DE69734783T2

DE69734783T2 - Peptidnukleinsäuren mit erhöhter bindungsaffinität, sequenzspezifität und löslichkeit

Info

Publication number: DE69734783T2
Application number: DE69734783T
Authority: DE
Inventors: E. Peter NIELSEN; Michael Egholm; H. Rolf BERG; Ole Buchardt
Original assignee: Egholm Michael Lexington
Current assignee: Egholm Michael Lexington
Priority date: 1996-07-24
Filing date: 1997-07-24
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2017-07-25
Also published as: AU3808197A; EP0960121B1; EP0960121A1; JP3306073B2; WO1998003542A1; AU717387B2; CA2261566A1; EP0960121A4; JP2002105059A; DE69734783D1; JP2000503671A; ATE311402T1

Description

QUERVERWEIS AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
Die vorliegende Anmeldung ist eine Teilfortführungsanmeldung der US-Patentanmeldungen mit den Nummern 08/685,484, 08/686,116, 08/686,114 und 08/686,113, die jeweils am 24. Juli 1996 eingereicht wurden, von denen jede eine Teilfortführungsanmeldung der US-Anmeldung mit der Nummer 08/108,591 ist, welche am 22. November 1993 eingereicht wurde, die wiederum eine Teilfortführungsanmeldung der dänischen Patentanmeldung mit der Nummer 986/91 ist, die am 24. Mai 1991 eingereicht wurde, ferner der dänischen Patentanmeldung mit der Nummer 987/91, die am 24. Mai 1991 eingereicht wurde, und der dänischen Patentanmeldung mit der Nummer 510/92, die am 15. April 1992 eingereicht wurde. Die Anmeldung ist ferner anspruchsberechtigt bezüglich der provisorischen US-Patentanmeldung mit der Nummer 60/051,002, die am 29. Mai 1997 eingereicht wurde, und stellt eine Teilfortführungsanmeldung dieser Anmeldung dar.
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf Verfahren zur Verbesserung der Sequenzspezifität, Bindungsaffinität und Löslichkeit von Peptidnucleinsäuren (PNAs) gerichtet, in welchen natürlich auftretende Nucleobasen oder nicht-natürlich auftretende Nucleobasen kovalent an ein Polyamid-Grundgerüst gebunden sind. Die PNAs der vorliegenden Erfindung umfassen zumindest eine C₁-C₈ Alkylamin-Seitenkette, was zu einer verbesserten Löslichkeit und Bindungsaffinität zu Nucleinsäuren und zu einer Sequenzspezifität sowie zu anderen vorteilhaften Eigenschaften führt. Unter bestimmten Gesichtspunkten ist die Erfindung auf Histidin-enthaltende Peptidnucleinsäuren und auf synthetische Zwischenverbindungen gerichtet, die bei der Herstellung solcher Verbindungen eingesetzt werden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Funktion eines Gens beginnt mit der Transkription seiner Information in Messenger-RNA (mRNA). Durch eine Wechselwirkung mit dem ribosomalen Komplex dirigiert die mRNA die Synthese des Proteins. Das Verfahren zur Proteinsynthese ist auch als Translation bekannt. Bei der Translation ist es notwendig, dass verschiedene Cofaktoren, Bildungseinheiten, Aminosäuren und Transfer-RNAs (tRNAs) vorliegen, die sämtlich in normalen Zellen auch vorliegen.
Die meisten herkömmlichen Arzneimittel üben ihre Wirkung durch eine Wechselwirkung mit und durch eine Modulierung eines oder mehrerer endogenen Zielproteine, wie bspw. Enzyme, aus. Typischerweise sind solche Arzneimittel jedoch nicht für Ziel proteine spezifisch, sondern treten auch mit anderen Proteinen in Wechselwirkung. Daher ist der Einsatz einer relativ großen Dosis des Arzneimittels notwendig, um die Wirkung eines bestimmten Proteins effektiv zu modulieren. Wenn die Modulierung einer Proteinaktivität durch die Wechselwirkung mit oder durch die Inaktivierung von mRNA erreicht werden kann, könnte eine bedeutende Reduktion in der notwendigen Arzneimittelmenge sowie bei den Nebenwirkungen des Arzneimittels erreicht werden. Weitere Verringerungen der notwendigen Arzneimittelmenge und den Nebenwirkungen könnte erreicht werden, wenn eine solche Wechselwirkung Stellen-spezifisch ist. Da ein funktionierendes Gen kontinuierlich mRNA produziert, wäre es sogar noch vorteilhafter, wenn die Gentranskription gänzlich eingestellt werden könnte. Oligonucleotide und deren Analoga sind als Diagnostika, Therapeutika und Forschungsreagenzien entwickelt worden. Ein Beispiel einer Modifizierung von Oligonucleotiden ist deren Markierung mit nicht-isotopischen Markern, wie bspw. Fluorescein, Biotin, Digoxigenin, alkalischer Phosphatase oder anderen Reportermolekülen. Um die Resistenz gegenüber Nucleasen zu erhöhen, wurden andere Modifizierungen des Ribose-Phosphat-Grundgerüsts vorgenommen. Diese Modifizierungen schließen die Verwendung von Linkern wie Methylphosphonate, Phosphorothioate und Phosphorodithioate, sowie 2'-O-Methylribosezuckerkomponenten mit ein. Andere Oligonucleotid-Modifizierungen schließen solche mit ein, mit welchen die Aufnahme und die zelluläre Verteilung moduliert wird. Phosphorothioat-Oligonucleotide werden gegenwärtig als Antisens-Wirkstoffe in menschlichen klinischen Studien zur Behandlung verschiedener Krankheitszustände eingesetzt. Obwohl einige Verbesserungen bei der diagnostischen und therapeutischen Verwendung mit diesen Oligonucleotid-Modi fizierungen umgesetzt werden konnten, so besteht ein weiterführender Bedarf für verbesserte Oligonucleotid-Analoga.
Im Stand der Technik gibt es einige bekannte Nucleinsäure-Analoga mit Nucleobasen, die an Grundgerüste gebunden sind, die nicht aus den natürlich vorkommenden Ribonucleinsäuren oder Desoxyribonucleinsäuren bestehen. Diese Nucleinsäure-Analoga können an Nucleinsäuren mit komplementären Nucleobasen-Sequenzen binden. Unter diesen erwiesen sich die Peptidnucleinsäuren (PNAs), wie bspw. in der WO 92/20702 beschrieben, wirksam als therapeutische und diagnostische Reagenzien. Dies kann daran liegen, dass sie eine allgemein höhere Affinität für komplementäre Nucleobasen-Sequenzen aufweisen als die entsprechenden Wildtyp-Nucleinsäuren.
PNAs sind Verbindungen, die analog zu Oligonucleotiden sind, die sich jedoch in der Zusammensetzung unterscheiden. In PNAs ist das Desoxyribose-Grundgerüst des Oligonucleotids durch ein Peptid-Grundgerüst ersetzt. Jede Untereinheit des Peptid-Grundgerüsts ist an eine natürlich vorkommende oder an eine nicht-natürlich vorkommende Nucleobase gebunden. Ein solches Peptid-Grundgerüst wird aus sich wiederholenden Einheiten von N-(2-Aminoethyl)glycin, verbunden durch Amid-Bindungen, hergestellt.
PNAs binden sowohl an DNA als auch an RNA und bilden PNA/DNA- oder PNA/RNA-Duplexe. Die resultierenden PNA/DNA- oder PNA/RNA-Duplexe werden stärker als entsprechende DNA/DNA- oder DNA/RNA-Duplexe gebunden, wie durch deren höhere Schmelztemperaturen (T_m) gezeigt ist. Diese hohe thermale Stabilität von PNA/DNA(RNA)-Duplexen wurde der Neutralität des PNA-Grund gerüsts zugeschrieben, was in der Beseitigung der Ladungsabstoßung resultiert, die bei DNA/DNA- oder RNA/RNA-Duplexen vorliegt. Ein anderer Vorteil von PNA/DNA(RNA)-Duplexen ist der, dass die T_m praktisch unabhängig von der Salzkonzentration ist. Dem gegenüber sind DNA/DNA-Duplexe stark von der Ionenstärke abhängig.
