JP5478886B2 - 癌の早期mri検出を改善するための腫瘍標的化ナノ送達系 - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、薬剤送達、癌処置および診断および医薬の分野である。本発明は、癌性腫瘍を含む疾患の処置および造影のために、分子の全身送達するための抗体または抗体フラグメント標的化イムノリポソームの製造方法を提供する。本発明はまたイムノリポソームおよび組成物、ならびに種々の組織の造影法も提供する。本リポソーム複合体は、例えば、磁気共鳴造影に使用するための、造影剤の封入に有用である。送達系の特異性は、抗体または抗体フラグメントの標的化に由来する。
初期段階で、原発性および転移性疾患の両方である癌を検出する能力は、該疾患の疼痛および病苦の終息である目標に向けた主要な段階である。遺伝子治療のための腫瘍標的化送達系の開発は、現在達成可能であるよりも、より効率的な造影剤の送達の可能性を広げている。磁気共鳴造影(MRI)は、臓器の3次元解剖学的画像を獲得できる。これらと常磁性画像の組合せは、腫瘍の正確な局在化ならびに腫瘍増殖および血管形成の長手方向および定量的モニタリングをもたらす。(Gillies, R.J., et al., Neoplasia 2:139-451(2000); Degani, H., et al., Thrombosis & Haemostasis 89:25-33(2003))。
一つの態様において、本発明は、抗体または抗体フラグメント標的化カチオン性イムノリポソーム複合体の製造方法であって、抗体または抗体フラグメントを製造し、該抗体または抗体フラグメントとカチオン性リポソームを混合して、カチオン性イムノリポソームを形成させ(ここで、該抗体または抗体フラグメントは、該カチオン性リポソームに化学的に結合していない)、そして該カチオン性イムノリポソームと造影剤を混合して、該抗体または抗体フラグメント標的化カチオン性イムノリポソーム複合体を形成することを含む、方法を提供する。本発明の実施に際して使用する抗体フラグメントの例は、一本鎖Fvフラグメント、例えば抗トランスフェリン受容体一本鎖Fv(TfRscFv)および抗HER−2抗体または抗体フラグメントを含む。さらなる態様において、本方法は、さらに、カチオン性イムノリポソームとK[K(H)KKK]5−K(H)KKC(HoKC)(配列番号1)ペプチドを含むペプチドを混合することを含む。
図1Aおよび1Bは、TfRscFv−リポソーム−DNAナノ複合体によるCaPan−1正所性転移モデルの腫瘍特異的ターゲティングを示す。1Aにおいて矢印で示す肝臓中の同じ腫瘍小結節は、1Bにおいて強いβ−ガラクトシダーゼ発現を示す。1A=肉眼的剖検;1B=β−ガラクトシダーゼについて染色後の組織。
本発明は、造影剤、例えば磁気共鳴造影(MRI)剤、例えばガドリニウム、ガドペンタテートジメグルミン(Magnevist(登録商標))および、イオパミドール、酸化鉄;CTのためのバリウム、ヨウ素および食塩水造影剤;およびPETのための18F−2−デオキシ−2−フルオロ−D−グルコース(FDG)および、組織、例えば腫瘍を標的化するための他の造影剤の全身送達のためのナノ複合体を提供することにより、早期検出および腫瘍と良性組織の鑑別診断のための、増進した感受性および腫瘍細胞特異性に対する重要な要請を満たす。走査型電子顕微鏡(SEM)および走査型プローブ顕微鏡(SPM)(Wolfert, M.A., et al., Human Gene Therapy 7:2123-2133 (1996); Dunlap, D.D., et al., Nucleic Acids Research 25:3095-3101 (1997); Kawaura, C., et al., FEBS Letters 421:69-72 (1998); Choi, Y.H., et al., Human Gene Therapy 10:2657-2665 (1999); Diebel, C.E., et al., Nature 406:299-302 (2000); Rasa, M., et al., J. Coll. Interface Sci 250:303-315 (2002))は、こららの造影剤運搬ナノ複合体の物理的構造およびサイズを試験するために使用されている。大きな磁気モーメントを有する高原子番号元素であるガドリニウムの場合、これらの特性は、SEMおよびSPMの両方においてコントラストを増強するための種々の方法に活用されている。ここに示される発見は、本発明のリポソームナノ複合体が、実際にMagnevist(登録商標)のような造影剤を封入し、そしてこれらの複合体の静脈内投与が増強された腫瘍造影をもたらすことを証明する。本発明は、肺における胸膜転移を含む非常に小さな転移の検出という予期されない、そして驚くべき結果、ならびに良性および癌性組織を鑑別する能力を提供する。
