WO2020096234A1 - 피부 투과성 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

피부 투과성 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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bioactive
peptide nucleic
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김혜주
강유선
이동인
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for the prevention or treatment of skin diseases containing a skin-permeable nucleic acid complex as an active ingredient, and more specifically, a skin in which a bioactive nucleic acid targeting TLR2 or IL-4R ⁇ and a carrier peptide nucleic acid are complementarily bound.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition or a cosmetic composition for preventing, improving or treating atopic dermatitis containing a permeable nucleic acid complex.
  • nucleic acid drugs inhibit the expression of target-specific messenger RNA (mRNA), so it is possible to cover areas of research that could not be treated with existing drugs targeting proteins (Kole R. et al. Nature Rev. Drug Discov. 2012; 11; 125-140., Wilson C. et al. Curr. Opin. Chem. Bio. 2006; 10: 607-614.).
  • mRNA messenger RNA
  • the oligo nucleic acid has a risk of damage due to nuclease, etc., and the electrical properties (charge) and size of the oligo nucleic acid may prevent cell membrane penetration by passive diffusion.
  • efforts are being made to secure biological stability through modification of nucleic acids, and in the case of modified artificial nucleic acids, it is possible to increase affinity with a target nucleic acid without losing biological activity. Was done.
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • a type of modified artificial nucleic acid is an artificial nucleic acid in which (2-aminoethyl) -glycine peptide backbone is introduced, and a complementary base sequence It has the property of strongly binding to RNA and DNA having.
  • the peptide nucleic acid is resistant to nuclease, and has high biological stability, and research on therapeutic agents based on various oligonucleotides has been conducted.
  • the peptide nucleic acid has a disadvantage that it is difficult to be introduced into cells due to its electrical neutral property (Joergensen M. et al. Oligonucleotides 2011, 21; 29-37.).
  • oligonucleotide itself to penetrate the cell membrane is quite low.
  • DNA or RNA since DNA or RNA has a negative charge, it cannot penetrate the hydrophobic phospholipid bilayer of the cell, making it difficult for intracellular delivery through simple diffusion.
  • viral carriers such as retroviruses or AAV (adeno-associated virus) allows oligonucleotides to be introduced into cells, but there is a risk of unintentional immune activity and possibility of recombination of oncogenes. (Couto LB et al. Curr. Opin. Pharmacol. 2010, 5; 534-542.).
  • nucleic acid delivery techniques have functional residues as direct bonds, include steps for complex formation, and of liposome structure. It has problems such as endosome escape efficiency and biotoxicity. Well, it is necessary raise the resolution of problems related to the improvement of the nucleic acid introduced features and manufacturing procedures and side effects.
  • the skin is an organ having the largest surface area in the human body, and is an effective delivery path for drugs when appropriate methods are used. Therefore, administration of a physiologically active agent such as a therapeutic drug through the skin, commonly referred to as transdermal delivery, has received great attention due to characteristics such as a relatively simple drug administration regimen.
  • the skin consists of two major parts: the relatively thin outermost layer, the epidermis (epidermis) layer, and the thicker inner region, the dermis (dermal layer).
  • the outermost layer of the epidermal layer, the stratum corneum consists of flat dead cells filled with keratin.
  • the area between the flat dead cells of the stratum corneum consists of lipids that form a lamellar phase that contributes to the skin's natural barrier properties.
  • the stratum corneum which is present on the outermost part of the skin, acts as a natural barrier, and thus the skin permeability of external substances such as therapeutic drugs is extremely low, which makes it difficult to deliver a high molecular weight and hydrophilic substance.
  • the present inventors surprisingly improve the cell permeability of the nucleic acid complex in which the carrier peptide nucleic acid (Carrier Peptide Nucleic Acid) modified to have a positive charge as a whole with the bioactive nucleic acid is complementarily improved. It has been confirmed that the expression of the target gene can be regulated very efficiently, and a patent has been filed for a new construct with low cytotoxicity and improved cell permeability and gene expression control ability of bioactive nucleic acids (PCT / KR2017 / 008636) ).
  • the carrier peptide nucleic acid Carrier Peptide Nucleic Acid
  • the present inventors have modified the carrier peptide nucleic acid (Carrier) to have a positive charge as a whole with a bioactive nucleic acid (Bioactive Nucleic Acid) Peptide Nucleic Acid) has a property in which the nucleic acid complexes complementarily bound to the skin, preferably the stratum corneum and / or epidermal layer, pass very efficiently, confirming that these nucleic acid complexes have excellent skin permeability.
  • Carrier carrier peptide nucleic acid
  • Bioactive Nucleic Acid Bioactive Nucleic Acid
  • Peptide Nucleic Acid Peptide Nucleic Acid
  • the present inventors tried to apply a nucleic acid complex excellent in skin permeability to the treatment of skin diseases, and as a result, a skin-permeable nucleic acid complex in which a bioactive nucleic acid targeting TLR2 or IL-4R ⁇ and a carrier are complementarily prevented atopic dermatitis or It was found that it shows an excellent effect on treatment, and the present invention has been completed.
  • An object of the present invention is effective in skin permeable nucleic acid complexes in which carriers and bioactive nucleic acids targeting TLR2 or IL-4R ⁇ , which are high in skin permeability and skin persistence and which have excellent prevention or treatment effect of atopic dermatitis, are carriers and carriers are complementarily coupled. It is to provide a pharmaceutical composition or a cosmetic composition for the prevention, improvement or treatment of skin diseases containing as an ingredient.
  • the present invention is a bioactive nucleic acid (Bioactive Nucleic Acid) having a sequence capable of binding to the TLR2 or IL-4R ⁇ gene; And it provides a pharmaceutical composition or a cosmetic composition for the prevention, improvement or treatment of skin diseases containing a skin permeable nucleic acid complex complementarily coupled to a carrier peptide nucleic acid (Carrier Peptide Nucleic Acid).
  • Bioactive Nucleic Acid Bioactive Nucleic Acid
  • Carrier Peptide Nucleic Acid Carrier Peptide Nucleic Acid
  • the present invention also provides a formulation comprising the composition.
  • the present invention also, TLR2 or IL-4R ⁇ gene having a sequence capable of binding to a bioactive nucleic acid (Bioactive Nucleic Acid); And it provides a method for preventing or treating skin diseases comprising the step of administering a carrier permeable nucleic acid complex complementary to the carrier peptide nucleic acid (Carrier Peptide Nucleic Acid).
  • TLR2 or IL-4R ⁇ gene having a sequence capable of binding to a bioactive nucleic acid (Bioactive Nucleic Acid); And carrier peptide nucleic acid (Carrier Peptide Nucleic Acid).
  • the present invention also, a bioactive nucleic acid (Bioactive Nucleic Acid) having a sequence capable of binding to the TLR2 or IL-4R ⁇ gene for the manufacture of a drug for the prevention or treatment of skin diseases; And carrier peptide nucleic acid (Carrier Peptide Nucleic Acid).
  • Bioactive Nucleic Acid having a sequence capable of binding to the TLR2 or IL-4R ⁇ gene for the manufacture of a drug for the prevention or treatment of skin diseases
  • carrier peptide nucleic acid Carrier Peptide Nucleic Acid
  • FIGS. 1A to 1C are diagrams illustrating effects according to types of structures in which a bioactive nucleic acid and a carrier peptide nucleic acid are combined in an atopic dermatitis-like cell model.
  • Figure 1a shows the cell viability according to the type of structure in which bioactive nucleic acid and carrier peptide nucleic acid are combined in a keratinocyte cell line derived from atopic dermatitis-induced humans induced by house dust mite ( Dermatophagoides farinae ) extract.
  • Figure 1b shows the cell viability according to the type of structure in which a bioactive nucleic acid and a carrier peptide nucleic acid are combined in a keratinocyte cell line derived from atopic dermatitis induced by house dust mite ( Dermatophagoides pteronyssinus ) extract.
  • Figure 1c shows the cell viability according to the type of structure in which a bioactive nucleic acid and a carrier peptide nucleic acid are combined in a keratinocyte line derived from atopic dermatitis-induced humans induced by sick house syndrome-inducing chemical (2-dinitroclorobenzene) DNCB.
  • FIGS. 2A to 2C are diagrams illustrating effects according to types of structures in which a bioactive nucleic acid and a carrier peptide nucleic acid are combined in an atopic dermatitis-like cell model.
  • Figure 2a shows the effect on target gene TLR2 expression and sub-stage gene expression according to the type of structure in which a bioactive nucleic acid and a carrier peptide nucleic acid are combined in a keratinocyte cell line derived from atopy dermatitis-induced humans induced by house dust mite ( Dermatophagoides farinae ) extract It is shown.
  • Figure 2b shows the effect on the expression of the target gene TLR2 and sub-stage gene expression according to the type of structure in which a bioactive nucleic acid and a carrier peptide nucleic acid are combined in a keratinocyte cell line derived from human atopy dermatitis induced by house dust mite ( Dermatophagoides pteronyssinus ) extract It is shown.
  • Figure 2c is a nesting syndrome-inducing chemical (2-dinitroclorobenzene) DNCB-induced atopic dermatitis-induced human-derived keratinocyte line expression of target gene TLR2 and sub-step gene expression according to the type of structure in which bioactive nucleic acid and carrier peptide nucleic acid are combined It shows the effect on.
  • 3A to 3H show the therapeutic effect in an animal model inducing atopic dermatitis of a nucleic acid complex targeting TLR2.
  • Figure 3a is a photograph showing that the atopic dermatitis phenotype of the mouse is reduced by the nucleic acid complex in NC / Nga mice.
  • Figure 3b shows that the concentration of IgE in the serum is reduced by the nucleic acid complex in NC / Nga mice inducing atopic dermatitis using house dust mite extract.
  • Figure 3c shows that the concentration of TARC in the serum is reduced by the nucleic acid complex in NC / Nga mice inducing atopic dermatitis using house dust mite extract.
  • Figure 3d shows the expression of the target gene TLR2 and low-level gene expression by the nucleic acid complex in NC / Nga mouse skin tissues causing atopic dermatitis using house dust mite extract.
  • Figure 3e shows the transdermal thickness reduction by the nucleic acid complex in NC / Nga mouse skin tissues causing atopic dermatitis using house dust mite extract.
  • Figure 3f shows that the inflammatory marker CD3 is reduced by the nucleic acid complex in NC / Nga mice inducing atopic dermatitis using house dust mite extract.
  • Figure 3g shows that the inflammatory marker CD11c is reduced by the nucleic acid complex in NC / Nga mice inducing atopic dermatitis using house dust mite extract.
  • Figure 3h is a numerical representation of the reduction of the inflammatory marker CD3 / CD11c by the nucleic acid complex in NC / Nga mice inducing atopic dermatitis using house dust mite extract.
  • 4A to 4B are diagrams illustrating effects according to types of structures in which bioactive nucleic acids and carrier peptide nucleic acids are combined in atopic dermatitis-like cell models.
  • Figure 4a shows the cell viability according to the type of structure in which a bioactive nucleic acid and a carrier peptide nucleic acid are combined in a keratinocyte cell line derived from IL-4 induced atopic dermatitis-induced human.
  • Figure 4b shows the cell viability according to the type of structure in which bioactive nucleic acid and carrier peptide nucleic acid are combined in a keratinocyte cell line derived from IL-13-induced atopic dermatitis-induced human.
  • 5A to 5B are diagrams illustrating effects according to types of structures in which a bioactive nucleic acid and a carrier peptide nucleic acid are combined in an atopic dermatitis-like cell model.
  • Figure 5a shows the effect on the expression of the target gene IL-4R ⁇ and low-level gene expression according to the type of structure in which a bioactive nucleic acid and a carrier peptide nucleic acid are combined in a keratinocyte line derived from IL-4 induced atopic dermatitis-induced humans. .
  • Figure 5b shows the effect on the expression of the target gene IL-4R ⁇ and low-level gene expression according to the type of the structure in which the bioactive nucleic acid and carrier peptide nucleic acid are combined in a keratinocyte line derived from IL-13-induced atopic dermatitis-induced human cells. .
  • 6A to 6B are diagrams illustrating effects according to types of structures in which a bioactive nucleic acid and a carrier peptide nucleic acid are combined in an atopic dermatitis-like cell model.
  • Figure 6a shows the effect on the expression of the target gene IL-4R ⁇ and low-level gene expression according to the type of the structure in which the bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid are combined in T lymphocyte derived from IL-4 induced atopic dermatitis-induced human .
  • Figure 6b is IL-4, PMA (Phorbol-12-myristate-13-acetate) and Ionomycin-induced atopic dermatitis-induced T lymphocyte derived from human bioactive nucleic acid and carrier peptide nucleic acid target gene according to the type of structure It shows the effect on the expression of -4R ⁇ and gene expression in the lower stage.
  • PMA Phorbol-12-myristate-13-acetate
  • Ionomycin-induced atopic dermatitis-induced T lymphocyte derived from human bioactive nucleic acid and carrier peptide nucleic acid target gene according to the type of structure It shows the effect on the expression of -4R ⁇ and gene expression in the lower stage.
  • 7A and 7B show the effect of treating atopic dermatitis of a combination of bioactive nucleic acid and carrier peptide nucleic acid selected through a similar cell model in a NC / Nga mouse model inducing atopic dermatitis using DNCB, suppressing tissue phenotype and protein expression in tissues. It showed the effect.
  • Figure 7a shows that the skin phenotype is improved by the nucleic acid complex in the animal model induced atopic dermatitis induced by DNCB.
  • FIG. 7B shows that the expression level of IL-4R ⁇ , a target gene in atopic dermatitis-induced skin tissue, is reduced by a nucleic acid complex in a DNCB-induced atopic dermatitis animal model.
  • 8A and 8B show the effect of treating atopic dermatitis of a combination of bioactive nucleic acid and carrier peptide nucleic acid selected through a similar cell model in an NC / Nga mouse model inducing atopic dermatitis using DNCB by ELISA analysis and SCORAD (atopic dermatitis action). Evaluation, pruritus and erythema).
  • Figure 8a shows that the amount of IgE, TARC and IL-4 in the serum is reduced by the nucleic acid complex in the DNCB-induced atopic dermatitis-induced animal model.
  • 9A and 9B show the effect of treating atopic dermatitis of a combination of bioactive nucleic acid and carrier peptide nucleic acid selected through a similar cell model in an NC / Nga mouse model inducing atopic dermatitis using DNCB, and H & E staining of atopic dermatitis skin tissue. It was confirmed by immunostaining.
  • 9A shows that the thickness of the transdermal tissue is reduced and the expression of inflammatory cells is decreased by the nucleic acid complex through H & E staining of DNCB-induced atopic dermatitis-induced animal model skin tissue.
  • 9B shows that the expression of dendritic cells and macrophage markers CD3 and CD11c in the skin tissue is reduced by the nucleic acid complex through immunostaining of DNCB-induced atopic dermatitis animal model skin tissue.
  • the nucleic acid complex to which the bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid are complementarily bound has skin permeability and skin residue, and in particular, the bioactive nucleic acid targeting TLR2 or IL-4R ⁇ and the carrier peptide nucleic acid are complementary. It was confirmed that it can be used to treat skin diseases such as atopic dermatitis through application of the skin surface of the combined skin-permeable nucleic acid complex.
  • a bioactive nucleic acid having a sequence capable of binding to the TLR2 or IL-4R ⁇ gene Bioactive Nucleic Acid
  • a pharmaceutical composition or a cosmetic composition for the prevention, improvement or treatment of skin diseases containing a skin-permeable nucleic acid complex complementarily coupled to a carrier peptide nucleic acid Carrier Peptide Nucleic Acid
  • a nucleic acid complex in which a bioactive nucleic acid and a carrier peptide are complementarily bound can be characterized by having the structure of the following structural formula (1).
  • A is a bioactive nucleic acid (Bioactive Nucleic Acid) having a sequence capable of binding to the desired gene,
  • C is a carrier peptide nucleic acid (Carrier Peptide Nucleic Acid) capable of binding to a bioactive nucleic acid,
  • ' ⁇ ' means a complementary bond between a bioactive nucleic acid and a carrier peptide nucleic acid
  • the bioactive nucleic acid represented by A has a negative charge or neutrality as a whole
  • the carrier peptide nucleic acid includes one or more peptide nucleic acid monomers modified to be positively charged throughout the carrier peptide nucleic acid.
  • bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid in the nucleic acid complex according to the present invention may have an anti-parallel binding or parallel binding form.
  • biogenic nucleic acid is a nucleic acid having a complementary sequence capable of binding to a target gene of interest to reduce expression, particularly a complementary sequence capable of binding to the mRNA of such target gene of interest.
  • a nucleic acid involved in gene expression regulation such as suppressing the expression of the gene, and may be a nucleic acid having a sequence complementary to a target gene to reduce expression.
  • bioactive nucleic acid in the present invention in vitro ( in vitro ) or in vivo ( in vivo ) in combination with the target gene and a base sequence containing the same, the unique function of the gene (eg For example, it may be characterized by performing functions such as inhibiting transcript expression or protein expression.
  • the "bioactive nucleic acid (Bioactive Nucleic Acid)" in the present invention is preferably an antisense peptide nucleic acid of TLR2 (Toll like Receptor 2) and IL-4R ⁇ (Interleukin-14 receptor ⁇ ), target genes for atopic dermatitis disease, More preferably, it is represented by an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 4, but is not limited thereto.
  • bioactive nucleic acid capable of binding to the TLR2 gene is preferably represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • bioactive nucleic acid capable of binding to the IL-4R ⁇ gene is preferably represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • carrier peptide nucleic acid refers to a nucleic acid that confers functionality by complementarily binding a bioactive nucleic acid and a part or all of the base
  • the carrier peptide nucleic acid used in the present invention is a peptide nucleic acid (PNA: Peptide Nucleic Acid), and similar modified nucleic acids can be used, and peptide nucleic acids are preferred, but are not limited thereto.
