ＢＰＥＩ）２０グラム（１１．１ｍｍｏｌ）及び乾燥クロロホルム２００ｍＬを一緒に混合し、ＢＰＥＩを溶解する。溶解後、乾燥クロロホルム２００ｍＬ中にクロロギ酸コレステリル４ｇ及び活性化したメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ−ＳＰＡメトキシポリエチレングリコール−プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ＭＰＥＧ ＭＷ５５０、エステルＭＷ７１９）１８．７ｇ（２６ｍｍｏｌ）を含有する溶液を、２０〜３０分かけて、攪拌しながら、反応混合物に滴下添加した後、３〜４時間のインキュベーション期間を置く。次いで、混合物を真空下で放置し、溶液を濃縮し、残留クロロホルムを除去する。得られた残留物を１Ｍの水性ＨＣｌ３２０ｍＬに溶解し、攪拌する。ＰＰＣ塩酸塩のこの溶液を再度、真空下で濃縮し、非常に粘着性のある物質を得る。ＰＰＣ塩酸塩を単離し、反応副生成物及び未反応出発物質を除去するために、濃縮した混合物をアセトン（＜０．４％水）と混合して攪拌し、自由流動物質として、ＰＰＣ塩酸塩の沈殿を生じさせる。沈殿の後、上澄み液を廃棄する。吸湿性のＰＰＣ塩酸塩を真空下で乾燥させる。

１０％ラクトース中で適切な濃度でＰＰＣ及びＤＮＡを調製することにより、まずポリマーＤＮＡ複合体を生成する。注入用の水中のカチオン性ポリマー（５ｍｇ／ｍｌ）及びＤＮＡ（３ｍｇ／ｍｌ）の貯蔵液を、０．３〜３％のラクトース溶液で希釈する。これらは再構成時に、最終的な１０％ラクトース濃度を達成するために必要とされる。次に、ＤＮＡをＰＰＣ溶液に攪拌しながら、滴下添加し、複合体を形成するために、室温で１５分間インキュベートする。

調製した組成物５００μｌを２ｍｌのホウケイ酸ガラス瓶に添加し、フリードライヤー（ｆｒｅｅｄｒｙｅｒ）に入れる。１次乾燥を開始する前に、瓶を４時間、−３４℃に冷却する。２４時間後、棚温度を２０℃に上昇させ、さらに２４時間真空下で維持する。最後に、棚温度を４℃に上昇させ、真空下で瓶に蓋をする。

調製Ｃ
分岐性ＰＥＩ１８００（０．１ｍＭ）１８０ミリグラムをクロロギ酸エステル４ｍｌに溶解し、室温で３０分間攪拌する。クロロギ酸コレステリル（０．１４ｍＭ）７０ミリグラム及びＰＥＧ３３０（０．１４ｍＭ）４８ｍｇをクロロギ酸エステル１ｍｌに溶解し、シリンジを使用して、３〜１０分かけて、ゆっくりとＰＥＩ溶液に添加する。混合物を室温で４時間攪拌する。沈殿のために、酢酸エチル１０ｍｌを添加した後、溶液を−２０℃で一晩かけてインキュベートした後、液体をフラスコから静かに注ぐ。残留物質を酢酸エチル／ｎ−ヘキサン（ｌ／ｌ；ｖ／ｖ）の５ｍｌ混合物を使って、２回洗浄する。１０〜１５分の窒素パージにより、残留物質を乾燥させ、１０ｍｌの０．０５Ｎ ＨＣｌに２０分間溶解した後、溶液を０．２μｍシリンジフィルターで濾過する。水溶液をフリーズドライ法により凍結乾燥させ、ポリマーから水分を除去する。

この調製物のモル比は、ＰＥＧ０．８５モル及びコレステロール０．９モルをＰＥＩ分子１モルに共役させる。

調製Ｄ
２５ｋＤａ直鎖状ＰＥＩ（０．０２ｍＭ）５００ミリグラムを３０ｍｌに溶解し、３０分間、６５℃で攪拌する。三口フラスコに縮合及び添加漏斗を装備する。クロロホルム５ｍｌ中のｍＰＥＧ−ＮＨＳ１０００（０．２ｍＭ）２００ｍｇとクロロギ酸コレステリル（０．０８ｍＭ）４０ｍｇとの混合物を、３〜１０分かけて、ＰＥＩ溶液にゆっくりと添加する。溶液をさらに４時間、６５℃で絶えず攪拌し、容積をロータリーエバポレーターで約５ｍｌに減少する。溶液をエチルエーテル５０ｍｌに沈殿させ、遊離コレステロールを除去し、液体をフラスコから静かに注ぎ、エチルエーテル２０ｍｌを使って、残留物質を２回洗浄する。純窒素で乾燥させた後、物質を２．０Ｎ ＨＣｌ１０ｍｌ及びトリフルオロ酢酸２ｍｌの混合物に溶解する。溶液をＭＷＣＯ １５０００透析管を使って、脱イオン水に対して４８時間透析し、１２時間ごとに新鮮な水に交換する。溶液を凍結乾燥し、水分を除去する。

