PT1633327E - Método para melhoramento da estabilidade e duração de armazenamento de complexos lipossomais - Google Patents

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PT1633327E PT04754323T PT04754323T PT1633327E PT 1633327 E PT1633327 E PT 1633327E PT 04754323 T PT04754323 T PT 04754323T PT 04754323 T PT04754323 T PT 04754323T PT 1633327 E PT1633327 E PT 1633327E
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liposome
lyophilized
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Esther H Chang
Kathleen F Pirollo
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Univ Georgetown
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Description

DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA MELHORAMENTO DA ESTABILIDADE E DURAÇÃO DE ARMAZENAMENTO DE COMPLEXOS LIPOSSOMAIS"
Este pedido reivindica prioridade do pedido provisório U.S. número 60/475500, apresentado a 4 de Junho de 2003, aqui incorporado por referência na sua totalidade.
Campo da Invenção
Esta invenção refere-se a um método de preparação de um complexo estável, compreendendo um ligando e um lipossoma catiónico encapsulando um agente terapêutico ou de diagnóstico.
Antecedentes da Invenção
Os lipossomas catiónicos são compostos por bicamadas lipidicas positivamente carregadas e podem ser complexados com adn simples, carregado negativamente, através de mistura simples de lipidos e ADN, de modo a que o complexo resultante tenha uma carga global positiva. O complexo pode ser ligado e incorporado por células em cultura, com eficiência de transfecção moderadamente boa. Provou-se que os lipossomas catiónicos são seguros e eficientes para transferência génica in vivo. 1
Os lipossomas podem ser utilizados para visar células tumorais por modificação dos lipossomas, de modo que os mesmos distribuam selectivamente a sua carga a células tumorais. As moléculas de superfície podem ser utilizadas para direccionar lipossomas para células tumorais, porque o tipo e/ou número de moléculas que estão no exterior das células tumorais diferem daquelas em células normais. Por exemplo, se um lipossoma tiver uma molécula de folato ou transferrina (Tf) na sua superfície, o mesmo irá dirigir-se para células cancerosas que tenham níveis do receptor de folato ou transferrina que sejam superiores àqueles em células normais.
Adicionalmente à utilização de ligandos que são reconhecidos por receptores em células tumorais, também podem ser conjugados à superfície do lipossoma anticorpos específicos, permitindo que os mesmos sejam direccionados para antigénios de superfície específicos de tumor (incluindo mas não limitados a receptores). Estes "imunolipossomas" podem distribuir fármacos terapêuticos a uma população celular específica. Verificou-se, por exemplo, que fragmentos Fab de anticorpo monoclonal anti-HER-2 (Mab) conjugados com lipossomas poderiam ligar-se especificamente a uma linha celular de cancro da mama, S-BR-3, que subreexpressa HER-2 (Park, J.W., et al. PNAS 92: 1327-1331 (1995)). Verificou-se que os imunolipossomas são eficientemente internalizados e a ancoragem de fragmentos Fab anti-HER-2 melhorou os seus efeitos inibidores. A combinação de técnicas de transferência génica de lipossoma catiónico e imunolipossoma parece ser um sistema promissor para a terapia génica direccionada.
Foi descrito na técnica um sistema de distribuição lipossomal de direccionamento de ligando para terapia génica de 2 ADN, possuindo direccionamento selectivo para tumor e elevada eficiência de transfecção. Xu, L., et al., Human Gene Therapy 8:467-475 (1997); Xu, L., et al., Human Gene Therapy 10:2941-2952 (1999); e Xu, L., et al., Tumor Targeting 4:92-104 (1999). Este sistema foi melhorado através de utilização de um fragmento de anticorpo de cadeia simples de receptor anti-transferrina (TfRscFv), como o ligando de direccionamento no complexo (Xu, L., et al. Molecule Medicine 7:723-734 (2001); Xu, L., et al. Molecular Câncer Therapeutics 1:337-346 (2002)). O TfRscFv é formado pela ligação dos domínios componentes variáveis VH e VL das cadeias leve e pesada, respectivamente, com um péptido ligante apropriadamente concebido. O ligante estabelece uma ligação entre a extremidade C da primeira região variável e a extremidade N da segunda, ordenadas como vh-ligante-VL ou VL-ligante-VH. O sítio de ligação de um scFv pode replicar tanto a afinidade como a especificidade do seu sítio de ligação de anticorpo parental.
Tratamentos convencionais para cancro envolvem tratamentos de quimioterapia e/ou radiação. A incorporação, nestas terapias de cancro convencionais, de um novo componente que resulta na sensibilização de tumores para a quimioterapia ou terapia de radiação teria grande relevância clínica, diminuindo as doses eficazes de ambos os tipos de modalidades anticancerosas e atenuando, em conformidade, os graves efeitos secundários frequentemente associados a estes tratamentos.
Estudos iniciais com complexos lipossomais, como anteriormente descritos, mostraram que os complexos são eficientes na distribuição de agentes de diagnóstico ou terapêuticos às células alvo de interesse. É impraticável administrar os complexos a um doente, imediatamente após a sua 3 preparação. Seria desejável proporcionar complexos lipossomais direccionados que, após liofilização e armazenamento a 2-8 °C, -20 °C ou -80 °C, permanecessem estáveis durante, pelo menos, seis meses e pudessem ser reconstituídos sem uma perda significativa de actividade.
Relatos anteriores indicaram que um complexo de dois componentes (lipido e ADN mas sem ligando de direccionamento ou proteínas) poderia ser liofilizado na presença de monossacáridos ou dissacáridos e, todavia, manter a sua actividade biológica e um tamanho de partícula apropriado para terapia génica (Li, B., et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 89:355-364 (2000) e Molina, M.D.C. et al. Journal of Pharmaceutical Sciences 90:1445-1455 (2001); Allison, S.D., et al. Biochemical et Biophysical Acta 1468:127-138 (2000)). Adicionalmente, Tf ligada através de PEG a um poliplexo PEI-ADN reteve alguma actividade biológica após congelação e descongelação (Kursa, M. et ai., Bioconjugate Chemistry 14:222-231 (2003)). É importante notar que este complexo não foi liofilizado, sem indicação dada de possível duração de armazenamento ou estado e foi adicionado açúcar (glucose), se incluído, após descongelação. Este complexo polimérico requer que a Tf seja ligada ao polímero através de uma molécula de PEG. A Patente U.S. N° 5811406 divulga complexos polinucleotídicos estabilizados através da adição de um composto crioprotector e liofilização da formulação resultante. Esta referência não divulga um lipossoma com um ligando de direccionamento, quanto mais um complexo de direccionamento celular liofilizado, como aqui se descreve. 4
Sumário da Invenção Método para preparação de um complexo estável, compreendendo um ligando e um lipossoma catiónico encapsulando um agente terapêutico ou de diagnóstico ou gene repórter, compreendendo: combinar um complexo, compreendendo um ligando e um lipossoma catiónico encapsulando um agente de diagnóstico ou terapêutico ou gene repórter, com uma solução compreendendo uma quantidade estabilizante de sacarose, como descrita na reivindicação 1; e liofilizar a solução resultante de complexo e sacarose de modo a obter-se uma preparação liofilizada; em que, após reconstituição, a preparação retém, pelo menos, cerca de 80% da sua actividade de pré-liofilização.
Numa forma de realização preferida, a preparação retém, pelo menos, cerca de 85% da sua actividade de pré-liof ilização e, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 90% da sua actividade de pré-liofilização.
Breve Descrição das Figuras A Figura 1 mostra o tamanho (nm) dos complexos preparados de fresco e liofilizados (Tf-LipA-Luc e TfRscFv-LipA-Luc), contendo dextrose a 5% ou sacarose a 5%. 5 A Figura 2A e 2B mostra a eficiência de transfecção in vitro, proporcionada como unidades relativas de luz (RLU) por pg de proteina de complexos preparados de fresco e liofilizados (Tf-LipA-Luc e TfRscFv-LipA-Luc), contendo dextrose a 5% ou sacarose a 5%, em células humanas de próstata DU145. A Figura 3 mostra a comparação da eficiência de transfecção in vitro do complexo TfRscFv-LipA-Luc, preparado de fresco e liofilizado (RLU/pg de proteina), contendo sacarose a 5% ou 10%, em células humanas de cancro da próstata DU145. A Figura 4A e 4B, respectivamente, mostra o direccionamento para tumor de xenoenxerto DU145 da próstata e PANCI pancreático por complexos de ADN plasmidico ligando-lipossoma liofilizados. A Figura 5 demonstra, num modelo de murganho de xenoenxerto de cancro da próstata humano (DU145) que a capacidade de direccionamento para tumor do complexo TfRscFv-LipA-p53 preparado em laboratório, com sacarose a 10%, é mantida após liofilização e armazenamento a 2°-8 °C, durante até seis meses. A Figura 6 mostra a consistência do direccionamento para tumor e eficiência de transfecção de lote para lote de complexos TfRscFv-LipA-p53 liofilizados, com sacarose a 10%, num modelo de murganho de xenoenxerto DU145. A Figura 7 mostra o direccionamento para tumor e eficiência de transfecção de cinco lotes diferentes comercialmente preparados e liofilizados de TfRscFv-LipA-p53, com sacarose a 10%, num modelo de murganho de xenoenxerto DU145. 6 A Figura 8 mostra a percentagem estimada de TfRscFv não complexado em vários complexos TfRscFv-LipA-p53, de fresco e liofilizados, por electroforese em gel não desnaturante. A Figura 9 mostra a comparação in vitro de inibição de crescimento celular entre complexos TfRscFv-LipA-AS-HER-2, liofilizados e preparados de fresco, em células de cancro da mama MDA-MB-435. A Figura 10 mostra a comparação in vitro de quimiossensibilização de PANC-1 por complexos TfRscFv-LipA-AS HER-2, preparados de fresco ou liofilizados. A Figura 11 mostra a modulação negativa in vitro da expressão de HER-2 em células humanas de cancro da mama MDA-MB-435 por TfRscFv-LipA-AS-HER-2, com sacarose a 10%, após liofilização e armazenamento a 2°-8 °C, durante até seis meses.
