KR20230095864A - 약물전달입자의 엔도좀 탈출 효율 분석 방법 - Google Patents

약물전달입자의 엔도좀 탈출 효율 분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 약물전달입자의 엔도좀 탈출효율을 정량적으로 분석하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 자기공명영상 장치를 이용해 내부에 산화철 담지 입자를 섭취한 세포에 전자기파(예컨대 라디오파)를 전사해서 반향되는 자기공명신호(MR signal)를 측정하고, 이로부터 시간 경과에 따른 자기이완율의 변화율을 얻음으로써 약물전달입자의 엔도좀 탈출효율을 정량적으로 분석할 수 있는 방법에 관한 것이다.

Description

약물전달입자의 엔도좀 탈출 효율 분석 방법{Method for analyzing endosomal escape efficiency of drug delivery particles}
본 발명은 약물전달입자의 엔도좀 탈출 효율을 분석하는 방법에 관한 것이다.
지질나노입자(lipid nanoparticle, LNP), 리포좀 등의 약물전달입자는 세포 내 유입시에 엔도좀(endosome)이라는 세포 소기관의 형성을 통해서 세포 내로 유입된다. 약물전달입자 내 물질의 효과적인 전달 및 전달된 물질의 발현을 위해서는 세포 내로 유입되어 엔도좀으로 둘러싸인 입자가 엔도좀을 탈출하여 핵으로 이동하거나 세포질에서 그 기능을 수행할 수 있어야 한다. 이러한 엔도좀 탈출 효율은 입자에 따라 달라, 오늘날 신약 개발 분야에서 목적물질을 담지할 수 있는 입자에 대한 연구가 많이 이뤄지고 있지만, 약물전달입자의 엔도좀 탈출효율을 정량적으로 분석할 수 있는 방법이 없는 실정이다.
자기공명영상법(MRI: Magnetic Resonance Imaging)은 자력에 의해 발생하는 자기장을 이용하여 생체의 임의의 단층상을 얻는 영상법이다. MRI에서는 영상변수를 조절함으로써 다양한 영상을 얻을 수가 있으며, T1 이완시간이 짧은 조직을 밝게 하는 영상법을 T1 강조영상법, T2 이완시간이 짧은 조직을 어둡게 보이도록 하는 영상법을 T2 강조영상법이라고 한다. 또한, 적절한 T1 또는 T2 이완시간을 갖도록 영상변수를 조절함으로써 분자영상과 세포영상에 가장 적합한 T1 또는 T2 강조영상을 얻을 수 있다.
자기공명영상에 사용되는 영상조영제는 T1 조영제와 T2 조영제로 일반적으로 구분되며 이들 영상조영제는 각각 T1, T2 측정시 이완시간을 감소시키는 효과가 있다(M Modo, M Hoehn, JW Bulte, Cellular MR imaging, Mol Imaging, 4, 143 (2005); WJ Rogers, H Meyer, CM Kramer, Technology insight: in vivocell tracking by use of MRI, Nat ClinPrac, 3, 554 (2006); D Kim, KS Hong, J Song, The present status of cell tracking methods in animal models using magnetic resonance imaging technology, Mol Cells, 23, 132 (2007)). 특히, 산화철 계열의 T2 조영제는 T2 이완시간을 줄이는 효과가 매우 크며, T2 이완시간의 감소에 의해 강력한 영상 조영 효과가 나타난다.
한국등록특허 제 10-2262260호
본 발명은 약물전달입자의 엔도좀 탈출 효율을 정량적으로 분석하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 산화철이 내부에 담지된 입자가 섭취된 세포에서 상기 산화철이 상기 입자로부터 상기 세포로 방출됨에 따라 변화하는 자기공명신호를 측정하는 단계; 상기 자기공명신호로부터 시간 경과에 따른 자기이완율 변화 그래프를 얻는 단계; 상기 그래프의 임의의 시간 구간에서 자기이완율의 변화율을 얻는 단계; 및 상기 자기이완율의 변화율을 하기 수학식 1에 대입하여 상기 입자의 엔도좀 탈출률을 얻는 단계를 포함하는 약물전달입자의 엔도좀 탈출 효율 분석방법:
[수학식 1]
엔도좀 탈출률(%) = (입자가 섭취된 세포에서 자기이완율의 변화율 ÷ (엔도좀 탈출 이전의 입자에 담지된 총 산화철의 자기이완율 - 엔도좀 탈출로 입자에서 방출된 총 자유 산화철의 자기이완율)) × 100
2. 위 1에 있어서, 상기 자기이완율은 R 2 자기이완율인, 약물전달입자의 엔도좀 탈출 효율 분석방법.
3. 위 1에 있어서, 상기 세포 내 섭취된 총 산화철 농도를 얻는 단계; 및 상기 세포 내 섭취된 산화철 총 농도를 하기 수학식 2에 대입하여, 상기 엔도좀 탈출 이전의 입자에 담지된 산화철의 총 R 2 자기이완율과 엔도좀 탈출로 입자에서 상기 세포로 방출된 산화철의 총 R 2 자기이완율의 차를 얻는 단계를 더 포함하는, 약물전달입자의 엔도좀 탈출 효율 분석방법:
[수학식 2]
{(입자에 담지된 산화철의 총 자기이완율) - (입자 내에서 세포로 방출된 자유 산화철의 총 자기이완율)}=
세포 내 산화철 농도 × (입자에 담지된 산화철의 단위 농도당 자기이완율 - 자유 산화철의 단위 농도당 자기이완율).
4. 위 1에 있어서, 상기 입자는 지질나노입자, 리포좀, 마이셀, 폴리머 나노입자, 덴드리머나노입자, DNA 나노구조체, 금속나노입자, 탄소나노튜브, 풀러렌 및 바이러스유사입자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 약물전달입자의 엔도좀 탈출 효율 분석방법.
5. 위 1에 있어서, 상기 입자의 크기는 50nm 내지 250nm인, 약물전달입자의 엔도좀 탈출 효율 분석방법.
6. 위 1에 있어서, 상기 산화철 크기는 1nm 내지 20nm인, 약물전달입자의 엔도좀 탈출 효율 분석방법.
본 발명은 약물전달입자의 엔도좀 탈출 효율을 분석하는 방법을 제공한다.
본 발명의 약물전달입자의 엔도좀 탈출효율 분석방법은 세포 내로 섭취된 약물전달입자에서 방출되는 산화철의 양에 따라 달라지는 자기공명영상 신호를 활용함으로써, 약물전달입자의 엔도좀 탈출 효율을 정량적으로 분석할 수 있다.
도 1은 RNA 또는 산화철이 담지된 약물전달입자의 엔도좀 탈출 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 산화철(IONP) 및 산화철이 담지된 지질나노입자(IO@LNP)의 물리화학적 특성을 나타낸다. a는 용매열 합성에 의해 합성된 초소형 및 단분산 IONP(검은 점)를 보여주는 대표적인 투과 전자 현미경(TEM) 이미지이다(스케일 바, 20nm.). b는 IO@LNP(0.2mg IONP/mg 지질)의 대표적인 cryo-TEM 이미지이다(LNP의 검은 점은 IONP를 나타냄, 스케일 바= 100nm). c는 IONP 및 IO@LNP의 유체역학적 크기 분포를 나타낸다. d는 IONP 및 IO@LNP의 제타 전위 분포를 나타낸다. IO@LNP는 양이온 지질로 인해 음으로 하전된 IONP(-17.7 ± 5.09)보다 더 많은 양의 표면 전하(6.11 ± 7.18 mV)를 가진다. e는 IONP(mg) 대 지질(mg)의 비율에 따른 IO@LNP의 MR 팬텀 R 2맵 이미지를 나타낸다. f는 IONP, IO@LNP 및 빈 LNP의 MR 팬텀 R2 맵 이미지를 나타낸다. 이미지는 1/1(IONP의 경우 ml당 0.87mg IONP 및 0mg 총 지질, IO@LNP의 경우 ml당 0.87mg IONP 및 4.33mg 총 지질, 빈 LNP의 경우 0mg IONP 및 4.33mg 총 지질)에서 1/5로 연속 희석하여 얻었다. 식염수 샘플은 0으로 표시되었다. g는 자유 산화철(IONP, 갈색, y = 2.18x + 1.05, R2 = 0.99) 및 지질나노입자에 담지된 산화철(IO@LNP 내 IONP, 빨간색, y = 5.69x + 1.05, R2 = 0.99)의 농도에 따른 R 2 자기이완율 값을 나타낸다. 각 점선 영역은 각 회귀 곡선의 95% 신뢰 구간을 나타낸다. h는 Triton X-100 세제가 IO@LNP에서 처리되었는지 여부에 따른 R 2 자기이완율 값을 나타낸다. 자유 산화철 (IONP, 갈색, y = 1.79x + 1.72, R2 = 0.94), 세제 처리하지 않은 지질나노입자에 담지된 산화철(IO@LNP(w/o detergent), 빨간색, y = 6.01x + 1.33, R2 = 1.00) 및 세제 처리한 지질나노입자에 담지된 산화철(IO@LNP(w/ detergent, 파란색, y = 1.25x + 1.74, R2 = 0.78)의 R 2 자기이완율 값을 나타낸다. 각 점선 영역은 각 회귀 곡선의 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
도 3은 세포에 산화철나노입자가 담지된 지질나노입자를 처리한 후의 시간 변화에 따른 R 2 자기이완율 변화 (인비트로)실험 결과를 나타낸다. a는 IO@LNP가 세포의 LNP 흡수 시간(40분의, 노란색 및 빨간색) 동안 세포와 함께 배양된 후, 다양한 시점(0, 20, 40 및 80분)(녹색) 동안 추가로 배양되었음을 나타낸다. 마지막으로, 수확된 각 세포(1.0 x 107에서 1.9 x 107 총 세포/ml; 세포 생존율: 74%-87%)를 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정함. b는 a에서 얻은 세포 펠릿의 인비트로 MR 팬텀 R 2 맵을 나타낸다. c는 엔도좀 탈출을 촉진하는 클로로퀸 처리군(y = -0.03x + 19.64, R 2 = 0.2147)에서의 R 2 자기이완율 값 변화를 나타낸다.