この調製物のモル比は、ＰＥＧ１２．０モル及びコレステロール５．０モルをＰＥＩ分子１モルに共役させる。

調製Ｅ
ＰＥＩ（ＭＷ：１２００ダルトン）１グラムを、無水メチレンクロリド１５ｍＬとトリエチルアミン（ＴＥＡ）１００μｌとの混合物に溶解する。３０分間、氷の上で攪拌後、クロロギ酸コレステリル溶液１．２ｇをＰＥＩ溶液にゆっくりと添加し、混合物を氷の上で一晩攪拌する。得られた生成物を、エチルエーテルを添加して沈殿させた後、遠心分離し、続いて追加のエチルエーテル及びアセトンを使って洗浄する。非水溶性リポポリマーをクロロホルムに溶解し、最終濃度０．０８ｇ／ｍＬを得る。合成及び精製に続き、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦ ＭＳ及び^１Ｈ ＮＭＲを使って、非水溶性リポポリマーの特性を求める。

非水溶性リポポリマー１２００のＮＭＲ測定では、ＰＥＩに共役したコレステロールの量は約４０％と示される。非水溶性リポポリマーのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光分析では、その分子量が約１６００と示される。

調製Ｆ
ＰＥＩ（ＭＷ：１８００ダルトン）３グラムを、無水エチレンクロリド１０ｍｌとトリエチルアミン１００μｌとの混合物中で、氷の上で３０分間攪拌する。クロロギ酸コレステリル１グラムを、氷のように冷たい無水メチレンクロリド５ｍｌに溶解した後、３０分かけて、ＰＥＩ溶液にゆっくりと添加する。混合物を氷の上で１２時間攪拌し、得られた生成物をロータリーエバポレーターで乾燥する。粉末を０．１Ｎ ＨＣｌ５０ｍｌに溶解する。メチレンクロリド１００ｍＬを使って、水溶液を３回抽出した後、ガラスマイクロファイバフィルターで濾過する。生成物を溶媒蒸発により濃縮し、大過剰なアセトンで沈殿させ、真空下で乾燥させる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロフォトメトリー及び１０^１Ｈ ＮＭＲを使って、生成物を分析する。水溶性リポポリマー１８００のＮＭＲ結果は、ＰＥＩに共役したコレステロールの量が約４７％と示される。ＰＥＡＣＥのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦ質量分光分析では、その分子量が約２２００と示される。これは、一部は共役していない又はモル比２／１（コレステロール／ＰＥＩ）で共役しているが、ＰＥＡＣＥ１８００の大多数では、コレステロールとＰＥＩとのモル比は１／１であることを示唆する。

調製Ｇ
５０ミリグラムのＰＥＩ１８００を、氷の上で無水メチレンクロリド２ｍＬに溶解する。次に、クロロギ酸ベンジル２００μＬを反応混合物にゆっくりと添加し、溶液を氷の上で４時間攪拌する。攪拌の後、メチレンクロリド１０ｍＬを添加し、飽和ＮＨ_４Ｃｌ１５ｍＬを使って、溶液を抽出する。硫酸マグネシウムを使って、メチレンクロリド相から水を除去する。溶液の容積を真空下で減少させ、エチルエーテルを使って、生成物である、ＣＢＺで保護されたＰＥＩを沈殿させる。一級アミンＣＢＺ保護されたＰＥＩ５０ミリグラムを、メチレンクロリドに溶解し、クロロギ酸コレステロール１０ｍｇを添加し、溶液を１２時間、氷の上で攪拌する。エチルエーテルを使って、生成物である、ＣＢＺで保護されたリポポリマーを沈殿させ、アセトンで洗浄した後、水素供与体としてのＨ_２のもとで、触媒としてパラジウム活性化炭素を含むＤＭＦ中で溶解する。混合物を室温で１５時間攪拌し、ＣＥＬＩＴＥ（登録商標）で濾過し、溶液の容積をロータリーエバポレーターで減少させる。エチルエーテルによる沈殿から、最終生成物を得る。

調製Ｈ
ＮＨ_２−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ３４００（０．１５ｍＭ）５００ミリグラムを、室温で３０分間、無水クロロホルム５ｍｌに溶解した。無水クロロホルム１ｍｌ中クロロギ酸コレステロール（１．５ｍＭ）６７６ｍｇの溶液を、ＰＥＧ溶液にゆっくりと添加した後、さらに４時間、室温で攪拌する。混合物を１時間、氷の上でエチルエーテル５００ｍｌ中に沈殿させた後、エチルエーテルを使って３回洗浄し、共役していないコレステロールを除去する。窒素パージで乾燥させた後、粉末を０．０５Ｎ ＨＣｌ５ｍｌに溶解し、ＰＥＧ上のカルボキシル基を酸性化させる。物質をフリーズドライヤーで乾燥させる。ＰＥＩ１８００（０．０５６ｍＭ）１００ミリグラム、ＤＣＣ５０ｍｇ及びＮＨＳ５０ｍｇを室温でクロロホルム５ｍｌに溶解し、混合物を２０分間攪拌した後、クロロホルム１ｍｌ中ｃｈｏｌ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ３８０ｍｇの溶液をＰＥＩ溶液にゆっくりと添加する。室温で６時間攪拌した後、ロータリーエバポレーターを使って、有機溶媒を除去した。残留物質を脱イオン水１０ｍｌに溶解し、ＦＰＬＣで精製した。

