KR102484332B1 - 핵산 복합체를 함유하는 피부 투과성 전달체 및 이의 용도 - Google Patents

핵산 복합체를 함유하는 피부 투과성 전달체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생활성 핵산을 세포 내에 도입할 수 있는 새로운 구조의 핵산 복합체를 함유하는 피부 투과성 전달체 및 이를 포함하는 질병의 진단, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 상보적으로 결합된 핵산 복합체를 함유하며, 피부 투과성 및 피부 잔류성을 갖는 피부 투과성 전달체 및 이를 포함하는 질병의 진단, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 구조식 (1)의 구조를 가지는 핵산 복합체를 함유하는 피부 투과성 전달체는 큰 분자량의 약물을 효과적으로 전달하기 위한 피부 투과 기능과 체내 유효성을 동시에 가진다. 본 발명에 따른 전달체는 특히, 생활성 핵산 또는 여러 화합물의 피부 표피 및 진피 통과를 가능하게 하여, 피부 표면에 도포하는 외용적 처치를 가능하게 한다.

Description

핵산 복합체를 함유하는 피부 투과성 전달체 및 이의 용도{Skin-penetrating Delivery Carrier Comprising Nucleic Acid Complex and Uses thereof}
본 발명은 생활성 핵산을 세포 내에 도입할 수 있는 핵산 복합체를 함유하는 피부 투과성 전달체 및 이를 포함하는 질병의 진단, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 상보적으로 결합된 핵산 복합체를 함유하며, 피부 투과성 및 피부 잔류성을 갖는 피부 투과성 전달체 및 이를 포함하는 질병의 진단, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
전통적인 약제와 다르게 핵산 약제는 표적 특이적 전령 RNA(messenger RNA, mRNA)의 발현을 억제하므로, 단백질을 표적으로 하는 기존 약제로 치료가 불가능 했던 연구 영역을 다룰 수 있게 되었다(Kole R. 등 Nature Rev. Drug Discov. 2012; 11; 125-140., Wilson C. 등 Curr. Opin. Chem. Bio. 2006; 10: 607-614.).
올리고 핵산(Oligo nucleic acid)을 기반으로 유전자 발현 조절의 뛰어난 효과 및 다양한 용도에도 불구하고, 핵산을 기반으로 하는 치료제를 개발하기 위해서는 극복해야 할 방해물이 다수 존재한다. 예를 들면, 올리고 핵산은 핵산분해효소(nuclease) 등에 의한 손상의 위험이 있으며, 올리고 핵산의 전기적 성질(전하)과 크기로 인하여 수동 확산(passive diffusion)에 의한 세포막 투과가 불가능한 점 등이 있다. 상기 문제점들을 해소하기 위하여, 핵산의 변형을 통한 생물학적 안정성을 확보하려는 노력이 계속되고 있으며, 변형된 인공핵산(Artificial Nucleic Acid)의 경우 생물학적인 활성의 손실 없이 표적 핵산과의 친화성을 높이는 것이 가능하게 되었다.
변형된 인공핵산의 한 종류인 펩티드 핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA)은 (2-아미노에틸)-글리신 펩티드 백본((2-aminoethyl)-glycine peptide backbone)이 도입된 인공 핵산으로, 상보적인 염기 서열을 가지는 RNA 및 DNA에 강하게 결합하는 성질을 가지고 있다. 특히, 상기 펩티드 핵산은 핵산분해효소에 대해 저항성이 있고, 생물학적 안정성이 높아 다양한 올리고 핵산을 기반으로 하는 치료제 관련 연구가 수행되고 있다. 하지만 상기 펩티드 핵산은 전기적 중성을 가지는 특성으로 세포 내 도입이 어려운 단점을 가지고 있다(Joergensen M. 등 Oligonucleotides 2011, 21; 29-37.).
올리고 핵산 자체의 세포막 투과 능력은 상당히 낮으며, 특히 DNA 또는 RNA는 음전하를 띄고 있기 때문에, 세포의 소수성 인지질 이중막을 통과하지 못하므로 단순 확산을 통한 세포 내 전달이 어렵다. 레트로바이러스(Retrovirus) 혹은 AAV(adeno-associated virus) 등의 바이러스 운반체의 사용은 올리고 핵산의 세포 내 도입을 가능하게 하지만, 의도치 않은 면역활성과 발암유전자(oncogene)의 재조합 가능성 등의 위험성이 있다(Couto L. B. 등 Curr. Opin. Pharmacol. 2010, 5; 534-542.).
이러한 이유로 세포독성이 적고, 면역활성이 낮은 비-바이러스성 올리고 핵산을 기반으로 하는 핵산 운반체 개발의 중요성이 더욱 커지고 있으며, 그 결과로 양전하성 지질(cationic lipid), 리포좀(liposome, 안정된 핵산 지질 입자(stable nucleic acid lipid particle, SNALP), 폴리머 및 세포-투과 입자(cell-penetrating peptide)를 이용한 세포 도입 기법이 개발되고 있다(Zhi D. 등 Bioconjug. Chem. 2013, 24; 487-519., Buyens K. 등 J. Control Release, 2012, 158; 362-70., ROSSI, J. J. 등 Gene Ther. 2006, 13: 583-584., Yousefi A. 등 J. Control Release, 2013, 170; 209-18., Trabulo S. 등 Curr. Pharm. Des. 2013, 19; 2895-923.).
이러한 핵산 전달 기법은 기능성 잔기를 직접적인 결합으로 가지고 있으며, 복합체 형성을 위한 단계를 포함하고, 리포좀(liposome) 구조의 앤도좀 에스케이프(endosome escape) 효율 및 생체독성 등의 문제점을 가지고 있어, 올리고 핵산 도입 기능의 향상과 제조 절차 및 부작용과 관련된 문제점의 해소가 필요하다.
한편, 피부는 인간 신체에서 표면적이 가장 큰 기관으로, 적절한 방법을 사용할 경우 효과적으로 약물을 전달할 수 있는 경로가 된다. 따라서 통상적으로 경피 전달(transdermal delivery)이라고 불리는 피부를 통한 치료용 약물 등의 생리적 활성제의 투여는 비교적 상대적으로 간단한 약물 등의 투여 요법 등의 특징으로 인해 큰 관심을 받아왔다.
구조적으로 피부는 두 주요 부분인, 상대적으로 얇은 최외곽층인 표피층(epidermis, epidermal layer)과, 그보다 두꺼운 안쪽영역인 진피층(dermis, dermal layer)으로 이루어진다. 특히 표피층의 최외곽층인 각질층(stratum corneum)은 케라틴으로 가득찬 편평한 죽은 세포들로 이루어진다. 각질층의 편평한 죽은 세포들 사이의 영역은, 피부의 천연 장벽 특성에 기여하는 라멜라상(lamellar phase)을 형성하는 지질들로 구성되어 있다. 피부의 제일 바깥쪽에 존재하는 각질층(stratum corneum) 등이 천연장벽으로 작용하여, 치료용 약물 등의 외부물질의 피부 투과도는 극단적으로 낮아 분자량이 크고 친수성이 있는 물질의 전달에 어려움이 있다.
이러한 피부로의 치료용 약물 등의 전달 시 피부 장벽의 외부물질에 대한 방어기전을 극복하고자 여러 피부투과 방법에 관한 연구가 시도되었으나, 물리적으로 피부를 손상 또는 자극하지 않고 화학물질의 특성을 통해 약물을 전달하는 것은 매우 어렵다고 여겨지고 있으며, 이를 극복한 소재에 기대할 수 있는 다양한 장점 때문에 지속적으로 개발이 요구되고 있는 실정이다.
이러한 요구에 따라, 큰 분자량의 약물을 효과적으로 전달하기 위한 리포좀 또는 나노 파티클, 펩타이드 리간드 등의 피부투과 전달소재에 관련된 연구가 다수 보고되고 있으며[Lademann et al., 2007(Eur J Pharm Biopharm. 2007 May;66(2):159-64.), Chen et al., 2006a(J Pharmacol Exp Ther. 2006 Nov;319(2):765-75.), Chen et al., 2006b(Nat Biotechnol. 2006 Apr;24(4):455-60.)], 이를 통한 실용화 단계의 개발 비용이 증가함에도 불구하고 전달하고자 하는 약물의 효율과 안정성을 보장할 수 없어, 피부투과 기능과 체내 유효성을 동시에 갖는 소재 개발이 요구되고 있다. 피부 표면에 도포하는 외용적 처치 소재의 유효성은 표피 및 진피를 통과해야 하는 기술적 어려움으로 인해 많은 노력이 요구된다.
이와 관련하여, 본 발명자들은 생활성 핵산과 전체적으로 양전하를 가지도록 변형된 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체가 세포 투과성(cell permeability)이 놀랍게 향상되며, 이를 이용하여 표적 유전자의 발현을 매우 효율적으로 조절할 수 있음을 확인하고, 이러한 세포 독성이 낮고, 생활성 핵산의 세포투과성 및 유전자 발현 조절능력이 향상된 새로운 구조체에 대한 특허를 출원한 바 있다(PCT/KR2017/008636).
상기 구조체 및 치료용 약물 등의 피부 투과 및 세포 전달 기능이 향상된 전달체에 대한 연구를 지속적으로 수행한 결과, 본 발명자들은 상기와 같은 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)과 전체적으로 양전하를 가지도록 변형된 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이 상보적으로 결합된 핵산 복합체가 피부, 바람직하게는 각질층 및/또는 표피층을 매우 효율적으로 통과하는 특성을 가지고 있어, 이러한 핵산 복합체가 피부 투과성 전달체로 이용될 수 있음을 규명하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 생활성 핵산 및/또는 치료용 약물을 피부를 통해 투여할 수 있는 새로운 구조의 핵산 복합체를 함유하는 피부 투과성 전달체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 피부 투과성 전달체를 포함하는 질병의 진단, 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 하기 구조식 (1)의 구조를 가지는 핵산 복합체를 함유하는 피부 투과성 전달체를 제공한다.
구조식 (1)
[ A ≡ C (+) ]
상기 구조식 (1)에 있어서,
A는 목적하는 유전자와 결합할 수 있는 서열 또는 목적하는 유전자 서열을 가지는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)이고,
C는 생활성 핵산과 결합할 수 있는 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이고,
'≡'는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 간의 상보적인 결합을 의미하며,
A로 표시되는 생활성 핵산은 전체적으로 음전하 또는 중성을 가지며,
C(+)는 캐리어 펩티드 핵산이 전체적으로 양전하를 가진다는 것을 의미하며,
캐리어 펩티드 핵산은 캐리어 펩티드 핵산 전체적으로 양전하를 띠도록 변형된 펩티드 핵산 단량체를 하나 이상 포함한다.
본 발명은 또한, 상기 피부 투과성 전달체를 포함하는 질병의 진단용 조성물 및 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 구조식 (1)의 구조를 가지는 핵산 복합체를 함유하는 피부 투과성 전달체는 큰 분자량의 약물을 효과적으로 전달하기 위한 피부 투과 기능과 체내 유효성을 동시에 가진다.
본 발명에 따른 전달체는 특히, 생활성 핵산 또는 여러 화합물의 피부 각질층, 표피층 및/또는 진피층 통과를 가능하게 하여, 피부 표면에 도포되는 치료용 약물의 외용적 처치 및 혈액 등의 체내 순환계에 목적하는 약물이 전달되도록 할 수 있다.
도 1a 내지 도 1e는 피부 투과성 전달체 내의 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 결합된 구조를 도식화하여 나타낸 것이다.
(a) 역평행 결합의 형태로 결합된 구조,
(b) 평행 결합의 형태로 결합된 구조,
(c) 피부 투과성 전달체에 치료용 약물이 결합된 구조,
(d) 피부 투과성 전달체에 엔도좀 탈출을 도와주는 물질(m)이 결합된 구조,
(e) 피부 투과성 전달체에 엔도좀 탈출을 도와주는 물질(m)과 치료용 약물이 모두 결합된 구조.
도 2는 피부 각질층, 표피층 및 진피층을 나타내는 도면이다.
도 3은 (A)는 siRNA single 및 duplex의 피부 전달 능력을 나타내는 도면으로 siRNA 자체로는 표피에서부터 진피로의 전달이 확인되지 않았음을 보여주는 도면이고, (B)는 핵산 복합체의 피부 전달 능력을 나타내는 도면으로 핵산 복합체가 표피로부터 진피로 전달되고, 24시간 후에는 진피까지 전달된 것을 확인한 도면이다.