Es zeigte sich, dass Homopyrimidin-PNAs komplementäre DNA oder RNA binden, wodurch (PNA)₂/DNA(RNA)-Triplexe mit hoher thermaler Stabilität gebildet werden (Egholm et al., Science, 1991, 254, 1497; Egholm et al., J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1895; Egholm et al., J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 9677).
Zusätzlich zu der erhöhten Affinität besitzen PNAs eine erhöhte Spezifität für die DNA-Bindung. Aus diesen Gründen zeigt eine PNA/DNA-Duplex-Fehlanpassung gegenüber dem DNA/DNA-Duplex ein Absinken in der T_m um 8 bis 20°C. Dieses Absinken in der T_m wird bei der entsprechenden DNA/DNA-Duplex-Fehlanpassung nicht beobachtet (Egholm et al., Nature, 1993, 365, 566).
Die Bindung eines PNA-Strangs an einen DNA- oder RNA-Strang kann in einer von zwei Orientierungen stattfinden. Die Orientierung wird als anti-parallel bezeichnet, wenn der DNA- oder RNA-Strang in einer 5'- bis 3'-Orientierung an den komplementären PNA-Strang bindet, und zwar derart, dass das Carboxylende der PNA in Richtung des 5'-Endes der DNA oder RNA gerichtet ist, und das Aminoende der PNA in Richtung des 3'-Endes der DNA oder RNA. Bei der parallelen Orientierung sind das Carboxylende und das Aminoende der PNA bezüglich der 5'- bis 3'-Richtung der DNA oder RNA genau umgekehrt orientiert.
PNAs binden sowohl einzelsträngige DNA als auch doppelsträngige DNA. Wie oben bemerkt, wurde bei einer Bindung an doppelsträngige DNA beobachtet, dass zwei PNA-Stränge an die DNA binden können. Während PNA/DNA-Duplexe in der antiparallelen Konfiguration stabil sind, so wurde zuvor angenommen, dass die parallele Orientierung bei (PNA)₂/DNA bevorzugt ist.
Die Bindung von zwei einzelsträngigen Pyrimidin-PNAs an eine doppelsträngige DNA – so fand man heraus – findet über eine Strang-Versetzung statt, und zwar eher als über eine konventionelle Tripel-Helixbildung, wie bei triplexierenden Oligonucleotiden beobachtet wird. Wenn ein PNA-Strang mit einer doppelsträngigen DNA in Wechselwirkung tritt, so wird ein Strang der DNA versetzt und bildet an der Stelle des PNA₂/DNA-Komplexbereiches eine Schleife. Der andere DNA-Strang wird in der (PNA)₂/DNA-Triplexstruktur festgehalten. Der Schleifenbereich (alternativ als eine D-Schleife bezeichnet) ist – wenn sie einzelsträngig ist – der Spaltung durch Enzyme zugänglich, die einzelsträngige DNA spalten können.
Ein weiterer Vorteil von PNAs gegenüber Oligonucleotiden ist der, dass das Polyamid-Grundgerüst von PNAs gegenüber dem Abbau durch Enzyme resistent ist.
Diese Eigenschaften machen PNAs für mehrere Anwendungen nützlich. Da PNAs stärker binden können und eine höhere Spezifität als Oligonucleotide haben, werden sie als Sonden beim Klonieren, bei Blot-Verfahren und bei Anwendungen wie in situ-Fluoreszenzhybridisierung (FISH) eingesetzt. Homopyrimidin-PNAs werden zur Strangversetzung bei Homopurin-Zielen eingesetzt. Die Restriktionsstellen, die mit der D-Schleife überlappen, oder benachbart zu dieser sind, werden nicht durch Restriktionsenzyme geschnitten. Ferner inhibiert auch der lokale Triplex die Gentranskription. Daher kann durch die Bindung von PNAs an spezifische Restriktionsstellen innerhalb eines DNA-Fragments die Spaltung an diesen Stellen inhibiert werden. Daraus kann ein Vorteil bei Klonierungs- und Subklonierungsverfahren gezogen werden. Markierte PNAs werden auch dazu eingesetzt, DNA-Moleküle direkt zu kartieren. Hierbei hybridisieren PNA-Moleküle mit einem fluoreszierenden Marker an komplementäre Sequenzen in Duplex-DNAs durch eine Strang-Invasion.
PNAs wurden auch zur Detektion von Punktmutationen in PCR-basierenden Assays („PCR-Clamping") eingesetzt. Beim PCR-Clamping werden PNAs eingesetzt, um Punktmutation in einem PCR-basierten Assay zu detektieren, wie bspw. den Unterschied zwischen einem gewöhnlichen Wildtyp-Allel und einem Mutanten-Allel in einem zu untersuchenden DNA-Segment. Dabei wird ein PNA-Oligomer, das komplementär zu der Wildtyp-Sequenz ist, synthetisiert. Die PCR-Reaktionsmischung enthält diese PNA sowie zwei DNA-Primer, von denen einer zu der Mutanten-Sequenz komplementär ist. Das Wildtyp-PNA-Oligomer und der DNA-Primer konkurrieren um die Hybridisierung an das Ziel. Die Hybridisierung des DNA-Primers und die nachfolgende Amplifizierung findet nur statt, wenn das Ziel ein Mutanten-Allel ist. Mit diesem Verfahren kann das Vorliegen und die exakte Identität einer Mutante bestimmt werden.
Eine intensive Forschung richtet sich auf die Anwendung von Oligonucleotiden und Oligonucleotid-Analoga, die an komplementäre DNA- und RNA-Stränge binden, zur Verwendung als Diagnostika, Forschungsreagenzien und potenzielle Therapeutika.
Die Oligonucleotide und Oligonucleotid-Analoga müssen für viele Anwendungen über die Zellmembranen transportiert werden oder aber durch die Zellen aufgenommen werden, um deren Aktivität zu exprimieren.
Die WO 92/20702 beschreibt neue PNAs, die fester an komplementäre DNA und RNA binden als die entsprechende DNA. Es ist wünschenswert, an diese PNAs Gruppen anzuhängen, die deren Aktivität modulieren werden, deren Membran-Permeabilität modifizieren oder deren Eigenschaft zur zellulären Aufnahme erhöhen werden. Ein Verfahren zur Erhöhung der Menge an zellulären Aufnahme-Eigenschaften von PNAs ist es, eine lipophile Gruppe anzuheften. Die US-Patentanmeldung mit der Nummer 117,363, angemeldet am 3. September 1993, beschreibt mehrere Alkylamino-Funktionalitäten und deren Verwendung beim Anheften solcher anhängenden Gruppen an Oligonucleotide.
Die US-Patentanmeldung mit der Nummer 07/943,516, angemeldet am 11. September 1992, sowie die korrespondierende veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 94/06815 offenbaren andere neue Amin-enthaltende Verbindungen und deren Einbau in Oligonucleotide, unter anderem zum Zwecke der Verstärkung der zellulären Aufnahme, der Erhöhung der Lipophilizität, zur Bewirkung einer höheren zellulären Aufrechterhaltung und eine Erhöhung der Verteilung der Verbindung innerhalb der Zelle.
Die US-Patentanmeldung mit der Nummer 08/116,801, angemeldet am 3. September 1993, beschreibt Nucleoside und Oligonucleoside, die derivatisiert wurden, um eine Thiolalkyl-Funktionalität einzuschließen, über welche anzuhängende Gruppen angeheftet werden.
