WO2023277584A1 - 셀레늄 화합물을 유효성분으로 포함하는 노화세포 제거용 조성물 - Google Patents

셀레늄 화합물을 유효성분으로 포함하는 노화세포 제거용 조성물 Download PDF

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WO2023277584A1
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senescent cells
disorders
diseases
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김태국
장형주
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(주)라이프신약
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    • C07D293/00—Heterocyclic compounds containing rings having nitrogen and selenium or nitrogen and tellurium, with or without oxygen or sulfur atoms, as the ring hetero atoms
    • C07D293/02—Heterocyclic compounds containing rings having nitrogen and selenium or nitrogen and tellurium, with or without oxygen or sulfur atoms, as the ring hetero atoms not condensed with other rings
    • C07D293/04—Five-membered rings

Definitions

  • the present invention relates to a composition for removing senescent cells comprising a selenium compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Aging refers to a process in which a human being is born, grows for a certain period of time, and gradually declines physically and cognitively as he gets older, leading to death.
  • WHO World Health Organization
  • M2A disease code
  • telomeres As people age, aging progresses in the human body due to internal factors such as a decrease in telomeres and an increase in active oxygen, and as a result, various 'aging-associated diseases & disabilities/disorders' occur.
  • SASP senescence-associated secretory phenotype
  • senescent cells are removed by the body's immune cells, but because immune cells age together with age, they fail to function properly, and eventually senescent cells accumulate in the human body.
  • This cellular aging phenomenon occurs in all cells constituting the human body, and is observed not only in general somatic cells such as immune cells, but also in stem cells and various disease cells such as cancer. When aging progresses in stem cells, organs and tissues cannot be regenerated and maintained, and when aging progresses in diseased cells, diseases are further aggravated.
  • selenium is an essential inorganic element present in trace amounts in the body and is a component of protein that has an antioxidant action. It is known that synthesized compounds including selenium, which is a natural element, have an activity to remove senescent cells, apart from the natural action of selenium, which protects cells and plays an important role in cell survival and maintenance. does not exist.
  • Non-Patent Document 1 Robbins PD et al., Annuual Review of Pharmacological Toxicology 61, 779-803, 2021.
  • the inventors of the present invention completed the present invention by confirming that selenium compounds remove various types of senescent cells with high efficiency as a result of research to develop safe and effective drugs capable of removing senescent cells.
  • one aspect of the present invention provides a composition for removing senescent cells, comprising the selenium compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • composition for removing senescent cells according to the present invention significantly reduces the survival rate of not only naturally senescent cells but also various senescent cells artificially induced by various factors over time, thereby reducing various aging-related pathological diseases secreted from these senescent cells. Expression and secretion of phosphorus factors can be fundamentally blocked and inhibited. Therefore, the composition for removing senescent cells according to the present invention can be usefully used for suppression and treatment of aging-related diseases and disorders. Furthermore, the composition for removing senescent cells according to the present invention can be usefully used in pharmaceuticals, cosmetics, health functional foods, animal products, etc. in relation to aging-related diseases and disorders related to senescent cells.
  • Fig. 2 is a photograph of adipose tissue staining in naturally aged mice without and with LX-112 treatment.
  • Figure 3 is a photograph of staining of adipose tissue in mice treated with and without LX-112 senescence induced by doxorubicin (DOX) treatment.
  • halogen means F, Cl, Br or I unless otherwise specified.
  • alkyl means a linear or branched, saturated hydrocarbon moiety.
  • C 1-6 alkyl means an alkyl having a backbone of 1 to 6 carbons. Specifically, C 1-6 alkyl is methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, i-butyl, t-butyl, n-pentyl, i-pentyl, t-pentyl, sec-pentyl, neopentyl , hexyl.
  • haloalkyl as used herein means an alkyl substituted with one or more halogens. Specifically, haloalkyl may be an alkyl substituted with two or more halogens of the same kind or two or more halogens.
  • alkoxy refers to a group having the formula -O-alkyl, wherein the alkyl group as defined above is attached to the parent compound through an oxygen atom.
  • the alkyl portion of an alkoxy group is 1 to 20 carbon atoms (ie C 1 -C 20 alkoxy), 1 to 12 carbon atoms (ie C 1 -C 12 alkoxy), or 1 to 6 carbon atoms (ie C 1 -C 20 alkoxy). C 1 -C 6 alkoxy).
  • alkoxy groups are methoxy (-O-CH 3 or -OMe), ethoxy (-OCH 2 CH 3 or -OEt), t-butoxy (-OC(CH 3 ) 3 or -O-tBu). etc.
  • alkenyl refers to a linear or branched hydrocarbon moiety containing one or more double bonds.
  • C 2-6 alkenyl refers to an alkenyl group having a backbone of 2 to 6 carbon atoms.
  • C 2-6 alkenyl may include ethenyl, n-propenyl, isopropenyl, n-butenyl, isobutenyl, octenyl, decenyl, tetradecenyl, hexadecenyl, and the like. there is.
  • alkynyl refers to a linear or branched hydrocarbon moiety containing one or more triple bonds.
  • C 2-6 alkynyl refers to an alkenyl group having a backbone of 2 to 6 carbon atoms. Specifically, it may include ethynyl, n-propynyl, and the like.
  • aryl refers to an aromatic hydrocarbon radical derived by the removal of one hydrogen atom from six carbon atoms of a parent aromatic ring system.
  • an aryl group can have 6 to 20 carbon atoms, 6 to 14 carbon atoms, or 6 to 12 carbon atoms.
  • An aryl group can be a phenyl.
  • heteroaryl refers to an aromatic heterocyclyl having one or more heteroatoms in the ring.
  • Non-limiting examples of heteroaryl include pyridinyl, pyrrolyl, oxazolyl, indolyl, isoindolyl, purinyl, furanyl, thienyl, benzofuranyl, benzothiophenyl, carbazolyl, imidazolyl, thiazolyl , isoxazolyl, pyrazolyl, isothiazolyl, quinolyl, isoquinolyl, pyridazyl, pyrimidyl, pyrazyl (which may have one or more substituents on the ring), and the like.
  • cycloalkyl refers to a saturated mono- or poly-cycle containing only carbon atoms in the ring.
  • “3- to 9-membered cycloalkyl” means a cyclic hydrocarbon moiety containing from 3 to 9 carbon atoms.
  • Cycloalkyls can have 3 to 7 carbon atoms as monocycles and 7 to 9 carbon atoms as bicyclic cycloalkyls.
  • heterocycloalkyl refers to a non-aromatic heterocyclyl having one or more heteroatoms in the ring.
  • Heterocycloalkyls can have one or more carbon-carbon double bonds or carbon-heteroatom double bonds in the ring to the extent that the ring is not aromatic due to the presence of the double bond.
  • heterocycloalkyl examples include azetidinyl, aziridinyl, pyrrolidinyl, piperidinyl, piperazinyl, homopiperazinyl, morpholino, thiomorpholino, tetrahydrofuranyl, tetrahydrothio There are furanyl, tetrahydropyranyl, and pyranyl.
  • heteroatom means an atom other than carbon (C), and may specifically be a selenium (Se), nitrogen (N), oxygen (O), or sulfur (S) atom.
  • One aspect of the present invention provides a composition for removing senescent cells, comprising a selenium compound represented by Formula 1 below or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • R is a single bond, -(CH 2 ) n -, or -(CH 2 ) p -X-(CH 2 ) q -; n is an integer from 1 to 10; p and q are each independently an integer from 1 to 5; X is -S-, -Se- or phenylene; A is a group represented by Formula 2 below, or phenyl, amine or amide;
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5, R 6 , R 7 and R 8 are each independently H, halogen, C 1-6 alkyl, haloC 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy; carboxy, amine, or nitro.
  • the amine and amide are each C 1-10 alkyl, C 2-10 alkenyl, C 2-10 alkynyl, 3-10 membered cycloalkyl, C 6-10 aryl, 3-10 membered heterocycloalkyl, or It may be a 5-10 membered heteroaryl substituted or unsubstituted group.
  • the selenium compound according to the present invention is a compound represented by Formula 3 below.
  • R is -(CH 2 ) n - or -(CH 2 ) p -X-(CH 2 ) q -; n is an integer from 1 to 10; p and q are each independently an integer from 1 to 5; X is -S-, -Se- or phenylene; R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5, R 6 , R 7 and R 8 are each independently H, halogen, C 1-6 alkyl, haloC 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy; carboxy, amine, or nitro.
  • the selenium compound according to the present invention is a compound represented by Formula 4 below.
  • R is -(CH 2 ) n - or -(CH 2 ) p -X-(CH 2 ) q -; n is an integer from 1 to 10; p and q are each independently an integer from 1 to 5; X is -S-, -Se- or phenylene.
  • the selenium compound according to the present invention is a compound represented by Formula 5 or 6 below.
  • n is an integer from 1 to 8; p and q are each independently an integer from 1 to 4; X is -S-, -Se- or phenylene.
  • the selenium compound according to the present invention is a compound represented by any one of Formulas 7 to 13 below.
  • the compound of Chemical Formula 7 is a type of selenium compound generally called ethaselen, and is referred to as LX-112 in the present specification.
  • the compound represented by Chemical Formula 8 is a type of selenium compound generally called propylselen.
  • the compound of Chemical Formula 9 is a type of selenium compound generally called butaselen, and is referred to as LX-114 in the present specification.
  • the compound of Chemical Formula 10 is a type of selenium compound generally called butathiobiselen, and is referred to as LX-115 in the present specification.
  • the compound of Formula 11 is a kind of selenium compound generally called butaselenobiselen, and is referred to as LX-116 in the present specification.
  • the compound of Chemical Formula 12 is a type of selenium compound generally called hexaselen, and is referred to as LX-117 in the present specification.
  • the compound of Chemical Formula 13 is a type of selenium compound generally called ebselen, PZ51, DR3305, or SPI-1005, and is referred to as LX-128 in the present specification.
  • the compound represented by Formula 1 and pharmaceutically acceptable salts thereof can selectively kill senescent cells.
  • the aging may be any one selected from the group consisting of natural aging over time, aging due to stress caused by anticancer agents, and aging due to stress caused by obesity. That is, the senescent cells may be related to any one selected from the group consisting of natural aging over time, aging due to stress caused by anticancer drugs, and aging due to stress caused by obesity.
  • the senescent cells may be any one selected from the group consisting of somatic cells, stem cells, and cells abnormally changed due to diseases.
  • the senescent cells may be cells of organ tissues derived from liver, kidney, spleen, brain, lung, muscle, skin, fat, and the like.
  • the disease may be selected from the group consisting of inflammation, fibrosis, and cancer.
  • the senescent cells may exhibit any one or more of the following characteristics.
  • Nuclear structural proteins such as Lamin B1 and chromatin binding proteins such as HMGB1 are reduced.
  • SA- ⁇ -gal ⁇ -galactosidase
  • Lipofuscin is produced as a degenerative abnormal complex of proteins and lipids according to aging.
  • CDK cyclin-dependent kinase inhibitory factors
  • p16 and p21 are activated and highly expressed.
  • signal transduction systems such as p53 according to DDR (DNA damage response) are activated, and the expression of related target genes is regulated accordingly.
  • senescence-associated markers may include SA- ⁇ -gal, lipofuscin, p16, p21, p53, etc., along with cell division and growth arrest as common characteristics of senescent cells ( See https://doi.org/10.1016/j.tcb.2018.02.001).
  • composition for removing senescent cells according to the present invention when the composition for removing senescent cells according to the present invention is treated with artificially senescent cells and naturally senescent cells through continuous subculture, senescent cells can be effectively removed. .
  • the composition for removing senescent cells according to the present invention is applied to naturally aged mice or mice or tumors artificially induced by aging due to stress such as anticancer drugs, fibrosis inducing drugs, and obesity, respectively.
  • stress such as anticancer drugs, fibrosis inducing drugs, and obesity, respectively.
  • senescent cells can be effectively removed from various organ tissues.
  • composition for removing senescent cells according to the present invention can be used to suppress the expression and secretion of aging-related markers, aging-accelerating factors, or aging-related secreted factors (SASPs). Since these factors are expressed and secreted in senescent cells, the expression and secretion of the factors may be fundamentally blocked as senescent cells are removed.
  • SASPs aging-related secreted factors
  • the aging-related marker is any one selected from the group containing various factors (https://doi.org/10.1016/j.tcb.2018.02.001) including p16, p21, SA- ⁇ -gal, lipofuscin, and the like. It can be one or more arguments.
  • the aging-related secreted factor includes various aging-related pathological factors such as aging-related inflammation and fibrosis, IL1 ⁇ , IL1 ⁇ , IL6, IL10, MCP1, PAI1 VCAM1, MMP1, MMP2, MMP3, MMP12, MMP13, GM-CSF, GRO ⁇ , GRO ⁇ , GRO ⁇ , IGFBP7, IL7, IL8, MIP1 ⁇ , ENA78, GCP2, GITR, HGF, ICAM1, IGFBP2, IGFBP4, IGFBP5, IGFBP6, IL13, MCP4, MIF, MIP3 ⁇ , MMP14, NAP2, PIGF, RANTES, sgp130, TIMP2, TRAILR3, Acrp30, Axl, bFGF, BLC, BTC, CTACK, EGFR, Fas, FGF7, GCSF, GDNF, HCC4, I309, IFN ⁇ , IGFBP1, IGFBP3, IL11,
  • the composition for removing senescent cells according to the present invention by using the composition for removing senescent cells according to the present invention, the expression and secretion of various aging-related pathological factors (SASP) from senescent cells are removed in advance to effectively treat various aging-related diseases and disorders. suppression and treatment.
  • SASP aging-related pathological factors
  • the composition for removing senescent cells according to the present invention can be used for suppression and treatment of aging-related diseases and disorders. That is, the present invention provides a use of the selenium compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the inhibition and treatment of aging-related diseases and disorders. In addition, the present invention provides a use of the selenium compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the manufacture of a pharmaceutical for the inhibition and treatment of aging-related diseases and disorders. In addition, the present invention provides a method for inhibiting and treating aging-related diseases and disorders, comprising administering the selenium compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject in need thereof. In addition, the present invention provides a method for removing senescent cells comprising the step of treating senescent cells with the selenium compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the aging-related diseases and disorders include proliferative diseases and disorders, inflammatory or autoimmune diseases and disorders, neurological diseases and disorders, metabolic diseases and disorders, cardiovascular diseases and disorders, lung diseases and disorders, kidney diseases and disorders, Liver diseases and disorders, ocular diseases and disorders, skin diseases and disorders, stem cell or organ tissue regeneration maintenance-related diseases and disorders, foreign transplant-related diseases and disorders, fibrosis diseases and disorders, sclerosis diseases and disorders, ⁇ -galacto It may be any one or more selected from the group consisting of sidase-related diseases and disorders, other geriatric diseases and disorders, side effects and sequelae caused by stress, and aging-related diseases and disorders resulting therefrom.
  • the above aging-related diseases and disorders are associated with senescent cells, inflammation, fibrosis, sclerosis, cancer, anticancer drugs, or side effects and sequelae caused by stress caused by obesity, frailty, sarcopenia, lipoatrophy, liver and kidney damage, or skin aging and related thereto. diseases and disorders.
  • the side effects and aftereffects caused by stress caused by anticancer drugs or obesity related to the senescent cells may be fatigue and weakness, weight loss, anxiety and depression, lethargy, or fatty liver.
  • the inflammation is aging inflammation (inflamm-aging, immuno-senescence, senescence-associated inflammation) caused by senescent cells, which is observed in the elderly due to chronic and progressive chronic and degenerative inflammation or infection such as viruses.
  • the fibrosis and sclerosis include liver, lung, or kidney-related diseases, and the cancer is aged through prosenescence anti-cancer therapy. It is suppressed and treated by removing cancer cells, and includes cancer, early cancer, prevention, recurrence, metastasis, resistance, malignancy or sequelae of cancer, and the skin aging and diseases and disorders related thereto include wrinkles, loss of elasticity, hair loss, and fur deterioration. , melasma, blemishes, birthmarks, birthmarks, spots, pigmentation, warts, hives, exacerbated pores, or impaired wound healing.
  • frailty is, for example, a specific disease recently assigned the R54 code, and is senile fatigue, weakness, asthenia, inactivity, and muscle weakness that occur with or without cognition and memory impairment according to aging. , gait disturbance, etc. Frailty can be analyzed by known symptom indicators (https://en.wikipedia.org/wiki/Frailty_syndrome).
  • Proliferative diseases such as cancer, pre-cancerous/pre-malignant condition, cancer prevention, cancer relapse, cancer metastasis, cancer resistance, cancer malignancy, and various hyperplastic diseases and disability; arthritis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, degenerative articular cartilage, inflammatory bowel disease, ulcerative colitis, Crohn's disease, mucositis, oral mucositis, chronic pancreatitis, tendinopathy, tendinosis, tendinitis, inflammation-aging, hyperinflammation ( inflammatory or autoimmune diseases and disorders, such as amplified hyperinflammation), coronavirus infection/complication (COVID19 infection/complication); Memory decline, (mild) cognitive decline dysfunction, degenerative brain disease, dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis ), amyotrophic lateral sclerosis, primary lateral sclerosis, motor neuron disease, progressive supranuclear palsy, progressive
  • Transplantation diseases and disorders of stem cells/bone marrow/organs/tissues/cells such as graft-versus-host reaction or disease, corneal allograft rejection, transplant rejection, etc.
  • Foreign substances Immunomodulatory diseases and disorders such as /material transplantation diseases and disorders, inflammation, and foreign transplant-related diseases and disorders such as damage and functional decline of various organs/tissues; idiopathic pulmonary fibrosis, cystic fibrosis, pulmonary fibrosis, renal fibrosis, tubulointerstitial fibrosis, liver fibrosis ), cardiac fibrosis, pancreatic fibrosis, uterine fibrosis, oral submucosal fibrosis, muscle fibrosis, glial fibrosis, postperitoneal fibrosis, myelofibrosis, fibrotic diseases and disorders such as mediastinal fibrosis, keloids, and fibrodysplasia ossificans progressiva; scler
  • composition for removing senescent cells of the present invention may also contain a pharmaceutically acceptable salt of the selenium compound represented by Chemical Formula 1 as an active ingredient.
  • the pharmaceutically acceptable salt should have low toxicity to humans and should not have any adverse effect on the biological activity and physicochemical properties of the parent compound.
  • the pharmaceutically acceptable salt may be an acid addition salt formed with a pharmaceutically acceptable free acid.
  • An inorganic acid or an organic acid may be used as the free acid.
  • the inorganic acid may be hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, perchloric acid, bromic acid, etc.
  • the organic acid may be acetic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, p-toluene sul phonic acid, fumaric acid, maleic acid, malonic acid, phthalic acid, succinic acid, lactic acid, citric acid, gluconic acid, tartaric acid, salicylic acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, embonic acid, aspartic acid, glutamic acid, and the like.
  • the acid addition salt is prepared by a conventional method, for example, by dissolving the compound of Formula 1 in an excess aqueous acid solution and precipitating the salt using a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile It can be.
  • the pharmaceutically acceptable salt may be an alkali metal salt (sodium salt, etc.) or an alkaline earth metal salt (potassium salt, etc.).
  • the alkali metal salt or alkaline earth metal salt may be obtained, for example, by dissolving the compound of Formula 1 in an excess alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the undissolved compound salt, and then evaporating and drying the filtrate. .
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting and treating aging-related diseases and disorders, comprising the selenium compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are those commonly used in preparation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, silicic acid Calcium, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, saline, phosphate buffered saline (PBS) ) Or media, nanocapsules, nanospheres, nanogels, hydrogels, mesoporous silica, liposomes, exosomes, cyclodextrins, micelles (PLA / PLGA / PCL / PEG / SOL (Soluplus), etc.), including Including, but not limited to,
  • the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable additive, and the additive may be, for example, a pH adjusting agent, an isotonizing agent, a preservative, and other excipients.
  • a pharmaceutically acceptable additive may be, for example, a pH adjusting agent, an isotonizing agent, a preservative, and other excipients.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition may vary depending on the method of use, but may be prepared as a warning agent, granule, powder, syrup, liquid, fluid extract, emulsion, suspension, precipitate, tablet, injection, capsule, pill, and the like.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition includes ointments, pastes, creams, lotions, gels, powders, solutions, sprays, inhalants or patches for topical or transdermal administration.
  • the pharmaceutical composition may be aseptically mixed with a pharmaceutically acceptable carrier and, if necessary, a preservative or buffer.
  • Ointments, pastes, creams and gel formulations according to the present invention additionally contain animal and vegetable fats, oils, waxes, paraffins, starches, toragacanthos, cellulose derivatives, polyethylene glycols, silicones, bentonites, etc. as excipients, as well as silicic acid, talc, zinc oxide, or mixtures thereof.
  • the term “inhibition” refers to any action (prevent, inhibit or delay) that prevents or blocks, suppresses, or delays the progression of aging-related diseases and disorders by administration of the composition according to the present invention. "” refers to all activities (alleviate, reverse or treat) in which symptoms of aging-related diseases and disorders are improved, ameliorated, or changed beneficially by administration of the composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a patient in a therapeutically effective amount or a pharmaceutically effective amount.
  • terapéuticaally effective amount or “pharmaceutically effective amount” is an amount of a compound or composition effective for preventing or treating a target disease, sufficient to treat the disease with a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment It means an amount that does not cause side effects.
  • the "effective amount” refers to an amount sufficient to inhibit or reduce the activity of senescent cells in aging-related diseases either in vitro or in vivo.
  • the level of the effective amount is the patient's state of health, type of disease, severity, activity of the drug, sensitivity to the drug, method of administration, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, factors including drugs used in combination or concurrently, and It may be determined according to other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered by any suitable route, in the form of a pharmaceutical composition suitable for such route, and in a dosage effective for the intended treatment.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or in multiple doses. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the composition for removing senescent cells according to the present invention may be for removing senescent cells in vitro, and accordingly, the present invention provides a composition for removing senescent cells in vitro.