도 4a 내지 도 4l은 cy3-표지된 siRNA의 transdermal 능력 테스트 결과를 나타낸 도면이다.
(a) 캐리어 펩티드 핵산과 동일한 길이의 상보적으로 결합하는 생활성 핵산의 charge에 변화를 주고 누드 마우스 등에 처리 1시간 후 핵산 복합체의 피부 전달 능력,
(b) 생활성 핵산보다 짧은 캐리어 펩티드 핵산에 상보적으로 결합하는 생활성 핵산의 charge에 변화를 주고 누드 마우스 등에 처리 1시간 후 핵산 복합체의 피부 전달 능력,
(c) 캐리어 펩티드 핵산과 동일한 길이의 상보적으로 결합하는 생활성 핵산의 charge에 변화를 주고 누드 마우스 등에 처리 3시간 후 핵산 복합체의 피부 전달,
(d) 생활성 핵산보다 짧은 캐리어 펩티드 핵산에 상보적으로 결합하는 생활성 핵산의 charge에 변화를 주고 누드 마우스 등에 처리 3시간 후 핵산 복합체의 피부 전달 능력,
(e) 캐리어 펩티드 핵산과 동일한 길이의 상보적으로 결합하는 생활성 핵산의 charge에 변화를 주고 누드 마우스 등에 처리 24시간 후 핵산 복합체의 피부 전달 능력,
(f) 생활성 핵산보다 짧은 캐리어 펩티드 핵산에 상보적으로 결합하는 생활성 핵산의 charge에 변화를 주고 누드 마우스 등에 처리 24시간 후 핵산 복합체의 피부 전달 능력,
(g) 전체적으로 음전하를 띠는 생활성 핵산에 다양한 charge를 가지는 캐리어 펩티드 핵산이 결합한 다양한 복합체를 누드 마우스 등에 처리 1시간 후 피부 전달 능력,
(h) 전체적으로 음전하를 띠는 생활성 핵산에 다양한 charge를 가지는 캐리어 펩티드 핵산이 결합한 다양한 복합체를 누드 마우스 등에 처리 3시간 후 피부 전달 능력,
(i) 전체적으로 음전하를 띠는 생활성 핵산에 다양한 charge를 가지는 캐리어 펩티드 핵산이 결합한 다양한 복합체를 누드 마우스 등에 처리 24시간 후 피부 전달 능력,
(j) 전체적으로 음전하를 띠는 생활성 핵산에 다양한 길이를 가지는 캐리어 펩티드 핵산이 결합한 다양한 복합체에 대해 누드 마우스 등에 처리 1시간 후 피부 전달 능력,
(k) 전체적으로 음전하를 띠는 생활성 핵산에 다양한 길이를 가지는 캐리어 펩티드 핵산이 결합한 다양한 복합체에 대해 누드 마우스 등에 처리 3시간 후 피부 전달 능력,
(l) 전체적으로 음전하를 띠는 생활성 핵산에 다양한 길이를 가지는 캐리어 펩티드 핵산이 결합한 다양한 복합체에 대해 누드 마우스 등에 처리 24시간 후 피부 전달 능력.
도5a 내지 도 5c는 저분자 물질을 포함하는 핵산 복합체의 피부 전달 능력을 나타내는 도면이다.
(a) 저분자 물질을 포함하는 핵산 복합체 처리 0시간 후 피부 전달 능력,
(b) 저분자 물질을 포함하는 핵산 복합체 처리 3시간 후 피부 전달 능력,
(c) 저분자 물질을 포함하는 핵산 복합체 처리 24시간 후 피부 전달 능력.
도 6a 내지 도 6f는 IFI16을 표적 유전자로 하는 핵산 복합체의 피부질환인 건선에 대한 실험관 시험 및 동물 시험에서의 치료 효과를 나타내는 도면이다.
(a) IL-17A에 의해 유도된 사람 유래 각질 세포주에서 세포 생존율,
(b) IL-17A에 의해 유도된 사람 유래 각질 세포주에서 표적 유전자의 발현 및 하위 경로 유전자의 발현,
(c) imiquimod로 유도한 건선 질환 동물 모델에서 마우스 귀의 건선 표현형이 감소하는 것을 나타낸 사진,
(d) imiquimod로 유도한 건선 질환 동물 모델에서 마우스 귀의 두께가 감소하고, 표적 유전자의 발현이 감소하는 것을 나타낸 도면,
(e) imiquimod로 유도한 건선 질환 동물 모델에서 imiquimod에 의해 증가된 마우스 귀 조직의 epidermis 두께가 핵산 복합체에 의해 감소하는 것을 H&E 염색을 통해 나타낸 도면,
(f) imiquimod로 유도한 건선 질환 동물 모델에서 imiquimod에 의해 증가된 마우스 귀 조직의 Psoriasis marker인 CD3, CD11c의 발현이 핵산복합체에 의해 감소하는 것을 면역염색법을 통해 나타낸 도면.
도 7a 및 도 7b는 Mechanism study of anti-metastatic effect with TGFβR2 targeted PNA in vitro TGFβR2를 표적 유전자로 하는 핵산 복합체의 전이성 피부 흑색종 세포주에서의 세포 전이 능력 억제 효과를 나타내는 도면이다.
(a) TGFβ-2로 유도된 피부 전이성 흑색종 세포주에서 표적 유전자 발현 및 하위 경로 유전자의 발현,
(b) TGFβ-2로 유도된 피부 전이성 흑색종 세포주에서 세포의 전이 능력.
도 8a 내지 도 8j는 TLR2를 표적 유전자로 하는 핵산 복합체의 아토피 피부염 유도 유사 세포 모델 및 아토피 피부염 유도 동물 모델에서의 치료 효과를 나타내는 도면이다.
(a) DNCB로 유도한 사람 유래 각질 세포주에서 세포 생존율 변화,
(b) DNCB로 유도한 사람 유래 각질 세포주에서 표적 유전자 발현 및 하위 경로 유전자의 발현,
(c) NC/Nga 마우스에서 핵산 복합체에 의해 마우스의 아토피 피부염 표현형이 감소하는 것을 사진으로 나타낸 도면,
(d) 집먼지 진드기 추출물을 사용하여 아토피 피부염을 유발한 NC/Nga 마우스에서 핵산 복합체에 의해 혈청 내 IgE 및 TARC의 농도가 감소하는 것을 나타낸 도면,
(e) DNCB를 사용하여 아토피 피부염을 유발한 Balb/C 마우스에서 핵산 복합체에 의해 마우스의 아토피 피부염 표현형이 감소하는 것을 사진으로 나타낸 도면,
(f) DNCB를 사용하여 아토피 피부염을 유발한 Balb/C 마우스에서 핵산 복합체에 의해 혈청 내 IgE 및 TARC의 농도가 감소하는 것을 나타낸 도면,
(g) 집먼지 진드기 추출물을 사용하여 아토피 피부염을 유발한 NC/Nga 마우스에서 핵산 복합체에 의한 경피 두께가 감소를 나타낸 도면,
(h) DNCB를 사용하여 아토피 피부염을 유발한 Balb/C 마우스에서 핵산 복합체에 의한 경피 두께 감소를 나타낸 도면,
(i) 집먼지 진드기 추출물을 사용하여 아토피 피부염을 유발한 NV/Nga 마우스에서 핵산 복합체에 의한 염증성 마커 CD3가 감소하는 것을 나타낸 도면,
(j) DNCB를 사용하여 아토피 피부염을 유발한 NV/Nga 마우스에서 핵산 복합체에 의한 염증성 마커 CD3가 감소하는 것을 나타낸 도면.
도 9a 및 도 9b는 smad3를 표적 유전자로 하는 핵산 복합체의 사람 유래 각질 세포주에서의 세포 손상 회복 효과를 나타내는 도면이다.
(a) TGFβ-1로 유도된 사람 유래 각질 세포주에서 상처 후 회복능,
(b) TGFβ-1로 유도된 사람 유래 각질 세포주에서 표적 유전자 발현.
도 10a 및 도 10b는 TIEG1을 표적 유전자로 하는 핵산 복합체의 켈로이드성 섬유 아세포에서의 세포 성장 억제 효과를 나타내는 도면이다.
(a) 상처 후 비대증 조직에서 분리한 세포주에서 세포 생존율,
(b) 상처 후 비대증 조직에서 분리한 세포주에서 표적 유전자 및 하위 경로 유전자의 발현.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 일 실시예에서, 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 상보적으로 결합된 핵산 복합체가, 피부 투과성 및 피부 잔류성이 있음을 확인하고, 피부 표면 도포를 통한 질병의 치료에 활용될 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 하기 구조식 (1)의 구조를 가지는 핵산 복합체를 함유하는 피부 투과성 전달체에 관한 것이다.
구조식 (1)
[ A ≡ C (+) ]
상기 구조식 (1)에 있어서,
A는 목적하는 유전자와 결합할 수 있는 서열 또는 목적하는 유전자 서열을 가지는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)이고,
C는 생활성 핵산과 결합할 수 있는 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이고,
'≡'는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 간의 상보적인 결합을 의미하며,
A로 표시되는 생활성 핵산은 전체적으로 음전하 또는 중성을 가지며,
C(+)는 캐리어 펩티드 핵산이 전체적으로 양전하를 가진다는 것을 의미하며,
캐리어 펩티드 핵산은 캐리어 펩티드 핵산 전체적으로 양전하를 띠도록 변형된 펩티드 핵산 단량체를 하나 이상 포함한다.
본 발명에 있어서 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체에서의 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 역평행결합(anti-parallel binding) 또는 평행결합(parallel binding) 형태를 가질 수 있다(도 1a 및 도 1b 참조).
본 발명에 있어서, “피부 투과성 전달체”는 생활성 물질을 세포 내로 전달하기 위한 수단으로서, 피부와의 접촉을 통해 생활성 물질을 체내, 궁극적으로 세포 내로 침투시킬 수 있는 전달 물질을 의미하며, 구체적으로는 피부의 표피층의 최 외곽층인 각질층 및/또는 표피층을 통과하여, 표피층이나 진피층에 목적하는 약물을 전달하거나, 진피층도 통과하여 체내로 목적하는 약물을 전달할 수 있는 능력을 가지는 물질을 의미한다.
본 발명에 따른 피부 투과성 전달체는 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체에서의 전체적인 전하량(net charge) 및/또는 핵산 복합체에서의 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산의 개수 등에 따라 각질층, 표피층 또는 진피층에 잔류하거나, 진피층까지 통과하여 체내로 목적하는 약물을 전달할 수 있다.
이에 따라 본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체를 포함하는 피부 투과 전달체는 피부 잔류성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 피부 각질층, 표피층 및 진피층에 상기 생활성 핵산이 존재하는 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, “피부 투과성 전달체”에서 생활성 핵산 자체가 치료용 약물로서 기능할 수도 있고(도 1a 및 도 1b 참조), 또한 “피부 투과성 전달체”에 추가적으로 질병의 치료를 위한 치료용 약물 등이 결합된 형태일 수 있다(도 1c 참조).
즉, 구조식 1에 따른 핵산 복합체 자체가 피부 투과성 전달체이자 치료제 자체로 이용이 가능할 수도 있고, 핵산 복합체에 치료용 약물이 결합된 형태로도 이용이 가능하다.
특히, 본 발명에 따른 “피부 투과성 전달체”는 피부를 통해 체내로 경피 전달(transdermal delivery)된 이후, 목적하는 세포 내로 전달될 수 있는 특성을 가지며, 상기 핵산 복합체를 함유하는 어떠한 형태로도 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서, “생활성 핵산”은 발현을 감소시키고자 하는 목적하는 표적 유전자와 결합할 수 있는 상보적인 서열, 특히 그러한 목적하는 표적 유전자의 mRNA에 결합할 수 있는 상보적인 서열을 가지거나, 발현시키고자 하는 표적 유전자의 발현을 촉진하는 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 핵산으로, 해당 유전자의 발현을 억제하거나, 촉진하는 등의 유전자 발현조절에 관여하는 핵산을 의미하며, 발현을 감소 또는 증가시키고자 하는 표적 유전자에 상보적인 서열을 가지는 핵산이거나, pre-mRNA, miRNA, mRNA 등 단일가닥 RNA 서열에 상보적인 서열의 핵산일 수 있다.