Peptidnucleinsäuren können Purin- oder Pyrimidin-Nucleobasen enthalten. Allerdings zeigen erste PNRs mit einem hohen Purin-Nucleobasen-Gehalt eine verminderte Löslichkeit bei einem physiologischen pH-Wert. Mit PNAs der vorliegenden Erfindung kann dieses Problem überwunden werden.
Trotz neuester Fortschritte besteht immer noch ein Bedarf für eine stabile Verbindung, die das Binden an Nucleinsäuren verstärkt oder dieses moduliert, die hybridisierten Komplexe stabilisiert und die wässrige Löslichkeit erhöht.
ZUSAMMENFASSENDE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Verbesserung der Löslichkeit, der Sequenzspezifität und der Bindungsaffinität von Peptidnucleinsäuren (PNAs) für komplementäre DNA oder RNA bereit, und zwar durch Einbau einer C₁-C₈ Alkylamin-Seitenkette in PNAs.
Die Peptidnucleinsäuren (PNAs) der Erfindung umfassen im Allgemeinen Liganden, die an ein Polyamid-Grundgerüst gebunden sind. Beispielhafte Liganden schließen die vier großen natürlich vorkommenden DNA-Nucleobasen mit ein (d.h. Thymin, Cytosin, Adenin und Guanin), andere natürlich vorkommende Nucleobasen (wie bspw. Inosin, Uracil, 5-Methylcytosin, Thiouracil oder 2,6-Diaminopurin) oder künstliche Basen (wie bspw. Bromthymin, Azadenin oder Azaguanin), die über einen geeigneten Linker an ein Polyamid-Grundgerüst angeheftet sind.
Unter einem Gesichtspunkt wird mit der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung der DNA- oder RNA- Sequenzspezifität einer Peptidnucleinsäure bereitgestellt, und zwar durch Einbau einer C₁-C₈ Alkylamin-Seitenkette in die Peptidnucleinsäure mit der Formel (I):
in welcher:
jedes L unabhängig voneinander eine Nucleobase ist;
jedes R^7' unabhängig voneinander Wasserstoff oder ein C₁-C₈ Alkylamin ist, mit der Maßgabe, dass zumindest ein R^7' ein C₁-C₈ Alkylamin ist;
R^h OH, NH₂ oder NHLysNH₂ ist;
Rⁱ H, COCH₃ oder t-Butoxycarbonyl ist; und
n eine ganze Zahl von 1 bis 30 ist.
Vorzugsweise ist zumindest ein R^7' ein C₃-C₆ Alkylamin. Noch bevorzugter ist zumindest ein R^7' ein C₄-C₅ Alkylamin. Noch bevorzugter ist zumindest ein R^7' Butylamin. Und noch bevorzugter sind im Wesentlichen alle der R^7' Butylamin.
Vorzugsweise ist das Kohlenstoffatom, an welches der Substituent R^7' angebracht ist, stereochemisch angereichert. Nachfolgend bedeutet „stereochemisch angereichert", dass ein Ste reoisomer in größerer Menge vorliegt als das andere Stereoisomer, und zwar in einer Menge, mit welcher ein vorteilhafter Effekt bewirkt wird. Vorzugsweise liegt ein Stereoisomer mit mehr als 50 % vor. Noch bevorzugter liegt ein Stereoisomer mit mehr als 80 % vor. Noch weiter bevorzugt ist es, wenn ein Stereoisomer mit mehr als 90 % vorliegt. Es ist ferner darüber hinaus noch bevorzugter, wenn ein Stereoisomer mit mehr als 95 % vorliegt. Ferner ist noch bevorzugter, wenn ein Stereoisomer mit mehr als 99 % vorliegt. Noch bevorzugter ist es, wenn ein Stereoisomer im Wesentlichen quantitativ vorliegt. Die stereochemische Anreicherung ist vorzugsweise eine R-Konfiguration.
Die Peptidnucleinsäure ist vorzugsweise von einer Aminosäure abgeleitet. Noch bevorzugter ist es, wenn die Peptidnucleinsäure von D-Lysin abgeleitet ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Verbesserung der DNA- oder RNA-Bindungsaffinität einer Peptidnucleinsäure bereit, und zwar durch Einbau einer C₁-C₈ Alkylamin-Seitenkette in die Peptidnucleinsäure mit der Formel (I).
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Verbesserung der Löslichkeit einer Peptidnucleinsäure bereit, durch Einbau einer C₁-C₈ Alkylamin-Seitenkette in die Peptidnucleinsäure mit der Formel (I).
Die PNAs der Erfindung werden durch Anwendung von standardisierten Peptidsyntheseverfahren synthetisiert, und zwar entweder in Lösung oder an einer festen Phase.
In einigen bevorzugten Ausführungsformen sind die Monomer-Untereinheiten der Erfindung Aminosäuren oder deren aktivierte Derivate, die durch Standard-Schutzgruppen geschützt sind, die im Stand der Technik bekannt sind. Bevorzugte Monomer-Untereinheiten gemäß der vorliegenden Erfindung sind Aminosäureverbindungen mit der Formel (II):
in welcher:
L eine Nucleobase ist;
R^7' ein C₁-C₈ Alkylamin ist;
E COOH oder ein aktiviertes oder geschütztes Derivat davon ist; und Z NH₂ oder NHPg ist, wobei Pg eine Amino-Schutzgruppe ist.
Vorzugsweise ist R^7' C₃-C₆ Alkylamin. Noch bevorzugter ist R^7' C₄-C₅ Alkylamin. Und noch bevorzugter ist R^7' Butylamin.
Das Kohlenstoffatom, an welches der Substituent R^7' gebunden ist (markiert mit einem Sternchen), ist stereochemisch angereichert. Die stereochemische Anreicherung ist vorzugsweise eine R-Konfiguration.
Die Verbindung (II) der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise von einer Aminosäure abgeleitet. Noch bevorzugter ist die Verbindung (II) der vorliegenden Erfindung von D-Lysin abgeleitet.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, welche Peptidnucleinsäuren der vorliegenden Erfindung und zumindest einen pharmazeutisch wirksamen Träger, Bindemittel, Verdickungsmittel, Verdünnungsmittel, Puffer, Konservierungsstoff oder oberflächenaktives Agens aufweist.
Unter anderen Gesichtspunkten werden Verfahren zur Verbesserung der DNA- oder RNA-Sequenzspezifität einer Peptidnucleinsäure bereitgestellt, durch Einbau eines oder mehrerer 2,6-Diaminopurin-Nucleobasen in das Peptidnucleinsäure-Grundgerüst.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1(a) und 1(b) zeigen Beispiele für natürlich vorkommende und nicht-natürlich vorkommende Nucleobasen für die Erkennung von DNA.
2 zeigt den Acr¹-Liganden und eine PNA, Acr¹-(Taeg)₁₀-Lys-NH₂.
3 zeigt ein allgemeines Schema für eine Festphasen-PNA-Synthese, welche die Herstellung von linearen, ungeschützten PNA-Amiden zeigt.
4 zeigt ein Verfahren zur Synthese von ungeschützten PNA-Synthons.
5 zeigt ein Verfahren zur Synthese von Thymin-Monomer-Synthons mit Seitenketten, welche herkömmlichen Aminosäuren entsprechen.
6 stellt ein Verfahren zur Synthese eines Aminoethyl-β-Alanin-Analogs eines Thymin-Monomer-Synthons bereit.
Die 7(a), 7(b) und 7(c) sind schematische Darstellungen der Synthese von PNA-Monomeren, die Lysin enthalten.