도 4는 Bio-TEM과 인비트로 MRI 결과와의 상관관계를 나타낸다. a는 과량의 IONP로 처리되거나 아무것도 처리되지 않은(Control) 4T1 세포의 Bio-TEM 이미지(n = 그룹당 20개 이미지)이다. 과량의 IONP로 처리되거나 아무것도 처리되지 않은(대조군) 4T1 세포에서는 검은 점을 포함하는 눈에 보이는 엔도좀이 관찰되지 않았다. b는 IO@LNP가 처리된 4T1 세포의 Bio-TEM 이미지(n = 그룹당 20개 이미지)이다. 엔도좀(적색 화살표)이 40분에 가장 많이 검출되었다(스케일 바, 2μm). c는 Bio-TEM 이미지(그룹당 n = 20개 이미지)당 8um × 8um 영역의 엔도좀 수의 합을 보여주는 Bio-TEM 결과의 반정량 분석 결과이다. 세포 내 IO@LNP는 cavity에 명확한 대비와 약 100-200nm 크기의 검은 점이 3개 이상 있는 경우에만 계산되었다. 그 결과 엔도좀 탈출로 인해 시간이 지날수록 엔도좀의 수가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. d는 Bio-TEM 정량화와 체외 MRI 결과 간의 상관관계 분석(y = 0.23x + 2.97, R 2 = 0.77)결과를 나타낸다. 배양시간이 길어질수록 엔도좀 탈출이 증가하고 R 2 이완율이 동시에 감소하였다.
도 5a 내지 도 5c는 IO@LNP/Sulfo-cy5.5의 토모큐브 이미징 결과를 나타낸다. 도 5a는 5분마다 Tomocube에서 얻은 IO@LNP/Sulfo-cy5.5의 형광 이미지이다(스케일 바, 10μm). 도 5b는 95 백분위수보다 밝은 픽셀(노란색)과 60 백분위수보다 밝은 픽셀(녹색 및 노란색)로 구분된 IO@LNP/Sulfo-cy5.5 형광 이미지이다. 도 5c는 소포의 공칭(nominal) 수와 R 2 값 사이의 선형 관계를 나타낸다. 소포의 공칭 수는 노란색 영역을 녹색 영역으로 나눈 값으로 정의된다. d는 IO@LNP/Sulfo-cy5.5로부터의 세포외 형광 강도의 정량 분석 결과를 나타낸다. 80분 후에 elbow point를 보여 활성 세포외 배출이 80분 후에 발생했음을 나타낸다.
도 6은 마우스에 산화철나노입자가 담지된 지질나노입자를 처리한 후의 시간 변화에 따른 간의 R 2 자기이완율 변화 (인비보)실험 결과를 나타낸다. a는 IO@LNP/DiR을 정맥 주사한 마우스의 생체 내 이미징 시스템(IVIS)을 시각화한 것이다. 마우스는 식염수 처리 대조군(n = 4 Balb/c 생쥐)과 비교하여 IO@LNP의 정맥 주사 후 이미지화 되었다. b는 24시간 후에 검출된 주요 장기(비장, 간, 심장, 신장 및 폐)의 형광을 나타낸다. 간의 형광 신호는 다른 장기에 비해 유의하게 검출되었다.c는 a로부터의 인비보 간 정량 분석 결과를 나타낸다. 관심 영역(ROI)은 간 신호를 측정하기 위해 IVIS 소프트웨어에 지정되었다. 주사 2시간 후에 상당량의 IO@LNP가 간에 도달했다. d는 IO@LNP(0.8mg IONP/4mg 총 지질/ml PBS)를 처리한 후 상이한 시점에서 마우스 간의 생체내 R 2 맵을 나타낸다. 2시간 후 간에서 포화된 LNP의 분포와 대조적으로, R 2 값의 감소를 나타내는 마우스 간 조직 영역이 있었고, 이를 통해 해당영역에서 엔도좀 탈출이 발생했음을 알 수 있었다. e는 IO@LNP를 처리 후 시간 경과에 따른 R 2 자기이완율을 나타낸다. IO@LNPs 처리 마우스에서 선형의 R 2 자기이완율 감소를 보였다. IO@LNP에서는 엔도좀 탈출로 인한 일정한 속도의 IONP 배출이 일어났음을 알 수 있다.
도 7은 산화철의 FT-IR 및 VSM 결과를 나타낸다. a는 IONP의 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR) 스펙트럼 결과이고, b는 300K에서 진동 샘플 자력계에 의해 결정된 IONP의 정규화된 전계 종속 자화 곡선(M-H 곡선)이다. IONP의 정규화된 포화 모멘트는 약 3 emu/g이다.
도 8은 DLS로 측정한 시간에 따른 다양한 용매 내 IONP 및 IO@LNP의 직경 및 다분산지수(Polydispersity index, PDI)를 나타낸다. a는 IONP의 안정성 테스트 결과, b는 IO@LNP의 안정성 테스트 결과, c는 IONP 및 IO@LNP에 대한 전기영동 결과이다.
도 9는 빈 LNP(Empty LNP)의 물리화학적 특성을 나타낸다. a는 IONP를 포함하지 않은 빈 LNP의 대표적인 투과 전자 현미경(TEM) 이미지(스케일 바, 100nm)이고, b는 직경 129.7 ± 31.18 nm(평균 ± SD) 및 PDI 0.040을 나타내는 빈 LNP의 유체역학적 크기 분포이고, c는 IO@LNP(6.11±7.18mV)보다 더 음으로 하전된 빈 LNP(11.9±6.01mV)의 제타 전위 분포이다.
도 10은 형광염료(DiD, Sulfo-Cy5.5 아민)로 표지된 IO@LNP의 물리화학적 특성을 나타낸다. a는 형광 친유성 염료 중 하나인 DiD가 표면에 표지된 IO@LNP의 직경(105.2 ± 41.21 nm)과 PDI(0.155)를 나타낸다. b는 형광 친수성 염료 중 하나인 Sulfo-Cy5.5 아민이 로딩된 IO@LNP의 직경(84.34 ± 51.08 nm)과 PDI(0.275)를 나타낸다.
도 11은 빈 LNP의 MR 팬텀 결과를 나타낸다. a는 빈 LNP의 R 2 자기이완율 계수 값(R 2 relaxation rate coefficient value, y = 0.10x + 0.75, R 2 = 0.42)을 나타내고, b는 빈 LNP의 R 1 자기이완율 계수 값(R 1 relaxation rate coefficient value, y = -0.03x + 0.38, R2 = 0.67)을 나타낸다. 각 점선 영역은 각 회귀 곡선의 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
도 12는 4T1 세포에 IO@LNP 처리 후 시간 변화에 따른 세포의 IO@LNP 섭취 정도를 나타낸다. a는 IO@LNP를 4T1 세포에 처리 후 엔도좀 탈출의 시작 시점을 결정하기 위한 실험 일정이다. 세포를 IO@LNP/DiD(노란색)와 함께 배양하고 다른 배양 시간(분홍색) 후에 세척한 다음 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 이미지화 했다. b는 IO@LNP의 세포내 섭취를 보여주는 공초점 형광 이미지이다. 핵은 Hoechst 33342(파란색)로 염색되었고 DiD(빨간색)는 LNP의 세포내 분포를 보여주었다. 공초점 이미지는 시간에 따라 세포질 내부의 IO@LNPs의 점진적 내재화를 보여주었다. LNP는 20분에 세포막 표면에 위치하였다. 배양 시작 후 40분부터 세포질에 LNP가 높은 운동성으로 분포되어 있어 엔도좀 탈출이 진행되고 있음을 시사한다(스케일 바, 50um).