Descrição Detalhada da Invenção
De acordo com a presente invenção, a estabilidade de complexos liofilizados de um ligando e um lipossoma encapsulando um agente de diagnóstico ou terapêutico pode ser aumentada através da combinação dos complexos, antes de liofilização, com uma solução aquosa de uma quantidade estabilizante de sacarose. A solução de sacarose pode ser simplesmente sacarose em água ou pode ser incluído um tampão, tais como PBS, HEPES, TRIS ou TRIS/EDTA. Tipicamente, a solução de sacarose é combinada com o complexo até uma concentração final de cerca de 1% a cerca de 80% de sacarose, tipicamente 1% a cerca de 50% de sacarose, tal como 1% a cerca de 10%, 20%, 30% ou 40% de sacarose, de um modo 7 preferido, cerca de 5% a 10% de sacarose e, de um modo muito preferido, cerca de 10% de sacarose. A preparação liofilizada é estável dentro de uma gama desde cerca de 2-8 °C a cerca de -80 °C, durante um período de, pelo menos, 6 meses, sem perda significativa de actividade. De um modo preferido, a preparação é estável durante um período de, pelo menos, cerca de 6-12 meses. Após reconstituição, os complexos retêm, pelo menos, cerca de 80% da sua actividade de pré-liofilização, de um modo preferido, pelo menos, cerca de 85% da sua actividade de pré-liofilização e, de um modo muito preferido, pelo menos, cerca de 90 - 95% da sua actividade de pré-liofilização.
Relatos anteriores indicaram que uma mistura de lípido e ADN poderia ser liofilizada na presença de monossacáridos ou dissacáridos e manter actividade biológica (Li, B., et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 89:355-364 (2000) e Molina, M.D.C. et al. Journal of Pharmaceutical Sciences 90:1445-1455 (2001); Allison, S.D., et al. Biochemical et Biophysical Acta 1468:127-138 (2000)). Contudo, é inesperado que um complexo de três componentes consistindo em 1) uma proteína (e. g., transferrina), incluindo mesmo uma proteína que é um anticorpo ou fragmento de anticorpo (e. g., fragmento de anticorpo de cadeia simples de receptor anti-transferrina, TfRscFv); 2) um lipossoma e 3) uma molécula de ácido nucleico terapêutica (e. g., um ADN plasmídico, uma molécula de oligonucleótidos anti-sentido ou mesmo uma molécula de ARNsi) também pudesse ser liofilizado e reter, após reconstituição o seu tamanho e actividade biológica.
Os complexos lipossomais são tipicamente administrados intravenosamente. Para injecção intravenosa, uma solução de dextrose a 50% foi, de modo convencional, adicionada aos 8 complexos ligando-lipossoma até uma concentração final de 5%. Foi, agora, surpreendentemente verificado que através da combinação de complexos ligando-lipossoma preparados de fresco (í. e., um complexo que não tem mais do que cerca de 1 a cerca de 24 horas de idade) com uma solução de sacarose, em vez de dextrose, a actividade e duração de armazenamento dos complexos de três componentes (incluindo aqueles com uma entidade de direccionamento antigénica), após liofilização e reconstituição, pode ser significativamente aumentada.
Os complexos de três componentes podem simplesmente ser misturados com uma solução de sacarose antes de liofilização. Tipicamente, a solução compreende cerca de 50 a cerca de 100% de sacarose, em peso, de um modo preferido cerca de 50%, em peso, de sacarose. A liofilização pode ser de acordo com qualquer processo convencional que reduza o teor de humidade do complexo para menos de cerca de 1,3%. Um processo preferido compreende a liofilização da solução contendo complexo a -50 °C a -60 °C, 20-50 militorr, de um modo preferido 25 militorr, durante 12 a 60 horas, de um modo preferido 20-48 horas, depois, o armazenamento da preparação liofilizada entre cerca de 2-8 °C e cerca de -80 °C. Noutro processo preferido, frasquinhos de vidro contendo a solução de complexo são carregados dentro de um liofilizador de tipo comercial, à temperatura ambiente, depois, a temperatura é variada em rampa para -45 °C ± 3 °C, ao longo de 1 hora e mantida a essa temperatura durante três horas. O condensador é, depois, arrefecido para -80 °C, ou mais frio, e o vácuo é fixado em 50 micron Hg. A temperatura de armazenamento é, depois, variada em rampa para -35° ± 3 °C ao longo de 1 hora e, uma vez ai, é mantida a esta temperatura, durante cerca de 36-72 horas, de um modo preferido cerca de 48 horas. A temperatura de prateleira é, depois, variada em rampa para 9 20° ± 3 °C ao longo de 4 horas e mantida a esta temperatura, durante cerca de 6 a cerca de 48 horas, de um modo preferido, cerca de 12 horas. No fim deste processo, a pressão da câmara é restabelecida para a pressão atmosférica com azoto (passado através de um filtro retentor microbiano esterilizante apropriado) e o frasquinho de vidro tapado.
Os complexos liofilizados podem ser reconstituídos pela adição de água estéril, livre de endotoxina, igual ao volume de solução antes de liofilização. Os complexos secos dissolvem-se rapidamente com oscilação suave. Não ocorrem alterações apreciáveis no tamanho do complexo ou potencial zeta em virtude da liofilização ou armazenamento.
Complexos adequados que podem ser misturados com uma solução de sacarose, liofilizados e reconstituídos são complexos de moléculas de direccionamento celular de ligando/lipossoma/terapêuticas, repórter ou de diagnóstico que são capazes de distribuição sistémica direccionada para células de uma variedade de tipos de moléculas terapêuticas ou de diagnóstico, para utilização no tratamento ou diagnóstico de doenças. A célula alvo é, de um modo preferido, uma célula cancerosa mas também pode ser uma célula não cancerosa. Células alvo cancerosas preferidas, incluem cancros da próstata, pâncreas, mama, cabeça e pescoço, ovariano, fígado e cérebro e melanoma. É sabido pelo especialista na técnica que a maioria dos tipos de células cancerosas, incluindo mas não limitados àqueles anteriormente listados, subreexpressa o receptor para transferrina e folato e que estes receptores também se reciclam rapidamente em células cancerosas (Li, H., e Qian, Z.M., Medicinal research Reviews 2(3):225-250 (2000); Qian, Z.M., et al., Pharmacological Reviews 54(4):561-587 (2002); gosselin, 10 Μ.A. e Lee, P.J., Biotechnology annual Reviews 8:103-131 (2002) ) .
Desejavelmente, a molécula terapêutica é um gene, polinucleótido, tais como ADN plasmidico, fragmento de ADN, oligonucleótido, oligodesoxinucleótido, oligonucleótido anti-sentido, oligonucleótido de ARN/ADN quimérico, ARN, ARNsi, ribozima, partícula virai, factor de crescimento, citocina, agente imunomodulador ou outra proteína, incluindo proteínas que, quando expressas, apresentam um antigénio que estimula ou suprime o sistema imunitário. São agentes terapêuticos preferidos moléculas de ácidos nucleicos, de um modo preferido, moléculas de ADN ou ARNsi. Uma molécula de ADN preferida é aquela que codifica um gene, tal como uma molécula p53 de tipo selvagem, uma molécula Rb94, uma molécula de Apoptina, uma molécula EGFG ou uma molécula anti-sentido. Um oligonucleótido anti-sentido de HER-2 preferido é contra o gene de HER-2 e tem a sequência 5'-TCC ATG GTG CTC ACT-3'. Uma molécula de ARNsi preferida é aquela que actua contra ARNm de HER-2. Outras moléculas terapêuticas preferidas podem ser determinadas pelos especialistas na técnica, sem experimentação indevida.