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • the carrier peptide nucleic acid is preferably represented by an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 5 to 18, but is not limited thereto.
  • the "skin-permeable nucleic acid complex” can penetrate bioactive substances into the body and ultimately through cells in contact with the skin, specifically, the stratum corneum and / or epidermal layer, which is the outermost layer of the epidermal layer of the skin. It has the ability to pass through, transfer to the epidermal layer or dermis layer, or to the body through the dermis layer.
  • the skin permeable nucleic acid complex Depending on the total amount of net charge in the skin permeable nucleic acid complex according to the present invention and / or the number of bioactive nucleic acids and / or carrier peptide nucleic acids in the nucleic acid complex, it remains in the stratum corneum, epidermal layer or dermal layer, or passes through the dermal layer to the body Can be delivered to
  • the nucleic acid complex may be characterized by having skin persistence.
  • the bioactive nucleic acid itself may function as a therapeutic drug, that is, the complex itself may be used as a skin permeable carrier and a therapeutic agent itself.
  • the “skin-permeable nucleic acid complex” has a property that can be delivered into a desired cell after transdermal delivery through the skin to the body, and can be used in any form containing the nucleic acid complex. Can be.
  • the skin permeable nucleic acid complex is a bioactive nucleic acid represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4; And a carrier peptide nucleic acid represented by any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 5 to 18, but is not limited thereto.
  • the binding force (melting temperature, Tm) of the bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid capable of binding to the TLR2 or IL-4R ⁇ gene is the desired TLR2 or IL-4R ⁇ gene of the bioactive nucleic acid and the bioactive nucleic acid. It can be characterized in that the lower than the bonding force of.
  • a bioactive nucleic acid or a carrier peptide nucleic acid may be characterized in that a 5'-terminal or 3'-terminal of each nucleic acid is further bound to a substance that helps endosome escape. That is, it may be characterized by having a structure of the following structural formula (2) further comprising a substance that helps the endosome escape (endosome escape) of the bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid.
  • 'm' refers to a substance that helps endosome escape of bioactive nucleic acids and carrier peptide nucleic acids.
  • “substances that help escape the endosome” may be characterized by increasing the osmotic pressure inside the endosome or assisting escape from the endosome of the bioactive nucleic acid by a method of destabilizing the membrane of the endosome. have. It means that bioactive nucleic acids move more efficiently and rapidly to the nucleus or cytoplasm to meet and act on target genes (DW Pack, AS Hoffman, S. Pun, PS Stayton, “Design and development of polymers for gene delivery,” Nat. Rev. Drug. Discov., 4, 581-593 (2005)).
  • the substances that help escape the endosome include peptides, lipid nanoparticles, polyplex nanoparticles, polymer nanospheres, inorganic nanoparticles, and cationic lipids It may be characterized by any one or more selected from the group consisting of cationic lipid-based nanoparticles, cationic polymers and pH sensitive polymers.
  • a peptide having the sequence of GLFDIIKKIAESF can be linked to a bioactive nucleic acid as a substance that helps escape the endosome, and a linker-mediated connection of Histisine (10) to a carrier peptide nucleic acid It may be characterized by combining in a way, but is not limited thereto.
  • the lipid nanomaterials may be characterized by being selected from the group consisting of Lipid, phospholipids, cetyl palmitate, poloxamer 18, Tween 85, tristearin glyceride and Tween 80.
  • the conjugate nanomaterials may be characterized in that the poly (amidoamine) or polyethylenimine (PEI).
  • the polymer nanospheres are selected from the group consisting of polycaprolactone, poly (lactide-co-glycolide, polylactide, polyglycolide, poly (d, l-lactide), chitosan and PLGA-polyethylene glycol. It can be characterized as.
  • the inorganic nanomaterials may be characterized in that selected from the group consisting of Fe2O3 Fe3O4, WO3 and WO2.9.
  • the cationic lipid nanomaterials is 1- (aminoethyl) iminobis [N- (oleicylcysteinyl-1-amino-ethyl) propionamide], N-alkylated derivative of PTA and 3, 5- It may be characterized by being selected from the group consisting of didodecyloxybenzamidine.
  • the cationic polymer may be characterized in that it is selected from the group consisting of vinylpyrrolidone-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate acid copolymer diethyl sulphate, polyisobutylene and poly (N-vinylcarbazole).
  • the pH-sensitive polymers may be characterized by being selected from the group consisting of polyacids, poly (acrylic acid), poly (methacrylic acid) and hydrolyzed polyacrylamide.
  • the bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid each contain 2 to 50, preferably 5 to 30, more preferably 10 to 25, and most preferably 15 to 17 nucleic acid monomers. It can be characterized by.
  • the bioactive nucleic acid may be characterized by consisting of a natural nucleic acid base and / or a modified nucleic acid monomer.
  • the monomer used in the bioactive nucleic acid is PNA, it is referred to as a bioactive peptide nucleic acid, and is called in the same manner when other monomers are used.
  • the bioactive nucleic acid and carrier peptide nucleic acid are phosphodiester, 2 '0-methyl (2' 0-methyl), 2 'methoxy-ethyl (2' methoxy-ethyl), phosphor It may be characterized in that it further comprises any one or more functional groups selected from the group consisting of amidate (phosphoramidate), methylphosphonate (methylphosphonate) and phosphorothioate (phosphorothioate).
  • the carrier peptide nucleic acid may be characterized in that the bioactive nucleic acid and a part or all of the base sequence are composed of complementary sequences.
  • the carrier peptide nucleic acid may include one or more universal bases, and all of the carrier peptide nucleic acids may be made of universal bases.
  • each of the bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid in the skin-permeable nucleic acid complex may be a complex characterized in that the electrical properties as a whole have positive charge (positive), negative charge (negative) or neutral charge.
  • the meaning of “total” means the electrical properties of the entire bioactive nucleic acid or carrier peptide nucleic acid when viewed from the outside, not the electrical properties of individual bases, for example, life
  • the bioactive nucleic acid has a negative charge in view of “overall” electrical properties
  • some bases and / or in the carrier peptide nucleic acid When the number of bases and / or backbones that are positive even though the backbone has a negative number is present, the carrier peptide nucleic acid has a positive charge in view of the “overall” electrical properties.
  • the nucleic acid complex of the present invention may be characterized as having an overall positive charge.
  • the bioactive nucleic acid may have a negative charge or neutral property when viewed as a whole, and the carrier peptide nucleic acid may be characterized as having positive charge when viewed as a whole, It is not limited thereto.
  • a modified peptide nucleic acid monomer can be used, and the modified peptide nucleic acid monomer is a carrier peptide nucleic acid having a positive charge (Lysine, Lys, K).
  • Arginine Arg, R
  • Histidine Histidine, His, H
  • Diamino butyric acid DAB
  • Ornithine Orn
  • any one or more positive charges selected from the group consisting of amino acid analogs It may be characterized in that it comprises an amino acid of the carrier peptide nucleic acid having a negative charge, negatively charged amino acid glutamic acid (Glutamic acid, Glu, E) or negatively charged amino acids of amino acid analogs.
  • the carrier peptide nucleic acid may be characterized in that it comprises at least one gamma- or alpha-backbone modified peptide nucleic acid monomer to have a positive charge as a whole.
  • the gamma- or alpha-backbone modified peptide nucleic acid monomer has lysine (Lysine, Lys, K), arginine (Arg, R), histidine (Histidine, His, H), diamino butyric acid, DAB), ornithine (Ornithine, Orn) and amino acids having any one or more positive charges selected from the group consisting of amino acid analogs may be characterized as including in the backbone.
  • a nucleobase-modified peptide nucleic acid monomer may be used for modification of the peptide nucleic acid monomer for charge application.
  • amine, triazole, and imidazole moeity may be included in the nucleobase to have electrical positive or carboxylic acid may be included in the base to have electrical negative.
  • the modified peptide nucleic acid monomer of the carrier peptide nucleic acid may further include a negative charge in the backbone or nucleobase, but the modified peptide nucleic acid monomer contains more positively charged monomers than the negatively charged monomer, and thus the carrier peptide as a whole. It is preferable that the charge of the nucleic acid becomes positive.
  • the nucleic acid complex according to the present invention is characterized in that it has a positive charge as a whole.
  • At least one substance selected from the group consisting of a hydrophobic moiety, a hydrophilic moiety, a target antigen specific antibody, an aptamer or a fluorescent / luminescent marker, etc. is a bioactive nucleic acid.
  • / or a carrier peptide nucleic acid preferably the hydrophobic moiety, hydrophilic moiety, target antigen specific antibody, aptamer and fluorescent / luminescent marker for imaging.
  • One or more substances selected from the group consisting of, for example, may be bound to the carrier peptide nucleic acid.
  • the binding of the carrier peptide nucleic acid may be characterized by a simple covalent bond or a covalent bond mediated by a linker, but is not limited thereto.
  • the cell permeation, solubility, stability, transport and imaging-related substances (eg, hydrophobic residues, etc.) bound to the nucleic acid carrier will be present independently of the bioactive nucleic acid that regulates the expression of the target gene.
  • the complementary binding form of the bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid can be characterized as having a form of antiparallel binding and parallel binding.
  • the complementary binding form has a structure that is separated in the presence of the target sequence (complementary sequence with the bioactive nucleic acid) of the bioactive nucleic acid.
  • the anti-parallel and parallel bonds are determined according to the 5'-direction and 3'-direction in the DNA-DNA or DNA-PNA binding method.
  • Anti-parallel binding is a general DNA-DNA or DNA-PNA binding method, and the nucleic acid complex according to the present invention is described as an example.
  • the bioactive nucleic acid is 5 'to 3'
  • the carrier peptide nucleic acid is 3 'to 5'. It means the form that is combined with each other in the direction.
  • the parallel bond is a form in which the binding force is slightly lower than that of the antiparallel bond, and refers to a form in which both the bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid are bonded to each other in the 5 'to 3' direction or the 3 'to 5' direction.
  • the binding force between the bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid may be characterized in that it is lower than the binding force between the bioactive nucleic acid and the target gene of the bioactive nucleic acid, particularly the mRNA of the target gene.
  • the bonding force is determined by the melting temperature, melting temperature or Tm.
  • Examples of specific methods for making the binding force (melting temperature, Tm) of the bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid lower than the binding force between the bioactive nucleic acid and the target gene of the bioactive nucleic acid, particularly the mRNA of the target gene, include:
  • the bioactive nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid may be characterized by parallel binding or partial specific binding, but are not limited thereto.
  • the carrier peptide nucleic acid has one or more peptide nucleic acid bases selected from the group consisting of a linker, a universal base and a peptide nucleic acid base having a base that is not complementary to a corresponding base of a bioactive nucleic acid.
  • a linker a universal base
  • a peptide nucleic acid base having a base that is not complementary to a corresponding base of a bioactive nucleic acid.
  • the universal base is adenine (adenine), guanine (guanine), cytosine (cytosine), thymine (thymine), uracil (Uracil), and the like without binding to the base and complementary selectivity
  • a base having a binding strength lower than the binding strength one or more selected from the group consisting of inosine PNA, indole PNA, nitroindole PNA, and abasic can be used, preferably It may be characterized by using inosine PNA.
  • the combination of the nucleic acid and the electrical properties combination to control the particle size and time of action, cell permeability, solubility and specificity It can be characterized by improving the degree.
  • the time when the bioactive peptide nucleic acid is combined with the target sequence (the time when the bioactive nucleic acid is replaced with the target sequence, Target specific separation and binding time).
  • the control of the time of target displacement and target specific release and binding of the bioactive nucleic acid to the target gene is determined by carrier peptides for non-specific binding of the complex. It can be characterized in that it can be controlled by the presence, number and location of non-specific bases, universal bases and linkers of nucleic acids. It may be characterized in that it can be adjusted by a combination of the above conditions, such as a parallel (parallel) or antiparallel (bond) in the form of complementary binding of the peptide complex.
  • the particles of the nucleic acid complex may be characterized by having a size of 5 nm to 300 nm, preferably 10 nm to 80 nm, most preferably 15 nm to 70 nm.
  • the particle size of the nucleic acid complex may be characterized by being adjusted by adjusting the charge balance of the bioactive peptide nucleic acid and the carrier peptide nucleic acid. Specifically, when the positive charge of the carrier peptide nucleic acid increases, the particle size decreases, but when the positive charge of the carrier peptide nucleic acid exceeds a certain level, the particle size increases. In addition, the particle size is determined by proper charge balance with the overall carrier peptide nucleic acid according to the bioactive peptide nucleic acid charge complexed with other important factors for determining the particle size.
  • the positive charge of the carrier peptide nucleic acid according to the present invention is 1 to 7 (meaning that 1 to 7 monomers having a positive charge are included), preferably 2 to 5, most preferably 2 to 3
  • the charge of the bioactive nucleic acid is 0 to 5 negative charges, preferably 0 to 3 net charges of the charge balance.
  • the nucleic acid complex can be prepared by hybridizing a bioactive nucleic acid and a carrier peptide nucleic acid under appropriate conditions.
  • Hybridization of the present invention means that complementary single-stranded nucleic acids form double-stranded nucleic acids. Hybridization can occur when the complementarity between two nucleic acid strands is a perfect match or even if some mismatch bases are present. The degree of complementarity required for hybridization may vary depending on the hybridization conditions, and may be specifically controlled by the bonding temperature.
  • target gene of the present invention means a nucleic acid sequence (base sequence) to be activated, inhibited or labeled, and does not differ from the term “target nucleic acid” and is used interchangeably herein.
  • the bioactive nucleic acid when a target nucleic acid (base sequence) containing a target gene is contacted (bound) with the complex in vitro or in vivo , the bioactive nucleic acid is separated from the carrier peptide nucleic acid. It becomes biologically active.
  • a disease that can be prevented and treated using the nucleic acid complex can be determined according to a target gene to which a bioactive nucleic acid in the nucleic acid complex binds.
  • the target gene to which the bioactive nucleic acid binds may be characterized as TLR2 or IL-4R ⁇ .
  • the disease that can be prevented and treated using the nucleic acid complex is preferably a skin disease, for example, psoriasis, atopic disease, including atopic dermatitis, black Skin cancer such as melanoma, keloid disease, skin damage and pigmentation, tumor or cancer, inflammatory disease, senile macular degeneration, diabetic retinopathy, rare disease and severe disease, Cardiovascular disease, metabolic disease, and the like, but is not limited thereto.
  • a skin disease for example, psoriasis, atopic disease, including atopic dermatitis, black Skin cancer such as melanoma, keloid disease, skin damage and pigmentation, tumor or cancer, inflammatory disease, senile macular degeneration, diabetic retinopathy, rare disease and severe disease, Cardiovascular disease, metabolic disease, and the like, but is not limited thereto.
  • the term “therapeutic composition” can be used interchangeably with a “pharmaceutical (pharmaceutical, pharmaceutical) composition (pharmaceutical composition)", the bioactive nucleic acid of the present invention and a carrier peptide nucleic acid binding to the nucleic acid It includes a nucleic acid complex containing as an active ingredient, it may be in the form of a therapeutic drug for treating a desired disease in addition to the nucleic acid complex.
  • the therapeutic composition of the present invention may be formulated in a form of skin delivery form according to standard pharmaceutical practice. These formulations may contain, in addition to the active ingredient, additives such as carriers, excipients, adjuvants or diluents, which are suitable for pharmaceutically acceptable formulations in particular in the form applicable to the skin.
  • additives such as carriers, excipients, adjuvants or diluents, which are suitable for pharmaceutically acceptable formulations in particular in the form applicable to the skin.
  • composition according to the invention may be formulated in the form of an aqueous solution, gel, ointment, cream, lotion, paste, smear or patch.
  • aqueous solution can be used in the form of distilled water and buffer solution.
  • physiologically acceptable means a property that does not impair the biological activity and properties of the compound.
  • carrier is defined as a compound that facilitates the addition of nucleic acid complexes into cells or tissues.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • carrier facilitates the introduction of many organic compounds into an organism's cells or tissues.
  • diluent is defined as a compound that dilutes in water that will dissolve the compound, as well as stabilize the biologically active form of the subject compound. Salts dissolved in buffer solutions are used in the art as diluents. A commonly used buffer solution is phosphate buffered saline because it mimics the salt state of human solutions. Because buffer salts can control the pH of a solution at low concentrations, buffer diluents rarely modify the biological activity of the compound.
  • the substance containing the nucleic acid complex in the present invention can be administered to a patient as a pharmaceutical composition, either by itself or in combination with other active ingredients, such as in combination therapy, or mixed with a suitable carrier or excipient.
  • compositions suitable for use in the present invention include compositions wherein the active ingredients are contained in an amount effective to achieve its intended purpose. More specifically, a therapeutically effective amount refers to an amount of a compound effective to prolong the survival of the subject to be treated, or to prevent, alleviate or alleviate symptoms of the disease. Determination of a therapeutically effective amount is within the skill of the skilled artisan, particularly in terms of the detailed disclosure provided herein.
  • prevention used in the present invention means all actions to prevent the development of a disease or inhibit its progression by administration (or application) of a therapeutic composition comprising the skin-permeable nucleic acid complex.
  • improvement of the present invention means any action that at least reduces the severity of the parameters associated with the condition being treated of the disease, eg, administration of a therapeutic composition comprising the skin permeable nucleic acid complex (or application). .
