WO2021141368A2 - 세포 투과성 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 황반변성의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or treating macular degeneration containing a cell-permeable nucleic acid complex as an active ingredient, and more particularly, to a cell-permeable nucleic acid complex in which a bioactive nucleic acid targeting the NLRP3 gene and a carrier peptide nucleic acid are complementary to each other. It relates to a pharmaceutical composition for prevention, improvement or treatment of macular degeneration containing.
  • Macular degeneration one of the three major blindness diseases along with glaucoma and diabetic retinopathy, is largely classified into wet (exudative) macular degeneration and dry (non-exudative) macular degeneration.
  • the macula a nervous tissue located at the center of the retina, plays an important role in vision.
  • dry macular degeneration is a disease in which retinal and choroid atrophy due to the accumulation of drusen with age. Although it does not affect vision, it is caused by wet macular degeneration. It is a progressive disease that requires attention.
  • the treatment of dry (non-exudative) macular degeneration involves taking antioxidant vitamins known to slow the progression of macular degeneration, treatment for high blood pressure and hyperlipidemia, which are risk factors for macular degeneration, and lifestyle treatments such as smoking and UV protection.
  • dry (non-exudative) macular degeneration progresses to wet (exudative) macular degeneration
  • active treatment is required to preserve vision.
  • Thermal laser photocoagulation is performed when the boundaries of the area where degeneration has occurred, and photodynamic therapy, antibody injection, and vitrectomy are performed, but there is no complete treatment yet, and active research is ongoing.
  • Anti-VEGF antibody an anti-vascular endothelial growth factor antibody
  • Representative drugs include aflibercept (Eylia), ranibizumab (Lucentis), and bevacizumab (Avastin).
  • aflibercept Esylia
  • ranibizumab Ranibizumab
  • Avastin bevacizumab
  • NLRP3 is a protein involved in the inflammatory response, and plays a major role in the expression of IL-1 ⁇ and IL-18.
  • NLRP3 NOD-like receptor family, pyrin domain-containing 3
  • the inflammasome is a sensor protein, NLRP3 (NOD-like receptor family, pyrin domain-containing 3); ASC (adaptor protein apoptosis-associated spec-like protein containing a caspase-recruitment domain), which is an adapter protein; and pro-caspase-1, an effector protein.
  • Inflammasome activated by assembly activates caspase-1 and secretes IL-1_ or IL-18 to induce an inflammatory response.
  • the association between NLRP3 inflammasome activation and retinal disease has been previously reported in several literatures (Lucia Celkova, et al., NLRP3 Inflammasome and Pathobiology in AMD, J Clin Med. 2015 Jan; 4 (1): 172-192).
  • dry (non-exudative) macular degeneration is characterized by the presence of excessive amounts of drusen, and Sarah Doyle and Matthew Campbell found that drusen accumulated in the macula can lead to the production of IL-18 and IL-1 ⁇ through an inflammatory response.
  • IL-18 can progress from dry macular degeneration to wet macular degeneration.
  • NLRP3 is associated with accumulation of AluRNA and loss of Dicer-1, and activation of caspase-1 along with NLRP3 inflammasome causes retinal pigment epithelial degeneration, which is very similar to geographic atrophy in vivo. It has been reported to show one aspect (Valeria Tarallo et al., Cell 2012 May 11;149(4):847-59).
  • nucleic acid drugs inhibit the expression of target-specific messenger RNA (mRNA), making it possible to address research areas that were impossible to treat with conventional drugs targeting proteins (Kole R. et al. Nature Rev. Drug Discov. 2012; 11; 125-140., Wilson C. et al. Curr. Opin. Chem. Bio. 2006; 10: 607-614.).
  • mRNA messenger RNA
  • Various clinical trials using nucleic acids are in progress due to their performance and advantages as drugs, and despite the increasing use of nucleic acid-based therapeutics, the use of carriers for intracellular introduction is extremely limited.
  • nucleic acids are mainly through administration routes such as intramuscular injection, ocular administration, and subcutaneous injection, which are parenteral methods without including a delivery system.
  • the cell membrane penetration ability of the oligonucleic acid itself is quite low, and in particular, since DNA or RNA has a negative charge, it cannot pass through the hydrophobic phospholipid bilayer of the cell, and thus intracellular delivery through simple diffusion is difficult.
  • viral carriers such as retroviruses or adeno-associated virus (AAV) enables the introduction of oligonucleic acids into cells, but there are risks such as unintended immune activity and the possibility of recombination of oncogenes. (Couto LB et al. Curr. Opin. Pharmacol. 2010, 5; 534-542.).
  • This nucleic acid delivery technique has a functional residue in direct binding, includes a step for complex formation, and has problems such as endosome escape efficiency and biotoxicity of the liposome structure. It is necessary to improve the introduction function and solve the problems related to the manufacturing procedure and side effects.
  • the present inventors have found that the cell permeability of a nucleic acid complex in which a bioactive nucleic acid and a carrier peptide nucleic acid modified to have a positive charge as a whole are complementarily bound to each other is surprisingly improved, and using this It has been confirmed that the expression of the target gene can be very efficiently regulated, and a patent has been registered for a new construct with low cytotoxicity, improved cell permeability of bioactive nucleic acids and improved gene expression control ability (Korean Patent No. 10- 1963885).
  • the present inventors found a carrier peptide nucleic acid modified to have a positive charge as a whole with a bioactive nucleic acid (Bioactive Nucleic Acid). ), the nucleic acid complex to which this complementarily bound has the property of passing through the skin and cells very efficiently, confirming that this nucleic acid complex has excellent cell permeability.
  • Bioactive Nucleic Acid Bioactive Nucleic Acid
  • the present inventors have made diligent efforts to develop a nucleic acid complex that can effectively treat macular degeneration by a simple method such as administration of eye drops without direct injection by improving ocular cell permeability.
  • bioactive nucleic acids targeting the NLRP3 gene It was found that the cell-permeable nucleic acid complex in which a carrier peptide nucleic acid and a carrier peptide nucleic acid are complementary to each other exhibits an excellent effect in preventing or treating macular degeneration, thereby completing the present invention.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing, improving or treating macular degeneration, which contains a nucleic acid complex having high cell permeability and excellent preventive or therapeutic effect on macular degeneration as an active ingredient.
  • the present invention provides a bioactive nucleic acid targeting the NLRP3 gene (Bioactive Nucleic Acid); And carrier peptide nucleic acid (Carrier Peptide Nucleic Acid) provides a pharmaceutical composition for the prevention, improvement or treatment of macular degeneration containing a cell-permeable nucleic acid complex complementarily bound as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating macular degeneration comprising administering the cell-permeable nucleic acid complex.
  • the present invention also provides the use of the cell-permeable nucleic acid complex for the prevention or treatment of macular degeneration.
  • the present invention also provides the use of the cell-permeable nucleic acid complex for the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of macular degeneration.
  • Figure 2a shows the results of analysis by immunocytochemical staining to confirm the change in NLRP3 expression over time (day 1, day 3, and day 5) after the nucleic acid complex of Table 5 was treated with a dry human-derived retinal pigment epithelial cell line.
  • Figure 2b is immunocytochemistry confirming the change in the expression of the sub-step gene (Caspase-1) according to time (day 1, day 3, and day 5) after treatment of the nucleic acid complex of Table 5 in a dry human-derived retinal pigment epithelial cell line; It is the result of analysis by staining method.
  • FIG. 3 is a photograph of retinal tissue observed with a light microscope 2 weeks after administration of an eye drop containing the nucleic acid complex of Table 6 in mice induced with macular degeneration.
  • damage to the retinal pigment epithelial cells was suppressed, and the collapse of the extragranular layer and the inner granular layer was alleviated.
  • 5A is a photograph of retinal tissue observed with a light microscope 2 weeks after administration of an eye drop containing the nucleic acid complex of Table 7 in mice induced with macular degeneration.
  • 5B is a photograph of a retinal section confirmed 2 weeks after administration of an eye drop containing the nucleic acid complex of Table 7 in mice induced with macular degeneration.
  • Macular degeneration remains the number one cause of blindness and threatens a healthy old life. Dry macular degeneration is classified into early, middle, and late macular degeneration according to the presence or absence of drusen, the size and number of drusen, and the presence and extent of geographic atrophy. It is known that about 10% of patients with dry macular degeneration progress to wet macular degeneration, which can eventually lead to blindness, so the development of a treatment for dry macular degeneration is very important. Currently, in the case of dry macular degeneration, taking antioxidant vitamins, treatment for high blood pressure and hyperlipidemia, which are risk factors for macular degeneration, and lifestyle treatment such as smoking and UV protection, rather than treatment of the disease, maintenance of the status quo and wet macular degeneration, etc. It is meaningful in suppressing the progression of the disease, and there is no effective treatment.
  • a cell-permeable nucleic acid complex in which a bioactive nucleic acid targeting the NLRP3 gene and a carrier peptide nucleic acid are complementarily combined can be utilized for the prevention and treatment of macular degeneration.
  • a cell-permeable nucleic acid complex in which a bioactive nucleic acid targeting the NLRP3 gene and a carrier peptide nucleic acid are complementarily combined with human retinal pigment
  • a bioactive nucleic acid targeting the NLRP3 gene and a carrier peptide nucleic acid are complementarily combined with human retinal pigment
  • the present invention in one aspect, a bioactive nucleic acid targeting the NLRP3 gene (Bioactive Nucleic Acid); And it relates to a pharmaceutical composition for preventing, improving or treating macular degeneration containing a cell-permeable nucleic acid complex to which a carrier peptide nucleic acid is complementarily bound as an active ingredient.
  • the nucleic acid complex in which the bioactive nucleic acid and the carrier peptide are complementary to each other may have a structure of the following structural formula (1).
  • A is a bioactive nucleic acid (Bioactive Nucleic Acid) having a sequence capable of binding to a desired gene
  • C is a carrier peptide nucleic acid capable of binding to a bioactive nucleic acid (Carrier Peptide Nucleic Acid),
  • ' ⁇ ' means complementary binding between the bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid
  • the bioactive nucleic acid represented by A has an overall negative charge or neutrality
  • C(+) means that the carrier peptide nucleic acid has an overall positive charge
  • the carrier peptide nucleic acid comprises one or more peptide nucleic acid monomers modified to be positively charged throughout the carrier peptide nucleic acid.
  • the bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid in the nucleic acid complex according to the present invention may have an anti-parallel binding or parallel binding form.
  • the complementary binding form of the nucleic acid can be isolated in the presence of a target sequence (sequence complementary to the bioactive nucleic acid) of the bioactive nucleic acid.
  • the carrier peptide nucleic acid preferably includes one or more gamma- or alpha-backbone-modified peptide nucleic acid monomers such that the entire carrier peptide nucleic acid has a positive charge, and the gamma- or alpha-backbone-modified peptide nucleic acid is nucleic acid. It is more preferable that the monomer contains more of the monomer having the amino acid having a positive charge than the monomer having the amino acid having the negative charge so that the overall charge of the carrier peptide nucleic acid is positive.
  • the "bioactive nucleic acid” binds to a target gene and a nucleotide sequence including the same in vitro or in vivo, and the intrinsic function of the gene (eg, transcript transcript) expression or protein expression) to activate or inhibit, or to regulate splicing of pre-mRNA (eg, exon skipping), and the base sequence is It may be characterized in that it is a gene regulatory sequence, a gene coding sequence, or a splicing regulatory sequence,
  • the bioactive nucleic acid is a bioactive nucleic acid whose expression is reduced.
  • a nucleic acid having a complementary sequence capable of binding to a target gene of interest particularly a complementary sequence capable of binding to mRNA of the target gene, and a nucleic acid involved in gene expression regulation such as suppressing the expression of the gene means, and may be a nucleic acid having a sequence complementary to a target gene whose expression is to be reduced.
  • bioactive nucleic acid in the present invention is preferably an antisense peptide nucleic acid of NLRP3 (NOD-like receptor family, pyrin domain-containing 3) gene, which is a related target gene of macular degeneration, more preferably may include the sequence of SEQ ID NO: 4 of Table 1, but is not limited thereto.
  • NLRP3 NOD-like receptor family, pyrin domain-containing 3
  • the bioactive nucleic acid is DNA, RNA, or modified nucleic acid, such as peptide nucleic acid (PNA), phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide (PMO), locked nucleic acid (LNA), glycol nucleic acid (GNA) and threose nucleic acid (TNA), antisense It may be one selected from the group consisting of an antisense oligonucleotide, an aptamer, a small interfering RNA (siRNA), a short hairpin RNA (shRNA), a ribozyme, and a DNAzyme, preferably the bioactivity Nucleic acid is selected from the group consisting of DNA, RNA, or modified nucleic acids, such as peptide nucleic acid (PNA), phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide (PMO), locked nucleic acid (LNA), glycol nucleic acid (GNA), and threose nucle
  • carrier peptide nucleic acid refers to a nucleic acid that imparts functionality by complementary binding of a bioactive nucleic acid and some or all of its bases
  • the carrier peptide nucleic acid used in the present invention is a peptide nucleic acid (PNA: Peptide).
  • Nucleic Acid as well as similar modified nucleic acids can be used, and peptide nucleic acids are preferred, but not limited thereto.
  • the carrier peptide nucleic acid is preferably represented by a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 5 to 11 of Table 2, but is not limited thereto.