8 zeigt ein Diagramm, welches die Inhibierung der HCV-Proteintranslation in einem in vitro-Translationsassay zeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die spezifische Sequenzerkennung von DNA oder RNA ist für die Entwicklung von biologischen Sonden und neuen Reagenzien zur Verwendung in der Forschung von steigender Wichtigkeit (Uhlmann, E., Payman, A., Chem. Rev., 1990, 90, 544, und Helene, C., Toulme, J.J., Biochim. Biophys. Acta., 1990, 1049, 99). Peptidnucleinsäuren (PNA), achirale Analoga von DNA, in welchen die Nucleobasen oder die Nucleobasen-Analoga an ein (2-Aminoethyl)-glycin-Grundgerüst über einen Methylen-Carbonyl-Linker gebunden sind, weisen Eigenschaften auf, wodurch sie zur Verwendung als biologische Sonden oder für andere Anwendungen geeignet sind. PNAs besitzen nachgewiesenermaßen eine hohe Bindungsaffinität und Spezifität für komplementäre DNA, sowie eine Sequenz-spezifische Inhibierung der DNA-Restriktionsenzymspaltung und eine stellenspezifische in vitro-Inhibierung der Translation (Egholm, M., et al., Chem. Soc., Chem. Commun., 1993, 800; Egholm, M., et al., Nature, 1993, 365, 566; Nielsen, M., et al., Nucl. Acids Res., 1993 21, 197; und Hanvey, J.C., et al., Science, 1992, 258, 1481). Modifizierungen von PNA schließen erweiterte Grundgerüste (Hyrup, B., et al., Chem. Soc., Chem. Commun., 1993, 518), verlängerte Linker zwischen dem Grundgerüst und der Nucleobase, die Umkehr der Aminobindung (Lagriffoul, P.H., et al., Biomed. Chem. Lett., 1994, 4, 1081), und die Verwendung eines chiralen Grundgerüsts, basierend auf Alanin (Dueholm, K.L., et al., BioMed. Chem. Lett., 1994,4, 1077).
Bei den PNAs der vorliegenden Erfindung mit der Formel (I) ist die Nucleobase L eine natürlich vorkommende Nucleobase, die an derjenigen Position gebunden ist, wie es auch in der Natur gefunden wird, d.h. an Position 9 für Adenin oder Guanin und an Position 1 für Thymin oder Cytosin, ferner eine nicht-natürlich vorkommenden Nucleobase (Nucleobasen-Analogon) oder eine Nucleobasen-Bindungseinheit. Die Nucleobase L kann auch eine natürlich vorkommende Nucleobase, wie bspw. eine 2,6-Diaminopurin-Nucleobase, sein. Einige typische Nucleobasen und beispielhafte synthetische Nucleobasen sind in den 1(a) und 1(b) gezeigt.
Bei Monomer-Untereinheiten gemäß der vorliegenden Erfindung mit der Formel (II) ist L eine natürlich vorkommende Nucleobase oder eine nicht-natürlich vorkommende Base, die mit einer oder mehreren Schutzgruppen geschützt sein kann. Beispielhafte Schutzgruppen schließen t-Butoxycarbonyl (BOC), Fluorenylmethyloxycarbonyl (FMOC) oder 2-Nitrobenzyl (2Nb) mit ein. Solche Schutzgruppen können dementsprechend entweder eine Säure, eine Basen, hydrogenolytisch oder photolytisch labil sein.
R^7' ist vorzugsweise unabhängig voneinander Wasserstoff oder C₁-C₈ Alkylamin.
E in der Monomer-Untereinheit ist vorzugsweise COOH oder ein aktiviertes Derivat davon. Die Aktivierung kann bspw. durch Verwendung eines Säureanhydrids oder eines aktiven Esterderivats erreicht werden.
Die Aminosäuren, die das Polyamid-Grundgerüst bilden, können identisch oder unterschiedlich sein. Vorliegend haben wir herausgefunden, dass diejenigen, die auf 2-Aminoethylglycin basieren, besonders nützlich für die vorliegende Erfindung sind.
Die PNAs der vorliegenden Erfindung können an Effektorliganden mit niedrigem Molekulargewicht gebunden sein, wie bspw. Liganden mit einer Nucleaseaktivität oder einer alkylierenden Aktivität oder Reporterliganden (wie bspw. fluoreszierende Marker, Spinmarker, radioaktive Marker, Proteinerkennungsmarker, wie bspw. Biotin oder Haptene). PNAs können auch an Peptide oder Proteine gebunden sein, wobei die Peptide eine signalgebende Aktivität haben. Beispielhafte Proteine schließen Enzyme, Transkriptionsfaktoren und Antikörper mit ein. Die PNAs der vorliegenden Erfindung können auch an wasserlösliche Polymere, wasserunlösliche Polymere, Oligonucleotide oder Kohlenwasserstoffe gebunden sein. In angemessener Art und Weise kann ein PNA-Oligomer an eine Komponente (wie bspw. eine Peptidkette, einen Reporter, eine interkalierende Substanz oder eine andere Art einer Liganden-enthaltenden Gruppe), welche an einen festen Träger gebunden ist, synthetisiert werden.
Bei Monomer-Untereinheiten gemäß der vorliegenden Erfindung mit der Formel (II) ist L eine natürlich vorkommende Nucleobase oder eine nicht-natürlich vorkommende Nucleobase, die mit einer oder mehreren Schutzgruppen geschützt sein kann.
Bei einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung mit der allgemeinen Formel (II) ist L eine 2,6-Diaminopurin-Nucleobase, die mit einer oder mehreren Schutzgruppen geschützt sein kann. Beispielhafte Schutzgruppen schließen t-Butoxycarbonyl (BOC), Fluorenylmethyloxycarbonyl (FMOC) oder 2-Nitrobenzyl (2Nb) mit ein. Dementsprechend können solche Schutzgruppen entweder eine Säure, eine Basen, hydrogenolytisch oder photolytisch labil sein.
R^7' ist vorzugsweise unabhängig von einander Wasserstoff oder C₁-C₈ Alkylamin.
E in der Monomer-Untereinheit ist vorzugsweise COOH oder ein aktiviertes Derivat davon. Die Aktivierung kann bspw. durch Verwendung eines Säureanhydrids oder eines aktiven Esterderivats erreicht werden.
Die Aminosäuren, die das Polyamid-Grundgerüst bilden, können identisch oder unterschiedlich sein. Wir haben herausgefunden, dass diejenigen, die auf 2-Aminoethylglycin basieren, besonders nützlich für die vorliegende Erfindung sind.
Die PNAs der vorliegenden Erfindung können für eine Gen-Modulierung (wie bspw. auf Gene abgerichtete Arzneimittel) eingesetzt werden, ferner als Diagnostika, in der Biotechnologie und anderen Forschungszwecken. Die PNAs können auch dazu eingesetzt werden, um auf RNA und einzelsträngige DNA (ssDNA) abzuzielen, um sowohl Antisens-Typ-Gen-regulierende Komponenten als auch Hybridisierungssonden bereitzustellen, wie bspw. für die Identifizierung und Reinigung von Nucleinsäuren. Darüber hinaus können PNAs derart modifiziert werden, dass sie Tripel-Helices mit doppelsträngiger DNA (dsDNA) bilden. Verbindungen, die sequenzspezifisch an dsDNA binden, wurden als Arzneimittel eingesetzt, die Gene zum Ziel haben. Diese Verbindungen sind äußerst nützliche Arzneimittel zur Behandlung von Krankheiten wie Krebs, dem erworbenen Immunschwäche-Syndrom (AIDS) und anderen viralen Infektionen und genetischen Krankheiten. Darüber hinaus können diese Verbindungen auch in der Forschung, als Diagnostika und zur Detektion und Isolierung spezifischer Nucleinsäuren eingesetzt werden.