（例１）
カチオン性リポポリマーを有する縮合された核酸の濃縮液体製剤の調製
この例では、ベンチスケール産生での完全に縮合された核酸の高度に濃縮された製剤の調製を説明する。これは、カチオン性ポリマーを有する核酸複合体の調製の後、凍結乾燥し、等張液に再構成することを含む。使用される核酸は、ＩＬ−１２又はルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡであり、ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びコレステロール（Ｃｈｏｌ）に共有結合したポリエチレンイミン（ＰＥＩ）骨格を含んでいた（ＰＥＧ−ＰＥＩ−Ｃｈｏｌ又はＰＰＣ）。ＰＥＧとＰＥＩとの間及びコレステロールとＰＥＩとの間のモル比は、それぞれ０．５〜１０、０．１〜１０である。まず、ＤＮＡ及びＰＰＣ溶液を、注入用の水中で、５ｍｇ／ｍｌで別々に調製し、その後、３％ラクトースで０．１５ｍｇ／ｍｌ（ＤＮＡ）及び０．５５４ｍｇ／ｍｌ（ＰＰＣ）に希釈する。マイクロピペットを使って、窒素対リン酸塩比（Ｎ：Ｐ比）１１：１で、ラクトース溶液中ＤＮＡを、ラクトース溶液中ＰＰＣに添加し、製剤を室温で１５分間インキュベートし、複合体が形成できるようにする。３％ラクトース中ＰＰＣ／ＤＮＡ複合体を、ミズーリ州カンザスシティのＬＡＢＣＯＮＣＯ社のＦＲＥＥＺＯＮＥフリーズドライシステムを使って、凍結乾燥する。調製した製剤５００μｌを２ｍｌのホウケイ酸ガラス瓶に添加し、次に以下のセグメントからなるフリーズドライプログラムを使って凍結乾燥した：
１）凍結セグメント（０．２５℃／分でランプ、３４℃で４時間保持）
２）１次乾燥セグメント（３４℃で２４時間保持）
３）２次乾燥セグメント（２０℃にランプし、２４時間保持）及び
４）０．２５℃／分で４℃にランプ。

注射用の水を使って、０．１ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌＤＮＡまでの様々な濃度に、得られた凍結乾燥粉末を再構成する。小規模調製の代表的なバッチは、完全に製剤されたＤＮＡの量が１００〜２００ｍｇになった。

（例１Ａ）
上記の実施例１で概要を記した手順に基本的に従って、１１：１のＮ：Ｐ比で、カチオン性リポポリマー及びＩＬ−１２核酸を使って、核酸／カチオン性リポポリマー製剤を調製する。カチオン性リポポリマーは、ＰＥＧ：ＰＥＩ：コレステロールのモル比約２．５：１：０．６及び分子量（遊離塩基）約３．５４ｋＤを有する。ラクトースを含有する、得られた製剤は凍結乾燥され、核酸の凝集又は大幅なトランスフェクション活性の損失を伴わずに、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍｌの核酸濃度に再構成することができる。

（例２）
カチオン性リポポリマーを有する縮合された核酸の濃縮液体製剤の調製
この例では、図１に示すように、縮合された核酸の高度に濃縮された製剤の調製を説明する。このプロトコルは、（実施例１に記載の小規模調製から産生される１００〜２００ｍｇのＤＮＡとは対照的に）６０００ｍｇを超える完全に製剤化されたＤＮＡを産生し、さらに高い産生量にまで拡大することが可能である。スケールアップした方法は、蠕動ポンプを使って、大量のＤＮＡ及びポリマー溶液を混合し、オンライン混合シナリオを達成し、複合体を形成した後、大容量に対応可能なフリーズドライサイクルを実施することを伴った。簡単に言うと、ＤＮＡ及びＰＰＣ溶液を、３％ラクトース中で、それぞれ０．３ｍｇ／ｍｌ、１．１ｍｇ／ｍｌで調製する。シリコン管（ＷＡＴＳＯＮ ＭＡＲＬＯＷ、Ｚ９８２−００８８）の内径が０．８９ｍｍの蠕動ポンプ（ＷＡＴＳＯＮ ＭＡＲＬＯＷ、ＳＣＩ４００）を使って、流量２２５±２５ｍｌ／分で、２つの成分を、一定の流量で結合させる。２つの混合物を、各管の端でポリプロピレンＴコネクターを使って接合する。ポリマー及びＤＮＡ溶液の混合により、ナノ粒子が即座に形成された。製剤された複合体４０ミリリットルを１００ｍｌのガラス瓶に入れ、次のセグメントからなるフリーズドライプログラムを使って凍結乾燥する：
１）最大７２０分間−５０℃で予備凍結し、
２）６５μｍＨｇで、最大１８０分間−４０℃で、次に最大１９８０分間−３４℃で１次乾燥し、
３）６５μｍＨｇで、最大７２０分間−２５℃で、最大３１８０分間−１５℃で、最大１５００分間−１０℃で、そして最大１４４０分間４℃で２次乾燥する。