특히, 본 발명에서의 “생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)”은 생체 외(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 표적 유전자 및 이를 포함하는 염기서열과 결합하여 해당 유전자의 고유 기능(예를 들어, 전사체(transcript) 발현 또는 단백질 발현)을 활성화 또는 저해시키거나, pre-mRNA의 스플라이싱(splicing)을 조절(예를 들어, 엑손 스키핑(exon skipping))하는 등의 기능을 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 염기서열은 유전자 조절부위(gene regulatory sequence) 또는 유전자 부위(gene coding sequence) 또는 스플라이싱 조절 부위(splicing regulatory sequence)인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 유전자 조절부위는 프로모터, 전사 인핸서, 5' 비번역 영역, 3' 비번역 영역, 바이러스 팩키징 서열, 및 선택 마커에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 유전자 부위는 엑손 또는 인트론일 수 있으며, 상기 유전자 부위는 유전자의 전사 개시 부위의 10, 5, 3, 1kb 또는 500, 300, 200bp 내에, 예를 들어, 개시 부위의 상류(upstream) 또는 하류(downstream)에 있을 수 있다. 또한, 상기 스플라이싱 조절부위는 exon skipping, cryptic splicing, pseudo-splice site activation, intron retention, alternative splicing deregulation 관련 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, “캐리어 펩티드 핵산”은 생활성 핵산과 일부 혹은 전부의 염기가 상보적으로 결합하여 기능성을 부여하는 핵산을 의미하며, 본 발명에서 사용되는 캐리어 펩티드 핵산은 펩티드 핵산(PNA: Peptide Nucleic Acid) 뿐 아니라, 이와 유사한 변형된 핵산을 사용할 수 있으며, 펩티드 핵산이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 피부 투과 전달체에 포함되는 핵산 복합체는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 엔도좀 탈출(endosome escape)을 도와주는 물질을 더 포함하여 하기 구조식 (2)의 구조를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 “피부 투과성 전달체”는 엔도좀 탈출(endosome escape)를 도와주는 물질이 결합된 형태일 수 있다(구조식 (2), 도 1d 및 도 1e 참조).
구조식 (2)
[ mA ≡ mC (+) ]
상기 구조식 (2)에 있어서,
'm'은 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 엔도좀 탈출(endosome escape)을 도와주는 물질을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산은 각각의 핵산의 5'-말단과 3'-말단에 엔도좀 탈출을 도와주는 물질을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, “엔도좀 탈출을 도와주는 물질”은 엔도좀 내부의 삼투압을 증가시키거나, 엔도좀의 막을 불안정화 시키는 방법에 의하여 생활성 핵산의 엔도좀에서 탈출을 도와주는 것을 특징으로 할 수 있다. 생활성 핵산이 보다 효율적이고 빠르게 핵이나 세포질로 이동하여 표적 유전자를 만나 작용하도록 도와주는 것을 의미한다(D. W. Pack, A. S. Hoffman, S. Pun, P. S. Stayton, “Design and development of polymers for gene delivery,” Nat. Rev. Drug. Discov., 4, 581-593 (2005)).
상기 엔도좀 탈출을 도와주는 물질로서 생활성 핵산에는 GLFDIIKKIAESF(서열번호 49)의 서열을 갖는 펩티드가 링커 매개로 연결될 수 있으며, 캐리어 펩티드 핵산 또한 Histisine(10)을 링커 매개로 연결하는 방법으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 엔도좀 탈출을 도와주는 물질은 펩티드, 지질 나노물질(lipid nanoparticles), 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles), 고분자 나노구(polymer nanospheres), 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles), 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles), 양이온 고분자(cationic polymer) 및 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 펩티드는 GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(서열번호 48), GLFDIIKKIAESF(서열번호 49) 및 Histidine(10)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 지질 나노물질(lipid nanoparticles)은 Lipid, phospholipids, cetyl palmitate, poloxamer 18, Tween 85, tristearin glyceride 및 Tween 80로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles)은 poly(amidoamine) 또는 polyethylenimine (PEI)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 고분자 나노구(polymer nanospheres)는 polycaprolactone, poly(lactide-co-glycolide, polylactide, polyglycolide, poly(d,l-lactide), chitosan 및 PLGA-polyethylene glycol로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles)은 Fe2O3 Fe3O4, WO3 및 WO2.9로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles)은 1-(aminoethyl)iminobis[N-(oleicylcysteinyl-1-amino-ethyl)propionamide], N-alkylated derivative of PTA 및 3, 5-didodecyloxybenzamidine로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 양이온 고분자(cationic polymer)는 vinylpyrrolidone-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate acid copolymer diethyl sulphate, polyisobutylene 및 poly(N-vinylcarbazole)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)는 polyacids, poly(acrylic acid), poly(methacrylic acid) 및 hydrolyzed polyacrylamide로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 피부 투과성 전달체에 포함되는 핵산 복합체는 앞서 기술한 바와 같이, 치료용 약물, 예를 들어 치료용 단백질, 치료용 화합물, 암 화학치료제, 톡신, 세포독성 물질, 소염제, 관절염 치료제, 성장인자, 사이토킨, 케모카인, 항체, siRNA나 miRNA와 같은 RNAi, 안티센스, 핵산, 핵산 유사체, 세포, 바이러스, 파지, 바이러스 입자, 파지 입자, 바이러스 캡시드, 파지 캡시드, 바이러스 유사입자, 리포솜, 미셀, 비드, 나노입자, 마이크로입자, 화학치료제, 조영제, 영상제, 표지(label), 표지화제 또는 그 배합물로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 피부 투과성 전달체에 포함되는 핵산 복합체와 치료용 약물은 공유결합 또는 링커-매개된 형태로 결합될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 각각 2 내지 50개, 바람직하게는 5 내지 30개, 더욱 바람직하게는 10 내지 25개, 가장 바람직하게는 15 내지 17개의 핵산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 생활성 핵산은 천연(natural) 핵산 염기 및/또는 변형된 핵산 단량체로 이루어져 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산은 DNA, RNA 또는 변형된 핵산인 PNA(peptide nucleic acid), PMO(phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide), LNA(locked nucleic acid), GNA(glycol nucleic acid), TNA(threose nucleic acid), 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), 앱타머(aptamer), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), 리보자임(ribozyme) 및 DNAzyme로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 DNA, RNA 또는 변형된 핵산인 PNA, PMO, LNA, GNA 및 TNA로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어, 상기 생활성 핵산에 사용된 단량체가 PNA일 경우, 생활성 펩티드 핵산이라고 하며, 다른 단량체가 사용된 경우에도 동일한 방식으로 부른다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 포스포디에스테르(phosphodiester), 2' 0-메틸(2' 0-methyl), 2' 메톡시-에틸(2' methoxy-ethyl), 포스포르아미데이트(phosphoramidate), 메틸포스포네이트(methylphosphonate) 및 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 작용기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 상기 생활성 핵산과 염기서열 일부 혹은 전부가 상보적인 서열로 구성되는 것을 특징으로 할 수 있다. 특히, 캐리어 펩티드 핵산은 유니버설 염기(universal base)를 하나 이상 포함할 수 있으며, 캐리어 펩티드 핵산 모두가 유니버설 염기로 이루어질 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 피부 투과성 전달체에 포함되는 핵산 복합체 내의 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산 각각은 전기적 특성이 전체적으로, 양전하(양성), 음전하(음성) 또는 중성 전하를 가지는 것을 특징으로 하는 복합체일 수 있다.
상기 전기적 특성의 표현에 있어, “전체적으로”의 의미는 개별 염기의 전기적 특성이 아닌 전체적인 생활성 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산 각각의 전하가 외부에서 볼 때 전체적인 전기적 특성을 의미하는 것으로, 예를 들어, 생활성 핵산 내의 일부 단량체가 양성을 가지더라도 음성을 가지는 단량체의 개수가 더 많이 존재하는 경우에는 생활성 핵산은 “전체적으로” 전기적 특성을 볼 때 음전하를 가지게 되는 것이며, 캐리어 펩티드 핵산 내의 일부 염기 및/또는 백본(backbone)이 음성을 가지더라도 양성을 가지는 염기 및/또는 백본의 개수가 더 많이 존재하는 경우에는 캐리어 펩티드 핵산은 “전체적으로” 전기적 특성을 볼 때 양전하를 가지게 되는 것이다.
이러한 관점에서, 본 발명의 구조식 (1)의 구조를 가지는 핵산 복합체는 전체적으로 양전하를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 구조식 (1)에 따른 핵산 복합체에 있어서, 바람직하게는 상기 생활성 핵산은 전체적으로 전기적 특성을 볼 때 음전하 또는 중성의 특성을 가지며, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 전기적 특성을 볼 때 양전하 특성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 전기적 특성의 부여는 변형된 펩티드 핵산 단량체를 사용할 수 있고, 변형된 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 캐리어 펩티드 핵산으로 리신(Lysine, Lys, K), 아르기닌(Arginine, Arg, R), 히스티딘(Histidine, His, H), 디아미노 부티르산(Diamino butyric acid, DAB), 오르니틴(Ornithine, Orn) 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양전하의 아미노산을 포함하고, 음전하를 가지는 캐리어 펩티드 핵산으로 음전하의 아미노산인 글루타민산(Glutamic acid, Glu, E) 또는 아미노산 유사체의 음전하의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 양전하를 가지도록 1개 이상의 gamma- 또는 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 gamma- 혹은 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체는 전기적 양성을 가지도록 리신(Lysine, Lys, K), 아르기닌(Arginine, Arg, R), 히스티딘(Histidine, His, H), 디아미노 부티르산(Diamino butyric acid, DAB), 오르니틴(Ornithine, Orn) 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 양전하를 가지는 아미노산을 backbone에 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 전하 부여를 위한 펩티드 핵산 단량체의 변형은 상기 backbone 변형 이외에도 nucleobase가 변형된 펩티드핵산 단량체를 사용할 수 있다. 바람직하게는 전기적 양성을 가지도록 amine, triazole, imidazole moeity를 nucleobase에 포함하거나, 전기적 음성을 가지도록 carboxylic acid를 염기에 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산의 변형 펩티드 핵산 단량체는 음전하를 backbone 혹은 nucleobase에 더 포함할 수 있지만, 변형 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 단량체가 음전하를 가지는 단량체에 비해 더 많이 포함되어 전체적으로 캐리어 펩티드 핵산의 전하가 양성이 되는 것이 바람직하다.
바람직하게는 본 발명에 따른 상기 구조식 (1)의 핵산 복합체는 전체적으로 양의 전하를 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 상기 구조식 (1)의 핵산 복합체에 있어, 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머 또는 형광/발광 표지자 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질이 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산에 결합된 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 상기 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머 및 이미징을 위한 형광/발광 표지자 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질은 상기 캐리어 펩티드 핵산에 결합된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱타머, 소광자, 형광 표지자 및 발광 표지자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질과 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산의 결합은 단순 공유결합 또는 링커로 매개된 공유결합인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다(표 1 참조). 바람직하게는, 상기 핵산 운반체에 결합된 세포투과, 용해도, 안정성, 운반 및 이미징 관련 물질(예컨대, 소수성 잔기 등)은 표적 유전자의 발현을 조절하는 생활성 핵산과 독립적으로 존재하게 된다.
본 발명에 있어서, 앞서 기술한 바와 같이, 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 상보적인 결합 형태는 크게 역평행결합(antiparallel binding)과 평행결합(parallel binding)의 형태를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 상보적인 결합 형태는 생활성 핵산의 목적서열(생활성 핵산과 상보적인 서열) 존재 하에서 분리되는 구조를 가진다.
상기 역평행결합과 평행결합은 DNA-DNA 또는 DNA-PNA의 결합 방식에 있어, 5'-방향성과 3'-방향성에 따라 결정된다. 역평행 결합은 일반적인 DNA-DNA 또는 DNA-PNA의 결합 방식으로, 본 발명에 따른 구조식 (1)의 핵산 복합체를 예로 들어 설명하면, 생활성 핵산은 5'에서 3' 방향으로, 캐리어 펩티드 핵산은 3'에서 5' 방향으로 서로 결합되는 형태를 의미한다. 평행결합은 역평행결합에 비해서는 결합력이 다소 떨어지는 형태로, 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 모두가 5'에서 3' 방향 또는 3'에서 5' 방향으로 서로 결합되는 형태를 의미한다.