Como notado anteriormente, a célula alvo pode ser, alternativamente, uma célula não cancerosa. Células alvo não cancerosas preferidas, incluem células dendríticas, células endoteliais dos vasos sanguíneos, células pulmonares, células da mama, células da medula óssea e células do fígado. Podem ser visadas células indesejáveis, mas benignas, tais como células da hiperplasia prostática benigna, células da tiróide superactivas, células de lipoma e células relacionando-se com doenças auto-imunes, tal como células B, que produzem anticorpos 11 envolvidos em artrite, lúpus, miastenia grave, metaplasia escamosa, displasia e semelhantes.
Alternativamente, o agente pode ser um agente de diagnóstico capaz de detecção in vivo após administração. Agentes de diagnóstico exemplificativos incluem material electronicamente denso, agentes de imagiologia de ressonância magnética e radiofármacos. Radionuclideos úteis para imagiologia incluem radioisótopos de cobre, gálio, índio, rénio e tecnécio, incluindo os isótopos 64Cu, 67Cu, min, 99mTc, 67Ga ou 68Ga. Os agentes de imagiologia divulgados por Low et al. na Patente U.S. 5688488, são úteis nos complexos lipossomais aqui descritos. 0 ligando pode ser qualquer ligando cujo receptor é expresso, de modo diferencial, na célula alvo. Exemplos incluem transferrina, folato, outras vitaminas, EGF, insulina, Heregulina, péptidos RGD ou outros polipéptidos reactivos para receptores de integrina, anticorpos ou os seus fragmentos. Um fragmento de anticorpo preferido é um fragmento Fv de cadeia simples de um anticorpo. 0 anticorpo ou fragmento de anticorpo é aquele que se irá ligar a um receptor na superfície da célula alvo e, de um modo preferido, a um receptor que é expresso, de modo diferencial, na célula alvo. Um anticorpo preferido é um anticorpo monoclonal anti-TfR e um fragmento de anticorpo preferido é um scFv baseado num anticorpo monoclonal anti-TfR. Outro anticorpo preferido é um anticorpo monoclonal anti-HER-2 e outro fragmento de anticorpo preferido é um scFv baseado num anticorpo monoclonal anti-HER-2. 12
0 ligando é misturado com o lipossoma, à temperatura ambiente e a uma razão ligando: lipossoma na gama de cerca de 1:0,001 a 1:500 (pg:nmole), de um modo preferido cerca de 1:10 a cerca de 1:50 (pg:nmole). O agente terapêutico é misturado com o lipossoma catiónico, à temperatura ambiente e a uma razão agente: lipido na gama de cerca de 1:0,1 a cerca de 1:50 (pg:nmole), de um modo preferido cerca de 1:10 a cerca de 1:24 (pg:nmole). Em complexos, por exemplo, nos quais o ligando é transferrina e o agente terapêutico é ADN plasmidico, razões úteis de agente terapêutico para lipossoma para ligando estão tipicamente dentro da gama de cerca de 1 pg: 0,1-50 nmoles: 0,1-100 pg, de um modo preferido 1 pg: 5-24 nmoles :6-36 pg, de um modo muito preferido cerca de 1 pg: 10 nmoles: 12,5 pg. Se o ligando for TfRscFv, razões úteis de ligando para lipossoma estão tipicamente dentro da gama de cerca de 1:5 para 1:40 (pg:pg), de um modo preferido 1:30 (pg:pg) e a razão de ADN plasmidico para lipossoma está tipicamente dentro da gama de cerca de 1:6 a 1:20 (pg:pg), de um modo preferido 1:14 (pg:pg) . Se o agente terapêutico for um oligonucleótido (ODN) em vez de ADN plasmidico, razões típicas de ligando, lipossoma e o ODN são 0,1 nmole a 36 nmole (ODN: lipossoma e 0,1 pg a 100 pg (ligando:lipossoma, de um modo preferido 0,5 nmoles a 20 nmoles (ODN:lipossoma) e 0,5 pg a 50 pg (ligando:lipossoma, de um modo muito preferido 1 nmole a 15 nmole (ODN: lipossoma) e 1 pg a 30 pg (ligando:lipossoma) . Se o agente terapêutico for um ARNsi, razões úteis dos componentes podem ser 0,1 pg a 30 nmole (ARNsi: lipossoma e 0,1 pg a 100 pg (TfRscFv: lipossoma, de um modo preferido 1 pg a 7 nmole (ARNsi:lipossoma) e 1 pg a 30 pg (TfRscFv:lipossoma).
Uma ampla variedade de lipossomas catiónicos é útil na preparação dos complexos. O pedido PCT publicado WO99/25320, 13 aqui incorporado por referência, descreve a preparação de diversos lipossomas catiónicos. Exemplos de lipossomas desejáveis incluem aqueles que compreendem uma mistura de fosfato de dioleoiltrimetilamónio (DOTAP) e dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) e/ou colesterol (chol), ou uma mistura de brometo de dimetildioctadecilamónio (ddab) e DOPE e/ou colesterol. A razão dos lipidos pode ser variada, de modo a optimizar a eficiência de absorção da molécula terapêutica para o tipo especifico de célula alvo. 0 lipossoma pode compreender uma mistura de um ou mais lipidos catiónicos e um ou mais lipidos neutros ou auxiliares. Uma razão desejável de lípido(s) catiónico(s) para lípido(s) neutro(s) ou auxiliar(es) é cerca de 1:(0,5-3), de um modo preferido 1:(1-2) (razão molar).
Numa forma de realização, o lipossoma utilizado para formar o complexo é um lipossoma estereoquimicamente estabilizado. Os lipossomas estereoquimicamente estabilizados são lipossomas dentro dos quais foi integrado um polímero hidrófilo, tal como PEG, poli(ácido 2-etilacrílico) ou poli(n-isopropilacrilamida) (PNIPAM). Os lipossomas assim modificados podem ser particularmente úteis quando complexados com agentes terapêuticos ou de diagnóstico, visto não serem tipicamente depurados da corrente sanguínea pelo sistema reticuloendotelial tão rapidamente como o são lipossomas comparáveis que não foram deste modo modificados. Numa segunda forma de realização, o lipossoma utilizado para formar o complexo também é ligado a um péptido composto por histidina e lisina (ramificado ou linear), onde o péptido tem, pelo menos, cerca de 10 aminoácidos em comprimento, tipicamente entre cerca de 10 e 1000 aminoácidos em comprimento e é composto por 5-100% de histidina e 0-95% de aminoácidos não histidina; de um modo preferido, pelo menos, 10% dos aminoácidos não histidina são lisina. De um modo muito 14 preferido, o péptido tem cerca de trinta e um aminoácidos, aproximadamente 20% dos quais são histidina e aproximadamente 80% dos quais são não histidina. Destes, pelo menos, 75% são lisina e, pelo menos, um é uma cisteina terminal. Um péptido preferido tem a estrutura 5'-K[K(Η)-K-K-K]5-K(H)-K-K-C-3' e pode ser covalentemente conjugado ao lipossoma através da cisteina terminal e um grupo maleimido no lipossoma. Em tais complexos, as razões dos componentes podem ser tipicamente como se segue: ligando para HK-lipossoma (pg: pg) de 1:5 a 1:40, de um modo preferido, 1:30 e adn para HK-lipossoma (pg:nmole) de 1:1 a 1:20, de um modo preferido 1:14.
Os complexos podem ser preparados através da mistura do ligando-lipossoma e do agente terapêutico ou de diagnóstico entre si, invertendo lentamente a solução resultante um determinado número de vezes ou agitando a solução, a uma velocidade onde se forma apenas um vórtice na solução, durante um período variando entre cerca de 10 segundos a cerca de 10 minutos, de um modo preferido 15 segundos a cerca de 2 minutos.
Os complexos podem ser administrados em combinação com outro agente terapêutico, tal como um agente de radiação ou quimioterapêutico. O agente terapêutico ou uma combinação de agentes terapêuticos, pode ser administrado antes ou depois da administração do complexo, por exemplo, no espaço de cerca de 12 horas a cerca de 7 dias. Agentes quimioterapêuticos incluem mas não estão limitados a, por exemplo, doxorrubicina, 5-fluorouracilo (5FU), cisplatina (CDDP), docetaxel, gemcitabina, paclitaxel, vinblastina, etoposido (VP-16), camptotecina, actinomicina D, mitoxantrona e mitomicina C. 15
Terapias de radiação incluem radiação gama, raios X, irradiação UV, microondas, emissões electrónicas e semelhantes. A invenção é, adicionalmente, ilustrada pelos exemplos seguintes que são proporcionados para fins ilustrativos e não se pretende que sejam limitativos.
