KR102262260B1 - 엔도좀 탈출능을 갖는 펩티드 핵산 복합체 및 이의 용도 - Google Patents

엔도좀 탈출능을 갖는 펩티드 핵산 복합체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생활성 핵산을 세포 내에 도입할 수 있는 새로운 구조의 핵산 복합체, 이를 포함하는 질병의 치료 또는 진단용 조성물 및 이를 이용한 표적 유전자 발현 조절 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 엔도좀 탈출을 도와주는 물질을 포함하는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 상보적으로 결합된 핵산 복합체, 이를 포함하는 질병의 치료 또는 진단용 조성물, 표적 유전자 발현 조절용 조성물 및 이를 이용한 표적 유전자 발현 조절 방법에 관한 것이다.
본 발명의 구조식 (1)에 따른 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 핵산 복합체는 생활성 핵산의 안정성을 높이고, 생활성 핵산의 자가 응집(self-aggregation) 등으로 인한 침전 등의 손실을 감소시킬 수 있으며, 세포 내 생활성 핵산의 전달 효율을 높이고, 표적 유전자의 발현을 용이하게 조절할 수 있다. 또한, 상기 핵산 복합체는 엔도좀 탈출을 도와주는 물질을 포함함으로써, 세포내재화에 의해 세포 내부로 침투한 핵산 복합체가 세포질에서 효과적으로 활성을 나타내도록 하는 데 유용하다.

Description

엔도좀 탈출능을 갖는 펩티드 핵산 복합체 및 이의 용도{Peptide Nucleic Acid Complex with Endosome Escape Ability and Uses thereof}
본 발명은 생활성 핵산을 세포 내에 도입할 수 있는 새로운 구조의 핵산 복합체, 이를 포함하는 질병의 치료 또는 진단용 조성물 및 이를 이용한 표적 유전자 발현 조절 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 엔도좀 탈출을 도와주는 물질을 포함하며 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 상보적으로 결합된 핵산 복합체, 이를 포함하는 질병의 치료 또는 진단용 조성물, 표적 유전자 발현 조절용 조성물 및 이를 이용한 표적 유전자 발현 조절 방법에 관한 것이다.
전통적으로 새로운 약제를 탐색하는데 있어, 컴퓨터 연구를 통한 다양한 화합물을 스크리닝하는 것을 기본으로 하며, 스크리닝된 화합물의 대다수는 단백질을 표적으로 한다.
전통적인 약제와 다르게 핵산 약제는 표적 특이적 전령 RNA(messenger RNA, mRNA)의 발현을 억제하므로, 단백질을 표적으로 하는 기존 약제로 치료가 불가능 했던 연구 영역을 다룰 수 있게 되었다(Kole R. 등 Nature Rev. Drug Discov. 2012; 11; 125-140., Wilson C. 등 Curr. Opin. Chem. Bio. 2006; 10: 607-614.).
올리고 핵산(Oligo nucleic acid)을 기반으로 유전자 발현 조절의 뛰어난 효과 및 다양한 용도에도 불구하고, 핵산을 기반으로 하는 치료제를 개발하기 위해서는 극복해야 할 방해물이 다수 존재한다. 예를 들면, 올리고 핵산은 핵산분해효소(nuclease) 등에 의한 손상의 위험이 있으며, 올리고 핵산의 전기적 성질(전하)과 크기로 인하여 수동 확산(passive diffusion)에 의한 세포막 투과가 불가능한 점 등이 있다. 상기 문제점들을 해소하기 위하여, 핵산의 변형을 통한 생물학적 안정성을 확보하려는 노력이 계속되고 있으며, 변형된 인공핵산(Artificial Nucleic Acid)의 경우 생물학적인 활성의 손실 없이 표적 핵산과의 친화성을 높이는 것이 가능하게 되었다.
변형된 인공핵산의 한 종류인 펩티드 핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA)은 (2-아미노에틸)-글리신 펩티드 백본((2-aminoethyl)-glycine peptide backbone)이 도입된 인공 핵산으로, 상보적인 염기 서열을 가지는 RNA 및 DNA에 강하게 결합하는 성질을 가지고 있다. 특히, 상기 펩티드 핵산은 핵산분해효소에 대해 저항성이 있고, 생물학적 안정성이 높아 다양한 올리고 핵산을 기반으로 하는 치료제 관련 연구가 수행되고 있다. 하지만 상기 펩티드 핵산은 전기적 중성을 가지는 특성으로 세포 내 도입이 어려운 단점을 가지고 있다(Joergensen M. 등 Oligonucleotides 2011, 21; 29-37.).
약제로서의 성능 및 장점으로 인하여 핵산을 이용한 다양한 임상시험이 진행되고 있고, 증가하는 핵산 기반 치료제의 용도에도 불구하고 세포 내 도입을 위한 운반체의 사용은 극히 제한적이다. 예를 들어, 나노입자(nanoparticle), 양성 리포좀(cationic liposome) 및 폴리머 나노입자(polymeric nanoparticle)를 사용하는 올리고 핵산을 기반으로 하는 약제의 세포 또는 조직 내로의 운반 전략(방법)을 사용한 임상시험이 진행되고 있으나, 대다수의 경우 운반 시스템을 포함하지 않고, 비경구적인 방법인 근육주사, 안구(ocular) 투여, 피하주사 등의 투여 경로(administration route)로 핵산의 직접 도입이 주를 이루고 있다.
또한, 올리고 핵산 자체의 세포막 투과 능력은 상당히 낮으며, 특히 DNA 또는 RNA는 음전하를 띄고 있기 때문에, 세포의 소수성 인지질 이중막을 통과하지 못하므로 단순 확산을 통한 세포 내 전달이 어렵다. 레트로바이러스(Retrovirus) 혹은 AAV(adeno-associated virus) 등의 바이러스 운반체의 사용은 올리고 핵산의 세포 내 도입을 가능하게 하지만, 의도치 않은 면역활성과 발암유전자(oncogene)의 재조합 가능성 등의 위험성이 있다(Couto L. B. 등 Curr. Opin. Pharmacol. 2010, 5; 534-542.).
이러한 이유로 세포독성이 적고, 면역활성이 낮은 비-바이러스성 올리고 핵산을 기반으로 하는 핵산 운반체 개발의 중요성이 더욱 커지고 있으며, 그 결과로 양전하성 지질(cationic lipid), 리포좀(liposome, 안정된 핵산 지질 입자(stable nucleic acid lipid particle, SNALP), 폴리머 및 세포-투과 입자(cell-penetrating peptide)를 이용한 세포 도입 기법이 개발되고 있다(Zhi D. 등 Bioconjug. Chem. 2013, 24; 487-519., Buyens K. 등 J. Control Release, 2012, 158; 362-70., ROSSI, J. J. 등 Gene Ther. 2006, 13: 583-584., Yousefi A. 등 J. Control Release, 2013, 170; 209-18., Trabulo S. 등 Curr. Pharm. Des. 2013, 19; 2895-923.).
이러한 핵산전달 기법은 기능성 잔기를 직접적인 결합으로 가지고 있으며, 복합체 형성을 위한 단계를 포함하고, 리포좀(liposome) 구조의 엔도좀 탈출(endosome escape) 효율 및 생체독성 등의 문제점을 가지고 있어, 올리고 핵산 도입 기능의 향상과 제조 절차 및 부작용과 관련된 문제점의 해소가 필요하다.
한편, 일반적으로 생활성 핵산은 막수용체 세포내재화(receptor-mediated endocytosis)를 통해 엔도좀(endosome)이라는 세포 소기관의 형성을 통해서 세포 내로 유입된다. 효과적인 생활성 핵산의 발현 및 치료를 위해서는 엔도좀 내부의 생활성 핵산이 엔도좀을 탈출하여 핵으로 이동하거나 세포질에서 그 기능을 수행할 수 있어야 한다. 따라서, 엔도좀에서 세포질로 탈출하는 과정, “엔도좀 탈출(endosome escape)”이 필수적이다(D. W. Pack, A. S. Hoffman, S. Pun, P. S. Stayton, “Design and development of polymers for gene delivery,” Nat. Rev. Drug. Discov., 4, 581-593, 2005).
이와 관련하여, 본 발명자들은 생활성 핵산과 전체적으로 양전하를 가지도록 변형된 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체가 세포투과성(cell permeability)이 놀랍게 향상되며, 이를 이용하여 표적 유전자의 발현을 매우 효율적으로 조절할 수 있음을 확인하고, 이러한 세포 독성이 낮고, 생활성 핵산의 세포투과성 및 유전자 발현 조절능력이 향상된 새로운 구조체에 대한 특허를 출원한 바 있다(PCT/KR2017/008636).
이후, 지속적인 연구를 통해, 상기와 같은 구조체에 엔도좀 탈출(endosome escape)을 도와주는 물질이 결합될 경우, 상기 구조체에 포함된 생활성 핵산의 세포 내에서의 활성이 현저하게 향상되는 것을 규명하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 엔도좀 탈출(endosome escape)을 도와주는 물질을 포함하는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)과 전체적으로 양전하를 가지도록 변형된 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체 및 이를 포함하는 질병의 진단 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 핵산 복합체를 포함하는 표적 유전자 발현 조절용 조성물 및 상기 핵산 복합체를 이용한 표적 유전자 발현 조절 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 하기 구조식 (1)의 구조를 가지는 핵산 복합체를 제공한다.
구조식 (1)
[ mA ≡ mC (+) ]
상기 구조식 (1)에 있어서,
A는 목적하는 유전자와 결합할 수 있는 서열 또는 목적하는 유전자 서열을 가지는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)이고,
C는 생활성 핵산과 결합할 수 있는 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이고,
'≡'는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 간의 상보적인 결합을 의미하며,
'm'은 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 엔도좀 탈출(endosome escape)을 도와주는 물질을 의미하며,
A로 표시되는 생활성 핵산은 전체적으로 음전하 또는 중성을 가지며,
C(+)는 캐리어 펩티드 핵산이 전체적으로 양전하를 가진다는 것을 의미하며,
캐리어 펩티드 핵산은 캐리어 펩티드 핵산 전체적으로 양전하를 띠도록 변형된 펩티드 핵산 단량체를 하나 이상 포함한다.
본 발명은 또한, 상기 구조식 (1)의 핵산 복합체를 포함하는 질병의 진단용 조성물 및 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 구조식 (1)의 핵산 복합체를 포함하는 표적 유전자 발현 조절용 조성물 및 표적 유전자 발현 조절 방법을 제공한다.
본 발명의 구조식 (1)에 따른 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 핵산 복합체는 생활성 핵산의 안정성을 높이고, 생활성 핵산의 자가 응집(self-aggregation) 등으로 인한 침전 등의 손실을 감소시킬 수 있으며, 세포 내 생활성 핵산의 전달 효율을 높이고, 표적 유전자의 발현을 용이하게 조절할 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 핵산 복합체에서의 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 결합은 생활성 핵산의 표적 유전자의 염기서열 존재 하에서만 분리되기 때문에 상기 생활성 핵산의 단독 세포 내 도입에 비해 표적 유전자에 대한 선택성 및 특이도가 높고, 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산 간의 다양한 구조 조합을 통해 결합력을 조절하여 복합체를 제조할 수 있으므로 생활성 핵산의 세포 내 또는 세포 외에서 작용시점의 조절이 가능한 장점이 있다.
또한, 상기 핵산 복합체는 엔도좀 탈출을 도와주는 물질을 포함함으로써, 세포내재화에 의해 세포 내부로 침투한 핵산 복합체가 세포질에서 효과적으로 활성을 나타내도록 하는 데 유용하다.
도 1a 내지 1e는 VEGF 특이적 생활성 펩티드 핵산을 포함하는 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체를 이용하여 인간유래 자궁암 세포주에서의 세포 내로 침투한 핵산 복합체가 세포질로 효과적으로 나오는 것을 확인한 결과, 인간유래 유방암 세포주와 폐암 세포주의 세포 생존율 변화 및 VEGF와 그 하위 경로 단백질의 발현이 억제 및 세포 사멸 유도를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
(a) HeLa에서 핵산 복합체의 세포 투과성 및 엔도좀 탈출의 변화
(b) MDA-MB-231 세포 생존율의 변화,
(c) A549 세포 생존율의 변화,
(d) VEGF 및 하위 경로 단백질의 발현 변화,
(e) VEGF 억제에 따른 세포 사멸 유도 분석.
도 2a 내지 2g는 VEGF 특이적 생활성 펩티드 핵산을 포함하는 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체를 이용하여 인간 유방암 세포주가 이식된 마우스에서의 종양 성장 억제 효능을 입증한 결과를 나타낸 도면이다.
(a) In vivo animal test design 도식화,
(b) 마우스의 체중 변화,
(c) 종양 부피의 변화,
(d) 종양 무게의 변화,
(e) 종양의 외관 변화,
(f) 간독성 지표의 변화,
(g) VEGF 및 하위 경로 단백질의 발현 변화.
도 3은 PD-L1 특이적 생활성 펩티드 핵산을 포함하는 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체를 이용하여 인간유래 유방암 세포주가 이식된 마우스에서의 종양 성장 억제 효능을 입증한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 Androgen receptor 특이적 생활성 펩티드 핵산을 포함하는 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체를 이용하여 인간유래 전립선암 세포주에서 androgen receptor와 그 하위 경로 단백질 발현이 억제되는 것을 확인한 도면이다.
(A) 생활성 펩티드 핵산(서열번호 12 또는 서열번호 13)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 16 내지 서열번호 19 또는 서열번호 24 내지 서열번호 27)으로 이루어진 복합체를 사용한 경우,
(B) 생활성 펩티드 핵산(서열번호 14 또는 서열번호 15)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 20 내지 서열번호 23 또는 서열번호 28 내지 서열번호 31)으로 이루어진 복합체를 사용한 경우.
도 5a 내지 5c는 clusterin 특이적 생활성 펩티드 핵산을 포함하는 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체를 이용하여 인간 전립선암의 세포 생존율 변화 및 clusterin과 관련된 경로 단백질의 발현의 억제를 확인한 도면이다.
(a) 생활성 펩티드 핵산(서열번호 32 또는 서열번호 33)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 36 내지 서열번호 39 또는 서열번호 44 내지 서열번호 47)으로 이루어진 복합체를 사용한 경우, PC-3 세포 생존율의 변화,
(b) 생활성 펩티드 핵산(서열번호 34 또는 서열번호 35)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 40 내지 서열번호 43 또는 서열번호 48 내지 서열번호 51)으로 이루어진 복합체를 사용한 경우, PC-3 세포 생존율의 변화,
(c) clusterin 및 관련 경로 단백질의 발현 변화,
(1) 생활성 펩티드 핵산(서열번호 32 또는 서열번호 33)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 36 내지 서열번호 39 또는 서열번호 44 내 서열번호 47)으로 이루어진 복합체를 사용한 경우,
(2) 생활성 펩티드 핵산(서열번호 34 또는 서열번호 35)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 36 내지 서열번호 39 또는 서열번호 44 내지 서열번호 47)으로 이루어진 복합체를 사용한 경우.
도 6a 내지 6f는 VEGF 특이적 생활성 펩티드 핵산을 포함하는 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체를 이용하여 인간유래 망막색소상피 세포주의 세포 생존율 변화 및 VEGF와 그 하위 경로 단백질의 발현의 억제 및 유리체내주사 및 안구점안액을 통한 쥐의 망막에서의 혈관의 생성이 억제되는 것을 확인한 도면이다.
(a) ARPE-19 세포 생존율의 변화,
(b) VEGF 및 하위 경로 단백질의 발현 변화,
(c) 생활성 펩티드 핵산(서열번호 2)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 8)으로 이루어진 복합체를 사용한 경우, 유리체내주사를 한 후 일주일 뒤 쥐의 망막에서 혈관 생성의 확인,
(d) 및 (e) 생활성 펩티드 핵산(서열번호 2)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 6 또는 서열번호 8)으로 이루어진 복합체를 사용한 경우, 유리체내주사를 통한 쥐의 망막에서 혈관 생성의 확인,
(f) 생활성 펩티드 핵산(서열번호 2)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 8)으로 이루어진 복합체를 사용한 경우, 안구점안액을 통한 쥐의 망막에서 혈관 생성의 확인.
도 7은 PDE4B 특이적 생활성 펩티드 핵산을 포함하는 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체를 이용하여 인간유래 호흡기 상피 세포 및 인간유래 폐암 세포주에서 PDE4B와 염증 관련 단백질 발현이 억제되는 것을 확인한 도면이다.
(A) 생활성 펩티드 핵산(서열번호 52 또는 서열번호 55)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 56 내지 서열번호 63)으로 이루어진 복합체를 사용한 경우, NCI-H292에서 PDE4B 및 염증 단백질의 발현 확인,
(B) 생활성 펩티드 핵산(서열번호 52 또는 서열번호 55)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 56 내지 서열번호 63)으로 이루어진 복합체를 사용한 경우, A549에서 PDE4B 및 염증 단백질의 발현 확인.