Arzneimittel, die auf Gene abzielen, werden mit einer Nucleobasensequenz (die vorzugsweise zwischen 10 bis 20 Einheiten enthält) ausgebildet, die zu der regulatorischen Region (dem Promotor) des Zielgens komplementär sind. Daher binden auf Gene abzielende Arzneimittel nach ihrer Verabreichung an den Promotor und verhindern, dass die RNA-Polymerase Zugang zum Promotor hat. Als Konsequenz wird keine mRNA und daher auch kein Genprodukt (Protein) produziert. Wenn das Ziel innerhalb eines lebenswichtigen Gens für ein Virus liegt, werden keine lebensfähigen Virenpartikel produziert. Alternativ könnte die Zielregion stromabwärts von dem Promotor liegen, wodurch die RNA- Polymerase an dieser Stelle terminiert, wodurch eine verkürzte mRNA/Protein gebildet wird, das nicht funktional ist.
Die sequenzspezifische Erkennung von sDNA durch eine Basen-komplementäre Hybridisierung kann auf ähnliche Weise angewandt werden, um auf spezifische Gene und Viren abzuzielen. In diesem Fall ist die Zielsequenz in der mRNA enthalten, so dass die Bindung des Arzneimittels an das Ziel die Wirkung der Ribosomen verhindert und – als Konsequenz – die Translation der mRNA in ein Protein. Die PNAs der vorliegenden Erfindung haben eine höhere Affinität für komplementäre ssDNA als andere gegenwärtig verfügbare Oligonucleotid-Analoga. Ferner müssen die PNAs der vorliegenden Erfindung keine Nettoladung aufweisen und können Substituenten enthalten, die die wässrige Löslichkeit verstärkt, was die zelluläre Aufnahme erleichtert. Darüber hinaus enthalten die PNAs der vorliegenden Erfindung Amide nicht-biologischer Aminosäuren, wodurch diese biostabil und resistent gegenüber einem enzymatischen Abbau sind.
Die PNAs der vorliegenden Erfindung, welche C₁-C₈ Alkylamin-Seitenketten aufweisen, zeigen eine verstärkte Bindungsaffinität. Dies wird durch eine erhöhte thermale Stabilität des Komplexes gezeigt, der zwischen diesen Verbindungen der vorliegenden Erfindung und einem komplementären DNA-Strang gebildet wird. Die PNAs der vorliegenden Erfindung zeigen auch eine verstärkte Löslichkeit und Sequenzspezifität bei der Bindung an komplementäre Nucleinsäuren.
Alkylgruppen gemäß der vorliegenden Erfindung schließen gerade Ketten, verzeigte Ketten und cyclische Wasserstoffe mit ein – sind jedoch nicht hierauf beschränkt –, wie bspw. Me thyl-, Ethyl-, Propyl-, Pentyl-, Isopropyl-, 2-Butyl-, Isobutyl-, 2-Methylbutyl- und Isopentylbestandteile mit 1 bis ungefähr 12 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis ungefähr 7 Kohlenstoffatomen.
Arylgruppen gemäß der vorliegenden Erfindung sind aromatische Gruppen, welche – nicht ausschließlich – bspw. Benzyl, Imidazolyl, Naphthyl, Phenyl, Pyridyl, Pyrimidinyl und Xylyl-gruppen sowie substituierte Derivate davon mit einschließen, insbesondere diejenigen, die mit Alkyl-, Alkoxy-, Amino- und Nitrogruppen substituiert sind. Bevorzugte Arylgruppen besitzen 6 bis ungefähr 14 Kohlenstoffatome.
Der Ausdruck Aminosäure, wie er hierin verwendet wird, soll alle natürlich vorkommenden und synthetischen Aminosäuren mit einschließen, die im Stand der Technik bekannt sind. Im Allgemeinen haben Aminosäuren die Struktur H₂N-CH(R_c)-C(O)OH, wobei R_c die Aminosäurenseitenkette ist. Beispielhafte, natürlich vorkommende Seitenketten sind in der Tabelle 1 gezeigt.
TABELLE 1
Bevorzugte Seitenketten schließen diejenigen mit ein, die eine Polarität aufweisen, wie bspw. diejenigen, die primäre oder sekundäre Amine besitzen. Eine noch bevorzugtere Liste schließt Folgende mit ein: HO-CH₂-, HO-C₆H₅-CH₂-, HO₂C-CH(NH₂)-CH₂ S-S-CH₂-, HO-CH₂-CH₂-, HCO₂-CH₂-CH₂-, H₂N-C(NH)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-, H₂N-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-, H₂N-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂- und p-HO-m-HO-C₆H₄-CH₂-.
Nucleotidbasen gemäß der vorliegenden Erfindung schließen heterocyclische Basen mit ein, einschließlich solche, die in DNAs und RNAs natürlich auftreten, und modifizierte Basen. Modifizierte Basen sind diejenigen, in welchen der Purin- oder Pyrimidin-Ring verändert ist. Natürlich vorkommende Basen schließen Adenin, Guanin, Hypoxanthin, Xanthin, Uracil, Cytosin und Thymin mit ein. Beispielhaft modifizierte Basen schließen 6-Methylaminopurin, 7-Methylguanin und 5-Methylcytosin mit ein.
Schutzgruppen sind per se als chemische funktionelle Gruppen bekannt, die jeweils angehängt werden können und von der Funktionalität entfernt werden können, wie bspw. Amin, Carboxyl, oder Hydroxylgruppen, die in einer chemischen Verbindung vorliegen, wodurch eine solche Funktionalität gegenüber chemischen Reaktionsbedingungen inert wird, welchen die Verbindung ausgesetzt wird. Siehe bspw. Greene und Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Edition, John Wiley & Sons, New York, 1991. Beispielhafte Carboxylschutzgruppen schließen niedere (also C₁-C₇) Alkylester und Benzylester mit ein. Bevorzugte Carboxylschutzgruppen sind diejenigen, die einer durchschnittlich starken Säure gegenüber stabil sind, die jedoch unter stark sauren Bedingungen entfernt werden können.
PNAs der vorliegenden Erfindung sind als Forschungsreagenzien und als diagnostische Mittel geeignet. PNAs sind in Untersuchungen verwendet worden, um zwischen vollständig komplementären und solchen Zielen zu unterscheiden, die in einer einzigen Base voneinander abweichen (Orum, H., et al., Nucleic Acids Research, 1993, 21, 53332-5336). Das Verfahren macht sich die Eigenschaften der PNA zu Nutze, d.h. die höhere thermale Stabilität, die größere Spezifität – wenn diese an komplementäre Nucleinsäuresequenzen gebunden sind – als die entsprechenden Desoxyribooligonucleotide, und dass die PNAs nicht durch die DNA-Polymerase als Primer erkannt werden. Ein PNA/DNA-Komplex kann die Bildung eines PCR-Produkts effektiv blockieren, wenn die PNA auf die PCR-Primerstelle abzielt. Dieses Verfahren ist bei der Blockierung von Zielsequenzen effektiv, wenn zwei Zielsequenzen im gleichen Assay sich durch lediglich ein Basenpaar unterscheiden. Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit einer größeren Spezifität als normale PNA sind für die Verwendung in diagnostischen Assays dieser Art gut geeignet.
Die folgenden Beispiele sind lediglich beispielhaft für die vorliegende Erfindung und sollen den Rahmen der Erfindung in keiner Weise beschränken. Diese Beispiele und Äquivalente davon werden den Fachleuten auf Grund der vorliegenden Offenbarung und den beigefügten Ansprüchen klarer werden.
Eine Synthese von PNAs gemäß der vorliegenden Erfindung wird nachfolgend im Detail diskutiert.