  • treatment as used in the present invention, by administration (or application) of a therapeutic composition comprising the skin-permeable nucleic acid complex refers to all actions to improve or cure the symptoms of the disease.
  • the skin-permeable nucleic acid complex may be administered (or applied) using a carrier such as a liposome.
  • a carrier such as a liposome.
  • the liposomes can help target the complex against specific tissues, such as lymphoid tissue, or selectively target infected cells, and also help increase the half-life of the composition containing the complex.
  • Liposomes include emulsions, foams, micelles, insoluble monolayers, liquid crystals, phospholipid dispersions, and lamellar layers.
  • the complexes delivered are liposomes, either alone or with specific cells, with molecules that bind to the predominant receptors in lymphocytes, such as monoclonal antibodies that bind to the CD45 antigen, or with other therapeutic compositions. It is incorporated as part of. Accordingly, liposomes that are delivered or decorated with a predetermined complex of the present invention to deliver the nucleic acid complex composition can be directed to the site of lymphocytes.
  • Liposomes for use in accordance with the present invention are generally formed from standard vesicle-forming lipids, including sterols such as neutral and negatively charged phospholipids and cholesterol.
  • lipids are selected in consideration of, for example, stability of liposomes in the bloodstream, acid lability, and size of liposomes.
  • Various methods can be used for liposome production. See, eg, Szoka, et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467, 1980), and US Pat. Nos. 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028 and 5,019,369.
  • the present invention is a bioactive nucleic acid (Bioactive Nucleic Acid) having a sequence capable of binding to the TLR2 or IL-4R ⁇ gene; And a carrier peptide nucleic acid (Carrier Peptide Nucleic Acid) relates to a method for preventing or treating skin diseases comprising the step of administering to the individual a skin-permeable nucleic acid complex to which it is complementarily bound.
  • Bioactive Nucleic Acid Bioactive Nucleic Acid
  • Carrier Peptide Nucleic Acid Carrier Peptide Nucleic Acid
  • composition comprising the nucleic acid complex according to the present invention may be applied to the skin in an effective amount as a medicament to treat skin diseases or to suppress (or alleviate) symptoms of skin diseases. It can vary depending on various factors such as the type of skin disease, the patient's age, weight, the nature and extent of symptoms, the type of current treatment, the number of treatments, the type of application, and the route, and can be easily determined by experts in the field. .
  • the composition of the present invention may be applied together or sequentially with the aforementioned pharmacological or physiological components, and may also be applied in combination with additional conventional therapeutic agents and sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. This application can be a single or multiple applications.
  • “individual” means a mammal suffering from or at risk of a condition or disease that can be alleviated, inhibited or treated by administering (applying) the skin-permeable nucleic acid complex according to the present invention, preferably human. it means.
  • the dose (applied amount) of the compound of the present invention to the human body may vary according to the patient's age, weight, gender, dosage (applied) form, health status and disease degree, and is based on an adult patient with a body weight of 70 kg. In general, it is generally 0.001 to 1,000 mg / day, preferably 0.01 to 500 mg / day, and may be dividedly administered (applied) once to several times a day at regular time intervals according to the judgment of a doctor or pharmacist. have.
  • Toxicity and therapeutic efficiency of compositions comprising skin permeable nucleic acid complexes described herein include, for example, LD50 (lethal dose to 50% of the population), ED50 (dose having therapeutic effect against 50% of the population).
  • LD50 lethal dose to 50% of the population
  • ED50 dose having therapeutic effect against 50% of the population
  • IC50 dose with therapeutic inhibitory effect on 50% of the population
  • the dose ratio between toxicity and therapeutic effect is the therapeutic index and it can be expressed as the ratio between LD50 and ED50 (or IC50).
  • Compounds with high therapeutic indices are preferred.
  • the data obtained from these cell culture assays can be used to estimate the range of doses used in humans.
  • the dosage or application amount of such compounds is preferably within a range of circulating concentrations including ED50 (or IC50) with little or no toxicity.
  • administration means the act of introducing the pharmaceutical composition of the present invention to an individual by any suitable method, and the route of administration can be administered through various routes, oral or parenteral, as long as the target tissue can be reached. have.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition of the present invention can be administered through any general route as long as it can reach the target tissue.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited thereto, but may be administered intraperitoneally, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, orally, intranasally, intrapulmonarily, or rectally as desired.
  • the composition can be administered by any device capable of transporting the active substance to the target cell.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount, the term "pharmaceutically effective amount" of the present invention to treat or prevent a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment or prevention
  • the effective dose level refers to the severity of the disease, the activity of the drug, the patient's age, weight, health, sex, the patient's sensitivity to the drug, the time of administration, route of administration and rate of excretion of the composition of the invention used.
  • the duration of treatment can be determined by factors including drugs used in combination or coincidental with the composition of the present invention used and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And it can be administered single or multiple. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect in a minimal amount without side effects.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention can be determined by those skilled in the art in consideration of the purpose of use, the degree of poisoning of the disease, the age, weight, sex, history of the patient, or the type of substance used as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to mammals including humans for 10 to 100 mg / kg, more preferably 10 to 30 mg / kg for one day, and the frequency of administration of the composition of the present invention is It is not particularly limited, but may be administered once to three times a day or divided into doses and administered several times.
  • the present invention is a bioactive nucleic acid (Bioactive Nucleic Acid) having a sequence capable of binding to the TLR2 or IL-4R ⁇ gene; And a carrier permeable nucleic acid complex to which a carrier peptide nucleic acid (Carrier Peptide Nucleic Acid) is complementarily bound is used for the prevention or treatment of skin diseases.
  • Bioactive Nucleic Acid Bioactive Nucleic Acid
  • Carrier Peptide Nucleic Acid Carrier Peptide Nucleic Acid
  • the present invention is a bioactive nucleic acid (Bioactive Nucleic Acid) having a sequence capable of binding to the TLR2 or IL-4R ⁇ gene for the manufacture of a drug for the prevention or treatment of skin diseases; And the use of a skin permeable nucleic acid complex to which a carrier peptide nucleic acid (Carrier Peptide Nucleic Acid) is complementarily bound.
  • Bioactive Nucleic Acid Bioactive Nucleic Acid
  • Carrier Peptide Nucleic Acid Carrier Peptide Nucleic Acid
  • the cosmetic composition of the present invention can be applied to any formulation applied to the skin. More specifically, skin lotion, skin softener, skin toner, astringent, lotion, milk lotion, moisture lotion, nutrition lotion, massage cream, nutrition cream, moisture cream, hand cream, foundation, essence, nutrition essence, spray, pack, etc.
  • soaps, cleansing foams, cleansing lotions, cleansing creams, body lotions, body creams, body oils, body cleaners, shampoos, ointments, patches (hydrogel slimming patches), etc. may be prepared, but are not limited thereto.
  • it can be produced as a skin contact material that comes into contact with the skin, such as makeup, detergent, and fibers.
  • the cosmetic composition of the present invention can be appropriately selected according to the purpose.
  • the formulation of the present invention is a paste, cream or gel, animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tragacanth, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide are used as carrier components.
  • animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tragacanth, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide are used as carrier components.
  • tragacanth cellulose derivative
  • polyethylene glycol silicone
  • bentonite silica
  • talc talc
  • zinc oxide cellulose derivative
  • Can bentonite silica
  • talc talc
  • zinc oxide cellulose derivative
  • Can bentonite silica
  • talc talc
  • zinc oxide zinc oxide
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as a carrier component, and in the case of a spray, additionally chlorofluorohydrocarbon, propane / butane Or propellants such as dimethyl ether.
  • a solvent, a solubilizing agent or an emulsifying agent is used as a carrier component, for example water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol , 1,3-butyl glycol oil, glycerol aliphatic esters, polyethylene glycol or fatty acid esters of sorbitan.
  • liquid diluents such as water, ethanol or propylene glycol as carrier components
  • suspensions such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol esters and polyoxyethylene sorbitan esters, and microcrystals Sex cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tragacanth, and the like can be used.
  • the formulation of the present invention is a surfactant-containing cleansing, aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivatives, methyltaurate, sarcosinate, fatty acids as carrier components
  • Amide ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters and the like can be used.
  • the cosmetic composition of the present invention can be blended with other ingredients that are usually blended into the cosmetic composition as needed in each formulation.
  • the additive component that can be added include antioxidants (for example, carboxylic acids such as ascorbic acid and citric acid; phenols such as tocopherol and dibutylhydroxytoluene), and wetting agents (eg, glycerin, propylene glycol, and dipropylene glycol).
  • Glycols such as 1,3-butylene glycol; organic salts such as hyaluronic acid; amides such as urea), viscous agents (eg, polymer compounds such as polyethylene glycol; carboxymethyl cellulose sodium, carboxypropyl cellulose, etc.) Cellulose), buffers (for example, organic acids such as citric acid, lactic acid, and tartaric acid; inorganic acids such as hydrochloric acid and boric acid; salts such as sodium dihydrogen phosphate and sodium citrate; organic bases such as triethanolamine; sodium hydroxide and hydroxide Inorganic bases such as potassium), adsorbents (for example, hydrous aluminum silicates such as kaolin and bentonite; aluminium hydroxide) Namagnesium, inorganic salts such as aluminum hydroxide), bases (e.g.
  • inorganic salts such as sodium metaphosphate, zinc oxide, and titanium oxide
  • polyoxyethylene lauryl sulfate ether sulfate organic salts such as sodium lauryl sulfate
  • adhesives such as sodium polyacrylate, dipropylene glycol) Polymer compounds
  • emulsifiers e.g.
  • sorbitan monoolefin polyoxyethylene sorbitan monoolefin, D-sorbitol, polyglycerin monolauric acid, carbohydrates such as polyoxyethylene lauryl ether sodium sulfate), surfactant (For example, polymer compounds such as polyglycerin monolaurate and polyoxyethylene oleyl alcohol ether), fragrances, pigments (dyes, pigments), metal blockers, deodorants, Film-forming agents, ultraviolet absorbers, ultraviolet scattering agents, vitamins, and the like.
  • the cosmetic composition of the present invention can be applied by applying an appropriate amount to the skin according to the skin area to be applied, and can be used repeatedly once to several times a day as needed.
  • the amount and frequency of application may be appropriately increased or decreased as necessary according to the skin condition of the individual, the formulation, the age, sex, weight, responsiveness, and the duration of application.
  • the dosage form of the composition may be a single dosage form or a repeated dosage form, and the effective amount may be divided and administered several times.
  • the pharmaceutical or cosmetic composition of the present invention is for the purpose of enhancing the permeability of the active ingredient, iontophoresis, sonophoresis, electroporation, microelectronic patch, mechanical It can be applied to the skin by pressure, osmotic gradient, occlusive cure or microinjection therapy, or a combination of these.
  • Example 1 Preparation of bioactive nucleic acids and carrier peptide nucleic acids, and complexes using them
  • TLR2 Toll like Receptor 2
  • IL-4R ⁇ Interleukin-14 receptor ⁇
  • TLR2 a gene that is expressed when allergens or bacteria penetrate the skin, is overexpressed in atopic dermatitis patients, thereby exacerbating atopic dermatitis due to increased inflammation caused by inflammatory cytokines in the skin. This is expected to be an important target for atopic dermatitis.
  • Mutation of IL-4R ⁇ one of the mutations characteristic of atopic dermatitis patients, is known as a factor that induces atopic dermatitis by breaking the differentiation homeostasis to T helper 1/2 type during T cell differentiation.
  • antisense peptide nucleic acid was used as a bioactive nucleic acid for TLR2 and IL-4R ⁇ .
  • the bioactive nucleic acid (antisense PNA) used as a control of the present invention is composed of the sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 3, and the bioactive nucleic acid (antisense PNA) used to confirm the therapeutic effect of atopic dermatitis is SEQ ID NO: 2 and 4 It consists of a sequence represented by.
  • the peptide nucleic acid-based bioactive nucleic acid used in this example was coupled to 5 'GLFDIIKKIAESF (SEQ ID NO: 19), which is a peptide to help endosomes escape ability, and base sequences, monomer modifications and structures are shown in Table 1 below.
  • Table 1 below shows the sequence information of bioactive nucleic acid and carrier peptide nucleic acid used as a control for atopic dermatitis targeting TLR2 and IL-4R, and bioactive nucleic acid and carrier peptide nucleic acid used as controls.
  • Bioactive nucleic acids of SEQ ID NOs: 1 and 2 carrier nucleic acids of SEQ ID NOs: 5 to 13 target TLR2, bioactive nucleic acids of SEQ ID NOs: 3 and 4, and carrier nucleic acids of SEQ ID NOs: 14 to 18 target IL-4R ⁇ .
  • All peptide nucleic acids used in the present invention were synthesized in Panazine (PANAGENE, Korea) through an HPLC purification method. Some of all the carrier peptide nucleic acids according to the embodiment of the present invention have a peptide such as Histidine (10) attached to the 5 'to 3' end to help the endosomal escape ability, and the sequences set forth in SEQ ID NOs: 5 to 18 It consists of (Table 1).
  • the backbone of the peptide nucleic acid is electrolyzed to lysine (Lysine, Lys, K, (+) ), and the negative to glutamic acid (Glutamic acid, Glu, E, (-)) . It was made to have the peptide backbone modified with (notation).
  • each bioactive nucleic acid and carrier peptide nucleic acid was hybridized under DMSO, and as a result, a complex composed of bioactive nucleic acid and carrier peptide nucleic acid was produced.
  • Example 2 Analysis of treatment effect in atopic dermatitis-like cell model using skin permeable nucleic acid complex
  • Example 1 the effect of treating atopic dermatitis was analyzed using a skin permeable nucleic acid complex comprising a bioactive peptide nucleic acid and a carrier peptide nucleic acid having TLR2 as a target gene prepared in the structure of Table 2 below.
  • Example 2-1 Cell culture
  • HaCaT Human keratinocytes obtained from CLS (CLS Cell Lines Service, Germany) in 10% (v / v) fetal calf serum, penicillin 100units / ml, strepto in DMEM culture medium (Dulbecco Modified Eagle Medium, Weljin, Korea) 100 ⁇ g / ml of mycin was added, and cultured under conditions of 37 ° C. 5% (v / v) CO 2 .
  • 5 ng / mL of house dust mite extract and 5 ⁇ M of DNCB (2-dinitrochlorobenzene) were treated and cultured for 24 hours.
  • Example 2-2 Cell viability analysis in keratinocyte line with MTT (MTT assay)
  • Example 2-1 As a test condition in Example 2-1, a human-derived keratinocyte cell line was seeded at 6x10 3 in 96 wells, and after 24 hours of incubation, a complex comprising a bioactive nucleic acid and a carrier peptide nucleic acid prepared in the structure of Table 2 was used.
  • MTT 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-Diphenyltetrazolium Bromide
  • solution was prepared in a treated cell line at a concentration of 5 mg / mL in 1X PBS and treated with 20 ⁇ L per well for 4 hours. After incubation, OD (optical density) was measured and analyzed with a spectrophotometer.
  • the nucleic acid complex combination used in this example is shown in Table 3 below.
  • Example 2-3 Analysis of gene expression by Western blot assay
  • the human-derived keratinocyte cell line was seeded with a cell of 1x10 5 in a 6-well plate, cultured for 24 hours, and then experimented under the conditions of Example 2-1 to treat a complex containing a bioactive peptide nucleic acid and a carrier peptide nucleic acid. After incubation for 72 hours, 30 ⁇ L of RIPA buffer was added to each well to obtain protein lysate.
  • Protein lysate was quantified using the BCA assay kit (Thermo Fisher, USA), and 30 ⁇ g of protein was separated by size through electrophoresis, and then transferred to the PVDF membrane, followed by primary antibody TLR2 (SantaCruz Biotech., USA), p-NFkB (Cell signaling Technology, USA), MyD88 (Cell signaling Technology, USA), TARC (Abcam, USA) was treated at 1: 1000 and left at 4 ° C. for 1 day. Washed with 1X TBS-T and treated with secondary antibodies Goat Anti-Rabbit, Goat Anti-mouse (SantaCruz Biotech., USA) at 1: 2000 and left at room temperature for 2 hours. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, USA) was treated and the expression suppression efficiency of target genes in keratinocyte lines was analyzed using Image600 (Amersham, Germany) equipment.
  • TLR2 and low-level gene expression changes in atopic dermatitis-like cell models using house dust mites and sick house syndrome-causing chemicals were analyzed by selecting nucleic acid combinations whose effectiveness was verified through Example 2-2.
  • the complex combinations are shown in Table 4 below.
  • Example 3 Analysis of treatment effect in atopic dermatitis animal model using skin permeable nucleic acid complex
  • Example 3-1 Analysis of atopic dermatitis phenotypic effect in animal models of atopic dermatitis induction using house dust mite extract
  • the back of the NC / Nga mice was shaved and AD cream (house dust mite extract cream, Biostir, Japan) was applied 100 mg twice a week for a total of 3 weeks to construct an animal model causing atopic dermatitis caused by house dust mites.
  • AD cream house dust mite extract cream, Biostir, Japan
  • a total of two cream-form nucleic acid complexes were treated a week, and atopic dermatitis animal model phenotype was analyzed by photographs, and the degree of hair growth on the back was measured by ImageJ.
  • nucleic acid combinations verified for effectiveness through Example 2-2 were selected to analyze phenotypic and histological findings, TLR2 and low-level gene expression changes in atopic dermatitis-like animal models using house dust mite extract.
  • the nucleic acid complex combination is shown in Table 5 below.
  • FIG. 3A Cream control is a group containing a cream formulation but not a nucleic acid complex, and positive control is a cream formulation containing dexamethsone, a conventional therapeutic agent).