도 13은 MR 팬텀 R 1 자기이완율 값과 인비트로 MRI 결과를 나타낸다. a는 IONP, IO@LNP 및 빈 LNP의 MR 팬텀 R 1 이미지를 나타낸다. 이미지는 1/1(IONP의 경우 ml당 0.87mg IONP 및 0mg 총 지질, IO@LNP의 경우 ml당 0.87mg IONP 및 4.33mg 총 지질, 빈 LNP의 경우 ml당 0mg IONP 및 4.33mg 총 지질)에서 1/5로 연속 희석하여 얻었다. 식염수 샘플은 0으로 표시되었다. b, 자유 IONP(갈색, y = 0.27532x + 0.37587, R2 = 0.9802) 및 IO@LNP의 IONP(빨간색, y = 0.09477x + 0.37587, R2 = 0.9694)의 R 1 자기이완율 계수 값(R 1 relaxation rate coefficient value)을 나타낸다. c는 IONP와 비교하여 Triton X-100 세제가 IO@LNP로 처리되었는지 여부에 따른 MR 팬텀의 결과를 나타낸다. 자유 IONP(갈색, y = 1.0901x + 0.36387, R2 = 0.6371), 세제를 처리하지 않은 IO@LNP의 IONP(빨간색, y = 1.0417x + 0.37296, R2 = 0.6297) 및 세제를 처리한 IO@LNP의 IONP (파란색, y = 0.2012x + 0.36387, R2 = 0.5204)의 R 1 자기이완율 계수 값을 나타낸다. c에는 고정된 y-절편을 갖는 선형 회귀 곡선이 표시되었다. d는 인비트로 MRI 실험에서 IO@LNP과 IO@LNP + 클로로퀸의 R 1 자기이완율 값을 나타낸다. e는 총 배양 시간에 따른 IO@LNP로 처리된 세포 펠릿(n = 3)의 R 1 자기이완율을 나타낸다. f는 총 배양 시간에 따른 클로로퀸 및 IO@LNP로 처리된 세포 펠릿(n = 3)의 R 1 자기이완율을 나타낸다. e 및 f에서 Control은 아무것도 처리하지 않은 세포의 R 1 자기이완율 값이다.
도 14는 다양한 약물전달입자 내부에 IONP를 담지시킨 결과이다. a는 IONP를 리포좀, DNA 나노구조체 및 LNP에 담지시킨 후 전기영동으로 이를 확인한 것이다. b는 IONP, IO@lipo(산화철이 담지된 리포좀) 및 Empty lipo(빈 리포좀)의 MR 팬텀 R 2 맵 이미지, c는 이들의 R 1 맵 이미지를 나타낸다. 이미지는 1/1(IONP에 대해서 ml당 0.8 mg IONP 및 0 mg 총 지질, IO@lipo에 대해 ml당 0.8 mg IONP 및 4 mg 총 지질, Empty lipo에 대해 ml당 0 mg IONP 및 4 mg 총 지질 ml)에서 1/5로 연속희석을 하면서 얻었다. 식염수 샘플은 0으로 표시되었다.
본 발명은 약물전달입자의 엔도좀 탈출효율을 정량적으로 분석하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 자기공명영상 장치를 이용해 내부에 산화철 담지 입자를 섭취한 세포에 전자기파(예컨대 라디오파)를 전사해서 반향되는 자기공명신호(MR signal)를 측정하고, 이로부터 시간 경과에 따른 자기이완율의 변화율을 얻음으로써 약물전달입자의 엔도좀 탈출효율을 정량적으로 분석할 수 있는 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 용어 "지질나노입자", 및 "LNP"는 상호교환적으로 사용 가능하며, 인지질, 콜레스테롤, PEG-인지질(폴리에틸렌글리콜-인지질) 등을 포함하는 수송 비히클이다. 약물의 체내 전달을 위한 약물전달체로서 응용 가능성을 갖는다.
본 명세서에서 용어 "IONP"는 산화철나노입자(Iron oxide nano particle)를 의미하며, "산화철"과 상호 교환적으로 사용 가능하다.
본 명세서에서 용어 "IO@LNP"는 산화철이 담지된 지질나노입자를 의미하고, "Empty LNP"는 아무것도 담지 되지 않은 빈 지질나노입자를 의미한다.
본 발명은 산화철이 내부에 담지된 입자가 섭취된 세포에서 상기 산화철이 상기 입자로부터 상기 세포로 방출됨에 따라 변화하는 자기공명신호를 얻는 단계; 상기 자기공명신호로부터 시간 경과에 따른 자기이완율 변화 그래프를 산출하는 얻는 단계; 상기 그래프의 임의의 시간 구간에서 자기이완율의 변화율을 얻는 단계; 및 상기 자기이완율의 변화율을 하기 수학식 1에 대입하여 상기 입자의 엔도좀 탈출률을 얻는 단계를 포함하는 약물전달입자의 엔도좀 탈출 효율 분석방법을 제공한다:
[수학식 1]
엔도좀 탈출률(%) = (입자가 섭취된 세포에서 자기이완율의 변화율 ÷ (엔도좀 탈출 이전의 입자에 담지된 총 산화철의 자기이완율 - 엔도좀 탈출로 입자에서 방출된 총 자유 산화철의 자기이완율)) × 100.
자기공명신호(예컨대 종축 자화 신호 또는 횡축 자화 신호)는 세포에 산화철이 담지된 입자를 처리하고 일정 시간 배양한 후 세포에 라디오파를 조사함으로써 얻을 수 있다. 예컨대 세포에 산화철이 담지된 지질나노입자를 처리하고 10분, 20분, 30분, 40분, 60분, 80분 또는 120분 배양한 후에 자기공명영상장치를 이용해 세포에 라디오파를 조사하고, 세포로부터 방출되는 자기공명신호를 얻을 수 있다.
입자 내에 담지된 산화철이 엔도좀 탈출을 통해 세포에 방출됨에 따라, 세포로부터 방출되는 자기공명신호의 세기(예컨대 종축 자화 세기(I z ) 또는 횡축 자화 세기(I xy ))가 달라진다.
측정된 자기공명신호의 세기로부터 자기이완율(종축 자기이완율(R 1) 또는 횡축 자기이완율(R 2))을 산출할 수 있으며, 자기이완율 산출에는 pMRI 소프트웨어를 이용할 수 있다.
상기 자기이완율은 R 2 자기이완율, 상기 자기이완율의 변화율은 R 2 자기이완율의 감소율일 수 있으며, R 2 자기이완율의 감소율은 임의의 시간 구간에서 R 2 자기이완율의 단위시간당 감소량이다.
약물전달입자에 담지된 산화철이 세포로 방출됨에 따라 변화하는 횡축 자화 세기(I xy )를 측정하고, 이로부터 변화하는 R 2 자기이완율 값을 산출할 수 있다.
횡축 자화 세기(I xy )로부터 R 2 자기이완율 값 산출에는 다음과 같은 식을 이용할 수 있다:
Figure pat00001
Figure pat00002
(식 중, I xy는 횡축 자화 세기, M xy 0는 열 평형 상태에서의 벌크 자화 벡터(bulk magnetization vector), R 2는 횡축 자기이완율 (s-1), R 2,0는 조영제(산화철)가 담지되지 않았을 때의 기본 횡축 자기이완율 (s-1), r 2는 조영제(산화철)의 단위농도당 횡축 자기이완율 (s-1[mg/ml]-1), C는 조영제(산화철)의 농도 (mg/ml), TE는 에코 시간(echo time)임).
상기 자기이완율은 R 1 자기이완율, 상기 자기이완율의 변화율은 R 1 자기이완율의 증가율일 수 있으며, R 1 자기이완율의 증가율은 임의의 시간 구간에서 R 1 자기이완율의 단위시간당 증가량이다.
약물전달입자에 담지된 산화철이 세포로 방출됨에 따라 변화하는 종축 자화 세기(I z )를 측정하고, 이로부터 변화하는 R 1 자기이완율 값을 산출할 수 있다.
종축 자화 세기(I z )로부터 R 1 자기이완율 값 산출에는 다음과 같은 식을 이용할 수 있다:
Figure pat00003
Figure pat00004
(식 중, I z는 종축 자화 세기, M z 0는 열 평형 상태에서의 벌크 자화 벡터(bulk magnetization vector), R 1는 종축 자기이완율(s-1), R 1,0는 조영제(산화철)가 담지되지 않았을 때의 기본 종축 자기이완율(s-1), r 1는 조영제(산화철)의 단위농도당 종축 자기이완율(s-1[mg/ml]-1), C는 조영제(산화철)의 농도(mg/ml), TI는 반전 시간(s), TR은 반복 시간(s)임).
위와 같이 산출된 자기이완율 값을 이용해 시간 경과에 따른 자기이완율 변화 그래프를 얻을 수 있다. 예컨대 도 3의 c 같은 시간 경과에 따른 R 2 자기이완율 변화 그래프를 얻을 수 있다.
엔도좀 탈출로 입자 내 담지된 산화철이 세포로 방출됨에 따라, 세포의 R 1 자기이완율은 증가하고, R 2 자기이완율은 감소한다. 임의의 시간 구간에서 R 1 자기이완율의 단위 시간당 증가량(R 1 자기이완율의 증가율) 또는 R 2 자기이완율의 단위 시간당 감소량(R 2 자기이완율의 감소율)을 측정하여 상기 입자의 엔도좀 효율을 분석할 수 있다.
산화철나노입자가 담지된 약물 전달 입자의 R 2 자기이완율 값은 담지된 산화철나노입자의 양과 선형비례관계에 있다. 예컨대, 50개 산화철나노입자가 담지된 지질나노입자의 R 2 자기이완율 값은 100개 산화철나노입자가 담지된 지질나노입자의 R 2 자기이완율 값의 1/2이다.