ある態様において、本発明は、1種以上の造影剤がリポソームの内部に封入されている、二層の炭化水素鎖領域内に含まれる、内および/または外単層と複合体化/結合している(例えば、静的相互作用または化学的/共有結合性相互作用を介して)、またはこれらの任意のまたは全ての可能性の組合せの、カチオン性リポソーム複合体を提供する。適当には、本造影剤をリポソーム内部に封入するおよび/または内および/または該単層と結合させる。
Magnevist(登録商標)含有イムノリポソーム複合体
材料および方法
細胞株
ヒトリンパ芽球性白血病細胞株K562を、Lombardi Comprehensive Cancer Center Tissue Culture core facilityから得た。これらの懸濁液細胞を、10%熱不活性化FBS+2mM L−グルタミン、ならびにペニシリン、ストレプトマイシン(streptomycion)およびネオマイシンのそれぞれ50μg/mlを補ったRPMI1640に維持した。ヒト膵臓癌細胞株CaPan−1(ATCC Manassas, VAから得た)は、膵臓の転移腺肉腫由来であった。それを20%非熱不活性化FBS、2mM L−グルタミンならびにペニシリン、ストレプトマイシンおよびネオマイシンのそれぞれ50μg/mLを補った、4mM L−グルタミンおよび重炭酸ナトリウム含有Iscov's Modified Dulbecco's Mediumに維持した。ヒト前立腺癌細胞株DU145(ATCC, Manassas, VA)は、元々、前立腺の広範な転移癌腫を有する患者の脳における病巣から元々由来した。それを、上記のように10%熱不活性化FBS+L−グルタミンおよび抗体で補ったアール塩(EMEM)含有最小必須培地に維持した。
カチオン性リポソーム(DOTAP:DOPE)を、先に記載のエタノール注入法により製造した(その各々の開示を引用により本明細書に包含させる米国公開特許出願2003/0044407;Xu L, et al., Molecular Cancer Therapeutics 1:337-346 (2002)参照)。プラスミドDNAを送達するとき、完全複合体を、以前に記載のものと同じ方法で形成した(米国公開特許出願2003/0044407参照)。インビトロ使用のために造影剤を封入するために、TfRscFvをリポソームと、特異的比率で混合し、室温で10分インキュベートした。Magnevist(登録商標)をこの溶液に添加し、混合し、再び、室温で10分インキュベートした。2−8℃で貯蔵したとき、本複合体はMalvern Zetasizer 3000Hを使用したサイズ測定により決定して、少なくとも8日間安定である。この時間枠中の測定値のキュムラント(Z平均)平均は112.3±4.67(S.E.)であり、一方多分散性(反復スキャン中の値の再現性を示す)は0.445±0.03である。ナノ複合体の許容されるサイズ範囲は約20から1000nm、適当には約50から700nmおよびより適当には約100から500nmである。インビトロトランスフェクションのために、2mlの無血清培地をトランスフェクション前に本複合体に添加した。インビボ使用のために、本複合体は、上記方法を使用して、1mg造影剤対0.33−1.17μg TfRscFv対10−35μgリポソーム(適当には1mg造影剤対0.5から1.0μg TfRScFv対14−28μgリポソーム、最も適当には1mg造影剤対0.71μg TfRscFv対21μgリポソーム)の比率で形成した。インビボ使用のために製造するとき、デキストロースを5%の最終濃度で添加した。
懸濁液細胞K562をトランスフェクトするために、血清以外の全ての添加物を含む総容量4.0mlの培地(無血清培地培地)中の15×106細胞を、100mm2組織培養皿に置いた。種々の量のMagnevist(登録商標)を含む上記からの2mlのトランスフェクション溶液を細胞懸濁液に添加した。プレートを37℃で、穏やかに振盪しながら結果の小で示す時間(90分まで)インキュベートし、その後細胞を4℃で0.5ml マイクロ遠心管中、穏やかにペレット化し(600×gで7分)、10mlの無血清培地培地で3回洗浄して全ての過剰なトランスフェクション溶液を除去し、造影するまで湿った氷上に置いた。
原発および転移腫瘍へのTfRscFv−Lipナノ複合体の腫瘍選択的ターゲティングを評価するために、ヒト膵臓癌細胞株CaPan−1を使用した正所性転移モデルを使用した。CaPan−1の皮下異種移植腫瘍を、MatrigelTM コラーゲン基準膜マトリックス(BD Biosciences)に懸濁した1×107 CaPan−1細胞の注射により、雌無胸腺ヌードマウスに誘発させた。約8週間後、腫瘍を回収し、腫瘍の単一細胞懸濁液を調製した。同様にMatrigelTMに懸濁させた1.2−1.5×107細胞も、雌無胸腺ヌードマウスの外科的に暴露させた膵臓に注入した。手術5週間後、LacZ遺伝子担持複合体を、3回、24時間にわたりi.v.注射した(40μgDNA/注射)。60時間後動物を殺し、先に記載した方法を使用してβ−ガラクトシダーゼ発現について染色された転移および臓器の存在について試験した(Xu, L., et al., Human Gene Therapy 10:2941-2952(1999))。