도 8a 내지 8f는 TLR2 특이적 생활성 펩티드 핵산을 포함하는 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체를 이용하여 아토피와 관련된 TLR2의 발현을 억제하는 것을 확인한 도면이다.
(a) 생활성 펩티드 핵산(서열번호 64 또는 서열번호 65)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 67 내지 서열번호 71)으로 이루어진 복합체를 사용한 경우, HaCaT에서의 세포 생존율의 변화,
(b) 생활성 펩티드 핵산(서열번호 64 또는 서열번호 65)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 66 내지 서열번호 71)으로 이루어진 복합체를 사용한 경우, HaCaT에서의 TLR2 및 하위 유전자의 단백질의 억제,
(c) 생활성 펩티드 핵산(서열번호 65)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 67 또는 서열번호 70)으로 이루어진 복합체를 사용한 경우, 약효 평가 동물에서의 아토피 피부염 표현형의 변화,
(d) 약효 평가 동물의 혈청 내 IgE 및 TARC 농도 변화,
(e) 약효 평가 동물의 H&E를 통한 아토피 표현형의 변화,
(f) 약효 평가 동물에서의 면역염색을 통한 조직에서의 염증 마커의 변화.
도 9a 및 9b는 Smad3 특이적 생활성 펩티드 핵산을 포함하는 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체를 이용하여 피부 재생과 관련된 Smad3의 발현을 억제하는 것을 확인한 도면이다.
(a) 생활성 펩티드 핵산(서열번호 73)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 75 또는 서열변호 77 내지 서열번호 78)으로 이루어진 복합체를 사용한 경우, HaCaT에서의 상처 후 회복 능력 분석,
(b) 생활성 펩티드 핵산(서열번호 72 또는 서열번호 73)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 74 내지 서열번호 78)으로 이루어진 복합체를 사용한 경우, HaCaT에서의 Smad3 유전자의 단백질의 억제.
도 10a 및 10b는 TIEG1 특이적 생활성 펩티드 핵산을 포함하는 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체를 이용하여 상처 후 비대증과 관련된 TIEG1의 발현을 억제하는 것을 확인한 도면이다.
(a) 생활성 펩티드 핵산(서열번호 79 또는 서열번호 80)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 81 내지 서열번호 84)으로 이루어진 복합체를 사용한 경우, KEL-FIB에서의 세포 생존율 변화,
(b) 생활성 펩티드 핵산(서열번호 79 또는 서열번호 80)과 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 81 내지 서열번호 84)으로 이루어진 복합체를 사용한 경우, KEL-FIB에서의 TIEG1 유전자 및 하위 유전자의 단백질의 변화.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 일 실시예에서, 엔도좀 탈출을 도와주는 물질을 포함하는 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 상보적으로 결합된 핵산 복합체를 이용하여, 세포 내 생활성 핵산의 전달 효율을 높이고, 표적 유전자 발현을 용이하게 조절할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 하기 구조식 (1)의 구조를 가지는 핵산 복합체에 관한 것이다.
구조식 (1)
[ mA ≡ mC (+) ]
상기 구조식 (1)에 있어서,
A는 목적하는 유전자와 결합할 수 있는 서열 또는 목적하는 유전자 서열을 가지는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)이고,
C는 생활성 핵산과 결합할 수 있는 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이고,
'≡'는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 간의 상보적인 결합을 의미하며,
'm'은 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 엔도좀 탈출(endosome escape)을 도와주는 물질을 의미하며,
A로 표시되는 생활성 핵산은 전체적으로 음전하 또는 중성을 가지며,
C(+)는 캐리어 펩티드 핵산이 전체적으로 양전하를 가진다는 것을 의미하며,
캐리어 펩티드 핵산은 캐리어 펩티드 핵산 전체적으로 양전하를 띠도록 변형된 펩티드 핵산 단량체를 하나 이상 포함한다.
본 발명에 있어서, “생활성 핵산”은 발현을 감소시키고자 하는 목적하는 표적 유전자와 결합할 수 있는 상보적인 서열, 특히 그러한 목적하는 표적 유전자의 mRNA에 결합할 수 있는 상보적인 서열을 가지거나, 발현시키고자 하는 표적 유전자의 발현을 촉진하는 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 핵산으로, 해당 유전자의 발현을 억제하거나, 촉진하는 등의 유전자 발현조절에 관여하는 핵산을 의미하며, 발현을 감소 또는 증가시키고자 하는 표적 유전자에 상보적인 서열을 가지는 핵산이거나, pre-mRNA, miRNA, mRNA 등 단일가닥 RNA 서열에 상보적인 서열의 핵산일 수 있다.
특히, 본 발명에서의 “생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)”은 생체 외(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 표적 유전자 및 이를 포함하는 염기서열과 결합하여 해당 유전자의 고유 기능(예를 들어, 전사체(transcript) 발현 또는 단백질 발현)을 활성화 또는 저해시키거나, pre-mRNA의 스플라이싱(splicing)을 조절(예를 들어, 엑손스키핑(exon skipping))하는 등의 기능을 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 염기서열은 유전자 조절부위(gene regulatory sequence) 또는 유전자 부위(gene coding sequence) 또는 스플라이싱 조절 부위(splicing regulatory sequence)인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 유전자 조절부위는 프로모터, 전사 인핸서, 5' 비번역 영역, 3' 비번역 영역, 바이러스 팩키징 서열, 및 선택 마커에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 유전자 부위는 엑손 또는 인트론일 수 있으며, 상기 유전자 부위는 유전자의 전사 개시 부위의 10, 5, 3, 1kb 또는 500, 300, 200bp 내에, 예를 들어, 개시 부위의 상류(upstream) 또는 하류(downstream)에 있을 수 있다. 또한, 상기 스플라이싱 조절부위는 exon skipping, cryptic splicing, pseudo-splice site activation, intron retention, alternative splicing deregulation 관련 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, “캐리어 펩티드 핵산”은 생활성 핵산과 일부 혹은 전부의 염기가 상보적으로 결합하여 기능성을 부여하는 핵산을 의미하며, 본 발명에서 사용되는 캐리어 펩티드 핵산은 펩티드 핵산(PNA: Peptide Nucleic Acid) 뿐 아니라, 이와 유사한 변형된 핵산을 사용할 수 있으며, 펩티드 핵산이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산은 각각의 핵산의 5'-말단 및/또는 3'-말단에 엔도좀 탈출(endosome escape)을 도와주는 물질이 결합된 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산 각각의 5'-말단에 엔도좀 탈출을 도와주는 물질이 결합된 형태가 사용될 수 있다.
상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산과 엔도좀 탈출을 도와주는 물질은 공유결합으로 연결되는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, “엔도좀 탈출(endosome escape)을 도와주는 물질”은 엔도좀 내부의 삼투압을 증가시키거나, 엔도좀의 막을 불안정화 시키는 방법에 의하여 생활성 핵산의 엔도좀에서 탈출을 도와주는 것을 특징으로 할 수 있다. 생활성 핵산이 보다 효율적이고 빠르게 핵이나 세포질로 이동하여 표적 유전자를 만나 작용하도록 도와주는 것을 의미한다(D. W. Pack, A. S. Hoffman, S. Pun, P. S. Stayton, “Design and development of polymers for gene delivery,” Nat. Rev. Drug. Discov., 4, 581-593 (2005)).
상기 엔도좀 탈출을 도와주는 물질은 생활성 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산과 5' 말단 또는 3' 말단에 링커 매개의 연결 방법으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 엔도좀 탈출을 도와주는 물질은 펩티드, 지질 나노물질(lipid nanoparticles), 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles), 고분자 나노구(polymer nanospheres), 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles), 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles), 양이온 고분자(cationic polymer) 및 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
하나의 바람직한 예로서, 본 발명에 있어서, 상기 펩티드는 GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(서열번호 85), GLFDIIKKIAESF(서열번호 86) 및 Histidine(10)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
하나의 바람직한 예로서, 본 발명에 있어서, 상기 지질 나노물질(lipid nanoparticles)은 Lipid, phospholipids, cetyl palmitate, poloxamer 18, Tween 85, tristearin glyceride 및 Tween 80로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고,
상기 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles)은 poly(amidoamine) 또는 polyethylenimine (PEI)인 것을 특징으로 할 수 있으며,
상기 고분자 나노구(polymer nanospheres)는 polycaprolactone, poly(lactide-co-glycolide, polylactide, polyglycolide, poly(d,l-lactide), chitosan 및 PLGA-polyethylene glycol로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고,
상기 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles)은 Fe2O3 Fe3O4, WO3 및 WO2.9로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며,
본 발명에 있어서, 상기 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles)은 1-(aminoethyl)iminobis[N-(oleicylcysteinyl-1-amino-ethyl)propionamide], N-alkylated derivative of PTA 및 3, 5-didodecyloxybenzamidine로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 하나의 바람직한 예로서, 본 발명에 있어서, 상기 양이온 고분자(cationic polymer)는 vinylpyrrolidone-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate acid copolymer diethyl sulphate, polyisobutylene 및 poly(N-vinylcarbazole)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며,
상기 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)는 polyacids, poly(acrylic acid), poly(methacrylic acid) 및 hydrolyzed polyacrylamide로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 각각 2 내지 50개, 바람직하게는 5 내지 30개, 더욱 바람직하게는 10 내지 25개, 가장 바람직하게는 15 내지 17개의 핵산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 생활성 핵산은 천연(natural) 핵산 염기 및/또는 변형된 핵산 단량체로 이루어져 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산은 DNA, RNA 또는 변형된 핵산인 PNA(peptide nucleic acid), PMO(phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide), LNA(locked nucleic acid), GNA(glycol nucleic acid), TNA(threose nucleic acid), 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), 앱타머(aptamer), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), 리보자임(ribozyme) 및 DNAzyme로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 DNA, RNA 또는 변형된 핵산인 PNA, PMO, LNA, GNA 및 TNA로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어, 상기 생활성 핵산에 사용된 단량체가 PNA일 경우, 생활성 펩티드 핵산이라고 하며, 다른 단량체가 사용된 경우에도 동일한 방식으로 부른다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 상기 생활성 핵산과 염기서열 일부 혹은 전부가 상보적인 서열로 구성되는 것을 특징으로 할 수 있다. 특히, 캐리어 펩티드 핵산은 유니버설 염기(universal base)를 하나 이상 포함할 수 있으며, 캐리어 펩티드 핵산 모두가 유니버설 염기로 이루어질 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 포스포디에스테르(phosphodiester), 2' 0-메틸(2' 0-methyl), 2' 메톡시-에틸(2' methoxy-ethyl), 포스포르아미데이트(phosphoramidate), 메틸포스포네이트(methylphosphonate) 및 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 작용기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산 각각은 전기적 특성이 전체적으로, 양전하(양성), 음전하(음성) 또는 중성 전하를 가지는 것을 특징으로 하는 복합체일 수 있다.
상기 전기적 특성의 표현에 있어, “전체적으로”의 의미는 개별 염기의 전기적 특성이 아닌 전체적인 생활성 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산 각각의 전하가 외부에서 볼 때 전체적인 전기적 특성을 의미하는 것으로, 예를 들어, 생활성 핵산 내의 일부 단량체가 양성을 가지더라도 음성을 가지는 단량체의 개수가 더 많이 존재하는 경우에는 생활성 핵산은 “전체적으로” 전기적 특성을 볼 때 음전하를 가지게 되는 것이며, 캐리어 펩티드 핵산 내의 일부 염기 및/또는 백본(backbone)이 음성을 가지더라도 양성을 가지는 염기 및/또는 백본의 개수가 더 많이 존재하는 경우에는 캐리어 펩티드 핵산은 “전체적으로” 전기적 특성을 볼 때 양전하를 가지게 되는 것이다.
이러한 관점에서, 본 발명의 구조식 (1)의 구조를 가지는 핵산 복합체는 전체적으로 양전하를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체에 있어서, 바람직하게는 상기 생활성 핵산은 전체적으로 전기적 특성을 볼 때 음전하 또는 중성의 특성을 가지며, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 전기적 특성을 볼 때 양전하 특성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 전기적 특성의 부여는 변형된 펩티드 핵산 단량체를 사용할 수 있고, 변형된 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 캐리어 펩티드 핵산으로 리신(Lysine, Lys, K), 아르기닌(Arginine, Arg, R), 히스티딘(Histidine, His, H), 디아미노 부티르산(Diamino butyric acid, DAB), 오르니틴(Ornithine, Orn) 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양전하의 아미노산을 포함하고, 음전하를 가지는 캐리어 펩티드 핵산으로 음전하의 아미노산인 글루타민산(Glutamic acid, Glu, E) 또는 아미노산 유사체의 음전하의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 양전하를 가지도록 1개 이상의 gamma- 또는 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 gamma- 혹은 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체는 전기적 양성을 가지도록 리신(Lysine, Lys, K), 아르기닌(Arginine, Arg, R), 히스티딘(Histidine, His, H), 디아미노 부티르산(Diamino butyric acid, DAB), 오르니틴(Ornithine, Orn) 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양전하를 가지는 아미노산을 backbone에 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 전하 부여를 위한 펩티드 핵산 단량체의 변형은 상기 backbone 변형 이외에도 nucleobase가 변형된 펩티드핵산 단량체를 사용할 수 있다. 바람직하게는 전기적 양성을 가지도록 amine, triazole, imidazole moeity를 nucleobase에 포함하거나, 전기적 음성을 가지도록 carboxylic acid를 염기에 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산의 변형 펩티드 핵산 단량체는 음전하를 backbone 혹은 nucleobase에 더 포함할 수 있지만, 변형 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 단량체가 음전하를 가지는 단량체에 비해 더 많이 포함되어 전체적으로 캐리어 펩티드 핵산의 전하가 양성이 되는 것이 바람직하다.
바람직하게는 본 발명에 따른 상기 구조식 (1)의 핵산 복합체는 전체적으로 양의 전하를 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 상기 구조식 (1)의 핵산 복합체에 있어, 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머 또는 형광/발광 표지자 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질이 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산에 결합된 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 상기 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머 및 이미징을 위한 형광/발광 표지자 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질은 상기 캐리어 펩티드 핵산에 결합된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머, 소광자, 형광 표지자 및 발광 표지자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질과 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산의 결합은 단순 공유결합 또는 링커로 매개된 공유결합인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다(표 1 참조). 바람직하게는, 상기 핵산 운반체에 결합된 세포투과, 용해도, 안정성, 운반 및 이미징 관련 물질(예컨대, 소수성 잔기 등)은 표적 유전자의 발현을 조절하는 생활성 핵산과 독립적으로 존재하게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 상보적인 결합 형태는 크게 역평행결합(antiparallel binding)과 평행결합(parallel binding)의 형태를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 상보적인 결합 형태는 생활성 핵산의 목적서열(생활성 핵산과 상보적인 서열) 존재 하에서 분리되는 구조를 가진다.
상기 역평행결합과 평행결합은 DNA-DNA 또는 DNA-PNA의 결합 방식에 있어, 5'-방향성과 3'-방향성에 따라 결정된다. 역평행결합은 일반적인 DNA-DNA 또는 DNA-PNA의 결합 방식으로, 본 발명에 따른 구조식 (1)의 핵산 복합체를 예로 들어 설명하면, 생활성 핵산은 5'에서 3' 방향으로, 캐리어 펩티드 핵산은 3'에서 5' 방향으로 서로 결합되는 형태를 의미한다. 평행결합은 역평행결합에 비해서는 결합력이 다소 떨어지는 형태로, 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 모두가 5'에서 3' 방향 또는 3'에서 5' 방향으로 서로 결합되는 형태를 의미한다.
본 발명에 따른 구조식 (1)의 핵산 복합체에 있어서, 바람직하게는 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력은 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자, 특히 목적 유전자의 mRNA와의 결합력보다 낮은 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 결합력은 융해온도, melting temperature 또는 Tm에 의해 결정된다.
상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력(융해온도, melting temperature, Tm)이 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자, 특히 목적 유전자의 mRNA와의 결합력보다 낮게 하기 위한 구체적인 방법의 예로는, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 평행 결합(Parallel binding) 또는 부분 특이결합(Partial specific binding)하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 예로서 상기 캐리어 펩티드 핵산이 링커, 유니버설 염기(universal base) 및 생활성 핵산의 대응되는 염기와 상보적이지 않은 염기를 가지는 펩티드 핵산 염기로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 펩티드 핵산 염기를 갖는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다(표 1 참조).