  • mice blood was collected through orbital blood collection on the day of the end of the final experiment, and left at room temperature for 2 hours or more to collect serum using a centrifuge (14,000 rpm, 15 min).
  • the collected serum was measured for the concentration of IgE and TARC in serum using an experimental method provided by the IgE ELISA kit (Goma Biotech, Korea) and the TARC ELISA kit (R & D system, USA).
  • Example 3-3 Analysis of gene expression by Western blot assay
  • Example 3-1 The experiment was conducted under the conditions of Example 3-1, and a portion of tissue, such as a biopsy mouse, was added to each well by adding 200 ⁇ L of RIPA buffer to obtain protein lysate. Protein lysate was quantified using the BCA assay kit (Thermo Fisher, USA), and 30 ⁇ g of protein was separated by size through electrophoresis, and then transferred to the PVDF membrane, followed by primary antibody TLR2 (SantaCruz Biotech., USA), p-NFkB (Cell signaling Technology, USA), MyD88 (Cell signaling Technology, USA) was treated at 1: 1000 and left at 4 ° C for one day.
  • Example 3-4 Phenotypic analysis in atopic dermatitis-induced animal model by H & E staining
  • Example 3-1 Experiments were conducted under the conditions of Example 3-1, and biopsies of mice and other tissues were fixed for 1 day in a 4% formalin solution and paraffin-embedded tissues were sectioned into 5 ⁇ m sections and mounted on slide glass. The mounted tissue was stained with Hematoxylin: Eosin staining solution for a period of time, washed with 1X PBS and analyzed under a microscope.
  • the thickness and inflammatory cells of the percutaneous tissue decreased in the group treated with the nucleic acid complex as compared to the control group inducing atopic dermatitis as shown in FIG. 3E.
  • Example 3-5 Analysis of inflammatory markers in tissues in atopic dermatitis-induced animal models with immunostaining
  • Example 3-1 Experiments were conducted under the conditions of Example 3-1, and biopsies of mice and other tissues were fixed for 1 day in a 4% formalin solution, and the fixed tissues were paraffin-embedded and sectioned at 5 ⁇ m to mount on a slide glass. Mounted tissue was blocked with 0.5% BSA solution for 1 hour, and treated with CD3, CD11c primary antibody solution for 1 day. Subsequently, the primary antibody solution was removed, washed with 1X PBS, and then treated with the secondary antibody solution for 2 hours at room temperature and analyzed through DAB staining.
  • Example 4 Analysis of atopic dermatitis treatment effect using skin permeable nucleic acid complex
  • Example 1 the effect of treating atopic dermatitis was analyzed using a skin-permeable nucleic acid complex comprising a bioactive peptide nucleic acid and a carrier peptide nucleic acid having IL-4R ⁇ as a target gene prepared in the structure of Table 6 below.
  • HaCaT Human keratinocytes obtained from CLS (CLS Cell Lines Service, Germany) in 10% (v / v) fetal calf serum, penicillin 100units / ml, strepto in DMEM culture medium (Dulbecco Modified Eagle Medium, Weljin, Korea) 100 ⁇ g / ml of mycin was added and cultured at 37 ° C. under 5% (v / v) CO 2 conditions.
  • IL-4 10 ng / mL and IL-13 10 ng / mL were treated and cultured for 24 hours.
  • Example 4-2 Cell viability analysis in keratinocyte line with MTT (MTT assay)
  • Example 4-1 As a test condition in Example 4-1, a human-derived keratinocyte cell line was seeded at 6x10 3 in 96 wells, and after 24 hours of incubation, a complex comprising a bioactive nucleic acid and a carrier peptide nucleic acid prepared in the structure of Table 5 was used.
  • MTT 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-Diphenyltetrazolium Bromide
  • solution was prepared in a treated cell line at a concentration of 5 mg / mL in 1X PBS and treated with 20 ⁇ L per well for 4 hours. After incubation, OD (optical density) was measured and analyzed with a spectrophotometer.
  • Example 4-3 Analysis of gene expression by Western blot assay
  • the human-derived keratinocyte cell line was seeded with a cell of 1x10 5 in a 6-well plate, cultured for 24 hours, and then subjected to the experiment under the conditions of Example 4-1 to treat a complex comprising a bioactive peptide nucleic acid and a carrier peptide nucleic acid, 24, 48 After incubation for 72 hours, 30 ⁇ L of RIPA buffer was added to each well to obtain protein lysate.
  • Protein lysate was quantified using the BCA assay kit (Thermo Fisher, USA), and 30 ⁇ g of the protein was separated by size through electrophoresis, and then transferred to the PVDF membrane, followed by primary antibody IL-4R ⁇ (SantaCruz Biotech ., USA), p-JAK3 (Cell signaling Technology, USA), p-stat6 (Cell signaling Technology, USA) was treated at 1: 1000 and left at 4 ° C for one day. Washed with 1X TBS-T and treated with secondary antibodies, Goat Anti-Rabbit, Goat Anti-mouse (SantaCruz Biotech., USA) at 1: 2000 and left at room temperature for 2 hours. Supersignal TM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, USA) was treated and the expression suppression efficiency of target genes in keratinocyte lines was analyzed using Image600 (Amersham, Germany) equipment.
  • IL-4R ⁇ and sub-step gene expression changes in atopic dermatitis-like cell models using IL-4 and IL-13 were analyzed, and the nucleic acid complex combination used is shown in Table 8 below.
  • the combination of the nucleic acid complexes of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 16 inhibited IL-4R ⁇ and sub-step gene expression in atopic dermatitis-like cell model. .
  • Example 5 Analysis of T4 helper type 2 differentiation inhibitory effect of CD4 positive T lymphocytes using skin permeable nucleic acid complex
  • T helper cell differentiation inhibitory effect was analyzed using a skin permeable nucleic acid complex comprising a bioactive peptide nucleic acid and a carrier peptide nucleic acid having IL-4R ⁇ as a target gene prepared in the structure of Table 5 below.
  • T cells Jurkat, CD4 + naive T cells obtained from American Type Culture Collection (ATCC) in RPMI-1640 culture medium (ATCC, USA) 10% (v / v) fetal bovine serum, penicillin 100units / ml , Streptomycin 100 ⁇ g / ml was added, and cultured under conditions of 37 ° C. 5% (v / v) CO 2 .
  • T helper type 2 treated with IL-4 10 ng / mL (Fig. 6A) and IL-4 10 ng / mL + PMA (Phorbol-12-myristate-13-acetate) + Ionomycin (Fig. 6B) 24 , 48, 72 hours incubation.
  • Example 5-2 Analysis of gene expression by Western blot assay
  • T cells Jurkat, CD4 + naive T cells
  • 2x10 5 cells were seeded in 2x10 5 cells in a 6-well plate, and cultured for 24 hours, and then experimented under the conditions of Example 5-1 to include bioactive peptide nucleic acid and carrier peptide nucleic acid.
  • 30 ⁇ L of RIPA buffer was added to each well to obtain protein lysate.
  • Protein lysate was quantified using the BCA assay kit (Thermo Fisher, USA), and 30 ⁇ g of the protein was separated by size through electrophoresis, and then transferred to the PVDF membrane, followed by primary antibody IL-4R ⁇ (SantaCruz Biotech ., USA), p-stat6 (Cell signaling Technology, USA) was treated at 1: 1000 and left at 4 ° C for one day. Washed with 1X TBS-T and treated with secondary antibodies Goat Anti-Rabbit, Goat Anti-mouse (SantaCruz Biotech., USA) at 1: 2000 and left at room temperature for 2 hours. Supersignal TM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, USA) was treated and the expression suppression efficiency of target genes in keratinocyte lines was analyzed using Image600 (Amersham, Germany) equipment.
  • IL-4R ⁇ and sub-step gene expression changes in a T helper type2 differentiation model using IL-4 and IL-4 + PMA were analyzed, and the nucleic acid complex combination used is the same as in Table 8 below.
  • Example 6 Analysis of the effect of treating atopic dermatitis in an animal model of DNCB (2-Dinitrocholrobenzene) -induced atopic dermatitis using a skin permeable nucleic acid complex
  • Example 6-1 Analysis of atopic dermatitis phenotypic effect in atopic dermatitis induction animal model using DNCB (2-Dinitrochlorobenzene)
  • Atopic dermatitis-causing animal model was constructed by applying twice for a total of 4 weeks. A total of 2 times a week for 2 weeks, the nucleic acid complex of the cream formulation was treated, and a cross-section of 0.4% DNCB solution was applied to maintain the animal model causing atopic dermatitis, and when the nucleic acid complex treatment of the cream formulation was completed, the animal model phenotype of atopic dermatitis was photographed. Analysis.
  • nucleic acid complexes whose effects were verified through Examples 4 and 5 were selected, and phenotypic and histological findings and IL-4R ⁇ target gene expression changes in an atopic dermatitis-induced animal model using DNCB were analyzed.
  • the combination is shown in Table 9 below.
  • Example 6-2 Analysis of gene expression by Western blot assay
  • Example 6-1 Experiments were conducted under the conditions of Example 6-1, and a portion of tissue, such as a biopsy mouse, was added to each well by adding 200 ⁇ L of RIPA buffer to obtain protein lysate. Protein lysate was quantified using the BCA assay kit (Thermo Fisher, USA), and 30 ⁇ g of the protein was separated by size through electrophoresis, and then transferred to the PVDF membrane, followed by primary antibody IL-4R ⁇ (SantaCruz Biotech ., USA) at 1: 1000 and left at 4 ° C. for 1 day.
  • BCA assay kit Thermo Fisher, USA
  • Example 6-3 Analysis of IgE, TARC and IL-4 concentration changes in serum
  • mice blood was collected through orbital blood collection on the day of the end of the final experiment and left at room temperature for 2 hours or more to collect serum using a centrifuge (14,000 rpm, 15 min).
  • the collected serum was measured for the concentration of IgE, TARC and IL-4 in serum using the experimental methods provided by the IgE and IL-4 ELISA kit (Goma Biotech, Korea) and the TARC ELISA kit (R & D system, USA).
  • Example 6-4 Analysis of pruritus and erythema improvement effect in atopic dermatitis-induced animal model through animal behavior analysis
  • the presence of erythema symptoms is observed during the period of inducing atopic dermatitis, and the effect of improving erythema symptoms at the time of induction of atopic dermatitis and completion of administration of the nucleic acid complex was confirmed.
  • Example 6-5 Phenotypic analysis in atopic dermatitis-induced animal model by H & E staining
  • Example 6-1 Experiments were conducted under the conditions of Example 6-1, and biopsies of mice and other tissues were fixed for 1 day in a 4% formalin solution and paraffin-embedded tissues were sectioned into 5 ⁇ m sections and mounted on slide glass. The mounted tissue was stained with Hematoxylin: Eoin staining solution for a period of time, washed with 1X PBS and analyzed under a microscope.
  • Example 6-6 Analysis of inflammatory markers in tissues in animal models inducing atopic dermatitis with immunostaining
  • Example 6-1 Experiments were conducted under the conditions of Example 6-1, and biopsies of mice and other tissues were fixed for 1 day in a 4% formalin solution, and the fixed tissues were paraffin-embedded and sectioned at 5 ⁇ m to mount on a slide glass. Mounted tissue was blocked with 0.5% BSA solution for 1 hour, and treated with CD3, CD11c primary antibody solution for 1 day. Subsequently, the primary antibody solution was removed, washed with 1X PBS, and then treated with the secondary antibody solution for 2 hours at room temperature and analyzed through DAB staining.
  • the skin permeable nucleic acid complex in which the bioactive nucleic acid targeting TLR2 or IL-4R ⁇ and the carrier peptide nucleic acid according to the present invention are complementarily combined has high skin permeability and skin persistence, preventing, improving or treating skin diseases such as atopic dermatitis Useful for

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Abstract

본 발명은 피부 투과성 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 피부질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 TLR2 또는 IL-4Rα을 표적하는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 상보적으로 결합된 피부 투과성 핵산 복합체를 함유하는 아토피 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물 또는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 TLR2 또는 IL-4Rα을 표적하는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 상보적으로 결합된 피부 투과성 핵산 복합체는 피부 투과성 및 피부 잔류성이 높아 아토피성 피부염과 같은 피부질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용하다.

Description

피부 투과성 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 피부 투과성 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 피부질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 TLR2 또는 IL-4Rα를 표적하는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 상보적으로 결합된 피부 투과성 핵산 복합체를 함유하는 아토피 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물 또는 화장료 조성물에 관한 것이다.
전통적인 약제와 다르게 핵산 약제는 표적 특이적 전령 RNA(messenger RNA, mRNA)의 발현을 억제하므로, 단백질을 표적으로 하는 기존 약제로 치료가 불가능 했던 연구 영역을 다룰 수 있게 되었다(Kole R. 등 Nature Rev. Drug Discov. 2012; 11; 125-140., Wilson C. 등 Curr. Opin. Chem. Bio. 2006; 10: 607-614.).
올리고 핵산(Oligo nucleic acid)을 기반으로 유전자 발현 조절의 뛰어난 효과 및 다양한 용도에도 불구하고, 핵산을 기반으로 하는 치료제를 개발하기 위해서는 극복해야 할 방해물이 다수 존재한다. 예를 들면, 올리고 핵산은 핵산분해효소(nuclease) 등에 의한 손상의 위험이 있으며, 올리고 핵산의 전기적 성질(전하)과 크기로 인하여 수동 확산(passive diffusion)에 의한 세포막 투과가 불가능한 점 등이 있다. 상기 문제점들을 해소하기 위하여, 핵산의 변형을 통한 생물학적 안정성을 확보하려는 노력이 계속되고 있으며, 변형된 인공핵산(Artificial Nucleic Acid)의 경우 생물학적인 활성의 손실 없이 표적 핵산과의 친화성을 높이는 것이 가능하게 되었다. 변형된 인공핵산의 한 종류인 펩티드 핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA)은 (2-아미노에틸)-글리신 펩티드 백본((2-aminoethyl)-glycine peptide backbone)이 도입된 인공 핵산으로, 상보적인 염기 서열을 가지는 RNA 및 DNA에 강하게 결합하는 성질을 가지고 있다. 특히, 상기 펩티드 핵산은 핵산분해효소에 대해 저항성이 있고, 생물학적 안정성이 높아 다양한 올리고 핵산을 기반으로 하는 치료제 관련 연구가 수행되고 있다. 하지만 상기 펩티드 핵산은 전기적 중성을 가지는 특성으로 세포 내 도입이 어려운 단점을 가지고 있다(Joergensen M. 등 Oligonucleotides 2011, 21; 29-37.). 올리고 핵산 자체의 세포막 투과 능력은 상당히 낮으며, 특히 DNA 또는 RNA는 음전하를 띄고 있기 때문에, 세포의 소수성 인지질 이중막을 통과하지 못하므로 단순 확산을 통한 세포 내 전달이 어렵다. 레트로바이러스(Retrovirus) 혹은 AAV(adeno-associated virus) 등의 바이러스 운반체의 사용은 올리고 핵산의 세포 내 도입을 가능하게 하지만, 의도치 않은 면역활성과 발암유전자(oncogene)의 재조합 가능성 등의 위험성이 있다(Couto L. B. 등 Curr. Opin. Pharmacol. 2010, 5; 534-542.).
이러한 이유로 세포독성이 적고, 면역활성이 낮은 비-바이러스성 올리고 핵산을 기반으로 하는 핵산 운반체 개발의 중요성이 더욱 커지고 있으며, 그 결과로 양전하성 지질(cationic lipid), 리포좀(liposome, 안정된 핵산 지질 입자(stable nucleic acid lipid particle, SNALP), 폴리머 및 세포-투과 입자(cell-penetrating peptide)를 이용한 세포 도입 기법이 개발되고 있다(Zhi D. 등 Bioconjug. Chem. 2013, 24; 487-519., Buyens K. 등 J. Control Release, 2012, 158; 362-70., ROSSI, J. J. 등 Gene Ther. 2006, 13: 583-584., Yousefi A. 등 J. Control Release, 2013, 170; 209-18., Trabulo S. 등 Curr. Pharm. Des. 2013, 19; 2895-923.). 이러한 핵산 전달 기법은 기능성 잔기를 직접적인 결합으로 가지고 있으며, 복합체 형성을 위한 단계를 포함하고, 리포좀(liposome) 구조의 앤도좀 에스케이프(endosome escape) 효율 및 생체독성 등의 문제점을 가지고 있어, 올리고 핵산 도입 기능의 향상과 제조 절차 및 부작용과 관련된 문제점의 해소가 필요하다.
한편, 피부는 인간 신체에서 표면적이 가장 큰 기관으로, 적절한 방법을 사용할 경우 효과적으로 약물을 전달할 수 있는 경로가 된다. 따라서 통상적으로 경피 전달(transdermal delivery)이라고 불리는 피부를 통한 치료용 약물 등의 생리적 활성제의 투여는 비교적 상대적으로 간단한 약물 등의 투여 요법 등의 특징으로 인해 큰 관심을 받아왔다. 구조적으로 피부는 두 주요 부분인, 상대적으로 얇은 최외곽층인 표피층(epidermis, epidermal layer)과, 그보다 두꺼운 안쪽영역인 진피층(dermis, dermal layer)으로 이루어진다. 특히 표피층의 최외곽층인 각질층(stratum corneum)은 케라틴으로 가득찬 편평한 죽은 세포들로 이루어진다. 각질층의 편평한 죽은 세포들 사이의 영역은, 피부의 천연 장벽 특성에 기여하는 라멜라상(lamellar phase)을 형성하는 지질들로 구성되어 있다. 피부의 제일 바깥쪽에 존재하는 각질층(stratum corneum) 등이 천연장벽으로 작용하여, 치료용 약물 등의 외부물질의 피부 투과도는 극단적으로 낮아 분자량이 크고 친수성이 있는 물질의 전달에 어려움이 있다.