Exemplos
Exemplo 1
Preparação de Complexos de Fresco e Liofilizados com Hidrato de Carbono e Avaliação In Vitro de Actividade e Tamanho
Foram realizadas experiências iniciais para testar o tamanho e a eficiência de transfecção in vitro dos complexos de ácido nucleico ligando-lipossoma, preparados com hidrato de carbono, antes e após liofilização. Foram testados dois ligandos separados, Tf e TfRscFv. Os complexos foram preparados utilizando a metodologia descrita no Pedido de Patente U.S. 09/601444 e Pedidos de Patente U.S. publicados 09/914046 e 10/113927 [Ver, também, Xu, L., et al. Human Gene Therapy 10:2941-2952 (1999); Xu, L., et al., Human Gene Therapy 13:469-481 (2002); e Xu, L., et al., Molecular Câncer Therapeutics 1:337-346 (2002)]. Em cada complexo, o lipossoma foi uma razão 1:1 de DOTAP:DOPE, aqui identificado como Lipossoma A (LipA). O ADN utilizado foi um plasmideo transportando um gene codificando o gene da luciferase do pirilampo. Em todos os casos, a solução de hidrato de carbono foi adicionada como a última etapa na preparação do complexo. 16
Foi preparada uma série de 8 complexos. Quatro continham Tf como o ligando (a uma razão de ADN:LipA:Tf de 1 pg:10 nmoles:12,5 pg); quatro continham TfRscFv como o ligando (a uma razão de ADN:LipA:TfrscFv de 1 pg:14 nmoles:0,34 pg) . As soluções contendo o ligando-lipossoma e o ADN foram misturadas entre si, invertidas lentamente 10 vezes e a solução resultante foi mantida à temperatura ambiente, durante 15 minutos, antes da adição de uma solução aquosa de dextrose ou sacarose em água, até uma concentração final de 5%. Cada mistura resultante foi invertida 10 vezes e, depois, mantida à temperatura ambiente, durante 15 minutos, antes de liofilização ou transfecção.
As soluções a serem liofilizadas foram liofilizadas utilizando um liofilizador Virtis Benchtop de 3 L, a 25 militorr, durante 24 horas, a -55 °C e, depois, armazenadas, de um dia para o outro, a -80 °C, antes de reconstituição. Após reconstituição com um volume de água igual ao volume de solução antes de liofilização, o recipiente contendo cada solução foi lentamente invertido 10 vezes e mantido, à temperatura ambiente, durante 60 minutos. Após este tempo, o complexo reconstituído poderia ser mantido a 2°-8 °C, durante até 24 horas. O tamanho dos complexos, antes e após liofilização, foi medido por dispersão de luz laser dinâmica, utilizando um Malvern Zetasizer 3000H.
Os resultados da classificação por tamanho (média númerica) são mostrados na Figura 1. Quando o ligando era Tf existiu um aumento aproximado de 10 vezes no tamanho, após liofilização na presença de dextrose a 5%. Embora o tamanho do complexo de fresco com sacarose a 5% fosse ligeiramente superior àquele com dextrose a 5%, não existiu essencialmente alteração pré/pós liofilização na presença de sacarose. Foi observado um padrão 17 semelhante quando TfRscFv foi utilizado como o ligando. Também aqui, a utilização de sacarose a 5% proporcionou resultados pós-liofilização muito melhores.
Os complexos de fresco e liofilizado também foram avaliados para a sua eficiência de transfecção numa linha celular de tumor da próstata humana DU145. Foram comparadas as eficiências de transfecção dos complexos liofilizados (com Tf e TfRscFv) após reconstituição e solução preparada de fresco correspondente do mesmo complexo. Os resultados da eficiência de transfecção pré-liofilização e pós-liofilização são mostrados nas Figuras 2A e 2B. Quando o ligando foi Tf, a eficiência caiu, após liofilização, para cerca de 60% daquela do complexo preparado de fresco, para a preparação contendo dextrose a 5%, ao passo que a preparação liofilizada contendo sacarose a 5% reteve cerca de 80% da sua actividade inicial. O padrão era semelhante com o ligando TfRscFv. O complexo liofilizado contendo dextrose a 5% diminuiu para cerca de 50% da actividade de fresco, ao passo que foi retida cerca de 90% da actividade quando foi utilizada sacarose a 5% (Fig. 2B) . Deste modo, a sacarose é um estabilizante mais eficiente que a dextrose. A razão açúcar/complexo foi adicionalmente optimizada, de modo a melhorar a estabilidade e manter o tamanho de partícula. Complexos com 5% e 10% de sacarose foram comparados. A quantidade de ADN plasmídico também foi aumentada para 20 pg, a quantidade habitualmente utilizada para uma única injecção nos estudos in vivo abaixo discutidos. Após liofilização, como anteriormente descrito, a eficiência de transfecção do complexo contendo sacarose a 10% foi -95% daquela verificada com o complexo de fresco, preparado da forma convencional, com solução de dextrose a 5%. A Figura 3 mostra uma comparação da eficiência 18 de transfecção entre complexos preparados com 5% e 10% de sacarose. A eficiência de transfecção in vitro foi melhor com o complexo liofilizado contendo sacarose a 10%. Verificou-se que isto foi verdade, independentemente de se o fragmento de proteína ou de anticorpo foi utilizado como ligando de direccionamento. Também foi avaliado o tamanho dos complexos contendo sacarose a 10%, antes e após liofilização, utilizando as condições anteriormente proporcionadas. Não existiu diferença significativa entre os tamanhos dos complexos preparados com sacarose a 10%, quer antes e após liofilização, em comparação com o complexo preparado de fresco convencional, com dextrose a 5%. Também aqui se verificou ser este o caso, independentemente do ligando de direccionamento.
Deste modo, a presença de sacarose a 10% numa preparação de complexo lipossomal reconstituída, resultou em superior manutenção de actividade biológica e tamanho do que aquela obtida com preparações reconstituídas comparáveis, contendo dextrose a 5% ou sacarose a 5%.
Exemplo 2
Direccionamento para Tumor da Próstata Humano In Vivo por Complexo Liofilizado Após Armazenamento a 2-8 °C Durante Uma Semana O direccionamento para tumor in vivo de um complexo lipossomal com sacarose a 10% (preparado de fresco ou liofilizado) e armazenado durante 1 semana a 2-8 °C, foi testado utilizando proteína verde fluorescente melhorada (EGFP) como o gene repórter no complexo. O complexo foi TfRscFv-Lipossoma 19 A-pEGFP, onde Lipossoma A é DOTAPrDOPE (1:1). A razão dos três componentes foi 0,3 pg: 14 nmoles: 1 pg (TfRscFv: Lipossoma: ADN) . O complexo foi preparado e liofilizado como anteriormente descrito no Exemplo 1. Após liofilização, o complexo foi armazenado refrigerado a 2-8 °C, durante uma semana. As amostras foram reconstituídas pela adição de água livre de endotoxina até um volume igual àquele antes de liofilização, como descrito no Exemplo 1.
Murganhos contendo tumores de xenoenxerto DU145 de, pelo menos, 50 mm3 foram injectados, i.v., 3 vezes ao longo de 24 horas com diversos complexos (preparação preparada de fresco com dextrose a 5%; preparação preparada de fresco com sacarose a 10% e uma preparação liofilizada reconstituída com sacarose a 10% que, antes de reconstituição, tinha sido mantida refrigerada durante 1 semana, a 2-8 °C, todas com TfRscFv como o ligando de direccionamento). Após 48 horas, os animais foram sacrificados, o tumor e fígado excisados, a proteína isolada e realizada análise de Western utilizando Ab anti-EGFP (COVANCE). Como mostrado na Figura 4A, o complexo liofilizado e reconstituído com sacarose a 10% teve um nível comparável de expressão génica, em comparação com qualquer dos complexos preparados de fresco. Mais significativamente, embora fosse evidente num elevado nível de expressão génica exógena nos tumores, quase não foi expressa EGFP nos fígados dos murganhos, demonstrando a natureza específica de tumor do complexo e que esta especificidade de direccionamento para tumor foi mantida após liofilização, armazenamento a 2o-8 °C durante, pelo menos, uma semana e reconstituição. 20
Exemplo 3
Direccionamento para Tumor Pancreático Humano In Vivo por Complexo Liofilizado Após Armazenamento a -80 °C Durante Um Mês A estabilidade do complexo liofilizado também foi testada após um mês de armazenamento, a -80 °C, através do direccionamento para tumores de xenoenxerto de cancro pancreático. O complexo (o mesmo complexo e razão, como anteriormente descritos no Exemplo 2) foi preparado com sacarose a 10% e liofilizado, como descrito no Exemplo 1. Após liofilização, as amostras foram armazenadas, a -80 °C, durante um mês e, depois, reconstituídas com água livre de endotoxina, como descrito no Exemplo 1.
Como mostrado na Figura 4B, os tumores de murganhos injectados, i.v., 3 vezes, ao longo de um periodo de 24 horas (como no Exemplo 2 anterior), mostraram um nivel ainda mais alto de expressão génica de EGFP do que o verificado após injecção com o complexo preparado de fresco. De novo, verificou-se muito pouca ou nenhuma expressão no figado.