본 발명에 있어서, 상기 유니버설 염기(universal base)는 아데닌(adenine), 구아닌(guanine), 사이토신 (cytosine), 티민(thymine), 우라실(Uracil) 등의 천연 염기와 선택성 없이 결합하고, 상보적인 결합력보다 낮은 결합력을 가지는 염기로 이노신 PNA(inosine PNA), 인돌 PNA(indole PNA), 나이트로인돌 PNA(nitroindole PNA) 및 무염기(abasic)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 사용할 수 있으며, 바람직하게는 이노신 PNA를 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 결합 예시
Type 복합체 구조 특징
Ⅰ 캐리어 펩티드 핵산 5'-[NNNNN*NNNNNNNNN*NNNNN]-3' Partial match 1 (Substitution)
생활성 핵산 3'-[NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN]-5'
Ⅱ 캐리어 펩티드 핵산 5'-[NNNNNNNNNNNNNNNNNNN]-3' Partial match 2 (Insertion/Deletion)
생활성 핵산 3'-[NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN]-5'
Ⅲ 캐리어 펩티드 핵산 5'-[NNNNNNN$$$$NN$NNNNNNN]-3' Universal base
생활성 핵산 3'-[NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN]-5'
Ⅳ 캐리어 펩티드 핵산 5'-[NNNNNNNNN=NNNNNNNNN]-3' Linker
생활성 핵산 3'-[NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN]-5'
Ⅴ 캐리어 펩티드 핵산 5'-[NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN]-3' Parallel binding
생활성 핵산 5'-[NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN]-3'
상기 표 1에서, N은 핵산의 염기(ATGC)이며, *는 안티센스 핵산(antisense nucleic acid) 서열과 상보적이지 않은 서열이고, $는 유니버설 염기(universal base)이이며, =은 링커이고, 5'-, 3'-은 핵산(염기)의 방향성을 나타낸다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체의 기능 조절을 위한 핵산들의 결합 형태와 전기적 성질 조합을 제공하고, 상기 핵산의 결합 형태와 전기적 성질 조합으로 입자 크기 및 작용 시점을 조절하고, 세포투과성, 용해도 및 특이도를 향상시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 결합력 조절을 통해, 목적 유전자의 존재 하에서, 생활성 펩티드 핵산이 목적 서열과 결합되는 시점(생활성 핵산의 목적 서열로의 치환되는 시점, 표적 특이적 분리 및 결합 시점) 등의 조절이 가능하다.
본 발명에 따른 구조식 (1)의 핵산 복합체에 있어서, 생활성 핵산의 목적 유전자로의 치환(strand displacement) 시점, 표적 특이적 분리 및 결합(target specific release and bind) 시점의 조절은 복합체의 비특이 결합을 위한 캐리어 펩티드 핵산의 비특이 염기, 유니버설 염기 및 linker의 유무, 개수 및 위치에 의하여 조절이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 펩티드 복합체의 상보적인 결합의 형태인 평행(parallel) 또는 역평행(antiparallel) 형태의 결합 등과 상기 조건의 조합에 의하여 조절이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 구조식 (1)의 핵산 복합체의 입자는 5 nm 내지 300 nm, 바람직하게는 10 nm 내지 80 nm, 가장 바람직하게는 15 nm 내지 70 nm의 크기를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체의 입자 크기는 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 전하 밸런스(charge balance)를 조절함으로써 조절되는 것을 특징으로 할 수 있다. 구체적으로는 캐리어 펩티드 핵산의 양전하가 증가하면 입자의 크기가 작아지나, 캐리어 펩티드 핵산의 양전하가 일정 수준을 넘게 되면 입자의 크기가 커지는 특징을 가지게 된다. 또한, 입자 크기를 결정하는 다른 중요한 요소로 복합체를 이루는 생활성 펩티드 핵산 전하에 따른 전반적인 캐리어 펩티드 핵산과의 적절한 전하 밸런스에 의해서 입자 크기가 결정된다.
본 발명에 따른 캐리어 펩티드 핵산의 양전하는 1개 내지 7개(양전하를 가지는 단량체가 1개 내지 7개 포함됨을 의미한다), 바람직하게는 2개 내지 5개, 가장 바람직하게는 2개 내지 3개이며, 생활성 핵산의 전하는 전하 밸런스의 넷 차지(net charge)가 음전하 0개 내지 5개, 바람직하게는 0개 내지 3개이다.
본 발명에 있어서, 상기 구조식 (1)의 핵산 복합체는 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 적절한 조건에서 혼성화됨으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 “혼성화”는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 결합 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산의 양 말단에는 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자(quencher)가 결합될 수 있다. 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 CY5을 사용한다. 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 구조식 (1)의 구조를 가지는 핵산 복합체를 포함하는 질병의 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 구조식 (1)의 구조를 가지는 핵산 복합체를 포함하는 질병의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 구조식 (1)의 구조를 가지는 핵산 복합체를 예방 또는 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 “표적 유전자”는 활성, 억제 또는 표지 하고자 하는 핵산 서열(염기서열)을 의미하며, 용어 “표적 핵산”과 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
상기 표적 유전자를 포함하는 표적 핵산(염기서열)이 생체 외(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 상기 복합체와 접촉(결합)하게 되면, 캐리어 펩티드 핵산으로부터 생활성 핵산이 분리되어 생물학적 활성을 나타내게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 구조식 (1)의 구조를 가지는 핵산 복합체를 이용하여 진단 또는 예방, 치료할 수 있는 질병은, 상기 핵산 복합체 내의 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자에 따라 결정될 수 있으며, 바람직하게는 암 또는 종양이지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 용어 “치료용 조성물”은 "의약(약제학적, 약학적) 조성물(pharmaceutical composition)"과 혼용될 수 있으며, 본 발명의 생활성 핵산 및 상기 핵산과 결합하는 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 핵산 복합체를 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 치료용 조성물은 표준 의약 실시에 따라 경구 또는 비경구 투여 제형의 형태로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 보조제 또는 희석제 등의 첨가물을 함유할 수 있다.
용어 "약학적으로 허용되는(physiologically acceptable)"은 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 특성을 의미한다.
용어 "담체(carrier)"는 세포 또는 조직 내로의 복합체의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
용어 "희석제(diluent)"는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.
여기에 사용된 복합체를 함유하는 화합물들은 인간 환자에게 그 자체로서 또는 병용 요법(combination therapy)에서와 같이 다른 활성 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형제와 함께 혼합된 의약 조성물로서 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용에 적합한 의약 조성물에는, 활성 성분들이 그것의 의도된 목적을 달성하기에 유효한 양으로 함유되어 있는 조성물이 포함된다. 더욱 구체적으로, 치료적 유효량은 치료될 객체의 생존을 연장하거나, 질환의 증상을 방지, 경감 또는 완화시키는데 유효한 화합물의 량을 의미한다. 치료적 유효량의 결정은, 특히, 여기에 제공된 상세한 개시 내용 측면에서, 통상의 기술자의 능력 범위 내에 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은, 상기 복합체 또는 이의 의약으로 허용 가능한 염을 포함하는 의약 조성물의 투여(또는 도포)로 항암 활성을 나타내고, 암의 증식의 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는, 상기 복합체 또는 이의 의약으로 허용 가능한 염을 포함하는 의약 조성물의 투여(또는 도포)로 암 질환의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체를 포함하는 조성물로 예방 또는 치료할 수 있는 질병은 종양 또는 암, 염증성 질환, 노인성 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 희귀질환 및 중증질환, 심혈관 질환, 대사성 질환 또는 피부질환 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체를 포함하는 질병의 예방 또는 치료용 조성물이 치료할 수 있는 질병은 핵산 복합체 내에 포함된 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자에 의해 결정된다. 상기 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자의 예로는, 암 치료를 위한 표적 유전자는 VEGF, Androgen receptor, Clusterin, TGFßR2, ERBB3, ABCB1, 및 PD-L1 등이 있으며, 염증 질환을 표적으로 하는 유전자는 PDE4B 또는 Pellino-1이고, 희귀질환 및 중증질환을 표적으로 하는 유전자는 SMN2, ApoB-100, ICAM-1, ApoCIII, TTR, HTT, GHr, SOD1, ANGPTL3, PKK, miR-21, TMPRSS6, FMR1 또는 Connexin 26이다. 심혈관 질환을 표적으로 하는 유전자는 Factor XI, Apo(a), ApoCIII 또는 AGT이고, 대사성 질환을 표적으로 하는 유전자는 GCGR, ANGPTL3, miR-103/107 또는 DGAT2이다. 피부질환을 표적으로 하는 유전자는 IFI16, TLR6 또는 TIEG1가 예시될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 치료용 조성물은, 그들만 혹은 이하에서 설명하는 것과 같은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 공지의 방법으로 비경구 또는 경구 투여용 제형으로 제제화 할 수 있다. 이와 같은 제형의 구체적인 예로서는, 주사제, 연질캡슐제, 경질캡슐제, 정제, 시럽제 등의 경구제 또는 외용제를 들 수 있다.
바람직하게는 상기 핵산 복합체를 포함하는 치료용 조성물은 비경구 투여용 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 적절한 비경구 투여용 제형으로는 피하 주사, 정맥 주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사용 등에 적절한 주사액 또는 동결건조 제형이 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체를 포함하는 조성물은 피부 전달(skin delivery) 경로를 통해 투여될 수 있다. 피부 전달을 위한 제형은 수성 용액, 크림 및 연고 등에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며 피부 전달을 위해 해당 기술분야에 알려진 모든 형태의 제형이 이용 가능하다.
비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여, 본 발명에 따른 복합체를 포함하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 한 성분 또는 둘 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다. 특히, 동결건조(lyophilized)된 형태의 제형으로 제제화하여 제공하는 것이 바람직하다. 동결건조 제형 제조를 위해서 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려져 있는 방법이 사용될 수 있으며, 동결건조를 위한 안정화제가 추가될 수도 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍톤 약학 과학(Remington's pharmaceutical Science, Mack Publishing company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질병에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 치료용 조성물은 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제, 점안액 등과 같은 경구 투여 제형으로 제형화될 수 있는데, 이때 약학적으로 허용되는 하나 이상의 부형제가 첨가될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체를 포함하는 조성물은 암의 예방 또는 치료용 조성물인 것을 특징으로 할 수 있다. 치료 가능한 종양 또는 암은 특별히 제한되는 것은 아니며, 고형암 및 혈액암을 모두 포함한다. 바람직하게는 유방암, 전립선암 또는 폐암인 것을 특징으로 할 수 있다.
바람직하게는 본 발명에 따른 암 치료를 위한 핵산 복합체 내에 포함된 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자는 VEGF, PD-L1, Androgen receptor, Clusterin, TGFßR2, ERBB3, ABCB1, 및 PDE4B로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상을 예로 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 구조식 (1)의 구조를 가지는 핵산 복합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물은 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 표시되는 VEGF 특이적 생활성 펩티드 핵산 또는 서열번호 10로 표시되는 PD-L1 특이적 생활성 펩티드 핵산 및 이에 상보적인 캐리어 펩티드 핵산을 포함한다. 상기 캐리어 펩티드 핵산은 바람직하게는 서열번호 4 내지 서열번호 9(VEGF) 또는 서열번호 11(PD-L1)의 서열을 가질 수 있으며, 상기 서열 중 일부가 유니버설 염기로 치환되어 사용될 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 구조식 (1)의 구조를 가지는 핵산 복합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물은 서열번호 12 내지 서열번호 15로 표시되는 androgen receptor 특이적 생활성 펩티드 핵산 및 이에 상보적인 캐리어 펩티드 핵산을 포함한다. 상기 캐리어 펩티드 핵산은 바람직하게는 서열번호 16 내지 서열번호 31의 서열을 가질 수 있으며, 상기 서열 중 일부가 유니버설 염기로 치환되어 사용될 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 구조식 (1)의 구조를 가지는 핵산 복합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물은 서열번호 32 내지 서열번호 35로 표시되는 clusterin 특이적 생활성 펩티드 핵산 및 이에 상보적인 캐리어 펩티드 핵산을 포함한다. 상기 캐리어 펩티드 핵산은 바람직하게는 서열번호 36 내지 서열번호 51의 서열을 가질 수 있으며, 상기 서열 중 일부가 유니버설 염기로 치환되어 사용될 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 구조식 (1)의 구조를 가지는 핵산 복합체를 포함하는 조성물은 노인성 황반변성(Aged Macular Degeneration) 또는 당뇨병성 망막병증의 예방 또는 치료용 조성물인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 따른 노인성 황반변성 또는 당뇨병성 망막병증의 예방 또는 치료를 위한 핵산 복합체 내에 포함된 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자는 VEGF가 예시될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 노인성 황반변성 또는 당뇨병성 망막병증의 예방 또는 치료용 조성물은 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 표시되는 VEGF 특이적 생활성 펩티드 핵산 및 이에 상보적인 캐리어 펩티드 핵산을 포함한다. 캐리어 펩티드 핵산은 바람직하게는 서열번호 4 내지 서열번호 9의 서열을 가질 수 있으며, 상기 서열 중 일부가 유니버설 염기로 치환되어 사용될 수도 있다.
상기 노인성 황반변성 또는 당뇨병성 망막병증의 예방 또는 치료용 조성물은 수성 용액, 주사제, 안약 또는 점안액에서 선택되는 어느 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체를 포함하는 조성물은 만성폐쇄성폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)의 예방 또는 치료용 조성물인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 핵산 복합체 내에 포함된 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자는 PDE4B일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 COPD의 예방 또는 치료용 조성물은 서열번호 52 내지 55로 표시되는 PDE4B 특이적 생활성 펩티드 핵산 및 이에 상보적인 캐리어 펩티드 핵산을 포함한다. 캐리어 펩티드 핵산은 바람직하게는 서열번호 56 내지 63의 서열을 가질 수 있으며, 상기 서열 중 일부가 유니버설 염기로 치환되어 사용될 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체를 포함하는 조성물은 피부질환의 예방 또는 치료용 조성물인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 핵산 복합체 내에 포함된 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자는 TLR2, Smad3, IFI16 및 TIEG1으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상을 예시로 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 피부질환은 건선, 색소침착 관련 피부질환 또는 아토피 피부염, 피부 손상 또는 켈로이드(keloids; 상처 후 비대증) 등이 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는 본 발명은 아토피 피부염(Atopic Dermatitis) 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 아토피 치료용 조성물은 서열번호 64 또는 서열번호 65로 표시되는 TLR2 특이적 생활성 펩티드 핵산 및 이에 상보적인 캐리어 펩티드 핵산을 포함한다. 상기 캐리어 펩티드 핵산은 바람직하게는 서열번호 66 내지 서열번호 71의 서열을 가질 수 있으며, 상기 서열 중 일부가 유니버설 염기로 치환되어 사용될 수도 있다.
본 발명은 또한, 피부 손상 치료용 조성물을 제공한다. 상기 치료용 조성물은 피부 상처 치료(skin wound healing)를 포함하는 피부 재생(skin regeneration)을 위한 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 피부 손상 치료용 조성물은 서열번호 72 또는 73으로 표시되는 Smad3 특이적 생활성 펩티드 핵산 및 이에 상보적인 캐리어 펩티드 핵산을 포함한다. 상기 캐리어 펩티드 핵산은 바람직하게는 서열번호 74 내지 78의 서열을 가질 수 있으며, 상기 서열 중 일부가 유니버설 염기로 치환되어 사용될 수도 있다.
본 발명은 또한, 켈로이드 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 켈로이드 치료용 조성물은 서열번호 79 또는 80으로 표시되는 TIEG1 특이적 생활성 펩티드 핵산 및 이에 상보적인 캐리어 펩티드 핵산을 포함한다. 상기 캐리어 펩티드 핵산은 바람직하게는 서열번호 81 내지 84의 서열을 가질 수 있으며, 상기 서열 중 일부가 유니버설 염기로 치환되어 사용될 수도 있다.