  • the bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid are phosphodiester, 2'0-methyl (2'0-methyl), 2' methoxy-ethyl (2' methoxy-ethyl), phosphor It may be characterized in that it further comprises at least one functional group selected from the group consisting of amidate (phosphoramidate), methylphosphonate (methylphosphonate) and phosphorothioate (phosphorothioate).
  • the "cell-permeable nucleic acid complex” is capable of penetrating a bioactive substance into the body and ultimately into a cell through extracellular treatment, and specifically, capable of delivering a bioactive nucleic acid targeting the NLRP3 gene into the cell. have the ability
  • the cell-permeable nucleic acid complex may remain in the eye or may pass through cells and be delivered into the body.
  • the nucleic acid complex may be characterized as having ocular persistence.
  • the "cell-permeable nucleic acid complex" is, in addition to direct administration into cells, intraocular instillation, intraretinal administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, intranasal administration
  • it has the property of being able to be delivered into a desired cell or into an ocular cell through administration, intrapulmonary administration, rectal administration or transdermal administration, and may be used in any form containing the nucleic acid complex.
  • the cell-permeable nucleic acid complex is a bioactive nucleic acid represented by SEQ ID NO: 2; and a carrier peptide nucleic acid represented by any one sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3 to 7, but is not limited thereto.
  • the binding force (melting temperature, Tm) of the bioactive nucleic acid targeting the NLRP3 gene and the carrier peptide nucleic acid is lower than the binding force between the bioactive nucleic acid and the NLRP3 gene, a target of the bioactive nucleic acid.
  • the binding force is the bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid by parallel binding or partial specific binding according to the 5'-direction and the 3'-direction of each nucleic acid, whereby the bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid
  • the binding force (melting temperature, melting temperature, Tm) of the bioactive nucleic acid may be lower than the binding force between the bioactive nucleic acid and the target gene of the bioactive nucleic acid.
  • the bioactive nucleic acid or carrier peptide nucleic acid may be characterized in that a substance that helps endosomes escape is additionally bound to the 5'-end or 3'-end of each nucleic acid. That is, it may be characterized in that it has the structure of the following structural formula (2) by further including a substance that helps the endosome escape of the bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid.
  • 'm' refers to a substance that helps the endosome escape of the bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid.
  • the "substance that helps endosomes escape” is characterized in that it helps the escape of the bioactive nucleic acids from the endosomes by increasing the osmotic pressure inside the endosomes or destabilizing the membranes of the endosomes. have. It means that bioactive nucleic acids move more efficiently and quickly into the nucleus or cytoplasm to meet and act on target genes (DW Pack, AS Hoffman, S. Pun, PS Stayton, "Design and development of polymers for gene delivery,” Nat. Rev. Drug. Discov., 4, 581-593 (2005)).
  • the material helping the endosomes escape is a peptide, lipid nanomaterials, conjugate nanomaterials (polyplex nanoparticles), polymer nanospheres, inorganic nanomaterials (inorganic nanoparticles), cationic lipids It may be characterized in that at least one selected from the group consisting of nanomaterials (cationic lipid-based nanoparticles), cationic polymers and pH sensitive polymers.
  • a peptide may be linked to a bioactive nucleic acid as a substance that helps the endosomal escape through a linker, and Histidine (10) is linked to a carrier peptide nucleic acid via a linker. It may be characterized by combining, but is not limited thereto.
  • the lipid nanomaterial may be characterized in that it is selected from the group consisting of Lipid, phospholipids, acetyl palmitate, poloxamer 18, Tween 85, tristearin glyceride and Tween 80.
  • the conjugate nanomaterial may be characterized in that poly(amidoamine) or polyethylenimine (PEI).
  • the polymer nanospheres are selected from the group consisting of polycaprolactone, poly(lactide-co-glycolide, polylactide, polyglycolide, poly(d,l-lactide), chitosan and PLGA-polyethylene glycol. can be characterized.
  • the inorganic nanomaterial may be characterized in that selected from the group consisting of Fe2O3 Fe3O4, WO3 and WO2.9.
  • the cationic lipid-based nanoparticles are 1-(aminoethyl)iminobis[N-(oleicylcysteinyl-1-amino-ethyl)propionamide], N-alkylated derivative of PTA and 3,5- It may be characterized in that it is selected from the group consisting of didodecyloxybenzamidine.
  • the cationic polymer is selected from the group consisting of vinylpyrrolidone-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate acid copolymer diethyl sulphate, polyisobutylene and poly(N-vinylcarbazole). It may be characterized.
  • the pH sensitive polymers may be selected from the group consisting of polyacids, poly(acrylic acid), poly(methacrylic acid) and hydrolyzed polyacrylamide.
  • the bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid each comprise 2 to 50, preferably 5 to 30, more preferably 10 to 25, most preferably 15 to 17 nucleic acid monomers.
  • the bioactive nucleic acid may be characterized in that it consists of a natural nucleic acid base and/or a modified nucleic acid monomer.
  • the monomer used for the bioactive nucleic acid is PNA, it is called a bioactive nucleic acid, and when other monomers are used, it is called in the same manner.
  • the bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid are phosphodiester, 2' 0-methyl (2' 0-methyl), 2' methoxy-ethyl (2' methoxy-ethyl), phosphor It may be characterized in that it further comprises any one or more functional groups selected from the group consisting of amidate (phosphoramidate), methylphosphonate (methylphosphonate) and phosphorothioate (phosphorothioate).
  • the carrier peptide nucleic acid may be characterized in that part or all of the nucleotide sequence is complementary to the bioactive nucleic acid.
  • the carrier peptide nucleic acid may include one or more universal bases, and all of the carrier peptide nucleic acids may consist of the universal base.
  • each of the bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid in the cell-permeable nucleic acid complex may be a complex, characterized in that the overall electrical properties have a positive charge (positive), a negative charge (negative) or a neutral charge.
  • the meaning of “total” means the overall electrical properties when viewed from the outside, and the charge of the entire bioactive nucleic acid or carrier peptide nucleic acid is not the electrical property of individual bases, for example, Although some of the monomers in the sex nucleic acid are positive, if there is a greater number of negative monomers, the bioactive nucleic acid has a negative charge in electrical properties "as a whole", and some bases and/or bases in the carrier peptide nucleic acid Even if the backbone is negative, when the number of positive bases and/or backbones is greater, the carrier peptide nucleic acid has a positive charge in terms of electrical properties "as a whole".
  • the nucleic acid complex of the present invention has a positive charge as a whole.
  • the bioactive nucleic acid has a negative charge or a neutral property in view of the overall electrical properties
  • the carrier peptide nucleic acid has a positive charge property in view of the overall electrical property.
  • the present invention is not limited thereto.
  • a modified peptide nucleic acid monomer may be used for imparting electrical properties between the bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid, and the modified peptide nucleic acid monomer is a carrier peptide nucleic acid having a positive charge.
  • Lysine (Lysine, Lys, K) , Arginine (Arginine, Arg, R), histidine (Histidine, His, H), diamino butyric acid (Diamino butyric acid, DAB), ornithine (Ornithine, Orn) and any one or more positive charges selected from the group consisting of amino acid analogs
  • a carrier peptide nucleic acid having a negative charge it may be characterized as comprising an amino acid of glutamic acid (Glutamic acid, Glu, E), which is a negatively charged amino acid, or a negatively charged amino acid of an amino acid analog.
  • the carrier peptide nucleic acid may be characterized in that it comprises one or more gamma- or alpha-backbone modified peptide nucleic acid monomers to have a positive charge as a whole.
  • the gamma- or alpha-backbone-modified peptide nucleic acid monomer is lysine (Lysine, Lys, K), arginine (Arginine, Arg, R), histidine (Histidine, His, H), diamino butyric acid to have an electrical positive acid, DAB), ornithine (Orn), and amino acids having a positive charge at least one selected from the group consisting of amino acid analogs may be characterized in that the backbone contains.
  • the modification of the peptide nucleic acid monomer for charge imparting may use a nucleobase-modified peptide nucleic acid monomer in addition to the backbone modification.
  • a nucleobase-modified peptide nucleic acid monomer in addition to the backbone modification.
  • it may be characterized by including an amine, triazole, or imidazole moiety in the nucleobase so as to have an electronegativity, or a carboxylic acid in a base to have an electronegativity.
  • the modified peptide nucleic acid monomer of the carrier peptide nucleic acid may further include a negative charge in the backbone or nucleobase, but the modified peptide nucleic acid monomer contains more of the monomer having a positive charge than the monomer having a negative charge. It is preferred that the charge of the nucleic acid be positive.
  • the nucleic acid complex according to the present invention is characterized in that it has a positive charge as a whole.
  • At least one substance selected from the group consisting of a hydrophobic moiety, a hydrophilic moiety, a target antigen-specific antibody, an aptamer, or a fluorescent/luminescent marker is a bioactive nucleic acid and/or may be characterized as bound to a carrier peptide nucleic acid, preferably the hydrophobic moiety, hydrophilic moiety, target antigen-specific antibody, aptamer and fluorescent/luminescent marker for imaging.
  • One or more substances selected from the group consisting of, etc. may be bound to the carrier peptide nucleic acid.
  • the binding of the carrier peptide nucleic acid may be characterized as a simple covalent bond or a covalent bond mediated by a linker, but is not limited thereto.
  • the cell permeability, solubility, stability, transport and imaging-related substances (eg, hydrophobic residues, etc.) bound to the nucleic acid carrier exist independently of the bioactive nucleic acid that modulates the expression of the target gene.
  • the complementary binding form of the bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid is largely characterized in that it has the form of antiparallel binding and parallel binding.
  • the complementary binding form has a structure that is separated in the presence of a target sequence (sequence complementary to the bioactive nucleic acid) of the bioactive nucleic acid.
  • the antiparallel bond and the parallel bond are determined according to the 5'-direction and the 3'-direction in the binding method of DNA-DNA or DNA-PNA.
  • Antiparallel binding is a general method of binding DNA-DNA or DNA-PNA.
  • the bioactive nucleic acid is in the 5' to 3' direction
  • the carrier peptide nucleic acid is in the 3' to 5' direction. It means a form that is coupled to each other in the direction.
  • Parallel bond refers to a form in which binding force is somewhat lower than that of antiparallel bond, and refers to a form in which both the bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid are bonded to each other in the 5' to 3' direction or 3' to 5' direction.
  • the binding force of the bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid is lower than the binding force of the bioactive nucleic acid and the bioactive nucleic acid to a target gene, in particular, mRNA of the target gene.
  • the bonding strength is determined by melting temperature, melting temperature or Tm.
  • Examples of a specific method for making the binding force (melting temperature, Tm) of the bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid lower than the binding force of the bioactive nucleic acid and the bioactive nucleic acid with a target gene, particularly the mRNA of the target gene, include,
  • the bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid may be characterized in parallel binding or partial specific binding, but is not limited thereto.
  • the carrier peptide nucleic acid has at least one peptide nucleic acid base selected from the group consisting of a linker, a universal base, and a peptide nucleic acid base having a base that is not complementary to a corresponding base of the bioactive nucleic acid. can be, but is not limited thereto.
  • the universal base binds without selectivity with natural bases such as adenine, guanine, cytosine, thymine, and uracil, and is complementary
  • natural bases such as adenine, guanine, cytosine, thymine, and uracil
  • At least one selected from the group consisting of inosine PNA, indole PNA, nitroindole PNA, and abasic as a base having a lower binding force than the binding force may be used, preferably It may be characterized by using inosine PNA.
  • the combination of the binding form and electrical properties of nucleic acids for controlling the function of the nucleic acid complex is provided, and the particle size and time of action are controlled by the combination of the binding form and electrical properties of the nucleic acid, and cell permeability, solubility and specificity It can be characterized by improving the degree.
  • the time point at which the bioactive nucleic acid is combined with the target sequence in the presence of the target gene (the point at which the bioactive nucleic acid is replaced with the target sequence, the target specificity separation and binding time), etc. can be controlled.
  • the control of the time of strand displacement and target specific release and binding of the bioactive nucleic acid to the target gene is a carrier peptide for non-specific binding of the complex. It may be characterized in that it can be controlled by the presence, number and position of non-specific bases, universal bases, and linkers of nucleic acids. It may be characterized in that it can be controlled by a combination of the above conditions, such as a parallel or antiparallel form of a complementary bond of the peptide complex.
  • the particles of the nucleic acid complex may have a size of 5 nm to 300 nm, preferably 10 nm to 200 nm, and most preferably 15 nm to 100 nm.
  • the particle size of the nucleic acid complex may be controlled by controlling the charge balance of the bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid. Specifically, when the positive charge of the carrier peptide nucleic acid increases, the particle size decreases, but when the positive charge of the carrier peptide nucleic acid exceeds a certain level, the particle size increases. In addition, the particle size is determined by the appropriate charge balance with the overall carrier peptide nucleic acid according to the charge of the bioactive nucleic acid complexed as another important factor determining the particle size.
  • the positive charge of the carrier peptide nucleic acid according to the present invention is 1 to 7 (meaning that 1 to 7 monomers having a positive charge are included), preferably 2 to 5, most preferably 2 to 3 and the charge of the bioactive nucleic acid is 0 to 5 negative charges, preferably 0 to 3 net charges of the charge balance.