注射用の水を使って、０．１ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌＤＮＡまでの様々な濃度に得られた凍結乾燥粉末を再構成する。この規模の代表的なバッチは、完全に製剤化されたＤＮＡの量が６０００ｍｇになる。

（例３）
カチオン性リポポリマーを有する縮合された核酸の濃縮液体製剤の粒径の測定
カチオン性リポポリマーを有するプラスミドＤＮＡ、即ちＰＰＣ、の高度に濃縮された製剤を、実施例１及び２に記載されているとおりに調製する。ポリマー／核酸の粒径の測定のために、ニューヨーク州ホルツビルのＢＲＯＯＫＨＡＶＥＮ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社の９０Ｐｌｕｓ／ＢＩ−ＭＡＳ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅｒを使って、一定分量の液体製剤を分析する。具体的には、分析のために、製剤５０μｌを、ポリスチレンキュベットに入れたミリＱ水９５０μｌに添加する。

図２に、予備乾燥凍結された製剤又は濃縮されていない製剤（０．１５ｍｇ／ｍｌＤＮＡ）中のＤＮＡ／ＰＰＣ複合体及び０．５ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌまでのより高い濃度で、ＩＬ−１２プラスミド（図２Ａ）又はルシフェラーゼプラスミド（図２Ｂ）を使って、再構成した後のＤＮＡ／ＰＰＣ複合体の粒径を示す。より高い濃度での再構成は、粒径に有意な影響は及ぼしておらず、これは複合体が安定していることを示唆する。

（例４）
カチオン性リポポリマーを有する核酸の濃縮液体製剤の核酸縮合体の分析
この例では、ＰＰＣポリマーがプラスミドＤＮＡを縮合する能力を評価する。カチオン性リポポリマーを有するプラスミドＤＮＡの高度に濃縮された製剤、即ちＰＰＣ、を、実施例１及び２に記載されているとおりに調製する。１％のアガロースゲルを使って、核酸／ポリマー複合体を電気泳動させる。正に帯電したＰＰＣポリマーに対する負に帯電したプラスミドＤＮＡの静電気引力により、ＤＮＡはアガロースゲルの中を移動することができない。図３に示すように、高度に濃縮された製剤中に存在するＤＮＡはすべて縮合される。

（例５）
カチオン性リポポリマーを有する核酸の濃縮液体製剤の核酸濃度の測定
ＡＧＩＬＥＮＴ ８４５３分光光度計（カリフォルニア州サンタクララのＡＧＩＬＥＮＴ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）を使って、ＤＮＡ及びＰＰＣ複合体中の高度に濃縮された製剤中の核酸の量を測定する。クオーツキュベット中の注入用の水（ＷＦＩ）９５０μｌを使って、製剤５０μｌを希釈し、波長２６０ｎｍを使って、吸光速度を測定する。（２６０ｎｍにおいて）１光学密度＝ＤＮＡ ５０μｇ／ｍｌと仮定して、ＤＮＡ濃度を測定する。

（例６）
カチオン性リポポリマーを有する核酸の濃縮液体製剤のトランスフェクション活性の測定
ＤＮＡ及びＰＰＣ複合体の高度に濃縮された製剤のトランスフェクション活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定する。濃縮されていない製剤との直接的な比較を実施する。実施例１及び２に記載の方法により、ルシフェラーゼ又はＩＬ−１２プラスミドを含むトランスフェクション複合体を調製し、０．１５ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌまでのＤＮＡ濃度で再構成する。Ｃｏｓ−１細胞（１．５×１０^５細胞／ウェル）を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中で、１２ウェルの組織培養プレートに播種する。合計容積５００μｌのＤｕｌｂｅｃｃｏ／Ｖｏｇｔ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＥａｇｌｅのＭｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）で、ＦＢＳの非存在下で、複合体ＤＮＡ４μｇを使って、各ウェルを６時間、インキュベートする。インキュベーション期間が終了したら、さらに４０時間、１０％ＦＢＳを補給して、培地を１ｍｌの新鮮ＤＭＥＭに交換する。インキュベーション期間の終了時に、トランスフェクション活性を細胞培養培地（ＩＬ−１２）又は細胞溶解物（ルシフェラーゼ）で測定した。ＩＬ−１２レベルの測定には、ＩＬ−１２ ＥＬＩＳＡ分析により、細胞培養培地を直接分析する。ルシフェラーゼ測定には、リン酸緩衝食塩水を使って、細胞を洗浄し、ＴＥＮＴ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ［ｐＨ８．０］２ Ｍｍ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を使って溶解する。Ｏｒｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（テネシー州オークリッジのＢＥＲＴＨＯＬＤ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭＳ）を使って、細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性を相対的な光強度値（ＲＬＵ）として測定する。ルシフェラーゼの最終的な値は、ＲＬＵ／総タンパク質量（ｍｇ）の単位で報告される。合計タンパク質レベルは、ＢＣＡタンパク質分析キット（イリノイ州ロックフォードのＰＩＥＲＣＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）を使って測定する。ＩＬ−１２及びルシフェラーゼプラスミド／ＰＰＣ複合体の高度に濃縮された製剤からのＩＬ−１２及びルシフェラーゼ発現のレベルを、それぞれ図４Ａ及び４Ｂに示す。データは、高度に濃縮された形態での核酸複合体のトランスフェクション活性が保存されることを示している。