상기 피부질환의 예방 또는 치료용 조성물은 수성 용액, 크림, 젤, 페이스트, 로션 또는 연고 등의 제형으로 제조될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체를 포함하는 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 핵산 복합체 내에 포함된 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자는 PDE4B 또는 Pellino-1일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체를 포함하는 조성물은 희귀질환 및 중증 질환의 예방 또는 치료용 조성물인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 핵산 복합체 내에 포함된 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자는 SMN2, ApoB-100, ICAM-1, ApoCIII, TTR, HTT, GHr, SOD1, ANGPTL3, PKK, miR-21, TMPRSS6 또는 Connexin 26이 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는 본 발명에 따른 희귀질환 및 중증 질환은 난청이고, 핵산 복합체 내에 포함된 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자는 Connexin 26일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 복합체는 리포솜(liposome) 등의 전달체를 이용하여 투여(또는 도포)할 수도 있다. 상기 리포솜은 림프 조직과 같은 특정 조직에 대해 상기 복합체를 표적화하거나, 감염 세포에 대해 선택적으로 표적화하는데 도움을 줄 수 있고, 또한 상기 복합체가 포함된 조성물의 반감기를 증가시키는데 도움을 줄 수 있다. 리포솜으로는 에멀션, 포움(foam), 마이셀(micelle), 불용성 단층, 액정, 인지질 분산물, 라멜라 층(lamellar layer) 등이 있다. 이러한 제제에 있어서, 송달되는 상기 복합체는, 단독으로 또는 특정 세포들을 대상으로, CD45 항원에 결합되는 모노클로날 항체와 같은 림프 세포 중 우세한 수용체에 결합하는 분자와 함께 또는 기타 치료 조성물과 함께, 리포솜의 일부로서 혼입시킨다. 따라서, 본 발명의 소정 복합체로 충진되거나 도포되어(decorated) 상기 복합체 조성물을 송달하는 리포솜은 림프 세포의 상기 부위로 지향될 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 리포솜은 일반적으로 중성 및 음전하 인지질 및 콜레스테롤 등의 스테롤을 비롯한 표준 베시클 (vesicle)-형성 지질로부터 형성된다. 일반적으로, 예를 들어 혈류 중의 리포솜의 안정성, 산 불안정성(acid lability) 및 리포솜의 크기 등을 고려하여 지질을 선택한다. 리포솜 제조에는 다양한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Szoka, et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:467, 1980), 및 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호, 제4,837,028호 및 제5,019,369호]에 기재되어 있는 바와 같은 방법을 이용할 수 있다.
본 발명은 일 양태에서 복합체 또는 복합체를 포함하는 조성물을 개체에 투여(또는 도포)하여 질병을 치료하고 억제(또는 완화)하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 복합체를 이용하여 치료할 수 있는 질환은 사용되는 생활성 핵산의 특성에 따라 결정되며, 특별히 제한되지는 않는다.
바람직한 본 발명에 따른 복합체를 이용하여 치료 가능한 질환의 예로는 암, 황반변성 등의 이상혈관 증식 질환, 피부질환, 염증질환, 자가면역질환 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따른 복합체를 포함하는 조성물은 암 질환을 치료하기 위하여 또는 암 질환의 증세를 억제(또는 완화)하기 위하여 의약으로 효과적인 양으로 투여(또는 도포)될 수 있다. 색소 침착 관련 피부질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 치료 회수, 투여(도포) 형태 및 경로 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 해당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기한 약리학적 또는 생리학적 성분을 함께 투여(도포)하거나 순차적으로 투여(도포)할 수 있으며, 또한 추가의 종래의 치료제와 병용하여 투여(도포)될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여(도포)될 수 있다. 이러한 투여(도포)는 단일 또는 다중 투여(도포)일 수 있다.
본 발명에서, "개체"는 본 발명에 따른 복합체를 투여(도포)하여 경감, 억제 또는 치료될 수 있는 상태 또는 질환을 앓고 있거나 그러한 위험이 있는 포유동물을 의미하며, 바람직하게 사람을 의미한다.
또한, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 투여량(도포량)은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여(도포) 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000㎎/일이고, 바람직하게는 0.01 ~ 500㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여(도포)할 수도 있다.
본 발명의 방법들에서 사용되는 임의의 복합체 또는 이를 포함하는 혼합물에 대한 치료적 유효량은 세포 배양 분석으로부터 초기에 측정될 수 있다. 예를 들어, 선량(dose)은 세포 배양에서 결정된 IC50(half maximal inhibitory concentration) 또는 EC50(half maximal effective concentration)를 포함하는 순환 농도 범위를 얻기 위하여 동물 모델에서 계산될 수 있다. 그러한 정보는 인간에서의 유용한 선량을 더욱 정확히 결정하는데 사용될 수 있다.
여기에 기재되어 있는 복합체 또는 이를 포함하는 혼합물들의 독성과 치료 효율성은, 예를 들어, LD50(군집의 50%에 대한 치사량), ED50(군집의 50%에 대해 치료 효과를 갖는 선량), IC50(군집의 50%에 대해 치료 억제 효과를 갖는 선량)을 결정하기 위하여, 세포 배양 또는 실험동물에서의 표준 제약 과정들에 의해 산정될 수 있다. 독성과 치료 효과 간의 선량 비가 치료 지수이고 이것은 LD50과 ED50(또는, IC50) 간의 비율로서 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 보이는 화합물들이 바람직하다. 이들 세포 배양 분석에서 얻어진 데이터는 인간에 사용하는 선량의 범위를 산정하는데 사용될 수 있다. 그러한 화합물들의 투여량(dosage) 또는 도포량은 바람직하게는 독성이 없거나 거의 없는 상태에서 ED50(또는, IC50)을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 복합체를 포함하는 암 또는 종양 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명에서 암 또는 종양 진단을 위한 검체 시료는 인간을 포함하는 동물의 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 상기 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 상기 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다.
상기 검체 시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid) 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 객담, 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 표적 증폭 PCR 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 아울러, 상기 키트는 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 통상의 기술자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 상기 키트는 앞서 언급된 구성성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 생활성 핵산과 상보적으로 수소결합하여 상기 핵산을 세포 내로 운반할 수 있고, 상기 생활성 핵산은 표적 유전자와 결합하여 표적 유전자의 발현을 조절하는 것을 특징으로 할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 구조식 (1)의 구조를 가지는 핵산 복합체를 포함하는 표적 유전자 발현 조절용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 구조식 (1)의 구조를 가지는 핵산 복합체를 이용하는 것을 특징으로 하는 표적 유전자 발현 조절 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 표적 유전자 발현 조절 방법은 (a) 엔도좀 탈출(endosome escape)을 도와주는 물질을 포함하는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)과 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)을 결합시켜 복합체를 형성하는 단계; 및 (b) 상기 복합체를 표적 세포에 접촉시켜 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 표적 세포는 전술한 암 또는 종양 유래 세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서 복합체가 세포 내로 도입되어 이동한 다음, 생활성 핵산은 상보적인 염기서열을 가지는 표적 핵산과 결합하고, 캐리어 펩티드 핵산과 분리되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 생활성 핵산은 표적 유전자와 결합하여 표적 유전자의 발현을 조절하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 복합체는 표적 핵산(표적 서열)이 부재하는 경우 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산은 상보적인 결합을 유지하는 반면, 생활성 핵산의 염기서열과 상보성을 이루는 표적 핵산이 존재하는 경우는 “생활성 핵산의 목적서열로의 치환(strand displacement)”, "표적 특이적 분리 및 결합(target specific release and bind)" 방법으로, 생활성 핵산은 캐리어 펩티드 핵산으로부터 분리되고 표적 핵산과 결합한다. 상기 분리 및 결합의 시점은 생활성 핵산의 캐리어 펩티드 핵산과 표적 핵산의 염기서열의 상보성에 따른 각각의 핵산(염기) 간의 수소 결합력의 조절을 통하여 조절이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 표적 특이적 분리 및 결합 방법은; i) 상보적인 결합 중 일부가 다른 서열(partial specific sequence)을 가진 캐리어 펩티드 핵산 구조로 “단일염기서열변이(single nucleotide polymorphism, SNP)”, 혹은 “생활성 핵산보다 짧은 서열”을 가지게 제작하거나, ii) 캐리어 펩티드 핵산의 일부 서열을 유니버설 염기(universal base)로 교체하거나, iii) 캐리어 펩티드 핵산의 일부 서열을 링커(linker)로 교체하거나, vi) 생활성 핵산에 평행(parallel)으로 결합하는 캐리어 펩티드 핵산 구조를 가지도록 하여 표적 핵산과 생활성 핵산의 결합력보다 캐리어 펩티드 핵산과 생활성 핵산의 결합력이 상대적으로 낮게 제작되는 방식으로 구현될 수 있으며, 상기 방법은 두 가지 이상의 조합으로 사용이 가능하며, 평행 결합(parallel binding) 방식을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 유니버설 염기(universal base)는 아데닌(adenine), 구아닌(guanine), 사이토신 (cytosine), 티민(thymine), 우라실(Uracil) 등의 천연 염기와 선택성 없이 결합하고 상보적인 결합력보다 낮은 결합력을 가지는 염기로 이노신 PNA(inosine PNA), 인돌 PNA(indole PNA), 나이트로인돌 PNA(nitroindole PNA) 및 무염기(abasic)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있으며 바람직하게는 이노신 PNA를 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 결합력 조절을 통해 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 분리시점 및 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자의 결합 시점의 조절이 가능한 장점이 있다.
본 발명에 있어서, 구조식 (1)의 구조를 가지는 핵산 복합체에서 엔도좀 탈출을 도와주는 물질을 포함하지 않는 구조식 [ A ≡ C(+) ] 의 구조를 가지는 핵산 복합체를 이용하여, 그 효능을 검증하였다. PCT/KR2017/008636를 참조할 수 있다.
본 발명에 따른 캐리어 펩티드 핵산(즉, 변형된 캐리어 펩티드 핵산)은 변형되지 않은 종래의 네이키드 펩티드 핵산(naked-PNA)의 자가응집(self-aggregation) 성질 등으로 인한 침전문제를 해소하였으며, 세포 투과성, 용해도의 증가 및 세포 내 확산효과를 증진시킬 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 구조식 ( 1)의 구조를 가지는 신규 복합체를 사용한 인간유래 유방암 세포 및 폐암 세포에서의 혈관내피 성장인자의 억제에 의한 항암 약리 효과 확인
많은 암세포에서 높은 발현이 확인되는 혈관 내피 성장 인자인 VEGF는 암세포에서 세포 혈관 증식을 유도하는 것으로 알려져 있기에 이에 대한 신규 복합체를 이용하여 VEGF를 억제하여 항암 약리 효과를 확인하고자 한다.
혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)는 혈관, 림프관의 발생과 항상성 유지에 관여하며 신경세포에도 중요한 효과를 가진다. 이러한 VEGF는 종양 및 눈에서의 질병과 관련된 신혈관생성의 중요한 매개자인 것으로 알려졌다. 또한 VEGF mRNA는 조사된 대다수 사람의 종양에 의해 과발현된다(Berkman 등, J Clin Invest., 91:153-159 (1993)). 암의 경우 자신의 성장을 위해 영양분의 공급과 노폐물을 배출하는 통로로 새로운 모세혈관을 필요로 하며, 이를 위해 암세포와 암의 기질세포는 VEGF를 계속적으로 분비하고, 분비된 VEGF는 조직을 통해 확산되어, 혈관내피세포의 이동을 촉진한다(Ferrara.N. 등, Nat Rev Cancer, 2:795-803, (2002)). 암세포에 의해 유도된 신생혈관은 주위세포의 도움을 받지 않기 때문에 정상적으로 형성된 모세혈관에 비해 불완전한 것이 특징이다. VEGF는 수용체인 VEGFR1, 2, 3에 결합하지만, VEGFR2를 통해 내피세포의 증식, 이동, 투과성을 유도하는 신호를 전달한다(Zeng H. 등, J Biol. Chem., 276:26969-26976 (2001)). 그러므로 VEGF를 타겟하는 약물을 이용하여 신생혈관형성을 제어함으로써, 암세포의 증식 및 신생혈관형성 관련 질환을 치료할 수 있다.
실시예 1-1. 세포 배양
ATCC(American Type Culture Collection, 미국)로부터 입수한 인간 유방암 세포(MDA-MB-231), 인간 폐암 세포(A549)와 인간 자궁암 세포(HeLa)를 DMEM 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, 웰진, 한국)에 10％(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37℃, 5％(v/v) CO2의 조건하에서 배양하였다.
실시예 1-2. 핵산 복합체의 세포 내 도입, 세포 투과성 및 엔도좀 탈출의 변화 확인
혈관내피 성장 인자를 억제하기 위한 신규 복합체는 혈관 성장의 필수 유전자인 VEGF mRNA와 상보적인 서열(서열번호 1 내지 서열번호 3)의 생활성 펩티드 핵산을 제작하였으며, 엔도좀 탈출을 도와주는 물질이 포함된 생활성 펩티드 핵산과 상보적인 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 4 내지 서열번호 9)을 제작한 후 동량을 혼성화하여 복합체를 제작하였다(표 2 참조). 생물학적 활성을 가지는 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 결합되어 있는 복합체의 처리 방법은 PCT/KR2017/008636에 개시된 바와 같다.
VEGF 활성 억제를 위한 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 서열
구분 서열번호 염기서열 단량체 변형
생활성 핵산 서열번호 1 5'- AT(-)GA(+)TTC(-)TG(+)CCC(-)TCC-O-K-3' -+-+-
서열번호 2 5'- GLFDIIKKIAESF-O-AT(-)GA(+)TTC(-)TG(+)CCC(-)TCC-O-K-3' -+-+-
서열번호 3 5'-Histidine(10)-O-AT(-)GA(+)TTC(-)TG(+)CCC(-)TCC-O-K-3' -+-+-
캐리어 펩티드 핵산 서열번호 4 5'-K-O-GG(+)AG(+)G-3' ++
서열번호 5 5'-K-O-GG(+)AG(+)G-O-GLFDIIKKIAESF-3' ++
서열번호 6 5'-K-O-GG(+)AG(+)G-O-Histidine(10)-3' ++
서열번호 7 5'-GLFDIIKKIAESF-O-TAC(+)TAAGA(+)CGG(+)GAGG-O-K-3' +++
서열번호 8 5'-Histidine(10)-O-TAC(+)TAAGA(+)CGG(+)GAGG-O-K-3' +++
서열번호 9 5'-TAC(+)TAAGA(+)CGG(+)GAGG-O-K-3' +++
실시예 1-1에서 배양된 세포를 8웰 플레이트에 웰 당 5x103 cells를 배양하고, 복합체 처리 후 24, 48, 72, 96시간 간격으로 배양한 다음, 처리 시간 경과 후 Acridine orange staining의 방법으로 핵산 복합체의 세포 투과성 및 엔도좀 탈출의 변화를 확인하였다.
본 실시예에서 사용한 핵산 복합체의 조합은 하기 표 3과 같다.
엔도좀 탈출 확인을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
original PNA 1 서열번호 1 및 서열번호 4
original PNA 2 서열번호 1 및 서열번호 9
modified PNA 1 서열번호 2 및 서열번호 6
modified PNA 2 서열번호 2 및 서열번호 8
도 1a에 나타낸 바와 같이, 인간유래 자궁암 세포주에서, endosome escape moiety를 첨가함에 따라 첨가하지 않은 핵산 복합체보다 더 빠르게 세포질로 나오는 것을 확인하였다.
실시예 1-3. 인간유래 유방암 세포와 폐암 세포주에서의 세포 생존율 분석
신규 복합체의 혈관내피 성장 인자 억제 정도를 분석하기 위하여 실시예 1-1에서 배양된 세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 6x103 cells를 배양하고, 복합체 처리 후 24, 48, 72, 96시간 간격으로 배양한 다음 처리 시간 경과 후 PCT/KR2017/008636에 개시된 실험 조건으로 세포 생존율을 확인하였다.
본 실시예에서 사용한 핵산 복합체의 조합은 하기 표 4와 같다.
유방암 세포와 폐암 세포주에서의 세포 생존율 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
Original 서열번호 1 및 서열번호 4
PNA 1 서열번호 2 및 서열번호 4
PNA 2 서열번호 3 및 서열번호 4
PNA 3 서열번호 2 및 서열번호 5
PNA 4 서열번호 2 및 서열번호 6
PNA 5 서열번호 2 및 서열번호 7
PNA 6 서열번호 2 및 서열번호 8
그 결과, 도 1b 및 1c에 나타낸 바와 같이, 신규 복합체를 통한 혈관내피 성장인자 억제에 의해서 세포 생존율이 억제되는 것이 인간유래 유방암 세포와 폐암 세포에서 확인되었다.
실시예 1-4. 웨스턴 블랏 분석( Western blot assay ) 으로 유전자 발현의 분석
신규 복합체의 혈관내피 성장 인자 억제 정도를 분석하기 위하여 실시예 1-1에서 배양된 세포를 6-웰 플레이트에 웰 당 1x105 cells를 배양하고, 복합체 처리 후 24, 48, 72, 96시간 간격으로 배양한 다음 처리 시간 경과 후 항-VEGF 항체(SantaCruz Biotech., 미국), 항-p-Akt1 (Cell signaling, 미국)을 이용하여 PCT/KR2017/008636에 개시된 조건으로 단백질 발현을 분석하였다.
본 실시예에서 사용한 핵산 복합체의 조합은 하기 표 5와 같다.