  • the nucleic acid complex can be prepared by hybridizing a bioactive nucleic acid and a carrier peptide nucleic acid under appropriate conditions.
  • Hybridization in the present invention means that complementary single-stranded nucleic acids form a double-stranded nucleic acid. Hybridization may occur when complementarity between two nucleic acid strands is perfect (perfect match) or even when some mismatched bases are present. The degree of complementarity required for hybridization may vary depending on hybridization conditions, and in particular may be controlled by the binding temperature.
  • Target gene of the present invention means a nucleic acid sequence (base sequence) to be activated, inhibited or labeled, has no difference from the term “target nucleic acid”, and is used interchangeably herein.
  • the bioactive nucleic acid when a target nucleic acid (base sequence) containing a target gene is contacted (bound) with the complex in vitro or in vivo, the bioactive nucleic acid is separated from the carrier peptide nucleic acid. and exhibit biological activity.
  • diseases that can be prevented or treated using the nucleic acid complex may be determined according to the target gene of the bioactive nucleic acid in the nucleic acid complex.
  • the target gene of the bioactive nucleic acid may be characterized as NLRP3.
  • the disease that can be prevented and treated using the nucleic acid complex in the present invention may preferably be macular degeneration, and the macular degeneration includes age-related macular degeneration, dry macular degeneration and wet macular degeneration, Most preferably, the nucleic acid complex of the present invention is capable of preventing, improving or treating Dry Macular Degeneration.
  • the preventive and therapeutic effects on dry macular degeneration were confirmed, but the inflammasome, a caspase-1 activation complex protein complex related to NLRP3 protein, plays a major role in progressing from dry macular degeneration to wet macular degeneration.
  • the therapeutic composition of the present invention can be used to prevent, improve or treat wet macular degeneration, in particular, to prevent the progression from dry macular degeneration to wet macular degeneration (Alexander G. Marneros, 9445-958, 2013). ; Lucia Celkova, et. al., Journal of Clinical Medicine 4(1), 172-192, 2015; Yerramothu, P., et al., Eye 32, 491-505, 2018)
  • the term "therapeutic composition” may be used interchangeably with “pharmaceutical composition”, and the bioactive nucleic acid of the present invention and a carrier peptide nucleic acid binding to the nucleic acid It may include a nucleic acid complex comprising a nucleic acid complex as an active ingredient, and additionally, a therapeutic drug for treating a target disease is bound to the nucleic acid complex.
  • the pharmaceutical composition When the pharmaceutical composition is formulated and administered, it may be administered in the form of a formulation produced by a conventional method.
  • the form of the administered formulation may be, for example, eye drops, eye ointment, powder, granules, tablets, capsules, injections, ointments, and the like, and is preferably in the form of eye drops or skin delivery, but is not limited thereto.
  • Such formulations can be prepared according to methods common in the art.
  • a drop, spray, or gel form is possible, and as another method, it may be administered to the eye using liposomes. It can also be injected into the tear film through a pump-catheter system.
  • it can be incorporated into, carried by, or attached to, contact lenses over the eye.
  • the form contained in a sponge or cotton swab that can be applied to the ocular surface may be used, and a liquid spray that may be applied to the ocular surface may also be used.
  • composition according to the present invention may be formulated in the form of eye drops, aqueous solutions, gels, ointments, creams, lotions, pastes, smears or patches.
  • aqueous solution may be in the form of distilled water and a buffer solution.
  • formulations may contain additives such as pharmaceutically acceptable carriers, excipients, adjuvants or diluents suitable for formulations in a form that can be applied to the eye or skin in addition to the active ingredient.
  • additives such as pharmaceutically acceptable carriers, excipients, adjuvants or diluents suitable for formulations in a form that can be applied to the eye or skin in addition to the active ingredient.
  • pharmaceutically acceptable refers to a composition that is physiologically acceptable and does not normally cause allergic reactions such as gastrointestinal disorders, dizziness, or similar reactions when administered to humans.
  • carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
  • the pharmaceutical composition may further include a filler, an anti-aggregating agent, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, and a preservative.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may also be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • the formulation may be in the form of a sterile injectable solution or the like.
  • carrier is defined as a compound that facilitates the addition of a nucleic acid complex into a cell or tissue.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • carrier facilitates the introduction of many organic compounds into cells or tissues of living organisms.
  • diot is defined as a compound that not only stabilizes the biologically active form of the compound of interest, but is diluted in water which will dissolve the compound. Salts dissolved in buffer solutions are used as diluents in the art. A commonly used buffer solution is phosphate buffered saline because it mimics the salt state of human solutions. Because buffer salts can control the pH of a solution at low concentrations, buffer diluents rarely modify the biological activity of a compound.
  • the substance containing the nucleic acid complex in the present invention can be administered to the patient as a pharmaceutical composition as such or in combination with other active ingredients as in combination therapy or mixed with suitable carriers or excipients.
  • compositions suitable for use in the present invention include compositions in which the active ingredients are contained in amounts effective to achieve their intended purpose. More specifically, a therapeutically effective amount means an amount of a compound effective to prolong the survival of the subject being treated or to prevent, alleviate or ameliorate the symptoms of a disease. Determination of a therapeutically effective amount is within the ability of one of ordinary skill in the art, particularly in light of the detailed disclosure provided herein.
  • prevention refers to any action that prevents the onset of a disease or inhibits its progression by administration (or application) of a therapeutic composition comprising the cell-permeable nucleic acid complex.
  • the term "improvement” refers to any action of at least reducing the degree of a parameter, for example, a symptom, related to a treated state of a disease by administration (or application) of a therapeutic composition comprising the cell-permeable nucleic acid complex. .
  • treatment refers to any action in which symptoms of a disease are improved or cured by administration (or application) of a therapeutic composition comprising the cell-permeable nucleic acid complex.
  • Suitable delivery reagents include, but are not limited to, for example, Mirus Transit TKO lipophilic reagent, lipofectin, lipofectamine, cellfectin, polycations (eg, polylysine), atelocollagen, nanoplexes, and liposomes.
  • atelocollagen as a delivery vehicle for nucleic acid molecules is described in Minakuchi et al. Nucleic Acids Res., 32(13):e109 (2004); Hanai et al. Ann NY Acad Sci., 1082:9-17 (2006); and Kawata et al. Mol Cancer Ther., 7(9):2904-12 (2008).
  • Exemplary interfering nucleic acid delivery systems are provided in US Pat. Nos. 8,283,461, 8,313,772, and 8,501,930.
  • the cell-permeable nucleic acid complex may be administered (or applied) using a carrier such as liposome.
  • a carrier such as liposome.
  • the liposome may help to target the complex to a specific tissue, such as lymphoid tissue, or to selectively target an infected cell, and may also help increase the half-life of a composition comprising the complex.
  • Liposomes include emulsions, foams, micelles, insoluble monolayers, liquid crystals, phospholipid dispersions, and lamellar layers.
  • the complex to be delivered is liposomes, either alone or to specific cells in combination with a molecule that binds to a predominant receptor in lymphoid cells, such as a monoclonal antibody that binds to the CD45 antigen, or in combination with other therapeutic compositions.
  • liposomes filled or decorated with a given complex of the present invention to deliver the nucleic acid complex composition can be directed to the site of lymphocytes.
  • Liposomes for use in accordance with the present invention are generally formed from standard vesicle-forming lipids, including neutral and negatively charged phospholipids and sterols such as cholesterol.
  • lipids are selected in consideration of, for example, the stability of the liposome in the bloodstream, acid lability, and the size of the liposome.
  • Various methods can be used for preparing liposomes. See, eg, Szoka, et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:467, 1980), and US Pat. Nos. 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028 and 5,019,369).
  • the present invention provides a bioactive nucleic acid targeting the NLRP3 gene (Bioactive Nucleic Acid); And it relates to a method for preventing or treating macular degeneration, comprising administering to a subject a cell-permeable nucleic acid complex to which a carrier peptide nucleic acid (Carrier Peptide Nucleic Acid) is complementarily bound.
  • a bioactive nucleic acid targeting the NLRP3 gene Bioactive Nucleic Acid
  • Carrier Peptide Nucleic Acid Carrier Peptide Nucleic Acid
  • composition comprising the nucleic acid complex according to the present invention can be applied to the eye in an effective amount for the treatment of macular degeneration or to suppress (or alleviate) the symptoms of macular degeneration.
  • the type of macular degeneration, the age and weight of the patient, the characteristics and severity of symptoms, the type of current treatment, the number of treatments, the application form and route, etc. may vary depending on various factors, and may be easily determined by experts in the field.
  • the composition of the present invention may be applied together or sequentially with the aforementioned pharmacological or physiological components, and may also be applied in combination with an additional conventional therapeutic agent, or may be applied sequentially or simultaneously with the conventional therapeutic agent. These applications may be single or multiple applications.
  • “individual” means a mammal suffering from or at risk of a condition or disease that can be alleviated, inhibited or treated by administering (applying) the cell-permeable nucleic acid complex according to the present invention, preferably a human. it means.
  • the dosage (application amount) of the compound of the present invention to the human body may vary depending on the patient's age, weight, sex, administration (application) form, health status and disease level, and is based on an adult patient weighing 70 kg. In general, it is 0.001 to 1,000 mg/day, preferably 0.01 to 500 mg/day, and according to the judgment of a doctor or pharmacist, divided administration (applying) may be performed once or several times a day at regular time intervals. have.
  • the toxicity and therapeutic efficacy of a composition comprising a cell permeable nucleic acid complex described herein is, for example, LD50 (lethal dose for 50% of the population), ED50 (dose having a therapeutic effect on 50% of the population) , can be estimated by standard pharmaceutical procedures in cell culture or laboratory animals to determine the IC50 (dose having a therapeutic inhibitory effect on 50% of the population).
  • the dose ratio between toxicity and therapeutic effect is the therapeutic index, which can be expressed as the ratio between LD50 and ED50 (or IC50).
  • Compounds exhibiting high therapeutic indices are preferred. Data obtained from these cell culture assays can be used to estimate a range of doses used in humans.
  • the dosage or application of such compounds is preferably within a range of circulating concentrations that include the ED50 (or IC50) with little or no toxicity.
  • administration of the present invention means the act of introducing the pharmaceutical composition of the present invention to an individual in any suitable method, and the administration route can be administered through various routes, either oral or parenteral, as long as it can reach the target tissue. have.
  • the administration route of the pharmaceutical composition of the present invention may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited thereto, but depending on the purpose, intraocular instillation, intraretinal administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, intranasal administration, intrapulmonary administration , can be administered intrarectally.
  • the composition may be administered by any device capable of transporting the active agent to a target cell.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount, and the term "pharmaceutically effective amount" of the present invention means to treat or prevent a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment or prevention. It means a sufficient amount, and the effective dose level is the severity of the disease, the activity of the drug, the age, weight, health, sex, sensitivity of the patient to the drug, the time of administration of the composition of the present invention used, the route of administration and the rate of excretion.
  • the duration of treatment may be determined according to factors including drugs used in combination with or concurrently with the composition of the present invention and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or may be administered in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. and may be administered single or multiple. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount capable of obtaining the maximum effect with a minimum amount without side effects.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention can be determined by those skilled in the art in consideration of the purpose of use, the degree of addiction of the disease, the age, weight, sex, history, or the type of substance used as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered to mammals including humans at 10 to 100 mg/kg, more preferably 10 to 30 mg/kg, for one day, and the administration frequency of the composition of the present invention is Although not particularly limited thereto, it may be administered 1 to 3 times a day or administered several times by dividing the dose.
  • the present invention provides a bioactive nucleic acid targeting the NLRP3 gene (Bioactive Nucleic Acid); And the carrier peptide nucleic acid (Carrier Peptide Nucleic Acid) to the use of the cell-permeable nucleic acid complex complementarily bound to the prophylaxis or treatment of macular degeneration.
  • Bioactive Nucleic Acid Bioactive Nucleic Acid
  • Carrier Peptide Nucleic Acid Carrier Peptide Nucleic Acid
  • the macular degeneration may be dry macular degeneration or wet macular degeneration, and most preferably, dry macular degeneration.
  • the present invention provides a bioactive nucleic acid (Bioactive Nucleic Acid) targeting the NLRP3 gene for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of macular degeneration; And it relates to the use of a cell-permeable nucleic acid complex to which a carrier peptide nucleic acid (Carrier Peptide Nucleic Acid) is complementarily bound.
  • Bioactive Nucleic Acid Bioactive Nucleic Acid
  • Carrier Peptide Nucleic Acid Carrier Peptide Nucleic Acid
  • the macular degeneration may be dry macular degeneration or wet macular degeneration, and most preferably, dry macular degeneration.
  • the NLRP3 gene was used as a target gene.
  • Peptide nucleic acids antisense PNA
  • bioactive peptide nucleic acid used as a control of the present invention consists of the sequence shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, and the bioactive peptide nucleic acid (antisense PNA) used to confirm the therapeutic effect of dry macular degeneration is the sequence It consists of the sequence represented by No. 3 to No. 4.
  • the peptide nucleic acid-based bioactive nucleic acids used in this example the peptide GLFDIIKKIAESF (SEQ ID NO: 12) for helping the endosomal escape function of SEQ ID NOs: 1 and 3 was bound to 5', SEQ ID NOs: 2 and 4 are endosomes It was synthesized in a form without peptides that help escape function.