Exemplo 4
Estabilidade de Longo Prazo do Complexo Liofilizado Armazenado a 2-8 °C como Avaliada pelo Tamanho e Eficiência de Transfecção In Vitro
De modo a aumentar o potencial do presente complexo TfRscFv-lipossoma-ADN como uma terapêutica clinica viável, foi desenvolvido um meio de aumentar a sua estabilidade mantendo, 21 deste modo, a sua direccionabilidade para tumor e duração de armazenamento. Alguns dos presentes estudos indicaram que o complexo liofilizado, com sacarose a 10% como o excipiente, poderia ser armazenado com êxito a -20 °C, -80 °C ou 2-8 °C. Por razões de conveniência para utilização em clinica, o método preferido de armazenamento é 2-8 °C. De modo a determinar a duração do tempo que o complexo liofilizado pode ser armazenado a 2-8 °C, sem perda de actividade biológica, foi avaliada a eficiência de transfecção in vitro de complexo liofilizado e armazenado a 2-8 °C, durante 1, 4 e 6 meses. O complexo foi TfRscFv-Lipossoma A-p53, onde o lipossoma A é DOTAP:DOPE (1:1). A razão dos três componentes foi 0,3 pg: 14 nmoles: 1 pg (TfRscFv: Lipossoma A: ADN) que é equivalente a 0,34 pg:10 pg:l pg. Sacarose a 10% foi utilizada como o excipiente. O ADN no complexo era um vector plasmidico, contendo sequência de ADNc de ~1,7 Kb, codificando para p53 humano de tipo selvagem. O complexo foi preparado, liofilizado e reconstituído no tempo apropriado após armazenamento a 2-8 °C, como descrito no Exemplo 1. O tamanho (parâmetro de número) e Potencial Zeta foram determinados utilizando um Malvern 3000H Zetasizer. A actividade funcional foi avaliada utilizando um ensaio de co-transfecção de luciferase. As células humanas de cancro da próstata DU145 foram co-transfectadas com ADN plasmidico BP100 e com os complexos. O plasmídeo BP100 transporta o gene da luciferase, sob o controlo de um promotor indutível wtp53. Deste modo, o nível de p53 funcional nas células transfectadas é reflectido pelo nível de actividade de luciferase. 24 horas após a transfecção, as células foram lisadas e a actividade de luciferase ensaiada, utilizando o Promega Luciferase Reagent, de acordo com o protocolo do fabricante. Como mostrado na Tabela 1, a actividade de luciferase, tamanho e potencial zeta dos complexos são 22 consistentes entre o complexo preparado de fresco e os complexos liofilizados e armazenados a 2-8 °C, durante até seis meses.
Tabela 1
Comparação de Complexo Liofilizado Com Complexo Preparado de Fresco
Actividade de Luciferase (RLU/pg) Tamanho (nm) Potencial Zeta UT — — — BP100 — — — De Fresco-1 19550 — 25,3 De Fresco-2 19825 453,7 (100%) 8, 0 Lyo lmo-1 15420 450,8 (99,3%) 28,9 Lyo lmo-2 13879 463,3 (99,8%) 33,2 Lyo 4mo-l 20055 462,5 (99,4%) 29,1 Lyo 4mo-2 18413 554,2 (99,4%) 27, 5 Lyo 4mo-3 22058 548,5 (100%) 29,4 Lyo 6mo-l 14507 550 (99,7%) 23 Lyo 6mo-2 13301 414,5 (99,4%) 28 Lyo 6mo-3 15028 386,4 (99,4%) 25, 6 23
Exemplo 5
Direccionamento Específico para Tumor In Vivo do
Complexo Liofilizado_Sistemicamente_Administrado_Após
Armazenamento a 2-8 °C
Os complexos de fresco e liofilizados, preparados, armazenados a 2-8 °C, durante 1, 4 ou 6 meses e, depois, reconstituídos para os estudos descritos no Exemplo 4, também foram testados in vivo a sua capacidade para alcançarem e transfectarem tumores humanos de xenoenxerto de próstata após administração sistémica (i.v.) Murganhos nude atímicos, contendo tumores de xenoenxerto DU145 da linha celular de tumor da próstata humano subcutâneo de, pelo menos, 100 mm3 foram injectados, i.v., três vezes ao longo de 24 horas com complexo (de fresco ou liofilizado e reconstituído), numa quantidade equivalente a 40 pg de ADN por injecção, num volume final de 0,8 mL. Às 48 horas após a última injecção, os animais são humanamente eutanasiados, os órgãos removidos, a proteína isolada e a expressão determinada por análise de Western, como descrito por Xu, L. et ai., Tumor Targeting 4:92-104 (1999).
Outros métodos geralmente conhecidos na técnica poderiam ter sido alternativamente utilizados. 80 pg de lisado de proteína total foram carregados/corredor de um gel de SDS-poliacrilamida a 12%. Após o gel ter sido corrido, a proteína foi transferida para membrana de nitrocelulose e sondada com um anticorpo monoclonal de murganho anti-p53 (Oncogene Research Products).
Os resultados do direccionamento para tumor in vivo, em murganhos, são mostrados na Fig. 5. Os níveis de expressão de p53 foram semelhantes entre aqueles no tumor de animais recebendo o complexo preparado de fresco e aqueles de animais 24 recebendo cada dos complexos liofilizados, mesmo seis meses após liofilização. Os níveis de expressão de p53 em todos os tumores foram significativamente superiores àqueles no fígado, demonstrando que a especificidade de tumor após administração, i.v., é mantida, mesmo após de 6 meses de armazenamento a 2-8 °C.
Exemplo 6
Consistência e Estabilidade de Lote para Lote Após Liofilização E importante estabelecer que múltiplos lotes de complexo, preparados e liofilizados em diferentes momentos no mesmo dia e preparados e liofilizados em dias diferentes, têm tamanhos e níveis de eficiência de transfecção semelhantes. O complexo TfRscFv-Lipossoma A-p53, onde lipossoma A é DOTAP:DOPE (1:1) foi preparado, liofilizado, armazenado e reconstituído como descrito no Exemplo 1. A razão dos componentes e o ADN de p53 foram como descritos no Exemplo 4. A expressão funcional de múltiplos complexos TfRscFv-LipA-p53, quer preparados de fresco ou liofilizados, foi avaliada em células de cancro da próstata DU145. A actividade in vitro foi avaliada utilizando o plasmídeo BP100 e o ensaio de luciferase, como anteriormente descrito no Exemplo 4. Em 5 dias diferentes, foram preparadas e liofilizadas, pelo menos, duas amostras independentes. Após serem armazenadas a 2-8 °C, durante 2 semanas, as amostras foram reconstituídas como no Exemplo 1 e testadas in vitro e in vivo. Foi ensaiada in vitro a actividade de luciferase (RLU/pg: Unidades Relativas de Luz por pg de 25 proteína em célula), utilizando o Promega Luciferase Reagent, como descrito no protocolo do fabricante e o potencial zeta e o tamanho de partícula (parâmetro de número) de cada lote, também foram medidos, num Malvern 3000H Zetasizer. Como mostrado na Tabela 2, por número de parâmetro, o tamanho da maioria das preparações, está dentro da gama de 400-700 nm e os potenciais zeta são todos na gama positiva. Deste modo, complexos preparados em dias diferentes têm comportamento consistente.
Tabela 2
Classificação por Tamanho Amostra N° Actividade de Luciferase (RLU/pg de Proteína) Por Número (nm) Potencial Zeta *4/03 1 17284 ± 1175 100% 466 16 *4/03 2 21703 ± 2422 99% 509 32 1/3/03 1 16246 ± 1121 100% 575 38 1/3/03 2 19225 ± 1118 100% 477 32 1/7/03 1 17921 ± 1564 100% 537 39 1/7/03 2 17519 ± 3029 95% 444 31 1/8/03 1 21534 ± 3028 100% 668 29 1/8/03 2 21528 ± 3922 100% 750 32 1/9/03 1 18146 ± 1612 100% 478 60 1/9/03 2 12521 ± 172 91% 645 38 De Fresco 12806 66% 147 38 De 13173 100% 258 40 26 (continuação)
Classificação por Tamanho Amostra N° Actividade de Luciferase (RLU/pg de Proteína) Por Número (nm) Potencial Zeta Fresco BP 100 131 NA NA UT 103 NA NA
As amostras também foram avaliadas in vivo, em murganhos nude atímicos, contendo xenoenxerto DU145, como descrito no Exemplo 5. De modo a demonstrar que o complexo ligando-lipossoma-ADN, empregando TfRscFv como a entidade de direccionamento, mantém especificidade de tumor, foi empregue a análise de Western (Figura 6) . Estes lotes independentes de complexo TfRscFv-LipA-p53 foram testados no modelo de murganho de xenoenxerto subcutâneo de próstata humano DU145. Murganhos nude transportando tumores DU145 de -50-100 mm3 foram intravenosamente injectados, três vezes ao longo de um período de 24 horas, com os complexos (40 pg de ADN/injecção) . Vinte e quatro horas após a última injecção, os animais foram sacrificados e o tumor e fígado excisados. Foi isolada proteína. 80 pg de lisado de proteína total foram carregados/corredor de um gel de SDS-poliacrilamida a 12%. Após o gel ter sido corrido, a proteína foi transferida para membrana de nitrocelulose e sondada com um anticorpo monoclonal de murganho anti-p53 (Oncogene Research Products). A membrana foi subsequentemente sondada para níveis de GAPDH, de modo a demonstrar igual carregamento. Elevados níveis de expressão de p53 são evidentes no tumor dos murganhos recebendo os complexos contendo cada um 27 dos diversos lotes (Fig. 6). Nível de expressão de p53 semelhante foi observado nos tumores com o complexo TfRscFv preparado de fresco ou liofilizado. Por outro lado, é observada expressão muito baixa de p53 nos murganhos não tratados com o complexo. A especificidade de tumor é demonstrada pelos níveis muito baixos de expressão no fígado. Em todos os casos, há uma diferença de 5-10 vezes em expressão entre o tumor e o fígado. Comparativamente com o nível de p53 no tumor não tratado, todas as preparações proporcionaram forte sinal de p53 nos tumores de murganhos tratados mas não nos fígados correspondentes nos mesmos murganhos. Por conseguinte, estes estudos indicam que a liofilização do complexo completo é exequível e pode ser capaz de superar o problema de estabilidade e duração de armazenamento.