VEGF와 p-Akt1 유전자 발현 확인을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
PNA 1 서열번호 1 및 서열번호 4
PNA 2 서열번호 1 및 서열번호 9
PNA 3 서열번호 2 및 서열번호 6
PNA 4 서열번호 2 및 서열번호 8
도 1d에 나타낸 바와 같이, 혈관내피 성장 인자인 VEGF와 하위 유전자인 p-Akt1의 단백질 발현이 억제되는 것이 확인되었다.
실시예 1-5. 유세포 분석기( FACS )를 통한 세포 사멸의 분석
신규 복합체의 혈관내피 성장 인자 억제를 통한 세포 사멸을 분석하기 위하여 실시예 1-1에서 배양된 세포를 6-웰 플레이트에 웰 당 1x105 cells를 배양하고, 복합체 처리 후 72시간 동안 배양한 다음 세포를 수집한 다음 FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit(BD, 미국)의 Annexin V binding buffer 500 μL에 잘 풀어준 후, FITC Annexin V과 Propidium Iodide Staining Solution를 각각 5 μL를 처리한 후 유세포 분석기 전용 tube로 옮긴 후 이용하여 처리 시간 경과 후 FACS CantoⅡ(BD, 미국)으로 분석하였다.
본 실시예에서 사용한 핵산 복합체의 조합은 하기 표 6과 같다.
혈관내피 성장 인자 억제를 통한 세포 사멸 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
original PNA duplex 서열번호 1 및 서열번호 4
modified PNA duplex 서열번호 2 및 서열번호 6
modified PNA duplex 1 서열번호 2 및 서열번호 6
modified PNA duplex 2 서열번호 2 및 서열번호 8
그 결과, 생활성 펩티드 핵산과 결합하는 캐리어 펩티드 핵산의 Charge 또는 길이가 다른 복합체를 분석한 결과 각각 0.6 내지 3.1%의 세포 사멸이 유도되는 것이 확인되었다(도 1e).
실시예 2: 혈관내피 성장인자를 표적 유전자로 하는 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산 후보물질 복합체를 통한 항암 약제 평가
하기 표 7의 구조로 제조된 VEGF를 표적 유전자로 하는 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 후보물질 복합체를 이용하여 인간유래 유방암 종양 세포주 및 종양세포를 이식한 동물 모델에서 표적 유전자의 발현 억제를 통한 종양의 억제와 암세포의 표면에서 발현되어 계속적으로 암세포의 증식을 유도하는 PD-L1을 표적으로 하는 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 신규 복합체와 VEGF를 표적 유전자로 하는 후보물질 복합체를 함께 조합을 이루어 처리하였을 때의 암세포 성장을 억제하는지를 분석하고자 한다.
동물 모델에서 표적 유전자의 발현 억제를 통한 종양 억제를 분석하기 위한 서열
구분 서열번호 염기서열
sample 1 생활성 핵산 서열번호 2 5'- GLFDIIKKIAESF-O-AT(-)GA(+)TTC(-)TG(+)CCC(-)TCC-O-K-3'
캐리어 펩티드 핵산 서열번호 5 5'-K-O-GG(+)AG(+)G-O-GLFDIIKKIAESF-3'
sample 2 생활성 핵산 서열번호 2 5'- GLFDIIKKIAESF-O-AT(-)GA(+)TTC(-)TG(+)CCC(-)TCC-O-K-3'
캐리어 펩티드 핵산 서열번호 8 5'-Histidine(10)-O-TAC(+)TAAGA(+)CGG(+)GAGG-O-K-3'
sample 3 생활성 핵산 서열번호 2 5'- GLFDIIKKIAESF-O-AT(-)GA(+)TTC(-)TG(+)CCC(-)TCC-O-K-3'
캐리어 펩티드 핵산 서열번호 5 5'-K-O-GG(+)AG(+)G-3'
생활성 핵산 서열번호 10 5'- GLFDIIKKIAESF-O-AT(-)GA(+)AAGC(-)AA(+)TGA(-)T-O-K-3'
캐리어 펩티드 핵산 서열번호 11 5'-K-O-AT(+)CA(+)T-GLFDIIKKIAESF-3'
sample 4 생활성 핵산 서열번호 2 5'- GLFDIIKKIAESF-O-AT(-)GA(+)TTC(-)TG(+)CCC(-)TCC-O-K-3'
캐리어 펩티드 핵산 서열번호 8 5'-Histidine(10)-O-TAC(+)TAAGA(+)CGG(+)GAGG-O-K-3'
생활성 핵산 서열번호 10 5'- GLFDIIKKIAESF-O-AT(-)GA(+)AAGC(-)AA(+)TGA(-)T-O-K-3'
캐리어 펩티드 핵산 서열번호 11 5'-K-O-AT(+)CA(+)T-GLFDIIKKIAESF-3'
실시예 2-1. 인간유래 유방암 세포주( MDA - MB - 231)가 이식된 생쥐에서의 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산 후보물질 복합체의 미정맥 투여를 통한 항암 약효 평가
항암 약표 평가를 위해 특정병원체 부재(SPF) BALB/C 계통 및 암컷 누드 마우스(Nara Biotech Co, 한국)을 이용하여 인간유래 유방암 세포를 배양하여 5주령 된 암컷 누드 마우스에 이식을 위해 배양된 MDA-MB-231 세포주를 3×107 cells/ml로 조절 한 후 조절된 세포 배양액을 마우스당 0.3 ml(9×106 cells/mouse)씩 우측의 견갑부와 흉벽 사이의 액와부위 피하에 주입 하였다. 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산 후보물질 복합체를 음성대조물질(1, 2 mg/kg)과 sample 1, 2, 3, 4(1, 2 mg/kg)은 조제된 것을 마우스 당 0.1 ml씩 2회/주 (days 0, 3, 7, 10, 14, 17)로 미정맥투여 하였다. 모든 동물에 대하여 주사 개시 시 및 시험기간 중 투여직전 일반증상 관찰 및 체중 측정을 하였다. 암세포 이식 후 군별평균 종양 크기가 37.7 mm3 도달 시부터 21일째까지 총 10회 개체별로 Vernier caliper를 이용하여 3 방향을 측정한 후 length×width×height/2의 계산식으로 계산하였다. 약물투여 개시 21일째 안와정맥에서 헤파린 튜브를 사용하여 채혈(5000rpm, 5분간 원심분리, 상층액인 혈장만을 분리하여 vial에 분주하여 -70℃에 보관) 한 뒤 CO2 gas로 마우스를 안락사 시킨 후 종양을 분리하여 chemical balance에 무게를 측정 하였으며, 종양조직은 사진 촬영하였다.
실시예 2-2. 인간유래 유방암 세포주( MDA - MB - 231)가 이식된 생쥐에서의 혈액을 이용한 간독성 지표 물질 분석
항암 약표 평가를 진행했던 마우스의 채혈을 이용하여 채혈한 혈액 내 혈장을 분리하여 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈(ALT)와 아스팔테이트 아미노트랜스퍼레이즈(AST) 분석 키트(Biovision, 미국) 분석 용액에 적절한 희석비율로 희석하여 웰당 20 μL가 되도록 넣어주고, 또한 혈장 내 아미노트랜스퍼레이즈(ALT)와 아스팔테이트 아미노트랜스퍼레이즈(AST)의 양을 정량할 수 있도록 도와주는 표준 물질도 같이 준비하여 넣어 준 후, 분석 키트 내 방법대로 반응 용액(분석용액을 포함한 효소 및 염색시약 혼합물)을 제조하여 웰당 총 100 μL가 되도록 넣고 잘 섞어준 후 570 nm에서 OD를 spectrophotometer로 측정하였다.
실시예 2-3. 인간유래 유방암 세포주( MDA - MB - 231)가 이식된 생쥐에서의 종양 조직을 이용한 VEGF 및 하위 유전자 단백질 발현 분석
항암 약표 평가를 진행했던 마우스의 종양 조직을 이용하여 임의로 각 그룹의 2개의 조직에 대하여 homogenization을 RIPA buffer 100μl를 넣은 후 단백질을 분리한 후 항-VEGF 항체(SantaCruz Biotech., 미국), 항-VEGFR1 항체(Cell signaling, 미국), 항-VEGFR2 항체 (Cell signaling, 미국), 항-p-Akt1 항체(Cell signaling, 미국), 항-p-Akt1 항체(Cell signaling, 미국), 항-Bcl2 항체(SantaCruz Biotech., 미국), 항-Survivin 항체(Cell signaling, 미국), 항-CyclinD 1 항체(SantaCruz Biotech., 미국) 를 이용하여 PCT/KR2017/008636에 개시된 조건으로 단백질 발현을 분석하였다. 인간유래 유방암 세포주가 이식된 마우스에서의 미정맥 투여를 통한 동물 실험을 통해서, 투여 다음날부터 최종일까지 음성대조물질과 비교하여 모든 sample 투여군에서 시험기간 동안 특이한 일반증상 및 통계적으로 유의한 체중 감소는 관찰되지 않았다(도 2b). 또한, 종양 크기의 경우에는 최종일(day 21) 결과를 보면 음성대조물질 1 mg/kg투여군과 비교하여 sample 1, 2, 3, 4의 1 mg/kg투여군에서는 각각 18.4%(p<0.01), 26.0%(p<0.001), 17.5%(p<0.01), 23.9%(p<0.001), 음성대조물질2 mg/kg투여군과 비교하여 sample 1, 2, 3, 4의 2 mg/kg투여군에서는 30.1%(p<0.001), 41.4%(p<0.001), 32.6%(p<0.001), 36.4% (p<0.001)의 종양성장 억제효과가 나타났으며, 최종일 종양 무게의 경우에는 약물투여 개시 후 21일째 MDA-MB-231 tumor를 절제하여 그 무게를 측정한 결과 음성대조물질 1 mg/kg투여군과 비교하여 sample 1, 2, 3, 4의 1 mg/kg투여군에서는 각각 20.3%(p<0.01), 28.6%(p<0.001), 19.0%(p<0.01), 26.4%(p<0.001), 음성대조물질 2 mg/kg투여군과 비교하여 sample 1, 2, 3, 4의 2 mg/kg투여군에서는 각각 33.3% (p<0.001), 43.4%(p<0.001), 35.2%(p<0.001), 38.9%(p<0.001)의 종양무게 감소가 있었음을 확인할 수 있었다(도 2c 내지 도 2e). 마지막으로, 항암 약효 평가에서 사용되었던 마우스에서 채혈하여 간독성 지표 물질을 비교한 결과, 모든 투여 그룹에서 특이적으로 간독성이 확인되지 않았다(도 2f). 또한, VEGF를 비롯한 하위 유전자들의 발현이 신규 복합체를 처리한 군에서 효과적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었다(도 2g).
실시예 3: 인간유래 유방암 세포주( MDA - MB - 231)가 이식된 생쥐에서의 종양 조직을 이용한 PD-L1 억제
많은 암세포 유전자의 표면에서 발현되는 PD-L1으로 인해, T 세포의 PD-1과 결합하여 면역 세포에 의한 사멸이 유도되지 않고, 계속적으로 암세포의 증식을 유도하는 것으로 알려져 있기에 높은 발현을 보이는 인간유래 유방암 세포를 이식된 생쥐의 종양 조직에서 PD-L1을 표적으로 하는 신규 복합체를 이용하여 PD-L1을 억제하여 면역 항암 효과를 확인하고자 한다.
PD-L1 활성 억제를 위한 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 서열
구분 서열번호 염기서열 단량체 변형
생활성 핵산 서열번호 10 5'- GLFDIIKKIAESF-O-AT(-)GA(+)AAGC(-)AA(+)TGA(-)T-O-K-3' -+-+-
캐리어 펩티드 핵산 서열번호 11 5'-K-O-AT(+)CA(+)T-GLFDIIKKIAESF-3' +++
실시예 3-1. 인간유래 유방암 세포주( MDA - MB - 231)가 이식된 생쥐에서의 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산 후보물질 복합체의 미정맥 투여를 통한 PD-L1의 단백질 발현 분석
실시예 2-3과 동일한 방법으로 항암 약효 평가를 진행했던 마우스의 종양 조직에서 단백질을 분리하여 항-PD-L1 항체(Abcam, 영국)을 이용하여 단백질 발현을 확인하였다.
실시예 3-2. 인간유래 유방암 세포주( MDA - MB - 231)가 이식된 생쥐에서의 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산 후보물질 복합체의 미정맥 투여를 통한 조직에서의 면역 항암 평가
실시예 2-1과 동일한 방법으로 항암 약효 평가를 진행했던 마우스의 종양 조직을 생검하여 4% 포르말린 용액에 하루 동안 고정하고 고정한 조직을 파라핀 포매하여 5 μm로 섹션하여 슬라이드 글라스에 마운팅하였다. 마운팅한 조직을 0.5% BSA 용액에 1시간 동안 블락킹하고, PD-L1에 대한 1차 항체 용액을 처리하여 하루 동안 처리하였다. 이후, 1차 항체 용액을 제거하고 1X PBS로 씻어낸 후 2차 항체 용액을 처리하여 상온에서 2시간 처리하여 DAB 염색을 통해 분석하였다.
본 실시예에서 사용한 핵산 복합체의 조합은 하기 표 9와 같다.
유방암 세포주에서 면역 항암 평가를 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
Group 1 서열번호 2 및 서열번호 6
Group 2 서열번호 2 및 서열번호 8
Group 3 서열번호 2 및 서열번호 6
서열번호 10 및 서열번호 11
Group 4 서열번호 2 및 서열번호 8
서열번호 10 및 서열번호 11
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 마우스의 종양 조직에서 PD-L1을 처리한 그룹에서 단백질 발현이 감소하는 것과 조직에서 PD-L1의 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 신규 복합체를 사용한 인간유래 전립선암 세포에서의 안드로겐 수용체의 억제를 통한 항암 효과의 확인
전립선의 정상적인 발달과 보존은 안드로겐 수용체(androgen receptor, AR)를 통한 남성호르몬 안드로겐(androgen)의 역할에 의존하며, 안드로겐에 의해서 세포가 사멸되거나, 새로운 세포로 대체되는 등 안드로겐 수용체의 조절에 의해서 균형이 유지가 되는 것으로 알려져 있다. 그러나, 테스토스테론 또는 DHT(변형 테스토스테론)이 존재할 때, 안드로겐 수용체의 발현이 증가하여 균형이 깨지게 되고, 결국 이것은 암을 유발하는 것으로 알려져 있다. 전립선암 세포주에 DHT에 의해 유도된 안드로겐 수용체를 억제하여 인간유래 전립선암에서의 항암효과를 확인하고자 한다.
실시예 4-1. 세포 배양
ATCC(American Type Culture Collection, 미국)로부터 입수한 인간 전립선암 세포(LNCap)를 RPMI1640 (ATCC) (Roswell Park Memorial Institute, ATCC, 미국)에 10％(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37℃, 5％(v/v) CO2의 조건하에서 배양하였다.
실시예 4-2. 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체의 세포 내 도입
안드로겐 수용체를 억제하기 위한 신규 복합체는 전립선 세포의 성장과 균형에 필수 유전자인 androgen receptor mRNA와 상보적인 서열(서열번호 12 내지 서열번호 15)의 생활성 펩티드 핵산을 제작하였으며, 엔도좀 탈출을 도와주는 물질이 포함된 생활성 펩티드 핵산과 상보적인 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 16 내지 서열번호 31)을 제작한 후 동량을 혼성화하여 복합체를 제작하였다(표 10 참조). 생물학적 활성을 가지는 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 결합되어 있는 복합체의 처리 방법은 PCT/KR2017/008636에 개시된 바와 같다.