  • composition for removing aging cells according to the present invention can be used as a cosmetic composition for skin regeneration, and thus the present invention provides a cosmetic composition for skin regeneration.
  • SASP SASP
  • aging cells secrete various factors (SASP) to gradually spread and accumulate aging cells, resulting in various aging symptoms (skin aging, wrinkles, loss of elasticity, hair loss, fur deterioration, melasma, blemishes, birthmarks, spots, Pigmentation, pigmentation, warts, moles, exacerbated pores, poor wound healing, psoriasis, herpes, pruritus, sensory disturbance, immunosuppression, eczema, rash, dermatitis, eosinophilic dermatosis, immune bullous dermatosis, polio, pemphigus, pemphigoid , lupus, blisters, fibrosis, keloids, dermal fibrous histiocytosis, atopic dermatitis, cutaneous lymphoma, cutaneous lupus, photosensitivity and photoaging-related diseases and disorders, various skin diseases, etc.).
  • SASP skin aging, wrinkles, loss
  • the cosmetic composition of the present invention inhibits skin aging, wrinkles, loss of elasticity, hair loss, deterioration of fur, melasma, blemishes, birthmarks, spots, spots, pigmentation, warts, hives, deterioration of pores or poor wound healing, can be improved or reproduced.
  • composition for removing senescent cells according to the present invention as a cosmetic composition, it can be formulated into a formulation commonly prepared in the art, if necessary.
  • the cosmetic composition may be formulated into, for example, solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, soaps, surfactant-containing cleansing, oils, powder foundations, emulsion foundations, wax foundations and sprays. It may, but is not limited thereto. Specifically, it may be formulated into a formulation of softening lotion, nutrient lotion, nutrient cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, spray or powder.
  • the formulation of the cosmetic composition is a paste, cream or gel, animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tragacanth, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc, zinc oxide and mixtures thereof It may include a carrier component selected from the group consisting of.
  • the formulation of the cosmetic composition when it is a solution or emulsion, it may include a carrier component selected from the group consisting of a solvent, a solvating agent, an emulsifying agent, and mixtures thereof.
  • a carrier component selected from the group consisting of a solvent, a solvating agent, an emulsifying agent, and mixtures thereof. Examples thereof include water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3-butyl glycol oil, glycerol aliphatic esters, polyethylene glycol, sorbitan fatty acid esters, and mixtures thereof. can be heard
  • the formulation of the cosmetic composition is a suspension
  • a liquid diluent such as water, ethanol or propylene glycol, an ethoxylated isostearyl alcohol, a suspending agent such as polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, microcrystals and a carrier component selected from the group consisting of cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar, tragacanth, and mixtures thereof.
  • the carrier component may be included in about 1 to about 99.99% by weight, preferably about 80% to about 90% by weight based on the total weight of the cosmetic composition.
  • the cosmetic composition may be an external preparation for skin such as an ointment, a liquid, a cream, a spray, or a patch.
  • the cosmetic composition may be applied directly to the skin or sprayed according to the formulation. At this time, the application amount and the number of times of daily use of the cosmetic composition may be appropriately set according to the user's age, gender, use, skin condition, and the like.
  • composition for removing senescent cells according to the present invention can be used as a health functional food. Accordingly, the present invention provides a health functional food composition for improving aging-related diseases and disorders, comprising the selenium compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Types of the health functional food may be various foods, beverages, gums, vitamin complexes, health supplements, and the like.
  • the health functional food may be in the form of powder, granule, tablet, capsule or beverage, and may further include other natural or synthetic materials and additives for commercialization to improve and promote health functions.
  • the liquid component included in the health drink is not limited as long as the efficacy of the composition for removing aging cells is not inhibited, and various flavors or natural carbohydrates may be included as additional components like conventional drinks.
  • the natural carbohydrates include, for example, monosaccharides such as disaccharides such as glucose and fructose; polysaccharides such as maltose and sucrose; sugars such as dextrins and cyclodextrins; and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • flavoring agents natural flavoring agents (thaumatin, stevia extract (eg, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) may be used.
  • natural flavoring agents thaumatin, stevia extract (eg, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.)
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
  • health functional foods include various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, colorants and enhancers (cheese, chocolate, etc.), alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like may be included.
  • the composition for removing senescent cells according to the present invention can be used as animal medicines, external skin preparations for animals, or health functional foods for animals. Accordingly, the present invention provides an animal product composition for improving aging-related diseases and disorders, comprising the selenium compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the animal product composition may be a drug for animals, an external preparation for animal skin, or a health functional food for animals.
  • the veterinary drug may be prepared in an orally acceptable dosage form such as a capsule, tablet, powder, liquid, syrup, etc. together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, starch, lactose, maltose, sucrose, fructose, dextrose, maltodextrin, sugar, citric acid, malic acid, sweeteners such as other beverage flavorings, mannitol, sorbitol, xylitol, etc. of sugar alcohols, or dicalcium phosphate, calcium sulfate, calcium carbonate, microcrystalline cellulose, and the like.
  • the external skin preparation for animals may be in formulations such as ointments, liquids, creams, sprays, patches, and the like.
  • the skin external preparation for animals may include direct application to the skin or spraying depending on the formulation. At this time, the application amount and the number of times of daily use of the external skin preparation for animals may be appropriately set according to the age, sex, use, skin and hair condition of the individual.
  • the health functional food for animals may be an animal feed additive.
  • the animal feed additives may additionally add additives allowed according to feed testing standards, and the amount of feeding, feeding frequency, etc. may be adjusted according to the health condition of the individual.
  • composition for removing senescent cells according to the present invention can be used in pharmaceuticals, cosmetics (for example, cosmetics for skin regeneration), health functional foods, or animal products.
  • Example 1-1 Induction of cellular senescence
  • SASPs pathogenic factors
  • human-derived foreskin cells foreskin, source: Chungnam National University of Medicine
  • the designated medium Iscove's Modified Dulbecco's Medium, source: ATCC; 10% FBS, source: GenDEPOT; 100 U/ml Penicillin & Streptomycin, source: Invitrogen.
  • DOX doxorubicin
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Example 1-1 In the same manner as in Example 1-1, doxorubicin and control were treated and cultured cells were treated with LX-112 (purchase-BOC) at concentrations of 0 ⁇ M, 1.1 ⁇ M, 3.3 ⁇ M, and 10 ⁇ M, respectively, and after 3 days CellTiter- Cell viability and growth rate were measured using Glo Luminescent Cell Viability Assay (purchased from Promega) and are shown in Tables 2 and 3. At this time, NO in Table 3 is the number of cells before LX-112 treatment was calculated as 100%.
  • LX-112 purchased-BOC
  • Example 2-1 Induction of cancer cell senescence
  • Human-derived osteosarcoma cancer cell line SAOS-2 (purchase-ATCC) was cultured in the designated medium (DMEM, purchase-GenDEPOT; 10% FBS, purchase-GenDEPOT; 100 U/ml Penicillin & Streptomycin, purchase-Invitrogen) Then, senescence was induced in the same manner as in Example 1-1, and then the ratio of the cell senescence-related marker (SA- ⁇ -gal) was measured, and the results are shown in Table 4.
  • Example 2-2 LX-112 removes aged cancer cells
  • Example 2-3 Inhibition of senescent tumors by LX-112 in mice
  • mice 7-week-old male BALB/c nude mice (purchased from KRIBB Laboratory Animal Resource Center) were acclimated to the experimental environment for 1 week, and then the mice were randomized into the experimental group and the control group.
  • SAOS-2 (10 6 cells), a human osteosarcoma cancer cell line cultured in the same manner as in Example 2-1, was mixed in PBS (purchased by Welgene), and then mixed with 2% isoflurane (purchased by Sigma). It was administered subcutaneously to anesthetized mice. When the size of the tumor reached about 50 mm 2 , doxorubicin was mixed in a 1:1 solution of distilled water and PBS (pH 7.2) at a concentration of 10 mg/kg and administered intraperitoneally to induce aging of the tumor.
  • Example 3-1 Induction of natural aging of cells
  • the ratio of the senescence-associated marker (SA- ⁇ -gal) increased significantly in cells subcultured (REP) until they no longer grew continuously. From this, it was confirmed that aging was induced.
  • Example 3-1 After inducing natural aging of human-derived foreskin cells in the same manner as in Example 3-1, LX-112 was treated at concentrations of 0 ⁇ M, 1.1 ⁇ M, 3.3 ⁇ M, and 10 ⁇ M, and after 3 days CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Table 9 shows the cell viability using the assay (purchased by Promega), and the cell growth rate of cells in which senescence is not induced is shown in Table 10. At this time, N0 in Table 10 is the number of cells before LX-112 treatment was calculated as 100%.
  • Example 3 natural senescence of human foreskin cells was induced, and LX-112 was treated at a concentration of 3 ⁇ M, and then qRT-PCR (quantitative real-time PCR) was performed to detect the aging-related markers p16 and p21. The amount of mRNA was measured.
  • foreskin cells before induction of senescence were used. Specifically, the cells were collected and treated with TRIzol Reagent (purchased by Thermo Fisher Scientific) to extract total RNA. The total RNA concentration extracted was quantified using Nanodrop (purchased by Micro Digital).
  • Genomic DNA was removed from the total RNA extracted using SuperScript IV VILO Master Mix with ezDNase Enzyme (purchased by Thermo Fisher Scientific) and cDNA was prepared.
  • qRT-PCR for p16 and p21 was performed using SFCgreen I qPCR Master Mix (purchaser-SFC Probe) using GAPDH, a housekeeping gene, as a standard standard, and CFX Connect Real-Time PCR Detection System (purchaser-Bio Rad) was used for analysis.
  • Table 11 shows the mRNA levels of p16 and p21, which are senescence-related markers, before and after induction of senescence
  • Table 12 shows the mRNA levels of p16 and p21, which are senescence-related markers, before and after induction of senescence, and without and without LX-112 treatment.
  • the mRNA amounts of p16 and p21 after senescence were induced were calculated as 100%, respectively, and compared with the mRNA amounts of p16 and p21 after treatment with LX-112.
  • the primers used were synthesized through Bionics, and the sequences are shown in Table 13 below.
  • Example 5 Reduction in the amount of senescence-related inflammatory and fibrotic secretion factors (SASPs) expressed and secreted in senescent cells by LX-112
  • Example 3 natural aging of human foreskin cells was induced, and LX-112 was treated at a concentration of 3 ⁇ M, and then immunoassay was performed using the obtained culture medium (ProcartaPlex Immunoassay, Purchaser-Thermo Fisher Scientific) The expression levels of aging-related inflammation and fibrosis secreted factors (SASPs) IL1 ⁇ , IL1 ⁇ , IL6, IL10, MCP1, PAI1, VCAM1, MMP1, MMP2, MMP3, MMP12, and TGF ⁇ were measured.
  • SASPs aging-related inflammation and fibrosis secreted factors
  • Table 14 is before (-) and after (REP) inducing senescence
  • Table 15 is senescence-related inflammation and fibrosis secretion factor (SASP), respectively, in the conditions of induction of senescence and untreated and treated with LX-112.
  • SASP fibrosis secretion factor
  • Example 6-1 Induction of fibrosis in normal cells by aging-related secreted factor (SASP) expressed and secreted in senescent cells
  • SASP aging-related secreted factor
  • Example 5 a culture medium (REP) of human foreskin cells, in which natural aging was induced, was treated for one day to foreskin cells that normally grow without aging being induced. Then, in the same manner as in Example 4, qRT-PCR was used to measure the mRNA amounts of age-related fibrosis factors, ACTA2, COL1A1, COL1A2, FN1 and SDF1, and are shown in Table 16. As a control group (-), foreskin cells not treated with senescent cell culture medium were used. The primers used were synthesized through Bionics, and the sequences are shown in Table 17 below.
  • factors regulated by aging-related secreted factors include ACTA2, COL1A1, COL1A2, FN1, and SDF1, which are regulators of fibrosis and pigmentation. It was confirmed that they exist. . From this, it was confirmed that the amount of factors inducing fibrosis increased by aging. It was confirmed that the amount of SDF1, which inhibits pigmentation, was reduced by aging.
  • Example 6-2 Inhibition of fibrosis by LX-112 in mice
  • mice Eight-week-old male C57BL6J mice (purchased from KRIBB Laboratory Animal Resource Center) were acclimatized to the experimental environment for one week, and then the mice were randomized into an experimental group and a control group.
  • 0.1% chlorhexidine gluconate (CHG, purchased from Sigma) was dissolved in 15% ethanol phosphate buffer solution and intraperitoneally administered at a concentration of 10 ml/kg every 2 days for 20 days.
  • LX-112 was mixed with a 0.5% CMC-Na solution (from Sigma) and intraperitoneally administered at a concentration of 70 mg/kg every day.
  • the control group (-) was administered only the solution in the same volume.
  • Example 7 Elimination of senescent cells and related senescence inhibitory activity of LX-112 in naturally induced senescent mice
  • Example 7-1 Establishment of a naturally induced aging mouse model
  • mice 22-month-old female C57BL6J mice (purchased from KRIBB Laboratory Animal Resource Center) were acclimated to the experimental environment for one week, and then aged mice were randomized into the experimental group and the control group. 8-week-old mice were used as controls.
  • LX-112 was mixed with 0.5% CMC-Na solution (from Sigma) and orally administered at a concentration of 70 mg/kg daily for 21 days.
  • a control group was administered with the same volume of solution only. After drug administration was completed, the methods described in each of the following examples were performed.
  • Example 7-2 Decreased amount of aging-related marker (p16) of LX-112
  • concentration of the total RNA extracted was quantified using Nanodrop (purchaser-Micro Digital) or SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader (purchase-Molecular Device).
  • cDNA was prepared by removing genomic DNA using a cDNA synthesis kit (purchased from Thermo Fisher Scientific).
  • qRT-PCR for each gene using ⁇ -actin, a housekeeping gene, as a standard standard, Taqman Fast Abvanced Master Mix (purchase-Applied Biosystems), SFCgreen I qPCR Master Mix (purchase-SFC Probe), or AmfiSure It was performed using qGreen qPCR Master Mix (purchase-GenDEPOT) and analyzed using the CFX Connect Real-Time PCR Detection System (purchase-Bio Rad).
  • Table 19 is before (Young) and after (Old) induction of senescence
  • Table 20 is a result showing the amount of mRNA of p16, a senescence-related marker, in the conditions where senescence was induced and LX-112 was not treated and treated. to be.
  • the amount of mRNA of p16 after senescence was induced was calculated as 100% and compared with the amount of mRNA of p16 after treatment with LX-112.
  • the primers used were synthesized through Bionics, except that p16 and IL6 were used as TaqMan primers (purchased from Thermo Fisher Scientific). The sequences of the primers used are shown in Table 21 below.
  • Example 7-3 Decreased amount of aging-related marker (SA- ⁇ -gal) of LX-112
  • mice were sacrificed, tissue sections were prepared from organ tissues of each site, and the aging-related marker (SA- ⁇ -gal) was stained in the same manner as in Example 1-1. Specifically, fat was removed from the tissue of each site collected from the mouse and fixed at room temperature for 24 hours or more in 4% formalin. For cryopreservation, it was placed in 30% sucrose for more than 8 hours, and then rapidly frozen in cryoprotectant OCT medium for cryosectioning. Quick-frozen tissues were commissioned to Histoa, a company specializing in histopathology service, to produce frozen sections.
  • SA- ⁇ -gal aging-related marker
  • the fabricated tissue frozen sections were cut to a thickness of 8 ⁇ m, then sectioned on a slide cover, dried at room temperature for 30 minutes, and then stored at -80 ° C until use.
  • After staining with an aging-related marker (SA- ⁇ -gal) images were taken through an optical microscope, and the area of the stained area was calculated using the Image J program, and quantified by standardizing the total area.
  • Table 22 shows before (Young) and after (Old) induction of senescence
  • Table 23 shows staining of SA- ⁇ -gal, a marker associated with senescence, under the conditions of induction of senescence and untreated and treated with LX-112. This is the result of the area.
  • 2 is a photographic result of staining of adipose tissue.
  • Example 7-4 Decreased amount of aging-related degenerative marker (lipofuscin) in LX-112
  • Example 7-3 The mouse was sacrificed, and tissue sections were prepared from muscle tissue in the same manner as in Example 7-3, and degenerative abnormal complexes such as proteins and lipids produced in lysosomes of cells according to aging, which are aging-related degenerative markers.
  • the amount of lipofuscin was stained and photographed using Sudan Black B (purchased from Sigma), and then the area of the stained area was calculated using the Image J program, and quantified by standardization based on the total area.
  • Table 24 shows the results of staining areas of lipofuscin, an aging-related degenerative marker, before and after senescence induction
  • Table 25 shows senescence and LX-112 untreated and treated conditions.
  • the lipofuscin staining area in muscle tissue increased as the mice aged.
  • the lipofuscin staining area was reduced in various tissues. From this, it was confirmed that LX-112 effectively reduces the amount of lipofuscin, an aging-related degenerative marker, that increases in mouse muscle tissue by removing senescent cells that increase with aging of mice.
  • Example 7-5 LX-112 reduces the amount of aging-related inflammatory secreted factor (SASP) (IL6)
  • IL6 and MCP1 which are aging-related inflammatory secreted factors (SASPs)
  • SASPs aging-related inflammatory secreted factors
  • Table 26 is before and after inducing senescence
  • Table 27 is a result showing the amount of IL6 and MCP1, which are senescence-related inflammatory secreted factors (SASPs), in the conditions where senescence was induced and LX-112 was not treated and treated. .
  • Example 7-6 LX-112 reduces the amount of aging-related inflammation and fibrosis secreted factors (SASPs)
  • qRT-PCR was performed and analyzed for MMP3, IL1 ⁇ , MMP12, IL6, and MMP13, which are aging-related inflammation and fibrosis secretion factors (SASP), using the cDNA synthesized in the same manner as in Example 7-2.
  • Table 28 is before and after inducing senescence
  • Table 29 is senescence-related inflammation and fibrosis secreted factor (SASP) MMP3, IL1 ⁇ , MMP12, MMP3, IL1 ⁇ , MMP12, These are the results showing the mRNA amounts of IL6 and MMP13.
  • the amount of mRNA of each factor after senescence was induced was calculated as 100%, and the amount of mRNA of each factor after treatment with LX-112 was compared.
  • Example 7-7 Improvement of frailty (activity, endurance, muscle strength and grip strength, sarcopenia, lipotrophy, etc.) due to aging of LX-112
  • activity evaluation In order to analyze frailty due to aging in mice, activity evaluation (open field test), endurance evaluation (wire hanging test), muscle strength and grip strength evaluation (grip strength test) were performed. Specifically, in the activity evaluation (open field test), the mouse was placed in a white square box and the movement trajectory for a certain period of time was measured. The time spent in the center was standardized and quantified based on the total distance moved. In the endurance evaluation (wire hanging test), the time the mouse hangs on the wire (wire) was measured. In the muscle strength and grip strength test, the mouse was grabbed by the tail and made to hold the grip strength meter (purchased-Jeongdo B&P) with its forepaws, and then slightly pulled until it was missed to measure the force applied to the meter just before it was missed.
  • grip strength meter purchased-Jeongdo B&P
  • Table 30 is before and after inducing aging
  • Table 31 is a quantitative evaluation of activity evaluation, endurance evaluation, muscle strength and grip strength evaluation, which are criteria for judging frailty, under the condition of inducing aging and not and treated with LX-112, respectively. is the result represented by Table 31 calculates the amount of each evaluation after senescence is induced as 100%, and compares the amount of each evaluation after treatment with LX-112.
  • Example 7-8 LX-112 improves renal damage due to aging
  • urea and creatinine which are kidney damage markers, in serum collected from mice were measured by spectrophotometry using a kit (purchased from BioAssay Systems and Sigma).
  • the amount of Agtr1a mRNA, a kidney injury marker was measured by qRT-PCR as described in Example 7-2.
  • Table 32 shows the results quantitatively showing urea, creatinine, and Agtr1a mRNA, which are kidney damage markers, respectively, in the conditions of senescence induction and LX-112 untreated and treated.
  • the amount of each factor after senescence was induced was calculated as 100% and compared with the amount of each factor after treatment with LX-112.
  • Example 7-9 Improvement of skin aging according to aging of LX-112
  • Example 8 Removal of senescent cells and related senescence inhibitory activity of LX-112 in aged mice induced by anticancer drugs
  • Example 8-1 Establishment of anticancer drug-induced aging mouse model
  • Example 8-2 Decreased amount of aging-related marker (p16) of LX-112
  • mice were sacrificed in the same manner as in Example 7-2, and qRT-PCR was performed and analyzed using cDNA synthesized by RNA extraction from organ tissues of each site.
  • Table 34 is before and after induction of senescence by treatment with anticancer agents
  • Table 35 is senescence-related markers p16 and p21 in the conditions where senescence is induced by treatment with anticancer agents and LX-112 is not treated or treated. This is the result of expressing the amount of mRNA.
  • the mRNA amounts of p16 and p21 after senescence was induced by treatment with anticancer drugs were calculated as 100% and compared with the mRNA amounts of p16 and p21 after treatment with LX-112.
  • Example 8-3 Decreased amount of aging-related marker (SA- ⁇ -gal) of LX-112
  • mice described in Example 7-3 were sacrificed, and tissue sections were prepared from organ tissues of each region and stained for SA- ⁇ -gal, a marker associated with aging.
  • Table 36 is before and after induction of senescence by treatment with anticancer agents
  • Table 37 is senescence by treatment with anticancer agents and SA- ⁇ , a marker for senescence, under conditions without and with LX-112 treatment. This is the result showing the staining area of -gal. 3 is a photographic result of staining of adipose tissue.