（例７）
カチオン性リポポリマーを有する核酸の濃縮液体製剤の調製物における様々な賦形剤の糖及びその特性の評価
２つの一般に用いられている糖、ラクトース及びスクロースを、高度に濃縮された製剤の調製物の凍結乾燥工程中に利用可能な膨化剤又はフィラー剤の候補として評価する。ＰＰＣ／ＤＮＡ複合体を、各々、ラクトース及びスクロースで、３％、１．５％及び０．３％で調製する。実施例１のプロトコルを使って、製剤を凍結乾燥する。フリーズドライ工程後、ＷＦＩを使って、製剤を再構成し、最終的なＤＮＡ濃度を０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ及び５ｍｇ／ｍｌとして再構成する。粒径及びｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝子導入をこれらの種々の製剤について評価する。表１に示すように、凍結防止フィラーがスクロースとラクトースのいずれであっても、粒径及びトランスフェクション活性はどちらも保存される。これらの結果は、カチオン性ポリマーを有する核酸の物理化学的及び生物学的に安定な高濃縮物を調製する目的に、２種類以上の糖が利用できることを示している。
表１
カチオン性リポポリマーを有する核酸の濃縮された等張製剤の調製物における賦形剤の糖の評価

（例８）
カチオン性リポポリマーを有する核酸の濃縮液体製剤の頭蓋内発現後の正常脳実質におけるＩＬ−１２発現
核酸及びカチオン性リポポリマーの高度に濃縮された製剤がｉｎ ｖｉｖｏで生物学的に活性であるかどうかを判断するために、カチオン性ポリマーを有するＩＬ−１２プラスミド、即ち、ＰＰＣの正常脳組織への直接投与を調べる。治療後、１４日後又は１カ月後に安楽死させた動物から得た脳のスライスに、ＩＬ−１２の免疫組織化学染色を施す。ＰＰＣのみで治療した動物の脳実質は、ＩＬ−１２染色を一切示さなかった（図５Ａ）。対照的に、ｐｍＩＬ−１２／ＰＰＣを注入したマウスの脳実質は、頭蓋内でＩＬ−１２にポジティブな染色を示した（図５Ｂ）。この実験は、カチオン性ポリマーを有する核酸複合体の生物活性が、濃縮工程中に保存されることを実証している。加えて、注入後、サイトカインが少なくとも１カ月間、存在し続けると結論づけることもできる。さらに、安楽死させるまで生存していた動物の脳内にこのサイトカインが存在していることは、ＩＬ−１２の実際の発現は、脳に致命的な有毒性を引き起こさないことを示唆する。

（例９）
マウスの神経膠腫モデルにおけるカチオン性リポポリマーを有する核酸の濃縮液体製剤の有効性
ＩＬ−１２遺伝子を発現している、完全に複合化された核酸の高度に濃縮された製剤の抗がん効果を、マウスの神経膠腫モデルで調べる。５ｍｇ／ｍｌのＩＬ−１２プラスミドＤＮＡの高度に濃縮された製剤からの３μｌのＩＬ−１２／ＰＰＣ複合体の同時注入と一緒に、１×１０^５のＧＬ２６１神経膠腫細胞の頭蓋内注入を行い、マウスの大脳皮質に腫瘍を植え込む。神経毒性の兆候の有無について動物を監視し、可能なときは、死亡の原因が頭蓋内腫瘍であることを確認するために、死体を解剖する。カプラン−マイヤー生存分析法を使って、生存をプロットする。プラスミド投与量１５μｇで投与されるｐｍＩＬ−１２／ＰＰＣ複合体の単回頭蓋内注入は、有意な有害事象は観察されていないため、十分に許容される。プラスミド投与量１５μｇでのｐｍＩＬ−１２／ＰＰＣ複合体の単回注入は、動物の生存を有意に向上する結果を示した（図６）。