본 발명의 약물전달입자의 엔도좀 탈출 효율 분석방법은 세포 내 섭취된 총 산화철 농도를 얻는 단계; 및 상기 세포 내 섭취된 산화철 총 농도를 하기 수학식 2에 대입하여, 상기 엔도좀 탈출 이전의 입자에 담지된 산화철의 총 자기이완율과 엔도좀 탈출로 입자에서 상기 세포로 방출된 산화철의 총 자기이완율의 차를 얻는 단계를 더 포함할 수 있다:
[수학식 2]
{(입자에 담지된 산화철의 총 자기이완율) - (입자 내에서 세포로 방출된 자유 산화철의 총 자기이완율)}=
세포 내 산화철 농도 × (입자에 담지된 산화철의 단위 농도당 자기이완율 - 자유 산화철의 단위 농도당 자기이완율).
예컨대 세포 내 섭취된 산화철 총 농도를 하기 수학식 2에 대입하여, 엔도좀 탈출 이전의 입자에 담지된 산화철의 총 R 2 자기이완율과 엔도좀 탈출로 입자에서 상기 세포로 방출된 산화철의 총 R 2 자기이완율의 차를 구할 수 있다.
세포 내 산화철의 농도를 구하는 방법은 공지의 방법을 이용할 수 있으며, 예컨대 IVIS 분석, ICP-MS 분석, 동위원소 정량분석법 등을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 세포 내 산화철의 농도는 지질나노입자 제조시 처리한 산화철의 질량, 지질나노입자의 산화철 담지효율, 세포의 지질나노입자 섭취효율) 및 세포현탁액의 부피를 하기 수학식 3에 대입하여 구하였다.
[수학식 3]
세포 내 산화철의 농도 = (입자 제조시 처리한 산화철의 질량) × (입자의 산화철 담지효율) × (세포에 처리한 입자 부피 / 합성한 입자 부피) × (세포의 입자 섭취율) / (세포현탁액의 부피).
세포의 입자 섭취율을 측정하는 방법은 제한되지 않으며, 본 발명의 일 실시예에서 세포의 입자 섭취효율은 형광염료(DiD)가 표지된 입자(IONP@LNP/DiD)의 총 형광 강도 및 세포가 섭취하지 못한 입자의 형광강도(상등액의 형광강도)를 측정하여 세포가 섭취하지 못한 입자의 비율을 산출했으며, 이를 통해 세포의 입자 섭취율을 산출하였다.
Figure pat00005
(식 중, FLUsupernatant는 상등액의 형광강도, FLUparticle은 형광염료가 표지된 지질나노입자의 총 형광강도임).
본 발명의 일 실시예에서 지질나노입자의 산화철 담지효율은 약 99.88% 측정되어, 세포 내 산화철의 질량은 {(지질나노입자 제조시 첨가한 산화철의 질량) × (합성한 지질나노입자의 부피에 대하여 세포에 처리한 부피)× (세포의 지질나노입자 섭취율)}로 구하였다.
본 발명의 일 실시예에서 자유산화철의 농도에 따른 자기공명영상 신호를 측정하고, 이를 R 2 자기이완율로 변환하여 '자유산화철의 단위농도당 R 2 자기이완율', 즉 자유산화철의 r 2를 얻었다.
본 발명의 일 실시예에서 산화철이 담지된 지질나노입자의 산화철 농도에 따른 자기공명영상 신호와 빈 지질나노입자의 자기공명영상 신호를 측정하고, 이를 R 2 자기이완율로 변환한 후 산화철이 담지된 지질나노입자의 R 2 자기이완율과 빈 지질나노입자의 R 2 자기이완율의 차를 이용해 '지질나노입자에 담지된 산화철의 단위 농도당 R 2 자기이완율', 즉 지질나노입자에 담지된 산화철의 r 2를 얻었다.
본 발명의 약물전달입자의 엔도좀 탈출 효율 분석방법은 산화철이 담지된 입자를 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 산화철이 담지된 입자의 제조는 예컨대 지질용액과 산화철 용액이 T-junction 방법을 통해 일정한 속도로 만나도록 함으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 약물전달입자의 엔도좀 탈출 효율 분석방법은 산화철을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
산화철의 제조는 FeCl3, 디에틸렌글리콜 및 시트르산나트륨을 혼합하여 가열하는 단계; 및 상기 가열한 혼합물에 아세트산염을 추가로 혼합하여 가열하는 단계를 포함할 수 있다.
약물전달입자는 산화철을 내부에 담지시킬 수 있는 입자라면 종류는 특별히 제한되지 않으며, 예컨대 지질나노입자, 리포좀, 마이셀(micelle), 폴리머 나노입자, 덴드리머나노입자, DNA 나노구조체, 금속나노입자, 탄소나노튜브, 풀러렌 및 바이러스유사입자(Virus-like particle, VLP)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
약물전달입자의 크기는 입자의 종류에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예컨대 30 내지 500nm, 40 내지 300nm, 50 내지 250nm 또는 50 내지 200nm일 수 있다.
약물전달입자에 담지되는 산화철의 크기는 약물전달입자의 크기에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예컨대 1 내지 25nm, 1 내지 20 nm 또는 5 내지 20nm일 수 있다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
1.방법
1.1. 재료
무수에탄올(EtOH), 아세트산나트륨(NaAc), 아세트산(AcOH), 염화제2철6수화물(FeCl3·6H2O), 구연산나트륨3염기2수화물(Na3Cit·2H2O), 무수아세트산나트륨(CH3COONa), 디에틸렌글리콜(DEG), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:0 PC(DSPC)), 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판(클로라이드 염)(DOTMA), 콜레스테롤 및 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도디카르보시아닌, 4-클로로벤젠술폰산염 (DiD) 형광염료는 Sigma Aldrich, Korea에서 구입하였다. 또한, (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-5000])(DSPE-mPEG5k)는 Creative PEGWorks에서 구입했다. PD-10 컬럼은 Cytiva에서 구입했다. 마지막으로 Spectra/Por2에서 MWCO(Molecular weight cutoff)가 12-14 kD인 반투과성 투석 튜브를 구입하였다.
1.2. 산화철나노입자(IONP)의 용매열 합성
구연산염 안정화 초소형 산화철나노입자(IONP)를 다음과 같은 방법으로 합성하였다. 먼저, FeCl3·6H2O(270.25mg; 1.00mmol) 및 DEG 10ml를 3목 둥근 바닥 플라스크에 넣고 1,000rpm으로 교반하면서 녹였다. FeCl3가 DEG에 완전히 용해된 후 Na3Cit·2H2O(117.75mg; 0.40mmol)를 용액에 첨가하고 히팅맨틀(heating mantle)에서 2시간 동안 80℃로 가열하였다. 그 후, 무수 아세트산나트륨(328mg; 4.00mmol)을 용액에 첨가하고, 4시간 동안 200℃로 가열하였다. 그 후, 혼합물을 100℃로 냉각시켰다. 혼합물을 5개의 튜브로 균등하게 나누고 각 튜브에 20 ml EtOH를 첨가하였다. 8,500rpm에서 30분 동안 원심분리한 후 상등액을 제거하였다. 그 후, EtOH 15ml를 첨가하고, 산화철 침전물의 재현탁, 7,000rpm에서 30분간 원심분리, 상등액 제거를 순서대로 3회 반복하였다. 마지막으로 EtOH를 실온에서 밤새 건조하고 완전히 증발시켰다.
1.3. 산화철나노입자가 담지된 지질나노입자(IO@LNP)의 제조
지질(DOTMA, DSPC, DSPE, 콜레스테롤) 및 PEG를 1mL EtOH에 용해시켰다.
그 후 T-junction 및 Gemini 88 Plus Dual Rate Syringe Pump(KDS)를 사용하여 양쪽 말단에서 일정한 유속으로 NaAc(pH 4.0) 1ml를 EtOH 1ml와 혼합했다. pH 측정기에서 NaAc와 AcOH의 적절한 비율 혼합하면서 pH를 결정했다. 그 후 반투과성 투석 튜브로 최종 용액 및 PBS의 완충액을 교환했다.
DiD 형광염료로 표지된 IO@LNP/DiD는 지질 용액에 4μl DiD 첨가를 제외하고는 IO@LNP와 동일한 지질 조성을 따랐다.
산화철나노입자(IONP)가 담지된 리포좀(IO@lipo)을 합성하기 위해 다른 구성 요소는 IO@LNP와 동일하게 유지하면서 DOTMA를 제외했다
IONP가 담지된 DNA 나노스피어(IO@DNAns) 제조는 표준화된 프로토콜을 따랐습니다.
1.4. 산화철나노입자(IONP) 및 산화철나노입자가 담지된 지질나노입자(IO@LNP)의 특성
IONP 및 IO@LNP의 유체역학적 크기는 Zetasizer의 동적 광산란(DLS)으로 평가되었다. 또한, 얻어진 IONP의 크기 분포를 투과전자현미경(TEM) 이미지로 확인하였다. IONP, IO@LNP 및 Empty LNP의 제타 전위는 Zetasizer가 장착된 DTS1070 모세관 제타 셀로 측정되었다. IONP의 푸리에 변환 적외선(FT-IR) 스펙트럼은 Routine FT-IR 분광계(Bruker)에서 얻었다. VSM-7410으로 IONP의 초상자성 특성을 확인하기 위해 진동 샘플 자력계(VSM) 테스트를 수행했다. Cryo-TEM은 IONP가 IO@LNP에 로드되었는지 확인하는 데 사용되었다. IONP 및 IO@LNP의 안정성은 증류수, PBS 및 Roswell Park Memorial Institute 1640 성장 배지(RPMI 성장 배지)를 비롯한 다양한 용매를 사용하여 서로 다른 시점에서 유체역학적 크기를 획득하여 추정되었다. DiD 염료로 표지된 각 입자의 형광 강도를 얻기 위해 SYNERGY H1 마이크로플레이트 판독기(BioTek)를 사용하여 여기 및 방출 파장을 644 및 674 nm로 고정하였다.