Androgen receptor 활성 억제를 위한 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 서열
구분 서열번호 염기서열 단량체 변형
생활성 핵산 서열번호 12 5'- T(-)CA(+)ATAG(-)TGCA(+)AT(-)CA-O-K-3' -+-+-
서열번호 13 5'- CT(-)CA(+)ATG(-)GCT(+)TCC(-)AG-O-K-3' -+-+-
서열번호 14 5'- GLFDIIKKIAESF-O-T(-)CA(+)ATAG(-)TGCA(+)AT(-)CA-O-K-3' -+-+-
서열번호 15 5'- GLFDIIKKIAESF-O-CT(-)CA(+)ATG(-)GCT(+)TCC(-)AG-O-K-3' -+-+-
캐리어 펩티드 핵산 서열번호 16 5'- K-O-TG(+)AT(+)T-3' ++
서열번호 17 5'- TT(+)AG(+)T-O-K-3' ++
서열번호 18 5'- TGAT(+)TGCA(+)CTAT(+)TGA-O-K-3' +++
서열번호 19 5'- AGT(+)TATC(+)ACGT(+)TAGT-O-K-3' +++
서열번호 20 5'-K-O-TG(+)AT(+)T-O-Histidine(10)-3' ++
서열번호 21 5'-Histidine(10)-O-TT(+)AG(+)T-O-K-3' ++
서열번호 22 5'-Histidine(10)-TGAT(+)TGCA(+)CTAT(+)TGA-O-K-3' +++
서열번호 23 5'-Histidine(10)-AGT(+)TATC(+)ACGT(+)TAGT-O-K-3' +++
서열번호 24 5'-K-O-CT(+)GG(+)A-3' ++
서열번호 25 5'-AG(+)GT(+)C-O-K-3' ++
서열번호 26 5'-CTGG(+)AAGC(+)CATT(+)GAG-O-K-3' +++
서열번호 27 5'-GAGT(+)TACC(+)GAAG(+)GTC-O-K-3' +++
서열번호 28 5'-K-O-CT(+)GG(+)A-O-Histidine(10)-3' ++
서열번호 29 5'-Histidine(10)-O-AG(+)GT(+)C-O-K-3' ++
서열번호 30 5'-Histidine(10)-CTGG(+)AAGC(+)CATT(+)GAG-O-K-3' +++
서열번호 31 5'-Histidine(10)-GAGT(+)TACC(+)GAAG(+)TC-O-K-3' +++
실시예 4-3. 웨스턴 블랏 분석( Western blot assay ) 으로 유전자 발현의 분석
신규 복합체의 안드로겐 수용체 억제 정도를 분석하기 위하여 실시예 4-1에서 배양된 세포를 6-웰 플레이트에 웰 당 1x105 cells를 배양하고, DHT(변형 테스토스테론)을 처리하여 안드로겐 수용체의 발현을 올린 4시간 후, 복합체 처리 한 다음 72, 96, 120, 144, 168시간 간격으로 배양한 다음 처리 시간 경과 후 항-androgen receptor 항체(Cell signaling, 미국), 항-p-Akt1 (Cell signaling, 미국)을 이용하여 PCT/KR2017/008636에 개시된 조건으로 단백질 발현을 분석하였다.
본 실시예에서 사용한 핵산 복합체의 조합은 하기 표 11과 같다.
androgen receptor와 p-Akt1 유전자 발현 확인을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
1 서열번호 12 및 서열번호 16
2 서열번호 12 및 서열번호 17
3 서열번호 12 및 서열번호 18
4 서열번호 12 및 서열번호 19
5 서열번호 13 및 서열번호 24
6 서열번호 13 및 서열번호 25
7 서열번호 13 및 서열번호 26
8 서열번호 13 및 서열번호 27
11 서열번호 14 및 서열번호 20
12 서열번호 14 및 서열번호 21
13 서열번호 14 및 서열번호 22
14 서열번호 14 및 서열번호 23
15 서열번호 15 및 서열번호 28
16 서열번호 15 및 서열번호 29
17 서열번호 15 및 서열번호 30
18 서열번호 15 및 서열번호 31
그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, DHT에 의해 발현이 증가한 androgen receptor와 하위 유전자인 p-Akt1의 단백질 발현이 억제되는 것이 확인되었다.
실시예 5: 신규 복합체를 사용한 인간유래 전립선암 세포에서의 clusterin의 억제를 통한 항암 효과의 확인
Clusterin은 apolipoprotein J라고도 불리는 모든 포유류의 체액에 존재하는 이종 이량성 당단백질이며, 지금까지 연구된 거의 모든 종류의 세포에서 유도 및 발현되며, 정자성숙, 지질운송, 조직 재구성, 세포막 재활용, 세포-세포 또는 세포-세포하층 간의 상호작용 및 세포사멸 등의 다양한 정상적인 생물학적 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다. 인간의 여러 악성종양의 발생과 진행과정에 관여하는 clusterin의 강력한 종양형성 능력에 관해 보고되어 있고, clusterin이 세포 사멸을 조절하는 Bax의 발현을 억제하여, 암세포 성장을 증진하며, 암세포의 저항성에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 인간유래 전립선암에서 과발현되는 clusterin을 억제함으로 인해 항암 효과가 있는지 확인하고자 한다.
실시예 5-1. 세포 배양
ATCC(American Type Culture Collection, 미국)로부터 입수한 인간 전립선암 세포(PC-3)를 F12K 배양배지(Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium, Gibco, 미국)에 10％(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37℃, 5％(v/v) CO2의 조건하에서 배양하였다.
실시예 5-2. 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체의 세포 내 도입
Clusterin를 억제하기 위한 신규 복합체는 혈관 성장의 필수 유전자인 VEGF mRNA와 상보적인 서열(서열번호 32 내지 서열번호 35)의 생활성 펩티드 핵산을 제작하였으며, 엔도좀 탈출을 도와주는 물질이 포함된 생활성 펩티드 핵산과 상보적인 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 36 내지 서열번호 51)을 제작한 후 동량을 혼성화하여 복합체를 제작하였다(표 12 참조). 생물학적 활성을 가지는 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 결합되어 있는 복합체의 처리 방법은 PCT/KR2017/008636에 개시된 바와 같다.
Clusterin 활성 억제를 위한 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 서열
구분 서열번호 염기서열 단량체 변형
생활성 핵산 서열번호 32 5'- TAC(-)TCA(+)AG(-)CTAC(+)AT(-)TCA-O-K-3' -+-+-
서열번호 33 5'- GA(-)GCC(+)AC(-)TTCT(+)GC(-)A-O-K-3' -+-+-
서열번호 34 5'-GLFDIIKKIAESF-O-TAC(-)TCA(+)AG(-)CTAC(+)AT(-)TCA-O-K-3' -+-+-
서열번호 35 5'- GLFDIIKKIAESF-O- GA(-)GCC(+)AC(-)TTCT(+)GC(-)A-O-K-3' -+-+-
캐리어 펩티드 핵산 서열번호 36 5'- K-O-A(+)TG(+)TC-3' ++
서열번호 37 5'- CT(+)GT(+)A-O-K-3' ++
서열번호 38 5'- ATGT(+)CCAA(+)TCAG(+)GGA-O-K-3' +++
서열번호 39 5'- AGG(+)GACT(+)AACC(+)TGTA-O-K-3' +++
서열번호 40 5'- K-O-A(+)TG(+)TC-O-Histidine(10)-3' ++
서열번호 41 5'-Histidine(10)-O-CT(+)GT(+)A-O-K-3' ++
서열번호 42 5'-Histidine(10)-ATGT(+)CCAA(+)TCAG(+)GGA-O-K-3' +++
서열번호 43 5'-Histidine(10)- AGG(+)GACT(+)AACC(+)TGTA-O-K-3' +++
서열번호 44 5'- K-O-TG(+)CA(+)G-3' ++
서열번호 45 5'- GA(+)CG(+)T-O-K-3' ++
서열번호 46 5'- TG(+)CAGA(+)AGTG(+)GCTC-O-K-3' +++
서열번호 47 5'- CTC(+)GGTGA(+)AGAC(+)GT-O-K -3' +++
서열번호 48 5'- K-O-TG(+)CA(+)G-O-Histidine(10)-3' ++
서열번호 49 5'-Histidine(10)-O- GA(+)CG(+)T-O-K-3' ++
서열번호 50 5'-Histidine(10)- TG(+)CAGA(+)AGTG(+)GCTC-O-K-3' +++
서열번호 51 5'-Histidine(10)- CTC(+)GGTGA(+)AGAC(+)GT-O-K-3' +++
실시예 5-3. 인간유래 전립선암 세포주에서의 세포 생존율 분석
신규 복합체의 혈관내피 성장 인자 억제 정도를 분석하기 위하여 실시예 5-1에서 배양된 세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 6x103 cells를 배양하고, 복합체 처리 후 24, 48, 72, 96, 120시간 간격으로 배양한 다음 처리 시간 경과 후 PCT/KR2017/008636에 개시된 실험 조건으로 세포 생존율을 확인하였다.
본 실시예에서 사용한 핵산 복합체의 조합은 하기 표 13과 같다.
전립선암 세포주에서 세포 생존율 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
Original PNA duplex 1 서열번호 32 및 서열번호 36
Original PNA duplex 2 서열번호 32 및 서열번호 37
Original PNA duplex 3 서열번호 32 및 서열번호 38
Original PNA duplex 4 서열번호 32 및 서열번호 39
Original PNA duplex 5 서열번호 33 및 서열번호 44
Original PNA duplex 6 서열번호 33 및 서열번호 45
Original PNA duplex 7 서열번호 33 및 서열번호 46
Original PNA duplex 8 서열번호 33 및 서열번호 47
Modified PNA duplex 1 서열번호 34 및 서열번호 40
Modified PNA duplex 2 서열번호 34 및 서열번호 41
Modified PNA duplex 3 서열번호 34 및 서열번호 42
Modified PNA duplex 4 서열번호 34 및 서열번호 43
Modified PNA duplex 5 서열번호 35 및 서열번호 48
Modified PNA duplex 6 서열번호 35 및 서열번호 49
Modified PNA duplex 7 서열번호 35 및 서열번호 50
Modified PNA duplex 8 서열번호 35 및 서열번호 51
그 결과, 도 5a 및 5b에 나타낸 바와 같이, 신규 복합체를 통한 clusterin 억제에 의해서 세포 생존율이 억제되는 것이 인간유래 전립선암 세포에서 확인되었다.
실시예 5-4. 웨스턴 블랏 분석( Western blot assay ) 으로 유전자 발현의 분석
신규 복합체의 clusterin 억제 정도를 분석하기 위하여 실시예 5-1에서 배양된 세포를 6-웰 플레이트에 웰 당 1x105 cells를 배양하고, 복합체 처리 후 24, 48, 72, 96, 120시간 간격으로 배양한 다음 처리 시간 경과 후 항-clusterin (abcam, 영국), 항-Bax (SantaCruz Biotech., 미국)을 이용하여 PCT/KR2017/008636에 개시된 조건으로 단백질 발현을 분석하였다.
본 실시예에서 사용한 핵산 복합체의 조합은 하기 표 14와 같다.
clusterin과 Bax 유전자 발현 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
1 서열번호 32 및 서열번호 36
2 서열번호 32 및 서열번호 37
3 서열번호 32 및 서열번호 38
4 서열번호 32 및 서열번호 39
5 서열번호 33 및 서열번호 44
6 서열번호 33 및 서열번호 45
7 서열번호 33 및 서열번호 46
8 서열번호 33 및 서열번호 47
11 서열번호 34 및 서열번호 40
12 서열번호 34 및 서열번호 41
13 서열번호 34 및 서열번호 42
14 서열번호 34 및 서열번호 43
15 서열번호 35 및 서열번호 48
16 서열번호 35 및 서열번호 49
17 서열번호 35 및 서열번호 50
18 서열번호 35 및 서열번호 51
그 결과 도 5c에 나타낸 바와 같이, 암 저항성 및 유도 유전자인 clusterin과 조절 유전자인 Bax의 단백질 발현이 억제되는 것이 확인되었다.
실시예 6: 신규 복합체를 사용한 인간유래 망막소상피 세포에서의 혈관내피 성장인자의 억제 확인
노인성 황반변성의 원인으로 알려진 황반에서의 혈관 내피 성장 인자인 VEGF에 대한 신규 복합체를 이용하여 인간유래 망막색소상피 세포에 처리하여 혈관 생성을 억제하는지 확인하였다.
실시예 6-1. 세포 배양
ATCC(American Type Culture Collection, 미국)로부터 입수한 인간 망막소상피 세포(ARPE-19)를 DMEM-F12 배양배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12, Gibco, 미국)에 10％(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37℃, 5％(v/v) CO2의 조건하에서 배양하였다.
실시예 6-2. 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체의 세포 내 도입
혈관 내피 성장 인자를 억제하기 위한 신규 복합체는 혈관 성장의 필수 유전자인 VEGF mRNA와 상보적인 서열(서열번호 1 내지 서열번호 3)의 생활성 펩티드 핵산을 제작하였으며, 엔도좀 탈출을 도와주는 물질이 포함된 생활성 펩티드 핵산과 상보적인 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 4 내지 서열번호 9)을 제작한 후 동량을 혼성화하여 복합체를 제작하였다(표 2 참조). 생물학적 활성을 가지는 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 결합되어 있는 복합체의 처리 방법은 PCT/KR2017/008636에 개시된 바와 같다.
실시예 6-3. 인간유래 망막소상피 세포 생존율 분석
신규 복합체의 혈관 내피 성장 인자 억제 정도를 분석하기 위하여 실시예 6-1에서 배양된 세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 6x103 cells를 배양하고, 복합체 처리 후 24, 48, 72, 96, 120시간 간격으로 배양한 다음 처리 시간 경과 후 PCT/KR2017/008636에 개시된 실험 조건으로 세포 생존율을 확인하였다.
본 실시예에서 사용한 핵산 복합체의 조합은 하기 표 15와 같다.
망막소상피 세포 생존율 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
Original 서열번호 1 및 서열번호 4
PNA 1 서열번호 2 및 서열번호 4
PNA 2 서열번호 3 및 서열번호 4
PNA 3 서열번호 2 및 서열번호 5
PNA 4 서열번호 2 및 서열번호 6
PNA 5 서열번호 2 및 서열번호 7
PNA 6 서열번호 2 및 서열번호 8
그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 신규 복합체를 통한 혈관 내피 성장 인자 억제에 의해서 세포 생존율이 억제되는 것이 인간유래 망막색소상피 세포에서 확인되었다.
실시예 6-4. 웨스턴 블랏 분석( Western blot assay ) 으로 유전자 발현의 분석
신규 복합체의 혈관 내피 성장 인자 억제 정도를 분석하기 위하여 실시예 6-1에서 배양된 세포를 6-웰 플레이트에 웰 당 1x105 cells를 배양하고, 복합체 처리 후 24, 48, 72, 96, 120시간 간격으로 배양한 다음 처리 시간 경과 후 항-VEGF 항체(SantaCruz Biotech., 미국), 항-p-Akt1(Cell signaling, 미국)을 이용하여 단백질 발현을 분석하였다. 상기 표 15의 핵산 복합체 조합을 이용하였다. 도 6b에 나타낸 바와 같이, 혈관내피 성장 인자인 VEGF와 하위 유전자인 p-Akt1의 단백질 발현이 억제되는 것이 확인되었다.
실시예 6-5. 유리체내주사 ( intravitreal injections )를 이용한 생쥐의 망막에서의 혈관 생성 억제 분석
신규 복합체의 혈관 내피 성장 인자 억제 정도를 생쥐의 망막에서 확인하기 위해서 임신한 쥐(나라바이오텍, 한국)에서 갓 태어난 P0와 P16의 쥐에 신규 복합체를 30μg/kg으로 직접 유리체내주사를 하여 일주일이 지난 뒤 음성 대조군과 함께 비교 하였다. 먼저 쥐의 망막을 분리하기 전에, FITC-dextran(sigma, 미국) 250mg/ml로 눈 뒤에 주사 후 망막을 분리하여 형광현미경으로 분석하였다.
본 실시예에서 사용한 핵산 복합체의 조합은 하기 표 16과 같다.
망막에서의 혈관 생성 억제 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
PNA duplex 서열번호 2 및 서열번호 8
Modified PNA duplex 1 서열번호 2 및 서열변호 6
Modified PNA duplex 2 서열번호 2 및 서열변호 8
그 결과, 각각 도 6c, 6d 및 6e에 나타낸 바와 같이, 신규 복합체를 통한 혈관 내피 성장 인자 억제에 의해서 쥐의 망막에서의 혈관 생성이 효율적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6-6. 안구점안액(eye drops)을 이용한 생쥐의 망막에서의 혈관 생성 억제 분석
신규 복합체의 혈관 내피 성장 인자 억제 정도를 생쥐의 망막에서 안구점안액을 이용하여 혈관 생성이 억제되는지 확인하기 위해서 임신한 쥐(나라바이오텍, 한국)에서 태어난 지 P14의 쥐에 신규 복합체를 안구점안액을 이용하여 30μg/kg으로 망막에 하루에 한번 5일 동안 처리한 뒤 음성 대조군과 함께 비교 하였다. 먼저 쥐의 망막을 분리하기 전에, FITC-dextran(sigma, 미국) 250mg/ml로 눈 뒤에 주사 후 망막을 분리하여 형광현미경으로 분석하였다.