インビトロMRI造影のために、マイクロ遠心管中の細胞ペレットをマグネットの中央に置いた。MR造影をHoward Universityで、4.7Thorizontal bore NMR machine(Varian Inc, Palo Alto, CA)を使用して行った。造影プロトコールは、マルチスライスT1強調スピンエコー造影シークエンスおよび飽和回復シークエンスから成る。T1強調造影技術のために、繰り返し時間(TR)は1000msであり、エコー時間(TE)は13msであった。Tl強調スピンエコー造影技術は、陽画像増強を確認するために適用した。可変エコー時間での飽和回復MRシークエンスをT1測定のために使用した。画像のスライス厚は、0.5mmであった。用いたRFコイルは30mm 単一ループコイルであった。RFコイルは、RFトランスミッターおよびレシーバーとして働いた。RFパルスは、選択的5ms sincパルスであった。相コード化工程の数は256であった。視野は15mm×15mmであった。試験において選択した画像領域は、RF均質性のためにRFコイルの中心に位置した。MR画像を、マイクロ遠心管の横断面方向で取った。細胞ペレットの高さは12mmであった。マルチスライス画像の範囲は全ペレットをカバーした。空気−ペレット教会からの感受性効果のために、画像歪みにより影響を受けなかった中心スライス画像を、試験に使用した。画像強度を、Varian Image Browserソフトウエアを使用して測定した。シグナルを、各マイクロ遠心管からの画像の2/3をカバーするのに十分に大きい目的領域から取る。これらの試験管からのペレットの相対的画像強度を、コントラスト促進評価およびT1測定に適用した。
リポソーム封入Magnevist(登録商標)造影剤およびリポソーム封入複合体をコーティングする腫瘍ターゲティング一本鎖トランスフェリン受容体タンパク質から成る完全ナノ複合体、TfRscFv−Lip−Magのサンプル溶液をGUMCで調製し、NISTに送り、暗所で冷蔵保存した。個々の造影操作毎に、脱イオン水で、容量比1:3の新たな希釈液を調製し、5μL液滴を、30−60nm formvarおよび15−20nm 炭素から成る標準200メッシュTEMグリッド上にマイクロピペットで加えた。本液滴を、グリッド中で5分空気乾燥させ、その後顕微鏡のバキュームチャンバーに収納した。造影を、Hitachi S-4800電場放出顕微鏡を使用して、NISTで行った。SEMのNDA造影への適用の目的は、上部および下部二次電子検出器[SE(U)とSE(L)] −− その通常のモードでSEMを使用する −− を、装置を低電圧STEMに変更しながらの伝達電子(TE)の検出器の追加と、比較することである。
リポソーム封入Magnevist(登録商標)造影剤、および完全ナノ複合体のサンプル溶液をGUMCで調製し、NISTに送り、暗所および冷蔵保存した。各造影期間のために、脱イオン水で、容量で1:3の新たに希釈を調製し、5μL液滴を、天然オキシドまたはポリ−Lリシンコーティングと共に使用する超音波(untrasonically)洗浄したシリコン支持体にマイクロピペット輸送した。SPM造影を、Veeco MultiMode顕微鏡をNanoscope IVコントローラーと共に使用して得た。Zコントロール(〜320−360kHzおよびk 〜 20−60N/mのためのVeeco RTESPカンチレバー)を用いたタッピングモードによる形態学、相造影、および磁気被覆チップ(Veeco MESP 68kHz)を使用した磁気力顕微鏡を、ライフ・モードで行った。溶液が単離されたナノ粒子および塊を暴露するために蒸発するに連れた脱濡れ(dewetting)および表面エネルギー“相分離”の動的造影を、粒子安定性に対する溶媒乾燥の結果、およびSPM系で利用可能な種々のSPMコントラスト機構に対する影響の理解のために使用した。
レポーター遺伝子を担持するリガンド−リポソームナノ複合体による腫瘍特異的ターゲティング