  • Example 8-4 Decreased amount of aging-related degenerative marker (lipofuscin) in LX-112
  • Example 7-4 Mice were sacrificed in the same manner as in Example 7-4, tissue sections were prepared from muscle tissue, and lipofuscin, an aging-related degenerative marker, was stained.
  • Table 38 is before and after induction of senescence by treatment with anticancer agents
  • Table 39 is senescence by treatment with anticancer agents, and lipofuscin, an aging-related degenerative marker, under the conditions of not being treated and treated with LX-112. It is the result showing the staining area of .
  • Muscle Lipofuscin (%) - 100.0 ( ⁇ 19.3) LX 77.1 ( ⁇ 8.0)
  • Example 8-5 LX-112 reduces the amount of aging-related inflammatory secreted factor (SASP) (IL6)
  • Example 7-5 the amount of IL6, a senescence-associated inflammatory secretion factor (SASP), in serum collected from mice was measured by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA Kit, from R&D Systems).
  • ELISA Kit enzyme-linked immunosorbent assay
  • Table 40 shows before and after induction of senescence by treatment with anticancer agents
  • Table 41 shows senescence-associated inflammatory secretion factor (SASP) under the conditions of induction of senescence by treatment of anticancer agents and without and with LX-112 treatment. This is the result showing the amount of phosphorus IL6.
  • Example 8-6 LX-112 reduces the amount of aging-related inflammation and fibrosis secreted factors (SASPs)
  • qRT-PCR was performed and analyzed for IL6, CXCL1, CXCL10, IL1 ⁇ , etc., which are aging-related inflammation and fibrosis secretion factors (SASP), using the cDNA synthesized in the same manner as in Examples 7-6.
  • Table 42 is before and after induction of senescence by treatment with anticancer agents
  • Table 43 is senescence-related inflammation and fibrosis secreted factors under conditions where senescence is induced by treatment with anticancer agents and LX-112 is not treated or treated.
  • SASP IL6, CXCL1, CXCL10, and IL1 ⁇ mRNA amounts.
  • the amount of mRNA of each factor after senescence was induced by treatment with an anticancer agent was calculated as 100% and compared with the amount of mRNA of each factor after treatment with LX-112.
  • mice when mice were aged by treatment with anticancer drugs, the mRNA amounts of IL6, CXCL1, CXCL10, and IL1 ⁇ increased in organ tissues such as liver and epididymal fat (eWAT).
  • organ tissues such as liver and epididymal fat (eWAT).
  • mice senescence induced by treatment with anticancer drugs were treated with LX-112, the amount of senescence-related inflammatory and fibrotic secretion factor (SASP) mRNA was reduced in various organ tissues.
  • SASP senescence-related inflammatory and fibrotic secretion factor
  • LX-112 removes senescent cells that increase with aging of mice by treatment with anticancer drugs, thereby increasing aging-related inflammation and fibrosis secretion factors (SASPs) IL6, CXCL1, and CXCL10 in various organ tissues of mice. , it was confirmed that the amount of IL1 ⁇ was effectively reduced.
  • SASPs aging-related inflammation and fibrosis secretion factors
  • Example 8-7 Improvement of fatigue, weakness, and weight loss according to LX-112 anticancer drug
  • Table 46 shows the weight results before and after induction of senescence by treatment with anticancer drugs and in the conditions of induction of senescence by treatment with LX-112 and treatment with LX-112.
  • the amount of each evaluation after senescence was induced by treatment with an anticancer agent was calculated as 100%, and the amount of each evaluation after treatment with LX-112 was compared.
  • Example 8-8 Improvement of liver damage caused by LX-112 anticancer drug
  • AST aspartate aminotransferase
  • ALT alanine transaminase
  • Table 47 shows before and after induction of senescence by treatment with anticancer agents
  • Table 48 shows AST and ALT, which are markers of liver damage, under conditions of induction of senescence by treatment of anticancer agents and without and with LX-112 treatment. is the result of expressing the amount of In Table 48, the amount of each factor after senescence was induced by treatment with an anticancer agent was calculated as 100% and compared with the amount of each factor after treatment with LX-112.
  • Example 9-1 Establishment of an obesity-induced aging mouse model
  • mice 15-week-old male C57BL6J mice (purchased by Jackson Research Institute), whose obesity was induced by a high-fat diet, were adapted to the experimental environment for one week, and then the mice were randomized into an experimental group and a control group.
  • LX-112 was mixed with 0.5% CMC-Na solution (from Sigma) and orally administered at a concentration of 70 mg/kg daily for 21 days.
  • a control group was administered with the same volume of solution only. After drug administration was completed, the methods described in each of the following examples were performed. The mice were sacrificed and the weight of adipose tissue in each region was measured.
  • Table 50 shows body weight, epididymal fat (eWAT), inguinal fat (iWAT), subcutaneous fat (asWAT), mesenteric tissue before and after inducing obesity in mice induced with high-fat diet (DIO). This is the result of quantitatively expressing the weight of fat (mWAT) and interscapular brown fat (iBAT).
  • Body Weight g) eWAT (mg) iWAT (mg) asWAT (mg) mWAT (mg) iBAT (mg) - 20.7 ( ⁇ 0.1) 169.1 ( ⁇ 70.1) 188.4 ( ⁇ 2.1) 205.6 ( ⁇ 88.4) 96.6 ( ⁇ 19.1) 100.5 ( ⁇ 35.9) DIO 41.5 ( ⁇ 3.8) 2437.4 ( ⁇ 161.4) 1471.9 ( ⁇ 162.8) 1269.6 ( ⁇ 24.7) 1018.3 ( ⁇ 481.5) 344.7 ( ⁇ 140.7)
  • Example 9-2 Decreased amount of aging-related marker (p16) of LX-112
  • Table 51 shows the mRNA levels of p16 and p21, which are aging-related markers, before and after induction of senescence by obesity
  • Table 52 shows the senescence by obesity and untreated and treated with LX-112. is the result shown.
  • the mRNA levels of p16 and p21 after aging was induced by obesity were calculated as 100% and compared with the mRNA amounts of p16 and p21 after treatment with LX-112.
  • mice when mice are aged by aging, liver, muscle, lung, skin, epididymal fat (eWAT), inguinal fat (iWAT), subcutaneous
  • eWAT epididymal fat
  • iWAT inguinal fat
  • Table 52 when LX-112 was treated in mice whose aging was induced by aging, the mRNA levels of p16 and p21 were decreased in various organ tissues. From this, it was confirmed that LX-112 effectively reduces the amount of aging-related markers p16 and p21, which increase in various organ tissues of mice, by removing senescent cells that increase in mice due to aging caused by obesity.
  • Example 9-3 LX-112 reduces the amount of aging-related inflammatory secreted factor (SASP) (IL6)
  • Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA Kit, place of purchase- R&D Systems). Table 53 is before and after induction of senescence by obesity, and Table 54 is senescence-associated inflammatory secretion factor (SASP), IL6 and fluid, under the conditions of induction of senescence by obesity and without and with LX-112 treatment. This is the result showing the amount of activin A.
  • SASP senescence-associated inflammatory secretion factor
  • Example 9-4 Improvement of anxiety, depression and lethargy according to obesity with LX-112
  • Example 9-5 Improvement of fatty liver according to obesity with LX-112
  • Example 7-4 Mice were sacrificed in the same manner as in Example 7-4, and sections were prepared from liver tissue, and fat accumulation was stained with Oil Red O.
  • Table 57 shows before and after inducing aging by obesity
  • Table 58 shows the staining area of Oil Red O, which is the criterion for determining fatty liver, in the conditions of inducing aging by obesity and not and without LX-112 treatment. is the result shown.
  • Table 58 shows that the stained area of Oil Red O after aging was induced by obesity was calculated as 100% and compared with the stained area of Oil Red O after treatment with LX-112.
  • Example 10 Securing a variant selenium compound of LX-112 having senescent cell removal and related aging inhibitory activity
  • Example 10-1 Removal of senescent cells by LX-114, LX-115, LX-116, LX-117, LX-128
  • LX-114 (purchase-REONSIMI), LX-115 (purchase-REONSIMI), LX-116 (purchase-REONSIMI), LX-117 (purchase- REONSIMI), LX-128 (purchased from Abcam), and the like were treated at concentrations of 0 ⁇ M, 1.1 ⁇ M, 3.3 ⁇ M, and 10 ⁇ M, and cultured for 3 days. Then, cell viability was measured using CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (purchased by Promega).
  • Tables 59 and 60 show human-derived foreskin cells treated with doxorubicin (DOX) or a control, and then treated with each composition, such as LX-114, LX-115, LX-116, LX-117, and LX-128. The result shows the survival rate and growth rate.
  • DOX doxorubicin
  • Example 10-2 Reduction in the amount of aging-related markers (p16) and aging-related inflammation and fibrosis secreted factors (SASP) of LX-114, LX-115, LX-116, and LX-117
  • LX-114, LX-115, LX-116, and LX-117 were mixed in a 0.5% CMC-Na solution (purchase-Sigma) to mice aged in the same manner as in Example 7-1, and 70 mg/kg daily for 21 days. It was administered orally at a concentration. A control group was administered with the same volume of solution only. After drug administration was completed, the methods described in each of the following examples were performed. The mouse was sacrificed in the same manner as in Example 7-2, and qRT-PCR was performed and analyzed using cDNA synthesized by RNA extraction from liver tissue.
  • Table 61 shows the senescence-related marker p16 and senescence-related inflammation and fibrosis secreted factors ( SASP) is a result showing the amount of mRNA of MMP3.
  • SASP senescence-related inflammation and fibrosis secreted factors
  • Example 7-2 and Table 19 or Example 7-6 and Table 28 when the mouse was aged by natural aging, the amount of p16 and MMP3 mRNA increased in liver tissue.
  • Treatment with LX-114, LX-115, LX-116, and LX-117 decreased the mRNA levels of p16 and MMP3 (Table 61). From this, LX-114, LX-115, LX-116, and LX-117 remove the senescent cells that increase in mice by natural aging, so that the aging-related marker p16 and aging-related inflammation and fibrosis secretion factors ( SASP) was confirmed to effectively reduce the amount of MMP3.
  • SASP aging-related marker p16 and aging-related inflammation and fibrosis secretion factors

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Abstract

본 발명에 따른 노화세포 제거용 조성물은 셀레늄 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함함으로써, 노화세포의 사멸을 유도해 노화세포를 제거할 수 있으므로, 노화세포로부터 야기되는 각종 노화관련 질환 및 장애의 억제 및 치료에 유용하게 적용될 수 있다. 또한, 노화세포로부터 야기되는 노화관련 질환 및 장애와 관련해서 의약품, 화장품, 건강기능식품, 동물용 제품 등에도 유용하게 적용될 수 있다.

Description

셀레늄 화합물을 유효성분으로 포함하는 노화세포 제거용 조성물
본 발명은 셀레늄 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 노화세포 제거용 조성물에 관한 것이다.
노화(aging)는 인간이 태어나서 일정 기간 성장한 후, 나이가 들면서 점차 신체적 및 인지적으로 쇠퇴하여 죽음에 이르는 과정을 의미한다. 최근 세계보건기구(WHO)가 고령(old age) 자체에 대한 질병코드(MG2A)를 부여하면서 노화를 치료 또는 지연하기 위한 여러 연구개발 및 임상 시험이 활발히 진행되고 있다.
나이가 들어감에 따라 텔로미어의 감소, 활성 산소의 증가 등의 내부 요인에 의해 인체에서 노화가 진행되고, 그에 따라 여러'노화관련 질환 및 장애(aging-associated diseases & disabilities/disorders)'가 발생한다. 항암제 등 독성 물질의 투여, 비만 및 당뇨 등 대사의 교란, 조직 상처 및 이식 등을 포함한 여러 스트레스 요인은 노화관련 질환 및 장애의 발생을 가속화시킨다.
이러한 노화관련 질환 및 장애를 야기하는 근본적인 원인은 '노화세포(senescent cells)'인데, 최근 연구 결과에 따르면, 나이가 들어감에 따라 여러 요인에 의해 인체에 노화세포가 축적되고, 축적된 노화세포가 분비하는 인자는 노화촉진(senescence-promoting) 인자와 더불어 염증(senescence-associated inflammation) 및 섬유화증(senescence-associated fibrosis) 등 노화와 관련된 병적인(senescence-associated pathogenic) 인자 등을 다수 포함하는데, 이러한 노화관련 분비인자(SASP ; senescence-associated secretory phenotype)의 역할은 (i) 주위의 정상세포를 노화세포로 변화시켜 노화세포를 점차 확산시켜서, (ii) 이에 따라 전체 장기와 조직에서 구조적 및 기능적인 변이를 진행시키고, (iii) 노화에 따른 만성적인 염증(immuno-aging) 및 섬유화증(fibro-aging) 등의 여러 병적인 기저 이상 증상(underlying pathological phenotypes)을 야기시켜서, (iv) 이에 따라 결국에는 전신에 걸쳐서 여러 노화관련 질환 및 장애를 발생시키는 것으로 알려졌다.
이러한 노화세포는 체내의 면역세포에 의해 제거되지만, 나이가 들면서 면역세포들도 함께 노화되기 때문에 제 기능을 하지 못하여 결국 노화세포가 인체에 축적하게 된다. 이러한 세포의 노화 현상은 인체를 구성하는 모든 세포에서 발생하는데, 면역세포 등 일반적인 체세포(somatic cells) 뿐만 아니라, 줄기세포(stem cells) 그리고 암 등의 여러 질병세포에서도 관찰된다. 줄기세포에서 노화가 진행되면 장기와 조직이 재생 및 유지되지 못하고, 질병세포에서 노화가 진행되면 질병은 더욱 악화된다.
이에, 최근 암세포를 제거해서 암을 치료하듯이, 노화세포를 제거해서 노화관련 질환 및 장애를 치료하고자 하는 다양한 연구개발이 진행되고 있다(Robbins PD et al., Annuual Review of Pharmacological Toxicology 61, 779-803, 2021). 이러한 혁신적인 안티에이징 치료제로서 ABT263/737 등이 최근 보고된 바 있지만, 독성 등 많은 부작용이 문제점으로 존재한다.
한편, 셀레늄은 체내에 미량으로 존재하는 필수적인 무기질 원소이며 항산화 작용을 하는 단백질의 구성 성분이다. 이러한 자연적인 천연 요소인 셀레늄을 포함해서 합성된 화합물이, 세포를 보호하고 세포의 생존 및 유지에 중요한 역할을 하는 셀레늄 본연의 작용과는 별개로, 노화세포를 제거하는 활성을 가지고 있음은 알려진 바가 없다.
[선행기술문헌]
(비특허문헌 1) Robbins PD et al., Annuual Review of Pharmacological Toxicology 61, 779-803, 2021.
이에, 본 발명자들은 노화세포를 제거할 수 있는 안전하고 효과적인 약물을 개발하기 위해 연구한 결과, 셀레늄 화합물이 다양한 종류의 노화세포를 높은 효율로 제거하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 측면은, 화학식 1로 표시되는 셀레늄 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 노화세포 제거용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 노화세포 제거용 조성물은 시간 경과에 따라 자연적으로 노화된 세포뿐만 아니라 여러 요인에 의해 인위적으로 유도된 다양한 노화세포의 생존률을 현저하게 감소시켜서, 이러한 노화세포로부터 분비되는 다양한 노화관련 병적인 인자들의 발현 및 분비를 근원적으로 차단 및 억제시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 노화세포 제거용 조성물은 노화관련 질환 및 장애의 억제 및 치료에 유용하게 활용될 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 노화세포 제거용 조성물은 노화세포와 관련된 노화관련 질환 및 장애와 관련해서 의약품, 화장품, 건강기능식품, 동물용 제품 등에도 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 셀레늄 화합물을 이용한 노화세포 제거 작용을 나타낸다.
도 2는 자연적으로 노화를 유도한 마우스에 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서 지방 조직의 염색 사진이다.
도 3은 독소루비신(DOX) 처리에 의해 노화를 유도한 마우스에 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서 지방 조직의 염색 사진이다.
이하 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 명세서에서 용어 "할로겐"은 다른 언급이 없으면 F, Cl, Br 또는 I를 의미한다.
본 명세서에서 용어 "알킬"은, 달리 명시되지 않는 한, 선형 또는 분지형의 포화된 탄화수소 잔기를 의미한다. 예를 들어, "C1-6 알킬"은 1 내지 6개 탄소로 골격이 이루어진 알킬을 의미한다. 구체적으로 C1-6 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, i-부틸, t-부틸, n-펜틸, i-펜틸, t-펜틸, sec-펜틸, 네오펜틸, 헥실을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "할로알킬"은 하나 이상의 할로겐으로 치환된 알킬을 의미한다. 구체적으로, 할로알킬은 동종의 할로겐이 2개 이상 치환되거나 2종 이상의 할로겐이 치환된 알킬일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "알콕시"는, 달리 명시되지 않는 한, 앞에 정의한 알킬기가 산소 원자를 통하여 모 화합물에 부착되어 있는, 화학식 -O-알킬을 갖는 기를 의미한다. 알콕시기의 알킬 부분은 1 내지 20개의 탄소원자(즉, C1-C20 알콕시), 1 내지 12개의 탄소원자(즉, C1-C12 알콕시), 또는 1 내지 6개의 탄소원자(즉, C1-C6 알콕시)를 가질 수 있다. 적합한 알콕시기의 예로는 메톡시(-O-CH3 또는 -OMe), 에톡시(-OCH2CH3 또는 -OEt), t-부톡시(-O-C(CH3)3 또는 -O-tBu) 등이 있다.
본 명세서에서 용어 "알케닐"은 하나 이상의 이중결합을 함유하는 선형 또는 분지형의 탄화수소 잔기를 의미한다. 예를 들어, "C2-6 알케닐"은 2 내지 6개 탄소로 골격이 이루어진 알케닐기를 의미한다. 구체적으로 C2-6 알케닐은 에테닐, n-프로페닐, 이소프로페닐, n-부테닐, 이소부테닐, 옥테닐, 데세닐(decenyl), 테트라데세닐, 헥사데세닐 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에 용어 "알키닐"은 하나 이상의 삼중결합을 함유하는 선형 또는 분지형의 탄화수소 잔기를 의미한다. 예를 들어, "C2-6 알키닐"은 2 내지 6개 탄소로 골격이 이루어진 알케닐기를 의미한다. 구체적으로 에티닐, n-프로피닐 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "아릴"은 모 방향족 고리 시스템의 6개의 탄소원자로부터 1개의 수소 원자가 제거되어 유도되는 방향족 탄화수소 라디칼을 의미한다. 예를 들면, 아릴기는 6 내지 20개의 탄소원자, 6 내지 14개의 탄소원자, 또는 6 내지 12개의 탄소원자를 가질 수 있다. 아릴기는 페닐일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "헤테로아릴"은 고리 내에 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 방향족 헤테로사이클릴을 지칭한다. 헤테로아릴의 비제한적인 예로는 피리디닐, 피롤릴, 옥사졸릴, 인돌릴, 이소인돌릴, 퓨리닐, 퓨라닐, 티에닐, 벤조퓨라닐, 벤조티오페닐, 카바졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 이속사졸릴, 피라졸릴, 이소티아졸릴, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 피리다질, 피리미딜, 피라질(이들은 고리에 하나 이상의 치환기를 가질 수 있음) 등이 있다.
본 명세서에서 용어 "사이클로알킬"은 고리 중에 탄소원자만을 포함하는 포화 모노사이클 또는 폴리-사이클을 지칭한다. 예를 들어 "3원 내지 9원의 사이클로알킬"은 3 내지 9개 탄소원자를 포함하는 고리형 탄화수소 잔기를 의미한다. 사이클로알킬은, 모노사이클로서는 3 내지 7개의 탄소원자를, 바이사이클 사이클로알킬로서는 7 내지 9 탄소원자를 가질 수 있다.
본 명세서에서 용어 "헤테로사이클로알킬"은 고리 내에 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 비방향족 헤테로사이클릴을 지칭한다. 헤테로사이클로알킬은 이중 결합의 존재로 인해 고리가 방향성(aromatic)을 갖지 않는 범위에서 고리 내에 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-헤테로원자 이중 결합을 가질 수 있다. 헤테로사이클로알킬의 비제한적인 예로는 아제티딘일, 아지리딘일, 피롤리딘일, 피페리딘일, 피페라진일, 호모피페라진일, 모폴리노, 티오모폴리노, 테트라히드로퓨란일, 테트라히드로티오퓨란일, 테트라히드로피란일, 피란일 등이 있다.
본 명세서에서 용어 "헤테로원자"는 탄소(C) 이외의 원자를 의미하며, 구체적으로 셀레늄(Se), 질소(N), 산소(O) 또는 황(S) 원자일 수 있다.
본 발명의 일 측면은, 하기 화학식 1로 표시되는 셀레늄 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 노화세포 제거용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2022009345-appb-img-000001
여기서 R은 단일결합, -(CH2)n-, 또는 -(CH2)p-X-(CH2)q-이고; n은 1 내지 10의 정수이고; p 및 q는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고; X는 -S-, -Se- 또는 페닐렌이고; A는 아래 화학식 2로 표시되는 그룹이거나, 페닐, 아민 또는 아마이드이고;
[화학식 2]
Figure PCTKR2022009345-appb-img-000002
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 및 R8은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-6알킬, 할로C1-6알킬, C1-6알콕시, 카복시, 아민, 또는 니트로이다.
상기 아민 및 아마이드는 각각 C1-10알킬, C2-10알케닐, C2-10알키닐, 3-10원의 사이클로알킬, C6-10아릴, 3-10원의 헤테로사이클로알킬, 또는 5-10원의 헤테로아릴로 치환되거나 치환되지 않은 그룹일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 셀레늄 화합물은 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물이다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2022009345-appb-img-000003
여기서 R은 -(CH2)n- 또는 -(CH2)p-X-(CH2)q-이고; n은 1 내지 10의 정수이고; p 및 q는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고; X는 -S-, -Se- 또는 페닐렌이고; R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 및 R8은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-6알킬, 할로C1-6알킬, C1-6알콕시, 카복시, 아민, 또는 니트로이다.