이러한 피부로의 치료용 약물 등의 전달 시 피부 장벽의 외부물질에 대한 방어기전을 극복하고자 여러 피부투과 방법에 관한 연구가 시도되었으나, 물리적으로 피부를 손상 또는 자극하지 않고 화학물질의 특성을 통해 약물을 전달하는 것은 매우 어렵다고 여겨지고 있으며, 이를 극복한 소재에 기대할 수 있는 다양한 장점 때문에 지속적으로 개발이 요구되고 있는 실정이다. 이러한 요구에 따라, 큰 분자량의 약물을 효과적으로 전달하기 위한 리포좀 또는 나노 파티클, 펩타이드 리간드 등의 피부투과 전달소재에 관련된 연구가 다수 보고되고 있으며[Lademann et al., 2007(Eur J Pharm Biopharm. 2007 May;66(2):159-64.), Chen et al., 2006a(J Pharmacol Exp Ther. 2006 Nov;319(2):765-75.), Chen et al., 2006b(Nat Biotechnol. 2006 Apr;24(4):455-60.)], 이를 통한 실용화 단계의 개발 비용이 증가함에도 불구하고 전달하고자 하는 약물의 효율과 안정성을 보장할 수 없어, 피부투과 기능과 체내 유효성을 동시에 갖는 소재 개발이 요구되고 있다. 피부 표면에 도포하는 외용적 처치 소재의 유효성은 표피 및 진피를 통과해야 하는 기술적 어려움으로 인해 많은 노력이 요구된다.
이와 관련하여, 본 발명자들은 생활성 핵산과 전체적으로 양전하를 가지도록 변형된 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체가 세포 투과성(cell permeability)이 놀랍게 향상되며, 이를 이용하여 표적 유전자의 발현을 매우 효율적으로 조절할 수 있음을 확인하고, 이러한 세포 독성이 낮고, 생활성 핵산의 세포투과성 및 유전자 발현 조절능력이 향상된 새로운 구조체에 대한 특허를 출원한 바 있다(PCT/KR2017/008636).
상기 구조체 및 치료용 약물 등의 피부 투과 및 세포 전달 기능이 향상에 대한 연구를 지속적으로 수행한 결과, 본 발명자들은 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)과 전체적으로 양전하를 가지도록 변형된 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체가 피부, 바람직하게는 각질층 및/또는 표피층을 매우 효율적으로 통과하는 특성을 가지고 있어, 이러한 핵산 복합체가 피부 투과성이 우수함을 확인하였다.
이에, 본 발명자들은 피부 투과성이 우수한 핵산 복합체를 피부질환 치료에 적용하고자 예의 노력한 결과, TLR2 또는 IL-4Rα를 표적하는 생활성 핵산과 캐리어가 상보적으로 결합된 피부 투과성 핵산 복합체가 아토피 피부염 예방 또는 치료에 우수한 효과를 나타냄을 규명하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 피부 투과성 및 피부 잔류성이 높고 아토피성 피부염의 예방 또는 치료 효과가 우수한 핵산 복합체인 TLR2 또는 IL-4Rα을 표적하는 생활성 핵산과 캐리어가 상보적으로 결합된 피부 투과성 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 피부질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물 또는 화장료 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TLR2 또는 IL-4Rα 유전자와 결합할 수 있는 서열을 가지는 생활성 핵산 (Bioactive Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 피부 투과성 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 피부질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물 또는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 제형을 제공한다.
본 발명은 또한, TLR2 또는 IL-4Rα 유전자와 결합할 수 있는 서열을 가지는 생활성 핵산 (Bioactive Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 피부 투과성 핵산 복합체를 투여하는 단계를 포함하는 피부질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, TLR2 또는 IL-4Rα 유전자와 결합할 수 있는 서열을 가지는 생활성 핵산 (Bioactive Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 피부 투과성 핵산 복합체를 피부질환의 예방 또는 치료에 사용하는 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 피부질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 TLR2 또는 IL-4Rα 유전자와 결합할 수 있는 서열을 가지는 생활성 핵산 (Bioactive Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 피부 투과성 핵산 복합체의 용도를 제공한다.
도 1a 내지 도 1c는 아토피 피부염 유사 세포 모델에서 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 결합된 구조의 종류에 따른 효과를 도식화한 것이다.
도 1a는 집먼지 진드기 (Dermatophagoides farinae) 추출물로 유도한 아토피 피부염 유발 사람 유래 각질 세포주에서 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 결합된 구조의 종류에 따른 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 1b는 집먼지 진드기 (Dermatophagoides pteronyssinus) 추출물로 유도한 아토피 피부염 유발 사람 유래 각질 세포주에서 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 결합된 구조의 종류에 따른 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 1c는 새집증후군 유발 화학물질 (2-dinitroclorobenzene) DNCB로 유도한 아토피 피부염 유발 사람 유래 각질 세포주에서 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 결합된 구조의 종류에 따른 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 2a 내지 도 2c는 아토피 피부염 유사 세포 모델에서 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 결합된 구조의 종류에 따른 효과를 도식화한 것이다.
도 2a는 집먼지 진드기 (Dermatophagoides farinae) 추출물로 유도한 아토피 피부염 유발 사람 유래 각질 세포주에서 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 결합된 구조의 종류에 따른 표적 유전자 TLR2의 발현 및 하위단계 유전자 발현에 주는 영향을 나타낸 것이다.
도 2b는 집먼지 진드기 (Dermatophagoides pteronyssinus) 추출물로 유도한 아토피 피부염 유발 사람 유래 각질 세포주에서 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 결합된 구조의 종류에 따른 표적 유전자 TLR2의 발현 및 하위단계 유전자 발현에 주는 영향을 나타낸 것이다.
도 2c는 새집증후군 유발 화학물질 (2-dinitroclorobenzene) DNCB로 유도한 아토피 피부염 유발 사람 유래 각질 세포주에서 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 결합된 구조의 종류에 따른 표적 유전자 TLR2의 발현 및 하위단계 유전자 발현에 주는 영향을 나타낸 것이다.
도 3a 내지 도 3h는 TLR2를 표적 유전자로 하는 핵산 복합체의 아토피 피부염 유도 동물 모델에서의 치료 효과를 나타낸 것이다.
도 3a는 NC/Nga 마우스에서 핵산 복합체에 의해 마우스의 아토피 피부염 표현형이 감소하는 것을 사진으로 나타낸 것이다.
도 3b는 집먼지 진드기 추출물을 사용하여 아토피 피부염을 유발한 NC/Nga 마우스에서 핵산 복합체에 의해 혈청 내 IgE의 농도가 감소하는 것을 나타낸 것이다.
도 3c는 집먼지 진드기 추출물을 사용하여 아토피 피부염을 유발한 NC/Nga 마우스에서 핵산 복합체에 의해 혈청 내 TARC의 농도가 감소하는 것을 나타낸 것이다.
도 3d는 집먼지 진드기 추출물을 사용하여 아토피 피부염을 유발한 NC/Nga 마우스 피부 조직에서 핵산 복합체에 의한 표적 유전자 TLR2 및 하위단계 유전자의 발현 감소를 나타낸 것이다.
도 3e는 집먼지 진드기 추출물을 사용하여 아토피 피부염을 유발한 NC/Nga 마우스 피부 조직에서 핵산 복합체에 의한 경피 두께 감소를 나타낸 것이다.
도 3f는 집먼지 진드기 추출물을 사용하여 아토피 피부염을 유발한 NC/Nga 마우스에서 핵산 복합체에 의한 염증성 마커 CD3가 감소하는 것을 나타낸 것이다.
도 3g는 집먼지 진드기 추출물을 사용하여 아토피 피부염을 유발한 NC/Nga 마우스에서 핵산 복합체에 의한 염증성 마커 CD11c가 감소하는 것을 나타낸 것이다.
도 3h는 집먼지 진드기 추출물을 사용하여 아토피 피부염을 유발한 NC/Nga 마우스에서 핵산 복합체에 의한 염증성 마커 CD3/CD11c가 감소하는 것을 수치화하여 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4b는 아토피 피부염 유사 세포 모델에서 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 결합된 구조의 종류에 따른 효과를 도식화한 것이다.
도 4a는 IL-4로 유도한 아토피 피부염 유발 사람 유래 각질 세포주에서 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 결합된 구조의 종류에 따른 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 4b는 IL-13으로 유도한 아토피 피부염 유발 사람 유래 각질 세포주에서 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 합된 구조의 종류에 따른 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 5a 내지 도 5b는 아토피 피부염 유사 세포 모델에서 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 결합된 구조의 종류에 따른 효과를 도식화한 것이다.
도 5a는 IL-4로 유도한 아토피 피부염 유발 사람 유래 각질 세포주에서 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 결합된 구조의 종류에 따른 표적 유전자 IL-4Rα의 발현 및 하위단계 유전자 발현에 주는 영향을 나타낸 것이다.
도 5b는 IL-13으로 유도한 아토피 피부염 유발 사람 유래 각질 세포주에서 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 결합된 구조의 종류에 따른 표적 유전자 IL-4Rα의 발현 및 하위단계 유전자 발현에 주는 영향을 나타낸 것이다.
도 6a 내지 도 6b는 아토피 피부염 유사 세포 모델에서 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 결합된 구조의 종류에 따른 효과를 도식화한 것이다.
도 6a는 IL-4로 유도한 아토피 피부염 유발 사람 유래 T lymphocyte에서 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 결합된 구조의 종류에 따른 표적 유전자 IL-4Rα의 발현 및 하위단계 유전자 발현에 주는 영향을 나타낸 것이다.
도 6b는 IL-4, PMA (Phorbol-12-myristate-13-acetate) 및 Ionomycin으로 유도한 아토피 피부염 유발 사람 유래 T lymphocyte 에서 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 결합된 구조의 종류에 따른 표적 유전자 IL-4Rα의 발현 및 하위단계 유전자 발현에 주는 영향을 나타낸 것이다.
도 7a 및 도 7b는 DNCB를 이용하여 아토피 피부염을 유발한 NC/Nga 생쥐 모델에서 유사세포모델을 통해 선별한 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 조합의 아토피 피부염 치료 효과를 조직 표현형과 조직 내 단백질 발현 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 7a는 DNCB로 유도한 아토피 피부염 유발 동물모델에서 핵산복합체에 의해 피부 표현형이 개선되는 것을 나타낸 것이다.
도 7b는 DNCB로 유도한 아토피 피부염 동물모델에서 핵산복합체에 의해 아토피 피부염 유발 피부 조직 내 표적 유전자인 IL-4Rα의 발현량이 감소되는 것을 나타낸 것이다.
도 8a 및 도 8b는 DNCB를 이용하여 아토피 피부염을 유발한 NC/Nga 생쥐 모델에서 유사세포모델을 통해 선별한 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 조합의 아토피 피부염 치료 효과를 ELISA 분석과 SCORAD (아토피 피부염 행동 평가, 소양증 및 홍반) 분석을 통해 나타낸 것이다.
도 8a는 DNCB로 유도한 아토피 피부염 유발 동물모델에서 핵산복합체에 의해 혈청 내 IgE, TARC 및 IL-4의 양이 감소하는 것을 나타낸 것이다.
도 8b는 DNCB로 유도한 아토피 피부염 동물모델에서 핵산복합체에 의해 아토피 피부염 유발 생쥐에서 소양증과 홍반이 개선되는 것을 나타낸 것이다.
도 9a 및 도 9b는 DNCB를 이용하여 아토피 피부염을 유발한 NC/Nga 생쥐 모델에서 유사세포모델을 통해 선별한 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 조합의 아토피 피부염 치료 효과를 아토피 피부염 피부조직의 H&E 염색과 면역염색을 통해 확인하여 나타낸 것이다.
도 9a는 DNCB로 유도한 아토피 피부염 유발 동물모델 피부 조직의 H&E 염색을 통해 핵산복합체에 의해 경피 조직의 두께가 감소하고 염증성 세포의 발현이 감소하는 것을 나타낸 것이다.
도 9b는 DNCB로 유도한 아토피 피부염 동물모델 피부 조직의 면역염색을 통해 핵산복합체에 의해 피부 조직 내 수지상 세포 및 대식 세포 마커인 CD3과 CD11c의 발현이 감소하는 것을 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 상보적으로 결합된 핵산 복합체가 피부 투과성 및 피부 잔류성이 있음을 확인하고, 특히 TLR2 또는 IL-4Rα을 표적하는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 상보적으로 결합된 피부 투과성 핵산 복합체의 피부 표면 도포를 통해 아토피 피부염과 같은 피부질환 치료에 활용될 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일관점에서, TLR2 또는 IL-4Rα 유전자와 결합할 수 있는 서열을 가지는 생활성 핵산 (Bioactive Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 피부 투과성 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 피부질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물 또는 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 생활성 핵산과 캐리어 펩티드가 상보적으로 결합된 핵산 복합체는 하기 구조식 (1)의 구조를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
구조식 (1)
[ A ≡ C (+) ]
상기 구조식 (1)에 있어서,
A는 목적하는 유전자와 결합할 수 있는 서열을 가지는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)이고,
C는 생활성 핵산과 결합할 수 있는 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이고,
'≡'는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 간의 상보적인 결합을 의미하며,
A로 표시되는 생활성 핵산은 전체적으로 음전하 또는 중성을 가지며,
C(+)는 캐리어 펩티드 핵산이 전체적으로 양전하를 가진다는 것을 의미하며,
캐리어 펩티드 핵산은 캐리어 펩티드 핵산 전체적으로 양전하를 띠도록 변형된 펩티드 핵산 단량체를 하나 이상 포함한다.
본 발명에 따른 핵산 복합체에서의 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 역평행결합(anti-parallel binding) 또는 평행결합(parallel binding) 형태를 가질 수 있다.
본 발명에 있어서, “생활성 핵산”은 발현을 감소시키고자 하는 목적하는 표적 유전자와 결합할 수 있는 상보적인 서열, 특히 그러한 목적하는 표적 유전자의 mRNA에 결합할 수 있는 상보적인 서열을 가지는 핵산으로, 해당 유전자의 발현을 억제하는 등의 유전자 발현조절에 관여하는 핵산을 의미하며, 발현을 감소시키고자 하는 표적 유전자에 상보적인 서열을 가지는 핵산일 수 있다.
특히, 본 발명에서의 “생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)”은 생체 외(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 표적 유전자 및 이를 포함하는 염기서열과 결합하여 해당 유전자의 고유 기능(예를 들어, 전사체(transcript) 발현 또는 단백질 발현)을 저해시키는 등의 기능을 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
따라서, 본 발명에서의 "생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)"은 아토피 피부염 질환 표적 유전자인 TLR2 (Toll like Receptor 2) 및 IL-4Rα (Interleukin-14 receptor α)의 안티센스 펩티드 핵산인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1 내지 4로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, TLR2 유전자와 결합할 수 있는 생활성 핵산은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 것이 바람직하며, IL-4Rα 유전자와 결합할 수 있는 생활성 핵산은 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, “캐리어 펩티드 핵산”은 생활성 핵산과 일부 혹은 전부의 염기가 상보적으로 결합하여 기능성을 부여하는 핵산을 의미하며, 본 발명에서 사용되는 캐리어 펩티드 핵산은 펩티드 핵산(PNA : Peptide Nucleic Acid) 뿐 아니라, 이와 유사한 변형된 핵산을 사용할 수 있으며, 펩티드 핵산이 바람직하지만, 이에 한정되는 의미는 아니다.
특히, 본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 5 내지 18로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, “피부 투과성 핵산 복합체”는 피부와의 접촉을 통해 생활성 물질을 체내, 궁극적으로 세포 내로 침투시킬 수 있으며, 구체적으로는 피부의 표피층의 최 외곽층인 각질층 및/또는 표피층을 통과하여, 표피층이나 진피층에 전달하거나, 진피층도 통과하여 체내로 전달할 수 있는 능력을 가진다.
본 발명에 따른 피부 투과성 핵산 복합체에서의 전체적인 전하량(net charge) 및/또는 핵산 복합체에서의 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산의 개수 등에 따라 각질층, 표피층 또는 진피층에 잔류하거나, 진피층까지 통과하여 체내로 전달될 수 있다
이에 따라 본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체는 피부 잔류성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, “피부 투과성 핵산 복합체”에서 생활성 핵산 자체가 치료용 약물로서 기능할 수도 있으며, 즉, 복합체 자체가 피부 투과성 전달체이자 치료제 자체로 이용이 가능할 수도 있다.
특히, 본 발명에 따른 “피부 투과성 핵산 복합체”는 피부를 통해 체내로 경피 전달(transdermal delivery)된 이후, 목적하는 세포 내로 전달될 수 있는 특성을 가지며, 상기 핵산 복합체를 함유하는 어떠한 형태로도 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 피부 투과성 핵산 복합체는 서열번호 2 또는 4의 아미노산 서열로 표시되는 생활성 핵산; 및 서열번호 5 내지 18로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 TLR2 또는 IL-4Rα 유전자와 결합할 수 있는 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력(융해온도, melting temperature, Tm)은 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 TLR2 또는 IL-4Rα 유전자와의 결합력보다 낮은 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 생활성 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산은 각각의 핵산의 5'-말단 또는 3'-말단에 엔도좀 탈출을 도와주는 물질이 추가로 결합된 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 엔도좀 탈출(endosome escape)을 도와주는 물질을 더 포함하여 하기 구조식 (2)의 구조를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
구조식 (2)
[ mA ≡ mC (+) ]
상기 구조식 (2)에 있어서,
'm'은 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 엔도좀 탈출(endosome escape)을 도와주는 물질을 의미한다.