  • Carrier peptide nucleic acid used in this Example except for SEQ ID NOs: 6 and 11, all of the peptides for helping endosomes escape function were bound to the 5' to 3' ends, and consist of the sequence described. Base sequences, monomer modifications and structures are shown in Table 3 below.
  • Table 3 shows the sequence information of the bioactive nucleic acid and carrier peptide nucleic acid used as a control and the bioactive nucleic acid and carrier peptide nucleic acid used as a control to confirm the effect as a therapeutic agent for dry macular degeneration targeting the NLRP3 gene.
  • Modification of the monomer is converted into lysine (Lysine, Lys, K, (+)) for electrically positive and glutamic acid (Glutamic acid, Glu, E, (-) for electrically negative). It was prepared to have a modified peptide backbone as indicated).
  • Each bioactive nucleic acid and carrier peptide nucleic acid combination was hybridized under DMSO, and as a result, a complex including the bioactive nucleic acid and carrier peptide nucleic acid was prepared.
  • Example 2 Analysis of the therapeutic effect of dry macular degeneration using a nucleic acid complex
  • the therapeutic effect of dry macular degeneration was analyzed using a nucleic acid complex comprising a bioactive nucleic acid and a carrier peptide nucleic acid using the NLRP3 gene prepared according to Example 1 as a target gene.
  • Example 2-1 Cell culture
  • Human retinal pigment epithelium (ARPE-19, ATCC NO. CRL-2302) obtained from ATCC (American Type Culture Collection, USA) was treated with DMEM:F-12 culture medium (Dulbecco Modified Eagle Medium Nutrient Mixure F-12 (Ham), Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) was added with 10% (v/v) fetal bovine serum, penicillin 100 units/ml, and streptomycin 100 ⁇ g/ml, and under the conditions of 37_, 5% (v/v) CO2 cultured.
  • IL Interleukin
  • LPS Lipopolysaccharide
  • Example 2-2 Analysis of gene expression through Western blot assay
  • the human-derived retinal pigment epithelial cell line was seeded at 1x105 in a 6-well plate, and after culturing for 24 hours, the experiment was performed under the conditions of Example 2-1 to process a complex containing a bioactive peptide nucleic acid and a carrier peptide nucleic acid, After incubation for 48, 72, 96, and 120 hours, 30 ⁇ L of RIPA buffer was added to each well to obtain protein lysate.
  • Protein lysate is quantified by BCA assay kit (Thermo Fisher, USA), and 30 ⁇ g of protein is separated by size through electrophoresis, transferred to PVDF membrane, and the primary antibody, NLRP3 (abcam, USA) , ASC (SantaCruz Biotechnology, USA), procaspase-1, caspase-1 (SantaCruz Biotechnology, USA), proIL-1beta, IL-1beta (Abcam, USA) were treated at 1:1000 and left at 4°C for one day.
  • BCA assay kit Thermo Fisher, USA
  • NLRP3 and sub-stage gene expression changes in a dry macular degeneration-like cell model using IL-1alpha were analyzed, and the nucleic acid complex combinations used are the same as in Table 4.
  • a human-derived retinal pigment epithelial cell line was seeded at 5x103 in an 8-well plate and cultured for 24 hours, followed by an experiment under the conditions of Example 2-1 to process a complex containing a bioactive peptide nucleic acid and a carrier peptide nucleic acid, , 48, 72 after incubation, fixed in 4% paraformaldehyde, and then blocked with 0.1% Triton X-100 and normal donkey serum, and the primary antibody NLRP3 (abcam, USA) and caspase-1 (SantaCruz Biotechnology, USA) were treated at 1:200 and left at 4°C for one day.
  • NLRP3 and sub-stage gene expression changes in a dry macular degeneration-like cell model using LPS were analyzed, and the nucleic acid complex combinations used are the same as in Table 5.
  • Example 3 Analysis of the treatment effect in NaIO 3 induced animal model similar to dry macular degeneration using a nucleic acid complex
  • nucleic acid combinations whose effects were verified through Example 2 were selected and the phenotype and histological findings were analyzed in an animal model similar to dry macular degeneration using NaIO 3 , and the nucleic acid complex combinations used are shown in Table 6.
  • Example 3-1 Experimental Animal Breeding and Experimental Design
  • a 5-week-old male B6 mouse was used after acclimatization for a week.
  • NaIO3 (Sigma, USA) 35mg/kg was intravenously injected to induce selective degeneration and damage of retinal pigment epithelial cells as one of the changes seen in macular degeneration.
  • nucleic acid complexes (1, 2) were treated with eye drops at 60 ⁇ g / 1 drop once a day for the control group (nucleic acid complex 1) and the test drug group (nucleic acid complex 2) in the case of 60 ⁇ g / 1 drop once a day for 14 days, the experiment was divided into groups treated.
  • the slide sections were prepared by fixing them in 4% paraformaldehyde and embedding them in paraffin.
  • the slide sections were stained with Hematoxylin & Eosin (H&E) and retinal tissue was evaluated under an optical microscope.
  • H&E Hematoxylin & Eosin
  • the retinal pigment epithelial cells were damaged due to NaIO3 administration and the nuclei of photoreceptor cells located immediately above were concentrated in the outer nuclear layer and the inner nuclear layer. warping was observed. In the group treated with the nucleic acid complex using eye drops, it was confirmed that damage to the retinal pigment epithelial cells was inhibited, thereby inhibiting the collapse of the granular layer.
  • Example 3-2 Effect of 4-week administration of nucleic acid complex (60ug) of NLRP3 target gene
  • Example 3-1 the nucleic acid complex (1, 2) was treated with an eye drop at 60 ⁇ g/1 drop/1 day for 28 days to prevent damage to the retinal pigment epithelium.
  • the slide sections were prepared by fixing them in 4% paraformaldehyde and embedding them in paraffin.
  • the slide sections were stained with Hematoxylin & Eosin (H&E) and retinal tissue was evaluated under an optical microscope.
  • H&E Hematoxylin & Eosin
  • the retinal pigment epithelial cells were damaged due to NaIO 3 administration and the nuclei of photoreceptor cells located immediately above were concentrated in the outer nuclear layer and the inner nuclear layer. ), the bending phenomenon was observed. In the group treated with the nucleic acid complex using eye drops, it was confirmed that damage to the retinal pigment epithelial cells was inhibited, thereby inhibiting the warpage of the extragranular layer.
  • Example 3-3 Analysis of the therapeutic effect of NaIO 3 induced animal model using a nucleic acid complex
  • nucleic acid complexes (6, 7) of Table 7 were used to inhibit damage to the retinal pigment epithelium using eye drops.
  • Nucleic acid complex No. 6 was administered at 30 ⁇ g / 1 drop / 1 day for 14 days
  • Nucleic acid complex No. 7 was 30 ⁇ g / 1 drop / 1 day
  • Nucleic acid complex No. 7-1 was 10 ⁇ g / 1 drop / 1 day
  • nucleic acid In case of Complex 7-2 the inhibitory effect was confirmed by administering 5 ⁇ g / 1 drop / 1 day for 14 days.
  • MCC950 InvivoGen, USA
  • an NLRP3 inhibitor was orally administered daily for 14 days at a dose of 10 mg/kg.
  • the slide sections were prepared by fixing them in 4% paraformaldehyde and embedding them in paraffin.
  • the slide sections were stained with Hematoxylin & Eosin (H&E) and retinal tissue was evaluated under an optical microscope.
  • H&E Hematoxylin & Eosin
  • FIG. 5 it was observed that retinal degeneration was induced by inducing retinal pigment epithelial cell degeneration through oxidative stress by administration of NaIO 3 , and nucleic acid complex (PNA 7, 30 ⁇ g / 1 drop / 1). day), it was confirmed that the degeneration of retinal pigment epithelial cells was reduced compared to the positive control (PC).
  • PC positive control
  • PNA 7-1 10 ⁇ g / 1 drop / 1 day
  • PNA 7-2 5 ⁇ g / 1 drop / 1 day
  • the thickness of the outer nuclear layer in which the nuclei of photoreceptor cells are concentrated in the retina was significantly inhibited to confirm the treatment effect of dry macular degeneration.
  • the cell-permeable nucleic acid complex in which a bioactive nucleic acid targeting NLRP3 according to the present invention and a carrier peptide nucleic acid are complementarily combined has high cell permeability, so it can be administered by various methods including eye drops or skin application in addition to direct injection. And, by suppressing the expression of NLRP3, it is useful for the prevention, improvement or treatment of macular degeneration.

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Abstract

본 발명은 세포 투과성 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 황반변성의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 상보적으로 결합된 세포 투과성 핵산 복합체를 함유하는 황반변성의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 상보적으로 결합된 세포 투과성 핵산 복합체는 세포 투과성이 높아 직접적인 주사투여 없이도 NLRP3의 발현을 억제함으로써, 황반변성의 예방, 개선 또는 치료에 유용하다.

Description

세포 투과성 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 황반변성의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 세포 투과성 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 황반변성의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 NLRP3 유전자를 표적하는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 상보적으로 결합된 세포 투과성 핵산 복합체를 함유하는 황반변성의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
녹내장, 당뇨병성 망막병증과 함께 3대 실명질환으로 꼽히는 황반변성은 크게 습성 (삼출성) 황반변성과 건성 (비삼출성) 황반변성으로 분류된다. 망막 중심부에 위치한 신경조직인 황반은 시력에 중요한 역할을 하는 곳으로 특히 건성 황반변성의 경우 나이가 들면서 드루젠 (drusen)의 축적으로 망막 및 맥락막 위축이 나타나는 질환으로 시력에는 영향을 주지 않지만 습성 황반변성으로 진행할 수 있어 주의가 필요한 질환이다. 대부분 노화로 인해 발생하여 노인성 질환으로 여겼으나 최근에는 청장년층에서도 발병이 증가하는 추세로, 2011-2015년의 황반변성 환자는 5년 사이에 49% 가량이 증가하였다(건강보험심사평가원). 황반변성의 주요 원인은 노화이며, 그 다음으로 유전적인 요인, 그리고 환경적 요인으로는 자외선, 흡연, 고지방?고열량의 서구화 식단 등이 꼽히고 있다.
일반적인 건성(비삼출성) 황반변성의 치료방법에는 황반변성의 진행을 낮추는 것으로 알려진 항산화 비타민제의 복용을 하고, 황반변성의 위험인자인 고혈압, 고지혈증 등에 대한 치료와, 흡연 및 자외선 차단과 같은 생활치료가 병행된다. 건성 (비삼출성) 황반 변성에서 습성 (삼출성) 황반변성으로 진행되는 경우, 시력보존을 위한 적극적인 치료가 필요하다. 변성이 일어난 부위의 경계를 명확히 알 수 있는 경우는 열레이저광응고술을 시행하며, 광역학치료, 항체주사, 유리체절제술 등을 시행하나 아직까지 완전한 치료법은 없고 이에 관한 활발한 연구가 진행 중이다.
건성 (비삼출성) 황반변성에서 습성 (삼출성) 황반변성으로 진행되는 경우의 치료방법은 일반적으로 열레이저응고술을 시행하여 장기적인 시력저하를 예방하지만, 레이저치료 후 즉시 망막을 손상시켜 시력이 감소되는 문제점이 있다. 그 후 이러한 문제점을 보완하기 위해 약물과 레이저를 함께 사용하는 광역학치료 (Photodynamic therapy, PDT)가 개발되어 신생혈관성 병변을 안정화시키는데 도움이 되기는 하지만, 치료의 적응에 제한이 있고, 치료약이 비싸며 재치료를 필요로 하는 경우가 많은 단점이 있다.
최근에는 항 혈관내피성장인자 항체 (Anti-VEGF antibody)를 눈 속으로 주사하는 방법이 주로 사용되고 있다. 대표적인 약물에는 아플리버셉트 (아일리아), 라니비주맙 (루센티스), 베바시주맙 (아바스틴)이 있다. 앞의 치료에 비해 많은 수의 환자에서 시력 유지가 가능하며 일부에서 시력의 호전이 가능하다고 보고되고 있다. 그러나 4주 내지 8주 마다 반복적으로 주사를 시행해야 한다는 불편이 있으며 고가라는 단점이 있다.
한편, NLRP3는 염증반응에 관여하는 단백질로서, IL-1β, IL-18 발현에 주요한 역할을 한다. NLRP3(NOD-like receptor family, pyrin domain-containing 3)는 caspase-1 활성화 복합 단백질 복합체인 인플라마좀 (Inflammasome)을 구성한다. 상기 인플라마좀은 감각 단백질(sensor protein)인 NLRP3(NOD-like receptor family, pyrin domain-containing 3); 연결 단백질(adaptor protein)인 ASC(adaptor protein apoptosis-associated spec-like protein containing a caspase-recruitment domain); 및 이펙터 단백질인 pro-caspase-1로 구성되는 것으로 알려져 있으며, 조립에 의해 활성화된 Inflammasome은 caspase-1을 활성화시켜 IL-1_ 또는 IL-18을 분비하여 염증반응을 유발한다. NLRP3 inflammasome 활성화와 망막질환(건성, 습성 노인성 황반변성)과의 연관성은 종래의 여러 문헌에서 보고된 바 있다(Lucia Celkova, et al., NLRP3 Inflammasome and Pathobiology in AMD, J Clin Med. 2015 Jan; 4(1): 172-192). 또한, 건성 (비삼출성) 황반변성은 과도한 양의 드루젠이 존재한다는 특징이 있으며, Sarah Doyle 및 Matthew Campbell은 황반에 축적된 드루젠이 염증반응을 통해 IL-18, IL-1β의 생성으로 이어질 수 있고, IL-18 등에 의해 건성 황반변성에서 습성 황반변성으로 진행될 수 있다고 보고한 바 있다. 또한, NLRP3는 AluRNA의 축적, Dicer-1의 손실과 연관되어 있으며, NLRP3 inflammasome과 더불어 caspase-1의 활성화로 망막 색소상피 위축(retinal pigment epithelial degeneration을 일으켜, 이는 in vivo 상에서 지도형위축과 매우 흡사한 양상을 나타낸다고 보고된 바 있다(Valeria Tarallo et al., Cell 2012 May 11;149(4):847-59).