본 발명에 따른 구조식 (1)의 핵산 복합체에 있어서, 바람직하게는 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력은 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자, 특히 목적 유전자의 mRNA와의 결합력보다 낮은 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 결합력은 융해온도, melting temperature 또는 Tm에 의해 결정된다.
상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력(융해온도, melting temperature, Tm)이 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자, 특히 목적 유전자의 mRNA와의 결합력보다 낮게 하기 위한 구체적인 방법의 예로는, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산이 평행 결합(Parallel binding) 또는 부분 특이결합(Partial specific binding)하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 예로서 상기 캐리어 펩티드 핵산이 링커, 유니버설 염기(universal base) 및 생활성 핵산의 대응되는 염기와 상보적이지 않은 염기를 가지는 펩티드 핵산 염기로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 펩티드 핵산 염기를 갖는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다(표 1 참조).
본 발명에 있어서, 상기 유니버설 염기(universal base)는 아데닌(adenine), 구아닌(guanine), 사이토신 (cytosine), 티민(thymine), 우라실(Uracil) 등의 천연 염기와 선택성 없이 결합하고, 상보적인 결합력보다 낮은 결합력을 가지는 염기로 이노신 PNA(inosine PNA), 인돌 PNA(indole PNA), 나이트로인돌 PNA(nitroindole PNA) 및 무염기(abasic)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 사용할 수 있으며, 바람직하게는 이노신 PNA를 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 결합 예시
Type 복합체 구조 특징
Ⅰ 캐리어 펩티드 핵산 5'-[NNNNN*NNNNNNNNN*NNNNN]-3' Partial match 1 (Substitution)
생활성 핵산 3'-[NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN]-5'
Ⅱ 캐리어 펩티드 핵산 5'-[NNNNNNNNNNNNNNNNNNN]-3' Partial match 2 (Insertion/Deletion)
생활성 핵산 3'-[NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN]-5'
Ⅲ 캐리어 펩티드 핵산 5'-[NNNNNNN$$$$NN$NNNNNNN]-3' Universal base
생활성 핵산 3'-[NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN]-5'
Ⅳ 캐리어 펩티드 핵산 5'-[NNNNNNNNN=NNNNNNNNN]-3' Linker
생활성 핵산 3'-[NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN]-5'
Ⅴ 캐리어 펩티드 핵산 5'-[NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN]-3' Parallel binding
생활성 핵산 5'-[NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN]-3'
상기 표 1에서, N은 핵산의 염기(ATGC)이며, *는 안티센스 핵산(antisense nucleic acid) 서열과 상보적이지 않은 서열이고, $는 유니버설 염기(universal base)이이며, =은 링커이고, 5'-, 3'-은 핵산(염기)의 방향성을 나타낸다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체의 기능 조절을 위한 핵산들의 결합 형태와 전기적 성질 조합을 제공하고, 상기 핵산의 결합 형태와 전기적 성질 조합으로 입자 크기 및 작용 시점을 조절하고, 세포투과성, 용해도 및 특이도를 향상시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 결합력 조절을 통해, 목적 유전자의 존재 하에서, 생활성 펩티드 핵산이 목적 서열과 결합되는 시점(생활성 핵산의 목적 서열로의 치환되는 시점, 표적 특이적 분리 및 결합 시점) 등의 조절이 가능하다.
본 발명에 따른 구조식 (1)의 핵산 복합체에 있어서, 생활성 핵산의 목적 유전자로의 치환(strand displacement) 시점, 표적 특이적 분리 및 결합(target specific release and bind) 시점의 조절은 복합체의 비특이 결합을 위한 캐리어 펩티드 핵산의 비특이 염기, 유니버설 염기 및 linker의 유무, 개수 및 위치에 의하여 조절이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 펩티드 복합체의 상보적인 결합의 형태인 평행(parallel) 또는 역평행(antiparallel) 형태의 결합 등과 상기 조건의 조합에 의하여 조절이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 구조식 (1)의 핵산 복합체의 입자는 5 nm 내지 300 nm, 바람직하게는 10 nm 내지 80 nm, 가장 바람직하게는 15 nm 내지 70 nm의 크기를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 복합체의 입자 크기는 생활성 펩티드 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 전하 밸런스(charge balance)를 조절함으로써 조절되는 것을 특징으로 할 수 있다. 구체적으로는 캐리어 펩티드 핵산의 양전하가 증가하면 입자의 크기가 작아지나, 캐리어 펩티드 핵산의 양전하가 일정 수준을 넘게 되면 입자의 크기가 커지는 특징을 가지게 된다. 또한, 입자 크기를 결정하는 다른 중요한 요소로 복합체를 이루는 생활성 펩티드 핵산 전하에 따른 전반적인 캐리어 펩티드 핵산과의 적절한 전하 밸런스에 의해서 입자 크기가 결정된다.
본 발명에 따른 캐리어 펩티드 핵산의 양전하는 1개 내지 7개(양전하를 가지는 단량체가 1개 내지 7개 포함됨을 의미한다), 바람직하게는 2개 내지 5개, 가장 바람직하게는 2개 내지 3개이며, 생활성 핵산의 전하는 전하 밸런스의 넷 차지(net charge)가 음전하 0개 내지 5개, 바람직하게는 0개 내지 3개이다.
본 발명에 있어서, 상기 구조식 (1)의 핵산 복합체는 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산이 적절한 조건에서 혼성화됨으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 “혼성화”는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 결합 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 구조식 (1)의 구조를 가지는 핵산 복합체를 함유하는 피부 투과성 전달체를 포함하는 질병의 진단용 조성물에 관한 것이다.
바람직하게는 본 발명에 따른 피부 투과성 전달체가 질병의 진단 목적으로 사용되는 경우, 구조식 (1)에 따른 상기 생활성 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산의 양 말단에는 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자(quencher)가 결합될 수 있다. 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 CY5을 사용한다. 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 구조식 (1)의 구조를 가지는 핵산 복합체를 함유하는 피부 투과성 전달체를 포함하는 질병의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 “표적 유전자”는 활성, 억제 또는 표지 하고자 하는 핵산 서열(염기서열)을 의미하며, 용어 “표적 핵산”과 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
상기 표적 유전자를 포함하는 표적 핵산(염기서열)이 생체 외(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 상기 복합체와 접촉(결합)하게 되면, 캐리어 펩티드 핵산으로부터 생활성 핵산이 분리되어 생물학적 활성을 나타내게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 구조식 (1)의 구조를 가지는 핵산 복합체를 이용하여 진단 또는 예방, 치료할 수 있는 질병은, 상기 핵산 복합체 내의 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자 또는 핵산 복합체와 결합된 치료용 약물에 따라 결정될 수 있으며,
바람직하게는 피부질환, 예를 들어 건선(psoriasis), 아토피 피부염(atopic dermatitis)를 포함하는 아토피 질환(atopic disease), 흑색종(melanoma) 등의 피부암(skin cancer), 켈로이드(Keloid)성 질환, 피부 손상 및 색소침착 등의 질환, 종양 또는 암, 염증성 질환, 노인성 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 희귀질환 및 중증질환, 심혈관 질환, 대사성 질환 등의 치료에 사용될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명에 있어서, 용어 “치료용 조성물”은 "의약(약제학적, 약학적) 조성물(pharmaceutical composition)"과 혼용될 수 있으며, 본 발명의 생활성 핵산 및 상기 핵산과 결합하는 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 핵산 복합체를 유효성분으로 포함하며, 추가적으로 상기 핵산 복합체에 목적하는 질환을 치료하기 위한 치료용 약물이 결합된 형태일 수 있다.
이에 따라 본 발명에 있어서, 상기 피부 통과 전달체를 포함하는 치료용 조성물로 예방 또는 치료할 수 있는 질병은 피부질환, 예를 들어 건선(psoriasis), 아토피 피부염(atopic dermatitis)를 포함하는 아토피 질환(atopic disease), 흑색종(melanoma) 등의 피부암(skin cancer), 켈로이드(Keloid)성 질환, 피부 손상 및 색소침착 등의 질환, 종양 또는 암, 염증성 질환, 노인성 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 희귀질환 및 중증질환, 심혈관 질환, 대사성 질환 등의 치료에 사용될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 치료용 조성물은 표준 의약 실시에 따라 피부 전달 형태의 제형으로 제형화될 수 있다. 이들 제형은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는, 특히 피부에 적용될 수 있는 형태의 제형에 적합한 담체, 부형제, 보조제 또는 희석제 등의 첨가물을 함유할 수 있다.
바람직하게는 본 발명에 따른 치료용 조성물은 수성액, 겔, 연고, 크림, 로션, 페이스트, 도말제 또는 패치 형태로 제형화될 수 있다.
가장 바람직하게는 수성액의 형태로 제형화될 수 있고, 이때 수성액은 증류수 및 버퍼 용액의 형태가 사용될 수 있다.
용어 "약학적으로 허용되는(physiologically acceptable)"은 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 특성을 의미한다.
용어 "담체(carrier)"는 세포 또는 조직 내로의 핵산 복합체의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
용어 "희석제(diluent)"는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.
본 발명에서의 핵산 복합체를 함유하는 물질은, 환자에게 그 자체로서 또는 병용 요법(combination therapy)에서와 같이 다른 활성 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형제와 함께 혼합된 의약 조성물로서 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용에 적합한 의약 조성물에는, 활성 성분들이 그것의 의도된 목적을 달성하기에 유효한 양으로 함유되어 있는 조성물이 포함된다. 더욱 구체적으로, 치료적 유효량은 치료될 객체의 생존을 연장하거나, 질환의 증상을 방지, 경감 또는 완화시키는데 유효한 화합물의 량을 의미한다. 치료적 유효량의 결정은, 특히, 여기에 제공된 상세한 개시 내용 측면에서, 통상의 기술자의 능력 범위 내에 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은, 상기 피부 투과성 전달체를 포함하는 치료용 조성물의 투여(또는 도포)로 질환의 발병을 막거나, 이의 진행을 억제시키는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는, 상기 피부 투과성 전달체를 포함하는 치료용 조성물의 투여(또는 도포)로 질환의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 피부 투과성 전달체를 포함하는 질병의 예방 또는 치료용 조성물은 바람직하게는 피부질환의 예방 또는 치료용 조성물인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 핵산 복합체 내에 포함된 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자는 IFI16, TGFβR2, TLR2, smad3 및 TIEG1으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상을 예시로 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 피부질환은 건선, 피부암, 아토피 질환 또는 켈로이드성 질환 및 색소침착 등이 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는 본 발명은 건선(psoriasis) 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 건선 치료용 조성물은 서열번호 22로 표시되는 IFI16 특이적 생활성 펩티드 핵산 및 이에 상보적인 캐리어 펩티드 핵산을 포함한다. 캐리어 펩티드 핵산은 바람직하게는 서열번호 23 또는 24의 서열을 가질 수 있으며, 상기 서열 중 일부가 유니버설 염기로 치환되어 사용될 수도 있다.
본 발명은 또한, 악성 흑색종(malignant melanoma) 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 악성 흑색종(malignant melanoma) 치료용 조성물은 서열번호 25 또는 26의 서열인 TGFRβ2 특이적 생활성 펩티드 핵산 또는 각각 이에 상보적인 캐리어 펩티드 핵산을 포함한다. 캐리어 펩티드 핵산은 바람직하게는 서열번호 27 내지 30의 서열을 가질 수 있으며, 상기 서열 중 일부가 유니버설 염기로 치환되어 사용될 수도 있다.
본 발명은 또한, 아토피 피부염(atopic dermatitis) 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 아토피 피부염(atopic dermatitis) 치료용 조성물은 서열번호 31 또는 32의 서열인 TLR2 특이적 생활성 펩티드 핵산 및 이에 상보적인 캐리어 펩티드 핵산을 포함한다. 캐리어 펩티드 핵산은 바람직하게는 서열번호 33 내지 35의 서열을 가질 수 있으며, 상기 서열 중 일부가 유니버설 염기로 치환되어 사용될 수도 있다.