Exemplo 7
Liofilização por um Fabricante Comercial: Testes In Vitro e In Vivo
Para que um complexo liofilizado seja útil no tratamento de doentes humanos, é necessário mostrar que o processo de preparação de complexo na presença de sacarose a 10% poderia ser transferido e realizado com êxito numa grande escala por uma entidade fabricante comercial. Os complexos foram preparados por agitação, sob contrato e um acordo de confidencialidade, pela Cardinal Health, Albuquerque, NM. A solução de ADN foi adicionada à solução de TfRscFv:lipossoma agitando, simultaneamente, a uma velocidade onde se formava apenas um vórtice na solução, durante 30 segundos a 1 minuto. Esta solução foi mantida à temperatura ambiente, durante 10 - 20 minutos, 28 após o que foi adicionada uma solução aquosa de sacarose a 50% com agitação, como anteriormente, durante 30 segundos a 1 minuto, até uma concentração final de 10% e mantida à temperatura ambiente, durante 10 - 20 minutos. Os lotes comercialmente preparados variaram em tamanho de 50-1000 mL. O protocolo de liofilização utilizando um liofilizador Hull nesta instalação comercial foi como se segue: • Frasquinhos de vidro de 10 mL, contendo cada um 5 mL de complexo com sacarose a 10%, foram carregados, à temperatura ambiente. • A temperatura de armazenamento foi variada em rampa para -45 °C, ao longo de 1 hora. Assim que a temperatura de prateleira atingiu -45 ± 3 °C, o produto foi mantido durante 3 horas. • Nesta fase, o condensador foi arrefecido para -55 °C, ou mais frio, e o vácuo foi fixado em 50 mícron Hg. • A temperatura de armazenamento foi, depois, variada em rampa para -35 °C, ao longo de 1 hora. • Assim que a temperatura de armazenamento atingiu -35 °C, o produto foi mantido durante 48 horas. • A temperatura de armazenamento foi variada em rampa para 20 °C, ao longo de 4 horas e o produto foi mantido durante 12 horas. • No fim do ciclo, a pressão da câmara foi restabelecida para a pressão atmosférica com azoto, NF filtrado através de um filtro retentivo microbiano esterilizante apropriado. • O produto foi tapado, rotulado e armazenado a 2-8 °C.
Cinco lotes diferentes do complexo TfRscFv-LipA-p53 foram preparados pela entidade comercial. Um exemplo da actividade de 29 luciferase in vitro, tamanho e potencial zeta de lotes representativos comercialmente preparados são mostrados na Tabela 3. 0 tamanho, potencial zeta e nível de actividade de luciferase dos complexos comercialmente preparados e liofilizados eram comparáveis àqueles do complexo preparado de fresco no laboratório.
Tabela 3
Amostra Actividade de Luciferase (RLU/pg de proteína) Tamanho em número (mm) Potencial Zeta De Fresco 16,7 x 104 413 35 12,4 x 104 416 29, 8 Comercial 16,4 x 104 412 30, 9
De modo a comparar os cinco lotes, foram tratados murganhos contendo xenoenxertos DU145, como descrito no Exemplo 5 (a 40 pg ADN/injecção em 0,8 mL) . Cada murganho recebeu três injecções, i.v., ao longo de 24 horas. Quarenta e oito horas após a última injecção, os animais foram sacrificados e os órgãos recolhidos. Todos os cinco lotes mostram níveis elevados de expressão de p53 por análise de Western, que eram comparáveis àqueles do complexo preparado de fresco e significativamente superiores àqueles observados em tumor não tratado ou fígado (Fig. 7). Por conseguinte, esta tecnologia pode ser transferida com êxito para fabricantes comerciais. 30
Exemplo 8
Consistência de Percentagem de Níveis de TfRscFv Incompleto no Complexo Liofilizado
De modo a avaliar, adicionalmente, a estabilidade do complexo liofilizado, a quantidade de ligando não complexado foi determinada após armazenamento, a 2-8 °C, durante até seis meses. De modo a avaliar a quantidade de TfRscFv não complexado presente no complexo TfRscFv-LipA-p53, foi empregue electroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante e não redutor de gradiente de 4%-20%, seguido de análise de Western utilizando métodos geralmente conhecidos do especialista na técnica (Fig. 8) . Um anticorpo de coelho policlonal contra a proteína TfRscFv foi utilizado como o primeiro anticorpo (produzido por Animal Pharm, Healdsburg, CA) e um anticorpo monoclonal de murganho anti-coelho marcado com HRP (Sigma) como o segundo anticorpo. Complexos preparados de fresco ou liof ilizados, contendo em cada 134 ng de TfRscFv, foram preparados e liofilizados como descrito no Exemplo 1. As amostras liofilizadas foram armazenadas, a 2-8 °C, durante 1, 4 ou 6 meses, após o que foram reconstituídas como no Exemplo 1. Uma vez complexada aos lipossomas, a proteína TfRscFv não será capaz de entrar no gel PAGE. Por conseguinte, apenas a TfRscFv livre não complexada irá ser detectada. É difícil, sob condições não desnaturantes e não redutoras, determinar com precisão a quantidade do monómero TfRscFv livre. Deste modo, amostras não complexadas contendo 13,4 ng (10% dos quais em cada dos complexos), 26,8 ng (20%) ou 40,2 ng (30%) do agente único TfRscFv também foram corridas no mesmo gel como padrões de concentração para uma estimativa aproximada da quantidade do TfRscFv não complexado em cada dos complexos de teste. 31
Os resultados indicaram que, aproximadamente, 10% ou inferior do TfRscFv inicialmente colocado dentro do complexo, está presente como TfRscFv livre nas diversas preparações de fresco ou liofilizadas de complexo TfRscFv-LipA-p53, mesmo após armazenamento a 2-8 °C, durante seis meses. Estes dados sugerem que a quantidade de TfRscFv livre, não complexado, é bastante consistente em todas as preparações e que este nível não se altera após liofilização e armazenamento, a 2-8 °C, durante, pelo menos, seis meses.
Exemplo 9
Liofilização de Complexo Ligando-Lipossoma-Ácido Nucleico Contendo um Oliqonucleótido HER-2 Anti-Sentido
Os estudos anteriores utilizaram ADN plasmídico no complexo. Uma vez que ADN plasmídico e oligonucleótidos nem sempre são intercambiáveis e podem ter químicas diferentes, as experiências também foram efectuadas para demonstrar que o processo de liofilização poderia ser aplicado a um complexo ligando-lipossoma contendo uns oligonucleótidos (ODN). O ODN utilizado foi um ODN de HER-2 anti-sentido específico de sequência fosforotioatada de 15 nucleótidos, complementar à região de codão de iniciação do gene de HER-2 (AS her-2), com a sequência 5'-TCC ATG GTG CTC ACT-3'. Utilizando a linha celular de cancro da mama humano MDA-MB-453 como o sistema de ensaio, foi avaliada a morte celular pelo complexo TfRscFv-lipA-AS HER-2, após liofilização com diferentes açúcares, a concentrações crescentes de ODN. Os complexos foram preparados como descrito no Exemplo 1 e eram compostos por TfRscFv, lipossoma A 32 (DOTAPrDOPE a 1:1) e o ODN a uma razão de 1 nmole para 15 nmole (ODN:lipossoma) e 1 pg para 30 pg (TfRscFv:lipossoma).
Os complexos a serem liofilizados foram preparados para conterem quer dextrose a 5% ou sacarose a 10% e comparados com preparações de complexos comparáveis preparadas de fresco, compreendendo sacarose a 10%. Os complexos foram liofilizados como descrito no Exemplo 1, armazenados, de um dia para o outro, a 2-8 °C e reconstituídos em água livre de endotoxinas, como descrito no Exemplo 1. 5 x 103 células MDA-MB-453 foram semeadas/poço de uma placa de 96 poços. 24 horas mais tarde, as células foram transfectadas com os complexos preparados de fresco ou liofilizados e reconstituídos. O ensaio de citotoxicidade de viabilidade celular baseado em XTT (XTT=3[1-fenil-Amino-Carbonil)-3,4-[tetrazólio]-bis(4-metoxi-6-nitro)benzenossulfonato) foi realizado em triplicado, 48 horas pós-transfecção. Como mostrado na Figura 9, a concentrações de ODN AS-HER-2 acima de 0,25 pM, o complexo liofilizado e reconstituído contendo sacarose a 10% teve o maior efeito sobre a morte celular. Com as concentrações mais elevadas de ODN, os complexos contendo sacarose a 10%, de fresco e reconstituídos, foram muito superiores àqueles com dextrose a 5% e a liofilização não teve efeito adverso sobre a capacidade de morte celular do ODN anti-sentido HER-2 contido no complexo.