서열번호 2 및 서열번호 8로 표시되는 핵산 복합체인 modified PNA duplex를 이용하였다. 그 결과, 도 6f에 나타낸 바와 같이, 안구점안액을 이용한 신규 복합체에 의해서 혈관 내피 성장 인자 억제에 의해서 쥐의 망막에서의 혈관 생성이 효율적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 신규 복합체를 이용하여 인간유래 호흡기 상피 세포 및 폐암 세포에서의 PDE4B의 억제 확인
만성폐쇄성폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)은 기도의 만성염증과 폐실질 파괴로 폐기능이 감소한 질병 상태를 지칭하며, 질병은 주로 흡연력이 있는 중년 이상에서 발생하거나 만성 염증의 사람에게서도 발병한다. 호흡곤란으로 인하여 신체적 활동이나 일상생활을 할 때 장애가 있을 뿐만 아니라 우울, 불안과 같은 정신적 문제를 동반하며 입원과 사망을 증가시키는 중요한 질병으로 알려져 있다. 이런 COPD의 치료제로 PDE4 억제제가 사용되었으나, 동반되는 부작용으로 인해 현재는 사용되고 있지 않다. 최근 들어 PDE4 family 중 PDE4B를 억제하였을 때 cAMP의 분해를 억제하여 항염증효과를 나타내는 것으로 알려져 신규 복합체를 이용하여 PDE4B를 억제한 COPD의 치료 효과를 확인하고자 한다.
실시예 7-1. 세포 배양
ATCC(American Type Culture Collection, 미국)로부터 입수한 인간 호흡기 상피 세포(NCI-H292)를 RPMI1640 (ATCC) (Roswell Park Memorial Institute, ATCC, 미국)에서, 인간 폐암 세포(A549)는 F12K 배양배지(Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium, Gibco, 미국)에 10％(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37℃, 5％(v/v) CO2의 조건하에서 배양하였다.
실시예 7-2. 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체의 세포 내 도입
PDE4B를 억제하기 위한 신규 복합체는 염증을 일으키는 중요 물질인 cAMP의 분해에 관련된 PDE4B mRNA와 상보적인 서열(서열번호 52 내지 서열번호 55)의 생활성 펩티드 핵산을 제작하였으며, 엔도좀 탈출을 도와주는 물질이 포함된 생활성 펩티드 핵산과 상보적인 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 56 내지 서열번호 63)을 제작한 후 동량을 혼성화하여 복합체를 제작하였다(표 17 참조). 생물학적 활성을 가지는 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 결합되어 있는 복합체의 처리 방법은 PCT/KR2017/008636에 개시된 바와 같다.
PDE4B 활성 억제를 위한 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 서열
구분 서열번호 염기서열 단량체 변형
생활성 핵산 서열번호 52 5'- TAC(-)TCA(+)AG(-)CTAC(+)AT(-)TCA-O-K -3' -+-+-
서열번호 53 5'- TC(-)CAC(+)AT(-)CAA(+)AGC(-)ACT-O-K-3' -+-+-
서열번호 54 5'- GLFDIIKKIAESF-O-TAC(-)TCA(+)AG(-)CTAC(+)AT(-)TCA-O-K-3' -+-+-
서열번호 55 5'- GLFDIIKKIAESF-O- TC(-)CAC(+)AT(-)CAA(+)AGC(-)ACT-O-K -3' -+-+-
캐리어 펩티드 핵산 서열번호 56 5'- K-O-TC(+)AA(+)T-3' ++
서열번호 57 5'- ATGA(+)GTTCGA(+)TGTA(+)AGT-O-K-3' ++
서열번호 58 5'- K-O-TC(+)AA(+)T -O-Histidine(10)-3' +++
서열번호 59 5'-Histidine(10)- ATGA(+)GTTCGA(+)TGTA(+)AGT-O-K -3' +++
서열번호 60 5'- K-O-AG(+)TG(+)C-3' ++
서열번호 61 5'- AGGT(+)GTAGT(+)TTCG(+)TGA-O-K-3' ++
서열번호 62 5'- K-O-AG(+)TG(+)C-O-Histidine(10)-3' +++
서열번호 63 5'-Histidine(10)- AGGT(+)GTAGT(+)TTCG(+)TGA-O-K -3' +++
실시예 7-3. 웨스턴 블랏 분석( Western blot assay ) 으로 유전자 발현의 분석
신규 복합체의 PDE4B 억제 정도를 분석하기 위하여 실시예 7-1에서 배양된 세포를 6-웰 플레이트에 웰 당 1x105 cells를 배양하고, 복합체 처리 한 다음 4시간 후에 인간 유래 호흡기 상피 세포에는 CSE(sigma, 미국)을, 인간 유래 폐암 세포에는 LPS(sigma, 미국)을 처리하여 발병 모델을 만든 후 72, 96, 120 시간 간격으로 배양한 다음 처리 시간 경과 후 항-PDE4B 항체(abcam, 영국), 항-IL-6(Cell signaling, 미국), TNF-α(SantaCruz Biotech., 미국)을 이용하여 PCT/KR2017/008636에 개시된 조건으로 단백질 발현을 분석하였다.
본 실시예에서 사용한 핵산 복합체의 조합은 하기 표 18과 같다.
PDE4B 발현 억제 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
1 서열번호 52 및 서열번호 56
2 서열번호 52 및 서열번호 57
3 서열번호 54 및 서열번호 58
4 서열번호 54 및 서열번호 59
5 서열번호 53 및 서열번호 60
6 서열번호 53 및 서열번호 61
7 서열번호 55 및 서열번호 62
8 서열번호 55 및 서열번호 63
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, CSE와 LPS에 의해 발현이 증가한 PDE4B와 COPD에 의한 대표적인 염증 마커인 IL-6와 TNF-α의 단백질 발현이 억제되는 것이 확인되었다.
실시예 8: 신규 복합체를 이용하여 Atopic Dermatitis에서 TLR2의 억제 확인
핵산 복합체의 아토피 피부염 치료 효과 분석을 위하여 표적 유전자로 TLR2 (Toll-Like Receptor 2)를 사용하였다. 알러지 유발 물질이나 세균이 피부로 침투할 때 발현되는 유전자인 TLR2는 아토피 피부염 환자에서는 과발현 되어 있어 피부 내 염증성 사이토카인에 의한 염증 증가로 아토피 피부염을 악화시킨다. 이 때문에 아토피 피부염에 있어서 중요한 표적이 될 것으로 예측되고 있다.
실시예 8-1: 세포 배양
CLS(CLS Cell Lines Service, 독일)로부터 입수한 인간 각질 세포 (HaCaT)를 DMEM 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, 웰진, 한국)에 10％(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37℃, 5％(v/v) CO2의 조건하에서 배양하였다. 아토피 피부염 유사 세포 모델을 만들기 위해 집먼지 진드기 추출액 5 ng/mL과 DNCB (2-dinitrochlorobenzene) 5 μM을 처리하여 하루 동안 배양하였다.
실시예 8-2. 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체의 세포 내 도입
TLR2를 억제하기 위한 신규 복합체는 TLR2 mRNA와 상보적인 서열(서열번호 64 내지 서열번호 65)의 생활성 펩티드 핵산을 제작하였으며, 엔도좀 탈출을 도와주는 물질이 포함된 생활성 펩티드 핵산과 상보적인 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 66 내지 서열번호 71)을 제작한 후 동량을 혼성화하여 복합체를 제작하였다(표 19 참조). 생물학적 활성을 가지는 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 결합되어 있는 복합체의 처리 방법은 PCT/KR2017/008636에 개시된 바와 같다.
TLR2 활성 억제를 위한 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 서열
구분 서열번호 염기서열 단량체 변형
생활성 핵산 서열번호 64 5'- A(-)TGT(+)AGG(-)TG(+)ATCC(-)TGTT-O-K -3' -+-+-
서열번호 65 5'- GLFDIIKKIAESF-O- A(-)TGT(+)AGG(-)TG(+)ATCC(-)TGTT-O-K -3' -+-+-
캐리어 펩티드 핵산 서열번호 66 5'- K-O-A(+)AC(+)AG-3' ++
서열번호 67 5'- K-O-A(+)AC(+)AG-O-Histidine(10)-3' ++
서열번호 68 5'- Histidine(10)-O-G(+)AC(+)AA-O-K-3' ++
서열번호 69 5'- T(+)ACATCC(+)ACTAGG(+)ACAA-O-K-3' +++
서열번호 70 5'-K-O-T(+)ACAGGA(+)TCACCT(+)ACAT-O-Histidine(10)-3' +++
서열번호 71 5'- Histidine(10)-O-T(+)ACATCC(+)ACTAGG(+)ACAA-O-K-3' +++
실시예 8-3: 인간유래 각질 세포주에서 세포 생존율 변화
신규 복합체의 TLR2 억제 정도를 분석하기 위하여 실시예 8-1에서 배양된 세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 6x103 cells를 배양하고, 복합체 처리 후 24, 48, 72 시간 간격으로 배양한 다음 처리 시간 경과 후 PCT/KR2017/008636에 개시된 실험 조건으로 세포 생존율을 확인하였다.
그 결과, 도 8a에 나타낸 바와 같이, 신규 복합체를 통한 TLR2 억제에 의해서 세포 생존율이 억제되는 것이 인간유래 각질 세포에서 확인되었다.
실시예 8-4: 웨스턴 블랏 분석( Western blot assay ) 으로 유전자 발현의 분석
신규 복합체의 TLR2 억제 정도를 분석하기 위하여 실시예 8-1에서 배양된 세포를 6-웰 플레이트에 웰 당 1x105 cells를 배양하고, 복합체를 처리 후, 24, 48, 72시간 간격으로 배양한 다음 처리 시간 경과 후 항-TLR2 항체(SantaCruz Biotech., 미국), 항-p-NF-kB(Cell signaling, 미국), MyD88(Cell signaling, 미국), TARC(abcam, 영국)을 이용하여 PCT/KR2017/008636에 개시된 조건으로 단백질 발현을 분석하였다.
본 실시예에서 사용한 핵산 복합체의 조합은 하기 표 20과 같다.
TLR2 억제 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
1 서열번호 64 및 서열번호 65
2 서열번호 64 및 서열번호 66
3 서열번호 64 및 서열번호 67
4 서열번호 65 및 서열번호 69
5 서열번호 65 및 서열번호 70
6 서열번호 65 및 서열번호 71
그 결과, 도 8b에 나타낸 바와 같이, TLR2 및 하위 경로 유전자의 발현이 처리된 핵산 복합체에 의해 억제되는 것을 확인하였다.
실시예 8-5: 집먼지 진드기 추출물 및 DNCB를 이용한 아토피 피부염 유도 동물 모델에서의 아토피 피부염 표현형 효과 분석
NC/Nga 마우스의 등을 제모하고 AD cream(집먼지 진드기 추출물 크림, Biostir, 일본)을 100 mg씩 일주일에 2번 총 3주 동안 도포하여 집먼지 진드기에 의한 아토피 피부염 유발 동물 모델을 구축하였다. 또한 Balb/C 마우스의 등을 제모하여 일주일에 2번 총 3주 동안 50 μM의 DNCB를 도포하여 새집증후군에 의한 아토피 피부염 유발 동물 모델을 구축하였다. 일주일에 총 3번의 크림 제형의 핵산 복합체를 처리하고 아토피 피부염 동물 모델 표현형을 사진으로 분석하고, 등 부위 털 자람 정도를 Image J로 측정하였다.
본 실시예에서 사용한 핵산 복합체의 조합은 하기 표 21과 같다.
아토피 피부염 표현형 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
PNA 1 서열번호 65 및 서열번호 67
PNA 2 서열번호 65 및 서열번호 70
그 결과, 아토피 피부염 표현형이 신규 핵산 복합체를 처리한 그룹에서 감소하는 것을 확인하였다(도 8c).
실시예 8-6: 혈청 내 IgE 및 TARC 농도 변화 분석
실시예 8-5의 조건으로 진행한 동물 실험에서 최종 실험 종료일에 마우스 혈액을 안와정맥을 통해 수집하고 상온에서 2시간 이상 방치하여 원심분리기 (14,000 rpm, 15 min)를 이용하여 혈청을 수집하였다. 수집한 혈청을 IgE ELISA kit (고마바이오텍, 대한민국) 및 TARC ELISA kit (R&D system, 미국)에서 제공하는 실험방법을 이용하여 혈청 내 IgE 및 TARC의 농도를 측정하였다.
상기 표 21의 핵산 복합체 조합을 이용하였다. 그 결과, 아토피 피부염을 유도한 대조군에 비해서 신규 핵산 복합체를 처리한 그룹에서 IgE 및 TARC의 농도가 음성 대조군과 비슷한 수준으로 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 8d).
실시예 8-7: H&E 염색으로 아토피 유도 동물 모델에서의 표현형 분석
실시예 8-5의 조건으로 실험을 진행하여 최종 실험 종료일에 마우스 귀 조직을 생검하여 4% 포르말린 용액에 하루 동안 고정하고 고정한 조직을 파라핀 포매하여 조직을 5 μm로 섹션하여 슬라이드 글라스에 마운팅하였다. 마운팅한 조직을 Hematoxylin:Eoin 염색 용액에 일정 시간 동안 염색하고 1X PBS로 수세한 후 현미경으로 분석하였다.
상기 표 21의 핵산 복합체 조합을 이용하였다. 그 결과, 건선을 유도한 대조군에 비해서 신규 핵산 복합체를 처리한 그룹에서 피부의 epidermis의 비이상 증식이 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 8e).
실시예 8-8: 면역염색으로 아토피 유도 동물 모델에서의 조직 내 염증성 마커 분석
실시예 8-5의 조건으로 실험을 진행하여 최종 실험 종료일에 마우스 등 조직을 생검하여 4% 포르말린 용액에 하루 동안 고정하고 고정한 조직을 파라핀 포매하여 5 μm로 섹션하여 슬라이드 글라스에 마운팅하였다. 마운팅한 조직을 0.5% BSA 용액에 1시간 동안 블락킹하고, CD3에 대한 1차 항체 용액을 처리하여 하루 동안 처리하였다. 이후, 1차 항체 용액을 제거하고 1X PBS로 씻어낸 후 2차 항체 용액을 처리하여 상온에서 2시간 처리하여 DAB 염색을 통해 분석하였다.
상기 표 21의 핵산 복합체 조합을 이용하였다. 그 결과, 조직 내 염증성 마커인 CD3이 아토피 유도한 대조군에 비해 신규 핵산 복합체를 처리한 그룹에서 감소하는 것을 확인하였다(도 8f).
실시예 9: 신규 복합체를 이용하여 skin regeneration에서 Smad3의 억제 확인
핵산 복합체의 피부재생 효과 분석을 위하여, 표적유전자로 Smad3를 사용하였다. Smad3는 상처를 입은 피부에서 과발현되는 단백질로서, 피부 재생에 있어서 중요한 표적이 될 것으로 예측되고 있다.
실시예 9-1: 세포 배양
CLS(CLS Cell Lines Service, 독일)로부터 입수한 인간 각질 세포 (HaCaT)를 DMEM 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, 웰진, 한국)에 10％(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37℃, 5％(v/v) CO2의 조건하에서 배양하였다.
실시예 9-2. 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체의 세포 내 도입
Smad3를 억제하기 위한 신규 복합체는 상처 입는 부위에서 과발현되는 Smad3 mRNA와 상보적인 서열(서열번호 72 또는 서열번호 73)의 생활성 펩티드 핵산을 제작하였으며, 엔도좀 탈출을 도와주는 물질이 포함된 생활성 펩티드 핵산과 상보적인 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 74 내지 서열번호 78)을 제작한 후 동량을 혼성화하여 복합체를 제작하였다(표 22 참조). 생물학적 활성을 가지는 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 결합되어 있는 복합체의 처리 방법은 PCT/KR2017/008636에 개시된 바와 같다.
Smad3 활성 억제를 위한 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 서열
구분 서열번호 염기서열 단량체 변형
생활성 핵산 서열번호 72 5'- TG(-)TCA(+)AGCC(-)ACT(+) )GC(-)A-O-K-3' -+-+-
서열번호 73 5'- GLFDIIKKIAESF-O- TG(-)TCA(+)AGCC(-)ACT(+)GC(-)A-O-K-3' -+-+-
캐리어 펩티드 핵산 서열번호 74 5'- K-O-T(+)GCA(+)G-3' ++
서열번호 75 5'- K-O-T(+)GCA(+)G-O-Histidine(10)-3' ++
서열번호 76 5'- AC(+)AGTTCGG(+)TGACG(+)T-O-K-3' +++
서열번호 77 5'- K-O-T(+)GCAGT(+)GGCTTGA(+)CA-O-Histidine(10)-3' +++
서열번호 78 5'- Histidine(10)-O-AC(+)AGTTCGG(+)TGACG(+)T-O-K-3' +++
실시예 9-3: 상처 후 회복 능력 분석 ( Wounds - Healing assay )을 통한 세포 이동성 분석
신규 복합체의 Smad3 억제 정도를 분석하기 위하여 실시예 9-1에서 배양된 세포를 24-웰 플레이트에 웰 당 1x104 cells를 배양하고, 복합체를 처리 후, 24, 48시간 간격으로 배양한 다음 처리 시간 경과 후 인간 유래 각질 세포주에서 인위적으로 상처를 일으킨 부분에서부터 세포 이동성에 대한 효과를 확인하였다.