TfRscFv−LipAナノ複合体の、原発腫瘍および転移正所性転移モデルへの選択的ターゲティングを評価するために、ヒトPanCa細胞株CaPan−1を使用して、臨床的症状のより近い近接を用いた。CaPan−1異種移植腫瘍切片のヌードマウスへの外科的正所性移植は、56日以内に、肝臓および脾臓に転移を生じることが示されている(Alisauskus,R., et al., Cancer Research 55:5743s-5748s(1995))。CaPan−1の正所性腫瘍を、「方法」に記載の通り雌無胸腺ヌードマウスに誘発した。約5週間後、動物を殺し、膵臓および他の臓器における腫瘍を調べるために剖検した。図1Aに示す通り、広範な腫瘍増殖が膵臓中で明白である。1Aにおいて矢印で示した肝臓における同じ腫瘍小結節は、1Bにおいて強いβ−ガラクトシダーゼ発現を示す。1A=肉眼的剖検;1B=β−ガラクトシダーゼについて染色後の組織。転移は、5匹中4匹のマウスで、脾臓、肝臓、肺、副腎および横隔膜内でさえ含む、種々の臓器に存在した。この実験を繰り返し、同様の結果であった。
Magnevist(登録商標)が臨床において最も使用されている造影剤の一つであるために、これらの試験での使用のために選択した。これらの最初の実験において、本複合体がMagnevist(登録商標)を伴って製造できるか、もしそうであるならばMRIシグナルを増強するかを実験した。トリプシン処理が膜損傷および細胞からの造影剤の滲出をもたらすため、接着細胞をこれらの試験には使用しなかった。その代わり、懸濁液培養として増殖させたヒトリンパ芽球性白血病細胞株、K562を使用した。さらに、細胞の穏やかなペレット化および洗浄が、造影前に全ての過剰なMagnevist(登録商標)または複合体を除去し、細胞関連シグナルのみの検出を可能とした。
TfRscFv−Lip−Magnevist(登録商標)ナノ複合体のトランスフェクションのための最適時間を試験した。Magnevist(登録商標)の示される臨床用量は0.1mMole/kgである。これらの最初の試験において、250μlのトランスフェクション溶液あたり、複合体中、0.3mMole/kgの用量を使用した(ヒトに対してマウスの少ない体重および血液量に関して補正)。K562細胞を、20から90分の範囲の時間トランスフェクトした。20分は、画像強度に基づいて、非常に低いトランスフェクション活性を示した。しかしながら、図2Aに示される通り、60分までに、複合体でトランスフェクトされた細胞は、未処置細胞と比較して、強度の大きな増大を示した。未処置細胞の強度(202±48)は、空マーカー試験管(194±43)と有意差はなく、細胞それら自体が検出されるシグナルに関与しないことを示す。より重要なことに、トランスフェクトした細胞の60および90分の相対的強度が同一(それぞれ317±46および317±47)であるため、トランスフェクション効率は約60分でプラトーになった。
トランスフェクション時間として60分を使用して、次いで、TfRscFv−Lip−Mag複合体画像増強に対するMagnevist(登録商標)の量の増加の影響を評価した。試験した用量は0.05、0.3および0.9mMole/kgであった。マウスのサイズおよび血液量について補正して、250μlのトランスフェクション溶液中の複合体中で使用したMagnevist(登録商標)の量は0.25μl、1.5μlおよび4.5μlであった。図2Bおよび表1に示される通り、複合体中に含まれる造影剤の量の関数として、画像強度は増加し、T1緩和時間は短くなった。
上記実験に基づき、TfRscFv−リポソームがMagnevist(登録商標)と複合体化し、それを画像増強のために細胞に送達できることが示された。複合体化造影剤の該薬剤単独と比較した増強のレベルを評価し、得られたシグナルが、非包含Magnevist(登録商標)の存在によるものではないことを証明するために、K562細胞を遊離Magnevist(登録商標)またはTfRscFv−Lip−Magナノ複合体のいずれかで処理した。同一量の造影剤(0.3μM/kgまたは1.5μl/250μl トランスフェクション容量)およびトランスフェクション時間(60分)を両溶液について使用した。遊離Magnevist(登録商標)は、予測通り未処置細胞と比較して増強されたコントラストを示し、TfRscv−Lip−Mag複合体で処置された細胞は、未処置および遊離Magnevist(登録商標)処置細胞の両方と比較して、画像強度のより大きな増加および短いTi緩和時間を証明した(図2C、表2)。これらの結果は、標的化ナノ複合体の手段による造影剤取り込みの効率の増加を証明するだけでなく、観察されたシグナルが非複合体化Magnevist(登録商標)によるものではないであろうことも示す。