다른 한편, 전통적인 약제와 다르게 핵산 약제는 표적 특이적 전령 RNA(messenger RNA, mRNA)의 발현을 억제하므로, 단백질을 표적으로 하는 기존 약제로 치료가 불가능 했던 연구 영역을 다룰 수 있게 되었다(Kole R. 등 Nature Rev. Drug Discov. 2012; 11; 125-140., Wilson C. 등 Curr. Opin. Chem. Bio. 2006; 10: 607-614.). 약제로서의 성능 및 장점으로 인하여 핵산을 이용한 다양한 임상시험이 진행되고 있고, 증가하는 핵산 기반 치료제의 용도에도 불구하고 세포내 도입을 위한 운반체의 사용은 극히 제한적이다. 예를 들어, 나노입자(nanoparticle), 양성 리포좀(cationic liposome) 및 폴리머 나노입자(polymeric nanoparticle)룰 사용하는 올리고 핵산을 기반으로 하는 약제의 세포 또는 조직 내로의 운반 전략(방법)을 사용한 임상시험이 진행되고 있으나, 대다수의 경우 운반 시스템을 포함하지 않고, 비경구적인 방법인 근육주사, 안구(ocular) 투여, 피하주사 등의 투여 경로(administration route)로 핵산의 직접 도입이 주를 이루고 있다.
또한, 올리고 핵산 자체의 세포막 투과 능력은 상당히 낮으며, 특히 DNA 또는 RNA는 음전하를 띄고 있기 때문에, 세포의 소수성 인지질 이중막을 통과하지 못하므로 단순 확산을 통한 세포 내 전달이 어렵다. 레트로바이러스(Retrovirus) 혹은 AAV(adeno-associated virus) 등의 바이러스 운반체의 사용은 올리고 핵산의 세포내 도입을 가능하게 하지만, 의도치 않은 면역활성과 발암유전자(oncogene)의 재조합 가능성 등의 위험성이 있다(Couto L. B. 등 Curr. Opin. Pharmacol. 2010, 5; 534-542.).
이러한 이유로 세포독성이 적고, 면역활성이 낮은 비-바이러스성 올리고 핵산을 기반으로 하는 핵산 운반체 개발의 중요성이 더욱 커지고 있으며, 그 결과로 양전하성 지질(cationic lipid), 리포좀(liposome, 안정된 핵산 지질 입자(stable nucleic acid lipid particle, SNALP), 폴리머 및 세포-투과 입자(cell-penetrating peptide)를 이용한 세포 도입 기법이 개발되고 있다(Zhi D. 등 Bioconjug. Chem. 2013, 24; 487-519., Buyens K. 등 J. Control Release, 2012, 158; 362-70., ROSSI, J. J. 등 Gene Ther. 2006, 13: 583-584., Yousefi A. 등 J. Control Release, 2013, 170; 209-18., Trabulo S. 등 Curr. Pharm. Des. 2013, 19; 2895-923.).
이러한 핵산전달 기법은 기능성 잔기를 직접적인 결합으로 가지고 있으며, 복합체 형성을 위한 단계를 포함하고, 리포좀(liposome) 구조의 엔도좀 에스케이프(endosome escape) 효율 및 생체독성 등의 문제점을 가지고 있어, 올리고 핵산 도입 기능의 향상과 제조 절차 및 부작용과 관련된 문제점의 해소가 필요하다.
이와 관련하여, 본 발명자들은 생활성 핵산과 전체적으로 양전하를 가지도록 변형된 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체가 세포 투과성(cell permeability)이 놀랍게 향상되며, 이를 이용하여 표적 유전자의 발현을 매우 효율적으로 조절할 수 있음을 확인하고, 이러한 세포 독성이 낮고, 생활성 핵산의 세포투과성 및 유전자 발현 조절능력이 향상된 새로운 구조체에 대한 특허를 등록받은 바 있다(대한민국 특허 제10-1963885호).
상기 구조체 및 치료용 약물 등의 세포 전달 기능이 향상에 대한 연구를 지속적으로 수행한 결과, 본 발명자들은 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)과 전체적으로 양전하를 가지도록 변형된 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체가 피부 및 세포를 매우 효율적으로 통과하는 특성을 가지고 있어, 이러한 핵산 복합체가 세포 투과성이 우수함을 확인하였다.
이에, 본 발명자들은 안구 세포 투과성을 향상시켜서 직접적인 주사 투여 없이, 안구 점안액투여와 같은 간단한 방법으로 황반변성을 효과적으로 치료할 수 있는 핵산 복합체를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 상보적으로 결합된 세포 투과성 핵산 복합체가 황반변성의 예방 또는 치료에 우수한 효과를 나타냄을 규명하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 세포 투과성이 높고 황반변성의 예방 또는 치료 효과가 우수한 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 황반변성의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산 (Bioactive Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 세포 투과성 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 황반변성의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 세포 투과성 핵산 복합체를 투여하는 단계를 포함하는 황반변성의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 세포 투과성 핵산 복합체를 황반변성의 예방 또는 치료에 사용하는 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 황반변성의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 상기 세포 투과성 핵산 복합체의 용도를 제공한다.
도 1은 핵산 복합체의 투여 후, 시간(24시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 120시간)에 따른 NLRP3 및 하위단계의 유전자 발현 변화를 확인한 웨스턴 블랏 분석 결과이다. 각 레인의 복합체(1, 2, 3, 4, 5)는 표 4에 개시되어 있다.
도 2a는 표 5의 핵산복합체를 건성 사람 유래 망막색소상피 세포주에 처리한 후, 시간(1일, 3일 및 5일)에 따른 NLRP3의 발현 변화를 확인한 면역세포화학 염색법으로 분석한 결과이다.
도 2b는 표 5의 핵산복합체를 건성 사람 유래 망막색소상피 세포주에 처리한 후, 시간(1일, 3일 및 5일)에 따른 하위단계 유전자(Caspase-1)의 발현 변화를 확인한 면역세포화학 염색법으로 분석한 결과이다.
도 3은 황반 변성이 유도된 마우스에서 표 6의 핵산 복합체를 함유하는 안구점안액을 투여한 후, 2주 뒤에 광한현미경으로 관찰한 망막 조직 사진이다. 핵산 복합체 처리군에서 망막색소상피세포의 손상이 억제되고 외과립층과 내과립층의 붕괴 현상이 완화되었다.
도 4는 황반 변성이 유도된 마우스에서 표 6의 핵산 복합체를 함유하는 안구점안액을 투여한 후, 4주 뒤에 광한현미경으로 관찰한 망막 조직 사진 및, 안저 촬영을 통해 확인한 드루젠의 축적과 맥락막 위축부위를 image J로 수치화한 그래프이다.
도 5a는 황반 변성이 유도된 마우스에서 표 7의 핵산 복합체를 함유하는 안구점안액을 투여한 후, 2주 뒤에 광한현미경으로 관찰한 망막 조직 사진이다.
도 5b는 황반 변성이 유도된 마우스에서 표 7의 핵산 복합체를 함유하는 안구점안액을 투여한 후, 2주 뒤에 확인한 망막 절편 사진이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
황반변성은 실명 원인 1위를 유지하고 있으며 이는 건강한 노년의 삶을 위협하고 있다. 건성 황반변성은 드루젠의 존재 여부, 드루젠의 크기 및 개수 그리고 지도형 위축의 존재 여부와 침범범위에 따라 초기, 중기, 후기의 황반변성으로 구분한다. 건성 황반변성 환자의 약 10%는 습성 황반변성으로 진행되는 것으로 알려져 있으며, 최종적으로는 실명에 이를 수 있어, 건성 황반변성 치료제의 개발이 매우 중요하다. 현재 건성 황밤 변성이 발병한 경우에, 항산화 비타민제의 복용, 황반변성의 위험인자인 고혈압, 고지혈증 등에 대한 치료 및 흡연 및 자외선 차단과 같은 생활치료와 같이, 병의 치료보다는 현상 유지 및 습식 황반변성 등으로의 병의 진행을 억제하는 데 의미가 있으며, 효과적인 치료제는 전무한 실정이다.
본 발명에서는 NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 상보적으로 결합된 세포 투과성 핵산 복합체가 황반변성의 예방 및 치료에 활용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명자들의 대한민국 등록특허 제10-1963885호를 기반으로, NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 상보적으로 결합된 세포 투과성 핵산 복합체를 인간 망막색소 상피세포에 처리한 경우에, 효과적으로 NLRP3 및 하위단계 유전자의 발현이 억제되는 것을 확인하였으며, 본 발명의 다른 실시예에서, 상기 핵산 복합체를 안구에 투여한 마우스에서, 망막색소상피세포의 손상이 억제될 뿐만 아니라, 외과립층과 내과립층의 붕괴 현상이 완화되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산 (Bioactive Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 세포 투과성 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 황반변성의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 생활성 핵산과 캐리어 펩티드가 상보적으로 결합된 핵산 복합체는 하기 구조식 (1)의 구조를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
구조식 (1)
[ A ≡ C(+) ]
상기 구조식 (1)에 있어서,
A는 목적하는 유전자와 결합할 수 있는 서열을 가지는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)이고,
C는 생활성 핵산과 결합할 수 있는 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이고,
'≡'는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 간의 상보적인 결합을 의미하며,
A로 표시되는 생활성 핵산은 전체적으로 음전하 또는 중성을 가지며,
C(+)는 캐리어 펩티드 핵산이 전체적으로 양전하를 가진다는 것을 의미하며,
캐리어 펩티드 핵산은 캐리어 펩티드 핵산 전체적으로 양전하를 띠도록 변형된 펩티드 핵산 단량체를 하나 이상 포함한다.
본 발명에 따른 핵산 복합체에서의 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 역평행결합(anti-parallel binding) 또는 평행결합(parallel binding) 형태를 가질 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 핵산의 상보적인 결합 형태는 생활성 핵산의 목적서열(생활성 핵산과 상보적인 서열) 존재 하에서 분리될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 캐리어 펩티드 핵산 전체적으로 양전하를 띠도록 1개 이상의 gamma- 또는 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체를 하나 이상 포함하는 것이 바람직하며, 상기 gamma- 혹은 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 아미노산을 가지는 단량체가 음전하를 가지는 아미노산을 가지는 단량체에 비해 더 많이 포함되어 전체적인 캐리어 펩티드 핵산의 전하가 양성이 되도록 하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 있어서, "생활성 핵산"은 생체외(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 표적 유전자, 및 이를 포함하는 염기서열과 결합하여 해당 유전자의 고유 기능(예를 들어, 전사체(transcript) 발현 또는 단백질 발현)을 활성화시키거나 또는 저해하거나, pre-mRNA의 스플라이싱(splicing)을 조절(예를 들어, 엑손스키핑 (exon skipping) 하는 등의 기능을 수행하며, 상기 염기서열은 유전자 조절부위(gene regulatory sequence) 또는 유전자 부위(gene coding sequence) 또는 스플라이싱 조절 부위 (splicing regulatory sequence)인 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는, 상기 생활성 핵산은 발현을 감소시키고자 하는 목적하는 표적 유전자와 결합할 수 있는 상보적인 서열, 특히 그러한 목적하는 표적 유전자의 mRNA에 결합할 수 있는 상보적인 서열을 가지는 핵산으로, 해당 유전자의 발현을 억제하는 등의 유전자 발현조절에 관여하는 핵산을 의미하며, 발현을 감소시키고자 하는 표적 유전자에 상보적인 서열을 가지는 핵산일 수 있다.
따라서, 본 발명에서의 "생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)"은 황반변성의 관련 표적 유전자인 NLRP3(NOD-like receptor family, pyrin domain-containing 3) 유전자의 안티센스 펩티드 핵산인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 하기 표 1의 서열번호 4의 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
Figure PCTKR2021000102-appb-T000001
상기 생활성 핵산은 DNA, RNA, 또는 변형된 핵산인 PNA(peptide nucleic acid), PMO(phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide), LNA(locked nucleic acid), GNA(glycol nucleic acid) 및 TNA(threose nucleic acid), 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), 앱타머(aptamer), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), 리보자임(ribozyme) 및 DNAzyme로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 생활성 핵산은 DNA, RNA, 또는 변형된 핵산인 PNA(peptide nucleic acid), PMO(phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide), LNA(locked nucleic acid), GNA(glycol nucleic acid) 및 TNA(threose nucleic acid)로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, "캐리어 펩티드 핵산"은 생활성 핵산과 일부 혹은 전부의 염기가 상보적으로 결합하여 기능성을 부여하는 핵산을 의미하며, 본 발명에서 사용되는 캐리어 펩티드 핵산은 펩티드 핵산(PNA : Peptide Nucleic Acid) 뿐 아니라, 이와 유사한 변형된 핵산을 사용할 수 있으며, 펩티드 핵산이 바람직하지만, 이에 한정되는 의미는 아니다.