본 발명에 있어서, “엔도좀 탈출을 도와주는 물질”은 엔도좀 내부의 삼투압을 증가시키거나, 엔도좀의 막을 불안정화 시키는 방법에 의하여 생활성 핵산의 엔도좀에서 탈출을 도와주는 것을 특징으로 할 수 있다. 생활성 핵산이 보다 효율적이고 빠르게 핵이나 세포질로 이동하여 표적 유전자를 만나 작용하도록 도와주는 것을 의미한다(D. W. Pack, A. S. Hoffman, S. Pun, P. S. Stayton, “Design and development of polymers for gene delivery,” Nat. Rev. Drug. Discov., 4, 581-593 (2005)).
본 발명에 있어서, 상기 엔도좀 탈출을 도와주는 물질은 펩티드, 지질 나노물질(lipid nanoparticles), 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles), 고분자 나노구(polymer nanospheres), 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles), 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles), 양이온 고분자(cationic polymer) 및 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 엔도좀 탈출을 도와주는 물질로서 생활성 핵산에는 GLFDIIKKIAESF(서열번호 19)의 서열을 갖는 펩티드가 링커 매개로 연결될 수 있으며, 캐리어 펩티드 핵산에는 Histisine(10)을 링커 매개로 연결하는 방법으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 지질 나노물질(lipid nanoparticles)은 Lipid, phospholipids, cetyl palmitate, poloxamer 18, Tween 85, tristearin glyceride 및 Tween 80로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles)은 poly(amidoamine) 또는 polyethylenimine (PEI)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 고분자 나노구(polymer nanospheres)는 polycaprolactone, poly(lactide-co-glycolide, polylactide, polyglycolide, poly(d,l-lactide), chitosan 및 PLGA-polyethylene glycol로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles)은 Fe2O3 Fe3O4, WO3 및 WO2.9로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles)은 1-(aminoethyl)iminobis[N-(oleicylcysteinyl-1-amino-ethyl)propionamide], N-alkylated derivative of PTA 및 3, 5-didodecyloxybenzamidine로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 양이온 고분자(cationic polymer)는 vinylpyrrolidone-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate acid copolymer diethyl sulphate, polyisobutylene 및 poly(N-vinylcarbazole)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)는 polyacids, poly(acrylic acid), poly(methacrylic acid) 및 hydrolyzed polyacrylamide로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 각각 2 내지 50개, 바람직하게는 5 내지 30개, 더욱 바람직하게는 10 내지 25개, 가장 바람직하게는 15 내지 17개의 핵산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 생활성 핵산은 천연(natural) 핵산 염기 및/또는 변형된 핵산 단량체로 이루어져 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어, 상기 생활성 핵산에 사용된 단량체가 PNA일 경우, 생활성 펩티드 핵산이라고 하며, 다른 단량체가 사용된 경우에도 동일한 방식으로 부른다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 포스포디에스테르(phosphodiester), 2' 0-메틸(2' 0-methyl), 2' 메톡시-에틸(2' methoxy-ethyl), 포스포르아미데이트(phosphoramidate), 메틸포스포네이트(methylphosphonate) 및 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 작용기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 상기 생활성 핵산과 염기서열 일부 혹은 전부가 상보적인 서열로 구성되는 것을 특징으로 할 수 있다. 특히, 캐리어 펩티드 핵산은 유니버설 염기(universal base)를 하나 이상 포함할 수 있으며, 캐리어 펩티드 핵산 모두가 유니버설 염기로 이루어질 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 피부 투과성 핵산 복합체 내의 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산 각각은 전기적 특성이 전체적으로, 양전하(양성), 음전하(음성) 또는 중성 전하를 가지는 것을 특징으로 하는 복합체일 수 있다.
상기 전기적 특성의 표현에 있어, “전체적으로”의 의미는 개별 염기의 전기적 특성이 아닌 전체적인 생활성 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산 각각의 전하가 외부에서 볼 때 전체적인 전기적 특성을 의미하는 것으로, 예를 들어, 생활성 핵산 내의 일부 단량체가 양성을 가지더라도 음성을 가지는 단량체의 개수가 더 많이 존재하는 경우에는 생활성 핵산은 “전체적으로” 전기적 특성을 볼 때 음전하를 가지게 되는 것이며, 캐리어 펩티드 핵산 내의 일부 염기 및/또는 백본(backbone)이 음성을 가지더라도 양성을 가지는 염기 및/또는 백본의 개수가 더 많이 존재하는 경우에는 캐리어 펩티드 핵산은 “전체적으로” 전기적 특성을 볼 때 양전하를 가지게 되는 것이다.
이러한 관점에서, 본 발명의 핵산 복합체는 전체적으로 양전하를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 핵산 복합체에 있어서, 바람직하게는 상기 생활성 핵산은 전체적으로 전기적 특성을 볼 때 음전하 또는 중성의 특성을 가지며, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 전기적 특성을 볼 때 양전하 특성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 전기적 특성의 부여는 변형된 펩티드 핵산 단량체를 사용할 수 있고, 변형된 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 캐리어 펩티드 핵산으로 리신(Lysine, Lys, K), 아르기닌(Arginine, Arg, R), 히스티딘(Histidine, His, H), 디아미노 부티르산(Diamino butyric acid, DAB), 오르니틴(Ornithine, Orn) 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양전하의 아미노산을 포함하고, 음전하를 가지는 캐리어 펩티드 핵산으로 음전하의 아미노산인 글루타민산(Glutamic acid, Glu, E) 또는 아미노산 유사체의 음전하의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 양전하를 가지도록 1개 이상의 gamma- 또는 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 gamma- 혹은 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체는 전기적 양성을 가지도록 리신(Lysine, Lys, K), 아르기닌(Arginine, Arg, R), 히스티딘(Histidine, His, H), 디아미노 부티르산(Diamino butyric acid, DAB), 오르니틴(Ornithine, Orn) 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양전하를 가지는 아미노산을 backbone에 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 전하 부여를 위한 펩티드 핵산 단량체의 변형은 상기 backbone 변형 이외에도 nucleobase가 변형된 펩티드핵산 단량체를 사용할 수 있다. 바람직하게는 전기적 양성을 가지도록 amine, triazole, imidazole moeity를 nucleobase에 포함하거나, 전기적 음성을 가지도록 carboxylic acid를 염기에 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산의 변형 펩티드 핵산 단량체는 음전하를 backbone 혹은 nucleobase에 더 포함할 수 있지만, 변형 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 단량체가 음전하를 가지는 단량체에 비해 더 많이 포함되어 전체적으로 캐리어 펩티드 핵산의 전하가 양성이 되는 것이 바람직하다.
바람직하게는 본 발명에 따른 상기 핵산 복합체는 전체적으로 양의 전하를 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 상기 핵산 복합체에 있어, 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머 또는 형광/발광 표지자 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질이 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산에 결합된 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 상기 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머 및 이미징을 위한 형광/발광 표지자 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질은 상기 캐리어 펩티드 핵산에 결합된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머, 소광자, 형광 표지자 및 발광 표지자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질과 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산의 결합은 단순 공유결합 또는 링커로 매개된 공유결합인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 핵산 운반체에 결합된 세포투과, 용해도, 안정성, 운반 및 이미징 관련 물질(예컨대, 소수성 잔기 등)은 표적 유전자의 발현을 조절하는 생활성 핵산과 독립적으로 존재하게 된다.
본 발명에 있어서, 앞서 기술한 바와 같이, 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 상보적인 결합 형태는 크게 역평행결합(antiparallel binding)과 평행결합(parallel binding)의 형태를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 상보적인 결합 형태는 생활성 핵산의 목적서열(생활성 핵산과 상보적인 서열) 존재 하에서 분리되는 구조를 가진다.
상기 역평행결합과 평행결합은 DNA-DNA 또는 DNA-PNA의 결합 방식에 있어, 5'-방향성과 3'-방향성에 따라 결정된다. 역평행 결합은 일반적인 DNA-DNA 또는 DNA-PNA의 결합 방식으로, 본 발명에 따른 핵산 복합체를 예로 들어 설명하면, 생활성 핵산은 5'에서 3' 방향으로, 캐리어 펩티드 핵산은 3'에서 5' 방향으로 서로 결합되는 형태를 의미한다. 평행결합은 역평행결합에 비해서는 결합력이 다소 떨어지는 형태로, 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 모두가 5'에서 3' 방향 또는 3'에서 5' 방향으로 서로 결합되는 형태를 의미한다.
본 발명에 따른 핵산 복합체에 있어서, 바람직하게는 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력은 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자, 특히 목적 유전자의 mRNA와의 결합력보다 낮은 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 결합력은 융해온도, melting temperature 또는 Tm에 의해 결정된다.
상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력(융해온도, melting temperature, Tm)이 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자, 특히 목적 유전자의 mRNA와의 결합력보다 낮게 하기 위한 구체적인 방법의 예로는, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 평행 결합(Parallel binding) 또는 부분 특이결합(Partial specific binding)하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 예로서 상기 캐리어 펩티드 핵산이 링커, 유니버설 염기(universal base) 및 생활성 핵산의 대응되는 염기와 상보적이지 않은 염기를 가지는 펩티드 핵산 염기로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 펩티드 핵산 염기를 갖는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 유니버설 염기(universal base)는 아데닌(adenine), 구아닌(guanine), 사이토신 (cytosine), 티민(thymine), 우라실(Uracil) 등의 천연 염기와 선택성 없이 결합하고, 상보적인 결합력보다 낮은 결합력을 가지는 염기로 이노신 PNA(inosine PNA), 인돌 PNA(indole PNA), 나이트로인돌 PNA(nitroindole PNA) 및 무염기(abasic)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 사용할 수 있으며, 바람직하게는 이노신 PNA를 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체의 기능 조절을 위한 핵산들의 결합 형태와 전기적 성질 조합을 제공하고, 상기 핵산의 결합 형태와 전기적 성질 조합으로 입자 크기 및 작용 시점을 조절하고, 세포투과성, 용해도 및 특이도를 향상시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 결합력 조절을 통해, 목적 유전자의 존재 하에서, 생활성 펩티드 핵산이 목적 서열과 결합되는 시점(생활성 핵산의 목적 서열로의 치환되는 시점, 표적 특이적 분리 및 결합 시점) 등의 조절이 가능하다.
본 발명에 따른 핵산 복합체에 있어서, 생활성 핵산의 목적 유전자로의 치환(strand displacement) 시점, 표적 특이적 분리 및 결합(target specific release and bind) 시점의 조절은 복합체의 비특이 결합을 위한 캐리어 펩티드 핵산의 비특이 염기, 유니버설 염기 및 linker의 유무, 개수 및 위치에 의하여 조절이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 펩티드 복합체의 상보적인 결합의 형태인 평행(parallel) 또는 역평행(antiparallel) 형태의 결합 등과 상기 조건의 조합에 의하여 조절이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체의 입자는 5 nm 내지 300 nm, 바람직하게는 10 nm 내지 80 nm, 가장 바람직하게는 15 nm 내지 70 nm의 크기를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체의 입자 크기는 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 전하 밸런스(charge balance)를 조절함으로써 조절되는 것을 특징으로 할 수 있다. 구체적으로는 캐리어 펩티드 핵산의 양전하가 증가하면 입자의 크기가 작아지나, 캐리어 펩티드 핵산의 양전하가 일정 수준을 넘게 되면 입자의 크기가 커지는 특징을 가지게 된다. 또한, 입자 크기를 결정하는 다른 중요한 요소로 복합체를 이루는 생활성 펩티드 핵산 전하에 따른 전반적인 캐리어 펩티드 핵산과의 적절한 전하 밸런스에 의해서 입자 크기가 결정된다.
본 발명에 따른 캐리어 펩티드 핵산의 양전하는 1개 내지 7개(양전하를 가지는 단량체가 1개 내지 7개 포함됨을 의미한다), 바람직하게는 2개 내지 5개, 가장 바람직하게는 2개 내지 3개이며, 생활성 핵산의 전하는 전하 밸런스의 넷 차지(net charge)가 음전하 0개 내지 5개, 바람직하게는 0개 내지 3개이다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체는 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 적절한 조건에서 혼성화됨으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 “혼성화”는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 결합 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명의 “표적 유전자”는 활성, 억제 또는 표지 하고자 하는 핵산 서열(염기서열)을 의미하며, 용어 “표적 핵산”과 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
본 발명에 있어서, 표적 유전자를 포함하는 표적 핵산(염기서열)이 생체 외(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 상기 복합체와 접촉(결합)하게 되면, 캐리어 펩티드 핵산으로부터 생활성 핵산이 분리되어 생물학적 활성을 나타내게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체를 이용하여 예방, 치료할 수 있는 질병은, 상기 핵산 복합체 내의 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에서는 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자로 TLR2 또는 IL-4Rα인 것을 특징으로 할 수 있다.
따라서, 본 발명에서 상기 핵산 복합체를 이용하여 예방, 치료할 수 있는 질병은 피부질환인 것이 바람직하며, 예를 들어 건선(psoriasis), 아토피 피부염(atopic dermatitis)를 포함하는 아토피 질환(atopic disease), 흑색종(melanoma) 등의 피부암(skin cancer), 켈로이드(Keloid)성 질환, 피부 손상 및 색소침착 등의 질환, 종양 또는 암, 염증성 질환, 노인성 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 희귀질환 및 중증질환, 심혈관 질환, 대사성 질환 등의 치료에 사용될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명에 있어서, 용어 “치료용 조성물”은 "의약(약제학적, 약학적) 조성물(pharmaceutical composition)"과 혼용될 수 있으며, 본 발명의 생활성 핵산 및 상기 핵산과 결합하는 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 핵산 복합체를 유효성분으로 포함하며, 추가적으로 상기 핵산 복합체에 목적하는 질환을 치료하기 위한 치료용 약물이 결합된 형태일 수 있다.
본 발명의 치료용 조성물은 표준 의약 실시에 따라 피부 전달 형태의 제형으로 제형화될 수 있다. 이들 제형은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는, 특히 피부에 적용될 수 있는 형태의 제형에 적합한 담체, 부형제, 보조제 또는 희석제 등의 첨가물을 함유할 수 있다.
바람직하게는 본 발명에 따른 조성물은 수성액, 겔, 연고, 크림, 로션, 페이스트, 도말제 또는 패치 형태로 제형화될 수 있다.
가장 바람직하게는 수성액의 형태로 제형화될 수 있고, 이때 수성액은 증류수 및 버퍼 용액의 형태가 사용될 수 있다.
용어 "약학적으로 허용되는(physiologically acceptable)"은 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 특성을 의미한다.
용어 "담체(carrier)"는 세포 또는 조직 내로의 핵산 복합체의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
용어 "희석제(diluent)"는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.
본 발명에서의 핵산 복합체를 함유하는 물질은, 환자에게 그 자체로서 또는 병용 요법(combination therapy)에서와 같이 다른 활성 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형제와 함께 혼합된 의약 조성물로서 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용에 적합한 의약 조성물에는, 활성 성분들이 그것의 의도된 목적을 달성하기에 유효한 양으로 함유되어 있는 조성물이 포함된다. 더욱 구체적으로, 치료적 유효량은 치료될 객체의 생존을 연장하거나, 질환의 증상을 방지, 경감 또는 완화시키는데 유효한 화합물의 양을 의미한다. 치료적 유효량의 결정은, 특히, 여기에 제공된 상세한 개시 내용 측면에서, 통상의 기술자의 능력 범위 내에 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은, 상기 피부 투과성 핵산 복합체를 포함하는 치료용 조성물의 투여(또는 도포)로 질환의 발병을 막거나, 이의 진행을 억제시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 “개선”이란 상기 피부 투과성 핵산 복합체를 포함하는 치료용 조성물의 투여(또는 도포)로 질환의 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는, 상기 피부 투과성 핵산 복합체를 포함하는 치료용 조성물의 투여(또는 도포)로 질환의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 피부 투과성 핵산 복합체는 리포솜(liposome) 등의 전달체를 이용하여 투여(또는 도포)할 수도 있다. 상기 리포솜은 림프 조직과 같은 특정 조직에 대해 상기 복합체를 표적화하거나, 감염 세포에 대해 선택적으로 표적화하는데 도움을 줄 수 있고, 또한 상기 복합체가 포함된 조성물의 반감기를 증가시키는데 도움을 줄 수 있다. 리포솜으로는 에멀션, 포움(foam), 마이셀(micelle), 불용성 단층, 액정, 인지질 분산물, 라멜라 층(lamellar layer) 등이 있다. 이러한 제제에 있어서, 송달되는 상기 복합체는, 단독으로 또는 특정 세포들을 대상으로, CD45 항원에 결합되는 모노클로날 항체와 같은 림프 세포 중 우세한 수용체에 결합하는 분자와 함께 또는 기타 치료 조성물과 함께, 리포솜의 일부로서 혼입시킨다. 따라서, 본 발명의 소정 복합체로 충진되거나 도포되어(decorated) 상기 핵산 복합체 조성물을 송달하는 리포솜은 림프 세포의 상기 부위로 지향될 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 리포솜은 일반적으로 중성 및 음전하 인지질 및 콜레스테롤 등의 스테롤을 비롯한 표준 베시클 (vesicle)-형성 지질로부터 형성된다. 일반적으로, 예를 들어 혈류 중의 리포솜의 안정성, 산 불안정성(acid lability) 및 리포솜의 크기 등을 고려하여 지질을 선택한다. 리포솜 제조에는 다양한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Szoka, et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:467, 1980), 및 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호, 제4,837,028호 및 제5,019,369호]에 기재되어 있는 바와 같은 방법을 이용할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, TLR2 또는 IL-4Rα 유전자와 결합할 수 있는 서열을 가지는 생활성 핵산 (Bioactive Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 피부 투과성 핵산 복합체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 핵산 복합체를 포함하는 조성물은 피부질환을 치료하기 위하여 또는 피부질환의 증세를 억제(또는 완화)하기 위하여 의약으로 효과적인 양으로 피부에 적용될 수 있다. 피부질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 치료 회수, 적용 형태 및 경로 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 해당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기한 약리학적 또는 생리학적 성분을 함께 적용하거나 순차적으로 적용할 수 있으며, 또한 추가의 종래의 치료제와 병용하여 적용될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 적용될 수 있다. 이러한 적용은 단일 또는 다중적으로 적용일 수 있다.