본 발명은 또한, 피부 손상 치료용 조성물을 제공한다. 상기 치료용 조성물은 피부 상처 치료(skin wound healing)를 포함하는 피부 재생(skin regeneration)을 위한 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 피부 손상 치료용 조성물은 서열번호 36 또는 37의 서열인 smad3 특이적 생활성 펩티드 핵산 및 이에 상보적인 캐리어 펩티드 핵산을 포함한다. 캐리어 펩티드 핵산은 바람직하게는 서열번호 38 내지 41의 서열을 가질 수 있으며, 상기 서열 중 일부가 유니버설 염기로 치환되어 사용될 수도 있다.
본 발명은 또한, 켈로이드(keloid) 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 켈로이드(keloid) 치료용 조성물은 서열번호 42 또는 43의 서열인 TIEG1 특이적 생활성 펩티드 핵산 및 이에 상보적인 캐리어 펩티드 핵산을 포함한다. 캐리어 펩티드 핵산은 바람직하게는 서열번호 44 내지 47의 서열을 가질 수 있으며, 상기 서열 중 일부가 유니버설 염기로 치환되어 사용될 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 피부 투과성 전달체에 포함된 핵산 복합체는 리포솜(liposome) 등의 전달체를 이용하여 투여(또는 도포)할 수도 있다. 상기 리포솜은 림프 조직과 같은 특정 조직에 대해 상기 복합체를 표적화하거나, 감염 세포에 대해 선택적으로 표적화하는데 도움을 줄 수 있고, 또한 상기 복합체가 포함된 조성물의 반감기를 증가시키는데 도움을 줄 수 있다. 리포솜으로는 에멀션, 포움(foam), 마이셀(micelle), 불용성 단층, 액정, 인지질 분산물, 라멜라 층(lamellar layer) 등이 있다. 이러한 제제에 있어서, 송달되는 상기 복합체는, 단독으로 또는 특정 세포들을 대상으로, CD45 항원에 결합되는 모노클로날 항체와 같은 림프 세포 중 우세한 수용체에 결합하는 분자와 함께 또는 기타 치료 조성물과 함께, 리포솜의 일부로서 혼입시킨다. 따라서, 본 발명의 소정 복합체로 충진되거나 도포되어(decorated) 상기 핵산 복합체 조성물을 송달하는 리포솜은 림프 세포의 상기 부위로 지향될 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 리포솜은 일반적으로 중성 및 음전하 인지질 및 콜레스테롤 등의 스테롤을 비롯한 표준 베시클 (vesicle)-형성 지질로부터 형성된다. 일반적으로, 예를 들어 혈류 중의 리포솜의 안정성, 산 불안정성(acid lability) 및 리포솜의 크기 등을 고려하여 지질을 선택한다. 리포솜 제조에는 다양한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Szoka, et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:467, 1980), 및 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호, 제4,837,028호 및 제5,019,369호]에 기재되어 있는 바와 같은 방법을 이용할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 구조식 (1)의 구조를 가지는 핵산 복합체를 함유하는 피부 투과성 전달체를 개체에 투여(또는 도포)하여 질병을 치료하고 억제(또는 완화)하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 전달체를 이용하여 치료할 수 있는 질환은 사용되는 생활성 핵산의 특성에 따라 결정되며, 특별히 제한되지는 않는다.
본 발명에 따른 전달체를 포함하는 조성물은 상기의 질환을 치료하기 위하여 또는 상기 질환의 증세를 억제(또는 완화)하기 위하여 의약으로 효과적인 양으로 피부에 적용될 수 있다. 피부질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 치료 회수, 적용 형태 및 경로 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 해당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기한 약리학적 또는 생리학적 성분을 함께 적용하거나 순차적으로 적용할 수 있으며, 또한 추가의 종래의 치료제와 병용하여 적용될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 적용될 수 있다. 이러한 적용은 단일 또는 다중적으로 적용일 수 있다.
본 발명에서, "개체"는 본 발명에 따른 피부 투과성 전달체를 투여(도포)하여 경감, 억제 또는 치료될 수 있는 상태 또는 질환을 앓고 있거나 그러한 위험이 있는 포유동물을 의미하며, 바람직하게 사람을 의미한다.
또한, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 투여량(도포량)은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여(도포) 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000㎎/일이고, 바람직하게는 0.01 ~ 500㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여(도포)할 수도 있다.
본 명세서에 기재되어 있는 피부 투과성 전달체 또는 이를 포함하는 조성물의 독성과 치료 효율성은, 예를 들어, LD50(군집의 50%에 대한 치사량), ED50(군집의 50%에 대해 치료 효과를 갖는 선량), IC50(군집의 50%에 대해 치료 억제 효과를 갖는 선량)을 결정하기 위하여, 세포 배양 또는 실험동물에서의 표준 제약 과정들에 의해 산정될 수 있다. 독성과 치료 효과 간의 선량 비가 치료 지수이고 이것은 LD50과 ED50(또는, IC50) 간의 비율로서 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 보이는 화합물들이 바람직하다. 이들 세포 배양 분석에서 얻어진 데이터는 인간에 사용하는 선량의 범위를 산정하는데 사용될 수 있다. 그러한 화합물들의 투여량(dosage) 또는 도포량은 바람직하게는 독성이 없거나 거의 없는 상태에서 ED50(또는, IC50)을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 생활성 핵산( Bioactive Nucleic Acid ) 및 캐리어 펩티드 핵산, 및 이들을 이용한 복합체의 제조
본 발명에 따른 구조식 (1)의 핵산 복합체의 피부 투과 효과 및 피부 잔류 효과 검증을 위하여, 표적유전자로 건선 질환 표적 유전자인 IFI16을 사용하였다. IFI16은 건선 질환을 가지고 있는 환자의 피부에서 공통적으로 발현되는 단백질로서, 건선치료에 있어서 중요한 표적이 될 것으로 예측되고 있다(Up-regulation of Interferon-inducible protein 16 contributes to psoriasis by modulating chemokine production in keratinocytes 6:25381).
피부 투과 효과 및 피부 잔류 효과를 확인하기 위해 IFI16에 대한 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)으로 안티센스 펩티드 핵산(antisense PNA) 및 RNA를 사용하였다.
본 발명의 생활성 핵산(antisense PNA 및 RNA)은 서열번호 1 내지 9로 기재되는 서열로 구성되어 있다. 본 실시예에서 사용된 펩티드 핵산 기반 생활성 핵산은 이미징을 위한 형광(Cy3)을 3' 말단에 결합하였으며 염기서열, 단량체 변형 및 구조는 하기 표 2와 같다.
본 발명에서 사용한 모든 펩티드 핵산은 파나진(PANAGENE, 한국)에서 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였다. 본 발명의 실시예에 따른 모든 캐리어 펩티드 핵산은 서열번호 10 내지 21로 기재되는 서열로 구성되어 있다(표 2).
피부 투과 효과 및 피부 잔류 효과 검증을 위한 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 서열
구분 서열번호 염기서열 단량체 변형
생활성 핵산 서열번호 1 5'-AT(-)TCA(+)CAT(-)CAG(+)CC(-)AC-O-K (cy3)-3' -+-+-
서열번호 2 5'-ATTCACATCAG)CCAC-O-K (cy3)-3'
서열번호 3 5'-AT(-)TCAC(+)ATCAG(-)CCAC-O-K (cy3)-3' -+-
서열번호 4 5'-AT(-)TCA(-)CAT(-)CAG(-)CC(-)AC-O-K (cy3)-3' -----
서열번호 5 5'-AT(-)TCACAT(-)CAGCC(-)AC-O-K (cy3)-3' ---
서열번호 6 5'-ATT(+)CACATC(+)AGCC(+)AC-O-K (cy3)-3' ++
서열번호 7 5'-A(+)TTC(+)AC(+)ATC(+)AGCC(+)AC-O-K (cy3)-3' +++++
서열번호 8 5'- ATTCACATCAG)CCAC-(Cy3)-3'
서열번호 9 5'-stearic acid-O-AT(-)TCA(+)CAT(-)CAG(+)CC(-)AC-O-K (cy3)-3' -+-+-
캐리어 펩티드 핵산 서열번호 10 GTGGCTGATGTGAAT
서열번호 11 5'- TAAGTGTAGTCGGTG -O-K-3'
서열번호 12 5'- TA(+)AGTGTAGTCGG(+)TG -O-K-3' ++
서열번호 13 5'- TA(+)AGTGTA(+)GTCGG(+)TG -O-K-3' +++
서열번호 14 5'- TA(+)AGT(+)GTA(+)GTC(+)GG(+)TG -O-K-3' +++++
서열번호 15 5'- TA(-)AGTGTA(-)GTCGG(-)TG -O-K-3' ---
서열번호 16 5'- TA(-)AGT(-)GTA(-)GTC(-)GG(-)TG -O-K-3' -----
서열번호 17 5'- CG(+)GT(+)G-O-K -3' ++
서열번호 18 5'-GTC(+)GGT(+)G-O-K -3' ++
서열번호 19 5'-TAG(+)TCG(+)GTG-O-K-3 ++
서열번호 20 5'-TG(+)TAG(+)TCGG(+)TG-O-K-3' +++
서열번호 21 5'-AG(+)TGTA(+)GTCG(+)GTG-O-K-3' +++
단량체의 변형은 전기적인 성질을 부여하기 위하여 펩티드핵산의 backbone을 전기적 양성은 리신(Lysine, Lys, K, (+)로 표기)을 전기적 음성은 글루타민산(Glutamic acid, Glu, E, (-)로 표기)로 변형된 펩티드 backbone을 가지도록 제작하였다.
각각의 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 조합은 DMSO 하에서 혼성화 되었으며, 그 결과 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산으로 구성된 복합체가 제작되었다.
실시예 2: 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 핵산 복합체의 피부 투과 효과 분석
실시예 1에서 제조된 복합체의 피부 투과 효과를 확인하기 위해 누드 마우스의 등에 일정량을 도포하여 1, 3, 24 시간 동안 방치한 후 도포한 부위의 조직을 생검하였다. 생검한 조직을 4% 포르말린 용액에 고정하여 하루 동안 방치한 후 동결 절편기를 사용하여 마우스 등 조직을 20 μm로 절편하고 슬라이드에 마운팅 하였다. 마운팅한 조직을 형광현미경을 이용하여 복합체의 피부 투과 여부를 확인하였다.
본 실시예에서 사용한 핵산 복합체의 조합은 하기 표 3과 같다.
피부 투과 효과 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
siRNA single 서열번호 8
siRNA duplex 서열번호 8 및 10
PNA single 서열번호 1
PNA duplex 1 서열번호 1 및 17
PNA duplex 2 서열번호 1 및 13
그 결과, 도 3 및 도 4a 내지 도 4l에 나타낸 바와 같이, 핵산 복합체의 여러 조합들을 통해 1, 3, 24 시간에서 조합별 피부 전달 효과를 확인하였다.
실시예 3: 구조식 ( 1)의 구조를 가지는 복합체를 함유하고 저분자 물질을 링커 매개로 연결한 피부 투과성 전달체를 이용한 피부 투과 효과 분석
실시예 1에서 제조된 복합체와 비교하여 복합체에 저분자 물질을 링커 매개로 연결한 피부 투과성 전달체의 피부 투과 효과를 확인하기 위해 누드 마우스 등에 일정량 도포하여 0, 3, 24시간 동안 방치한 후 도포한 부위의 조직을 생검하였다. 생검한 조직을 4% 포르말린 용액에 고정하여 하루 동안 방치한 후 동결 절편기를 사용하여 마우스 등조직을 20 μm로 절편하고 슬라이드에 마운팅하였다. 마운팅한 조직을 형광현미경을 이용하여 피부 투과성 전달체인 핵산 복합체에 저분자 물질을 연결하였을 때의 피부 전달 효과를 확인하였다.
본 실시예에서 사용한 핵산 복합체의 조합은 하기 표 4와 같다.
저분자 물질이 연결된 핵산 복합체의 피부 투과 효과 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
PNA duplex 1 서열번호 1 및 17
PNA duplex 2 서열번호 1 및 13
PNA duplex 3 서열번호 9 및 17
PNA duplex 4 서열번호 9 및 13
그 결과, 도 5a 내지 도 5c 에 나타낸 바와 같이, 저분자 물질을 링커 매개로 연결한 피부 투과성 핵산 복합체에서도 기존 핵산 복합체와 같이 3시간 이후부터 피부 전달 효과가 나타나는 것을 형광현미경을 통해 확인하였다.