다른 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 셀레늄 화합물은 하기 화학식 4로 표시되는 화합물이다.
[화학식 4]
Figure PCTKR2022009345-appb-img-000004
여기서 R은 -(CH2)n- 또는 -(CH2)p-X-(CH2)q-이고; n은 1 내지 10의 정수이고; p 및 q는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고; X는 -S-, -Se- 또는 페닐렌이다.
또 다른 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 셀레늄 화합물은 하기 화학식 5 또는 6으로 표시되는 화합물이다.
[화학식 5]
Figure PCTKR2022009345-appb-img-000005
[화학식 6]
Figure PCTKR2022009345-appb-img-000006
여기서 n은 1 내지 8의 정수이고; p 및 q는 각각 독립적으로 1 내지 4의 정수이고; X는 -S-, -Se- 또는 페닐렌이다.
또 다른 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 셀레늄 화합물은 하기 화학식 7 내지 13 중에서 어느 하나로 표시되는 화합물이다.
[화학식 7]
Figure PCTKR2022009345-appb-img-000007
[화학식 8]
Figure PCTKR2022009345-appb-img-000008
[화학식 9]
Figure PCTKR2022009345-appb-img-000009
[화학식 10]
Figure PCTKR2022009345-appb-img-000010
[화학식 11]
Figure PCTKR2022009345-appb-img-000011
[화학식 12]
Figure PCTKR2022009345-appb-img-000012
[화학식 13]
Figure PCTKR2022009345-appb-img-000013
상기 화학식 7의 화합물은 일반적으로 에타셀렌(ethaselen)으로 불리는 셀레늄 화합물의 일종으로, 본 명세서에서는 LX-112로 칭한다.
상기 화학식 8의 화합물은 일반적으로 프로필셀렌(propylselen)으로 불리는 셀레늄 화합물의 일종이다.
상기 화학식 9의 화합물은 일반적으로 부타셀렌(butaselen)으로 불리는 셀레늄 화합물의 일종으로, 본 명세서에서는 LX-114로 칭한다.
상기 화학식 10의 화합물은 일반적으로 부타티오바이셀렌(butathiobiselen)으로 불리는 셀레늄 화합물의 일종으로, 본 명세서에서는 LX-115로 칭한다.
상기 화학식 11의 화합물은 일반적으로 부타셀레노바이셀렌(butaselenobiselen)으로 불리는 셀레늄 화합물의 일종으로, 본 명세서에서는 LX-116으로 칭한다.
상기 화학식 12의 화합물은 일반적으로 헥사셀렌(hexaselen)으로 불리는 셀레늄 화합물의 일종으로, 본 명세서에서는 LX-117로 칭한다.
상기 화학식 13의 화합물은 일반적으로 엡셀렌(ebselen), PZ51, DR3305, SPI-1005로 불리는 셀레늄 화합물의 일종으로, 본 명세서에서는 LX-128로 칭한다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 노화세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있다.
상기 노화는 시간의 경과에 따른 자연적인 노화 또는 항암제에 의한 스트레스로 인한 노화 및 비만에 의한 스트레스로 인한 노화로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 즉 상기 노화세포는 시간의 경과에 따른 자연적인 노화 또는 항암제에 의한 스트레스로 인한 노화 및 비만에 의한 스트레스로 인한 노화로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나와 관련된 것일 수 있다.
상기 노화세포는 체세포, 줄기세포 및 질병으로 비정상적으로 변한 세포 등으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 노화세포는 간, 신장, 비장, 뇌, 폐, 근육, 피부, 지방 등으로부터 유래하는 장기 조직의 세포일 수 있다. 상기 질병은 염증, 섬유화증 및 암 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 노화세포는 하기의 여러 특징들 중 임의의 하나 이상의 특징을 나타낼 수 있다. (i) 세포의 분열 및 성장이 거의 영구적으로 정지되어 있다. (ii) 노화되지 않은 정상세포에 비해서 전체적으로 세포 등의 크기가 증가되어 있다. 특히, 리소좀의 내용물이 증가되어 있고, 비정상적인 미토콘드리아가 증가되어 있다. (iii) Lamin B1 등 핵의 구조 단백질 및 HMGB1 등 크로마틴의 결합 단백질이 감소되어 있다. (iv) 노화에 따른 β-갈락토시데이즈(SA-β-gal)를 발현한다. (v) 노화에 따른 단백질 및 지질 등의 퇴행성 이상복합체로서 리포푸신(Lipofuscin)을 생성한다. (vi) p16 및 p21 등 CDK(cyclin-dependent kinase) 억제 인자를 활성화 및 많이 발현한다. (vii) 지속적인 스트레스 반응으로서 DDR(DNA damage response)에 따른 p53 등의 신호 전달 체계가 활성화되어 있고, 이에 따라 관련 타깃 유전자들의 발현이 조절되어 있다. 이와 같이, 노화세포가 공히 나타내는 특징으로서 세포의 분열 및 성장 멈춤과 더불어 노화관련 표지인자(senescence-associated marker)는 SA-β-gal, 리포푸신, p16, p21, p53 등을 포함할 수 있다(https://doi.org/10.1016/j.tcb.2018.02.001 참조).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 노화세포 제거용 조성물을 각각 인위적으로 노화 유도된 세포 및 연속적인 계대 배양에 의해 자연적으로 노화된 세포에 처리할 경우, 노화세포를 효과적으로 제거시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 노화세포 제거용 조성물을 각각 자연적으로 노화된 마우스 또는 항암제, 섬유화증 유도 약물 및 비만 등의 스트레스로 인해 인위적으로 노화가 유도된 마우스 또는 종양에 노화가 유도된 마우스에 처리할 경우, 각종 장기 조직에서 노화세포를 효과적으로 제거시킬 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 노화세포 제거용 조성물은 노화관련 표지인자, 노화촉진 인자, 또는 노화관련 분비인자(SASP)의 발현 및 분비의 억제에 사용될 수 있다. 이 인자들은 노화세포에서 발현 및 분비되므로, 노화세포가 제거됨에 따라서 근원적으로 인자들의 발현 및 분비가 차단될 수 있다.
상기 노화관련 표지인자는 p16, p21, SA-β-gal, 리포푸신 등을 포함한 다양한 인자(https://doi.org/10.1016/j.tcb.2018.02.001)들을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 인자일 수 있다.
상기 노화관련 분비인자(SASP)는 노화관련 염증 및 섬유화증 등 다양한 노화관련 병적인 인자 등을 포함하며, IL1α, IL1β, IL6, IL10, MCP1, PAI1 VCAM1, MMP1, MMP2, MMP3, MMP12, MMP13, TGFβ, ACTA2, COL1A1, COL1A2, FN1, CXCL1, CXCL10 등을 비롯해서 GM-CSF, GROα, GROβ, GROγ, IGFBP7, IL7, IL8, MIP1α, ENA78, GCP2, GITR, HGF, ICAM1, IGFBP2, IGFBP4, IGFBP5, IGFBP6, IL13, MCP4, MIF, MIP3α, MMP14, NAP2, PIGF, RANTES, sgp130, TIMP2, TRAILR3, Acrp30, Axl, bFGF, BLC, BTC, CTACK, EGFR, Fas, FGF7, GCSF, GDNF, HCC4, I309, IFNγ, IGFBP1, IGFBP3, IL11, IL15, IL2Rα, IL6R, ITAC, Leptin, LIF, MSPα, PAI2, PDGF-BB, SCF, SDF1, sTNF-RI, sTNF-RII, TIMP-1, tPA, uPA, uPAR, VEGF, MCP3, IGF1, TGFβ3, MIP1, IL4, FGF7, PDGF-BB, IL16, BMP4, MDC, MCP4, IL10, TIMP1, ICAM1, Axl, CNTF, INFγ, EGF, BMP6 등 노화관련 염증 및 섬유화증 인자를 비롯해서 암 등 다양한 병적인 인자(http://www.saspatlas.com 참조)들을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 인자일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 노화세포 제거용 조성물을 사용함으로써 노화세포로부터의 여러 노화관련 병적인 인자(SASP)의 발현 및 분비를 미연에 제거해서 다양한 노화관련 질환 및 장애를 효과적으로 억제 및 치료할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 노화세포 제거용 조성물을 사용해서 다양한 스트레스로부터 회복 탄력성(resilience) 및 저항성을 유지하게 하고, 여러 스트레스로 인한 다양한 부작용 및 후유증 및 그로 인한 질환 및 장애를 억제, 치료 및 개선할 수 있다.
이와 같이 본 발명에 따른 노화세포 제거용 조성물은 노화관련 질환 및 장애의 억제 및 치료에 사용될 수 있다. 즉, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 셀레늄 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의, 노화관련 질환 및 장애의 억제 및 치료를 위한 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 셀레늄 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의, 노화관련 질환 및 장애의 억제 및 치료용 의약품의 제조를 위한 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 셀레늄 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는, 노화관련 질환 및 장애의 억제 및 치료 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 셀레늄 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 노화세포에 처리하는 단계를 포함하는 노화세포의 제거 방법을 제공한다.
상기 노화관련 질환 및 장애는 노화세포와 관련된, 증식 질환 및 장애, 염증 또는 자가면역 질환 및 장애, 신경 질환 및 장애, 대사 질환 및 장애, 심혈관 질환 및 장애, 폐 질환 및 장애, 신장 질환 및 장애, 간 질환 및 장애, 안구 질환 및 장애, 피부 질환 및 장애, 줄기세포 또는 장기 조직의 재생유지 관련 질환 및 장애, 외래이식 관련 질환 및 장애, 섬유화증 질환 및 장애, 경화증 질환 및 장애, β-갈락토시데이즈 관련 질환 및 장애, 기타 노인성 질환 및 장애, 스트레스에 의한 부작용 및 후유증 및 이로 인한 노화관련 질환 및 장애로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 노화관련 질환 및 장애가 노화세포와 관련된, 염증, 섬유화증, 경화증, 암, 항암제 또는 비만에 의한 스트레스로 인한 부작용 및 후유증, 노쇠, 근감소증, 지방위축증, 간 및 신장 손상 또는 피부 노화 및 이와 관련된 질환 및 장애일 수 있다.
일례로서, 상기 노화세포와 관련된, 항암제 또는 비만에 의한 스트레스로 인한 부작용 및 후유증이 피로 및 쇠약, 체중 감소, 불안과 우울증 및 무기력증 또는 지방간 등일 수 있다.
상기 염증은 노화세포에 의해 야기되는 노화염증(inflamm-aging, immuno-senescence, senescence-associated inflammation)이고 이로 인해 노인층에서 관찰되는 지속적으로 점진적인 만성 및 퇴행성 염증 또는 바이러스 등의 감염 등으로 인해 노인층에서 관찰되는 사이토카인 폭풍을 동반하는 과다증폭성 염증을 포함하며, 상기 섬유화증 및 경화증은 간, 폐 또는 신장 관련 질환을 포함하며, 상기 암은 선노화 항암 치료법(prosenescence anti-cancer therapy)을 통해 노화된 암세포를 제거함으로써 억제 및 치료되는 것이고 암, 초기암, 암의 예방, 재발, 전이, 저항성, 악성화 또는 후유증을 포함하며, 상기 피부 노화 및 이와 관련된 질환 및 장애는 주름, 탄력저하, 탈모, 모피악화, 기미, 잡티, 모반, 반점, 반색, 색소침착, 사마귀, 두드러기, 모공악화 또는 상처치유저하를 포함할 수 있다.
상기 노쇠와 관련해서, 노쇠는 예컨대, 최근 R54 코드가 부여된 구체적인 질병으로서, 노화에 따라 인지 및 기억 장애를 동반하거나 또는 동반하지 않은 상태에서 발생하는 노년피로, 쇠약, 무력증, 비활동성, 근력약화, 보행장애 등의 증상이 나타난다. 공지된 증상 지표(https://en.wikipedia.org/wiki/Frailty_syndrome)에 의해서 노쇠를 분석할 수 있다.
이하, 노화세포 제거용 조성물에 의해 억제, 개선 및 치료 효과를 보인다고 공지된 다양한 질환 및 장애의 종류를 구체적으로 나타내었다.
암(cancer), 초기암(pre-cancerous/pre-malignant condition), 암예방, 암재발(relapse), 암전이(metastasis), 암저항성(resistance), 암악성화, 각종 증식이상질병 등의 증식 질환 및 장애; 관절염(arthritis), 골관절염(osteoarthritis), 류마티스관절염(rheumatoid arthritis), 퇴행성관절연골(degenerative articular cartilage), 염증성장질병(inflammatory bowel disease), 궤양성대장염(ulcerative colitis), 크론병(crohn's disease), 점막염(mucositis), 구강점막염(oral mucositis), 만성췌장염(chronic pancreatitis), 건병증(tendinopathy), 건증(tendinosis), 건염(tendonitis, tendinitis), 노화염증(inflamm-aging), 과다증폭성염증(amplified hyperinflammation), 코로나바이러스감염증/합병증(COVID19 infection/complication) 등의 염증 또는 자가면역 질환 및 장애; 기억감퇴, (경도)인지장애(cognitive decline dysfunction), 퇴행성뇌질병, 치매(dementia), 알츠하이머병(alzheimer's disease), 파킨스병(parkinson's disease), 헌팅턴병(huntington's disease), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis), 근위축성측색경화증, 원발측삭경화증, 운동신경질병장애, 진행성핵상(성)마비(progressive supranuclear palsy), 진행성구마비, 가성구마비, 진행성근육위축증, 하위운동신경증, 척수성위축증, 척수손상(spinal cord injury), 만성통증(chronic pain), 폴리오후증후군, 강직성하반신마비, 불안(anxiety), 우울증(depression), 신경정신병적장애(neuropsychiatric dysfunction), (외상후)스트레스장애(post-traumatic stress disorder), 수면장애 등의 신경 질환 및 장애; 비만(obesity), 당뇨(diabetes), 당뇨성궤양(diabetic ulcer), 당뇨성심근병증(diabetic cardiomyopathy), 골다공증(osteoporosis), 장내마이크로바이옴장애(intestinal bowel disease, intestinal bowel microbiome disorder), 지방이영양증, 각종 대사증후군 등의 대사 질환 및 장애; 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 심부전증(heart failure), 울혈성심부전증(congestive heart failure), 심근경색(myocardial infarction), 심근증(cardiomyopathy), 심근비대증(cardiomyocyte hypertrophy), 심장기능장애(cardiac dysfunction), 심장저항성감소(loss of cardiac stress tolerance), 심장부하저항, 심방세동이상, 협심증, 관상동맥류(coronary artery aneurysm), 대동맥류(aortic aneurysm), 부정맥, 경동맥협착증(carotid artery stenosis), 경막동정맥루(AV fistulae), 관상동맥질병, 말초혈관질병, 신장혈관협착증(renal artery stenosis), 죽상경화증, 신생내막증식증(neointimal hyperplasia), 고혈압(hypertension), 혈관기능장애(age-related vascular dysfunction), 혈관석회화(vascular hyporeactivity/calcification), 혈액응고장애, 뇌동맥류(brain aneurysm), 뇌졸증(stroke), 혈전증(thrombosis), 심내막염, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 승모판탈출증 등의 심혈관 질환 및 장애; 만성폐쇄성폐질병(chronic obstructive pulmonary disease), 만성폐염증, 폐부전증, 폐기능저하, 폐기종(emphysema), 기관지확장증(bronchiectasis), 과산소성폐손상(hyperoxic lung injury), 기관지폐이형성증(bronchopulmonary dysplasia), 호흡곤란증후군(respiratory distress syndrome), 폐고혈압(pulmonary hypertension), 천식(asthma), 바이러스성폐렴(viral pneumonia) 등의 폐 질환 및 장애; 신장병증(nephropathy), 면역글로블린A신병증(immunoglobulin A nephropathy), 신장부전증(renal failure/dysfunction), 사구체경화증(glomerulosclerosis), 만성신장질병(chronic kidney disease), 당뇨성(만성)신장질병(diabetic chronic kidney disease), 신장결석(kidney stone disease) 등의 신장 질환 및 장애; 간병증(cirrhosis), 지방간(fatty liver), 간염, 간지방증(hepatic steatosis), 비알콜성지방간(nonalcoholic fatty liver disease), 비알콜성지방간염(nonalcoholic steatohepatitis), 간장병(hepatopathy), 간경변증, 원발경화성담관염(primary sclerosing cholangitis), 원발성담즙성경변증(primary biliary cirrhosis), 간성뇌증(hepatic encephalopathy) 등의 간 질환 및 장애; 백내장(cataract), 녹내장(glaucoma), 황반변성(macular degeneration), 황반부종, 망막퇴행성질병(retinal degenerative disease), 당뇨성망막질병(diabetic retinopathy), 당뇨성황반부종(diabetic macular edema), 노안, 안구건조증(dry eye disease), 시력손실(age-related vision loss), 충혈(hyperemia) 등의 안구 질환 및 장애; 피부노화(skin aging), 주름(wrinkle), 탄력저하, 표피위축(epidermal atrophy), 탈모(hair loss, allopecia), 모피악화, 기미(melasma), 잡티, 모반(skin naevi), 반점(liver spot), 반색, 색소침착(pigmentation), 사마귀, 두드러기, 모공악화, 상처치유저하, 건선(psoriasis), 포진, 소양증, 감각장애, 습진, 발진, 피부염, 호산구피부병, 면역수포성피부병, 포창, 천포창, 유천포창, 낭창(lupus), 수포, 켈로이드, 피부섬유조직구증식, 아토피성피부염, 피부림프종, 피부루푸스, 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematosus), 홍색피부증, 편평태선, 태선모양피부병, 반응성호중구피부병, 딸기코, 백반증, 보통비늘증, 잇몸노화(senescence in gingival tissues), 피부근염, 광선각화증, 광감각 및 광노화 관련 질병 등의 피부 질환 및 장애; 줄기세포/골수/장기/조직의 재생유지 질환 및 장애, 골수저형성증, 골수증, 염증 등 면역조절 질환 및 장애, 근감소증(sarcopenia) 등 각종 장기/조직의 파손 및 기능저하 등의 재생유지 관련 질환 및 장애; 이식편대숙주질병(graft-versus-host reaction or disease), 각막동종이식편거부(corneal allograft rejection) 등 줄기세포/골수/장기/조직/세포의 이식(transplantation) 질환 및 장애, 이식거부반응 등 외래물질/소재의 이식 질환 및 장애, 염증 등 면역조절 질환 및 장애, 각종 장기/조직의 파손 및 기능저하 등의 외래이식 관련 질환 및 장애; 특발성폐섬유화증(idiopathic pulmonary fibrosis), 낭포성섬유화증(cystic fibrosis), 폐섬유화증(pulmonary fibrosis), 신장섬유화증(renal fibrosis), 신장세뇨관섬유화증(tubulointerstitial fibrosis), 간섬유화증(liver fibrosis), 심장섬유화증(cardiac fibrosis), 췌장섬유화증(pancreatic fibrosis), 자궁섬유화증(uterine fibrosis), 구강점막하섬유증, 근섬유화증(muscle fibrosis), 신경교섬유화증, 복막후섬유화증, 골수섬유화증, 종격동섬유화증, 켈로이드, 진행성골화섬유형성이상(fibrodysplasia ossificans progressiva) 등의 섬유화증 질환 및 장애; 피부경화증, 전신경화증(systemic sclerosis), 다발성경화증(multiple sclerosis) 등의 경화증 질환 및 장애; 조로증(progerias), 위드만-라우텐스트라우취증후군, 워너증후군(werner syndrome), 허친슨-길포드조로증증후군(hutchinson-gilford progeria syndrome), 로트문드-톰슨증후군, 코케인증후군, 다운증후군(down-syndrome), 각화부전증, 선천성근무력증, 재생불량성빈혈, 관절연골변성 등의 β-갈락토시데이즈 관련 질환 및 장애; 건강수명단축(reduced lifespan/healthspan), 노쇠(frailty), 노화염증(inflamm-aging), 근감소증(sarcopenia), 근위축증(muscular dystrophy), 근섬유화증(muscle fibrosis), 골다공증(osteoporosis), 근육피로장애, 운동실조(ataxia), 골관계장애, 만성염증, 상처치유장애(delayed wound healing), 골절치유장애(delayed fracture healing), 지방이상증(lipodystrophy), 지방위축증(adipose atrophy), 추간판변성증(intervertebral disc degeneration), 추간판탈출증, 척추후만증(kyphosis), 진행성골화섬유형성이상(fibrodysplasia ossificans progressiva), 폐경(menopause), 수전증(tremor), 요실금(urinary incontinence), 배뇨장애, 비장비대증, 전립선비대증(prostatic hypertrophy), 난청/청력상실(hearing loss), 후각/미각기능장애(olfactory dysfunction), 치주질환(periodontal disease) 등의 기타 노인성 질환 및 장애; 방사선/화학/표적/면역요법 등 항암제, 독성 및 부작용이 강한 약물/물질, 비만/당뇨 등 생리적인 교란, 고지방/고당분/고염분 등 식이섭식, 출혈성쇼크, 심근색, 저산소증, 영양결핍, 전쟁, 사고, 흡연, 바이러스/박테리아 등의 감염, 외래이식, 염증, 조직상처, 고열증 등 다양한 급성 및 만성적인 스트레스 요인으로 인한 독성 등을 비롯한 부작용 및 후유증 그리고 이로 인한 질환 및 장애로서, 피로, 쇠약(fatigue), 권태감, 체중감소(weight loss), 신체활동저하, 불안(anxiety), 우울증(depression), 무기력증, 운동실조(ataxia), 악액질(cachexia), 만성염증, 점막염(mucositis), 혈소판감소증(thrombocytopenia), 방사선궤양(radiation ulcers), 골수기능장애, 심장장애(heart functional disorder), 면역장애(immune disorder), 호르몬체계장애, 간/신장합병증(hepato/nephrocomplication), 스트레스신경장애, 간/신장/심장/위장/난소/혈관계/피부독성, 방사선궤양(radiation ulcers), 구역질, 구토, 설사, 말초신경병증(peripheral neuropathy), 실신, 빈혈, 탈모(hair loss, allopecia), 통증, 체액저류, 발진, 피부염, 과색소침착(hyperpigmentation), 거식증, 두드러기, 지방이영양증, 지방위축증(adipose atrophy), 공황장애, 심장근육병증, 울혈성심부전(congestive heart failure), 폐경(menopause), 골다공증(osteoporosis), 불임(infertility), 자간전증(preeclampsia), 임신중독증, 인지장애(cognitive decline dysfunction), 암재발(cancer relapse), 암전이(metastasis), 시력/청력손실(hearing loss), 폐용량감소 등 노화에 따른 상기 각종 노화관련 질환 및 장애 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 노화세포 제거용 조성물은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 셀레늄 화합물의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 염은 인간에 대한 독성이 낮아야 하며, 모 화합물의 생물학적 활성 및 물리화학적 특성에 임의의 부정적인 영향을 주지 않아야 한다. 예를 들어, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 약학적으로 허용가능한 유리 산(free acid)에 의해 형성된 산부가염일 수 있다. 상기 유리 산으로는 무기 산 또는 유기 산을 사용할 수 있으며, 이때 무기 산은 염산, 황산, 질산, 인산, 과염소산, 브롬산 등일 수 있고, 유기 산은 아세트산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 푸마르산, 말레산, 말론산, 프탈산, 석신산, 락트산, 시트르산, 글루콘산, 타르타르산, 살리실산, 말산, 옥살산, 벤조산, 엠본산, 아스파트산, 글루탐산 등일 수 있다. 상기 산부가염은 통상의 방법, 예를 들어 상기 화학식 1의 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조될 수 있다. 또한, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 알칼리금속염(나트륨염 등) 또는 알칼리토금속염(칼륨염 등)일 수 있다. 상기 알칼리금속염 또는 알칼리토금속염은, 예를 들어 상기 화학식 1의 화합물을 과량의 알칼리금속 수산화물 또는 알칼리토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 미용해된 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발 및 건조시켜 얻을 수 있다.