본 발명에서, "개체"는 본 발명에 따른 피부 투과성 핵산 복합체를 투여(도포)하여 경감, 억제 또는 치료될 수 있는 상태 또는 질환을 앓고 있거나 그러한 위험이 있는 포유동물을 의미하며, 바람직하게 사람을 의미한다.
또한, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 투여량(도포량)은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여(도포) 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000㎎/일이고, 바람직하게는 0.01 ~ 500㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여(도포)할 수도 있다.
본 명세서에 기재되어 있는 피부 투과성 핵산 복합체를 포함하는 조성물의 독성과 치료 효율성은, 예를 들어, LD50(군집의 50%에 대한 치사량), ED50(군집의 50%에 대해 치료 효과를 갖는 선량), IC50(군집의 50%에 대해 치료 억제 효과를 갖는 선량)을 결정하기 위하여, 세포 배양 또는 실험동물에서의 표준 제약 과정들에 의해 산정될 수 있다. 독성과 치료 효과 간의 선량 비가 치료 지수이고 이것은 LD50과 ED50(또는, IC50) 간의 비율로서 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 보이는 화합물들이 바람직하다. 이들 세포 배양 분석에서 얻어진 데이터는 인간에 사용하는 선량의 범위를 산정하는데 사용될 수 있다. 그러한 화합물들의 투여량(dosage) 또는 도포량은 바람직하게는 독성이 없거나 거의 없는 상태에서 ED50(또는, IC50)을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다.
본 발명의 용어 "투여"란, 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 행위를 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명의 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 포유동물에 하루 동안 10 내지 100 ㎎/㎏, 보다 바람직하게는 10 내지 30 ㎎/㎏으로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 내지 3회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, TLR2 또는 IL-4Rα 유전자와 결합할 수 있는 서열을 가지는 생활성 핵산 (Bioactive Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 피부 투과성 핵산 복합체를 피부질환의 예방 또는 치료에 사용하는 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 피부질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 TLR2 또는 IL-4Rα 유전자와 결합할 수 있는 서열을 가지는 생활성 핵산 (Bioactive Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 피부 투과성 핵산 복합체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 화장료 조성물은 피부에 적용되는 모든 제형으로 적용될 수 있다. 보다 구체적으로, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 스프레이, 팩 등과 같은 화장품류 뿐만 아니라, 비누, 클렌징폼, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 바디 로션, 바디 크림, 바디 오일, 바디 세정제, 샴푸, 연고, 패취 (하이드로젤 슬리밍패치) 등으로 제조될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 이 밖에도, 화장, 세제, 및 섬유 등 피부에 접촉하는 피부 접촉 물질로서도 제조 가능하다.
본 발명의 화장료 조성물은 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는 담체성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 수산화알루미늄, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 가용화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예를 들어 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미세결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면활성제-함유 클렌징인 경우에는 담체성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포석신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
또한 본 발명의 피부 외용 제제에는 상기 기재한 성분들 이외에 피부나 점막에 적용되는 화장료나 외용의 의약품·의약부외품에 배합되는 공지의 각종 성분을 적용량 배합할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 각각의 제형에 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합할 수 있다. 상기 첨가 가능한 배합성분으로는 항산화제(예를 들면, 아스코르브산, 구연산과 같은 카르본산류; 토코페롤, 디부틸히드록시톨루엔과 같은 페놀류), 습윤제(예를 들면, 글리세린, 프로필렌글리콜, 디프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌글리콜과 같은 글리콜류; 히알론산과 같은 유기염류; 요소와 같은 아미드류), 점조제(예를 들면, 폴리에틸렌글리콜과 같은 고분자 화합물; 카르복시메틸 셀룰로오스나트륨, 카르복시프로필셀룰로오스와 같은 셀룰로오스류), 완충제(예를 들면, 구연산, 락트산, 주석산과 같은 유기산류; 염산, 붕산과 같은 무기산류; 인산이수소나트륨, 구연산나트륨과 같은 염류; 트리에탄올아민과 같은 유기염기류; 수산화나트륨, 수산화칼륨과 같은 무기 염기), 흡착제(예를 들면, 카올린, 벤토나이트와 같은 함수 규산 알루미늄류; 수산화알루미나마그네슘, 수산화알루미늄과 같은 무기염류), 기제(예를 들면, 백색 바셀린, Tween60, Tween80, 유동 파라핀, 밀랍, 바셀린, 피마자유, 실리콘유, 경화 피마자유, 천연고무, 야자유 지방산 디에탄올아미드, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 천연고무 라텍스, 1,3-펜타디엔 공중합 수지와 같은 유기물; 폴리부텐, 합성 고무 SBR, 모노스테아르산폴리에틸렌 글리콜, 모노스테아르산폴리옥시에틸렌 글리콜, 폴리옥시에티렌세트스테아릴 에테르, 폴리옥시에티렌올레일세틸 에테르, 실리콘, 아크릴산 전분300, 폴리아크릴산나트륨, 메타아크릴산ㆍ아크릴산 n-부틸 코폴리머, 카르복시비닐 폴리머와 같은 고분자화합물; 스테아르산과 같은 지방산류; 세타놀, 미리스틸알코올과 같은 알코올류; 미리스틴산 옥타도데실, 미리스틴산 이소프로필, 옥탄산 세틸과 같은 지방산 에스테르류), 용제(예를 들면, 에탄올, 이소프로판올, 1,3-부틸렌글리콜, n-옥타데실알코올, 크로타미톤, 트리(카푸릴산ㆍ카푸론)글리세린과 같은 탄수화물), 안정화제(예를 들면, 메타인산나트륨, 산화아연, 산화티탄과 같은 무기염류; 폴리옥시에틸렌라우릴황산 에테르 황산나트륨, 라우릴 황산나트륨과 같은 유기 염류), 점착제(예를 들면, 폴리아크릴산나트륨, 디프로필렌글리콜과 같은 고분자 화합물), 유화제(예를 들면, 모노올레핀산 솔비탄, 모노올레핀산 폴리옥시에틸렌솔비탄, D-솔비톨, 모노라우린산 폴리글리세린, 폴리옥시에틸렌라우릴 에테르 황산나트륨과 같은 탄수화물), 계면활성제(예를 들면, 모노라우린산 폴리글리세린, 폴리옥시에틸렌올레일 알코올 에테르과 같은 고분자 화합물) 외에, 향료, 색소(염료, 안료), 금속 봉쇄제, 방취제, 피막 형성제, 자외선 흡수제, 자외선 산란제, 비타민류 등을 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 적용하고자 하는 피부 면적에 따라 적절한 양을 피부에 도포함으로써 적용될 수 있으며, 필요에 따라 하루 1회 내지 수 회 반복하여 사용할 수 있다. 적용하는 양 및 횟수는 개인의 피부 상태, 제형, 투여 대상의 연령, 성별, 체중, 반응감응성, 적용 기간 등에 따라 필요에 따라 적절히 증감할 수 있다.
당업자는 목적하는 효과에 효과적인 투여량을 적절하게 선택할 수 있다. 상기 조성물의 투여 제형은 단일투여 또는 반복투여 제형일 수 있으며, 상기 1일 유효량을 임의로 수회 나누어서 투여할 수 있다.
본 발명의 약학 또는 화장료 조성물은 유효성분의 투과력을 증진시키기 위한 목적으로, 이온토포레시스(iontophoresis), 소노포레시스(sonophoresis), 전기천공법(electroporation), 마이크로전자 패취(microelectric patch), 기계적 압력, 삼투압 구배, 차폐 요법(occlusive cure) 또는 미세주입요법, 또는 이들을 조합한 투여방법에 의해 피부에 적용될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid) 및 캐리어 펩티드 핵산, 및 이들을 이용한 복합체의 제조
본 발명의 핵산 복합체의 아토피 피부염 효과 검증을 위하여, 표적유전자로 아토피 피부염 질환 표적 유전자인 TLR2 (Toll like Receptor 2)와 IL-4Rα (Interleukin-14 receptor α)를 사용하였다. 알러지 유발 물질이나 세균이 피부로 침투할 때 발현되는 유전자인 TLR2는 아토피 피부염 환자에서는 과발현 되어 있어 피부 내 염증성 사이토카인에 의한 염증 증가로 아토피 피부염을 악화시킨다. 이 때문에 아토피 피부염에 있어서 중요한 표적이 될 것으로 예측되고 있다.
아토피 피부염 환자에게서 특징적으로 나타나는 돌연변이 중 하나인 IL-4Rα의 변이는 T 세포의 분화 중 T helper 1/2 타입으로의 분화 항상성을 깨뜨려 아토피 피부염을 유발하는 인자로 알려져 있다.
아토피 피부염 치료효과를 확인하기 위해 TLR2 및 IL-4Rα에 대한 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)으로 안티센스 펩티드 핵산(antisense PNA) 를 사용하였다.
본 발명의 대조군으로 사용한 생활성 핵산 (antisense PNA) 은 서열번호 1 및 3으로 표시되는 서열로 구성되어 있으며, 아토피 피부염 치료효과를 확인하기 위해 사용한 생활성 핵산(antisense PNA)은 서열번호 2 및 4로 표시되는 서열로 구성되어 있다.
본 실시예에서 사용된 펩티드 핵산 기반 생활성 핵산은 엔도좀 탈출능을 돕기 위한 펩타이드인 GLFDIIKKIAESF(서열번호 19)를 5'에 결합하였으며 염기서열, 단량체 변형 및 구조는 하기 표 1과 같다. 하기 표 1 은 TLR2 및 IL-4R를 표적으로 하는 아토피 피부염 치료제로서의 효과를 확인하기 위해 사용된 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 및 대조군으로 사용된 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 서열 정보를 나타낸다. 서열번호 1 및 2의 생활성 핵산, 서열번호 5 내지 13의 캐리어 핵산은 TLR2를 표적하며, 서열번호 3 및 4의 생활성 핵산, 서열번호 14 내지 18의 캐리어 핵산은 IL-4Rα를 표적한다.
본 발명에서 사용한 모든 펩티드 핵산은 파나진(PANAGENE, 한국)에서 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였다. 본 발명의 실시예에 따른 모든 캐리어 펩티드 핵산 중 일부는 엔도좀 탈출능을 돕기 위한 Histidine(10)과 같은 펩타이드를 5' 내지 3' 말단에 결합하였으며, 서열번호 5번 내지 18번으로 기재되는 서열로 구성되어 있다 (표 1).
Figure PCTKR2019013970-appb-T000001
단량체의 변형은 전기적인 성질을 부여하기 위하여 펩티드핵산의 backbone을 전기적 양성은 리신(Lysine, Lys, K, (+)로 표기)을 전기적 음성은 글루타민산(Glutamic acid, Glu, E, (-)로 표기)로 변형된 펩티드 backbone을 가지도록 제작하였다.
각각의 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 조합은 DMSO 하에서 혼성화 되었으며, 그 결과 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 복합체가 제작되었다.
실시예 2: 피부 투과성 핵산 복합체를 이용한 아토피 피부염(Atopic dermatitis) 유사 세포모델에서 치료 효과 분석
실시예 1에 따라, 하기 표 2의 구조로 제조된 TLR2를 표적 유전자로 하는 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 피부 투과성 핵산 복합체를 이용하여 아토피 피부염 치료 효과를 분석하였다.
Figure PCTKR2019013970-appb-T000002
실시예 2-1: 세포 배양
CLS(CLS Cell Lines Service, 독일)로부터 입수한 인간 각질 세포(HaCaT)를 DMEM 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, 웰진, 한국)에 10％(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37℃5％(v/v) CO2의 조건하에서 배양하였다. 아토피 피부염 유사 세포 모델을 만들기 위해 집먼지 진드기 추출액 5 ng/mL과 DNCB (2-dinitrochlorobenzene) 5 μM을 처리하여 24시간 배양하였다.
실시예 2-2: MTT (MTT assay)로 각질 세포주에서 세포 생존율 분석
실시예 2-1에서의 실험 조건으로 96웰에 사람 유래 각질 세포주를 6x103으로 씨딩하고, 24시간 배양한 후, 표 2의 구조로 제조된 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 이용하여 처리된 세포주에 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) 용액을 1X PBS에 5 mg/mL 농도로 제조하고 well당 20 μL로 처리하여 4시간 배양 후 OD (optical density)를 spectrophotometer로 측정하여 분석하였다.
본 실시예에서 사용한 핵산 복합체 조합은 하기 표 3과 같다.
Figure PCTKR2019013970-appb-T000003
그 결과, 도 1a 내지 1c에 나타낸 바와 같이, 집먼지 진드기 추출물 또는 DNCB로 유도된 아토피 피부염 유사 세포 모델에서 핵산 복합체에 의해 세포 생존율이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 2-3: 웨스턴 블랏 분석(Western blot assay)으로 유전자 발현의 분석
사람 유래 각질 세포주를 6웰 플레이트에 1x105으로 세포를 씨딩하고 24시간 배양 후 실시예 2-1의 조건으로 실험을 진행하여 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 처리하고 24, 48, 72시간 배양한 후, RIPA buffer를 각 웰에 30 μL씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30 μg을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 TLR2 (SantaCruz Biotech., 미국), p-NFkB (Cell signaling Technology, 미국), MyD88 (Cell signaling Technology, 미국), TARC (Abcam, 미국)를 1:1000으로 처리하고 4 ℃에서 하루 동안 방치하였다. 1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit, Goat Anti-mouse (SantaCruz Biotech., 미국)를 1:2000으로 처리하여 상온에서 2시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 각질 세포주에서 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
본 실시예에서는 실시예 2-2를 통하여 효과가 검증된 핵산 조합체를 선별하여 집먼지 진드기 및 새집증후군 유발 화학물질을 이용한 아토피 피부염 유사 세포 모델에서의 TLR2 및 하위단계 유전자 발현 변화를 분석하였으며, 사용한 핵산 복합체 조합은 하기 표 4와 같다.
Figure PCTKR2019013970-appb-T000004
표 4의 핵산 복합체 조합에 대해서 아토피 피부염 유사 세포 모델에서의 TLR2 단백질 및 하위 경로 유전자의 발현 패턴 분석하였다.
그 결과, 도 2a 내지 2c에 나타낸 바와 같이, 서열번호 2와 서열번호 7의 조합 핵산 복합체를 통하여 농도 의존적으로 표적 유전자의 발현 및 하위 경로 유전자의 발현이 시간에 따라 가장 많이 억제되는 것을 확인하였다.
실시예 3: 피부 투과성 핵산 복합체를 이용한 아토피 피부염(Atopic dermatitis) 동물모델에서의 치료 효과 분석
실시예 3-1: 집먼지 진드기 추출물을 이용한 아토피 피부염 유도 동물 모델에서의 아토피 피부염 표현형 효과 분석
NC/Nga 마우스의 등을 제모하고 AD cream (집먼지 진드기 추출물 크림, Biostir, 일본)을 100 mg씩 일주일에 2번 총 3주 동안 도포하여 집먼지 진드기에 의한 아토피 피부염 유발 동물 모델을 구축하였다. 일주일에 총 2번의 크림 제형의 핵산 복합체를 처리하고 아토피 피부염 동물 모델 표현형을 사진으로 분석하고, 등 부위 털 자람 정도를 ImageJ로 측정하였다.
본 실시예에서는 실시예 2-2를 통하여 효과가 검증된 핵산 조합체를 선별하여 집먼지 진드기 추출물을 이용한 아토피 피부염 유사 동물 모델에서의 표현형 및 조직학적 소견, TLR2 및 하위단계 유전자 발현 변화를 분석하였으며, 사용한 핵산 복합체 조합은 하기 표 5와 같다.
Figure PCTKR2019013970-appb-T000005
그 결과, 아토피 피부염 표현형이 핵산 복합체 그룹에서 감소하는 것을 확인하였으며(도 3a), 아토피 피부염을 유도한 동물 그룹과 비교하였을 때, 핵산복합체를 도포한 그룹에서 피부 손상으로 인한 탈모가 감소하는 것을 확인할 수 있었다 (도 3a; Cream control은 크림 제형을 포함하지만 핵산 복합체를 포함하지 않는 그룹이며, Positive control은 기존 치료제인 dexamethsone을 포함하는 크림 제형).
실시예 3-2: 혈청 내 IgE 및 TARC 농도 변화 분석
실시예 3-1의 조건으로 진행한 동물 실험에서 최종 실험 종료일에 마우스 혈액을 안와 채혈을 통해 수집하고 상온에서 2시간 이상 방치하여 원심분리기 (14,000 rpm, 15 min)를 이용하여 혈청을 수집하였다. 수집한 혈청을 IgE ELISA kit (고마바이오텍, 대한민국) 및 TARC ELISA kit (R&D system, 미국)에서 제공하는 실험방법을 이용하여 혈청 내 IgE 및 TARC의 농도를 측정하였다.