1.5. MR 팬텀
IONP, IO@LNP 및 Empty LNP의 MR 특성을 이해하기 위해 1/1(IONP의 경우 ml당 0.87mg IONP 및 0mg 총 지질; IO@LNP의 경우 ml 당 0.87mg IONP 및 총 지질 4.33mg, Empty LNP의 경우 ml 당 0 mg IONP 및 총 지질 4.33 mg)에서 1/5까지 연속 희석하여 MR 팬텀 결과를 얻었다.
MR 팬텀 이미징에는 7.0 Tesla Micro MRI를 사용했다. R 1 이완율은 반전 회복 FLASH(IR FLASH) 시퀀스를 이용해 측정되었다(FOV: 30 mm * 52.5 mm; 매트릭스: 128 * 128; 슬라이스 두께: 2.0 mm; TR: 8 ms; TE: 0 ms; TI: 20 내지 4804 ms, 평균: 1, 에코: 300, 지방 포화 없음, 스캔 시간: 16분). 또한, R 2 이완율은 MEMS(multi-echo spin-echo sequence)를 이용해 측정되었다(FOV: 35 mm * 52.6 mm; matrix: 128 * 128; 슬라이스 두께: 2.0 mm; TR: 5000 ms; TE: 9 내지 2700 ms; 평균: 2, 에코: 300, 지방 포화 없음; 스캔 시간: 22분).
IO@LNPs의 MR 매개변수가 지질 제거에 의해 예상된 대로 IONPs의 매개변수가 되었는지 확인하기 위해 세제로 Triton X-100를 이용했다. 이를 위해 Triton X-100을 IO@LNP 용액에서 37℃에서 10분 동안 처리하였다. 그 후, 용액을 실온에서 5분 동안 냉각시켰다. 마지막으로 샘플에 대해 MR 팬텀 실험을 수행했다.
1.6. 공초점 이미지 촬영
LNP 표면의 DiD-labeling이 선행되었다. 70,000개의 4T1 세포를 공초점 접시에 옮기고 밤새 배양했다. IO@LNP 처리 시간이 0, 20, 40, 60 또는 80분, Hoechst33342(접시당 0.5μl) 처리 시간이 5분이 되도록 2개의 재료를 적절한 시간에 동시에 또는 별도로 처리하였다. 입자 및 제제를 세척한 후, 공초점 형광 현미경으로 샘플을 관찰하였다.
1.7. 인비트로 MRI
4T1 세포를 IO@LNP이 첨가된 배지에서 40분 동안 배양하였다. 배지를 흡인한 후 세포별로 각각 0분, 20분, 40분, 80분 동안 추가 배양함으로써, 총 40분, 60분, 80분, 120분 배양 세포들을 얻었다. 그 후, 배지를 흡인하고, 세포를 DPBS로 1회 세척하고, 트립신-EDTA 처리 후, 세포를 2분 동안 배양하였다. 원심분리하여 세포 펠릿을 얻고 이를 1ml DPBS에 재현탁시켰다. 각 샘플에 대한 총 세포 밀도 및 세포 생존율은 표준 트리판-블루 염색 프로토콜에 따라 혈구계산기로 계산되었다. 세포를 1.5ml EP 튜브로 옮기고 펠릿을 500rcf에서 10분 동안 원심분리하여 얻었다. 그 다음, 펠릿을 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드(PFA)에 재현탁시켰다. 그 후, 500rcf에서 10분 동안 원심분리하고 DPBS 재현탁을 2회 반복하였다. 펠릿을 수집하고 50 μl DPBS에 재현탁하고 PCR 튜브로 옮겼다. 세포가 완전히 침전될 때까지 충분히 기다린 후 상등액을 제거하였다. 얻어진 시료는 4℃에서 보관하였다. R 1 및 R 2 자기이완율은 MR 팬텀 실험에서 설명한 대로 각각 IR FLASH 및 MEMS에서 얻었다.
또한, 세포펠릿에 형광을 처리한 후 형광광도법을 이용하여 세포의 지질나노입자 섭취율을 분석하였다. 형광염료(DiD)가 표지된 지질나노입자(IONP@LNP/DiD)의 총 형광 강도 및 세포가 섭취하지 못한 지질나노입자의 형광강도(상등액의 형광강도)를 측정하여, 이로부터 세포의 지질나노입자 섭취율을 산출하였다.
Figure pat00006
(식 중, FLUsupernatant는 상등액의 형광강도, FLUparticle은 형광염료가 표지된 지질나노입자의 총 형광강도임).
DiD 염료로 표지된 각 입자의 형광 강도를 얻기 위해 SYNERGY H1 마이크로플레이트 판독기(BioTek)를 사용하여 여기 및 방출 파장을 644 및 674 nm로 고정하였다.
1.8. MR 결과의 해석
R 1 자기이완율(종축 자기이완율) 및 R 2 자기이완율(횡축 자기이완율) 값의 결정 및 매개변수 이미지 획득은 pMRI 소프트웨어(www.parametricmri.com, Philadelphia, PA, USA)를 통해 수행되었다.
IR FLASH 시퀀스를 통해 측정된 종축 자화 세기(Iz)는 다음과 같이 산출된다:
Figure pat00007
Figure pat00008
(식 중, I z는 종축 자화 세기, M z 0는 열 평형 상태에서의 벌크 자화 벡터(bulk magnetization vector), R 1는 종축 자기이완율(s-1), R 1,0는 조영제(산화철)가 담지되지 않았을 때의 기본 종축 자기이완율(s-1), r 1는 조영제(산화철)의 단위농도당 종축 자기이완율(s-1[mg/ml]-1), C는 조영제(산화철)의 농도(mg/ml), TI는 반전 시간(s), TR은 반복 시간(s)임).
MEMS 시퀀스를 통해 측정된 횡축 자화 세기(Ixy)는 다음과 같이 산출된다:
Figure pat00009
Figure pat00010
(식 중, I xy는 횡축 자화 세기, M xy 0는 열 평형 상태에서의 벌크 자화 벡터(bulk magnetization vector), R 2는 횡축 자기이완율 (s-1), R 2,0는 조영제(산화철)가 담지되지 않았을 때의 기본 횡축 자기이완율 (s-1), r 2는 조영제(산화철)의 단위농도당 횡축 자기이완율 (s-1[mg/ml]-1), C는 조영제(산화철)의 농도 (mg/ml), TE는 에코 시간(echo time)임).
이완율의 비 α는 다음과 같이 산출된다:
Figure pat00011
(식 중, r1은 IONP 단위 농도당 종축 자기이완율(s-1[mg/ml]-1), r2는 IONP 단위 농도당 횡축 자기이완율(s-1[mg/ml]-1)임).
총 IONP 중 지질나노입자에 담지된 IONP의 비율이 θ일 때, 시간 경과에 따른 지질나노입자에 담지된 IONP의 감소율(엔도좀 탈출률) ∂θ/∂t은 다음과 같이 산출될 수 있으며, 이를 통해 r2 자기이완율 값은 지질에 대한 산화철나노입자의 비율에 크게 의존하지 않음을 알 수 있다.
Figure pat00012
Figure pat00013
또한, 하기 식을 이용하여 이론적으로 T1 및 T2 조영제로 사용할 수 있는 초소형 IONP를 사용하여 엔도좀 탈출률 뿐만 아니라 분해 또는 세포외 배출을 추정할 수 있다.
Figure pat00014
1.9. Bio-TEM 이미지 분석
4T1 세포를 T-175 플라스크에서 2일 동안 배양하였다. 그런 다음, 3 ml IO@LNP를 세포에 처리하고 40분, 60분, 80분 또는 120분 동안 배양하였다. 40분 배양 세포는 DPBS로 2회 세척하였다. 반면에, 60분, 80분, 120분 배양 세포는 40분 배양하고 DPBS로 1 회세척한 후 나머지 시간 동안 13ml RPMI 성장배지에서 추가로 배양하였다. 그후 마지막으로 DPBS로 1회 더 세척하였다.4 ml의 트립신-EDTA를 세포에 첨가한 후 2분 동안 배양하였다. 11ml 배지를 첨가하고 원심분리에 의해 펠릿을 수집하였다. 상등액을 흡인하고 세포를 1 ml DPBS에 재현탁시켰다. 그런 다음 펠릿을 500rcf로 10분 동안 원심분리하여 수집했다. 과량의 IONP에 대한 샘플을 준비하기 위해, IO@LNP에 담지된 양의 3.5배의 IONP 농도를 세포에 첨가하고, 다시 40분 동안 배양하였다. 대조군은 나노입자를 처리하지 않은 것 외에는 모든 절차를 40분 샘플과 동일하게 했다.
시료 전처리 과정은 Karnovsky 고정, En Bloc 염색, 포매 등 9단계로 구분하였다. 모든 방법은 권장되는 방법으로 수행되었다. 그 후, 마이크로톰으로 박막 단계를 계속한 후 Bio-TEM 이미지를 획득했다.