특히, 본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 하기 표 2의 서열번호 5 내지 11로 구성된 군에서 선택되는 서열로 표시되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
Figure PCTKR2021000102-appb-T000002
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 포스포디에스테르(phosphodiester), 2'0-메틸(2'0-methyl), 2' 메톡시-에틸(2' methoxy-ethyl), 포스포르아미데이트(phosphoramidate), 메틸포스포네이트(methylphosphonate) 및 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 작용기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, "세포 투과성 핵산 복합체"는 세포 외 처리를 통해 생활성 물질을 체내, 궁극적으로 세포 내로 침투시킬 수 있으며, 구체적으로, 세포 내로 NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산을 전달할 수 있는 능력을 가진다.
본 발명에 따른 세포 투과성 핵산 복합체에서의 전체적인 전하량(net charge) 및/또는 핵산 복합체에서의 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산의 개수 등에 따라 안구에 잔류하거나, 세포를 통과하여 체내로 전달될 수 있다
이에 따라 본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체는 안구 잔류성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 "세포 투과성 핵산 복합체"는 세포 내로의 직접 투여 이외에도, 안구 위 점안, 망막 내 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 또는 경피 투여 등을 통해 목적하는 세포 내, 본 발명에서는 안구세포 내로 전달될 수 있는 특성을 가지며, 상기 핵산 복합체를 함유하는 어떠한 형태로도 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 투과성 핵산 복합체는 서열번호 2로 표시되는 생활성 핵산; 및 서열번호 3 내지 7로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열로 표시되는 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력(융해온도, melting temperature, Tm)은 생활성 핵산과 생활성 핵산의 표적인 NLRP3 유전자와의 결합력보다 낮은 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 결합력은 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산은 각각의 핵산의 5'-방향성 및 3'-방향성에 따라 평행 결합(Parallel binding) 또는 부분 특이결합(Partial specific binding)함으로써, 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력(융해온도, melting temperature, Tm)이 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자와의 결합력보다 낮게 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 생활성 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산은 각각의 핵산의 5'-말단 또는 3'-말단에 엔도좀 탈출을 도와주는 물질이 추가로 결합된 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 엔도좀 탈출(endosome escape)을 도와주는 물질을 더 포함하여 하기 구조식 (2)의 구조를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
구조식 (2)
[ mA ≡ mC(+) ]
상기 구조식 (2)에 있어서,
'm'은 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 엔도좀 탈출(endosome escape)을 도와주는 물질을 의미한다.
본 발명에 있어서, "엔도좀 탈출을 도와주는 물질"은 엔도좀 내부의 삼투압을 증가시키거나, 엔도좀의 막을 불안정화 시키는 방법에 의하여 생활성 핵산의 엔도좀에서 탈출을 도와주는 것을 특징으로 할 수 있다. 생활성 핵산이 보다 효율적이고 빠르게 핵이나 세포질로 이동하여 표적 유전자를 만나 작용하도록 도와주는 것을 의미한다(D. W. Pack, A. S. Hoffman, S. Pun, P. S. Stayton, "Design and development of polymers for gene delivery," Nat. Rev. Drug. Discov., 4, 581-593 (2005)).
본 발명에 있어서, 상기 엔도좀 탈출을 도와주는 물질은 펩티드, 지질 나노물질(lipid nanoparticles), 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles), 고분자 나노구(polymer nanospheres), 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles), 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles), 양이온 고분자(cationic polymer) 및 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 엔도좀 탈출을 도와주는 물질로서 생활성 핵산에는 펩티드 (GLFDIIKKIAESF, 서열번호 12)가 링커 매개로 연결될 수 있으며, 캐리어 펩티드 핵산에는 Histidine(10)을 링커 매개로 연결하는 방법으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 지질 나노물질(lipid nanoparticles)은 Lipid, phospholipids, acetyl palmitate, poloxamer 18, Tween 85, tristearin glyceride 및 Tween 80로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles)은 poly(amidoamine) 또는 polyethylenimine (PEI)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 고분자 나노구(polymer nanospheres)는 polycaprolactone, poly(lactide-co-glycolide, polylactide, polyglycolide, poly(d,l-lactide), chitosan 및 PLGA-polyethylene glycol로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles)은 Fe2O3 Fe3O4, WO3 및 WO2.9로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles)은 1-(aminoethyl)iminobis[N-(oleicylcysteinyl-1-amino-ethyl)propionamide], N-alkylated derivative of PTA 및 3, 5-didodecyloxybenzamidine로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 양이온 고분자(cationic polymer)는 vinylpyrrolidone-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate acid copolymer diethyl sulphate, polyisobutylene 및 poly(N-vinylcarbazole)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)는 polyacids, poly(acrylic acid), poly(methacrylic acid) 및 hydrolyzed polyacrylamide로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 각각 2 내지 50개, 바람직하게는 5 내지 30개, 더욱 바람직하게는 10 내지 25개, 가장 바람직하게는 15 내지 17개의 핵산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 생활성 핵산은 천연(natural) 핵산 염기 및/또는 변형된 핵산 단량체로 이루어져 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어, 상기 생활성 핵산에 사용된 단량체가 PNA일 경우, 생활성 핵산이라고 하며, 다른 단량체가 사용된 경우에도 동일한 방식으로 부른다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 포스포디에스테르(phosphodiester), 2' 0-메틸(2' 0-methyl), 2' 메톡시-에틸(2' methoxy-ethyl), 포스포르아미데이트(phosphoramidate), 메틸포스포네이트(methylphosphonate) 및 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 작용기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 상기 생활성 핵산과 염기서열 일부 혹은 전부가 상보적인 서열로 구성되는 것을 특징으로 할 수 있다. 특히, 캐리어 펩티드 핵산은 유니버설 염기(universal base)를 하나 이상 포함할 수 있으며, 캐리어 펩티드 핵산 모두가 유니버설 염기로 이루어질 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 투과성 핵산 복합체 내의 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산 각각은 전기적 특성이 전체적으로, 양전하(양성), 음전하(음성) 또는 중성 전하를 가지는 것을 특징으로 하는 복합체일 수 있다.
상기 전기적 특성의 표현에 있어, "전체적으로"의 의미는 개별 염기의 전기적 특성이 아닌 전체적인 생활성 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산 각각의 전하가 외부에서 볼 때 전체적인 전기적 특성을 의미하는 것으로, 예를 들어, 생활성 핵산 내의 일부 단량체가 양성을 가지더라도 음성을 가지는 단량체의 개수가 더 많이 존재하는 경우에는 생활성 핵산은 "전체적으로" 전기적 특성을 볼 때 음전하를 가지게 되는 것이며, 캐리어 펩티드 핵산 내의 일부 염기 및/또는 백본(backbone)이 음성을 가지더라도 양성을 가지는 염기 및/또는 백본의 개수가 더 많이 존재하는 경우에는 캐리어 펩티드 핵산은 "전체적으로" 전기적 특성을 볼 때 양전하를 가지게 되는 것이다.
이러한 관점에서, 본 발명의 핵산 복합체는 전체적으로 양전하를 가지는 것이 바람직하다. 상기 핵산 복합체에 있어서, 바람직하게는 상기 생활성 핵산은 전체적으로 전기적 특성을 볼 때 음전하 또는 중성의 특성을 가지며, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 전기적 특성을 볼 때 양전하 특성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 전기적 특성의 부여는 변형된 펩티드 핵산 단량체를 사용할 수 있고, 변형된 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 캐리어 펩티드 핵산으로 리신(Lysine, Lys, K), 아르기닌(Arginine, Arg, R), 히스티딘(Histidine, His, H), 디아미노 부티르산(Diamino butyric acid, DAB), 오르니틴(Ornithine, Orn) 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양전하의 아미노산을 포함하고, 음전하를 가지는 캐리어 펩티드 핵산으로 음전하의 아미노산인 글루타민산(Glutamic acid, Glu, E) 또는 아미노산 유사체의 음전하의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 양전하를 가지도록 1개 이상의 gamma- 또는 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 gamma- 혹은 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체는 전기적 양성을 가지도록 리신(Lysine, Lys, K), 아르기닌(Arginine, Arg, R), 히스티딘(Histidine, His, H), 디아미노 부티르산(Diamino butyric acid, DAB), 오르니틴(Ornithine, Orn) 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양전하를 가지는 아미노산을 backbone에 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 전하 부여를 위한 펩티드 핵산 단량체의 변형은 상기 backbone 변형 이외에도 nucleobase가 변형된 펩티드핵산 단량체를 사용할 수 있다. 바람직하게는 전기적 양성을 가지도록 amine, triazole, imidazole moiety를 nucleobase에 포함하거나, 전기적 음성을 가지도록 carboxylic acid를 염기에 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산의 변형 펩티드 핵산 단량체는 음전하를 backbone 혹은 nucleobase에 더 포함할 수 있지만, 변형 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 단량체가 음전하를 가지는 단량체에 비해 더 많이 포함되어 전체적으로 캐리어 펩티드 핵산의 전하가 양성이 되는 것이 바람직하다.
바람직하게는 본 발명에 따른 상기 핵산 복합체는 전체적으로 양의 전하를 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 상기 핵산 복합체에 있어, 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머 또는 형광/발광 표지자 등으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 물질이 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산에 결합된 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 상기 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머 및 이미징을 위한 형광/발광 표지자 등으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 물질은 상기 캐리어 펩티드 핵산에 결합된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머, 소광자, 형광 표지자 및 발광 표지자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 물질과 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산의 결합은 단순 공유결합 또는 링커로 매개된 공유결합인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 핵산 운반체에 결합된 세포투과, 용해도, 안정성, 운반 및 이미징 관련 물질(예컨대, 소수성 잔기 등)은 표적 유전자의 발현을 조절하는 생활성 핵산과 독립적으로 존재하게 된다.
본 발명에 있어서, 앞서 기술한 바와 같이, 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 상보적인 결합 형태는 크게 역평행결합(antiparallel binding)과 평행결합(parallel binding)의 형태를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 상보적인 결합 형태는 생활성 핵산의 목적서열(생활성 핵산과 상보적인 서열) 존재 하에서 분리되는 구조를 가진다.
상기 역평행결합과 평행결합은 DNA-DNA 또는 DNA-PNA의 결합 방식에 있어, 5'-방향성과 3'-방향성에 따라 결정된다. 역평행 결합은 일반적인 DNA-DNA 또는 DNA-PNA의 결합 방식으로, 본 발명에 따른 핵산 복합체를 예로 들어 설명하면, 생활성 핵산은 5'에서 3' 방향으로, 캐리어 펩티드 핵산은 3'에서 5' 방향으로 서로 결합되는 형태를 의미한다. 평행결합은 역평행결합에 비해서는 결합력이 다소 떨어지는 형태로, 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 모두가 5'에서 3' 방향 또는 3'에서 5' 방향으로 서로 결합되는 형태를 의미한다.
본 발명에 따른 핵산 복합체에 있어서, 바람직하게는 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력은 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자, 특히 목적 유전자의 mRNA와의 결합력보다 낮은 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 결합력은 융해온도, melting temperature 또는 Tm에 의해 결정된다.
상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력(융해온도, melting temperature, Tm)이 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자, 특히 목적 유전자의 mRNA와의 결합력보다 낮게 하기 위한 구체적인 방법의 예로는, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 평행 결합(Parallel binding) 또는 부분 특이결합(Partial specific binding)하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 예로서 상기 캐리어 펩티드 핵산이 링커, 유니버설 염기(universal base) 및 생활성 핵산의 대응되는 염기와 상보적이지 않은 염기를 가지는 펩티드 핵산 염기로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 펩티드 핵산 염기를 갖는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 유니버설 염기(universal base)는 아데닌(adenine), 구아닌(guanine), 사이토신 (cytosine), 티민(thymine), 우라실(Uracil) 등의 천연 염기와 선택성 없이 결합하고, 상보적인 결합력보다 낮은 결합력을 가지는 염기로 이노신 PNA(inosine PNA), 인돌 PNA(indole PNA), 나이트로인돌 PNA(nitroindole PNA) 및 무염기(abasic)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상 사용할 수 있으며, 바람직하게는 이노신 PNA를 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체의 기능 조절을 위한 핵산들의 결합 형태와 전기적 성질 조합을 제공하고, 상기 핵산의 결합 형태와 전기적 성질 조합으로 입자 크기 및 작용 시점을 조절하고, 세포투과성, 용해도 및 특이도를 향상시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 결합력 조절을 통해, 목적 유전자의 존재 하에서, 생활성 핵산이 목적 서열과 결합되는 시점(생활성 핵산의 목적 서열로의 치환되는 시점, 표적 특이적 분리 및 결합 시점) 등의 조절이 가능하다.