본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 셀레늄 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 노화관련 질환 및 장애의 억제 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 활석, 마그네슘 스테아레이트, 미네랄 오일, 식염수, PBS(phosphate buffered saline) 또는 배지, 나노캡슐, 나노스피어, 나노겔, 하이드로겔, 메조포러스실리카, 리포좀, 엑소좀, 사이클로덱스트린, 마이셀러스(micelles, PLA/PLGA/PCL/PEG/SOL(Soluplus) 등) 등을 포함한 합성 제조된 입자(particle, crystal 등) 및 폴리머체(polymeric complex, capsule, matrix, colloid, amphiphilic graft polymer 등) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 첨가제를 더 포함할 수 있고, 상기 첨가제는, 예를 들면, pH 조절제, 등장액화제, 보존제, 기타 부형제 등일 수 있다.
상기 약학 조성물의 제형은 사용 방법에 따라 달라질 수 있으나, 경고제, 과립제, 산제, 시럽제, 액제, 유동엑스제, 유제, 현탁제, 침제, 정제, 주사제, 캅셀제 및 환제 등으로 제조할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물의 제형은 국소 또는 경피 투여용 제형인 연고, 페이스트, 크림, 로션, 젤, 분말, 용액, 스프레이, 흡입제 또는 패치를 포함한다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 및 필요에 따라서 방부제, 완충제등과 무균 혼합될 수 있다. 본 발명에 따른 연고, 페이스트, 크림 및 젤 제형은 추가적으로 부형제인 동물성 및 식물성 지방, 기름, 왁스, 파라핀, 전분, 토라가칸토, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트 등과 규산, 활석, 산화 아연, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 용어 "억제"는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 노화관련 질환 및 장애를 예방 또는 차단하거나, 억제하거나, 진행을 지연시키는 모든 행위(prevent, inhibit or delay)를 의미하며, "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 노화관련 질환 및 장애의 증상이 개선, 호전 및 이롭게 변경되는 모든 행위(alleviate, reverse or treat)를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 치료학적으로 유효한 양 또는 약학적으로 유효한 양으로 환자에 투여될 수 있다.
여기서 "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약학적으로 유효한 양"이란 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 화합물 또는 조성물의 양으로서, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 또한, 상기 "유효한 양"은 생체 외(in vitro) 또는 생체 내(in vivo) 어떤 쪽이든 노화관련 질환에서 노화세포의 활성을 억제 또는 줄이기에 충분한 양을 말한다. 상기 유효량의 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 임의의 적합한 경로에 의하여 이러한 경로에 적당한 약학 조성물의 형태, 그리고 의도된 치료를 위하여 효과적인 투여량으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 노화세포 제거용 조성물은 체외에서 노화세포를 제거하기 위한 것일 수 있고, 이에 따라 본 발명은 체외에서 노화세포를 제거하기 위한 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 노화세포 제거용 조성물은 피부 재생용 화장품 조성물로 사용될 수 있고, 이에 따라 본 발명은 피부 재생용 화장품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 노화세포 제거용 조성물을 자연적으로 노화된 세포에 처리할 경우, 피부 노화를 야기하는 인자(SASP)의 발현 및 분비를 효과적으로 억제 및 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 노화세포 제거용 조성물을 자연적으로 노화된 마우스에 처리할 경우, 피부 노화 등을 효과적으로 개선시킬 수 있다.
따라서, 노화세포는 여러 인자(SASP)을 분비해서 노화세포를 점차 확산 및 축적시켜서 피부에서 발생하는 여러 노화 증상(피부노화, 주름, 탄력저하, 탈모, 모피악화, 기미, 잡티, 모반, 반점, 반색, 색소침착, 사마귀, 두더러기, 모공악화, 상처치유저하, 건선, 포진, 소양증, 감각장애, 면역저하, 습진, 발진, 피부염, 호산구피부병, 면역수포성피부병, 포창, 천포창, 유천포창, 낭창, 수포, 섬유화증, 켈로이드, 피부섬유조직구증식, 아토피성피부염, 피부림프종, 피부루푸스, 광감각 및 광노화관련 질환 및 장애, 각종 피부병 등)을 유발한다. 이에, 노화세포를 제거하면 피부 노화를 억제, 개선 및 재생할 수 있다.
구체적인 예로서, 본 발명의 화장품 조성물은 피부노화, 주름, 탄력저하, 탈모, 모피악화, 기미, 잡티, 모반, 반점, 반색, 색소침착, 사마귀, 두드러기, 모공악화 또는 상처치유저하 등을 억제, 개선 또는 재생할 수 있다.
본 발명에 따른 노화세포 제거용 조성물을 화장품 조성물로 사용하기 위해서는, 필요에 따라 당업계에서 통상적으로 제조되는 제형으로 제제화시킬 수 있다.
상기 화장품 조성물은 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제제화될 수 있다. 또한, 상기 화장품 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 담체 성분을 포함할 수 있다.
또한, 상기 화장품 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 용매, 용매화제, 유탁화제 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 담체 성분을 포함할 수 있다. 이의 예로는, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄 지방산 에스테르 및 이의 혼합물 등을 들 수 있다.
또한, 상기 화장품 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미세결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라가칸트 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 담체 성분을 포함할 수 있다. 상기 담체 성분은 상기 화장품 조성물 총 중량을 기준으로 약 1 내지 약 99.99 중량%, 바람직하게는 약 80 중량% 내지 약 90 중량%로 포함될 수 있다.
또한, 상기 화장품 조성물은 연고제, 액제, 크림제, 스프레이제, 패취제 등과 같은 피부 외용제 제형일 수 있다.
상기 화장품 조성물은 제형에 따라 피부에 직접 도포하거나, 분무하여 적용할 수 있다. 이때, 상기 화장품 조성물의 도포량 및 하루 사용 횟수는, 사용자의 연령, 성별, 용도, 피부 상태 등에 따라 적절하게 설정될 수 있다.
본 발명에 따른 노화세포 제거용 조성물은 건강기능식품으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 상기 화학식 1로 표시되는 셀레늄 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 노화관련 질환 및 장애 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 건강기능식품의 종류는 각종 식품류, 음료류, 껌류, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등일 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품의 형태는 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태일 수 있으며, 건강 기능 개선 및 증진을 위해 기타 천연 또는 합성 물질 및 제품화를 위한 첨가물 등을 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 건강음료에 포함되는 액체 성분으로는 노화세포 제거용 조성물의 효능을 저해하지 않으면 제한하지 않으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다.
상기 천연 탄수화물은 예를 들어 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드; 말토오스, 수크로오스 등의 폴리사카라이드; 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 당; 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜을 들 수 있다.
이외에도, 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
또한, 건강기능식품은 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 노화세포 제거용 조성물은 동물용 의약품, 동물용 피부 외용제 또는 동물용 건강기능식품으로 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은, 상기 화학식 1로 표시되는 셀레늄 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 노화관련 질환 및 장애 개선용 동물용 제품 조성물을 제공한다. 상기 동물용 제품 조성물은 동물용 의약품, 동물용 피부 외용제 또는 동물용 건강기능식품일 수 있다.
상기 동물용 의약품은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 경구적으로 수용가능한 복용 형태인 캡슐제, 정제, 산제, 액제, 시럽제 등으로 제조될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 이에 제한되는 것은 아니나, 전분, 락토스, 말토스, 자당, 과당, 덱스트로스, 말토덱스트린, 설탕, 구연산, 사과산, 기타 음료용 향료 등의 감미료, 만니톨, 솔비톨, 자일리톨 등의 당알콜, 또는 디칼슘 포스페이트, 칼슘 설페이트, 칼슘 카보네이트, 마이크로결정 셀룰로스 등을 포함할 수 있다. 상기 동물용 피부 외용제는 연고제, 액제, 크림제, 스프레이제, 패취제 등과 같은 제형일 수 있다. 상기 동물용 피부 외용제는 제형에 따라 피부에 직접 도포하거나, 분무하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 상기 동물용 피부 외용제의 도포량 및 하루 사용 횟수는, 개체의 연령, 성별, 용도, 피부 및 모질 상태 등에 따라 적절하게 설정될 수 있다. 상기 동물용 건강기능식품은 동물 사료 첨가제일 수 있다. 상기 동물 사료 첨가제는 사료 검정 기준에 따라 허용되는 첨가제들을 추가로 첨가할 수 있고, 개체의 건강 상태에 따라 급여량, 급여횟수 등을 조절할 수 있다.
이와 같이 본 발명에 따른 노화세포 제거용 조성물은 의약품, 화장품(예를 들어 피부 재생용 화장품), 건강기능식품 또는 동물용 제품에 사용될 수 있다.
상기 내용을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 실시예의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 노화된 인간세포에서 노화세포 제거
실시예 1-1. 세포의 노화 유도
나이가 들어감에 따라 내부 및 외부 요인에 의해 인체에 축적되는 노화세포가 분비하는 병적인 인자(SASP)들로 인해서, 노화관련 질환 및 장애가 발생된다. 이 과정에서 근원적인 역할을 하는 노화세포를 셀레늄 화합물이 제거하는지 확인하기 위해, 노화세포를 노화관련 표지인자인 SA-β-gal로 염색하였다. 이와 같은 셀레늄 화합물의 작용을 도 1에 나타내었다.
구체적으로, 인간으로부터 유래된 포피세포(foreskin, 입수처-충남의대)를 지정된 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, 구입처-ATCC; 10% FBS, 구입처-GenDEPOT; 100 U/ml Penicillin & Streptomycin, 구입처-Invitrogen)에서 배양한 다음, 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹인 독소루비신(doxorubicin, DOX)을 250 nM 농도로 24시간 동안 처리하고, 7일 동안 추가 배양하여, 노화를 유도하였다. 노화를 유도하지 않은 대조군(-)은 DMSO만을 처리하였다. 노화된 세포의 비율을 측정하기 위하여, 독소루비신 및 대조군을 처리한 세포를 24 well plate에 접종하고 24시간 동안 안정화시킨 다음, 노화관련 표지인자인 SA-β-gal을 키트(구입처-Cell Signaling Technology)를 사용해서 염색하고, 광학 현미경을 통해 SA-β-gal이 염색된 노화세포의 비율을 측정하여 표 1에 나타내었다.
SA-β-gal(%) - 9.0 (±5.0)
DOX 90.0 (±7.0)
그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 대조군(-)에 비해 독소루비신(DOX)을 처리한 세포에서의 노화관련 표지인자(SA-β-gal)의 비율이 크게 증가하였으며, 더 이상 세포 성장을 하지 않았다. 이로부터, 노화가 유도된 것을 확인하였다.
실시예 1-2. LX-112의 노화된 세포 제거
실시예 1-1과 동일한 방법으로 독소루비신 및 대조군을 처리하고 배양한 세포에 LX-112(구입처-BOC)를 0 μM, 1.1 μM, 3.3 μM, 10 μM의 농도로 각각 처리하고 3일 후에 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(구입처-Promega)를 이용해서 세포 생존률 및 성장률을 측정하여 표 2 및 표 3에 나타내었다. 이때, 표 3의 N0는 LX-112 처리 전 세포수를 100%로 산정한 것이다.
LX 0 μM 1.1 μM 3.3 μM 10 μM
Survival (%) 100.2 (±4.0) 67.2 (±7.0) 27.0 (±4.0) 1.0 (±4.0)
LX N0 0 μM 1.1 μM 3.3 μM 10 μM
Growth (%) 100.0 (±11.0) 253.0 (±4.0) 201.0 (±8.0) 161 (±7.0) 123.3 (±8.0)
그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 독소루비신을 처리해서 노화가 유도된 세포에서 LX-112의 농도가 높을수록 세포 생존률이 급격히 감소하였다. 또한, 표 3에 나타난 바와 같이, 대조군을 처리해서 노화가 유도되지 않은 세포에서 LX-112를 다양한 농도로 처리하여도 세포 생존률에 커다란 변화가 없었고, 정상적으로 세포가 성장하였다. 이와 같은 체세포뿐만 아니라, LX-112에 의한 노화세포의 사멸은 줄기세포(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, 구입처-ATCC)에서도 10 μM의 농도에서 50% 정도로 확인하였다. 이로부터, LX-112가 노화세포의 사멸을 유도해 노화세포를 효과적으로 제거할 수 있음을 확인하였다.
실시예 2. 노화된 인간 암세포 및 종양에서 LX-112의 노화세포 제거
실시예 2-1. 암세포의 노화 유도
인간으로부터 유래된 골육종(osteosarcoma) 암세포주인 SAOS-2(구입처-ATCC)를 지정된 배지(DMEM, 구입처- GenDEPOT; 10% FBS, 구입처- GenDEPOT; 100 U/ml Penicillin & Streptomycin, 구입처-Invitrogen)에서 배양한 다음, 실시예 1-1과 동일한 방법으로 노화를 유도한 다음, 세포의 노화관련 표지인자(SA-β-gal)의 비율을 측정하여 표 4에 결과를 나타내었다.
SA-β-gal(%) - 5.0 (±6.0)
DOX 66.0 (±5.0)
그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이, 대조군(-)에 비해 독소루비신(DOX)을 처리한 세포에서의 노화관련 표지인자(SA-β-gal)의 비율이 크게 증가하였으며, 더 이상 세포 성장을 하지 않았다. 이로부터, 노화가 유도된 것을 확인하였다.
실시예 2-2. LX-112의 노화된 암세포 제거
골육종을 포함하는 다양한 암 치료의 표준은 반복적인 화학 요법의 시행이다. 이에, 실시예 2-1과 동일한 방법으로 SAOS-2에 노화를 유도한 다음, (i) 독소루비신을 다시 처리하거나(DOX→DOX) (ii) LX-112(5 μM) 조성물을 처리하였다(DOX→LX-112). 그 후, 3일(3d) 및 7일(7d) 이후에 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(구입처-Promega)를 이용해서 세포 생존률을 측정하여 표 5 및 표 6에 결과를 나타내었다.
- DOX→DOX
3d 7d
Survival (%) 100.0 (±6.0) 72.0 (±7.0) 55.0 (±5.0)
- DOX→LX
3d 7d
Survival (%) 100 (±3.0) 35.0 (±4.0) 14.0 (±5.0)
그 결과, 표 5 및 표 6에 나타난 바와 같이, 세포내 항암 유전자인 Rb 및 p53이 결손된 SAOS-2에 독소루비신을 반복 처리한 경우(DOX→DOX)보다 독소루비신과 LX-112를 병용 및 순차 처리한 경우(DOX→LX-112)가 더욱 효과적으로 암세포의 생존률을 감소시켰다. 이로부터, 화학 요법으로 항암제를 반복 처리하는 경우보다 노화를 유도하는 항암제 및 노화세포 제거용 조성물인 LX-112를 병용 및 순차 처리하는 경우에서 보다 효과적인 항암 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 2-3. 마우스에서 LX-112의 노화된 종양 억제
7주령의 수컷 BALB/c 누드 마우스(구입처-KRIBB 실험동물자원센터)를 1주일 동안 실험 환경에 적응시킨 후, 마우스를 실험군 및 대조군으로 무작위화하였다. 실시예 2-1과 동일한 방법으로 배양한 인간 골육종암세포주인 SAOS-2 (106개 세포)를 PBS(구입처- Welgene)에 섞은 다음, 2% 아이소플루레인(isoflurane, 구입처-Sigma)을 이용하여 마취된 마우스의 피하에 투여하였다. 종양의 크기가 50 mm2 정도 되었을 때, 독소루비신을 10 mg/kg의 농도로 증류수와 PBS(pH 7.2)의 1:1 용액에 섞어서 복강으로 투여하여 종양의 노화를 유도하였다. 10일 후에 100 mg/kg 농도로 0.5% CMC-Na 용액(구입처-Sigma)에 섞은 LX-112를 21일 동안 매일 경구로 투여한 다음, 종양의 크기를 측정하였다. 대조군은 독소루비신을 섞은 용액을 반복해서 투여한 다음, 종양의 크기를 측정하였다. 표 7에 이를 비교해서 결과를 나타내었다.
Tumor Diameter (mm) DOX→DOX 15.4 (±1.2)
DOX→LX 6.2 (±4.8)
그 결과, 표 7에 나타난 바와 같이, 마우스에서 노화를 유도한 종양에 LX-112를 처리(DOX→LX)한 경우가 독소루비신을 반복해서 처리(DOX→DOX)한 경우에 비해서 종양의 크기를 더욱 효과적으로 억제 및 감소시켰다. 이로부터, 마우스에서 화학 요법으로 항암제를 반복 처리하는 경우보다 형성된 종양에 노화를 유도하고 노화세포 제거용 조성물인 LX-112를 처리함으로써 보다 효과적인 항암 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 3. 노화된 인간세포에서 LX-112의 노화세포 제거
실시예 3-1. 세포의 자연적 노화 유도
인간으로부터 유래된 포피세포를 지정된 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, 구입처-ATCC; 10% FBS, 구입처-GenDEPOT; 100 U/ml Penicillin & Streptomycin, 구입처-Invitrogen)에서 더 이상 성장하지 않을 때까지 계대 배양(REP; replicative senescence)하여 자연적인 노화를 유도하였다. 대조군(-)으로 자연적 노화 유도 이전의 포피세포를 사용하였다. 이후, 실시예 1-1과 동일한 방법으로 세포의 노화관련 표지인자(SA-β-gal)의 비율을 측정하여 표 8에 결과를 나타내었다.
SA-β-gal(%) - 7.2 (±2.0)
REP 93.8 (±5.0)
그 결과, 표 8에 나타난 바와 같이, 연속적으로 더 이상 성장하지 않을 때까지 계대 배양(REP)한 세포에서 노화관련 표지인자(SA-β-gal)의 비율이 크게 증가하였다. 이로부터, 노화가 유도된 것을 확인하였다.
실시예 3-2. LX-112의 노화된 세포 제거
실시예 3-1과 동일한 방법으로 인간유래 포피세포의 자연적 노화를 유도한 다음, LX-112를 0 μM, 1.1 μM, 3.3 μM, 10 μM의 농도로 처리하고 3일 후에 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(구입처-Promega)를 이용해서 세포 생존률은 표 9에, 노화가 유도되지 않은 세포에 대한 세포 성장률을 측정해 표 10에 나타내었다. 이때, 표 10에서 N0는 LX-112 처리 전 세포수를 100%로 산정한 것이다.
LX 0 μM 1.1 μM 3.3 μM 10 μM
Survival (%) 100.5 (±4.0) 59.0 (±6.0) 29.0 (±5.0) 1.0 (±9.0)
LX N0 0 μM 1.1 μM 3.3 μM 10 μM
Growth (%) 100.0 (±6.0) 262.0 (±13.0) 206.0 (±15.0) 151.0 (±12.0) 122.7 (±16.0)
그 결과, 표 9 및 표 10에 나타난 바와 같이, 노화가 유도된 세포에서 LX-112의 농도가 높을수록 세포 생존률이 급격히 감소하였고, 노화가 유도되지 않은 세포에서는 LX-112를 다양한 농도로 처리하여도 세포 생존률에 변화가 없었고, 정상적으로 세포가 성장하였다. 이로부터, LX-112가 노화세포의 사멸을 유도해 노화된 세포를 효과적으로 제거하는 것을 확인하였다.