이미지로 반 정량 분석을 수행하기 위해 세포 소포에서 IO@LNP를 정의하기 위한 3가지 기준을 설정했다. 첫째, 관심 있는 신호는 주변 세포질 신호보다 현저히 낮아야 한다. 둘째, 캐비티(cavity)의 직경은 100~200nm 사이여야 한다. 마지막으로 캐비티(cavity)에 최소 3개의 검은 점이 포함되어야 한다. 캐비티는 세포 소포에서 IO@LNP로 정의될 수 있다.
1.10. 토모큐브 분석
1 x 105 세포를 3ml RPMI 성장 배지와 함께 Tomodish에 시딩했다. 그런 다음 세포를 2일 동안 배양하였다. 그 후, 300 μl IO@LNP/DiD를 40분 동안 세포에 처리하였다. 그런 다음 세포를 세로로 관찰했다. 모든 매개 변수는 기본값으로 설정되었다.
1.11. 인비보 실험
4마리의 정상 Balb/c 마우스에 꼬리 정맥을 통해 200μl IO@LNP/DiD를 주사했다. 주사 후 0, 0.5, 1, 2, 3, 6, 12 및 24시간 시점에 생체 내 형광 이미지를 생체 내 이미징 시스템(IVIS)을 통해 얻었다. 마지막으로 각 마우스에 대한 간의 형광 강도는 간 주변의 적절한 ROI에 의해 평가되었다.
유사하게, 1마리의 정상 Balb/c 마우스에 꼬리 정맥을 통해 500μl IO@LNP/DiD를 주사했다. 또한, R 2 맵은 전처리와 함께 IO@LNP/DiD 주사 후 1, 1.7, 2.4 및 6시간 시점에 7.0 Tesla Micro MRI를 통해 얻었다. R 2 이완율은 MEMS(multi-echo spin-echo sequence)(FOV: 35mm * 35mm; 매트릭스: 128 * 128; 슬라이스 두께: 2mm; TR: 5000ms; TE: 12~360ms; 평균: 4, 에코: 30, 지방 포화: O, 스캔 시간: 43분)로 측정되었다.
2.결과
2.1. IONP 및 IO@LNP의 특성
초소형 IONP는 더 높은 R 2 이완율과 LNP의 효율적인 캡슐화를 목적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 개질과 같은 표면 코팅 없이 합성되었다. IONP의 형태 및 크기 분포는 TEM 및 DLS에서 관찰되었다. 네거티브 염색을 사용한 TEM 이미지는 IONP가 균일하게 분산된 초소형 크기 분포를 가짐을 보여주었다(도 2의 a). IONPs의 유체역학적 크기는 2.289 ± 0.641 nm(평균 ± SD)였으며, 이는 1.9 nm의 기준 값과 일치한다(도 2의 c). 동시에 IONP의 다분산 지수(PDI)는 0.235였다. IONPs의 제타 전위(표면 전하)는 -17.7 ± 5.09 mV(평균 ± SD)였으며 이는 충분한 음전하로 인해 IONP 사이에 강한 반발력이 있음을 의미한다(도 2의 d). IONP의 푸리에 변환 적외선 스펙트럼은 1,587 및 1,372 cm-1과 같은 기준과 유사한 피크를 나타냈으며, 이는 컨쥬게이션된 C=O 및 C-O 결합의 스트레칭 진동으로 인한 것일 수 있다(도 7의 a). 또한 2,900 cm-1 및 1,100 cm-1 부근의 피크는 각각 구연산나트륨으로부터 -CH2- 그룹 및 C-O 결합의 신축 진동을 나타낸다. 진동 샘플 자력계(VSM)의 결과는 IONP의 초상자성 특성을 보여주었다(도 7의 b). IONP의 정규화된 포화 모멘트는 참조에서 알 수 있듯이 약 3 emu/g였다. 이것은 IONP가 T2 조영제로 사용될 수 있음을 보여준다. 또한 IONP는 증류수, 인산염 완충 식염수(PBS), 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 항생제-항진균제를 포함하는 RPMI 성장 배지를 포함한 다양한 배지에서 7시간 이내에 안정한 것으로 나타났다(도 8의 a). RPMI 성장 배지에서 IONP는 표면 코팅이 없기 때문에 하루 후에 약간 불안정함을 보였다. 유체역학적 크기의 증가는 매질에서 입자로의 단백질 결합을 의미한다.
합성된 IONP는 LNP에 캡슐화 되었다. IO@LNP는 유체 기반 장치를 사용하여 균일한 크기의 DOTMA, DSPC, DSPE-PEG5k 및 콜레스테롤로 제조되었다. Cryo-TEM은 IONP가 LNP(도 8의 b)에 성공적으로 담지되었음을 보여주었다. IONP 및 IO@LNP에 대한 전기영동 결과에서도 추가된 IONP가 LNP에 담지 되었음을 보여주었다(도 8의 c). IONP가 담지된 LNP(IO@LNP)의 크기는 PDI가 0.166인 93.13 ± 30.66 nm(평균 ± SD)였다(도 2의 c). 또한 IO@LNP의 제타 전위는 6.11 ± 7.18 mV(평균 ± 표준 편차)였다(도 2의 d). IO@LNP는 11.9 ± 6.01mV의 빈 LNP보다 더 많은 음의 표면 전하를 보였다(도 9의 c). 이는 음전하를 띤 IONP와 양이온성 지질이 서로 끌어당겨 IO@LNP 표면의 양이온성 지질의 유효 수를 감소시키는 것으로 나타났다. 또한 IO@LNP는 일주일 이내에 다양한 매체에서 안정적인 것으로 나타났다(도 8의 b). 크기와 PDI는 시간이 지남에 따라 상대적으로 일정하게 유지되었다. 시험관 내 실험을 위해 DiD-labelled IO@LNP (IO@LNP / DiD) 및 sulfo-cy5.5-loaded IO@LNP (IO@LNP / Sulfo-cy5.5)를 준비했다(도 10).
2.2. MR 팬텀
더 나은 해상도와 우수한 조영효과를 위해 7.0 Tesla(T)의 높은 자기장을 가진 MR 영상 장비를 이용하였다.
IONP(mg) 대 지질(mg)의 비율에 따른 IO@LNP의 R2 맵을 탐색했을 때 IONP 단위 농도당 횡축 자기이완율(r2)은 0.1 mg IO/mg lipid와 0.2 mg IO/ mg 지질 IO@LNP (p-값 = 0.51)사이인 것으로 나타났다(도 2의 e). 이는 IONP가 LNP에 담지 되면 자기 모멘트가 더 이상 크게 변하지 않는다는 것을 나타내며, r2는 산화철나노입자 대 지질의 비율에 관계없이 일정함을 의미한다. 또한 이것은 다음 공식으로 설명될 수 있다:
Figure pat00015
(식 중, r2는 IONP 단위 농도당 횡축 자기이완율(s-1), r2, loaded는 LNP에 담지된 산화철나노입자(IONP) 단위 농도당 횡축 자기이완율(s-1), r2, free는 자유 산화철나노입자(IONP) 단위 농도당 횡축 자기이완율(s-1), θ는 총 IONP 중 LNP에 담지된 IONP의 비율임).
표 1은 IONP 대 지질 비율에 따른 MR 팬텀에서 MR 시퀀스 특성을 나타내고, 표 2는 IONP 대 지질 비율에 따른 R2 맵에서 IO@LNP의 MR 매개변수를 나타낸다.
R2 map
Sequence MEMS
FOV (mm) 65
Matrix 128 x 128
Slice Thickness (mm) 2
TR (ms) 5000
TE (ms) 9 - 2700
TI (ms) -
Average 2
Echo 300
Fat Saturation No
Scan Time (min) 22
0.1 mg IO/mg lipid IO@LNP 0.2 mg IO/mg lipid IO@LNP Saline
R 2(s-1) in 1/1 2.22476 2.74949 0.73221
R 2(s-1) in 1/2 1.43608 1.76211 -
R 2(s-1) in 1/3 1.12056 1.34028 -
R 2(s-1) in 1/4 0.96463 1.12349 -
R 2(s-1) in 1/5 0.89962 1.01840 -
IONP conc (mg/ml) 1/1 0.18735 0.25833 -
r2(s-1[mg/ml]-1) 6.97390±0.30830 7.23820±0.25260 -
-모든 샘플은 살린에 용해됨
-IO@LNP의 r2 값은 IO의 r2 값임
R 2 맵 결과에서 IONP 단위 농도당 횡축 자기이완율(r2)은 IONP보다 IO@LNP에서 더 컸다(도 2의 f-g, 도 11의 a). 이는 IO@LNP 내 인접한 IONP 간의 자기 모멘트에 대한 시너지 효과에 의한 것으로 예상된다. IONP의 크기에 따른 r2의 증가는 이전 논문에서 보고되었다. 한편, IONP 단위 농도당 종축 자기이완율(r1)은 IONP보다 IO@LNP에서 더 작은 것으로 나타났다(도 11의 b, 도 13의 a, b). IO@LNP에 담지된 IONP의 제한된 동작으로 인해 무선 주파수(RF) 에너지 전달 효율이 낮기 때문일 수 있다.
IONP, 빈 LNP 및 IO@LNP에 대한 R1 맵 및 R2 맵의 MR 매개변수는 표 3 및 4에 표시했다. 표 3은 MR 시퀀스 특성, 표 4는 IO, 빈 LNP 및 IO@LNP의 MR 매개변수를 나타낸다.