그 결과, 도 3b와 3c에 나타낸 바와 같이, 아토피 피부염을 유도한 대조군 대비 핵산 복합체를 처리한 그룹에서 IgE 및 TARC의 농도가 음성 대조군과 비슷한 수준으로 감소한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3-3: 웨스턴 블랏 분석(Western blot assay)으로 유전자 발현의 분석
실시예 3-1의 조건으로 실험을 진행하여 생검한 마우스 등 조직의 일부를 RIPA buffer를 각 웰에 200 μL씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30 μg을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 TLR2 (SantaCruz Biotech., 미국), p-NFkB (Cell signaling Technology, 미국), MyD88 (Cell signaling Technology, 미국)를 1:1000으로 처리하고 4 ℃에서 하루 동안 방치하였다. 1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit, Goat Anti-mouse (SantaCruz Biotech., 미국)를 1:2000으로 처리하여 상온에서 2시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 마우스 등 조직에서 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
도 3d와 같이, 아토피 피부염 유사 동물 모델 조직에서 핵산 복합체를 처리한 그룹에서 TLR2의 발현 및 하위단계 유전자의 발현이 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 3-4: H&E 염색으로 아토피 피부염 유도 동물 모델에서의 표현형 분석
실시예 3-1의 조건으로 실험을 진행하여 최종 실험 종료일에 마우스 등 조직을 생검하여 4% 포르말린 용액에 하루 동안 고정하고 고정한 조직을 파라핀 포매하여 조직을 5 μm로 섹션하여 슬라이드 글라스에 마운팅하였다. 마운팅한 조직을 Hematoxylin:Eosin 염색 용액에 일정 시간 동안 염색하고 1X PBS로 수세한 후 현미경으로 분석하였다.
그 결과, 도 3e에서와 같이 아토피 피부염을 유도한 대조군 대비 핵산 복합체를 처리한 그룹에서 경피 조직의 두께 및 염증성 세포들이 감소한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3-5: 면역염색으로 아토피 피부염 유도 동물 모델에서의 조직 내 염증성 마커 분석
실시예 3-1의 조건으로 실험을 진행하여 최종 실험 종료일에 마우스 등 조직을 생검하여 4% 포르말린 용액에 하루 동안 고정하고 고정한 조직을 파라핀 포매하여 5 μm로 섹션하여 슬라이드 글라스에 마운팅하였다. 마운팅한 조직을 0.5% BSA 용액에 1시간 동안 블라킹하고, CD3, CD11c 1차 항체 용액을 처리하여 하루 동안 처리하였다. 이어서 1차 항체 용액을 제거하고 1X PBS로 씻어낸 후 2차 항체 용액을 처리하여 상온에서 2시간 처리하여 DAB 염색을 통해 분석하였다.
그 결과, 도 3f 내지 3g에 나타낸 바와 같이, 조직 내 염증성 마커인 CD3와 CD11c가 아토피 피부염을 유도한 대조군에 비해 핵산 복합체 그룹에서 감소하는 것을 확인하였으며, 이를 수치화하여 비교하였을 때에도 감소하는 것을 확인하였다 (도 3h).
실시예 4: 피부 투과성 핵산 복합체를 이용한 아토피 피부염(Atopic dermatitis) 치료 효과 분석
실시예 1에 따라, 하기 표 6의 구조로 제조된 IL-4Rα를 표적 유전자로 하는 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 피부 투과성 핵산 복합체를 이용하여 아토피 피부염 치료 효과를 분석하였다.
Figure PCTKR2019013970-appb-T000006
실시예 4-1: 세포 배양
CLS(CLS Cell Lines Service, 독일)로부터 입수한 인간 각질 세포(HaCaT)를 DMEM 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, 웰진, 한국)에 10％(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37℃, 5％(v/v) CO2의 조건하에서 배양하였다. 아토피 피부염 유사 세포 모델을 만들기 위해 IL-4 10 ng/mL과 IL-13 10 ng/mL 을 처리하여 24시간 배양하였다.
실시예 4-2: MTT (MTT assay)으로 각질 세포주에서 세포 생존율 분석
실시예 4-1에서의 실험 조건으로 96웰에 사람 유래 각질 세포주를 6x103으로 씨딩하고, 24시간 배양한 후, 표 5의 구조로 제조된 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 이용하여 처리된 세포주에 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) 용액을 1X PBS에 5 mg/mL 농도로 제조하고 well당 20 μL로 처리하여 4시간 배양 후 OD (optical density)를 spectrophotometer로 측정하여 분석하였다.
본 실시예에서 사용한 핵산 복합체 조합은 하기 표 7과 같다.
Figure PCTKR2019013970-appb-T000007
그 결과, 도 4a 내지 4b에 나타낸 바와 같이, IL-4 또는 IL-13로 유도된 아토피 피부염 유사 세포 모델에서 핵산 복합체에 의해 세포 생존율이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 4-3: 웨스턴 블랏 분석(Western blot assay)으로 유전자 발현의 분석
사람 유래 각질 세포주를 6웰 플레이트에 1x105으로 세포를 씨딩하고 24시간 배양 후 실시예 4-1의 조건으로 실험을 진행하여 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 처리하고 24, 48, 72시간 배양한 후, RIPA buffer를 각 웰에 30 μL씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30 μg을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 IL-4Rα (SantaCruz Biotech., 미국), p-JAK3 (Cell signaling Technology, 미국), p-stat6 (Cell signaling Technology, 미국)를 1:1000으로 처리하고 4 ℃에서 하루 동안 방치하였다. 1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit, Goat Anti-mouse (SantaCruz Biotech., 미국)를 1:2000으로 처리하여 상온에서 2시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 각질 세포주에서 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
IL-4 및 IL-13을 이용한 아토피 피부염 유사 세포 모델에서의 IL-4Rα 및 하위단계 유전자 발현 변화를 분석하였으며, 사용한 핵산 복합체 조합은 하기 표 8과 같다.
Figure PCTKR2019013970-appb-T000008
그 결과, 도 5a 내지 5b에서 나타난 바와 같이, 서열번호 4와 서열번호 15 및 서열번호 4와 서열번호 16의 핵산복합체 조합이 아토피 피부염 유사 세포 모델에서의 IL-4Rα 및 하위 단계 유전자 발현을 억제하였다.
실시예 5: 피부 투과성 핵산 복합체를 이용한 CD4 positive T lymphocyte의 T helper type 2 분화 억제 효과 분석
실시예 1에 따라, 하기 표 5의 구조로 제조된 IL-4Rα를 표적 유전자로 하는 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 피부 투과성 핵산 복합체를 이용하여 T helper cell 분화 억제 효과를 분석하였다.
실시예 5-1: 세포 배양
ATCC(American Type Culture Collection, 미국)로부터 입수한 순수 T 세포 (Jurkat, CD4+ naive T cell)를 RPMI-1640 배양배지(ATCC, 미국)에 10％(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37℃5％(v/v) CO2의 조건하에서 배양하였다. T helper type 2로 분화시키기 위해 IL-4 10 ng/mL (도 6a)과 IL-4 10 ng/mL + PMA (Phorbol-12-myristate-13-acetate) + Ionomycin (도 6b)을 처리하여 24, 48, 72시간 배양하였다.
실시예 5-2: 웨스턴 블랏 분석(Western blot assay)으로 유전자 발현의 분석
순수 T 세포 (Jurkat, CD4+ naive T cell)를 6웰 플레이트에 2x105으로 세포를 씨딩하고 24시간 배양 후 실시예 5-1의 조건으로 실험을 진행하여 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 처리하고 24, 48, 72시간 배양한 후, RIPA buffer를 각 웰에 30 μL씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30 μg을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 IL-4Rα (SantaCruz Biotech., 미국), p-stat6 (Cell signaling Technology, 미국)를 1:1000으로 처리하고 4 ℃에서 하루 동안 방치하였다. 1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit, Goat Anti-mouse (SantaCruz Biotech., 미국)를 1:2000으로 처리하여 상온에서 2시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 각질 세포주에서 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
IL-4 및 IL-4 + PMA을 이용한 T helper type2 분화 모델에서의 IL-4Rα 및 하위단계 유전자 발현 변화를 분석하였으며, 사용한 핵산 복합체 조합은 하기 표 8과 동일하다.
그 결과, 도 6a 내지 6b에서 나타난 바와 같이, 서열번호 4와 서열번호 15의 핵산복합체 조합이 아토피 피부염 유사 세포 모델에서의 IL-4Rα 및 하위 단계 유전자 발현을 가장 효율적으로 억제하였다.
실시예 6: 피부 투과성 핵산 복합체를 이용한 DNCB (2-Dinitrocholrobenzene) 유도 아토피 피부염 동물 모델에서의 아토피 피부염 치료 효과 분석
실시예 6-1: DNCB (2-Dinitrochlorobenzene)를 이용한 아토피 피부염 유도 동물 모델에서의 아토피 피부염 표현형 효과 분석
NC/Nga 마우스를 일주일동안 순화시킨 후에 등을 제모하고 1% DNCB 용액 (Acetone : Olive oil = 2:1)을 도포하여 첫번째 아토피 피부염 유도를 수행하고, 그 후 지속적으로 0.4% DNCB 용액을 일주일에 2번씩 총 4주 동안 도포하여 아토피 피부염 유발 동물 모델을 구축하였다. 일주일에 총 2번씩 2주 동안 크림 제형의 핵산 복합체를 처리하고 교차로 0.4% DNCB 용액을 도포하여 아토피 피부염 유발 동물 모델을 유지하였으며, 크림 제형의 핵산 복합체 처리가 완료된 시점에 아토피 피부염 동물 모델 표현형을 사진으로 분석하였다.
본 실시예에서는 실시예 4와 5를 통하여 효과가 검증된 핵산 복합체를 선별하여 DNCB를 이용한 아토피 피부염 유발 동물 모델에서의 표현형 및 조직학적 소견, IL-4Rα 표적 유전자 발현 변화를 분석하였으며, 사용한 핵산 복합체 조합은 하기 표 9와 같다.
Figure PCTKR2019013970-appb-T000009
그 결과, 아토피 피부염 표현형이 핵산 복합체 그룹에서 감소하는 것을 확인하였다 (도 7a).
실시예 6-2: 웨스턴 블랏 분석(Western blot assay)으로 유전자 발현의 분석
실시예 6-1의 조건으로 실험을 진행하여 생검한 마우스 등 조직의 일부를 RIPA buffer를 각 웰에 200 μL씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30 μg을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 IL-4Rα (SantaCruz Biotech., 미국) 를 1:1000으로 처리하고 4 ℃에서 하루 동안 방치하였다. 1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit, Goat Anti-mouse (SantaCruz Biotech., 미국)를 1:2000으로 처리하여 상온에서 2시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 마우스 등 조직에서 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
도 7b와 같이, 핵산 복합체를 처리한 그룹의 피부 조직에서 IL-4Rα의 발현이 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 6-3: 혈청 내 IgE, TARC 및 IL-4 농도 변화 분석
실시예 6-1의 조건으로 진행한 동물 실험에서 최종 실험 종료일에 마우스 혈액을 안와 채혈을 통해 수집하고 상온에서 2시간 이상 방치하여 원심분리기 (14,000 rpm, 15 min)를 이용하여 혈청을 수집하였다. 수집한 혈청을 IgE와 IL-4 ELISA kit (고마바이오텍, 대한민국) 및 TARC ELISA kit (R&D system, 미국)에서 제공하는 실험방법을 이용하여 혈청 내 IgE, TARC 및 IL-4의 농도를 측정하였다.
그 결과, 도 8a에 나타낸 바와 같이, 아토피 피부염을 유도한 대조군 대비 핵산 복합체를 처리한 그룹에서 IgE, TARC 및 IL-4의 농도가 음성 대조군과 비슷한 수준으로 감소한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6-4: 동물 행동 분석을 통한 아토피 피부염 유도 동물 모델에서의 소양증 및 홍반 개선 효과 분석
실시예 6-1의 조건으로 진행한 동물 실험에서 아토피 피부염 유발 시 나타나는 대표적인 증상인 소양증의 개선 효과를 확인하기 위해 아토피 피부염 유발 후 첫 주에 그룹간 생쥐의 행동 평가를 수행하고, 핵산 복합체를 투여한 마지막 주에 그룹간 생쥐의 행동 평가를 수행하여 소양증의 개선 효과를 확인하였다. 또한 아토피 피부염 유발 시에 피부에 나타나는 홍반 증상이 개선되는 여부를 확인하기 위해 아토피 피부염을 유도하는 기간에 홍반 증상 발현 여부를 관찰하고 아토피 피부염 유도 완료 시점과 핵산 복합체 투여 완료 시점에 홍반 증상의 개선 효과를 확인하였다.
그 결과, 도 8b에 나타낸 바와 같이, 아토피 피부염을 유도한 대조군 대비 핵산 복합체를 처리한 그룹에서 소양증 및 홍반 증상이 눈에 띄게 개선되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6-5: H&E 염색으로 아토피 피부염 유도 동물 모델에서의 표현형 분석
실시예 6-1의 조건으로 실험을 진행하여 최종 실험 종료일에 마우스 등 조직을 생검하여 4% 포르말린 용액에 하루 동안 고정하고 고정한 조직을 파라핀 포매하여 조직을 5 μm로 섹션하여 슬라이드 글라스에 마운팅하였다. 마운팅한 조직을 Hematoxylin:Eoin 염색 용액에 일정 시간 동안 염색하고 1X PBS로 수세한 후 현미경으로 분석하였다.
그 결과, 도 9a에서와 같이 아토피 피부염을 유도한 대조군 대비 핵산 복합체를 처리한 그룹에서 경피 조직의 두께 및 염증성 세포들이 감소한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6-6: 면역염색으로 아토피 피부염 유도 동물 모델에서의 조직 내 염증성 마커 분석
실시예 6-1의 조건으로 실험을 진행하여 최종 실험 종료일에 마우스 등 조직을 생검하여 4% 포르말린 용액에 하루 동안 고정하고 고정한 조직을 파라핀 포매하여 5 μm로 섹션하여 슬라이드 글라스에 마운팅하였다. 마운팅한 조직을 0.5% BSA 용액에 1시간 동안 블라킹하고, CD3, CD11c 1차 항체 용액을 처리하여 하루 동안 처리하였다. 이어서 1차 항체 용액을 제거하고 1X PBS로 씻어낸 후 2차 항체 용액을 처리하여 상온에서 2시간 처리하여 DAB 염색을 통해 분석하였다.
그 결과, 도 9b에 나타낸 바와 같이, 조직 내 염증성 마커인 CD3와 CD11c가 아토피 피부염을 유도한 대조군에 비해 핵산복합체 그룹에서 감소하는 것을 확인하였으며, 이를 수치화하여 비교하였을 때에도 감소하는 것을 확인하였다.
본 발명에 따른 TLR2 또는 IL-4Rα을 표적하는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 상보적으로 결합된 피부 투과성 핵산 복합체는 피부 투과성 및 피부 잔류성이 높아 아토피성 피부염과 같은 피부질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용하다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (20)

  1. TLR2 또는 IL-4Rα 유전자와 결합할 수 있는 서열을 가지는 생활성 핵산 (Bioactive Nucleic Acid); 및 캐리어 펩티드 핵산 (Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 피부 투과성 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 피부질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물 또는 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생활성 핵산은 서열번호 1 내지 4로 구성된 군에서 선택되는 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 5 내지 18로 구성된 군에서 선택되는 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 TLR2 유전자와 결합할 수 있는 생활성 핵산은 서열번호 2의 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 IL-4Rα 유전자와 결합할 수 있는 생활성 핵산은 서열번호 4의 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 핵산 복합체는 서열번호 2 또는 4의 서열로 표시되는 생활성 핵산; 및 서열번호 5 내지 18로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열로 표시되는 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 TLR2 또는 IL-4Rα 유전자와 결합할 수 있는 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력(융해온도, melting temperature, Tm)은 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 TLR2 또는 IL-4Rα 유전자와의 결합력보다 낮은 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 생활성 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산은 각각의 핵산의 5'-말단 또는 3'-말단에 엔도좀 탈출을 도와주는 물질이 추가로 결합된 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 엔도좀 탈출을 도와주는 물질은 펩티드, 지질 나노물질(lipid nanoparticles), 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles), 고분자 나노구(polymer nanospheres), 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles), 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles), 양이온 고분자(cationic polymer) 및 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 펩티드는 GLFDIIKKIAESF(서열번호 19) 또는 Histidine(10)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 생활성 핵산은 전체적으로 음전하 또는 중성을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 양전하를 가지도록 1개 이상의 gamma- 또는 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 gamma- 혹은 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 아미노산을 가지는 단량체가 음전하를 가지는 아미노산을 가지는 단량체에 비해 더 많이 포함되어 전체적인 캐리어 펩티드 핵산의 전하가 양성이 되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 양전하를 가지는 아미노산은 리신(Lysine, Lys, K), 아르기닌(Arginine, Arg, R), 히스티딘(Histidine, His, H), 디아미노 부티르산(Diamino butyric acid, DAB), 오르니틴(Ornithine, Orn) 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 음전하를 가지는 아미노산은 글루타민산(Glutamic acid, Glu, E), 아스파트산(Aspartic acid, Asp, D) 또는 아미노산 유사체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 핵산 복합체는 전체적으로 양전하를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 상기 핵산 복합체는 피부 잔류성을 갖는 피부 투과성인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 상기 피부질환은 아토피 피부염, 건선, 피부암, 피부 손상, 색소침착 및 켈로이드성 질환으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제1항에 따른 조성물을 포함하는 제형.
  20. 제19항에 있어서, 제형은 수성액, 겔, 연고, 크림, 로션, 페이스트, 도말제, 패치에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 제형.
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