上記試験は、本ナノ複合体が、Magnevist(登録商標)単独よりも効率的にインビトロで腫瘍細胞を造影できることを確立した。しかしながら、臨床使用の可能性を有するために、本複合体は、インビボで同様の効果を示さなければならない。レポーター遺伝子を担持する本複合体の腫瘍特異的ターゲティングを証明するために上記で使用したものと同じヒト膵臓癌正所性マウスモデル(CaPan−1)を、これらの試験に使用した。加えて、第二の腫瘍モデル、皮下前立腺異種移植マウスモデル(DU145)もまた使用した。CaPan−1またはDU145腫瘍を担持するマウスを、「方法」において記載の通り7TBruker NMRで造影した。コイル中に配置されると、基準画像がTI強調Turbo RARE(急速増強を伴う急速獲得)3次元造影シークエンスを使用して得られた。画像アラインメントを容易にするために、基準獲得後、動物をケース中に維持し、その間造影溶液を静脈内注射を介して投与した。シグナル獲得は、注射3分以内に開始した。遊離(臨床において行われている通り)または本複合体に包含されたいずれかでマウスに投与されたMagnevist(登録商標)の量は10μlであった。この量は、ヒトにおいて使用される0.2mM/Kgまたは2倍と同等である。この量は、0.1mM/Kg Magnevist(登録商標)の標準ヒト用量のみでは、マウスにおいて非常に乏しいシグナルをもたらすため選択した。遊離Magnevist(登録商標)およびTfRscFv−Lip−Mag複合体での造影を連続2日間行った。基準スキャンもまたナノ複合体投与前に行い、前日からのMagnevist(登録商標)の全てがウォッシュアウトされていることを確認した。MR技術およびウィンドウは、スキャナーの自動ウィンドウイング特性を補正するように調節されたウィンドウを有する2セットの画像の間で同一であった。
インビトロ試験は複合体化Magnevist(登録商標)がリポソーム内に封入される証明を提供し、精密な顕微鏡技術(SEMおよびSPM)がこれを証明しているが、TfRscFv−Lip−Mag複合体をさらに特徴付け(例えば複合体サイズ)する。
高解像度造影は狭い焦点深度を意味し、故に、相対的に薄くかつ平らなサンプルを必要とする。どの程度薄いかは技術に依存するが、表面および支持体効果 −−表面エネルギーおよび対称性低下 − がしばしばバイオマテリアルに典型的な構造力を支配する。これは、その薄い性質を考慮して、リポソームの場合特に当てはまる。(Foo, J.J., et al., Annals of Biomedical Engineering 31:1279-1286(2003))。故に、単離されたリポソームを調製するためのおよび次元的および機構的安定性特徴付けするための信頼できる方法が必須である。この特徴付けの目的は、造影剤が実際にナノ粒子に取りこまれており、リポソームと単に外的結合しているものではないことを確立するための、ナノ粒子の機械的剛性および磁気特性の直接検出を実施することである。
図5A−Cは、単離されたリポソーム封入Magnevist(Lip+Mag)ナノ粒子のSPMおよびSEM画像を示す。単一Lip+Mag粒子のサイズ分布は、光学測定に従って100−200nm直径およびスケールの範囲内であり、それは、ペイロード封入リポソームが、球形状態ではリポソーム単独より約50%大きいことを示す。
「方法」において記載の通り、完全TfRscFv−Lip−Magナノ複合体を調製し、SEMおよびSPMで造影した。図6Aおよび6Bに示す結果は、、溶媒フィルムが相分離を起こすことを示す;しかしながら、単離されたNDSの例は、乾燥フィルム上で容易に観察できる。SEMビームが明らかにフィルム上への何らかの傷の原因となるが、粒子は、ビーム傷が顕著になる前に数回繰り返し走査できることは注意すべきである。完全複合体の見かけは(Lip+Mag)のみのものと異なる。形態は規則性が低く、そして乾燥後のリポソーム表面の相当なテクスチャリングは、タンパク質変性と一致する。また、SEM TE画像は、(Lip+Mag)粒子で見られるリポソームの外環および中心の間の良く定義された境界が、あまり明瞭ではなく、形態がはるかに可変性であることを示す。これは、リポソーム内のタンパク質の存在が、フィルム乾燥中のリポソームを通る浸透性流出を変えるとの観察と一致する。
ここに記載の結果は、我々が、一般に使用されているMR造影剤Magnevist(登録商標)を封入し、インビトロおよび正所性動物モデルの両方で腫瘍細胞に送達でき、そしてそうすることにより、非複合体化Magnevist(登録商標)で見られるよりもより明確で強い画像を生じることを証明する。
種々の細胞株における造影の比較