R 1 map R 2 map
Sequence FLASH MEMS
FOV (mm) 30 x 52.5 35 x 52.5
Matrix 128 x 128 128 x 128
Slice Thickness (mm) 2 2
TR (ms) 8 5000
TE (ms) 0 9 - 2700
TI (ms) 20 - 4804 -
Average 1 2
Echo 300 300
Fat Saturation X X
Scan Time (min) 16 22
IONP 빈 LNP IO@LNP Saline
R 1(s-1) in 1/1 0.63696 0.35635 0.44988 0.37587±0.02180
R 1(s-1) in 1/2 0.48092 0.35065 0.42152 -
R 1(s-1) in 1/3 0.43543 0.35624 0.40992 -
R 1(s-1) in 1/4 0.41732 0.35558 0.40299 -
R 1(s-1) in 1/5 0.40670 0.35140 0.40382 -
r1(s-1[mg/ml]-1) 0.27486±0.01764 - 0.13288±
0.01412		 -
R 2(s-1) in 1/1 3.02159 1.20190 6.26705 1.05491±0.09108
R 2(s-1) in 1/2 1.93890 1.02397 3/30333 -
R 2(s-1) in 1/3 1.62390 0.98006 2.53705 -
R 2(s-1) in 1/4 1.47685 0.99272 2.22423 -
R 2(s-1) in 1/5 1.41793 1.03431 2.08270 -
r2(s-1[mg/ml]-1) 2.18343±0.05207 - 5.69480±0.16000 -
IONP conc (mg/ml) 1/1 0.87000 - 0.87000 -
α 7.94379 - 41.9051 -
-모든 샘플은 살린에 용해됨. IO@LNP의 r1 및 r2 값은 모두 IO@LNP에 담지된 IO를 기초로함.
- IO@LNP의 r1 및 r2 값은 IO@LNP에 담지된 IO의 r1 및 r2 값임
또한, Triton X-100 세제 처리 유무에 관계없이 MR 팬텀 실험을 수행하여 IO@LNP에서 지질 제거 후 MR 매개변수가 자유 IONP의 매개변수가 되었음을 입증했다(도 2의 h, 도 13의 c).
IONP, 빈 LNP 및 IO@LNP에 대한 Triton X-100 처리 후의 MR 매개변수는 표 5 및 6에 표시했다. 표 5는 MR 시퀀스 특성을 나타내고, 표 6은 IONP, Triton X-100 처리하지 않은 IO@LNP, 및 Triton X-100 처리한 IO@LNP MR 매개변수를 나타낸다.
R 1 map R 2 map
Sequence FLASH MEMS
FOV (mm) 30 x 52.5 35 x 52.5
Matrix 128 x 128 128 x 128
Slice Thickness (mm) 0.8 0.8
TR (ms) 8 5000
TE (ms) 0 9 - 2700
TI (ms) 28 - 4812 -
Average 1 2
Echo 300 300
Fat Saturation X X
Scan Time (min) 16 22
IONP IO@LNP w/o Triton X IO@LNP w/ Triton X Saline Trixon X
R 1(s-1) in 1/1 0.78708 0.45246 0.77608 0.36387 0.37296
R 1(s-1) in 1/2 0.72194 0.41376 0.71644 - -
R 1(s-1) in 1/3 0.66418 0.40526 0.66051 - -
R 1(s-1) in 1/4 0.62639 0.40366 0.62364 - -
R 1(s-1) in 1/5 0.67231 0.44300 0.67011 - -
r1(s-1[mg/ml]-1) 1.09010±
0.21470		 0.20117±
0.04428		 1.04170±
0.20710		 - -
R 2(s-1) in 1/1 2.78748 4.42259 2.66428 1.19619 1.45403
R 2(s-1) in 1/2 1.93937 2.81245 2.05870 - -
R 2(s-1) in 1/3 1.67159 2.29855 1.93423 - -
R 2(s-1) in 1/4 1.57104 2.08791 1.92206 - -
R 2(s-1) in 1/5 1.56901 2.01590 2.08751 - -
r2(s-1[mg/ml]-1) 3.00840±0.06447 6.29220±
0.13370		 2.51790±
0.29490		 - -
IONP conc (mg/ml) 1/1 0.52 0.52 0.52 - -
-IONP 및 IO@LNP w/o Triton X는 살린에 용해됨. IO@LNP w/ Triton X는 TritonX에 용해됨.
2.3. 인비트로 MRI 결과
IO@LNP의 엔도좀 탈출 시작 시점을 결정하기 위해 IO@LNP/DiD를 사용한 공초점 이미징을 통해 4T1 세포의 시간 경과에 따른 흡수 패턴을 평가했다. 같은 양의 IO@LNP/DiD를 세포에 처리하고 배양 시간을 달리한 후에 세척했다. 이미징을 통해 다음과 같은 관찰 결과를 확인할 수 있었다(도 13). 지질나노입자의 세포 내 흡수는 예상대로 0분에서는 드물었고, 지질나노입자는 20분에서는 주로 세포 표면에 위치하는 것으로 보였으며, 40분에서는 세포질 영역에 더 많이 위치하는 것으로 나타났다. 이를 통해, 20분 내지 40분 사이에 엔도좀 탈출이 일어나기 시작하는 것을 알 수 있었으며, 40분부터 엔도좀 탈출의 지속적인 효율을 추적할 수 있었다. 이를 바탕으로 하기 인비트로 MRI 실험에서 세포의 IO@LNP 섭취 시간을 40분으로 설정하고, 고정된 섭취 시간 후 엔도좀 탈출을 위해 세포를 추가로 배양(0, 20, 40 및 80분)하였다(총 배양 시간: 40, 60, 80, 120분)(도 3의 a).
R 2 맵에서 배양 시간이 증가함에 따라 R 2 값의 뚜렷한 감소가 관찰되었으며, 세포만 있는 그룹은 IO@LNP로 처리된 세포보다 낮은 R 2를 나타냈다. 엔도좀 탈출 효율 ∂θ/∂t는 다음과 같은 수학식을 통해 산출되었다(도 3, 도 13의 d-f):
Figure pat00016
(식 중, θ는 총 IONP 중 지질나노입자에 담지된 IONP의 비율, dR 2/dt는 지질나노입자가 섭취된 세포의 R 2 자기이완율의 감소율로 0.2189 s-1/min, r2, loaded는 LNP에 담지된 IONP 단위 농도당 횡축 자기이완율로 5.69480 s-1[mg/ml]-1, r2, free는 자유 IONP 단위 농도당 횡축 자기이완율로 2.18343 s-1[mg/ml]-1, C는 세포의 평균 IONP 농도로 6.26847 mg/ml임).
R 2 값의 감소가 엔도좀탈출에 의한 것임을 검증하기 위해 40, 60, 80분 배양한 세포의 R 1 값의 변화를 관찰했다. 위 시간 간격에서 R 1 값이 R 2 값과 반대 경향으로 나타난 바, 이 시간 간격에서 R 2 값의 감소는 엔도좀 탈출에 의한 것임을 확인할 수 있었다(도 3의 b 및 c, 도 13의 d-f). 그러나 120분 배양 세포에서는 R 1 및 R 2 값이 모두 감소하여 IONP의 분해 또는 세포외 배출이 발생했음을 알 수 있었다. 한편, 클로로퀸으로 전처리된 세포는 40분에서 120분까지 일정한 R 1 값을 나타냈다. 클로로퀸은 엔도좀 탈출을 촉진하는 바, 40분 이전에 엔도좀탈출이 완료됨을 알 수 있었다.
MR 매개변수를 표 7 내지 9에 나타냈다. 표 7은 MR 시퀀스 특성, 표 8 및 9는 IO@LNP 처리 후 40분의 동일한 섭취 시간을 포함하여 총 40분, 60분, 80분 및 120분 배양한 세포들의 MR 매개변수를 나타낸다. 대조군으로 IO@LNP 처리 없이 세포 단독의 MR 매개변수를 함께 나타냈다. 표 9는 클로로퀸으로 전처리된 세포를 이용하였다.
R 1 map R 2 map
Sequence FLASH MEMS
FOV (mm) 40 x 65 40 x 65
Matrix 128 x 128 128 x 128
Slice Thickness (mm) 0.5 0.5
TR (ms) 8 5000
TE (ms) 0 9 - 2700
TI (ms) 28 - 4804 -
Average 1 2
Echo 300 300
Fat Saturation X X
Scan Time (min) 16 22
40분 배양 60분 배양 80분 배양 120분 배양 세포단독
섭취율
(%)		 6.07410
R 1(s-1) 0.47832±
0.00694		 0.54833±
0.01263		 0.58974±
0.00929		 0.52174±
0.00859		 0.42435±
0.01711
R 2(s-1) 32.0836±5.57606 24.0780±
3.00415		 17.2224±
1.64582		 14.0396±
0.93145		 5.52222±
0.01786
세포 내 산화철 농도
(mg/ml)		 2.58 mg(세포 내 산화철 질량) ÷ 25ul(최종 부피) x 0.067410(세포의 지질나노입자 섭취율) = 6.26847(mg/ml)
모든 샘플은 아가로스겔에 고정 후 DPBS에 용해되었다
40분 배양 60분 배양 80분 배양 120분 배양 세포만
R 1(s-1) 0.56891±0.06197 0.54358±
0.01652		 0.57253±
0.00542		 0.58498±
0.01712		 0.39925±
0.00595
R 2(s-1) 20.52434±0.39818 14.65528±
0.42163		 16.84697±
0.42732		 16.32473±
0.59480		 16.7101±
0.50763
모든 샘플은 아가로스겔에 고정 후 DPBS에 용해되었다
LNP의 엔도좀 탈출을 촉진하기 위해 클로로퀸이 처리되었다.