De modo a confirmar que a liofilização e reconstituição na presença de sacarose a 10% não foi prejudicial à eficácia do complexo, foi realizado um ensaio de XTT avaliando o nível de quimiossensibilização a Gemzar em células humanas de cancro pancreático 1 (PANC), comparando complexos preparados de fresco contra complexos comparáveis que tinham sido liofilizados e reconstituídos, como descrito no Exemplo 1. As razões dos 33 componentes no complexo foram 1 nmole : 15 nmole (ODN:lipossoma) e 1 pg : 30 pg (TfRscFv:lipossoma) . Foram semeadas/poço 4 x 103 células PANC-1, de uma placa de 96 poços e transfectadas, 24 horas mais tarde, com complexo TfRscFv-LipA-AS HER-2 (ODN a 0,25 pM) que foi preparado de fresco ou tinha sido misturado com sacarose, de modo a proporcionar sacarose a 10% e liofilizado, armazenado refrigerado, de um dia para o outro, a 2-8 °C e reconstituído. O fármaco quimioterapêutico Gemzar foi adicionado 24 horas mais tarde. O ensaio de viabilidade celular baseado em XTT foi realizado em triplicado, 72 horas após a adição de fármaco. Os resultados são ilustrados na Figura 10. Como mostrado, as curvas de sobrevivência das amostras foram virtualmente idênticas. Adicionalmente, os valores de IC50 (a concentração de fármaco matando 50% das células) dos complexos são os mesmos, se não inferiores, aos anteriormente determinados utilizando um complexo preparado de fresco com dextrose a 5%. O método de preparação e armazenamento desta invenção também é, deste modo, passível de utilização com qualquer oligonucleótido anti-sentido, uma vez que o gene alvo é irrelevante para o processo.
Estes estudos indicam que a liofilização do complexo completo é exequível e que, quando se utiliza ODN como moléculas terapêuticas, podem ser superadas dificuldades anteriores com estabilidade e duração de armazenamento. 34
Exemplo 10
Manutenção de Tamanho, Potencial Zeta e Eficácia Após Liofilização de Complexo Transportando AS ODN e Armazenamento durante Seis Meses. O tamanho, potencial zeta e actividade de transfecção dos complexos ligando-lipossoma-ácido nucleico, contendo AS HER-2 ODN e preparados com sacarose a 10%, foram examinados antes e após liofilização. Verificou-se que o tamanho do complexo era essencialmente o mesmo antes e após liofilização e armazenamento, a -20 °C, durante até seis meses. Por exemplo: Pré-liofilização, os valores para tamanho (nm) em intensidade, volume e média numérica para os complexos de fresco e liofilizados seis meses, preparados como descrito no Exemplo 9, foram 410 (I), 454 (V) e 368 (N) vs 339 (I), 427 (V) e 397 (N), respectivamente. Adicionalmente, outro oligonucleótido que não afecta os niveis de HER-2 (SC-ODN_ (5'-CTA GCC ATG CTT GTC-3') também foi complexado à mesma razão, liofilizado, armazenado, durante até seis meses, a -20 °C e reconstituído, como no Exemplo 9. Também aqui, a liofilização e armazenamento, não tiveram efeito significativo sobre o tamanho ou potencial zeta do complexo. Deste modo, qualquer ODN pode ser complexado e liofilizado.
Os potenciais zeta foram -43,8 (de fresco) e -47,7 (liofilizado) após armazenamento de seis meses. A eficiência de transfecção do complexo liofilizado, com sacarose a 10%, foi medida através da avaliação da capacidade do TfRscFv-lip A-AS HER-2 modular negativamente a expressão de HER-2 in vitro. Após preparação, liofilização (como no Exemplo 4) e armazenamento a -20 °C, durante até seis meses, o complexo AS 35 HER-2 ODN, a duas concentrações diferentes (0,3 ou 0,6 μΜ) ou SC-ODN, a 0,6 μΜ, foi utilizado para transfectar células MDA-MS-435 da linha celular de cancro da mama humano. Os complexos preparados de fresco, transportando AS HER-2 ou SC-ODN foram utilizados como controlos. O SC-ODN não teve efeito antes ou após liofilização. Contudo, existiu uma modulação negativa, dependente de dose, de AS HER-2 ODN da expressão de HER-2 por complexos preparados de fresco e liofilizados (Figura 11), mesmo após seis meses de armazenamento a -20 °C. Uma vez que o SC-ODN não teve efeito, a modulação negativa observada não foi um resultado de qualquer citotoxicidade geral devida a liofilização do complexo.
Exemplo 11
Manutenção de Tamanho e Potencial Zeta de Complexo Transportando ARNsi Após Liofilização A estabilidade de um complexo de TfRscFv, Lipossoma A e ARNsi, com sacarose a 10%, após liofilização foi avaliada através da medição do tamanho do complexo e do potencial zeta, antes e após liofilização. O complexo era composto por TfRscFv, Lipossoma A (DOTAPrDOPE a razão molar de 1:1) e ARNsi a 33,3 pg. O volume total de complexo foi 500 pL. A razão dos componentes era de 1 pg para 7 nmole (ARNsi:lipossoma) e 1 pg para 30 pg (TfRscFv:lipossoma). A sacarose foi adicionada ao complexo até uma concentração final de 10%. O complexo foi preparado e liofilizado como descrito no Exemplo 1. Após liofilização, o complexo foi reconstituído como descrito no Exemplo 1 e o tamanho e potencial zeta foram medidos utilizando um Malvern Zetasizer 3000H. Os resultados são mostrados na Tabela 4. 36
Tabela 4
Tamanho (nm) Potencial Amostra intensidade Volume Número Zeta 31,9 (99%) De Fresco 416 437 363 (1%) 5, 0 115 (94%) Liofilizada 261 373 392 (6%) 5,4
Por conseguinte, após liofilização, não ocorreu alteração significativa no tamanho ou potencial zeta. Quanto muito, o tamanho em intensidade e volume são mesmo mais pequenos após liofilização, tornando o complexo mais eficiente para utilização in vivo.
Exemplo 12
Manutenção de Tamanho de Complexo Preparado com Péptido-Lipossoma Após Liofilização
De modo a demonstrar, adicionalmente, a natureza geral desta invenção, também foi preparado um complexo que continha um lipossoma modificado. 0 lipossoma utilizado para formar o complexo foi ligado a um péptido. 0 péptido compreendia histidina e lisina e era um péptido ramificado de 31 aminoácidos em comprimento e era composto por uma combinação de histidina e aminoácidos não histidina com a estrutura 5'-K[K(H)-K-K-K]5-K(H)-K-K-C-3'). Neste estudo, o lipossoma era formado por DOTAP:DOPE 37 (1:1). 0 péptido ΗΚ foi covalentemente conjugação ao lipossoma através da cisteína terminal e um grupo maleimido no lipossoma. 0 complexo consistia em TfRscFv-HK-lipossoma-ADN, onde as razões dos componentes foram como se segue: TfRscFv para HK-lipossoma (pg:pg) de 1 pg:30 pg e ADN para HK-lipossoma (pg:nmole) de 1 pg:14 nmole. 0 ADN utilizado foi p53 (ver o Exemplo 4) a 18 pg de ADN por 300 pL de volume total de complexo. Foi incluída sacarose a 10% no complexo final. O complexo foi preparado e liofilizado como descrito no Exemplo 1. Após liofilização, o complexo foi armazenado, a 2-8 °C, durante 3 dias e, depois, reconstituído como descrito no Exemplo 1. O tamanho do complexo antes de liofilização e após armazenamento de três dias, a 2-8 °C, foi medido num Malvern Zetasizer 3000H. Antes de liofilização, o tamanho (média de numérica) foi 601 nm. Após armazenamento e reconstituição, era 588. Deste modo, uma vez mais, a liofilização do complexo utilizando sacarose a 10% não resultou em qualquer alteração significativa no tamanho do complexo, mesmo com a inclusão do péptido HK.