図8A−8Hは、リガンド−HK−リポソーム−Magナノ複合体を使用した、癌の2種のモデルにおける改善されたMR造影を示す。本実施例において使用するためのナノ複合体は、実施例1に明示のものと同じ比率および方法を使用して製造した。ヒト乳癌MDA−MB−435(図8E−8H)またはヒト前立腺癌細胞株(DU145)(図8A−8D)細胞を雌無胸腺ヌードマウスの背下部に皮下注射した。遊離Magnevist(登録商標)、または同量のMagnevist(登録商標)を含むTfRscFv−リポソームナノ複合体(scLip−Mag)もしくはHoKcペプチド含有TfRscFv−HK−リポソームナノ複合体(scLip−HK−Mag)を、連続3日間、各マウスにi.v.注射(尾静脈を介して)した。Magnevist(登録商標)のこの量はヒト患者に投与する量の2倍に等しい。全例において投与した溶液の総容量は400μlであった。基準スキャンを両方のナノ複合体の投与直前に実施し、前日からのMagnevist(登録商標)の全てがウォッシュアウトされていることを確認した。MR技術およびウィンドウは、スキャナーの自動ウィンドウイング特性を補正するように調節されたウィンドウを有する4セットの画像の間で同一であった。パネルは、皮下腫瘍を有するマウスにおけるMRIシグナルの差異を示し、ここで、scLip−Mag注射後、そしてなおさらにscLip−HK−Mag注射後に前立腺腫瘍(DU145)(図8A−8D)および乳房腫瘍(435)(図8E−8H)の両方において増加した鮮明度およびコントラストが明白である。
遊離(非複合体化)またはTfRScFv−Lip−Magnevistの全身注射の皮下PANC−1腫瘍の動的MRIスキャンの比較
以下の実験を実施し、全身送達後の腫瘍における遊離(非複合体化)およびTfRscFv−Lip−Magの取り込みおよびウォッシュアウトの速度およびレベルを比較した。PANC−1の皮下異種移植腫瘍を、MatrigelTMコラーゲン基材膜マトリックス(BD Biosciences)に懸濁させた1から2×107 PANC−1細胞の注射により雌無胸腺ヌードマウスに誘発させた。約2.5−3週間後、動物を造影のために使用した。カチオン性リポソーム(DOTAP:DOPE)を、先に記載の通りエタノール注入法により調製した(その各々の開示を引用により本明細書に包含させる米国公開特許出願2003/0044407;Xu L, et al., Molecular Cancer Therapeutics 1:337-346 (2002)を参照のこと)。これらの試験で使用したターゲティング部分は抗トランスフェリン受容体一本鎖抗体フラグメント(TfRscFv)である。
TfRscFv−Lip−HoKC−MagnevistによるCaPan−1肝臓転移の検出
以下の実験を行い、本発明のTfRscFv−Lip−HoKC−Mag複合体が転移腫瘍を検出し、造影を増強する能力を評価する。例として、膵臓癌からの転移を試験したが、しかしながら、全てのタイプの癌からの転移の造影が、本発明の複合体および方法を使用して達成され得る(例えば前立腺、黒色腫、腎臓、乳房、胃、肝臓、卵巣、膀胱、頭頚部、脳、骨および全ての他のタイプの固形腫瘍)。CaPan−1の皮下異種移植腫瘍を、MatrigelTMコラーゲン基材膜マトリックス(BD Biosciences)に懸濁した0.5から1×107 CaPan−1細胞の注射により雌無胸腺ヌードマウスに誘発した。約8週間後 the腫瘍を回収し、腫瘍の単一細胞懸濁液を調製した。MatrigelTMにまた懸濁させた1.2−1.5×107細胞を、先に記載の通り雌無胸腺ヌードマウスの外科的に暴露した膵臓に注射した(Alisauskus, R., Wong, G.Y., and Gold, D.V., Initial studies of monoclonal antibody PAM4 targeting to xenografted orthotopic pancreatic cancer, Cancer Research 55, 5743s-5748s (1995))。
TfRscFv−Lip−Magnevistによる肺転移の増強された検出
以下の実験を行って、造影剤を担持する本発明の複合体を静脈内投与(または何らかの他の適当な経路、例えば、IT、ID、IM、IPであるがこれに限定されない)したとき、本複合体を使用せずに造影剤を投与したときと比べて転移の検出を増強できることを証明した。肺腫瘍を雌Balb/Cマウスに、1から10×104 RenCa細胞の静脈内注射により誘発した。この方法は、ほとんど排他的に動物の肺に存在し、故に、原発または転移のいずれかとして肺腫瘍をもたらす何らかの他のタイプの癌のモデル系として働く転移をもたらす。約2−4週間後動物を造影のために使用した。
TfRscFv−Lip−Magnevistによる小肺転移の増強された転移
以下の実験行って、造影剤を担持する本発明の複合体を静脈内投与(または何らかの他の適当な経路、例えば、IT、ID、IM、IPであるがこれに限定されない)したとき、本複合体を使用せずに造影剤を投与したときには検出できない、非常に小さな転移を検出できることを証明した。肺腫瘍を1から10×104 RenCa細胞の静脈内注射により、雌Balb/Cマウスに誘発した。この方法は、ほとんど排他的に動物の肺に存在し、故に、原発または転移のいずれかとして肺腫瘍をもたらす何らかの他のタイプの癌のモデル系として働く転移をもたらす。約7−9日後動物を造影のために使用した。