（例１０）
卵巣がん患者におけるカチオン性リポポリマーを有する核酸の濃縮液体製剤の生物活性
ＩＬ−１２遺伝子を発現している、完全に縮合された核酸の高度に濃縮された製剤の生物活性を、再発性卵巣がん患者で調べる。ＩＬ−１２プラスミド及びＰＰＣの高度に濃縮された等張性製剤を、再発性卵巣がんを罹患している女性に、毎週１回の腹腔内投与を４回実施した結果、治療患者の腹水において、ＩＬ−１２の代理マーカー、ＩＦＮ−γの有意なレベルが生じた。ＩＦＮ−γレベルは、腹水１ｍｌ当たり２０から２７５ｐｇまで変動する。これらのデータは、ＩＬ−１２核酸の高度に濃縮された製剤は、臨床応用に適していることを実証している。

（例１１）
カチオン性リポポリマーを有する核酸の濃縮液体製剤の特性におけるカチオン性ポリマーの化学組成の影響の評価
脂質又はポリマー等のカチオン性遺伝子担体を有する核酸製剤の濃縮は、濃縮工程の結果、安定性が低く、トランスフェクションが失われるため、極めて困難であることが、これまでの試みで明らかにされてきた。物理化学的及び生物学的に安定した、高濃度の完全に縮合された核酸の製造に成功したのは、テストカチオン性ポリマー、ＰＥＧ−ＰＥＩ−コレステロール（ＰＰＣ）の化学組成に固有であるかを判定するために、遊離ＰＥＩ、コレステロールに結合したＰＥＩ又はＰＥＧに結合したＰＥＩ及びカチオン性リポソームＤＯＴＡＰを含めて、他のカチオン性ポリマーをテストする。実施例１に記載されているとおりに、ＤＮＡ複合体を０．１５ｍｇ／ｍｌで調製した後、０．５及び５ｍｇ／ｍｌに濃縮する。実施例３及び６に記載されているとおりに、粒径及びトランスフェクション活性を測定する。図７及び８に示すように、遊離ＰＥＩ（ＰＥＩ１８００、ＰＥＩ１５０００、ＰＥＩ２５０００）又はＰＥＩ−コレステロール、ＰＥＩ−ＰＥＧ又はカチオン性脂質ＤＯＴＡＰを使って調製したＤＮＡ複合体は、凍結乾燥し、０．５ｍｇ／ｍｌ又は５ｍｇ／ｍｌに再構成した後、凝集し、トランスフェクション活性を失ったため、安定した複合体を産生しなかった。不安定化作用は、０．５ｍｇ／ｍｌよりも５ｍｇ／ｍｌでより顕著である。対照的に、ＰＥＧ−ＰＥＩ−コレステロール（ＰＰＣ）を使って調製されたＤＮＡ複合体は、凍結乾燥中及び高いＤＮＡ濃度での再構成中も物理化学的特性及びトランスフェクション特性を維持する（図７及び８）。これらの結果は、コレステロール及びＰＥＧによるカチオン性ポリマーの共有結合修飾は、濃縮工程中の活性保存に不可欠であることを示唆する。

（例１２）
カチオン性ポリマーを有する核酸の凍結乾燥又は濃縮した液体製剤の長期安定性
凍結乾燥したＩＬ−１２／ＰＰＣ複合体の大規模ロットを、実施例２に概要を示した方法を使って、ｃＧＭＰのもとで調製し、安定性評価のために、−８０℃、−２０℃、４℃及び２５℃（６０％ＲＨ）で保管する。分析時に、瓶を保管場所から取り出し、２．４ｍＬのＷＦＩを添加する。試料ごとに、ｐＨ、ＤＮＡ濃度、オスモル濃度、粒径及び生物活性を測定した。図９に示すように、ＩＬ−１２／ＰＰＣ複合体のＤＮＡ濃度、ｐＨ、オスモル濃度及び粒径は、指示温度で２年間、保存される。ｐＩＬ−１２／ＰＰＣの遺伝子導入活性は、実施例６に記載されているとおりに、ＣＯＳ−１細胞で定量化する。ＣＯＳ−１細胞に、ＤＮＡ４μｇで生物由来物質を使ってトランスフェクトする。細胞培養培地のＩＬ−１２のレベルを、市販されているＥＬＩＳＡキットを使って、トランスフェクションの４８時間後、定量化する。２年間の安定性研究から得た生物活性結果を図９に示す。−８０℃又は−２０℃での保管期間中、生物学的生成物の生物活性に有意な変化はない。０時間で、活性は１５１±１３０ｐｇ／ｍＬであり、時間の経過に従い、常に低下を示す２５℃を除き、残りのデータは、この標準偏差の範囲内で変動する。４℃では、トランスフェクション活性の低下が３６０日後に観察されるが、試料の不足のため、結論的な評価に到達できるだけの追跡時点がない。