Exemplo 13
Avaliação In Vitro e In Vivo de Complexo Transportando um Gene Terapêutico Diferente (RB94) Após Liofilização e Armazenamento a 2°-8 °C
Adicionalmente ao gene de Luciferase, um gene codificando para a proteína verde fluorescente melhorada, e o gene p53, um complexo lipossomal transportando outro ADN plasmídico pode ser liofilizado e reter o tamanho e actividade biológica. Para demonstração adicional, este complexo também foi preparado transportando outro gene terapêutico, o gene de supressão 38 tumoral RB94. 0 complexo era TfRscFv-lipossoma A-RB94, onde lipossoma A é DOTAP:DOPE (1:1). A razão dos três componentes (TfRscFV:Lipossoma:ADN) era 0,34 pg:10 pg:l pg. O complexo também continha 30 pg de ADN plasmídico RB94, num volume total de 0,5 mL, com sacarose a 10%. O complexo foi preparado como descrito no Exemplo 1 e liofilizado utilizando o método descrito no Exemplo 1, para os estudos de tamanho e potencial zeta ou preparado como no Exemplo 7, pela Cardinal Health, utilizando, para utilização, os estudos de direccionamento in vitro e in vivo.
Tamanho e Potencial Zeta O tamanho e potencial zeta do complexo preparado como no Exemplo 1 e liofilizado, armazenado a 2-8 °C, durante quatro dias e reconstituído como no Exemplo 1, foram comparados, antes e após liofilização e armazenamento, utilizando um Malvern Zetasizer 3000H. Antes de liofilização, o tamanho (nm) e intensidade foi 283 (Intensidade) e 392 (Volume), ao passo que mais tarde se verificou ser 303 (Intensidade) e 347 (Volume) . Deste modo, não ocorreu alteração significativa em tamanho após liofilização e armazenamento durante quatro dias, a 2°-8 °C, quando foi incluída sacarose a 10%. De modo semelhante, o potencial zeta não mostrou diferença importante, sendo ambos na gama +20 a +30 [19 (pré) e 30,7 (pós)].
Direccionamento In Vitro e In Vivo A capacidade de o complexo especificamente visar células tumorais e transfectar eficientemente as mesmas após 39 liofilização e armazenamento, a 2-8 °C, durante um período de tempo prolongado, também foi testada em cultura celular utilizando a linha celular DU145 da próstata humana e linha celular HTB-9 de carcinoma da bexiga humana. Ambas as linhas celulares foram transfectadas in vitro utilizando o complexo preparado de fresco ou o complexo que tinha sido preparado e liofilizado pelo contraente comercial (Exemplo 7) e armazenado, a 2°-8 °C, durante, aproximadamente, 4 meses, antes de reconstituição, como no Exemplo 1. 0 nível de expressão de proteína RB94 nas células foi determinado por análise de Western utilizando protocolos padrão, conhecidos pelo especialista na técnica. Não houve diferença significativa em qualquer linha celular tumoral humana entre a quantidade de proteína detectada, após transfecção com complexo preparado de fresco ou liofilizado.
Murganhos transportando tumores de xenoenxerto HTB-9 de carcinoma da bexiga humano foram injectados sistemicamente (i.v., por meio da veia da cauda) com o complexo preparado de fresco ou complexo que tinha sido preparado com sacarose a 10% por agitação, como no Exemplo 1, liofilizado (Exemplo 7) e armazenado, a 2°-8 °C, durante quase 5 meses, antes de reconstituição como no Exemplo 1. Os murganhos receberam um total de três injecções, i.v., ao longo de 24 horas (40 pg de ADN em 0,67 mL por injecção) . Aproximadamente 48 horas após a última injecção, os animais foram humanamente sacrificados, os tumores e fígado excisados e a proteína obtida e analisada por transferência Western, utilizando um anticorpo monoclonal anti-RB94 (QED Biosciences, inc) por meio de um processo comum, como descrito por Xu, L., et al., Tumor Targeting 4:92-104 (1999) . Como com os estudos in vitro, não houve diferença significativa no nível de proteína RB94 evidente nos tumores dos 40 animais recebendo os complexos de fresco ou liofilizados. Quanto muito, a expressão foi mesmo superior nos tumores dos murganhos injectados com o complexo liofilizado. Além do mais, não houve virtualmente nenhuma expressão nos fígados em qualquer grupo, demonstrando que a capacidade de direccionamento para tumor do complexo foi mantida após liofilização na presença de sacarose a 10% e armazenamento a 2-8 °C durante, pelo menos, 5 meses.
Lisboa, 28 de Outubro de 2010 41

Claims (22)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para preparação de um complexo de direccionamento celular estável, compreendendo um ligando e um lipossoma catiónico encapsulando um agente terapêutico, gene repórter ou agente de diagnóstico que compreende: proporcionar um complexo compreendendo um ligando e um lipossoma catiónico encapsulando um agente de diagnóstico, gene repórter ou agente terapêutico; combinar o referido complexo lipossomal com uma solução aquosa consistindo, essencialmente, numa quantidade estabilizante de sacarose em água ou num tampão, até uma concentração final de cerca de 1% a cerca de 80% de sacarose; e liofilizar a referida solução de complexo lipossomal e sacarose, de modo a obter-se uma preparação liofilizada; em que, após reconstituição, a referida preparação retém, pelo menos, cerca de 80% da sua actividade de pré-liofilização.
  2. 2. Método da reivindicação 1, em que a referida solução consiste, essencialmente, em sacarose num tampão PBS, num tampão HEPES, num tampão TRIS ou num tampão TRIS/EDTA.
  3. 3. Método da reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que a referida preparação retém, pelo menos, cerca de 85% ou, 1 pelo menos, cerca de 90% ou, pelo menos, cerca de 95% da sua actividade de pré-liofilização após reconstituição.
  4. 4. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o referido complexo é combinado com uma solução de sacarose, até uma concentração final de cerca de 1% a cerca de 80% ou cerca de 1% a cerca de 50% ou cerca de 1% a cerca de 20% ou cerca de 5% a cerca de 10% ou cerca de 10% de sacarose.
  5. 5. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o referido ligando compreende um ligando cujo receptor é expresso de modo diferencial numa célula alvo.
  6. 6. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o referido ligando é uma proteína.
  7. 7. Método da reivindicação 5, em que o referido ligando compreende transferrina, folato, um anticorpo ou um fragmento de anticorpo.
  8. 8. Método da reivindicação 7, em que o referido ligando compreende um anticorpo anti- Tf R.
  9. 9. Método da reivindicação 7, em que o referido ligando compreende um fragmento Fv de cadeia simples de um anticorpo.
  10. 10. Método da reivindicação 9, em que o referido fragmento de anticorpo compreende um scFv baseado num anticorpo anti-TfR. 2
  11. 11. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o referido lipossoma compreende, pelo menos, um lipido catiónico e, pelo menos, um lipido neutro ou auxiliar.
  12. 12. Método da reivindicação 11, em que o referido lipido catiónico compreende fosfato de dioleoiltrimetilamónio (DOTAP) ou brometo de dimetildioctadecilamónio (DDAB) e o referido lipido neutro ou auxiliar compreende dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) ou colesterol (chol).
  13. 13. Método da reivindicação 11, em que o referido lipossoma compreende uma mistura de DOTAP e DOPE.
  14. 14. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que o lipossoma é ligado a um péptido de, pelo menos, cerca de 10 aminoácidos, em que o referido péptido é composto por cerca de 5-100% de histidina e 0-95% de resíduos de não histidina.
  15. 15. Método da reivindicação 14, em que, pelo menos, 10% dos referidos resíduos de não histidina do referido péptido são resíduos de lisina.
  16. 16. Método da reivindicação 15, em que o referido péptido tem a estrutura 5'-K[K(Η)-K-K-K]5-K(H)-K-K-C-3'.
  17. 17. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 16, em que o referido agente terapêutico compreende um gene, ADN plasmídico, oligonucleótido, oligodesoxinucleótido, oligonucleótido anti-sentido ou ARNsi. 3
  18. 18. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 16, em que o referido agente de diagnóstico compreende material electronicamente denso, agentes de imagiologia de ressonância magnética ou radiofármacos.
  19. 19. Preparação liofilizada, compreendendo um complexo de um ligando e um lipossoma catiónico encapsulando um agente terapêutico ou gene repórter ou agente de diagnóstico que é estável a uma temperatura na gama de cerca de -80 °C a 8 °C durante, pelo menos, cerca de seis meses retendo, simultaneamente, pelo menos, cerca de 80% de actividade, a referida preparação compreendendo o referido complexo e cerca de 1% a cerca de 80% de sacarose, de modo a aumentar a estabilidade do referido complexo.
  20. 20. Preparação liofilizada da reivindicação 19 que compreende cerca de 1% a cerca de 50% ou cerca de 1% a cerca de 20% ou cerca de 5% a cerca de 10% ou cerca de 10% de sacarose.
  21. 21. Preparação liofilizada da reivindicação 19 que, após reconstituição, retém, pelo menos, cerca de 80% ou cerca de 85% ou cerca de 90% ou cerca de 95% da sua actividade de pré-liofilização.
  22. 22. Preparação liofilizada de qualquer uma das reivindicações 19 a 21, em que o referido ligando, referido agente terapêutico, referido agente de diagnóstico e referido lipossoma, são como definidos em qualquer uma das reivindicações 5 a 18. Lisboa, 28 de Outubro de 2010 4
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