SYNTHESE VON PNA-OLIGOMEREN
Das Prinzip der Verankerung von Molekülen während einer Reaktion an eine feste Matrix wird als Festphasen-Synthese oder Merrifield-Synthese bezeichnet (siehe Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 2149 und Science, 1986, 232, 341). Etablierte Verfahren zur schrittweisen oder Fragment-weisen Festphasen-Assemblierung von Aminosäuren in Peptide setzen normalerweise eine Kügelchen-Matrix eines vernetzten Styrol-Divinylbenzol-Copolymers ein. Das vernetzte Copolymer wird durch Perlen-Polymerisation des Styrol-Monomers gebildet, an welchen eine Mischung von Divinylbenzolen hinzugefügt wird. Gewöhnlich wird eine 1 bis 2 %ige Vernetzung eingesetzt. Eine solche Matrix kann für die Festphasen-PNA-Synthese der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden (3).
Mehr als 50 Verfahren zur anfänglichen Funktionalisierung der Festphase sind in Verbindung mit der herkömmlichen Festphasen-Peptidsynthese beschrieben worden (siehe Barany und Merrifield in „The Peptides" Vol. 2, Academic Press, New York, 1979, Seiten 1-284, und Stewart und Young, „Solid Phase Peptide Synthesis", 2. Ed., Pierce Chemical Company, Illinois, 1984). Reaktionen zur Einführung einer Chlormethylfunktionalität (Merrifield-Harz; über eine Chlormethylmethylether/SnCl₄-Reaktion), Aminomethylfunktionalität (über eine N-Hydroxymethylphthalamid-Reaktion; Mitchell et al., Tetrahedron Lett., 1976, 3795) und eine Benzhydrylaminofunktionalität (Pietta et al., J. Chem. Soc., 1970, 650) werden am meisten eingesetzt. Unabhängig von ihrer Beschaffenheit ist der Zweck der Einführung einer Funktionalität an der Festphase, eine Verankerungsverbindung zwischen dem festen Copolymer-Träger und dem C-Terminus der ersten Aminosäure, die an den festen Träger gekoppelt werden soll, zu bilden. Es ist klar, dass Verankerungsverbindungen auch zwischen dem festen Träger und dem N-Terminus der Aminosäure gebildet werden können. Die „Konzentration" der funktionellen Gruppe, die in der festen Phase vorliegt, wird im Allgemeinen in Millimol pro Gramm (mmol/g) ausgedrückt. Andere reaktive Funktionalitäten, die anfänglich eingeführt wurden, schließen 4-Methylbenzhydrylamino- und 4-Methoxybenzhydrylamino-Gruppen mit ein. All diese etablierten Verfahren sind im Prinzip im Kontext der vorliegenden Erfindung brauchbar.
Bei einem bevorzugten Verfahren der PNA-Synthese wird Aminomethyl als anfängliche Funktionalität eingesetzt. Aminomethyl ist besonders als „Spacer"- oder „Handle"-Gruppe bevorzugt, da es mit einer Carboxylsäuregruppe Amidbindungen in nahezu quantitativen Mengen bildet. Eine sehr große Anzahl relevanter Spacer- oder Handle-bildenden bifunktionalen Reagenzien sind bisher beschrieben worden (siehe Barany et al., Int. J. Peptide Protein Res., 1987, 30, 705). Beispielhafte bifunktionelle Reagenzien schließen 4-(Haloalkyl)aryl-niedere Alkansäuren, wie bspw. 4-(Brommethyl)phenylessigsäure mit ein; BOC-Aminoacyl-4-(oxymethyl)aryl-niedere Alkansäuren, wie bspw. BOC-Aminoacyl-4-(oxymethyl)phenylessigsäure mit ein; N-BOC-p-Acylbenzhydrylamine, wie bspw. N-BOC-p-Glutaroylbenzhydrylamin; N-BOC-4'-niedere Alkyl-p-acylbenzhydrylamine, wie bspw. N-BOC-4'-Methyl-p-glutaroylbenzhydrylamin; N-BOC-4'-niedere Alkoxy-p-acylbenzhydrylamine, wie bspw. N-BOC-4'-Methoxy-p-glutaroylbenzhydrylamin; und 4-Hydroxymethylphenoxyessigsäure. Eine Art der Spacer-Gruppe, die im Kontext der vorliegenden Erfindung besonders relevant ist, ist die Phenylacetamidomethyl(PAN)-Handle (Mitchell und Merrifield, J. Org. Chem., 1976, 41, 2015), die, da sie von der Elektronen-abziehenden Wirkung der 4-Phenylacetamidomethyl-Gruppe abgeleitet ist – ungefähr 100 Mal stabiler ist als eine Benzylesterverbindung in Richtung des BOC-Amino-Deprotektionsreagens Trifluoressigsäure (TFA).
Bestimmte Funktionalitäten (wie bspw. Benzhydrylamino, 4-Methylbenzhydrylamino und 4-Methoxybenzhydrylamino), die zum Zwecke der Spaltung einer synthetisierten PNA-Kette vom festen Träger eingebaut werden können, und zwar derart, dass das C-terminale Ende der PNA-Kette als ein Amin freigesetzt wird, brauchen keine Einführung einer Spacer-Gruppe. Jede solche Funktionalität kann vorteilhafterweise im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Eine alternative Strategie bezüglich der Einführung von Spacer- oder Handle-Gruppen ist die sog. „vorgefertigte Handle"-Strategie (siehe Tam et al., Synthesis, 1979, 955-957), welche eine vollständige Kontrolle über die Kopplung der ersten Aminosäure bietet, und die Möglichkeit von Komplikationen ausschließt, welche aus dem Vorliegen unerwünschter funktioneller Gruppen entstehen kann, die nicht mit dem Peptid oder der PNA-Synthese in Beziehung stehen. Bei dieser Strategie werden die Spacer- oder Handle-Gruppen – von der gleichen Art wie oben beschrieben – mit der ersten Aminosäuregruppe reagiert, welche an die Festphase gebunden werden soll, wobei die Aminosäure N-geschützt ist und ggf. an den anderen Seitenketten ebenfalls geschützt ist, die hinsichtlich des Wachsens der gewünschten PNA-Kette nicht relevant sind. Auf diese Weise kann in denjenigen Fällen, in welchen eine Spacer- oder Handle-Gruppe wünschenswert ist, die erste Aminosäure an den festen Träger entweder an das freie reaktive Ende einer Spacer-Gruppe gekoppelt werden, die an die anfänglich eingeführte Funktionalität (wie bspw. einer Aminomethylgruppe) gebunden wurde, oder kann mit dem Spacer-bildenden Reagens reagiert werden. Das Spacer-bildende Reagens wird anschließend mit der anfänglich eingeführten Funktionalität reagiert. Andere geeignete Verankerungsschemata schließen „mehrfach abtrennbare" Harze mit ein (siehe Tam et al., Tetrahedron Lett., 1979, 4935 und J. Am. Chem. Soc., 1980, 102, 611; Tam, J. Org. Chem , 1985, 50, 5291), welche mehr als eine Art der Freisetzung bereitstellen und dadurch eine höhere Flexibilität beim synthetischen Design ermöglichen.
Beispielhafte N-schützende Gruppen sind tert-Butyloxycarbonyl (BOC) (Carpino, J. Am. Chem. Soc., 1957, 79, 4427; McKay et al., J. Am. Chem. Soc., 1957, 79, 4686; Anderson et al., J. Am. Chem. Soc., 1957, 79, 6180) und das 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (FMOC) (Carpino et al., J. Am. Chem. Soc., 1970, 92, 5748 und J. Org. Chem, 1972, 37, 3404), Adoc (Hass et al., J. Am. Chem. Soc., 1966, 88, 1988), Bpoc (Sieber, Helv. Chem. Acta., 1968, 51, 614), Mcb (Brady et al., J. Org. Chem., 1977, 42, 143), Bic (Kemp et al., Tetrahedron, 1975, 4624), o-Nitrophenylsulfenyl (Nps) (Zervas et al., J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 3660) und Dithiasuccinoyl (Dts) (Barany et al., J. Am. Chem. Soc., 1977, 99, 7363), ebenso wie andere Gruppen, die den Fachleuten bekannt sind. Diese Aminoschutzgruppen, insbesondere diejenigen, die auf der weit verbreiteten Urethan-Funktionalität basieren, verhindern eine Racemisierung (vermittelt durch die Tautomerisierung der bereits gebildeten Oxazolinon(Azlacton)-Zwischenprodukte (Goodman et al., J. Am. Chem. Soc., 1964, 86, 2918)) während der Kopplung der meisten α-Aminosäuren.