본 발명에 따른 핵산 복합체에 있어서, 생활성 핵산의 목적 유전자로의 치환(strand displacement) 시점, 표적 특이적 분리 및 결합(target specific release and bind) 시점의 조절은 복합체의 비특이 결합을 위한 캐리어 펩티드 핵산의 비특이 염기, 유니버설 염기 및 linker의 유무, 개수 및 위치에 의하여 조절이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 펩티드 복합체의 상보적인 결합의 형태인 평행(parallel) 또는 역평행(antiparallel) 형태의 결합 등과 상기 조건의 조합에 의하여 조절이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체의 입자는 5 nm 내지 300 nm, 바람직하게는 10 nm 내지 200 nm, 가장 바람직하게는 15 nm 내지 100 nm의 크기를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체의 입자 크기는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 전하 밸런스(charge balance)를 조절함으로써 조절되는 것을 특징으로 할 수 있다. 구체적으로는 캐리어 펩티드 핵산의 양전하가 증가하면 입자의 크기가 작아지나, 캐리어 펩티드 핵산의 양전하가 일정 수준을 넘게 되면 입자의 크기가 커지는 특징을 가지게 된다. 또한, 입자 크기를 결정하는 다른 중요한 요소로 복합체를 이루는 생활성 핵산 전하에 따른 전반적인 캐리어 펩티드 핵산과의 적절한 전하 밸런스에 의해서 입자 크기가 결정된다.
본 발명에 따른 캐리어 펩티드 핵산의 양전하는 1개 내지 7개(양전하를 가지는 단량체가 1개 내지 7개 포함됨을 의미한다), 바람직하게는 2개 내지 5개, 가장 바람직하게는 2개 내지 3개이며, 생활성 핵산의 전하는 전하 밸런스의 넷 차지(net charge)가 음전하 0개 내지 5개, 바람직하게는 0개 내지 3개이다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체는 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 적절한 조건에서 혼성화됨으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 "혼성화"는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 결합 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명의 "표적 유전자"는 활성, 억제 또는 표지하고자 하는 핵산 서열(염기서열)을 의미하며, 용어 "표적 핵산"과 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
본 발명에 있어서, 표적 유전자를 포함하는 표적 핵산(염기서열)이 생체 외(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 상기 복합체와 접촉(결합)하게 되면, 캐리어 펩티드 핵산으로부터 생활성 핵산이 분리되어 생물학적 활성을 나타내게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체를 이용하여 예방, 치료할 수 있는 질병은, 상기 핵산 복합체 내의 생활성 핵산의 표적 유전자에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에서는 생활성 핵산의 표적 유전자는 NLRP3인 것을 특징으로 할 수 있다.
따라서, 본 발명에서 상기 핵산 복합체를 이용하여 예방, 치료할 수 있는 질병은 바람직하게는 황반변성(Macular Degeneration)일 수 있으며, 상기 황반변성은, 노인성 황반변성, 건성 황반변성 및 습성 황반변성을 포함하며, 가장 바람직하게는, 본 발명의 핵산 복합체는 건성 황반 변성(Dry Macular Degeneration)의 예방, 개선 또는 치료가 가능하다.
본 발명의 일 실시예에서는, 건성 황반변성에 대한 예방 및 치료효과를 확인하였으나, NLRP3 단백질과 관련된 caspase-1 활성화 복합 단백질 복합체인 인플라마좀은 건성 황반변성에서 습성 황반변성으로 진행되는데 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으므로, 본 발명의 치료용 조성물은 습성 황반변성의 예방, 개선 또는 치료, 특히, 건성 황반변성에서 습성 황반변성으로의 진행을 예방하기 위해서도 사용될 수 있다 (Alexander G. Marneros, 9445-958, 2013; Lucia Celkova, et. al., Journal of Clinical Medicine 4(1), 172-192, 2015; Yerramothu, P., et al., Eye 32, 491-505, 2018)
한편, 본 발명에 있어서, 용어 "치료용 조성물"은 "의약(약제학적, 약학적) 조성물(pharmaceutical composition)"과 혼용될 수 있으며, 본 발명의 생활성 핵산 및 상기 핵산과 결합하는 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 핵산 복합체를 유효성분으로 포함하며, 추가적으로 상기 핵산 복합체에 목적하는 질환을 치료하기 위한 치료용 약물이 결합된 형태일 수 있다.
상기 약학 조성물이 제형화되어 투여될 경우, 통상적인 방법에 의해 생성된 제제의 형태로서 투여될 수 있다.
투여되는 제제의 형태는 예를 들어 점안제(eye drop), 안 연고, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 주사제, 연고 등일 수 있으며, 바람직한 것은 점안액 또는 피부 전달 형태의 제제이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 제제는 해당 분야의 일반적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 안과적 국소 투여 형태로서, 점적, 스프레이 또는 겔 형태가 가능하며, 또 다른 방법으로 리포좀을 이용하여 눈에 투여할 수 있다. 또한, 펌프-카테테르(pump-catheter) 시스템을 통해 눈물막에 주입될 수 있다. 부가적인 구체예로서, 눈 위의 콘택트렌즈에 포함될 수 있으며, 그에 의해 운반되거나 그에 부착될 수 있다. 다른 구현예로, 안구 표면에 가해질 수 있는 스펀지 또는 면봉에 함유된 형태가 이용될 수 있으며, 안구 표면에 가해질 수 있는 액체 스프레이도 이용될 수 있다.
바람직하게는 본 발명에 따른 조성물은 점안액, 수성액, 겔, 연고, 크림, 로션, 페이스트, 도말제 또는 패치 형태로 제형화될 수 있다.
가장 바람직하게는 수성액의 형태로 제형화될 수 있고, 이때 수성액은 증류수 및 버퍼 용액의 형태가 사용될 수 있다.
이들 제형은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는, 예를 들어, 안구 또는 피부에 적용될 수 있는 형태의 제형에 적합한 담체, 부형제, 보조제 또는 희석제 등의 첨가물을 함유할 수 있다.
상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리톤, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 상기 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 멸균 주사 용액 등의 형태일 수 있다.
용어 "담체(carrier)"는 세포 또는 조직 내로의 핵산 복합체의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
용어 "희석제(diluent)"는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.
본 발명에서의 핵산 복합체를 함유하는 물질은, 환자에게 그 자체로서 또는 병용 요법(combination therapy)에서와 같이 다른 활성 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형제와 함께 혼합된 의약 조성물로서 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용에 적합한 의약 조성물에는, 활성 성분들이 그것의 의도된 목적을 달성하기에 유효한 양으로 함유되어 있는 조성물이 포함된다. 더욱 구체적으로, 치료적 유효량은 치료될 객체의 생존을 연장하거나, 질환의 증상을 방지, 경감 또는 완화시키는데 유효한 화합물의 양을 의미한다. 치료적 유효량의 결정은, 특히, 여기에 제공된 상세한 개시 내용 측면에서, 통상의 기술자의 능력 범위 내에 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은, 상기 세포 투과성 핵산 복합체를 포함하는 치료용 조성물의 투여(또는 도포)로 질환의 발병을 막거나, 이의 진행을 억제시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "개선"이란 상기 세포 투과성 핵산 복합체를 포함하는 치료용 조성물의 투여(또는 도포)로 질환의 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는, 상기 세포 투과성 핵산 복합체를 포함하는 치료용 조성물의 투여(또는 도포)로 질환의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 핵산 복합체의 투여(또는 도포)에 있어서, 당업계에 공지된 임의의 핵산 전달 방법이 사용될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 적합한 전달 시약은 예를 들어, Mirus Transit TKO lipophilic reagent, lipofectin, lipofectamine, cellfectin, polycations(예를 들어, polylysine), atelocollagen, nanoplexes 및 리포좀이 있다. 핵산 분자의 전달 운반체로서 아테로콜라겐(atelocollagen)의 사용은 Minakuchi et al. Nucleic Acids Res., 32(13):e109 (2004); Hanai et al. Ann NY Acad Sci., 1082:9-17 (2006); and Kawata et al. Mol Cancer Ther., 7(9):2904-12 (2008)에 기술되어 있다. 예시적인 간섭 핵산 전달 시스템은 미국 특허 제8,283,461호, 제8,313,772호, 제8,501,930호에 제공된다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 투과성 핵산 복합체는 리포솜(liposome) 등의 전달체를 이용하여 투여(또는 도포)할 수도 있다. 상기 리포솜은 림프 조직과 같은 특정 조직에 대해 상기 복합체를 표적화하거나, 감염 세포에 대해 선택적으로 표적화하는데 도움을 줄 수 있고, 또한 상기 복합체가 포함된 조성물의 반감기를 증가시키는데 도움을 줄 수 있다. 리포솜으로는 에멀션, 포움(foam), 마이셀(micelle), 불용성 단층, 액정, 인지질 분산물, 라멜라 층(lamellar layer) 등이 있다. 이러한 제제에 있어서, 송달되는 상기 복합체는, 단독으로 또는 특정 세포들을 대상으로, CD45 항원에 결합되는 모노클로날 항체와 같은 림프 세포 중 우세한 수용체에 결합하는 분자와 함께 또는 기타 치료 조성물과 함께, 리포솜의 일부로서 혼입시킨다. 따라서, 본 발명의 소정 복합체로 충진되거나 도포되어(decorated) 상기 핵산 복합체 조성물을 송달하는 리포솜은 림프 세포의 상기 부위로 지향될 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 리포솜은 일반적으로 중성 및 음전하 인지질 및 콜레스테롤 등의 스테롤을 비롯한 표준 베시클 (vesicle)-형성 지질로부터 형성된다. 일반적으로, 예를 들어 혈류 중의 리포솜의 안정성, 산 불안정성(acid lability) 및 리포솜의 크기 등을 고려하여 지질을 선택한다. 리포솜 제조에는 다양한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Szoka, et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:467, 1980), 및 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호, 제4,837,028호 및 제5,019,369호]에 기재되어 있는 바와 같은 방법을 이용할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산 (Bioactive Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 세포 투과성 핵산 복합체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 황반변성의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 핵산 복합체를 포함하는 조성물은 황반변성을 치료하기 위하여 또는 황반변성의 증세를 억제(또는 완화)하기 위하여 의약으로 효과적인 양으로 안구에 적용될 수 있다. 황반변성의 종류, 환자의 연령, 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 치료 회수, 적용 형태 및 경로 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 해당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기한 약리학적 또는 생리학적 성분을 함께 적용하거나 순차적으로 적용할 수 있으며, 또한 추가의 종래의 치료제와 병용하여 적용될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 적용될 수 있다. 이러한 적용은 단일 또는 다중적으로 적용일 수 있다.
본 발명에서, "개체"는 본 발명에 따른 세포 투과성 핵산 복합체를 투여(도포)하여 경감, 억제 또는 치료될 수 있는 상태 또는 질환을 앓고 있거나 그러한 위험이 있는 포유동물을 의미하며, 바람직하게 사람을 의미한다.
또한, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 투여량(도포량)은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여(도포) 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000㎎/일이고, 바람직하게는 0.01 ~ 500㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여(도포)할 수도 있다.
본 명세서에 기재되어 있는 세포 투과성 핵산 복합체를 포함하는 조성물의 독성과 치료 효율성은, 예를 들어, LD50(군집의 50%에 대한 치사량), ED50(군집의 50%에 대해 치료 효과를 갖는 선량), IC50(군집의 50%에 대해 치료 억제 효과를 갖는 선량)을 결정하기 위하여, 세포 배양 또는 실험동물에서의 표준 제약 과정들에 의해 산정될 수 있다. 독성과 치료 효과 간의 선량 비가 치료 지수이고 이것은 LD50과 ED50(또는, IC50) 간의 비율로서 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 보이는 화합물들이 바람직하다. 이들 세포 배양 분석에서 얻어진 데이터는 인간에 사용하는 선량의 범위를 산정하는데 사용될 수 있다. 그러한 화합물들의 투여량(dosage) 또는 도포량은 바람직하게는 독성이 없거나 거의 없는 상태에서 ED50(또는, IC50)을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다.
본 발명의 용어 "투여"란, 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 행위를 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 안구 위 점안, 망막 내 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명의 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 포유동물에 하루 동안 10 내지 100 ㎎/㎏, 보다 바람직하게는 10 내지 30 ㎎/㎏으로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 내지 3회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산 (Bioactive Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 세포 투과성 핵산 복합체를 황반변성의 예방 또는 치료에 사용하는 용도에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 황반변성은 건성 황반변성 또는 습성 황반변성일 수 있으며, 가장 바람직하게는 건성 황반변성일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 황반변성의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산 (Bioactive Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 세포 투과성 핵산 복합체의 용도에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 황반변성은 건성 황반변성 또는 습성 황반변성일 수 있으며, 가장 바람직하게는 건성 황반변성일 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 생활성 핵산(Bioactive Peptide Nucleic Acid) 및 캐리어 펩티드 핵산, 및 이들을 이용한 복합체의 제조
본 발명의 핵산 복합체의 건성 황반변성에 대한 효과를 검정하기 위하여 표적 유전자로 NLRP3 유전자를 사용하였으며, 건성 황반변성의 치료 효과를 확인하기 위해 NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산(Bioactive Peptide Nucleic Acid)으로 안티센스 펩티드 핵산(antisense PNA)을 사용하였다.
본 발명의 대조군으로 사용한 생활성 펩티드 핵산 (antisense PNA)은 서열번호 1 내지 2번으로 표시되는 서열로 구성되어 있으며, 건성황반변성 치료효과를 확인하기 위해 사용한 생활성 펩티드 핵산(antisense PNA)은 서열번호 3 내지 4번으로 표시되는 서열로 구성되어 있다.