（例１３）
カチオン性ポリマーを有する核酸の濃縮液体製剤の再構成した物質の安定性
再構成した物質の安定性を別の研究で調べる。凍結乾燥したＩＬ−１２プラスミドＤＮＡ／ＰＰＣ複合体を、実施例２に記載の方法に従って調製し、注入用の水の中で０．５ｍｇ／ｍｌに再構成する。再構成した物質を４℃で保管する。６０日後及び９０日後に試料を取り出し、粒径、オスモル濃度及び遺伝子発現について分析する。密封瓶に入れ、−８０℃で保管された凍結乾燥生成物を、比較のために、同時に分析する。表２に示すように、再構成したＥＧＥＮ−００１は、ＷＦＩによる再構成後、少なくとも９０日間、４℃で安定性がある。ＤＮＡ濃度、粒径、オスモル濃度又は遺伝子発現も含めて、安定性のパラメーターは、密封瓶に入れ、−８０℃で保管された凍結乾燥物質と比較して、有意な変化はない。
表２
４℃でカチオン性ポリマーを有する核酸の高度に濃縮され、完全に縮合された、等張性製剤の再構成された形態の長期安定性

（例１４）
ＰＥＧ−ＰＥＩ−コレステロールを使った共製剤化による合成核酸送達システムの高度に濃縮され、安定性のあるＤＮＡ製剤の調製
ＰＥＧ−ＰＥＩ−コレステロールを既存の合成核酸送達システムに添加し、高い核酸濃度では、通常、不安定な核酸製剤の安定性を高める。

１つの例において、ＰＥＧ−ＰＥＩ−コレステロールを、直鎖状ポリエチレンイミン２５ｋＤａ（ＬＰＥＩ２５ｋＤ）を使って調製されるＤＮＡ製剤に添加する。３％ラクトースの存在下で、０．１５ｍｇ／ｍｌ濃度のＤＮＡ製剤を、１０：１（Ｎ：Ｐ比）のＬＰＥＩ２５ｋＤを使って調製することができる。次に、製剤されたＤＮＡに対して様々なＰＰＣ比で、ＰＥＧ−ＰＥＩ−コレステロールリポポリマーを、ＬＰＥ１２５ｋＤ／ＤＮＡ複合体に添加することができる。例えば、ＰＰＣ／ＤＮＡ（Ｎ：Ｐ比）は、（０：１）、（１：１）、（５：１）、（７．５：１）、（１１：１）、（１５：１）及び（２０：１）とすることができる。各製剤５００μｌを２ｍｌのホウケイ酸ガラス瓶に添加した後、フリーズドライシステムで凍結乾燥することができる。フリーズドライプログラムは、次のセグメントからなる：
１）凍結セグメント（０．２５℃／分でランプ、−３４℃で４時間保持）、
２）１次乾燥セグメント（−３４℃で２４時間保持）、
３）２次乾燥セグメント（−２０℃にランプし、２４時間保持）及び
４）０．２５℃／分で４℃にランプ。

乾燥凍結した製剤は、注入用の水を使って０．５ｍｇ／ｍｌ又はその他の適切な濃度に再構成することができる。

上述した組成物及び応用方式は、本発明の好ましい実施形態を説明することだけを目的としたものであることを理解されたい。本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、当業者は、多くの変更及び代替配置を案出することが可能であり、付属の特許請求の範囲は、そのような変更及び配置を網羅することを意図している。したがって、本発明の最も実用的で、好ましい実施形態であると、現在、見なされているものと関連して、これまで、具体的に詳しく、本発明を記述してきたが、本明細書に規定された原理及び概念から逸脱することなく、これに限定されないが、大きさ、材質、形状、形式、機能及び操作方法、組立て及び使用のバリエーションも含め、多くの変更を加えることができることは、当業者に明白である。

Claims (25)