Zusätzlich zu solchen Amino-Schutzgruppen können auch Amino-Schutzgruppen vom Typ eines Nicht-Urethans eingesetzt werden, wenn die PNA-Moleküle aufgebaut werden. Daher sind nicht nur die oben genannten Amino-Schutzgruppen (oder diejenigen, die von irgendeiner dieser Gruppen abgeleitet sind) im Kontext der vorliegenden Erfindung nützlich, sondern im Prinzip jede Amino-Schutzgruppe, die im Wesentlichen die folgenden Bedingun gen erfüllt: (1) stabil gegenüber milden Säuren (nicht besonders anfällig durch Carboxylgruppen); (2) stabil gegenüber milden Basen oder Nucleophilen (nicht bedeutend angegriffen durch die in Frage stehende Aminogruppe); (3) resistent gegenüber einer Acylierung (nicht bedeutend angegriffen durch aktivierte Aminosäuren); (4) kann im Wesentlichen ohne ernste Nebenreaktionen entfernt werden; und (5) bewahrt die optische Integrität, wenn vorhanden, der einzuführenden Aminosäure nach einer Verbindung.
Die Auswahl der Schutzgruppen für die Seitenketten hängt im Allgemeinen von der Auswahl der Amino-Schutzgruppe ab, da die Schutzgruppe für die Seitenkette den Bedingungen der wiederholten Amino-Deprotektions-Zyklen widerstehen muss. Dies findet immer dann statt, wenn die Gesamtstrategie zum chemischen Aufbau von PNA-Molekülen sich bspw. auf eine unterschiedliche Säurestabilität der Amino- und Seitenketten-Schutzgruppe stützt (wie bspw. im Falle des oben erwähnten „BOC-Benzyl"-Ansatzes) oder setzt ein orthogonales, also chemoselektives Protektionsschema ein (wie bspw. im Fall des oben erwähnten „FMOC-t-Bu"-Ansatzes). Nach Verbindung der ersten Aminosäure ist der nächste Schritt der Festphasen-Synthese die systematische Ausarbeitung der erwünschten PNA-Kette. Diese Ausarbeitung beinhaltet wiederholte Deprotektions-/Bindungszyklen. Eine temporäre Schutzgruppe, wie bspw. BOC oder FMOC, kann an der zuletzt verbundenen Aminosäure durch eine geeignete Behandlung quantitativ entfernt werden, wie bspw. durch Azidolyse, wie bspw. mit Trifluoressigsäure im Falle von BOC, oder durch eine Behandlung mit einer Base, wie bspw. mit Piperidin im Falle von FMOC, um die N-terminale Aminfunktion freizusetzen.
Anschließend wird die als nächstes erwünschte N-geschützte Aminosäure an das N-terminale Ende der zuletzt gekoppelten Aminosäure gebunden. Dieses Verbinden des C-Terminus einer Aminosäure mit dem N-Terminus der zuletzt verbundenen Aminosäure kann auf verschiedene Arten erreicht werden. So kann es bspw. durch Bereitstellen der einzuführenden Aminosäure in einer Form erreicht werden, bei der die Carboxylgruppe durch eines von verschiedenen Verfahren aktiviert wurde, einschließlich der anfänglichen Bildung eines aktiven Esterderivats, wie bspw. eines 2,4,5-Trichlorphenylesters (Pless et al., Helv. Chim. Acta, 1963, 46, 1609), einem Phthalimidoester (Nefkens et al., J. Am. Chem. Soc., 1961, 83, 1263), einem Pentachlorophenylester (Kupryszewski, Rocz. Chem , 1961, 35, 595), einem Pentafluorophenylester (Kovacs et al., J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 183), einem o-Nitrophenylester (Bodanzsky, Nature, 1955, 175, 685), einem Imidazolester (Li et al., J. Am. Chem. Soc., 1970, 92, 7608) und einem 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydroquinazolin(Dhbt-OH)ester (Konic et al., Chem. Ber., 1973, 103, 2024 und 2034) oder die anfängliche Bildung eines Anhydrids, wie bspw. einem symmetrischen Anhydrid (Wieland et al., Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 1971, 10, 336). Alternativ kann die Carboxylgruppe der einzuführenden Aminosäure direkt mit dem N-Terminus der zuletzt verbundenen Aminosäure unter Zuhilfenahme eines Kondensations-Reagens reagiert werden, wie bspw. Dicyclohexylcarbodiimid (Sheehan et al., J. Am. Chem. Soc., 1955, 77, 1067) oder Derivaten davon. Benzotriazolyl-N-oxy-trisdimethylaminophosphoniumhexafluorophosphat (BOP), „Castros Reagens" Rivaille et(siehe al., Tetrahedron., 1980, 36, 3413) wird bei dem Aufbau von PNA-Molekülen mit sekundären Aminogruppen empfohlen. Schlussendlich versprechen PNA-Monomere, die zu den kürzlich berichteten Aminosäurenfluoriden (Carpino, J. Am. Chem. Soc., 1990,112, 9651) analog sind, auch bei der PNA-Synthese nützlich zu sein.
Nach dem Aufbau der gewünschten PNA-Kette, einschließlich der Schutzgruppen, wird der nächste Schritt normalerweise die Deprotektion der Aminosäurenkomponenten der PNA-Kette und die Spaltung der synthetisierten PNA von dem festen Träger sein. Diese Verfahren können im Wesentlichen gleichzeitig stattfinden, wodurch das freie PNA-Molekül in der erwünschten Form bereitgestellt wird. Alternativ ist es in den Fällen möglich, in welchen eine Kondensierung von zwei getrennt synthetisierten PNA-Ketten ausgeführt werden soll, durch Auswahl einer geeigneten Spacer-Gruppe zu Beginn der Synthese, die gewünschte PNA-Kette von deren jeweiligem festen Träger zu spalten (beide Peptidketten jedoch immer noch mit deren Seitenketten-Schutzgruppen) und schließlich Entfernen der Seitenketten-Schutzgruppen nach bspw. einem Verbinden der zwei Seitenketten-geschützten Peptidketten, um eine längere PNA-Kette zu bilden.
In dem oben erwähnten „BOC-Benzyl"-Protektionsschema wird die letztendliche Deprotektion der Seitenketten und das Freisetzen des PNA-Moleküls vom festen Träger meistens durch die Verwendung von starken Säuren durchgeführt, wie bspw. wasserfreies HF (Sakakibara et al., Bull. Chem. Soc. Jpn., 1965, 38, 4921), Bortris-(trifluoracetat) (Pless et al., Helv. Chim. Acta., 1973, 46, 1609) und Sulfonsäuren, wie bspw. Trifluormethansulfonsäure und Methansulfonsäure (Yajima et al., J. Chem. Soc., Chem. Comm., 1974, 107). Ein Deprotektionsverfahren mit einer starken Säure (bspw. wasserfreies HF) kann sehr reaktive Carbo-Kationen produzieren, die zu einer Alkylierung und Acylierung sensitiver Reste in der PNA-Kette führen können.