TfRscFv−Lip−Magnevistによる胸膜下肺転移の検出
図13および14について上記実施例6において、上記した通りの腫瘍モデル系および造影パラメータを用いて、図18A−18Fに示す通り、肺の胸膜下における転移を検出することも可能である。これは、現在の、実際には細胞に入らない非複合体化薬剤でのMRI造影がこの位置の転移を検出できないため、予期されず、そして驚きである。これは、肺および他のタイプの癌の早期検出および処置において顕著な利点を提供する。
TfRscFv−Lip−Magnevistによる黒色腫肺転移の増強された検出
胸膜転移の検出/処置について、臨床コントロールは非常に達成が困難であり、利益の測定も困難である。本実施例に示す結果は、本発明の複合体が胸膜転移に到達し、トランスフェクトでき、故にそれらの治療に使用できることも示す。さらに、本発明の複合体は、このまたは何らかの他の治療の有効性を測定するために用いる造影ツールであろう。
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Claims (34)
- 抗トランスフェリン受容体抗体または抗トランスフェリン受容体一本鎖Fvフラグメント(TfRscFv)標的化カチオン性イムノリポソーム複合体の製造方法であって:
(a)抗トランスフェリン受容体抗体またはTfRscFvを製造し;
(b)該抗トランスフェリン受容体抗体またはTfRscFvとカチオン性リポソームを混合して、カチオン性イムノリポソームを形成させ(ここで、該抗トランスフェリン受容体抗体またはTfRscFvは、該カチオン性リポソームに化学的に結合していない);そして
(c)該カチオン性イムノリポソームとガドペンタテートジメグルミンを1:10から1:35(mgガドペンタテートジメグルミン:μgリポソーム)の範囲の比率で混合して、該抗トランスフェリン受容体抗体またはTfRscFv標的化カチオン性イムノリポソーム複合体を形成する
ことを含む、方法。 - 該抗トランスフェリン受容体抗体またはTfRscFvが、該カチオン性リポソームとの混合前に、カルボキシ末端にシステイン部分を含む、請求項1に記載の方法。
- さらに該カチオン性イムノリポソームと、K[K(H)KKK]5−K(H)KKC(HoKC)(配列番号1)ペプチドを含むペプチドの混合を含む、請求項1に記載の方法。
- 該カチオン性リポソームが、1種以上のカチオン性脂質および1種以上の中性またはヘルパー脂質の混合物を含む、請求項1に記載の方法。
- 該抗トランスフェリン受容体抗体またはTfRscFvを、該カチオン性リポソームと、1:20から1:40(w:w)の範囲の比率で混合する、請求項1に記載の方法。
- 該カチオン性リポソームが、ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび/またはコレステロールの混合物;またはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび/またはコレステロールの混合物を含む、請求項1に記載の方法。
- 該カチオン性イムノリポソームを、該ガドペンタテートジメグルミンと、1:14から1:28(mgガドペンタテートジメグルミン:μgリポソーム)の比率で混合する、請求項1に記載の方法。
- 該カチオン性イムノリポソームを、該ガドペンタテートジメグルミンと、1:21(mgガドペンタテートジメグルミン:μgリポソーム)のモル比で混合する、請求項1に記載の方法。
- 請求項1の方法により製造したカチオン性イムノリポソーム複合体。
- カチオン性リポソーム、抗トランスフェリン受容体抗体または抗トランスフェリン受容体一本鎖Fvフラグメント(TfRscFv)、およびガドペンタテートジメグルミンを含む抗トランスフェリン受容体抗体またはTfRscFv標的化カチオン性イムノリポソーム複合体(ここで、該抗トランスフェリン受容体抗体またはTfRscFvが該カチオン性リポソームに化学的に結合していない)であって、該ガドペンタテートジメグルミンおよび該カチオン性イムノリポソームが1:10から1:35(mgガドペンタテートジメグルミン:μgリポソーム)の範囲の比率で存在する、カチオン性イムノリポソーム複合体。
- 該ガドペンタテートジメグルミンが該カチオン性リポソーム内に封入されている、請求項10に記載のカチオン性イムノリポソーム複合体。
- 該ガドペンタテートジメグルミンが該カチオン性リポソームの内または外単層と結合している、請求項10に記載のカチオン性イムノリポソーム複合体。
- 該カチオン性リポソームが1種以上のカチオン性脂質および1種以上の中性またはヘルパー脂質の混合物を含む、請求項10に記載のカチオン性イムノリポソーム複合体。