실시예 4. LX-112의 노화세포에서 발현되는 노화관련 표지인자의 양 감소
실시예 3와 동일한 방법으로, 인간 포피세포의 자연적 노화를 유도하고 3 μM의 농도로 LX-112를 처리한 다음, qRT-PCR(quantitative real-time PCR)로 노화관련 표지인자인 p16 및 p21의 mRNA 양을 측정하였다. 대조군으로는 노화 유도 이전의 포피세포를 사용하였다. 구체적으로, 세포를 수거해서 TRIzol Reagent(구입처-Thermo Fisher Scientific)를 처리하여 전체 RNA를 추출하였다. 추출된 전체 RNA 농도는 Nanodrop(구입처-Micro Digital)을 이용하여 정량하였다. SuperScript IV VILO Master Mix with ezDNase Enzyme(구입처-Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 추출된 전체 RNA에서 지노믹(genomic) DNA를 제거하고 cDNA를 제조하였다. 합성된 cDNA를 이용하여 하우스키핑 유전자인 GAPDH를 표준화 잣대로 사용해서 p16 및 p21 등에 관한 qRT-PCR을 SFCgreen I qPCR Master Mix(구입처-SFC Probe)를 사용해서 수행하였고, CFX Connect Real-Time PCR Detection System(구입처-Bio Rad)을 사용해서 분석하였다. 표 11은 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 12는 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노화관련 표지인자인 p16 및 p21의 mRNA 양을 나타낸 결과이다. 표 12는 노화가 유도된 후의 p16 및 p21의 mRNA 양을 각각 100%로 산정해서, LX-112를 처리한 후의 p16 및 p21의 mRNA 양과 비교하였다. 사용된 프라이머는 바이오닉스를 통해 합성하였고, 서열은 하기 표 13에 나타내었다.
mRNA (Fold) p16 p21
- 1.0 (±0.1) 1.0 (±0.3)
REP 5.0 (±0.5) 4.0 (±0.2)
mRNA (%) p16 p21
- 100.0 (±4.0) 100.0 (±6.0)
LX 43.0 (±4.0) 39.0 (±7.0)
Gene Primer 1 서열번호 Primer 2 서열번호
GAPDH GGAAGGGCTCATGACCACAG 1 ACAGTCTTCTGGGTGGCAGTG 2
p16 TGAGCTTTGGTTCTGCCATT 3 AGCTGTCGACTTCATGACAAG 4
p21 GAGACTAAGGCAGAAGATGTAGAG 5 GCAGACCAGCATGACAGAT 6
그 결과, 표 11에 나타난 바와 같이, 세포에서 노화가 유도되면 p16 및 p21의 mRNA 양이 급격히 증가하였다. 또한, 표 12에 나타난 바와 같이, 노화가 유도된 포피세포에 LX-112를 처리하면 p16 및 p21의 mRNA 양이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 세포 노화에 따라 증가하는 노화관련 표지인자인 p16 및 p21의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.
실시예 5. LX-112의 노화세포에서 발현 및 분비되는 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)들의 양 감소
실시예 3과 동일한 방법으로, 인간 포피세포의 자연적 노화를 유도하고 3 μM의 농도로 LX-112를 처리한 다음, 수득한 배양액을 이용해서 면역 검정법(ProcartaPlex Immunoassay, 구입처-Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)인 IL1α, IL1β, IL6, IL10, MCP1, PAI1 VCAM1, MMP1, MMP2, MMP3, MMP12, TGFβ의 발현량을 측정하였다. 표 14는 노화를 유도하기 이전(-) 및 이후(REP)에, 표 15는 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 각각의 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)의 양을 나타낸 결과이다. 표 15는 노화가 유도된 후의 각각의 인자의 양을 각각 100%로 산정해서, LX-112를 처리한 후의 각각의 인자의 양과 비교하였다.
Protein (Fold) IL1α IL1β IL6 IL10 MCP1 PAI1
- 1.0 (±0.3) 1.0 (±0.2) 1.0 (±0.1) 1.0 (±0.1) 1.0 (±0.2) 1.0 (±0.1)
REP 14.0 (±6.0) 11.0 (±3.0) 64.0 (±6.0) 16.0 (±4.0) 25.0 (±5.0) 69.0 (±9.0)
Protein (Fold) VCAM1 MMP1 MMP2 MMP3 MMP12 TGFβ
- 1.0 (±0.2) 1.0 (±0.1) 1.0 (±0.1) 1.0 (±0.2) 1.0 (±0.2) 1.0 (±0.1)
REP 32.0 (±4.0) 3.6 (±1.0) 18.0 (±8.0) 48.2 (±8.0) 13.0 (±4.0) 151.0 (±9.0)
Protein (%) IL1α IL1β IL6 IL10 MCP1 PAI1
- 100.0 (±4.0) 100.0 (±3.0) 100.0 (±6.0) 100.0 (±4.0) 100.0 (±3.0) 100.0 (±7.0)
LX 57.0 (±5.0) 46.0 (±6.0) 41.0 (±4.0) 57.0 (±7.0) 38.0 (±8.0) 41.0 (±4.0)
Protein (%) VCAM1 MMP1 MMP2 MMP3 MMP12 TGFβ
- 100.0 (±5.0) 100.0 (±2.0) 100.0 (±8.0) 100.0 (±4.0) 100.0 (±3.0) 100.0 (±4.0)
LX 45.0 (±5.0) 43.0 (±3.0) 39.0 (±9.0) 38.0 (±8.0) 41.0 (±6.0) 49.0 (±9.0)
그 결과, 표 14에 나타난 바와 같이, 세포에서 노화가 유도되면 IL1α, IL1β, IL6, IL10, MCP1, PAI1 VCAM1, MMP1, MMP2, MMP3, MMP12, TGFβ의 발현량이 급격히 증가하였다. 또한, 표 15에 나타난 바와 같이, 노화가 유도된 포피세포에 LX-112를 처리하면 각각의 인자의 양이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 세포 노화에 따라 증가하는 다양한 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.
실시예 6. 노화관련 분비인자(SASP)에 의한 섬유화증 유도 및 마우스에서 LX-112의 섬유화증 억제
실시예 6-1. 노화세포에서 발현 및 분비되는 노화관련 분비인자(SASP)에 의한 정상세포의 섬유화증 유도
실시예 5와 동일한 방법으로 자연적인 노화가 유도된 인간 포피세포의 배양액(REP)을 수득하여, 노화가 유도되지 않고 정상적으로 성장하는 포피세포에 1일 동안 처리하였다. 그 다음, 실시예 4와 동일한 방법으로 qRT-PCR로 노화관련 섬유화증 인자인 ACTA2, COL1A1, COL1A2, FN1 및 SDF1의 mRNA 양을 측정하여 표 16에 나타내었다. 대조군(-)은 노화세포의 배양액을 처리하지 않은 포피세포를 사용하였다. 사용된 프라이머는 바이오닉스를 통해 합성하였고, 서열은 하기 표 17에 나타내었다.
mRNA (Fold) ACTA2 COL1A1 COL1A2 FN1 SDF1
- 1.0 (±0.3) 1.0 (±0.2) 1.0 (±0.1) 1.0 (±0.2) 1.0 (±0.2)
REP 3.3 (±0.5) 4.5 (±0.6) 3.9 (±1.0) 4.1 (±0.4) 0.2 (±0.4)
Gene Primer 1 서열번호 Primer 2 서열번호
ACTA2 GTGAAGAAGAGGACAGCACTG 7 CCCATTCCCACCATCACC 8
COL1A1 AAGGGACACAGAGGTTTCAGTGG 9 CAGCACCAGTAGCACCATCATTTC 10
COL1A2 CTTGCAGTAACCTTATGCCTAGCA 11 CCCATCTAACCTCTCTACCCAGTCT 12
FN1 TGTCAGTCAAAGCAAGCCCG 13 TTAGGACGCTCATAAGTGTCACCC 14
SDF1 TGCCAGAGCCAACGTCAAG 39 CAGCCGGGCTACAATCTGAA 40
그 결과, 표 16에 나타난 바와 같이, 노화관련 분비인자(SASP)에 의해 조절되는 인자에는 섬유화증 및 색소침착의 조절 인자인 ACTA2, COL1A1, COL1A2, FN1 및 SDF1 등이 포함되어 존재하는 것을 확인하였다. 이로부터, 노화에 의해 섬유화증을 유도하는 인자들의 양이 증가되는 것을 확인하였다. 노화에 의해 색소침착을 억제하는 SDF1의 양이 감소되는 것을 확인하였다.
실시예 6-2. 마우스에서 LX-112의 섬유화증 억제
8주령의 수컷 C57BL6J 마우스(구입처-KRIBB 실험동물자원센터)를 1주일 동안 실험 환경에 적응시킨 후, 마우스를 실험군 및 대조군으로 무작위화하였다. 복막의 섬유화증을 유도하기 위해서 0.1% 클로르헥시딘 글루코네이트 (chlorhexidine gluconate, CHG, 구입처-Sigma)를 15% 에탄올 인산완충용액에 녹여서 10 ml/kg 농도로 2일 간격으로 20일 동안 복강으로 투여하였다. 9일째부터 LX-112는 0.5% CMC-Na 용액(구입처-Sigma)에 섞어서 매일 70 mg/kg 농도로 복강으로 투여하였다. 대조군(-)은 동일한 부피로 용액만을 투여하였다. 20일째, 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 용액에 고정시켜 제작한 복막 조직의 파라핀(paraffin) 절편을 H/E(Hematoxylin/Eosin) 및 트리크롬(trichrome)으로 염색하고, 광학 현미경으로 복막 중피세포층의 두께를 측정하였다. 표 18은 클로로헥시딘 글루코네이트(CHG)에 의해 복막 섬유화증이 유도된 마우스에 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 복막 중피세포층의 두께를 정량적으로 나타낸 결과이다.
Submesothelial Thickness (μm) - - 10.0 (±1.1)
CHG - 69.1 (±6.4)
LX 43.1 (±10.4)
그 결과, 표 18에 나타난 바와 같이, 클로르헥시딘 글루코네이트에 의해 복막의 두께가 증가하였고, LX-112는 증가된 두께를 억제 및 감소시켰다. 이로부터, LX-112가 섬유화증을 효과적으로 억제 및 치료함을 확인하였다.
실시예 7. 자연적으로 유도된 노화 마우스에서 LX-112의 노화세포 제거 및 관련 노화 억제 활성
실시예 7-1. 자연적으로 유도된 노화 마우스 모델의 확립
22개월령의 암컷 C57BL6J 마우스(구입처-KRIBB 실험동물자원센터)를 1주일 동안 실험 환경에 적응시킨 후, 노화 마우스를 실험군 및 대조군으로 무작위화하였다. 8주령의 마우스를 노화되지 않은 마우스를 대조군으로 사용하였다. LX-112는 0.5% CMC-Na 용액(구입처-Sigma)에 섞어서 21일 동안 매일 70 mg/kg 농도로 구강으로 투여하였다. 대조군은 동일한 부피로 용액만을 투여하였다. 약물 투여 종료 후, 하기 각각의 실시예에 기재된 방법을 수행하였다.
실시예 7-2. LX-112의 노화관련 표지인자(p16)의 양 감소
마우스를 희생시키고 각 부위의 장기 조직에서 RNA를 추출하여 합성된 cDNA를 이용하여 qRT-PCR을 수행하였다. 구체적으로, RNA 추출 과정에서 RNA의 퀄리티를 유지하기 위하여 채취한 각 부위의 조직은 즉시 30 mg 내지 50 mg 크기로 절단하여 RNA 안정화 용액(구입처-Thermo Fisher Scientific)에 넣고 1일 동안 조직에 흡수시킨 후, 사용 전까지 -80℃에서 보관하였다. 채취한 조직은 조직 균질용 비드(bead)가 포함된 튜브(구입처-엠피바이오)에 용해액과 함께 넣고, 조직 균질(homogenization) 장비(구입처-엠피바이오)를 이용하여 균질화하였다. 균질화된 조직으로부터 전체 RNA를 추출하였으며, 추출 방법은 간, 신장, 폐, 뇌 등을 포함하는 연조직(soft tissue)는 RNA 추출 키트(PureLink RNA Mini Kit, 구입처-Thermo Fisher Scientific)를 사용하였고, 근육, 피부, 지방 등을 포함하는 경조직(hard tissue)는 TRIzol Reagent(구입처-Thermo Fisher Scientific)를 사용하였다. 추출된 전체 RNA 농도는 Nanodrop(구입처-Micro Digital) 또는 SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader(구입처-Molecular Device)를 이용하여 정량하였다. 추출된 전체 RNA는 cDNA 합성 키트(구입처-Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 지노믹(genomic) DNA를 제거하고 cDNA를 제조하였다. 합성된 cDNA를 이용하여 하우스키핑 유전자인 β-actin을 표준화 기준으로 하여 각 유전자 별로 qRT-PCR을 Taqman Fast Abvanced Master Mix(구입처-Applied Biosystems), SFCgreen I qPCR Master Mix (구입처-SFC Probe) 또는 AmfiSure qGreen qPCR Master Mix(구입처-GenDEPOT)를 사용해서 수행하였고, CFX Connect Real-Time PCR Detection System(구입처-Bio Rad)을 사용해서 분석하였다. 표 19는 노화를 유도하기 이전(Young) 및 이후(Old)에, 표 20은 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노화관련 표지인자인 p16의 mRNA 양을 나타낸 결과이다. 표 20은 노화가 유도된 후의 p16의 mRNA 양을 100%로 산정해서, LX-112를 처리한 후의 p16의 mRNA 양과 비교하였다. 사용된 프라이머는 바이오닉스를 통해 합성하였고, 단, p16 및 IL6는 TaqMan 프라이머(구입처-Thermo Fisher Scientific)를 사용하였다. 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 21에 나타내었다.
p16 mRNA (Fold) Liver Kidney Lung Brain eWAT Muscle Skin
Young 1.0 (±0.7) 1.0 (±0.6) 1.0 (±0.1) 1.0 (±0.3) 1.0 (±0.4) 1.0 (±0.5) 1.0 (±0.0)
Old 53.9 (±10.8) 18.6 (±2.4) 3.3 (±1.0) 9.0 (±3.2) 3.5 (±1.1) 11.0 (±9.8) 7.3 (±2.5)
p16 mRNA (%) Liver Kidney Lung Brain eWAT Muscle Skin
- 100.0 (±4.8) 100.0 (±3.8) 100.0 (±5.7) 100.0 (±3.8) 100.0 (±9.7) 100.0 (±8.4) 100.0 (±1.5)
LX 62.0 (±3.5) 52.0 (±7.9) 69.0 (±1.0) 89.0 (±5.0) 79.0 (±2.0) 76.0 (±3.1) 74.0 (±6.7)
Gene Primer 1 서열번호 Primer 2 서열번호
β-actin CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC 15 ATGGAGCCACCGATCCACA 16
p21 GCAGATCCACAGCGATATCCA 17 AACAGGTCGGACATCACCAG 18
IL1α TCCATAACCCATGATCTGGAA 19 TTGGTTGAGGGAATCATTCAT 20
IL1β GTATGGGCTGGACTGTTTC 21 GCTGTCTGCTCATTCACG 22
CXCL1 ACCGAAGTCATAGCCACACTC 23 CTCCGTTACTTGGGGACACC 24
CXCL10 GCTGCCGTCATTTTCTGC 25 TCTCACTGGCCCGTCATC 26
MMP3 GTTGGAGAACATGGAGACTTTGT 27 CAAGTTCATGAGCAGCAACCA 28
MMP12 TGCACTCTGCTGAAAGGAGTCT 29 GTCATTGGAATTCTGTCCTTTCCA 30
MMP13 AAGGGGATAACAGCCACTACAA 31 ACCAACATAAAAATTAAGCCAAATG 32
MCP1 GCATCTGCCCTAAGGTCTTCA 33 GTGGAAAAGGTAGTGGATGCATT 34
COL1A1 CAGTCGATTCACCTACAGCAC 35 TGGAGGGAGTTTACACG 36
Agtr1a AAGGGCCATTTTGCTTTTCT 37 AACTCACAGCAACCCTCCAA 38
그 결과, 표 19에 나타난 바와 같이, 마우스가 노화되면 간(liver), 신장(kidney), 폐(lung), 뇌(brain), 부고환지방(eWAT), 근육(muscle), 피부(skin) 등의 각종 장기 조직에서 p16의 mRNA 양이 급격히 증가하였다. 또한, 표 20에 나타난 바와 같이, 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 각종 장기 조직에서 p16의 mRNA 양이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 각종 장기 조직에서 증가하는 노화관련 표지인자인 p16의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.
실시예 7-3. LX-112의 노화관련 표지인자(SA-β-gal)의 양 감소
마우스를 희생시키고 각 부위의 장기 조직에서 조직 절편을 제작하고, 실시예 1-1과 동일한 방법으로 노화관련 표지인자(SA-β-gal)을 염색하였다. 구체적으로, 마우스로부터 수집된 각 부위의 조직에서 지방을 제거하고 4% 포르말린(formalin)에서 24시간 이상 상온 고정하였다. 냉동 보존을 위해 30% 수크로즈(sucrose)에서 8시간 이상 두었다가 동결 절편화를 위해 동결보호제 OCT 배지에서 급속 냉동하였다. 급속 냉동한 조직을 조직병리서비스 전문업체인 히스토아에 의뢰하여 동결 절편을 제작하였다. 제작된 조직 동결 절편은 8 μm 두께로 자른 다음, 슬라이드 커버에 절편화시킨 뒤, 30분 동안 상온 건조시키고 이후 -80℃에서 사용 전까지 보관하였다. 노화관련 표지인자(SA-β-gal)을 염색한 다음, 광학 현미경을 통해 촬영한 후, 이미지 J 프로그램을 사용하여 염색된 부위의 면적를 계산하고, 전체 면적을 기준으로 표준화시켜 정량화하였다. 표 22는 노화를 유도하기 이전(Young) 및 이후(Old)에, 표 23은 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노화관련 표지인자인 SA-β-gal의 염색 면적을 나타낸 결과이다. 도 2는 지방 조직의 염색 사진 결과이다.
SA-β-gal (Fold) Liver Kidney Lung Skin eWAT
Young 1.0 (±0.5) 1.0 (±0.6) 1.0 (±0.2) 1.0 (±0.3) 1.0 (±1.0)
Old 4.5 (±0.2) 3.0 (±0.4) 1.1 (±0.5) 2.8 (±0.3) 45.9 (±9.3)
SA-β-gal (%) Liver Kidney Lung Skin eWAT
- 100.0 (±9.0) 100.0 (±8.0) 100.0 (±6.0) 100.0 (±9.0) 100.0 (±7.0)
LX 58.0 (±7.0) 55.0 (±17.0) 67.0 (±6.0) 68.0 (±9.0) 38.0 (±7.0)
그 결과, 표 22에 나타난 바와 같이, 마우스가 노화되면 간(liver), 신장(kidney), 폐(lung), 피부(skin), 부고환지방(eWAT) 등의 각종 장기 조직에서 SA-β-gal의 염색 면적이 증가하였다. 또한, 표 23 및 도 2에 나타난 바와 같이, 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 각종 장기 조직에서 SA-β-gal의 염색 면적이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 각종 장기 조직에서 증가하는 노화관련 표지인자인 SA-β-gal의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.
실시예 7-4. LX-112의 노화관련 퇴행성 표지인자(리포푸신)의 양 감소
마우스를 희생시키고 실시예 7-3과 동일한 방법으로 근육(muscle) 조직에서 조직 절편을 제작하고, 노화에 따라 세포의 라이소좀에서 생성되는 단백질 및 지질 등의 퇴행성 이상복합체로서 노화관련 퇴행성 표지인자인 리포푸신의 양을 수단블랙비(Sudan Black B, 구입처-Sigma)을 사용해서 염색해서 촬영한 후, 이미지 J 프로그램을 사용하여 염색된 부위의 면적를 계산하고, 전체 면적을 기준으로 표준화시켜 정량화하였다. 표 24는 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 25는 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노화관련 퇴행성 표지인자인 리포푸신의 염색 면적을 나타낸 결과이다.
Muscle
Lipofuscin(Fold) Young 1.0 (±0.2)
Old 1.5 (±0.4)
Muscle
Lipofuscin(%) - 100.0 (±8.0)
LX 71.0 (±6.0)
그 결과, 표 24에 나타난 바와 같이, 마우스가 노화되면 근육(muscle) 조직에서 리포푸신의 염색 면적이 증가하였다. 또한, 표 25에 나타난 바와 같이, 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 각종 조직에서 리포푸신의 염색 면적이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 근육 조직에서 증가하는 노화관련 퇴행성 표지인자인 리포푸신의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.
실시예 7-5. LX-112의 노화관련 염증 분비인자(SASP)(IL6)의 양 감소
마우스로부터 채취한 혈청(serum)은 사용 전까지 -80℃에서 보관하였다. 혈청에서 노화관련 염증 분비인자(SASP)인 IL6 및 MCP1의 양을 효소결합면역흡착제 검정법(ELISA Kit, 구입처-R&D Systems)를 사용하여 측정하였다. 표 26은 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 27은 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노화관련 염증 분비인자(SASP)인 IL6 및 MCP1의 양을 나타낸 결과이다.
Fold IL6 MCP1
Young 1.0 (±0.3) 1.0 (±0.2)
Old 4.2 (±0.3) 2.8 (±1.1)
% IL6 MCP1
- 100.0 (±29.0) 100.0 (±27.1)
LX 63.0 (±12.8) 58.0 (±9.8)
그 결과, 표 26에 나타난 바와 같이, 마우스가 노화되면 혈청에서 IL6 및 MCP1의 양이 증가하였다. 또한, 표 27에 나타난 바와 같이, 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 혈청에서 IL6 및 MCP1의 양이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 혈청에서 증가하는 노화관련 염증 분비인자(SASP)인 IL6 및 MCP1의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.