2.4. Bio-TEM 이미징을 이용한 인비트로 MRI 결과 검증
인비트로에서 MR 성능 결과를 확인하기 위해 Bio-TEM 이미징으로 검은 점을 포함하는 엔도좀을 계산했다(도 4). 과량의 IONP로 처리되거나 처리되지 않은(대조군) 4T1 세포에서는 검은 점을 포함하는 눈에 보이는 엔도좀이 관찰되지 않았다. 또한, IONP에 의한 세포독성 패턴은 나타나지 않았다. 그러나 IO@LNPs를 포함하는 더 많은 엔도좀이 나중 시점보다 40분에 더 많이 검출됨을 확인하였다(도 4의b). 도 4의 c는 Bio-TEM 이미지 당 8 μm × 8 μm 면적의 엔도좀 수의 합을 계산하여 제시되었다 (그룹당 n = 20 이미지). 총 배양 시간이 증가함에 따라 엔도좀의 빈도는 감소하였고, 이는 R 2 값의 감소 결과와 상응하였다(도 4의 d). 즉, 시간이 지남에 따라 엔도좀 탈출이 일어나면서 엔도좀의 수가 감소하고 동시에 R 2 이완율이 변하게 됨을 확인하였다. 또한, 120분의 세포는 Bio-TEM 이미지에서 많은 소포를 방출한 바, 이는 후기 시점(예컨대 120분 이후)의 R 2 감소가 활성 세포외유출에 의해 영향을 받을 수 있음을 시사한다.
Tomocube를 사용한 형광(FL) 이미징에서 LNP의 친수성 공간에 Sulfo-cy5.5 염료가 있는 IO@LNP/Sulfo-cy5.5가 관찰되었다. IO@LNP/Sulfo-cy5.5는 구두점 패턴이 초기에 나타나고 더 분산된 패턴이 나중 시점에서 우세함을 명확하게 보여주었다(도 5a). 또한 유의한 세포사멸 형태도 없었다. 또한 형광 세포내 엔도좀의 활발한 움직임을 보였다. 초기 엔도좀 탈출만이 높은 운동성을 가져온다는 것은 잘 알려져 있으므로 엔도좀의 활발한 움직임은 엔도좀 탈출이 일어나는 초기 엔도좀의 존재를 시사한다. 엔도좀 탈출 정도를 더 분석하기 위해 LNP를 포함하는 엔도좀의 공칭수(nominal number)는 95 백분위수(노란색)보다 밝은 픽셀 수를 60 백분위수(녹색 및 노란색)보다 밝은 픽셀 수로 나눈 값으로 정의되었다(도 5b). 그런 다음 엔도좀의 수와 해당 R 2 값 사이에 선형 관계가 나타났다(도 5c). 또한 배경형광 정량화에서 80분 후 엘보우 포인트를 관찰한 결과 세포외 유출은 80분 후에만 일어나는 것을 확인했다(도 5c).
2.5. 생체 내 실험
생체 내 이미징을 이용하여 본 발명 엔도좀 탈출효율 분석방법의 타당성을 검증했다. IO@LNP의 생체 분포를 조사하기 위해 암컷 마우스에 마우스당 IO@LNP/DiR(200ul, 0.8mg IONP/4mg 총 지질/ml PBS)을 정맥 주사했다. IO@LNP 처리된 마우스는 간(n = 4, Balb/c 마우스)에서 유의하게 증가된 형광 신호를 보였다(도 6의 a, b). 관심 영역(ROI)은 간에서 형광 신호를 측정하기 위해 IVIS 소프트웨어에 지정되었다(도 6의 c). 주사하고 2시간 후의 간의 LNP 신호는 주사하고 1시간 후보다 6.3배 더 높았다. IO@LNP를 주사하고 2시간 후에 간에서 최고점에 도달함을 확인했으며, 이는 주사된 나노입자가 간 많이 축적되었음을 의미한다. 간의 Kupffer 세포는 나노입자를 흡수하는 주요 세포 유형으로 생각되었으며, 생체 내 MR 실험을 위해 2시간을 지질나노입자 섭취 후 엔도좀 탈출의 기준 시점으로 결정했다.
마우스에 각각 IONP 및 IO@LNP를 정맥 주사했으며, 간에서 엔도좀 탈출 여부를 확인하였다(그림 6d-e). R 2 자기이완율 값은 IO@LNPs-처리된 마우스에서 선형적으로 감소했다. IVIS를 통해 주사 24시간 후에도 대부분의 IO@LNP가 간에서 발견되었지만 R 2 값은 시간이 지남에 따라 선형적으로 감소하였으며, 이를 통해 엔도좀 탈출로 인하여 R 2 값이 감소하였음을 알 수 있었다. 따라서, 다음과 같은 식을 적용하여 엔도좀 탈출률을 계산하였다.
Figure pat00017
Figure pat00018
(식 중, dR 2/dt는 지질나노입자가 섭취된 세포의 R 2 자기이완율의 감소율로 2.754717 s-1/h, r2, loaded는 LNP에 담지된 IONP 단위 농도당 횡축 자기이완율로 5.69480 s-1[mg/ml]-1, r2, free는 자유 IONP 단위 농도당 횡축 자기이완율로 2.18343 s-1[mg/ml]-1, C는 조직의 평균 IONP 농도로2.4 mg/ml로 측정되었으며 이를 통해 산출된 엔도좀 탈출률은 31.9%/hr(0.53%/min)이었다. 세포단위 실험에서보다 약 2배 느려진 엔도좀 탈출 효율은 생체내 장벽의 관여 때문인 것으로 판단되었다.
2.6. 다양한 약물 전달 시스템에 적용
본 발명의 엔도좀 탈출 효율을 분석방법에는 약물 전달 시스템으로 LNP 외에 리포좀, DNA 나노스피어 등 다양한 물질을 사용할 수 있다. 리포좀, 과 DNA nanosphere 내 IONP가 담지됨을 확인하였으며(도 14), IO@lipo(IONP가 담지된 리포좀)에서 IO@LNP와 유사한 MR 신호 변화가 관찰되었음을 확인하였다(도 14). 즉, 엔도좀 탈출 효율을 분석에 LNP 뿐만 아니라 리포좀, DNA 나노스피어 등의 다른 약물 전달 시스템을 이용할 수 있음을 확인하였다.

Claims (6)

  1. 산화철이 내부에 담지된 입자가 섭취된 세포에서 상기 산화철이 상기 입자로부터 상기 세포로 방출됨에 따라 변화하는 자기공명신호를 측정하는 단계;
    상기 자기공명신호로부터 시간 경과에 따른 자기이완율 변화 그래프를 얻는 단계;
    상기 그래프의 임의의 시간 구간에서 자기이완율의 변화율을 얻는 단계; 및
    상기 자기이완율의 변화율을 하기 수학식 1에 대입하여 상기 입자의 엔도좀 탈출률을 얻는 단계를 포함하는 약물전달입자의 엔도좀 탈출 효율 분석방법:
    [수학식 1]
    엔도좀 탈출률(%) = (입자가 섭취된 세포에서 자기이완율의 변화율 ÷ (엔도좀 탈출 이전의 입자에 담지된 총 산화철의 자기이완율 - 엔도좀 탈출로 입자에서 방출된 총 자유 산화철의 자기이완율)) × 100
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 자기이완율은 R 2 자기이완율인, 약물전달입자의 엔도좀 탈출 효율 분석방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 세포 내 섭취된 총 산화철 농도를 얻는 단계; 및
    상기 세포 내 섭취된 산화철 총 농도를 하기 수학식 2에 대입하여, 상기 엔도좀 탈출 이전의 입자에 담지된 산화철의 총 R 2 자기이완율과 엔도좀 탈출로 입자에서 상기 세포로 방출된 산화철의 총 R 2 자기이완율의 차를 얻는 단계를 더 포함하는, 약물전달입자의 엔도좀 탈출 효율 분석방법:
    [수학식 2]
    {(입자에 담지된 산화철의 총 자기이완율) - (입자 내에서 세포로 방출된 자유 산화철의 총 자기이완율)}=
    세포 내 산화철 농도 × (입자에 담지된 산화철의 단위 농도당 자기이완율 - 자유 산화철의 단위 농도당 자기이완율).
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 입자는 지질나노입자, 리포좀, 마이셀, 폴리머 나노입자, 덴드리머나노입자, DNA 나노구조체, 금속나노입자, 탄소나노튜브, 풀러렌 및 바이러스유사입자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 약물전달입자의 엔도좀 탈출 효율 분석방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 입자의 크기는 50nm 내지 250nm인, 약물전달입자의 엔도좀 탈출 효율 분석방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 산화철 크기는 1nm 내지 20nm인, 약물전달입자의 엔도좀 탈출 효율 분석방법.
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