본 실시예에서 사용한 핵산 복합체의 조합은 하기 표 23과 같다.
각질 세포주에서 세포 이동성 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
PNA 1 서열번호 73 및 서열번호 75
PNA 2 서열번호 73 및 서열번호 77
PNA 3 서열번호 73 및 서열번호 78
그 결과, 도 9a에 나타낸 바와 같이, 신규 복합체에 의해서 세포의 이동성이 향상되는 것을 확인하였다.
실시예 9-4: 웨스턴 블랏 분석( Western blot assay ) 으로 유전자 발현의 분석
신규 복합체의 Smad3 억제 정도를 분석하기 위하여 실시예 9-1에서 배양된 세포를 6-웰 플레이트에 웰 당 1x105 cells를 배양하고, 복합체를 처리 후, 24, 48, 72시간 간격으로 배양한 다음 처리 시간 경과 후 항-p-smad3 항체(Cell signaling, 미국)을 이용하여 PCT/KR2017/008636에 개시된 조건으로 단백질 발현을 분석하였다.
본 실시예에서 사용한 핵산 복합체의 조합은 하기 표 24와 같다.
Smad3 억제 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
1 서열번호 73 및 서열번호 74
2 서열번호 73 및 서열번호 75
3 서열번호 73 및 서열번호 76
4 서열번호 73 및 서열번호 77
5 서열번호 73 및 서열번호 78
6 서열번호 72 및 서열번호 74
7 서열번호 72 및 서열번호 75
8 서열번호 72 및 서열번호 76
9 서열번호 72 및 서열번호 77
10 서열번호 72 및 서열번호 78
그 결과, 도 9b에 나타낸 바와 같이, 신규 복합체에 의해서 인간 유래 각질 세포주에서 smad 3의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 10: 신규 복합체를 이용하여 Keloids에서 TIEG1의 억제 확인
신규 핵산 복합체의 상처 후 비대증 (켈로이드, keloids) 치료 효과 분석을 위하여 표적 유전자로 TIEG1을 사용하였다. Keloid 환자의 피부 조직에서 과발현되는 단백질로서, 켈로이드 치료에 있어서 중요한 표적이 될 것으로 예측되고 있다.
실시예 10-1: 세포 배양
인간 켈로이드 섬유 아세포 (KEL FIB)를 DMEM 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, 웰진, 한국)에 10％(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37℃, 5％(v/v) CO2의 조건하에서 배양하였다.
실시예 10-2. 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체의 세포 내 도입
TIEG1을 억제하기 위한 신규 복합체는 상처 후 비대증 부위에서 과발현되는 TIEG1 mRNA와 상보적인 서열(서열번호 79 또는 서열번호 80)의 생활성 펩티드 핵산을 제작하였으며, 엔도좀 탈출을 도와주는 물질이 포함된 생활성 펩티드 핵산과 상보적인 캐리어 펩티드 핵산(서열번호 81 내지 서열번호 84)을 제작한 후 동량을 혼성화하여 복합체를 제작하였다(표 25 참조). 생물학적 활성을 가지는 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 결합되어 있는 복합체의 처리 방법은 PCT/KR2017/008636에 개시된 바와 같다.
TIEG1 활성 억제를 위한 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 서열
구분 서열번호 염기서열 단량체 변형
생활성 핵산 서열번호 79 5'- GC(-)TTC(+)TAC(-)AG(+)CTT(-)CA-O-K-3' -+-+-
서열번호 80 5'- GLFDIIKKIAESF-O- GC(-)TTC(+)TAC(-)AG(+)CTT(-)CA-O-K -3' -+-+-
캐리어 펩티드 핵산 서열번호 81 5'- K-O-TG(+)AA(+)G-3' ++
서열번호 82 5'- K-O-TG(+)AA(+)G-O-Histidine(10) -3' ++
서열번호 83 5'- K-O-TG(+)AAGCTG(+)TAGAA(+)GC -3' +++
서열번호 84 5'- K-O-TG(+)AAGCTG(+)TAGAA(+)GC-O-Histidine(10) 3' +++
실시예 10-3: 인간유래 켈로이드 섬유아세포에서 세포 생존율 분석
신규 복합체의 TIEG1 억제 정도를 분석하기 위하여 실시예 10-1에서 배양된 세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 6x103 cells를 배양하고, 복합체 처리 후 24, 48, 72, 96 시간 간격으로 배양한 다음 처리 시간 경과 후 PCT/KR2017/008636에 개시된 실험 조건으로 세포 생존율을 확인하였다.
서열번호 79 및 서열번호 81 내지 서열번호 84의 핵산 복합체(Antisense PNA)와 서열번호 80 및 서열번호 81 내지 서열번호 84의 핵산 복합체(Modified antisense PNA)를 이용하였다. 그 결과, 도 10a에 나타낸 바와 같이, 신규 복합체를 통한 TIEG1 억제에 의해서 세포 생존율이 억제되는 것이 인간유래 켈로이드 섬유아세포에서 확인되었다.
실시예 10-4: 웨스턴 블랏 분석( Western blot assay ) 으로 유전자 발현의 분석
신규 복합체의 TIEG1 억제 정도를 분석하기 위하여 실시예 10-1에서 배양된 세포를 6-웰 플레이트에 웰 당 1x105 cells를 배양하고, 복합체를 처리 후, 24, 48, 72시간 간격으로 배양한 다음 처리 시간 경과 후 항- TIEG1 항체(SantaCruz Biotech., 미국), 항 p-smad2(Cell signaling, 미국), 항-smad7(SantaCruz Biotech., 미국)을 이용하여 PCT/KR2017/008636에 개시된 조건으로 단백질 발현을 분석하였다.
본 실시예에서 사용한 핵산 복합체의 조합은 하기 표 26과 같다.
TIEG1 억제 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
1 서열번호 79 및 서열번호 81
2 서열번호 79 및 서열번호 82
3 서열번호 79 및 서열번호 83
4 서열번호 79 및 서열번호 84
5 서열번호 80 및 서열번호 81
6 서열번호 80 및 서열번호 82
7 서열번호 80 및 서열번호 83
8 서열번호 80 및 서열번호 84
그 결과, 도 10b에 나타낸 바와 같이, 신규 복합체에 의해서 인간유래 섬유아세포주에서 TIEG1의 발현 및 하위 유전자들의 감소 및 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> SeasunBio Materials <120> Peptide Nucleic Acid Complex with Endosome Escape Ability and Uses thereof <130> P18-B009 <160> 86 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 1 atgattctgc cctcc 15 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 2 atgattctgc cctcc 15 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 3 atgattctgc cctcc 15 <210> 4 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 4 ggagg 5 <210> 5 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 5 ggagg 5 <210> 6 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 6 ggagg 5 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 7 tactaagacg ggagg 15 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 8 tactaagacg ggagg 15 <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 9 tactaagacg ggagg 15 <210> 10 <211> 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tactcaagct acattca 17 <210> 53 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 53 tccacatcaa agcact 16 <210> 54 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 54 tactcaagct acattca 17 <210> 55 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 55 tccacatcaa agcact 16 <210> 56 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 56 tcaat 5 <210> 57 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 57 atgagttcga tgtaagt 17 <210> 58 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 58 tcaat 5 <210> 59 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 59 atgagttcga tgtaagt 17 <210> 60 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 60 agtgc 5 <210> 61 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 61 aggtgtagtt tcgtga 16 <210> 62 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 62 agtgc 5 <210> 63 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 63 aggtgtagtt tcgtga 16 <210> 64 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 64 atgtaggtga tcctgtt 17 <210> 65 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 65 atgtaggtga tcctgtt 17 <210> 66 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 66 aacag 5 <210> 67 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 67 aacag 5 <210> 68 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 68 gacaa 5 <210> 69 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 69 tacatccact aggacaa 17 <210> 70 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 70 tacaggatca cctacat 17 <210> 71 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 71 tacatccact aggacaa 17 <210> 72 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 72 tgtcaagcca ctgca 15 <210> 73 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 73 tgtcaagcca ctgca 15 <210> 74 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 74 tgcag 5 <210> 75 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 75 tgcag 5 <210> 76 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 76 acagttcggt gacgt 15 <210> 77 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 77 tgcagtggct tgaca 15 <210> 78 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 78 acagttcggt gacgt 15 <210> 79 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 79 gcttctacag cttca 15 <210> 80 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 80 gcttctacag cttca 15 <210> 81 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 81 tgaag 5 <210> 82 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 82 tgaag 5 <210> 83 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 83 tgaagctgta gaagc 15 <210> 84 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 84 tgaagctgta gaagc 15 <210> 85 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 85 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln 20 25 <210> 86 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 86 Gly Leu Phe Asp Ile Ile Lys Lys Ile Ala Glu Ser Phe 1 5 10

Claims (36)

  1. 하기 구조식 (1)의 구조를 가지는 핵산 복합체:
    구조식 (1)
    [ mA ≡ mC(+) ]
    상기 구조식 (1)에 있어서,
    A는 목적하는 유전자와 결합할 수 있는 서열 또는 목적하는 유전자 서열을 가지는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)이고,
    C는 생활성 핵산과 결합할 수 있는 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이고,
    '≡'는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 간의 상보적인 결합을 의미하며,
    'm'은 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 엔도좀 탈출(endosome escape)을 도와주는 물질을 의미하며,
    A로 표시되는 생활성 핵산은 펩티드 핵산(Peptide Nucleic Acid)으로, 전체적으로 음전하 또는 중성을 가지며,
    C(+)는 캐리어 펩티드 핵산이 전체적으로 양전하를 가진다는 것을 의미하며,
    캐리어 펩티드 핵산은 캐리어 펩티드 핵산 전체적으로 양전하를 띠도록 변형된 펩티드 핵산 단량체를 하나 이상 포함한다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산은 각각의 5'-말단 및/또는 3'-말단에 엔도좀 탈출을 도와주는 물질이 결합된 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 엔도좀 탈출을 도와주는 물질은 펩티드, 지질 나노물질(lipid nanoparticles), 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles), 고분자 나노구(polymer nanospheres), 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles), 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles), 양이온 고분자(cationic polymer) 및 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 펩티드는 GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(서열번호 85), GLFDIIKKIAESF(서열번호 86) 및 Histidine(10)으로 구성된 군에서 선택되고,
    상기 지질 나노물질(lipid nanoparticles)은 Lipid, phospholipids, cetyl palmitate, poloxamer 18, Tween 85, tristearin glyceride 및 Tween 80로 구성된 군에서 선택되고,
    상기 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles)은 poly(amidoamine) 또는 polyethylenimine (PEI)이고,
    상기 고분자 나노구(polymer nanospheres)는 polycaprolactone, poly(lactide-co-glycolide, polylactide, polyglycolide, poly(d,l-lactide), chitosan 및 PLGA-polyethylene glycol로 구성된 군에서 선택되고,
    상기 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles)은 Fe2O3 Fe3O4, WO3 및 WO2.9로 구성된 군에서 선택되고,
    상기 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles)은 1-(aminoethyl)iminobis[N-(oleicylcysteinyl-1-amino-ethyl)propionamide], N-alkylated derivative of PTA 및 3, 5-didodecyloxybenzamidine로 구성된 군에서 선택되고,
    상기 양이온 고분자(cationic polymer)는 vinylpyrrolidone-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate acid copolymer diethyl sulphate, polyisobutylene 및 poly(N-vinylcarbazole)로 구성된 군에서 선택되고,
    상기 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)는 polyacids, poly(acrylic acid), poly(methacrylic acid) 및 hydrolyzed polyacrylamide로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 각각 2 내지 50개의 핵산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 상기 생활성 핵산과 염기서열 일부 혹은 전부가 상보적인 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 일부가 상보적인 서열로 구성되는 캐리어 펩티드 핵산은 하나 이상의 유니버설 염기를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  9. 제1항에 있어서, 전체적으로 양전하를 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  10. 제1항에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 양전하를 가지도록 1개 이상의 gamma- 또는 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 gamma- 혹은 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체는 전기적 양성을 가지도록 리신(Lysine), 아르기닌(Arginine), 히스티딘(Histidine), 디아미노 부티르산(Diamino butyric acid), 오르니틴(Ornithine) 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 양전하를 가지는 아미노산을 backbone에 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  12. 제10항에 있어서, 상기 gamma- 혹은 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체는 음전하를 가지는 아미노산인 글루타민산(Glutamic acid), 아스파트산(Aspartic acid) 또는 아미노산 유사체를 backbone에 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  13. 제10항에 있어서, 상기 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 아미노산을 가지는 단량체가 음전하를 가지는 아미노산을 가지는 단량체에 비해 더 많이 포함되어 전체적인 캐리어 펩티드 핵산의 전하가 양성이 되는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  14. 제1항에 있어서, 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머, 소광자, 형광 표지자 및 발광 표지자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질이 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산에 결합된 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱터머, 소광자, 형광 표지자 및 발광 표지자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질과 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산의 결합은 단순 공유결합 또는 링커로 매개된 공유결합인 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  16. 제1항에 있어서, 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산은 각각의 핵산의 5'-방향성 및 3'-방향성에 따라 평행(parallel) 또는 역평행(antiparallel)으로 결합된 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  17. 제1항에 있어서, 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력은 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자와의 결합력보다 낮은 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 평행 결합(parallel binding) 또는 부분 특이결합(partial specific binding)하는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  19. 제17항에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산이 링커, 유니버설 염기(universal base) 및 생활성 핵산의 대응되는 염기와 상보적이지 않은 염기를 가지는 펩티드 핵산 염기로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 펩티드 핵산 염기를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  20. 제19항에 있어서, 상기 유니버설 염기(universal base)는 아데닌(adenine), 구아닌(guanine), 사이토신 (cytosine), 티민(thymine), 우라실(Uracil) 등의 천연 염기와 선택성 없이 결합하고, 상보적인 결합력보다 낮은 결합력을 가지는 염기로 이노신 PNA(inosine PNA), 인돌 PNA(indole PNA), 나이트로인돌 PNA(nitroindole PNA) 및 무염기(abasic)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  21. 제17항에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 결합력 조절을 통해 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 분리 시점 또는 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자의 결합 시점의 조절이 가능한 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  22. 제1항에 있어서, 상기 핵산 복합체의 입자는 5 nm 내지 300 nm의 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  23. 제22항에 있어서, 상기 핵산 복합체의 입자 크기는 핵산 복합체의 전하 밸런스를 조절함으로써 조절되는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체.
  24. 제1항 내지 제5항 및 제7항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 핵산 복합체를 포함하는 질병의 진단용 조성물.
  25. 제1항 내지 제5항 및 제7항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 핵산 복합체를 포함하는 질병의 예방 또는 치료용 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 질병은 암, 염증성 질환, 노인성 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 만성폐쇄성폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 희귀질환 및 중증 질환, 심혈관 질환, 대사성 질환 또는 피부질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 핵산 복합체 내에 포함된 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자는 VEGF, PD-L1, Androgen receptor, Clusterin, TGFβR2, ERBB3, ABCB1 및 PDE4B로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상이고, 상기 질병은 암인 것을 특징으로 하는 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 암은 유방암, 전립선암 또는 폐암인 것을 특징으로 하는 조성물.
  29. 제26항에 있어서, 상기 핵산 복합체 내에 포함된 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자는 VEGF이고, 상기 질병은 노인성 황반변성 또는 당뇨병성 망막병증인 것을 특징으로 하는 조성물.
  30. 제26항에 있어서, 상기 핵산 복합체 내에 포함된 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자는 PDE4B이고, 상기 질병은 만성폐쇄성폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  31. 제26항에 있어서, 상기 핵산 복합체 내에 포함된 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자는 TLR2, Smad3, IFI16, TLR6 및 TIEG1로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상이고, 상기 질병은 피부질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 상기 피부질환은 건선, 색소침착 관련 피부질환, 아토피 피부염, 피부 손상 또는 켈로이드(상처 후 비대증)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  33. 제31항에 있어서, 수성 용액, 크림, 젤, 페이스트, 로션 및 연고에서 선택되는 어느 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  34. 제1항 내지 제5항 및 제7항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 핵산 복합체를 포함하는 표적 유전자 발현 조절용 조성물.
  35. 제1항 내지 제5항 및 제7항 내지 제23항 중 어느 한 항의 핵산 복합체를 이용하는 것을 특징으로 하는 표적 유전자 발현 조절 방법.
  36. 제35항에 있어서, (a) 엔도좀 탈출(endosome escape)을 도와주는 물질을 포함하는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)과 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)을 결합시켜 복합체를 형성하는 단계; 및 (b) 상기 복합체를 세포, 세균, 곰팡이, 기생충 등에 접촉시켜 생물체 및 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 유전자 발현 조절 방법.
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