- 該抗トランスフェリン受容体抗体またはTfRscFvおよび該カチオン性リポソームが1:20から1:40(w:w)の範囲の比率で存在する、請求項10に記載のカチオン性イムノリポソーム複合体。
- 該カチオン性リポソームがジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび/またはコレステロールの混合物;またはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび/またはコレステロールの混合物を含む、請求項10に記載のカチオン性イムノリポソーム複合体。
- 該ガドペンタテートジメグルミンおよび該カチオン性イムノリポソームが1:14から1:28(mgガドペンタテートジメグルミン:μgリポソーム)のモル比で存在する、請求項10に記載のカチオン性イムノリポソーム複合体。
- 該ガドペンタテートジメグルミンおよび該カチオン性イムノリポソームが1:21(mgガドペンタテートジメグルミン:μgリポソーム)のモル比で存在する、請求項10に記載のカチオン性イムノリポソーム複合体。
- さらに、該複合体と結合したK[K(H)KKK]5−K(H)KKC(HoKC)(配列番号1)ペプチドを含む、請求項10に記載のカチオン性イムノリポソーム複合体。
- 請求項10から18のいずれかに記載のカチオン性イムノリポソーム複合体を含む患者の臓器または組織を造影するための薬物であって、該カチオン性イムノリポソーム複合体が、該造影実施前に患者に投与される、薬物。
- 該投与が静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、眼内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、鼻腔内投与、脳内(intracereberal)投与または皮下投与を含む、請求項19に記載の薬物。
- 請求項10から18のいずれかに記載のカチオン性イムノリポソーム複合体を含む患者の癌性組織を造影するための薬物であって、該カチオン性イムノリポソーム複合体が、該造影実施前に患者に投与される、薬物。
- 請求項10から18のいずれかに記載のカチオン性イムノリポソーム複合体を含む患者の癌性転移を造影するための薬物であって、該カチオン性イムノリポソーム複合体が、該造影実施前に患者に投与される、薬物。
- 該投与が静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、眼内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、鼻腔内投与、脳内投与または皮下投与を含む、請求項21に記載の薬物。
- 該投与が静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、眼内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、鼻腔内投与、脳内投与または皮下投与を含む、請求項22に記載の薬物。
- 請求項10から18のいずれかに記載のカチオン性イムノリポソーム複合体を含む癌を有する患者の腫瘍組織を造影するための薬物であって、腫瘍組織を造影するために該カチオン性イムノリポソーム複合体が患者に投与され、該投与と同時に、または前もしくは後に腫瘍組織を処置するために抗癌剤が患者に投与される、薬物。
- 該投与が静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、眼内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、鼻腔内投与、脳内投与または皮下投与を含む、請求項25に記載の薬物。
- 該抗癌剤が化学療法剤、遺伝子または小分子である、請求項25に記載の薬物。
- 該化学療法剤がドセタキセル、ミトキサントロンおよびゲムシタビンから成る群から選択される、請求項27に記載の薬物。
- 該抗癌剤が該カチオン性イムノリポソームと結合している、請求項27に記載の薬物。
- 該抗癌剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAである、請求項22に記載の薬物。
- 該アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは該siRNAが該カチオン性イムノリポソームと結合している、請求項30に記載の薬物。
- 該抗癌剤をカチオン性イムノリポソーム複合体の前または後に送達する、請求項25に記載の薬物。
- 該抗癌剤をカチオン性イムノリポソーム複合体の少なくとも12時間前または後に送達する、請求項32に記載の薬物。
- 抗癌剤が投与される代わりに、患者に放射線療法が適用される、請求項25に記載の薬物。
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