본 실시예에서 사용된 펩티드 핵산 기반 생활성 핵산 중 서열번호 1번 및 3번 엔도좀 탈출능을 돕기 위한 펩타이드 GLFDIIKKIAESF(서열번호 12)를 5'에 결합하였고, 서열번호 2번 및 4번은 엔도좀 탈출능을 돕는 펩타이드가 없는 형태로 합성하였다. 본 실시예에서 사용된 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 6번 과 11번을 제외하고 모두 엔도좀 탈출능을 돕기 위한 펩타이드를 5' 내지 3' 말단에 결합하였으며, 기재되는 서열로 구성되어 있다. 염기서열, 단량체 변형 및 구조는 하기 표 3과 같다.
본 발명에서 사용한 모든 펩티드 핵산은 파나진(PANAGENE, 한국)에서 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였다(표 3).
Figure PCTKR2021000102-appb-T000003
상기 표 3 은 NLRP3 유전자를 표적으로 하는 건성 황반변성 치료제로서의 효과를 확인하기 위해 사용된 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 및 대조군으로 사용된 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 서열 정보를 나타내었다.
단량체의 변형은 전기적인 성질을 부여하기 위하여 펩티드 핵산의 backbone을 전기적 양성은 리신(Lysine, Lys, K, (+)로 표기)을 전기적 음성은 글루타민산(Glutamic acid, Glu, E, (-)로 표기)로 변형된 펩티드 backbone을 가지도록 제작하였다.
각각의 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 조합은 DMSO 하에서 혼성화 하였으며, 그 결과 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 제조하였다.
실시예 2: 핵산 복합체를 이용한 건성 황반변성의 치료 효과 분석
실시예 1에 따라 제조된 NLRP3 유전자를 표적 유전자로 하는 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 핵산 복합체를 이용하여 건성 황반변성의 치료 효과를 분석하였다.
실시예 2-1: 세포 배양
ATCC(American Type Culture Collection, 미국)로부터 입수한 인간 망막색소상피(ARPE-19, ATCC NO. CRL-2302)를 DMEM:F-12 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium Nutrient Mixure F-12(Ham), Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에 10％(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37_, 5％(v/v) CO2의 조건하에서 배양하였다. 건성 황반변성 유사 세포 모델을 만들기 위해 IL (Interleukin)-1α 4 ng/ml과 LPS (Lipopolysaccharide) 50 ng/ml 처리하여 24시간 배양하였다.
실시예 2-2: 웨스턴 블랏 분석(Western blot assay)을 통한 유전자 발현의 분석
사람 유래 망막색소상피 세포주를 6웰 플레이트에 1x105으로 세포를 씨딩하고 24시간 배양 후 실시예 2-1의 조건으로 실험을 진행하여 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 처리하고 24, 48, 72, 96, 120 시간 배양한 후, RIPA buffer를 각 웰에 30 μL씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30 μg을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 NLRP3 (abcam, 미국), ASC (SantaCruz Biotechnology, 미국), procaspase-1, caspase-1 (SantaCruz Biotechnology, 미국), proIL-1beta, IL-1beta (Abcam, 미국)를 1:1000으로 처리하고 4 ℃ 에서 하루 동안 방치하였다.
1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Anti-Rabbit (Cell signaling Technology, 미국), Anti-Mouse (Santa cruz Biotechnology, 미국)를 1:2000으로 처리하여 상온에서 1시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 사람 망막색소상피 세포주에서 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
본 실시예에서는 IL-1alpha를 이용한 건성황반변성 유사 세포 모델에서의 NLRP3 및 하위단계 유전자 발현 변화를 분석하였으며, 사용한 핵산 복합체 조합은 표 4와 동일하다.
Figure PCTKR2021000102-appb-T000004
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 서열번호 3과 서열번호 8의 조합과 서열번호 3과 서열번호 10의 조합 핵산 복합체를 통하여 표적 유전자의 발현 및 하위 경로 유전자의 발현이 시간에 따라 가장 많이 억제되는 것을 확인하였다.
실시예 2-3: 면역세포화학(Immunocytochemistry) 염색 분석
사람 유래 망막색소상피 세포주를 8웰 플레이트에 5x103으로 세포를 씨딩하고 24시간 배양 후, 실시예 2-1의 조건으로 실험을 진행하여 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 처리하고 24, 48, 72 배양한 후, 4% 파라포름알데히드(parafomaldehyde)에 고정시킨 후, 0.1% 트리톤(Triton) X-100과 정상 당나귀 혈청(normal donkey serum)을 블록킹(blocking)을 거치고 1차 항체인 NLRP3 (abcam, 미국), caspase-1 (SantaCruz Biotechnology, 미국)를 1:200으로 처리하고 4 ℃ 에서 하루 동안 방치하였다.
이후 2차 항체인 Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor® 647) (abcam, 미국), Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor® 488) (abcam, 미국)를 1:200으로 처리하여 상온에서 1시간 방치하고 DAPI가 포함된 마운팅제를 이용하여 고정시킨 후 현미경으로 결과를 확인하였다.
본 실시예에서는 LPS를 이용한 건성황반변성 유사 세포 모델에서의 NLRP3 및 하위단계 유전자 발현 변화를 분석하였으며, 사용한 핵산 복합체 조합은 표 5와 동일하다.
Figure PCTKR2021000102-appb-T000005
그 결과, 도 2a 내지 2b 에 나타낸 바와 같이, 서열번호 3과 서열번호 10의 핵산 복합체 조합이 건성황반변성 유사 세포 모델에서 NLRP3 발현 및 하위 경로 유전자의 발현이 시간에 따라 가장 많이 억제되는 것을 확인하였다.
실시예 3: 핵산 복합체를 이용한 건성 황반변성 유사 NaIO3 유도 동물모델에서 치료 효과 분석
본 실시예에서는 실시예 2을 통하여 효과가 검증된 핵산 조합체를 선별하여 NaIO3 이용한 건성황반변성 유사 동물 모델에서 표현형 및 조직학적 소견을 분석하였으며, 사용한 핵산 복합체 조합은 표 6과 같다.
Figure PCTKR2021000102-appb-T000006
실시예 3-1: 실험 동물 사육 및 실험 디자인
5주령 male B6 mouse을 일주일 동안 순화 후 사용하였다. 황반변성에서 나타나는 변화 중 하나로 망막색소상피세포의 선택적인 변성 및 손상을 유발하기 위하여 NaIO3 (Sigma, 미국) 35mg/kg을 정맥주사하였다.
NaIO3 3주 유도 시킨 뒤 핵산 복합체(1, 2)를 안구 점안액을 이용하여 대조군 (핵산 복합체 1)의 경우 60 μg / 1 drop 으로 하루에 한번 14일 동안 처리한 군과 시험약물군 (핵산 복합체 2)의 경우 60 μg / 1 drop 으로 하루에 한번 14일 동안 처리한 군으로 나누어 실험을 진행하였음.
핵산 복합체(1, 2)를 14일 동안 투여한 뒤 Micron IV (Phoenix Research Laboratories, 미국)으로 안저촬영을 실시하였다.
부검하여 안구 적출한 후, 4% 파라포름알데히드(parafomaldehyde)에 고정시킨 후 파라핀으로 포매하여 슬라이드 절편을 제작하였다. 슬라이드 절편은 Hematoxylin & Eosin(H&E) 염색하여 광학현미경 하에서 망막조직을 평가하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, NaIO3 투여로 인하여 망막색소상피세포의 손상을 받았고 바로 위에 위치하는 광수용체 세포의 핵들이 밀집되어 있는 외과립층(outer nuclear layer)과 내과립층(inner nuclear layer)에서 휘어지는 현상을 관찰하였다. 안구 점안액를 이용한 핵산 복합체 처리군에서 망막색소상피세포의 손상을 억제하여 외과립층 붕괴되는 현상을 억제하는 것을 확인하였다.
실시예 3-2: NLRP3 표적 유전자의 핵산 복합체(60ug) 4주 투여 효과
실시예 3-1에서의 실험 조건으로 핵산 복합체(1, 2)를 안구점안액을 이용하여 60 μg / 1 drop / 1 day로 28일 동안 처리하여 망막색소상피의 손상 예방 효과를 진행하였다.
핵산 복합체(1, 2) 28일 동안 투여한 뒤 Micron IV (Phoenix Research Laboratories, 미국)으로 안저촬영을 실시하였다.
부검하여 안구 적출한 후, 4% 파라포름알데히드(parafomaldehyde)에 고정시킨 후 파라핀으로 포매하여 슬라이드 절편을 제작하였다. 슬라이드 절편은 Hematoxylin & Eosin(H&E) 염색하여 광학현미경 하에서 망막조직을 평가하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, NaIO3 투여로 인하여 망막색소상피세포의 손상을 받았고 바로 위에 위치하는 광수용체 세포의 핵들이 밀집되어 있는 외과립층(outer nuclear layer)과 내과립층(inner nuclear layer)에서 휘어지는 현상을 관찰하였다. 안구 점안액를 이용한 핵산 복합체 처리군에서 망막색소상피세포의 손상을 억제하여 외과립층 휘어지는 현상을 억제하는 것을 확인하였다.
실시예 3-3: 핵산 복합체를 이용한 NaIO3 유도 동물 모델의 치료 효과 분석
실시예 3-1에서의 실험 조건으로 표 7의 핵산 복합체(6, 7)를 안구 점안액을 이용하여 망막색소상피의 손상 억제 효과를 진행하였다. 핵산 복합체 6번의 경우 30 μg / 1 drop / 1 day로 14일 동안 투여하였고 핵산 복합체 7번의 경우 30 μg / 1 drop / 1 day, 핵산 복합체 7-1번의 경우 10 μg / 1 drop / 1 day, 핵산 복합체 7-2번의 경우 5 μg / 1 drop / 1 day로 14일 동안 투여하여 억제 효과를 확인하였다. 양성 대조군의 경우 NLRP3 억제제인 MCC950 (InvivoGen, 미국)을 10mg/kg의 용량으로 14일 동안 매일 경구투여하였다.
Figure PCTKR2021000102-appb-T000007
핵산 복합체(6, 7) 14일 동안 투여한 뒤 Micron IV (Phoenix Research Laboratories, 미국)으로 안저촬영을 실시하였다.
부검하여 안구 적출한 후, 4% 파라포름알데히드(parafomaldehyde)에 고정시킨 후 파라핀으로 포매하여 슬라이드 절편을 제작하였다. 슬라이드 절편은 Hematoxylin & Eosin(H&E) 염색하여 광학현미경 하에서 망막조직을 평가하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, NaIO3 투여로 산화적 스트레스를 통해 망막색소상피세포의 퇴행을 유발하여 망막 변성을 유도한 것을 관찰하였으며, 핵산 복합체 (PNA 7, 30 μg / 1 drop / 1 day) 의 경우 양성 대조군 (Positive control, PC)보다 망막색소상피세포의 변성이 감소한 것을 확인하였다. 핵산 복합체 (PNA 7-1: 10 μg / 1 drop / 1 day, PNA 7-2: 5 μg / 1 drop / 1 day) 에서도 양성 대조군과 비슷한 억제 효과를 확인하였다(도 5a).
도 5b의 망막 절편 사진과 같이 망막에서 광수용체 세포(photoreceptor cell)의 핵들이 밀집되어 있는 외과립층(outer nuclear layer)의 두께가 안구 점안액를 이용한 핵산 복합체 처리군 (PNA 7)에서 광수용체 세포의 손상을 유의적으로 억제하여 건성 황반변성 치료 효과를 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 NLRP3를 표적으로 하는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 상보적으로 결합된 세포 투과성 핵산 복합체는 세포 투과성이 높아 직접적인 주사투여 외에도, 점안액이나 피부도포 등을 포함하는 여러 방법으로 투여가 가능하고, NLRP3의 발현을 억제함으로써, 황반변성의 예방, 개선 또는 치료에 유용하다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (10)

  1. NLRP3 유전자를 표적으로 하는 생활성 핵산 (Bioactive Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 세포 투과성 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 황반변성의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생활성 핵산은 서열번호 4의 서열로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 5 내지 11로 구성된 군에서 선택되는 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 핵산 복합체는 서열번호 4로 표시되는 서열을 포함하는 생활성 핵산; 및 서열번호 5 내지 11로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열로 표시되는 서열을 포함하는 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 생활성 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산은 각각의 핵산의 5'-말단 또는 3'-말단에 엔도좀 탈출을 도와주는 물질이 추가로 결합된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 엔도좀 탈출을 도와주는 물질은 펩티드, 지질 나노물질(lipid nanoparticles), 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles), 고분자 나노구(polymer nanospheres), 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles), 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles), 양이온 고분자(cationic polymer) 및 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  7. 6항에 있어서, 상기 펩티드는 GLFDIIKKIAESF(서열번호 12) 또는 Histidine(10)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 생활성 핵산은 전체적으로 음전하 또는 중성을 가지는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 양전하를 가지는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 핵산 복합체는 전체적으로 양전하를 가지는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
PCT/KR2021/000102 2020-01-06 2021-01-06 세포 투과성 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 황반변성의 예방 또는 치료용 조성물 WO2021141368A2 (ko)

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