실시예 7-6. LX-112의 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)들의 양 감소
실시예 7-2와 동일한 방법으로 합성된 cDNA를 이용하여 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)인 MMP3, IL1β, MMP12, IL6, MMP13에 대한 qRT-PCR을 수행 및 분석하였다. 표 28은 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 29는 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)인 MMP3, IL1β, MMP12, IL6, MMP13의 mRNA 양을 나타낸 결과이다. 표 29는 노화가 유도된 후의 각각의 인자의 mRNA 양을 100%로 산정해서, LX-112를 처리한 후의 각각의 인자의 mRNA 양과 비교하였다.
mRNA (Fold) Liver Kidney Lung Muscle Skin
MMP3 IL1β MMP12 IL6 MMP3 MMP12 MMP13
Young 1.0 (±0.2) 1.0 (±0.4) 1.0 (±0.5) 1.0 (±0.1) 1.0 (±0.3) 1.0 (±0.4) 1.0 (±0.1)
Old 2.2 (±0.2) 2.0 (±0.2) 3.6 (±1.9) 2.9 (±1.3) 1.5 (±0.2) 10.0 (±6.3) 1.3 (±0.6)
mRNA(%) Liver Kidney Lung Muscle Skin
MMP3 IL1β MMP12 IL6 MMP3 MMP12 MMP13
- 100.0 (±5.1) 100.0 (±9.9) 100.0 (±15.0) 100.0 (±12.0) 100.0 (±38.0) 100.0 (±8.4) 100.0 (±49.0)
LX 75.0 (±13.0) 67.0 (±3.9) 81.0 (±13.0) 65.0 (±21.0) 92.0 (±6.0) 78.0 (±14.0) 95.0 (±2.0)
그 결과, 표 28에 나타난 바와 같이, 마우스가 노화되면 간(liver), 신장(kidney), 폐(lung), 근육(muscle), 피부(skin) 등의 각종 장기 조직에서 MMP3, IL1β, MMP12, IL6, MMP13 등의 mRNA 양이 증가하였다. 또한, 표 29에 나타난 바와 같이, 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 각종 장기 조직에서 각각의 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)의 mRNA 양이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 각종 장기 조직에서 증가하는 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)인 MMP3, IL1β, MMP12, IL6, MMP13 등의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.
실시예 7-7. LX-112의 노화에 따른 노쇠(활동성, 지구력, 근력 및 악력, 근감소증, 지방위축증 등) 개선
마우스에서 노화에 따른 노쇠를 분석하기 위하여 활동성 평가(open field test), 지구력 평가(wire hanging test), 근력 및 악력 평가(grip strength test)를 수행하였다. 구체적으로, 활동성 평가(open field test)에서는, 마우스를 흰색의 네모난 상자에 넣고 일정 시간 동안 움직인 궤적을 측정하였다. 중앙에 머문 시간을 움직인 전체 거리를 기준으로 표준화시켜 정량화하였다. 지구력 평가(wire hanging test)에서는, 마우스가 와이어(wire)에 매달려서 버티는 시간을 측정하였다. 근력 및 악력 평가(grip strength test)에서는, 마우스의 꼬리를 잡고 악력 측정기(구입-정도비앤피)를 앞발로 잡게 만든 뒤, 놓칠 때까지 살짝 잡아 당겨 놓치기 직전 측정기에 가해지는 힘을 측정하였다. 표 30은 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 31은 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노쇠의 판단 기준인 활동성 평가, 지구력 평가, 근력 및 악력 평가를 각각 정량적으로 나타낸 결과이다. 표 31은 노화가 유도된 후의 각각의 평가의 양을 100%로 산정해서, LX-112를 처리한 후의 각각의 평가의 양과 비교하였다.
Open Field TestTime in Center (%) Wire Hanging TestTime (Sec) Grip Sterenght TestStrength (N)
Young 13.1 (±3.93) 64.0 (±10.0) 1.0 (±0.05)
Old 5.2 (±1.51) 45.0 (±7.0) 0.8 (±0.12)
Open Field TestTime in Center (%) Wire Hanging TestTime (Sec) Grip Sterenght TestStrength (N) Muscle Mass (g)
- 100.0 (±18.0) 100.0 (±15.0) 100.0 (±14.0) 0.5 (±0.0)
LX 121.0 (±9.0) 119.0 (±10.0) 132.0 (±11.0) 0.7 (±0.1)
그 결과, 표 30에 나타난 바와 같이, 노화가 유도됨에 따라 마우스의 활동성, 지구력, 근력 및 악력이 감소하였다. 또한, 표 31에 나타난 바와 같이, 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 활동성, 지구력, 근력 및 악력이 증가하였다. 또한, 근육 조직에서 노화관련 표지인자인 p16(표 19 및 20) 및 SA-β-gal(표 22 및 23), 노화관련 퇴행성 표지인자인 리포푸신(표 24 및 25), 노화관련 염증 분비인자(SASP)인 IL6(표 26, 27 및 29) 등도 LX-112의 처리에 의해서 감소하였다. 이로부터, LX-112가 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 노쇠를 개선시키는 것을 확인하였다. 이 개선 효과와 일치하는 사실로서, 표 31 결과로부터, LX-112가 노화된 마우스의 대퇴부 사두근(quadriceps)의 근육 조직 및 전반적인 지방 조직의 무게를 증가시키는 것을 확인하였다.
실시예 7-8. LX-112의 노화에 따른 신장 손상 개선
마우스로부터 채취한 혈청(serum)에서 신장 손상 표지인자인 요소(urea) 및 크레아티닌(creatinine)의 양을 키트(구입처-BioAssay Systems 및 Sigma)를 사용하여 분광광도법(spectrophotometry)으로 측정하였다. 또한, 신장 손상 표지인자인 Agtr1a mRNA의 양을 실시예 7-2에 기재된 대로 qRT-PCR로 측정하였다. 표 32는 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 신장 손상 표지인자인 요소, 크레아티닌, Agtr1a mRNA을 각각 정량적으로 나타낸 결과이다. 노화가 유도된 후의 각각의 인자의 양을 100%로 산정해서, LX-112를 처리한 후의 각각의 인자의 양과 비교하였다.
Urea (%) Creatinine (%) Agtr1a mRNA (%)
- 100.0 (±4.0) 100.0 (±11.0) 100.0 (±9.0)
LX 69.0 (±6.0) 87.0 (±7.8) 64.0 (±7.0)
그 결과, 표 32에 나타난 바와 같이, 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 요소, 크레아티닌, Agtr1a mRNA의 양이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 신장 손상 및 기능 장애를 개선시키는 것을 확인하였다.
실시예 7-9. LX-112의 노화에 따른 피부 노화 개선
피부 조직의 동결 절편을 H/E(Hematoxylin/Eosin)으로 염색하고, 광학 현미경으로 진피(dermis)의 두께를 관찰하였다. 또한, 콜라겐(COL1A1)의 mRNA 양을 실시예 7-2에 기재된 대로 qRT-PCR로 측정하였다. 표 33에 자연적으로 노화를 유도한 마우스에 LX-112를 처리하지 않은 조건 및 처리한 조건에서 피부(dermal)의 두께와 콜라겐(COL1A1) mRNA 양에 따른 피부 노화 정도를 정량적으로 나타내었다.
Dermal Thickness (μm) Collagen mRNA (Fold)
- 221.0 (±22.1) 1.0 (±0.2)
LX 265.0 (±17.2) 2.3 (±0.4)
그 결과, 표 33에 나타난 바와 같이, 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 피부의 두께와 콜라겐의 양이 증가하였다. 또한, 피부 조직에서 노화관련 표지인자인 p16(표 19 및 20) 및 SA-β-gal(표 22 및 23), 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)이며 콜라겐 분해 효소인 MMP1, MMP12, MMP13(표 29) 등도 LX-112의 처리에 의해서 감소하였다. 이로부터, LX-112가 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 피부 노화를 개선시키는 것을 확인하였다.
실시예 8. 항암제에 의해 유도된 노화 마우스에서 LX-112의 노화세포 제거 및 관련 노화 억제 활성
실시예 8-1. 항암제에 의해 유도된 노화 마우스 모델의 확립
8주령의 수컷 C57BL6J 마우스(구입처-KRIBB 실험동물자원센터)를 1주일 동안 실험 환경에 적응시킨 후, 항암제인 독소루비신을 10 mg/kg 농도로 복강으로 투여하고 10일 이상 노화를 유도시킨 마우스를 실험군 및 대조군으로 무작위화하였다. LX-112는 0.5% CMC-Na 용액(구입처-Sigma)에 섞어서 21일 동안 매일 70 mg/kg 농도로 구강으로 투여하였다. 대조군은 동일한 부피로 용액만을 투여하였다. 약물 투여 종료 후, 하기 각각의 실시예에 기재된 방법을 수행하였다.
실시예 8-2. LX-112의 노화관련 표지인자(p16)의 양 감소
실시예 7-2와 동일한 방법으로 마우스를 희생시키고 각 부위의 장기 조직에서 RNA 추출하여 합성된 cDNA를 이용하여 qRT-PCR을 수행 및 분석하였다. 표 34는 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 35는 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노화관련 표지인자인 p16 및 p21의 mRNA 양을 나타낸 결과이다. 표 35는 항암제의 처리에 의해서 노화가 유도된 후의 p16 및 p21의 mRNA 양을 100%로 산정해서, LX-112를 처리한 후의 p16 및 p21의 mRNA 양과 비교하였다.
Liver Kidney eWAT
p16 mRNA(Fold) - 1.0 (±0.3) 1.0 (±0.3) 1.0 (±0.3)
DOX 2.6 (±0.8) 1.3 (±0.3) 3.2 (±1.2)
p21 mRNA(Fold) - 1.0 (±0.6) 1.0 (±0.4) 1.0 (±.0.2)
DOX 3.8 (±2.3) 2.6 (±2.1) 3.9 (±3.0)
Liver Kidney eWAT
p16 mRNA(%) - 100.0 (±24.0) 100.0 (±9.89) 100.0 (±9.8)
LX 70.0 (±8.3) 75.0 (±14.81) 72.0 (±18.75)
p21 mRNA(%) - 100.0 (±18.58) 100.0 (±25.8) 100.0 (±18.51)
LX 78 (±11.5) 83.8 (±9.5) 68.4 (±15.1)
그 결과, 표 34에 나타난 바와 같이, 항암제의 처리에 의해서 마우스가 노화되면 간(liver), 신장(kidney), 부고환지방(eWAT) 등의 각종 장기 조직에서 p16 및 p21의 mRNA 양이 증가하였다. 또한, 표 35에 나타난 바와 같이, 항암제의 처리에 의해서 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 각종 장기 조직에서 p16 및 p21의 mRNA 양이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 항암제의 처리에 의해서 마우스에 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 각종 장기 조직에서 증가하는 노화관련 표지인자인 p16 및 p21의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.
실시예 8-3. LX-112의 노화관련 표지인자(SA-β-gal)의 양 감소
실시예 7-3와 동일한 방법으로 기재된 마우스를 희생시키고 각 부위의 장기 조직에서 조직 절편을 제작하여 노화관련 표지인자인 SA-β-gal을 염색하였다. 표 36은 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 37은 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노화관련 표지인자인 SA-β-gal의 염색 면적을 나타낸 결과이다. 도 3은 지방 조직의 염색 사진 결과이다.
SA-β-gal (Fold) Liver Kidney Lung eWAT
- 1.0 (±0.6) 1.0 (±0.9) 1.0 (±0.2) 1.0 (±0.1)
DOX 3.7 (±0.9) 4.1 (±1.5) 1.3 (±0.4) 4.2 (±0.9)
SA-β-gal (%) Liver Kidney Lung eWAT
- 100.0 (±7.2) 100.0 (±10.2) 100.0 (±6.2) 100.0 (±8.4)
LX 67.4 (±9.9) 69.2 (±10.2) 64.2 (±9.2) 51.4 (±13.4)
그 결과, 표 36에 나타난 바와 같이, 항암제의 처리에 의해서 마우스가 노화되면 간(liver), 신장(kidney), 폐(lung), 부고환지방(eWAT) 등의 각종 장기 조직에서 SA-β-gal의 염색 면적이 증가하였다. 또한, 표 37 및 도 3에 나타난 바와 같이, 항암제의 처리에 의해서 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 각종 장기 조직에서 SA-β-gal의 염색 면적이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 항암제의 처리에 의해서 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 각종 장기 조직에서 증가하는 노화관련 표지인자인 SA-β-gal의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.
실시예 8-4. LX-112의 노화관련 퇴행성 표지인자(리포푸신)의 양 감소
실시예 7-4과 동일한 방법으로 마우스를 희생시키고 근육(muscle) 조직에서 조직 절편을 제작하여 노화관련 퇴행성 표지인자인 리포푸신을 염색하였다. 표 38은 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 39는 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노화관련 퇴행성 표지인자인 리포푸신의 염색 면적을 나타낸 결과이다.
Muscle
Lipofuscin(Fold) - 1.0 (±0.2)
DOX 2.2 (±0.5)
Muscle
Lipofuscin(%) - 100.0 (±19.3)
LX 77.1 (±8.0)
그 결과, 표 38에 나타난 바와 같이, 항암제의 처리에 의해서 마우스가 노화되면 근육(muscle) 조직에서 리포푸신의 염색 면적이 증가하였다. 또한, 표 39에 나타난 바와 같이, 항암제의 처리에 의해서 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 근육 조직에서 리포푸신의 염색 면적이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 항암제의 처리에 의해서 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 근육 조직에서 증가하는 노화관련 퇴행성 표지인자인 리포푸신의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.
실시예 8-5. LX-112의 노화관련 염증 분비인자(SASP)(IL6)의 양 감소
실시예 7-5와 동일한 방법으로 마우스로부터 채취한 혈청(serum)에서 노화관련 염증 분비인자(SASP)인 IL6의 양을 효소결합면역흡착제 검정법(ELISA Kit, 구입처-R&D Systems)으로 측정하였다. 표 40은 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 41은 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노화관련 염증 분비인자(SASP)인 IL6의 양을 나타낸 결과이다.
IL6(Fold) - 1.0 (±1.1)
DOX 11.7 (±0.5)
IL6(%) - 100.0 (±38.4)
LX 69.8 (±12.2)
그 결과, 표 40에 나타난 바와 같이, 항암제의 처리에 의해서 마우스가 노화되면 혈청에서 IL6의 양이 증가하였다. 또한, 표 41에 나타난 바와 같이, 항암제의 처리에 의해서 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 혈청에서 IL6의 양이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 항암제의 처리에 의해서 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 혈청에서 증가하는 노화관련 염증 분비인자(SASP)인 IL6의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.
실시예 8-6. LX-112의 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)들의 양 감소
실시예 7-6과 동일한 방법으로 합성된 cDNA를 이용하여 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)인 IL6, CXCL1, CXCL10, IL1β 등에 대한 qRT-PCR을 수행 및 분석하였다. 표 42는 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 43은 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)인 IL6, CXCL1, CXCL10, IL1β의 mRNA 양을 나타낸 결과이다. 표 43은 항암제의 처리에 의해서 노화가 유도된 후의 각각의 인자의 mRNA 양을 100%로 산정해서, LX-112를 처리한 후의 각각의 인자의 mRNA 양과 비교하였다.
mRNA (Fold) IL6 CXCL1 CXCL10 IL1β
Liver - 1.0 (±0.5) 1.0 (±0.6) 1.0 (±0.3) 1.0 (±0.5)
DOX 1.8 (±0.3) 3.0 (±0.9) 2.6 (±0.9) 1.6 (±0.3)
eWAT - 1.0 (±0.5) 1.0 (±0.2) 1.0 (±0.4) 1.0 (±0.5)
DOX 3.2 (±3.3) 1.3 (±0.4) 3.0 (±1.2) 1.6 (±2.2)
mRNA (%) IL6 CXCL1 CXCL10 IL1β
Liver - 100.0 (±35.4) 100.0 (±38.5) 100.0 (±13.6) 100.0 (±28.4)
LX 42.0 (±23.5) 68.0 (±21.1) 84.0 (±11.5) 42.0 (±35.2)
eWAT - 100.0 (±38.4) 100.0 (±8.5) 100.0 (±38.7) 100.0 (±78.7)
LX 48.6 (±12.5) 94.8 (±1.2) 74.0 (±11.0) 38.0 (±37.0)
그 결과, 표 42에 나타난 바와 같이, 항암제의 처리에 의해서 마우스가 노화되면 간(liver) 및 부고환지방(eWAT) 등의 장기 조직에서 IL6, CXCL1, CXCL10, IL1β의 mRNA 양이 증가하였다. 또한, 표 43에 나타난 바와 같이, 항암제의 처리에 의해서 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 각종 장기 조직에서 각각의 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)의 mRNA 양이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 항암제의 처리에 의한 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 각종 장기 조직에서 증가하는 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)인 IL6, CXCL1, CXCL10, IL1β의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.
실시예 8-7. LX-112의 항암제에 따른 피로 및 쇠약, 체중 감소 개선
실시예 7-7과 동일한 방법으로 마우스에서 항암제의 처리에 의해서 부작용으로 발생하는 피로 및 쇠약을 분석하기 위하여 활동성 평가(open field test), 지구력 평가(wire hanging test), 근력 및 악력 평가(grip strength test)를 수행하였다. 표 44는 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 45는 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노쇠의 판단 기준인 활동성 평가, 지구력 평가, 근력 및 악력 평가를 각각 정량적으로 나타낸 결과이다. 표 46은 항암제의 처리에 의해 노화를 유도하기 이전 및 이후와 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하고 LX-112를 처리한 조건에서 체중 결과를 나타내었다. 표 45는 항암제의 처리에 의해서 노화가 유도된 후의 각각의 평가의 양을 100%로 산정해서, LX-112를 처리한 후의 각각의 평가의 양과 비교하였다.
Open Field TestTime in Center (%) Wire Hanging TestTime (Sec) Grip Sterenght TestStrength (N)
- 11.9 (±4.2) 69.0 (±7.0) 1.3 (±0.1)
DOX 4.9 (±2.2) 32.0 (±11.0) 0.7 (±0.1)
Open Field TestTime in Center (%) Wire Hanging TestTime (Sec) Grip Sterenght TestStrength (N)
- 100.0 (±22.0) 100.0 (±25.0) 100.0 (±29.0)
LX 129.0 (±15.0) 127.0 (±15.0) 122.0 (±18.0)
Mean Body Weight (g) - DOX DOX+LX
26.5 (±5.7) 21.3 (±2.6) 22.8 (±3.1)
그 결과, 표 44 내지 46에 나타난 바와 같이, 항암제의 처리에 의해서 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 활동성, 지구력, 근력 및 악력이 증가하였고, 체중 감소가 개선되었다. 또한, 근육 조직에서 노화관련 퇴행성 표지인자인 리포푸신(표 38 및 39) 등도 LX-112의 처리에 의해서 감소하였다. 이로부터, LX-112가 항암제의 처리에 의해서 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 항암제의 처리에 의해서 부작용으로 발생하는 마우스의 피로 및 쇠약을 개선시키는 것을 확인하였다. 이 개선 효과와 일치하는 사실로서, 표 46 결과로부터, LX-112가 항암제의 처리에 의해서 노화된 마우스의 체중을 증가시키는 것을 확인하였다.
실시예 8-8. LX-112의 항암제에 따른 간 손상 개선
실시예 7-5와 동일한 방법으로 마우스로부터 채취한 혈청(serum)에서 간 손상시 혈액으로 유리되어 나오는 AST(aspartate aminotransferase) 및 ALT(alanine transaminase)의 양을 키트(구입처-Sigma)를 사용하여 제조사의 설명서에 기재된 방법에 따라 분광광도법(spectrophotometry)으로 측정하였다. 표 47은 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 48은 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 간 손상 표지인자인 AST 및 ALT의 양을 나타낸 결과이다. 표 48은 항암제의 처리에 의해서 노화가 유도된 후의 각각의 인자의 양을 100%로 산정해서, LX-112를 처리한 후의 각각의 인자의 양과 비교하였다.
Fold AST ALT
- 1.0 (±0.1) 1.0 (±0.1)
DOX 1.3 (±0.0) 1.4 (±0.5)
% AST ALT
- 100.0 (±14.4) 100.0 (±9.2)
LX 78.0 (±17.3) 72.2 (±14.1)
그 결과, 표 47에 나타난 바와 같이, 항암제의 처리에 의해서 마우스가 노화되면 혈청에서 AST 및 ALT의 양이 증가하였다. 또한, 표 48에 나타난 바와 같이, 항암제의 처리에 의해서 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 혈청에서 AST 및 ALT의 양이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 항암제의 처리에 의해서 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 간 손상 및 기능 장애를 개선시키는 것을 확인하였다.
실시예 8-9. LX-112의 항암제에 따른 신장 손상 개선
실시예 7-8과 동일한 방법으로 마우스로부터 채취한 혈청(serum)에서 신장 손상 표지인자인 요소(urea) 및 크레아티닌(creatinine)의 양을 분광광도법(spectrophotometry)으로 측정하였다. 표 49는 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 신장 손상 표지인자인 요소, 크레아티닌, Agtr1a mRNA을 각각 정량적으로 나타낸 결과이다. 항암제의 처리에 의해서 노화가 유도된 후의 각각의 인자의 양을 100%로 산정해서, LX-112를 처리한 후의 각각의 인자의 양과 비교하였다.
% Urea Creatinine Agtr1a mRNA
- 100.0 (±0.2) 100.0 (±5.0) 100.0 (±6.0)
LX 91.2 (±1.2) 89.0 (±4.0) 75.0 (±9.0)
그 결과, 표 49에 나타난 바와 같이, 항암제의 처리에 의해서 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 요소, 크레아티닌, Agtr1a mRNA의 양이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 항암제의 처리에 의해서 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 신장 손상 및 기능 장애를 개선시키는 것을 확인하였다.