1. 等張液に懸濁された０．５〜２０ｍｇ／ｍｌの核酸を含み、該核酸は５０ｎｍ〜３００ｎｍの粒子径を有する医薬組成物の、以下を含む製造方法：
   水性溶媒中で核酸、カチオン性リポポリマー及びフィラー賦形剤を混合すること、ここで該カチオン性リポポリマーはコレステロール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基に独立に共有結合されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含み、該カチオン性リポポリマー中におけるモル比ＰＥＧ：ＰＥＩ：コレステロールを０．１〜１０：１：０．１〜１０の範囲にあり、核酸とカチオン性リポポリマーの前記混合物は複合体を形成する；
   前記混合物を粉末に凍結乾燥すること、及び
   希釈液で前記粉末を再構成して、等張液に０．５〜２０ｍｇ／ｍｌの縮合核酸を含む溶液を形成すること。
2. ポリエチレンイミン骨格中のアミン窒素対核酸中のリン酸塩のモル比が、１０：１〜２０：１である、請求項１に記載の方法。
3. 以下を含む凍結乾燥医薬組成物：
   (ａ）フィラー賦形剤、（ｂ）核酸及び（ｃ）カチオン性リポポリマーの混合物、ここで該カチオン性リポポリマーはコレステロール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基に独立に共有結合されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含み、
   該カチオン性リポポリマー中におけるモル比ＰＥＧ：ＰＥＩ：コレステロールは０．１〜１０：１：０．１〜１０の範囲であり、及び
   核酸とカチオン性リポポリマーの前記混合物は複合体を形成している。
4. 核酸の凝集を伴わずに、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌの核酸濃度に再構成することが可能な、請求項３に記載の凍結乾燥医薬組成物。
5. 下記を含む哺乳類細胞の形質移入に用いられる医薬の調製のための請求項３に記載の凍結乾燥医薬組成物の使用：
   前記哺乳類細胞を前記医薬に接触させること、及び
   前記哺乳類細胞のインキュベートを、前記医薬が細胞に入り、核酸の生物活性を引き出せるようにする条件下で行うこと。
6. 下記を含む標的組織の形質移入に用いられる医薬の調製のための請求項３に記載の凍結乾燥医薬組成物の使用であって、前記医薬を温血生命体に送達することを含む使用。
7. 医薬の送達が、腫瘍内、腹腔内、静脈内、動脈内、気管内、肝内門、経口、頭蓋内、筋肉内、関節内及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項６に記載の使用。
8. 標的組織、液体又は器官が、卵巣、子宮、胃、結腸、直腸、骨、血液、腸、膵臓、胸部、頭部、頚部、肺、脾臓、肝臓、腎臓、脳、甲状腺、前立腺、膀胱、皮膚、腹腔、胸腔及びそれらの組合せからなる群から選択される要素に局所化される、請求項７に記載の使用。
9. カチオン性ポリマー骨格中のアミン窒素対核酸中のリン酸塩の比が１０：１から２０：１である、請求項３に記載の凍結乾燥医薬組成物。
10. 下記を含む哺乳類細胞の形質移入に用いられる医薬の調製のための請求項９に記載の凍結乾燥医薬組成物の使用：
    前記哺乳類細胞を前記医薬に接触させること、及び
    前記哺乳類細胞のインキュベートを、前記医薬が細胞に入り、核酸の生物活性を引き出せるようにする条件下で行うこと。
11. 核酸がインターロイキン−１２遺伝子をコードするプラスミドである、請求項３に記載の凍結乾燥医薬組成物。
12. 核酸が阻害リボ核酸をコードするプラスミドである、請求項３に記載の凍結乾燥医薬組成物。
13. 核酸が合成の短い干渉リボ核酸である、請求項３に記載の凍結乾燥医薬組成物。
14. フィラー賦形剤が、糖、糖アルコール、デンプン、セルロース及びそれらの組合せからなる群から選択される要素である、請求項３に記載の凍結乾燥医薬組成物。
15. フィラー賦形剤がスクロースである、請求項３に記載の凍結乾燥医薬組成物。
16. フィラー賦形剤がラクトースである、請求項３に記載の凍結乾燥医薬組成物。
17. 懸濁された０．５〜２０ｍｇ／ｍｌの核酸、カチオン性リポポリマー及びフィラー賦形剤の混合物を等張液中に含む、医薬組成物：
    前記核酸は５０ｎｍ〜３００ｎｍの粒子径を有し、
    前記カチオン性リポポリマーはコレステロール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基に独立に共有結合されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含み、該カチオン性リポポリマー中におけるモル比ＰＥＧ：ＰＥＩ：コレステロールは０．１〜１０：１：０．１〜１０の範囲にあり、
    前記核酸及びカチオン性リポポリマーは複合体を形成している。
18. 下記を含む哺乳類細胞の形質移入に用いられる医薬の調製のための請求項１７に記載の再構成された医薬組成物の使用：
    前記哺乳類細胞を前記医薬に接触させること、及び
    前記哺乳類細胞のインキュベートを、前記医薬が細胞に入り、核酸の生物活性を引き出せるようにする条件下で行うこと。
19. 下記を含む標的組織の形質移入に用いられる医薬の調製のための請求項１７に記載の再構成された医薬組成物の使用であって、前記医薬を温血生命体に送達することを含む使用。
20. 医薬の送達が、腫瘍内、腹腔内、静脈内、動脈内、気管内、肝内門、経口、頭蓋内、筋肉内、関節内及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１９に記載の使用。
21. 標的組織、液体又は器官が、卵巣、子宮、胃、結腸、直腸、骨、血液、腸、膵臓、胸部、頭部、頚部、肺、脾臓、肝臓、腎臓、脳、甲状腺、前立腺、膀胱、皮膚、腹腔、胸腔及びそれらの組合せからなる群から選択される要素に局所化される、請求項１９に記載の使用。
22. 核酸がインターロイキン−１２遺伝子をコードするプラスミドである、請求項１７に記載の医薬組成物。
23. 核酸が阻害リボ核酸をコードするプラスミドである、請求項１７に記載の医薬組成物。
24. 核酸が合成の短い干渉リボ核酸である、請求項１７に記載の医薬組成物。
25. 少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌの核酸濃度であり核酸の凝集を伴わない、請求項１７に記載の医薬組成物。

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