실시예 4: 구조식 ( 1)의 구조를 가지는 복합체를 함유하는 피부 투과성 전달체를 이용한 건선 ( psoriasis ) 치료 효과 분석
실시예 1에 따라, 하기 표 5의 구조로 제조된 IFI16를 표적 유전자로 하는 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 피부 투과성 전달체를 이용하여 건선 치료 효과를 분석하였다.
IFI16 활성 억제를 위한 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 서열
구분 서열번호 염기서열 단량체 변형
생활성 핵산 서열번호 22 5'- AT(-)TCA(+)CAT(-)CAG(+)CC(-)AC-O-K-3' -+-+-
캐리어 펩티드 핵산 서열번호 23 5'-CG(+)GT(+)G-O-K-3' ++
서열번호 24 5'-K-O-GT(+)GG(+)C-3' ++
실시예 4-1: 세포 배양
CLS(CLS Cell Lines Service, 독일)로부터 입수한 인간 각질 세포(HaCaT)를 DMEM 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, 웰진, 한국)에 10％(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37℃, 5％(v/v) CO2의 조건하에서 배양하였다. 건선 유사 세포 모델을 만들기 위해 IL-17A를 10 ng/mL로 처리하여 배양하였다.
실시예 4-2: MTT ( MTT assay ) 으로 각질 세포주에서 세포 생존율 분석
실시예 1에 따라, 표 5의 구조로 제조된 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 이용하여 96웰 플레이트에 6x103으로 세포를 씨딩하고 24시간 배양 후 실시예 4-1의 조건으로 배양된 인간 유래 각질 세포주에 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) 용액을 1X PBS에 5 mg/mL 농도로 제조하고 well당 20 μL로 처리하여 4시간 배양 후 OD (optical density)를 spectrophotometer로 측정하여 분석하였다.
서열번호 22 및 서열번호 23의 핵산 복합체를 이용하였다(PNA 4). 그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, IL-17A로 유도된 건선 유사 세포 모델에서 핵산 복합체에 의해 세포 생존율이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 4-3: 웨스턴 블랏 분석( Western blot assay ) 으로 유전자 발현의 분석
인간 유래 각질 세포주를 6웰 플레이트에 1x105으로 세포를 씨딩하고 24시간 배양 후 실시예 4-1의 조건으로 실험을 진행하여 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 처리하고 24, 48, 72시간 배양한 후, RIPA buffer를 각 웰에 30 μL씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30 μg을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 IFI16 (Cell signaling Technology, 미국), p-NFkB (Cell signaling Technology, 미국)를 1:1000으로 처리하고 4 ℃ 에서 하루동안 방치하였다. 1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit (SantaCruz Biotech., 미국)를 1:2000으로 처리하여 상온에서 2시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 각질 세포주에서 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
표 5의 서열번호 22 및 서열번호 23의 핵산 복합체에 대해서 각질 세포주에서의 IFI16 단백질 및 하위 경로 유전자의 발현 패턴 분석하였다. 그 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 핵산 복합체를 통하여 농도 의존적으로 표적 유전자의 발현 및 하위 경로 유전자의 발현이 시간에 따라 억제되는 것을 확인하였다.
실시예 4-4: Imiquimod를 이용한 건선 유도 동물 모델에서의 건선 표현형 효과 분석
Balb/C 마우스의 오른쪽 귀에 매일 62.5 mg의 5% Imiquimod를 도포하여 7일 동안 건선 유도 동물 모델을 만들었으며, 표 5의 서열번호 22 및 서열번호 23의 핵산 복합체에 대해서 건선 모델 표현형을 사진으로 분석하고, 귀 두께를 micrometer로 측정하였다.
그 결과, 건선 표현형이 핵산 복합체 그룹에서 감소하는 것을 확인하였으며(도 6c), 귀 두께 측정을 통하여 건선을 유도한 동물 그룹과 비교하였을 때, 핵산복합체를 도포한 그룹에서 귀 두께가 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 6d; PNA 1은 제형을 포함하지 않은 핵산 복합체이며, PNA 2는 크림 제형을 포함하는 핵산 복합체).
실시예 4-5: H&E 염색으로 건선 유도 동물 모델에서의 표현형 분석
실시예 4-4의 조건으로 실험을 진행하여 최종 실험 종료일에 마우스 귀 조직을 생검하여 4% 포르말린 용액에 하루 동안 고정하고 고정한 조직을 파라핀 포매하여 조직을 5 μm로 섹션하여 슬라이드 글라스에 마운팅하였다. 마운팅한 조직을 Hematoxylin:Eoin 염색 용액에 일정 시간 동안 염색하고 1X PBS로 수세한 후 현미경으로 분석하였다.
그 결과, 도 6e에서와 같이 건선을 유도한 대조군 대비 핵산 복합체를 처리한 그룹에서 피부의 epidermis의 비이상 증식이 감소한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4-6: 면역염색으로 건선 유도 동물 모델에서의 조직 내 염증성 마커 분석
실시예 4-4의 조건으로 실험을 진행하여 최종 실험 종료일에 마우스 귀 조직을 생검하여 4% 포르말린 용액에 하루 동안 고정하고 고정한 조직을 파라핀 포매하여 5 μm로 섹션하여 슬라이드 글라스에 마운팅하였다. 마운팅한 조직을 0.5% BSA 용액에 1시간 동안 블라킹하고, CD3, CD11c 1차 항체 용액을 처리하여 하루 동안 처리하였다. 이어서 1차 항체 용액을 제거하고 1X PBS로 씻어낸 후 2차 항체 용액을 처리하여 상온에서 2시간 처리하여 DAB 염색을 통해 분석하였다.
그 결과, 도 6f에 나타낸 바와 같이, 조직 내 염증성 마커인 CD3와 CD11c가 건선 유도한 대조군에 비해 핵산복합체 그룹에서 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 5: 구조식 ( 1)의 구조를 가지는 복합체를 함유하는 피부 투과성 전달체를 이용한 악성 흑색종( malignant melanoma ) 치료 효과 분석
핵산 복합체의 악성 흑색종 치료 효과 분석을 위해 표적 유전자로 TGFβR2를 사용하였다. 암전이 작용기전 중 TGFβ-2에 의해 활성화 되는 기전을 억제하는 RNA 기반 치료제 개발이 확인되었으므로 펩티드 핵산 복합체를 이용한 치료 효과를 검증하고자 하였다.
TGFβR2 활성 억제를 위한 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 서열
구분 서열번호 염기서열 단량체 변형
생활성 핵산 서열번호 25 5'-G(-)GTC(+)ATC(-)CAC(+)AGA(-)CA-O-K-3' -+-+-
서열번호 26 5'-GA(-)CAA(+)TGA(-)TAG(+)TAT(-)T-O-K-3' -+-+-
캐리어 펩티드 핵산 서열번호 27 5'-K-O-AA(+)TA(+)C-3' ++
서열번호 28 5'-TG(+)TCTGTG(+)GATGAC(+)C-O-K-3' +++
서열번호 29 5'-CT(+)GTTACT(+)ATCATA(+)A-O-K-3' +++
서열번호 30 5'-A(+)ATACTA(+)TCATTG(+)TC-O-K-3' +++
실시예 5-1: 세포 배양
ATCC(American Type Culture Collection, 미국)로부터 입수한 피부 전이성 흑색종 (A375SM)를 DMEM 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, 웰진, 한국)에 10％(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37℃, 5％(v/v) CO2의 조건하에서 배양하였다. 세포의 전이성 확인을 위해 TGFβ-2를 5 ng/mL로 처리하여 배양하였다.
실시예 5-2: 웨스턴 블랏 분석( Western blot assay ) 으로 유전자 발현의 분석
전이성 피부 흑색종 세포주를 6웰 플레이트에 1x105으로 세포를 씨딩하고 24시간 배양 후 실시예 5-1의 조건으로 실험을 진행하여 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 처리하고 24, 48, 72시간 배양한 후, RIPA buffer를 각 웰에 30 μL씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30 μg을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 TGFβR2 (Abcam, 미국), MMP9 (SantaCruz Biotech., 미국), p-Akt1 (Cell signaling Technology, 미국)를 1:1000으로 처리하고 4 ℃ 에서 하루동안 방치하였다. 1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit, Goat Anti-mouse (SantaCruz Biotech., 미국)를 1:2000으로 처리하여 상온에서 2시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 전이성 피부 흑색종 세포주에서 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
전이성 피부 흑색종 세포주에서의 TGFβR2 단백질 및 하위 경로 유전자의 발현 패턴 분석하였다. 본 실시예에서 사용한 핵산 복합체의 조합은 하기 표 7과 같다.
흑색종 세포주에서 TGFβR2 발현 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
1 서열번호 25 및 27
2 서열번호 25 및 28
3 서열번호 26 및 29
4 서열번호 26 및 30
그 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이, 핵산 복합체를 통하여 농도 의존적으로 표적 유전자의 발현 및 하위 경로 유전자의 발현이 시간에 따라 억제되는 것을 확인하였다.
실시예 5-3: 세포 이동능력 분석( Cell migration assay ) 으로 핵산 복합체를 이용한 세포 이동능력 억제 효과 분석
전이성 피부 흑색종 세포주를 24웰 트랜스웰 플레이트에 2x104으로 세포를 윗 챔버에 씨딩하고 모든 챔버에는 소태아혈청이 없는 배지를 처리하여 24시간 배양 후 실시예 5-1의 조건으로 실험을 진행하여 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 윗챔버에 처리하고 아래 챔버에 TGFβ-2를 20 ng/mL로 처리하여 24, 48, 72시간 배양한 후, 세포의 이동능력을 0.5% crystal violet으로 염색하였다. 염색한 세포를 메탄올을 처리하여 crystal violet을 녹인 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
상기 표 7의 핵산 복합체에 대해서 전이성 피부 흑색종 세포주에서의 세포 이동력 억제효과를 분석하였다. 그 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이, 핵산 복합체를 통하여 시간별로 세포 이동 능력이 억제되는 것을 확인하였다.
실시예 6: 구조식 ( 1)의 구조를 가지는 복합체를 함유하는 피부 투과성 전달체를 이용한 아토피 피부염( atopic dermatitis ) 치료 효과 분석
핵산 복합체의 아토피 피부염 치료 효과 분석을 위하여 표적 유전자로 TLR2(Toll-Like Receptor 2)를 사용하였다. 알러지 유발 물질이나 세균이 피부로 침투할 때 발현되는 유전자인 TLR2는 아토피 피부염 환자에서는 과발현 되어 있어 피부 내 염증성 사이토카인에 의한 염증 증가로 아토피 피부염을 악화시킨다. 이 때문에 아토피 피부염에 있어서 중요한 표적이 될 것으로 예측되고 있다.
TLR2 억제를 위한 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 서열
구분 서열번호 염기서열 단량체 변형
생활성 핵산 서열번호 31 5'-A(-)TGT(+)AGG(-)TG(+)ATCC(-)TGTT-O-K-3' -+-+-
서열번호 32 GLFDIIKKIAESF-O-A(-)TGT(+)AGG(-)TG(+)ATCC(-)TGTT-O-K -+-+-
캐리어 펩티드 핵산 서열번호 33 5'-K-O-A(+)AC(+)AG-3' ++
서열번호 34 5'-K-O-A(+)AC (+)AG -O-Histidine (10)-3' ++
서열번호 35 K-O-T(+)ACAGGA(+)TCACCT(+)ACAT-O-Histidine(10) +++
실시예 6-1: 세포 배양
CLS(CLS Cell Lines Service, 독일)로부터 입수한 인간 각질 세포(HaCaT)를 DMEM 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, 웰진, 한국)에 10％(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37℃, 5％(v/v) CO2의 조건하에서 배양하였다. 아토피 피부염 유사 세포 모델을 만들기 위해 집먼지 진드기 추출액 5 ng/mL과 DNCB (2-dinitrochlorobenzene) 5 μM을 처리하여 24시간 배양하였다.
실시예 6-2: MTT ( MTT assay ) 으로 각질 세포주에서 세포 생존율 분석
실시예 6-1에서의 실험 조건으로 96웰에 사람 유래 각질 세포주를 6x103으로 씨딩하고, 24시간 배양한 후, 표 5의 구조로 제조된 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 이용하여 처리된 세포주에 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) 용액을 1X PBS에 5 mg/mL 농도로 제조하고 well당 20 μL로 처리하여 4시간 배양 후 OD (optical density)를 spectrophotometer로 측정하여 분석하였다.