실시예 9. 비만에 의해 유도된 노화 마우스에서 LX-112의 노화세포 제거 및 관련 노화 억제 활성
실시예 9-1. 비만에 의해 유도된 노화 마우스 모델의 확립
고지방식이로 비만이 유도된 15주령의 수컷 C57BL6J 마우스(구입처-잭슨연구소)를 1주일 동안 실험 환경에 적응시킨 후, 마우스를 실험군 및 대조군으로 무작위화하였다. LX-112는 0.5% CMC-Na 용액(구입처-Sigma)에 섞어서 21일 동안 매일 70 mg/kg 농도로 구강으로 투여하였다. 대조군은 동일한 부피로 용액만을 투여하였다. 약물 투여 종료 후, 하기 각각의 실시예에 기재된 방법을 수행하였다. 마우스를 희생시키고 각 부위의 지방 조직의 무게를 측정하였다. 표 50은 고지방식이(DIO)으로 비만을 유도한 마우스에서 비만을 유도하기 이전 및 이후에, 체중, 각각의 지방 조직인 부고환지방(eWAT), 서혜부지방(iWAT), 피하지방(asWAT), 장간막지방(mWAT), 견갑골 사이 갈색지방(iBAT)의 무게를 정량적으로 나타낸 결과이다.
Body Weight (g) eWAT (mg) iWAT (mg) asWAT (mg) mWAT (mg) iBAT (mg)
- 20.7 (±0.1) 169.1 (±70.1) 188.4 (±2.1) 205.6 (±88.4) 96.6 (±19.1) 100.5 (±35.9)
DIO 41.5 (±3.8) 2437.4 (±161.4) 1471.9 (±162.8) 1269.6 (±24.7) 1018.3 (±481.5) 344.7 (±140.7)
그 결과, 표 50에 나타난 바와 같이, 체중과 함께 각종 부위의 지방 조직의 무게가 증가하였다. 이로부터, 비만이 유도되었음을 확인하였다.
실시예 9-2. LX-112의 노화관련 표지인자(p16)의 양 감소
실시예 7-2와 동일한 방법으로 마우스를 희생시키고 각 부위의 장기 조직에서 RNA 추출하여 합성된 cDNA를 이용하여 qRT-PCR(quantitative real-time PCR)을 수행 및 분석하였다. 표 51은 비만에 의해서 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 52는 비만에 의해서 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노화관련 표지인자인 p16 및 p21의 mRNA 양을 나타낸 결과이다. 표 52는 비만에 의해서 노화가 유도된 후의 p16 및 p21의 mRNA 양을 100%로 산정해서, LX-112를 처리한 후의 p16 및 p21의 mRNA 양과 비교하였다.
Fold Liver Muscle Lung Skin eWAT iWAT asWAT iBAT
p16 mRNA - 1.0 (±0.1) 1.0 (±0.6) 1.0 (±0.3) 1.0 (±0.3) 1.0 (±0.4) 1.0 (±0.0) 1.0 (±0.2) 1.0 (±1.0)
DIO 1.2 (±0.5) 2.2 (±0.2) 1.1 (±0.2) 1.3 (±0.5) 3.3 (±2.2) 1.2 (±0.1) 1.2 (±0.2) 2.1 (±1.0)
p21 mRNA - 1.0 (±0.7) 1.0 (±0.1) 1.0 (±0.2) 1.0 (±0.1) 1.0 (±0.4) 1.0 (±0.5) 1.0 (±0.8) 1.0 (±0.1)
DIO 20.4 (±1.9) 1.2 (±0.1) 1.1 (±0.2) 1.2 (±0.0) 1.7 (±0.3) 2.9 (±0.2) 1.2 (±0.3) 1.4 (±1.1)
% Liver Muscle Lung Skin eWAT iWAT asWAT iBAT
p16 mRNA - 100.0 (±3.4) 100.0 (±4.7) 100.0 (±5.5) 100.0 (±1.6) 100 (±3.0) 100.0 (±3.4) 100.0 (±1.5) 100.0 (±1.3)
LX 71.3 (±4.5) 77.8 (±7.9) 81.0 (±3.0) 79.1 (±3.0) 61.2 (±4.3) 79.1 (±7.0) 84.1 (±3.3) 89.2 (±2.6)
p21 mRNA - 100.0 (±7.9) 100.0 (±9.4) 100.0 (±9.6) 100.0 (±9.4) 100.0 (±8.2) 100.0 (±4.5) 100.0 (±6.2) 100.0 (±4.3)
LX 62.9 (±9.7) 73.2 (±7.2) 79.3 (±8.4) 78.1 (±9.2) 67.2 (±6.8) 71.2 (±3.3) 82.1 (±7.7) 70.0 (±6.1)
그 결과, 표 51에 나타난 바와 같이, 노화에 의해서 마우스가 노화되면 간(liver), 근육(muscle), 폐(lung), 피부(skin), 부고환지방(eWAT), 서혜부지방(iWAT), 피하지방(asWAT), 견갑골 사이 갈색지방(iBAT) 등의 각종 장기 조직에서 p16 및 p21의 mRNA 양이 증가하였다. 또한, 표 52에 나타난 바와 같이, 노화에 의해서 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 각종 장기 조직에서 p16 및 p21의 mRNA 양이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 비만에 따른 노화에 의해서 마우스에 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 각종 장기 조직에서 증가하는 노화관련 표지인자인 p16 및 p21의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.
실시예 9-3. LX-112의 노화관련 염증 분비인자(SASP)(IL6)의 양 감소
실시예 7-5와 동일한 방법으로 마우스로부터 채취한 혈청(serum)에서 노화관련 염증 분비인자(SASP)인 IL6 및 액티빈A(activin A)의 양을 효소결합면역흡착제 검정법(ELISA Kit, 구입처-R&D Systems)으로 측정하였다. 표 53은 비만에 의해서 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 54는 비만에 의해서 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노화관련 염증 분비인자(SASP)인 IL6 및 액티빈A의 양을 나타낸 결과이다.
Fold IL6 Activin A
- 1.0 (±0.6) 1.0 (±0.5)
DIO 2.0 (±0.5) 2.9 (±1.2)
% IL6 Activin A
- 100.0 (±9.2) 100.0 (±13.2)
LX 51.8 (±14.2) 64.5 (±12.3)
그 결과, 표 53에 나타난 바와 같이, 비만에 의해서 마우스가 노화되면 혈청에서 IL6 및 액티빈A의 양이 증가하였다. 또한, 표 54에 나타난 바와 같이, 비만에 의해서 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 혈청에서 IL6 및 액티빈A의 양이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 비만에 따른 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 혈청에서 증가하는 노화관련 염증 분비인자(SASP)인 IL6 및 액티빈A의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.
실시예 9-4. LX-112의 비만에 따른 불안과 우울증 및 무기력증 개선
비만에 의한 불안 및 우울증은 증가된 체중과는 인과 관계가 없고, 노화세포의 축적이 원인임이 규명되었다. 이에, 실시예 7-7과 동일한 방법으로 마우스에서 비만에 의해서 발생하는 불안 및 우울증으로 인한 무기력증을 분석하기 위하여 활동성 평가(open field test)를 수행하였다. 표 55는 비만에 의해서 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 56은 비만에 의해서 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 불안 및 우울증으로 인한 무기력증의 판단 기준인 활동성 평가를 정량적으로 나타낸 결과이다. 표 56은 비만에 의해서 노화가 유도된 후의 활동성 평가의 양을 100%로 산정해서, LX-112를 처리한 후의 활동성 평가의 양과 비교하였다.
Open Field Test Time in Center (%) - 7.3 (±0.4)
DIO 2.8 (±0.0)
Open Field Test Time in Center (%) - 100.0 (±21.0)
LX 137.0 (±15.0)
그 결과, 표 55에 나타난 바와 같이, 비만에 의해서 노화가 유도된 마우스에서 활동성이 감소하였다. 또한, 표 56에 나타난 바와 같이, 비만에 의해서 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 활동성이 증가하였다. 이로부터, LX-112가 비만에 의해서 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 비만에 의해서 발생하는 마우스의 불안과 우울증 및 무기력증을 개선시키는 것을 확인하였다.
실시예 9-5. LX-112의 비만에 따른 지방간 개선
실시예 7-4과 동일한 방법으로 마우스를 희생시키고 간(liver) 조직에서 절편을 제작하여 지방 축적을 오일레드오(Oil Red O)로 염색하였다. 표 57은 비만에 의해서 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 58은 비만에 의해서 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 지방간의 판단 기준인 오일레드오의 염색 면적을 나타낸 결과이다. 표 58은 비만에 의해서 노화가 유도된 후의 오일레드오의 염색 면적을 100%로 산정해서, LX-112를 처리한 후의 오일레드오의 염색 면적과 비교하였다.
Oil Red O(Fold) - 5.8 (±1.4)
DIO 47.7 (±4.2)
Oil Red O(%) - 100.0 (±11.3)
LX 74.0 (±7.3)
그 결과, 표 57에 나타난 바와 같이, 비만에 의해서 마우스가 노화되면 오일레드오의 염색 면적이 증가하였다. 또한, 표 58에 나타난 바와 같이, 비만에 의해서 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 오일레드오의 염색 면적이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 비만에 의해서 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 간 조직에서 축적된 지방의 양을 감소시키는 것을 확인하였다.
실시예 10. 노화세포 제거 및 관련 노화 억제 활성을 가지는 LX-112의 변이체 셀레늄 화합물 확보
실시예 10-1. LX-114, LX-115, LX-116, LX-117, LX-128의 노화세포 제거
실시예 1과 동일한 방법으로 독소루비신 및 대조군을 처리하고 배양한 세포에 LX-114(구입처-REONSIMI), LX-115(구입처-REONSIMI), LX-116(구입처-REONSIMI), LX-117(구입처-REONSIMI), LX-128(구입처-Abcam) 등 각각의 조성물을 0 μM, 1.1 μM, 3.3 μM, 10 μM의 농도로 처리하고 3일 동안 배양하였다. 그 다음, CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(구입처 Promega)를 이용해서 세포 생존률을 측정하였다. 표 59 및 표 60은 인간유래 포피세포에 독소루비신(DOX) 또는 대조군을 처리한 다음, LX-114, LX-115, LX-116, LX-117, LX-128 등 각각의 조성물을 처리한 후의 세포 생존률 및 성장률을 나타낸 결과이다.
Survival (%) 0 μM 1.1 μM 3.3 μM 10 μM
LX-114 100.8 (±5.1) 69.1 (±2.3) 27.4 (±5.1) 6.2 (±3.4)
LX-115 100.1 (±8.1) 68.9 (±3.9) 24.2 (±6.7) 3.1 (±4.9)
LX-116 100.2 (±6.9) 51.5 (±6.7) 21.9 (±5.9) 3.1 (±7.8)
LX-117 100.4 (±8.3) 59.4 (±2.1) 25.6 (±6.6) 3.9 (±2.9)
LX-128 100.0 (±3.0) 96.0 (±5.4) 89.0 (±4.2) 58.0 (±6.1)
Growth (%) N0 0 μM 1.1 μM 3.3 μM 10 μM
LX-114 100.3 (±3.9) 260.4 (±14.4) 204.7 (±9.3) 163.7 (±14.2) 121.7 (±21.1)
LX-115 100.7 (±1.9) 249.7 (±11.1) 195.3 (±7.1) 174.5 (±16.9) 116.0 (±19.4)
LX-116 100.6 (±4.1) 261.9 (±19.3) 199.1 (±9.3) 163.2 (±19.4) 126.9 (±17.8)
LX-117 100.2 (±5.8) 257.7 (±14.9) 197.1 (±8.4) 165.4 (±21.0) 126.8 (±15.8)
LX-128 100.0 (±24) 301.0 (±8.9) 298.4 (±11.2) 290.6 (±20.1) 259.4 (±11.7)
그 결과, 표 59에 나타난 바와 같이, 독소루비신을 처리해서 노화가 유도된 세포에서 셀레늄을 포함하는 LX-114, LX-115, LX-116, LX-117, LX-128 등의 조성물의 농도가 높을수록 세포 생존률이 감소하였다. 또한, 표 60에 나타난 바와 같이, 대조군을 처리해서 노화가 유도되지 않은 세포에서 모든 조성물을 다양한 농도로 처리하여도 세포 생존률에 커다란 변화가 없었고, 정상적으로 세포가 성장하고 있었다. 이로부터, 셀레늄을 포함하는 LX-112 변이체 조성물이 노화세포의 사멸을 유도해 노화세포를 효과적으로 제거할 수 있음을 확인하였다.이와 더불어, 노화세포에서 활성산소종(ROS)의 발생을 분석하였다. LX-112, LX-114, LX-115, LX-116, LX-117 등 각각의 조성물을 30 μM 농도로 처리하고 배양한 세포에 DCFDA/H2DCFDA(2',7'-Dichlorofluorescein diacetate, 구입처-Abcam)를 20 μM로 처리하고 37℃에서 45분간 반응시켰다. 형광 염색된 세포는 플레이트 판독기(SpectraMax ID3, Ex/Em=485 nm/535 nm, 구입처-Molecular Device)를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 각각의 조성물(LX-112, LX-114, LX-115, LX-116, LX-117)이 노화세포의 사멸 유도시 화합물을 처리하기 전과 비교해서 활성산소종이 1.8~2.1배 정도 증가시킴을 확인하였다. 이로부터, 셀레늄을 포함하는 LX-112 변이체 조성물이 활성산소종을 발생시킴으로써 노화세포의 사멸을 유도해 노화세포를 효과적으로 제거할 수 있음을 확인하였다.
실시예 10-2. LX-114, LX-115, LX-116, LX-117의 노화관련 표지인자(p16) 및 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)의 양 감소
실시예 7-1과 동일한 방법으로 노화된 마우스에 LX-114, LX-115, LX-116, LX-117을 0.5% CMC-Na 용액(구입처-Sigma)에 섞어서 21일 동안 매일 70 mg/kg 농도로 구강으로 투여하였다. 대조군은 동일한 부피로 용액만을 투여하였다. 약물 투여 종료 후, 하기 각각의 실시예에 기재된 방법을 수행하였다. 실시예 7-2와 동일한 방법으로 마우스를 희생시키고 간(liver) 조직에서 RNA 추출하여 합성된 cDNA를 이용하여 qRT-PCR을 수행 및 분석하였다. 표 61은 자연적인 노화를 유도하고 LX-114, LX-115, LX-116, LX-117을 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노화관련 표지인자인 p16 및 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)인 MMP3의 mRNA 양을 나타낸 결과이다. 표 61은 자연적인 노화가 유도된 후의 p16 및 MMP3의 mRNA 양을 100%로 산정해서, LX-114, LX-115, LX-116, LX-117을 처리한 후의 p16 및 MMP3의 mRNA 양과 비교하였다.
LX-114 LX-115 LX-116 LX-117
p16 mRNA (%) 76.9 (±3.6) 75.2 (±5.5) 63.0 (±7.0) 71.3 (±4.0)
MMP3 mRNA (%) 84.3 (±6.9) 81.2 (±6.3) 71.3 (±6.7) 69.3 (±7.2)
그 결과, 실시예 7-2 및 표 19 또는 실시예 7-6 및 표 28에 나타난 바와 같이 자연적인 노화에 의해서 마우스가 노화되면 간(liver) 조직에서 p16 및 MMP3의 mRNA 양이 증가되었으나, 이에 LX-114, LX-115, LX-116, LX-117을 처리하면 p16 및 MMP3의 mRNA 양이 감소하였다(표 61). 이로부터, LX-114, LX-115, LX-116, LX-117이 자연적인 노화에 의해서 마우스에 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 노화관련 표지인자인 p16 및 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)인 MMP3의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.

Claims (16)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 셀레늄 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 노화세포 제거용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2022009345-appb-img-000014
    여기서
    R은 단일결합, -(CH2)n- 또는 -(CH2)p-X-(CH2)q-이고;
    n은 1 내지 10의 정수이고;
    p 및 q는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고;
    X는 -S-, -Se- 또는 페닐렌이고;
    A는 아래 화학식 2로 표시되는 그룹이거나, 페닐, 아민 또는 아마이드이고;
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2022009345-appb-img-000015
    R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 및 R8은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-6알킬, 할로C1-6알킬, C1-6알콕시, 카복시, 아민, 또는 니트로이다.
    　
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 셀레늄 화합물은 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물인, 노화세포 제거용 조성물:
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2022009345-appb-img-000016
    여기서
    R은 -(CH2)n- 또는 -(CH2)p-X-(CH2)q-이고;
    n은 1 내지 10의 정수이고;
    p 및 q는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고;
    X는 -S-, -Se- 또는 페닐렌이고;
    R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 및 R8은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-6알킬, 할로C1-6알킬, C1-6알콕시, 카복시, 아민, 또는 니트로이다.
    　
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 셀레늄 화합물은 하기 화학식 4로 표시되는 화합물인, 노화세포 제거용 조성물:
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2022009345-appb-img-000017
    여기서
    R은 -(CH2)n- 또는 -(CH2)p-X-(CH2)q-이고;
    n은 1 내지 10의 정수이고;
    p 및 q는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고;
    X는 -S-, -Se- 또는 페닐렌이다.
    　
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 셀레늄 화합물은 하기 화학식 5 또는 6으로 표시되는 화합물인, 노화세포 제거용 조성물:
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2022009345-appb-img-000018
    [화학식 6]
    Figure PCTKR2022009345-appb-img-000019
    여기서
    n은 1 내지 8의 정수이고;
    p 및 q는 각각 독립적으로 1 내지 4의 정수이고;
    X는 -S-, -Se- 또는 페닐렌이다.
    　
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 셀레늄 화합물은 하기 화학식 7 내지 13 중에서 어느 하나로 표시되는 화합물인, 노화세포 제거용 조성물:
    [화학식 7]
    Figure PCTKR2022009345-appb-img-000020
    [화학식 8]
    Figure PCTKR2022009345-appb-img-000021
    [화학식 9]
    Figure PCTKR2022009345-appb-img-000022
    [화학식 10]
    Figure PCTKR2022009345-appb-img-000023
    [화학식 11]
    Figure PCTKR2022009345-appb-img-000024
    [화학식 12]
    Figure PCTKR2022009345-appb-img-000025
    [화학식 13]
    Figure PCTKR2022009345-appb-img-000026
    .
    　
  6. 제1항에 있어서,
    상기 노화세포는 시간의 경과에 따른 자연적인 노화 또는 항암제에 의한 스트레스로 인한 노화 및 비만에 의한 스트레스로 인한 노화로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나와 관련된 것인, 노화세포 제거용 조성물.
    　
  7. 제1항에 있어서,
    상기 노화세포가 체세포, 줄기세포 및 질병으로 비정상적으로 변한 세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 노화세포 제거용 조성물.
    　
  8. 제7항에 있어서,
    상기 질병은 염증, 섬유화증 및 암으로 이루어진 군에서 선택되는, 노화세포 제거용 조성물.
    　
  9. 제7항에 있어서,
    상기 노화세포가 간, 신장, 비장, 뇌, 폐, 근육, 피부 또는 지방으로부터 유래하는 장기 조직의 세포인, 노화세포 제거용 조성물.
    　
  10. 제1항에 있어서,
    상기 노화세포 제거용 조성물이 노화관련 분비인자(SASP)의 발현 및 분비의 억제에 사용되는 것인, 노화세포 제거용 조성물.
    　
  11. 제1항에 있어서,
    상기 노화세포 제거용 조성물이 노화관련 질환 및 장애의 억제 및 치료에 사용되는 것인, 노화세포 제거용 조성물.
    　
  12. 제11항에 있어서,
    상기 노화관련 질환 및 장애가 노화세포와 관련된, 증식 질환 및 장애, 염증 또는 자가면역 질환 및 장애, 신경 질환 및 장애, 대사 질환 및 장애, 심혈관 질환 및 장애, 폐 질환 및 장애, 신장 질환 및 장애, 간 질환 및 장애, 안구 질환 및 장애, 피부 질환 및 장애, 줄기세포 또는 장기 조직의 재생유지 관련 질환 및 장애, 외래이식 관련 질환 및 장애, 섬유화증 질환 및 장애, 경화증 질환 및 장애, β-갈락토시데이즈 관련 질환 및 장애, 기타 노인성 질환 및 장애, 스트레스에 의한 부작용 및 후유증 및 이로 인한 노화관련 질환 및 장애로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 질환 및 장애인, 노화세포 제거용 조성물.
    　
  13. 제11항에 있어서,
    상기 노화관련 질환 및 장애가 노화세포와 관련된, 염증, 섬유화증, 경화증, 암, 항암제 또는 비만에 의한 스트레스로 인한 부작용 및 후유증, 노쇠, 근감소증, 지방위축증, 간 및 신장 손상 또는 피부 노화 및 이와 관련된 질환 및 장애인 것인, 노화세포 제거용 조성물.
    　
  14. 제13항에 있어서,
    상기 노화세포와 관련된, 항암제 또는 비만에 의한 스트레스로 인한 부작용 및 후유증이 피로 및 쇠약, 체중 감소, 불안과 우울증 및 무기력증, 또는 지방간인, 노화세포 제거용 조성물.
    　
  15. 제1항에 있어서,
    상기 노화세포 제거용 조성물이 의약품, 화장품, 건강기능식품 또는 동물용 제품에 사용되는 것인, 노화세포 제거용 조성물.
    　
  16. 제1항에 있어서,
    상기 노화세포 제거용 조성물이 체외에서 노화세포를 제거하기 위한 것인, 노화세포 제거용 조성물.
PCT/KR2022/009345 2021-06-29 2022-06-29 셀레늄 화합물을 유효성분으로 포함하는 노화세포 제거용 조성물 WO2023277584A1 (ko)

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WO2024008788A1 (fr) * 2022-07-05 2024-01-11 Association Francaise Contre Les Myopathies Utilisation de l'ebselen ou l'un de ses derives pour traiter des pathologies ou dysfonctionnements des mitochondries

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