그 결과, 도 8a에 나타낸 바와 같이, 집먼지 진드기 추출물 또는 DNCB로 유도된 아토피 피부염 유사 세포 모델에서 핵산 복합체에 의해 세포 생존율이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 6-3: 웨스턴 블랏 분석( Western blot assay ) 으로 유전자 발현의 분석
사람 유래 각질 세포주를 6웰 플레이트에 1x105으로 세포를 씨딩하고 24시간 배양 후 실시예 6-1의 조건으로 실험을 진행하여 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 처리하고 24, 48, 72시간 배양한 후, RIPA buffer를 각 웰에 30 μL씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30 μg을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 TLR2 (SantaCruz Biotech., 미국), MMP9 (SantaCruz Biotech., 미국), p-NFkB (Cell signaling Technology, 미국), MyD88 (Cell signaling Technology, 미국), TARC (Abcam, 미국)를 1:1000으로 처리하고 4 ℃ 에서 하루 동안 방치하였다. 1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit, Goat Anti-mouse (SantaCruz Biotech., 미국)를 1:2000으로 처리하여 상온에서 2시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 각질 세포주에서 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
본 실시예에서 사용한 핵산 복합체의 조합은 하기 표 9와 같다.
각질 세포주에서 TLR2 발현 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
1 서열번호 31 및 33
2 서열번호 31 및 34
3 서열번호 31 및 35
4 서열번호 32 및 33
5 서열번호 32 및 34
6 서열번호 32 및 35
그 결과, 도 8b에 나타낸 바와 같이, 핵산 복합체를 통하여 농도 의존적으로 표적 유전자의 발현 및 하위 경로 유전자의 발현이 시간에 따라 억제되는 것을 확인하였다.
실시예 6-4: 집먼지 진드기 추출물 및 DNCB를 이용한 아토피 피부염 유도 동물 모델에서의 아토피 피부염 표현형 효과 분석
NC/Nga 마우스의 등을 제모하고 AD cream (집먼지 진드기 추출물 크림, Biostir, 일본)을 100 mg씩 일주일에 2번 총 3주 동안 도포하여 집먼지 진드기에 의한 아토피 피부염 유발 동물 모델을 구축하였다. 또한 Balb/C 마우스의 등을 제모하여 일주일에 2번 총 3주 동안 50 μM의 DNCB를 도포하여 새집증후군에 의한 아토피 피부염 유발 동물 모델을 구축하였다. 일주일에 총 3번의 크림 제형의 핵산 복합체를 처리하고 아토피 피부염 동물 모델 표현형을 사진으로 분석하고, 등 부위 털 자람 정도를 ImageJ로 측정하였다.
본 실시예에서 사용한 핵산 복합체의 조합은 하기 표 10과 같다.
아토피 피부염 표현형 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
PNA 1 서열번호 32 및 34
PNA 2 서열번호 32 및 35
도 8c와 8e에 나타낸 바와 같이, 아토피 피부염 표현형이 핵산 복합체 그룹에서 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 6-5: 혈청 내 IgE 및 TARC 농도 변화 분석
실시예 6-4의 조건으로 진행한 동물 실험에서 최종 실험 종료일에 마우스 혈액을 안와 채혈을 통해 수집하고 상온에서 2시간 이상 방치하여 원심분리기 (14,000 rpm, 15 min)를 이용하여 혈청을 수집하였다. 수집한 혈청을 IgE ELISA kit (고마바이오텍, 대한민국) 및 TARC ELISA kit (R&D system, 미국)에서 제공하는 실험방법을 이용하여 혈청 내 IgE 및 TARC의 농도를 측정하였다.
그 결과, 도 8d와 8f에 나타낸 바와 같이, 아토피 피부염을 유도한 대조군 대비 핵산 복합체를 처리한 그룹에서 IgE 및 TARC의 농도가 음성 대조군과 비슷한 수준으로 감소한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6-6: H&E 염색으로 아토피 피부염 유도 동물 모델에서의 조직 내 표현형 분석
실시예 6-4의 조건으로 실험을 진행하여 최종 실험 종료일에 마우스 귀 조직을 생검하여 4% 포르말린 용액에 하루 동안 고정하고 고정한 조직을 파라핀 포매하여 조직을 5 μm로 섹션하여 슬라이드 글라스에 마운팅하였다. 마운팅한 조직을 Hematoxylin:Eoin 염색 용액에 일정 시간 동안 염색하고 1X PBS로 수세한 후 현미경으로 분석하였다.
그 결과, 도 8g와 8h에 나타낸 바와 같이, 아토피 피부염을 유도한 대조군 대비 핵산 복합체를 처리한 그룹에서 피부의 epidermis의 비이상 증식이 감소한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6-7: 면역염색으로 건선 유도 동물 모델에서의 조직 내 염증성 마커 분석
실시예 6-4의 조건으로 실험을 진행하여 최종 실험 종료일에 마우스 등 조직을 생검하여 4% 포르말린 용액에 하루 동안 고정하고 고정한 조직을 파라핀 포매하여 5 μm로 섹션하여 슬라이드 글라스에 마운팅하였다. 마운팅한 조직을 0.5% BSA 용액에 1시간 동안 블라킹하고, CD3, CD11c 1차 항체 용액을 처리하여 하루 동안 처리하였다. 이어서 1차 항체 용액을 제거하고 1X PBS로 씻어낸 후 2차 항체 용액을 처리하여 상온에서 2시간 처리하여 DAB 염색을 통해 분석하였다.
그 결과, 도 8i 및 8j에 나타낸 바와 같이, 조직 내 염증성 마커인 CD3가 아토피 피부염을 유도한 대조군에 비해 핵산복합체 그룹에서 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 7: 구조식 ( 1)의 구조를 가지는 복합체를 함유하는 피부 투과성 전달체를 이용한 피부재생( skin regeneration ) 효과 분석
핵산 복합체의 피부재생 효과 분석을 위하여, 표적유전자로 smad3를 사용하였다. smad3는 상처를 입은 피부에서 과발현되는 단백질로서, 피부 재생에 있어서 중요한 표적이 될 것으로 예측되고 있다
smad3 억제를 위한 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 서열
구분 서열번호 염기서열 단량체 변형
생활성 핵산 서열번호 36 5'-TG(-)TCA(+)AGCC(-)ACT(+)GC(-)A-O-K-3 -+-+-
서열번호 37 5'- GLFDIIKKIAESF-O-TG(-)TCA(+)AGCC(-)ACT(+)GC(-)A-O-K-3 -+-+-
캐리어 펩티드 핵산 서열번호 38 5'-K-O-T(+)GCA(+)G-3' ++
서열번호 39 5'-K-O-T(+)GCA(+)G-O-Histidine(10)-3' ++
서열번호 40 5'-AC(+)AGTTCGG(+)TGACG(+)T-O-K +++
서열번호 41 5'-Histidine(10)-O-AC(+)AGTTCGG(+)TGACG(+)T-O-K-3' +++
실시예 7-1: 세포 배양
CLS(CLS Cell Lines Service, 독일)로부터 입수한 인간 각질 세포(HaCaT)를 DMEM 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, 웰진, 한국)에 10％(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37℃, 5％(v/v) CO2의 조건하에서 배양하였다. 세포의 이동 능력을 확인하기 위해 TGFβ-1를 5 ng/mL로 처리하여 배양하였다.
실시예 7-2: 상처 후 재생 분석 ( Wound - Healing assay ) 으로 핵산 복합체를 이용한 세포 이동능력 향상 효과 분석
사람 유래 각질 세포주를 12웰 플레이트에 2x104으로 세포를 씨딩하고 소태아혈청이 없는 배지를 처리하여 24시간 배양 후 실시예 7-1의 조건으로 실험을 진행하여 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 처리하고 TGFβ-1를 5 ng/mL로 처리하여 24, 48시간 배양한 후, 세포의 이동능력을 현미경으로 분석하였다.
본 실시예에서 사용한 핵산 복합체의 조합은 하기 표 12와 같다.
각질 세포주에서 세포 이동능력 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
PNA 1 서열번호 37 및 38
PNA 2 서열번호 37 및 39
PNA 3 서열번호 36 및 40
그 결과, 도 9a에 나타낸 바와 같이, TGFβ-1을 처리한 양성 대조군 대비 핵산 복합체를 처리한 그룹에서 세포의 이동 능력이 향상되는 것을 확인하였다.
실시예 7-3: 웨스턴 블랏 분석( Western blot assay ) 으로 유전자 발현 분석
사람 유래 각질 세포주를 6웰 플레이트에 1x105으로 세포를 씨딩하고 24시간 배양 후 실시예 7-1의 조건으로 실험을 진행하여 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 처리하고 24, 48 시간 배양한 후, RIPA buffer를 각 웰에 30 μL씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30 μg을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 p-smad3 (Cell signaling Technology, 미국)를 1:1000으로 처리하고 4 ℃ 에서 하루 동안 방치하였다. 1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit (SantaCruz Biotech., 미국)를 1:2000으로 처리하여 상온에서 2시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 각질 세포주에서 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
본 실시예에서 사용한 핵산 복합체의 조합은 하기 표 13과 같다.
각질 세포주에서 smad3 단백질 및 하위 경로 유전자의 발현 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
1 서열번호 37 및 38
2 서열번호 37 및 38
3 서열번호 37 및 39
4 서열번호 37 및 40
5 서열번호 37 및 41
6 서열번호 36 및 38
7 서열번호 36 및 38
8 서열번호 36 및 39
9 서열번호 36 및 40
10 서열번호 36 및 41
그 결과, 도 9b에 나타낸 바와 같이, 핵산 복합체를 통하여 농도별로 표적 유전자의 발현 및 하위 경로 유전자의 발현이 시간에 따라 억제되는 것을 확인하였다.
실시예 8: 구조식 ( 1)의 구조를 가지는 복합체를 함유하는 피부 투과성 전달체를 이용한 켈로이드( keloid ) 치료 효과 분석
핵산 복합체의 상처 후 비대증(켈로이드, keloids) 치료 효과 분석을 위하여 표적 유전자로 TIEG1을 사용하였다. Keloid 환자의 피부 조직에서 과발현되는 단백질로서, 켈로이드 치료에 있어서 중요한 표적이 될 것으로 예측되고 있다.
TIEG1 억제를 위한 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 서열
구분 서열번호 염기서열 단량체 변형
생활성 핵산 서열번호 42 5'- GC (-)TTC(+)TAC(-)AG(+)CTT(-)CA-O-K-3' -+-+-
서열번호 43 GLFDIIKKIAESF-O-GC(-)TTC(+)TAC(-)AG(+)CTT(-)CA-O-K -+-+-
캐리어 펩티드 핵산 서열번호 44 5'-K-O-TG(+)AAGCTG(+)TAGAA(+)GC-3' +++
서열번호 45 5'-K-O-TG(+)AAGCTG(+)TAGAA(+)GC-O-Histidine(10)-3' +++
서열번호 46 5'-CG(+)AAGATG(+)TCGAA(+)GT-O-K-3' +++
서열번호 47 5' -Histidine(10)-O-CG(+)AAGATG(+)TCGAA (+)GT -O-K-3' +++
실시예 8-1: 세포 배양
ATCC(American Type Culture Collection, 미국)로부터 입수한 켈로이드 섬유 아세포 (KEL FIB)를 DMEM 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, 웰진, 한국)에 10％(v/v) 소태아혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37℃, 5％(v/v) CO2의 조건하에서 배양하였다.
실시예 8-2: MTT ( MTT assay ) 으로 켈로이드 섬유 아세포주에서 세포 생존율 분석
실시예 8-1에서의 실험 조건으로 96웰에 켈로이드 섬유 아세포주를 6x103으로 씨딩하고, 24시간 배양한 후, 표 의 구조로 제조된 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 이용하여 처리된 세포주에 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) 용액을 1X PBS에 5 mg/mL 농도로 제조하고 well당 20 μL로 처리하여 4시간 배양 후 OD (optical density)를 spectrophotometer로 측정하여 분석하였다.
본 실시예에서 사용한 핵산 복합체의 조합은 하기 표 15와 같다.
켈로이드 섬유 아세포주에서 세포 생존율 분석을 위한 핵산 복합체 조합
구분 핵산 복합체
1 서열번호 42 및 44
2 서열번호 42 및 45
3 서열번호 42 및 46
4 서열번호 42 및 47
5 서열번호 43 및 44
6 서열번호 43 및 45
7 서열번호 43 및 46
8 서열번호 43 및 47
그 결과, 도 10a에 나타낸 바와 같이, 켈로이드 섬유 아세포주에서 핵산 복합체에 의해 세포 생존율이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 8-2: 웨스턴 블랏 분석( Western blot assay ) 으로 유전자 발현의 분석
켈로이드 섬유 아세포주를 6웰 플레이트에 1x105으로 세포를 씨딩하고 24시간 배양 후 실시예 8-1의 조건으로 실험을 진행하여 생활성 펩티드 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산을 포함하는 복합체를 처리하고 24, 48, 72 시간 배양한 후, RIPA buffer를 각 웰에 30 μL씩 첨가하여 protein lysate를 얻었다. Protein lysate를 BCA assay kit (Thermo Fisher, 미국)를 사용하여 단백질 양을 정량하고 단백질 30 μg을 전기영동을 통해 사이즈 별로 분리하여, PVDF membrane에 단백질을 옮긴 후 1차 항체인 TIEG1(SantaCruz Biotech., 미국), p-smad2 (SantaCruz Biotech., 미국), smad7 (Cell Signaling Technology, 미국)를 1:1000으로 처리하고 4 ℃ 에서 하루 동안 방치하였다. 1X TBS-T를 이용하여 워싱하고 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit, Goat Anti-mouse (SantaCruz Biotech., 미국)를 1:2000으로 처리하여 상온에서 2시간 방치하였다. SupersignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher, 미국)을 처리하고 Image600 (Amersham, 독일) 장비를 이용하여 켈로이드 섬유 아세포주에서 표적 유전자의 발현 억제 효율을 분석하였다.
상기 표 14의 핵산 복합체에 대해서 각질 세포주에서의 TIEG1 단백질 및 하위 경로 유전자의 발현 패턴 분석하였다. 그 결과, 도 10b에 나타낸 바와 같이, 핵산 복합체를 통하여 농도 의존적으로 표적 유전자의 발현 및 하위 경로 유전자의 발현이 시간에 따라 억제되는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> SeasunBio Materials <120> Skin-penetrating Delivery Carrier Comprising Nucleic Acid Complex and Uses thereof <130> P18-B010 <160> 49 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 1 attcacatca gccac 15 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 2 attcacatca gccac 15 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 3 attcacatca gccac 15 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 4 attcacatca gccac 15 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 5 attcacatca gccac 15 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 6 attcacatca gccac 15 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 7 attcacatca gccac 15 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 8 attcacatca gccac 15 <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 9 attcacatca gccac 15 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 10 gtggctgatg tgaat 15 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 11 taagtgtagt cggtg 15 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 12 taagtgtagt cggtg 15 <210> 13 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 13 taagtgtagt cggtg 15 <210> 14 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 14 taagtgtagt cggtg 15 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 15 taagtgtagt cggtg 15 <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 16 taagtgtagt cggtg 15 <210> 17 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 17 cggtg 5 <210> 18 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 18 gtcggtg 7 <210> 19 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 19 tagtcggtg 9 <210> 20 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 20 tgtagtcggt g 11 <210> 21 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 21 agtgtagtcg gtg 13 <210> 22 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 22 attcacatca gccac 15 <210> 23 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 23 cggtg 5 <210> 24 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 24 gtggc 5 <210> 25 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 25 ggtcatccac agaca 15 <210> 26 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 26 gacaatgata gtatt 15 <210> 27 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 27 aatac 5 <210> 28 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 28 tgtctgtgga tgacc 15 <210> 29 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 29 ctgttactat cataa 15 <210> 30 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 30 aatactatca ttgtc 15 <210> 31 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 31 atgtaggtga tcctgtt 17 <210> 32 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 32 atgtaggtga tcctgtt 17 <210> 33 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 33 aacag 5 <210> 34 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 34 aacag 5 <210> 35 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 35 tacaggatca cctacat 17 <210> 36 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 36 tgtcaagcca ctgca 15 <210> 37 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 37 tgtcaagcca ctgca 15 <210> 38 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 38 tgcag 5 <210> 39 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 39 tgcag 5 <210> 40 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 40 acagttcggt gacgt 15 <210> 41 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 41 acagttcggt gacgt 15 <210> 42 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 42 gcttctacag cttca 15 <210> 43 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 43 gcttctacag cttca 15 <210> 44 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 44 tgaagctgta gaagc 15 <210> 45 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 45 tgaagctgta gaagc 15 <210> 46 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 46 cgaagatgtc gaagt 15 <210> 47 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA <400> 47 cgaagatgtc gaagt 15 <210> 48 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 48 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln 20 25 <210> 49 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 49 Gly Leu Phe Asp Ile Ile Lys Lys Ile Ala Glu Ser Phe 1 5 10

Claims (23)

  1. 하기 구조식 (1)의 구조를 가지는 핵산 복합체를 함유하는 피부 투과성 전달체:
    구조식 (1)
    [ A ≡ C(+) ]
    상기 구조식 (1)에 있어서,
    A는 목적하는 유전자와 결합할 수 있는 서열, 또는 목적하는 유전자 서열을 가지는 생활성 핵산(Bioactive Nucleic Acid)이고,
    C는 생활성 핵산과 결합할 수 있는 캐리어 펩티드 핵산(Carrier Peptide Nucleic Acid)이고,
    '≡'는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산 간의 상보적인 결합을 의미하며,
    A로 표시되는 생활성 핵산은 펩티드 핵산(Peptide Nucleic Acid)으로, 전체적으로 음전하 또는 중성을 가지며,
    C(+)는 캐리어 펩티드 핵산이 전체적으로 양전하를 가진다는 것을 의미하며,
    캐리어 펩티드 핵산은 캐리어 펩티드 핵산 전체적으로 양전하를 띠도록 변형된 펩티드 핵산 단량체를 하나 이상 포함한다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 핵산 복합체는 피부 잔류성을 갖는 것을 특징으로 하는 피부 투과성 전달체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 핵산 복합체는 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 엔도좀 탈출(endosome escape)을 도와주는 물질을 더 포함하여 하기 구조식 (2)의 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 피부 투과성 전달체:
    구조식 (2)
    [ mA ≡ mC (+) ]
    상기 구조식 (2)에 있어서,
    'm'은 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산의 엔도좀 탈출(endosome escape)을 도와주는 물질을 의미한다.
  4. 제3항에 있어서, 상기 생활성 핵산 또는 캐리어 펩티드 핵산은 각각의 핵산의 5'-말단 또는 3'-말단에 엔도좀 탈출을 도와주는 물질이 결합된 것을 특징으로 하는 피부 투과성 전달체.
  5. 제3항에 있어서, 상기 엔도좀 탈출을 도와주는 물질은 펩티드, 지질 나노물질(lipid nanoparticles), 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles), 고분자 나노구(polymer nanospheres), 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles), 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles), 양이온 고분자(cationic polymer) 및 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 피부 투과성 전달체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 펩티드는 GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(서열번호 48), GLFDIIKKIAESF(서열번호 49) 및 Histidine(10)으로 구성된 군에서 선택되고,
    상기 지질 나노물질(lipid nanoparticles)은 Lipid, phospholipids, cetyl palmitate, poloxamer 18, Tween 85, tristearin glyceride 및 Tween 80로 구성된 군에서 선택되고,
    상기 접합체 나노물질(polyplex nanoparticles)은 poly(amidoamine) 또는 polyethylenimine (PEI)이고,
    상기 고분자 나노구(polymer nanospheres)는 polycaprolactone, poly(lactide-co-glycolide, polylactide, polyglycolide, poly(d,l-lactide), chitosan 및 PLGA-polyethylene glycol로 구성된 군에서 선택되고,
    상기 무기물 나노물질(inorganic nanoparticles)은 Fe2O3 Fe3O4, WO3 및 WO2.9로 구성된 군에서 선택되고,
    상기 양이온 지질 나노물질(cationic lipid-based nanoparticles)은 1-(aminoethyl)iminobis[N-(oleicylcysteinyl-1-amino-ethyl)propionamide], N-alkylated derivative of PTA 및 3, 5-didodecyloxybenzamidine로 구성된 군에서 선택되고,
    상기 양이온 고분자(cationic polymer)는 vinylpyrrolidone-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate acid copolymer diethyl sulphate, polyisobutylene 및 poly(N-vinylcarbazole)로 구성된 군에서 선택되고,
    상기 pH 감응 고분자(pH sensitive polymers)는 polyacids, poly(acrylic acid), poly(methacrylic acid) 및 hydrolyzed polyacrylamide로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 피부 투과성 전달체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 핵산 복합체는 치료성 단백질, 치료성 화합물, 치료성 조성물, 암 화학치료제, 톡신, 세포독성 물질, 소염제, 관절염 치료제, 성장인자, 사이토킨, 케모카인, 하나 이상의 신호 전달 경로를 조절하는 화합물, 항체, 핵산, 핵산 유사체, 세포, 바이러스, 파지, 바이러스 입자, 파지 입자, 바이러스 캡시드, 파지 캡시드, 바이러스 유사입자, 리포솜, 미셀, 비드, 나노입자, 마이크로입자, 화학치료제, 조영제, 영상제, 표지(label), 표지화제 또는 그 배합물로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상과 공유결합 또는 링커-매개 결합된 것을 특징으로 하는 피부 투과성 전달체.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 상기 생활성 핵산과 염기서열 일부 혹은 전부가 상보적인 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 피부 투과성 전달체.
  10. 제1항에 있어서, 상기 핵산 복합체는 전체적으로 양전하를 가지는 것을 특징으로 하는 피부 투과성 전달체.
  11. 제1항에 있어서, 상기 캐리어 펩티드 핵산은 전체적으로 양전하를 가지도록 1개 이상의 gamma- 또는 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 투과성 전달체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 gamma- 혹은 alpha-backbone 변형 펩티드 핵산 단량체는 양전하를 가지는 아미노산을 가지는 단량체가 음전하를 가지는 아미노산을 가지는 단량체에 비해 더 많이 포함되어 전체적인 캐리어 펩티드 핵산의 전하가 양성이 되는 것을 특징으로 하는 피부 투과성 전달체.
  13. 제1항에 있어서, 소수성 잔기(hydrophobic moiety), 친수성 잔기(hydrophilic moiety), 표적 항원 특이적 항체, 앱터머, 소광자, 형광 표지자 및 발광 표지자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질이 생활성 핵산 및/또는 캐리어 펩티드 핵산에 결합된 것을 특징으로 하는 피부 투과성 전달체.
  14. 제1항에 있어서, 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산은 각각의 핵산의 5'-방향성 및 3'-방향성에 따라 평행(parallel) 또는 역평행(antiparallel)으로 결합된 것을 특징으로 하는 피부 투과성 전달체.
  15. 제1항에 있어서, 상기 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력은 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자와의 결합력보다 낮은 것을 특징으로 하는 피부 투과성 전달체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 생활성 핵산과 캐리어 펩티드 핵산은 평행 결합(Parallel binding) 또는 부분 특이결합(Partial specific binding)함으로써, 생활성 핵산 및 캐리어 펩티드 핵산의 결합력이 생활성 핵산과 생활성 핵산의 목적하는 유전자와의 결합력보다 낮은 것을 특징으로 하는 피부 투과성 전달체.
  17. 제1항 내지 제7항 및 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 피부 투과성 전달체를 포함하는 질병의 진단용 조성물.
  18. 제1항 내지 제7항 및 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 피부 투과성 전달체를 포함하는 질병의 예방 또는 치료용 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 질병은 피부질환, 암, 염증성 질환, 노인성 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 희귀질환 및 중증 질환, 심혈관 질환, 또는 대사성 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 피부 투과성 전달체 내에 포함된 생활성 핵산이 결합하는 표적 유전자는 IFI16, TGFβR2, ERBB3, TLR2, smad3 및 TIEG1으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상이고, 상기 질병은 피부질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 상기 피부질환은 건선, 피부암, 아토피 피부염, 피부 손상, 색소침착 및 켈로이드성 질환으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제18항에 있어서, 수성액, 겔, 연고, 크림, 로션, 페이스트, 도말제 및 패치에서 선택되는 어느 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 삭제
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