Solche Nebenreaktionen können nur teilweise durch die Gegenwart von Fängern, wie Anisol, Phenol, Dimethylsulfid und Mercaptoethanol vermieden werden. Daher wird das Sulfid-begleitete azidolytische S_N2-Deprotektionsverfahren (Tam et al., J. Am. Chem. Soc., 1983, 105, 6442 und J. Am. Chem. Soc., 1986, 108, 5242) häufig bei der Peptid- und PNA-Synthese eingesetzt, also das sog. „niedere" Verfahren, welches die Vorläufer gefährlicher Carbokationen zur Bildung inerter Sulfoniumsalze entfernt. Andere Verfahren zur Deprotektion und/oder Endspaltung der Bindung zwischen PNA und festem Träger können Basenkatalysierte Alkoholyse mit einschließen (Barton et al., J. Am. Chem. Soc., 1973,95, 4501), Ammonolyse, Hydrazinolyse (Bodanszky et al., Chem. Ind., 1964, 1423), Hydrogenolyse (Jones, Tetrahedron Lett., 1977, 2853 und Schlatter et al., Tetrahedron Lett., 1977, 2861) sowie Photolyse (Rich und Gurwara, J. Am. Chem. Soc., 1975, 97, 1575).
Schließlich kann im Gegensatz zur chemischen Synthese herkömmlicher Peptide die schrittweise Kettenbildung von achiralen PNAs – wie bspw. solcher, die auf Aminoethylglycyl-Grundgerüst-Einheiten basieren – entweder vom N-Terminus oder vom C-Terminus starten. Die Fachleute werden erkennen, dass die Synthese, die am C-Terminus anfängt, typischerweise geschützte Amingruppen und freie oder aktivierte Säuregruppen einsetzt, und dass bei Synthesen, die am N-Terminus anfangen, typischerweise geschützte Säuregruppen und freie oder aktivierte Amingruppen eingesetzt werden.
Basierend auf der Erkenntnis, dass die meisten Prozesse hinsichtlich der synthetischen Zyklen der Festphasen-Peptidsynthese identisch sind (wie es auch der Fall ist für die Fest phasen-PNA-Synthese), wurde kürzlich eine neue Matrix, PEPS, offenbart (Berg et al., J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 8024 sowie die Internationale Patentanmeldung WO 90/02749), um die Herstellung einer großen Anzahl von Peptiden zu erleichtern. Diese Matrix ist aus einer Polyethylen(PE)-Folie zusammengesetzt, mit angehängten langkettigen Polystyrol(PS)-Pfropfen (Molekulargewicht im Bereich von 10⁶ Dalton). Die Ladekapazität der Folie ist so hoch wie die einer Mikrosphären-Matrix, jedoch besitzt PEPS die zusätzliche Flexibilität, gleichzeitig für verschiedene Synthesen geeignet zu sein. Daher wird in einer neuartigen Konfiguration für die Festphasen-Peptidsynthese die PEPS-Folie in Form von getrennten, markierten Blättern ausgebildet, von denen jedes als einzelnes Feld dient. Während aller identischer Schritte der synthetischen Zyklen werden die Blätter in einem einzigen Reaktionsgefäß zusammengehalten, um die gleichzeitige Herstellung einer großen Zahl von Peptiden zu ermöglichen, und zwar mit einer Rate, die derjenigen einer einzigen Peptidsynthese durch herkömmliche Verfahren ähnlich ist. Man nimmt an, dass der PEPS-Folienträger, welcher Linker- oder Spacer-Gruppen aufweist, die an die jeweilige Chemie angepasst sind, besonders bei der Synthese einer Vielzahl von PNA-Molekülen wertvoll sein kann. Die Synthese von PNAs ist konzeptionell gesehen einfach, da normalerweise lediglich vier unterschiedliche Reaktionsfelder benötigt werden, eines für jedes der vier „Pseudo-Nucleotid"-Einheiten. Der PEPS-Folienträger ist in einer Anzahl von PNA-Synthesen erfolgreich getestet worden, welche parallel und im Wesentlichen gleichzeitig durchgeführt wurden. Die Ausbeute und die Qualität der von PEPS gewonnenen Produkte ist vergleichbar mit denjenigen, die durch Verwendung der traditionellen Polystyrol-Mikrosphärenträger gewonnen werden. Auch zeigten Experimente mit anderen Ausmaßen des PEPS-Polymers, wie bspw. nicht-gewebtem Filz, gewirkten Netzen, Stiften und Micro-Well-Platten, keine Beschränkung der Syntheseeffizienz.
Zwei andere Verfahren zur gleichzeitigen Synthese großer Anzahlen an Peptiden setzen auch die Herstellung einer Vielzahl von unterschiedlichen PNA-Molekülen ein. Das erste dieser Verfahren (Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81, 3998) verwendet Acrylsäure-aufpolymerisierte Polyethylen-Stäbchen und 96-Microtiter Well-Platten, um die wachsenden Peptidketten zu immobilisieren und um eine kompartimentalisierte Synthese durchzuführen. Dieses Verfahren ist zwar effektiv, jedoch lediglich im Mikrogramm-Maßstab anwendbar. Das zweite Verfahren (Houghten, Proc. Natl. Adac. Sci. USA, 1985, 82, 5131) setzt einen "Teebeutel" ein, der traditionell verwendete Polymerkügelchen enthält. Andere Verfahren zur vielfachen Peptid- oder PNA-Synthese im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung schließen die gleichzeitige Verwendung zweier unterschiedlicher Träger mit unterschiedlichen Dichten mit ein (Tregear in „Chemistry and Biology of Peptides", J. Meienhofer, Ed., Ann Arbor Sci. Publ., Ann Arbor, 1972, Seiten 175-178), das Kombinieren von Reaktionsgefäßen über einen Sammelträger (Gorman, Anal. Biochem., 1984, 136, 397), eine Multisäulen-Festphasen-Synthese (Krchnak et al., Int. J. Peptide Protein Res., 1989, 33, 209, und Holm und Meldal in „Proceedings of the 20th European Peptide Symposium", G. Jung und E. Bayer, EDs, Walter de Gruyter & Co., Berlin, 1989, Seiten 208-210) sowie die Verwendung von Cellulosepapier (Eichler et al., Collect. Czech. Chem. Commun., 1989, 54, 1746).
Im Zusammenhang der Festphasen-PNA-Synthese wird die herkömmliche vernetzte Styrol/Divinylbenzol-Copolymermatrix und der PEPS-Träger bevorzugt. Andere beispielhafte feste Träger schließen (1) Partikel mit ein, die auf Copolymeren von Dimethylacrylamid, vernetzt mit N,N'-Bisacryloylethylendiamin basieren, (2) feste Träger, die auf Silica-enthaltenden Partikeln, wie poröse Glaskügelchen und Silica-Gel basieren, (3) Komposite, die zwei Hauptinhaltsstoffe enthalten: ein Harz und ein anderes Material, das ebenfalls im Wesentlichen inert gegenüber den angewandten Reaktionsbedingungen ist (siehe Scott et al., J. Chrom. Sci., 1971, 9, 577; Kent und Merrifield, Israel J. Chem., 1978, 17, 243; und van Rietschoten in „Peptides 1974", Y. Wolman, Ed., Wiley und Söhne, New York, 1975, Seiten 113-116) und (4) aneinander angrenzende feste Träger außer PEPS, wie bspw. Baumwollblätter (Lebl und Eichler, Peptide Res., 1989, 2, 232) und Hydroxypropylacrylat-beschichtete Polypropylenmembranen (Daniels et al., Tetrahedron Lett., 1989, 4345).
Die Festphasen-PNA-Synthese wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung – egal, ob manuell oder automatisch durchgeführt – chargenweise durchgeführt. Jedoch können die meisten der Synthesen genau so gut auch im Durchflussverfahren durchgeführt werden, bei welchem der Träger in Säulen gepackt wird (Bayer et al., Tetrahedron Lett., 1970, 4503; und Scott et al., J. Chromatogr. Sci., 1971, 9, 577). Im Hinblick auf die Durchlauf-Festphasen-Synthese scheint der starre Poly(dimethylacrylamid)-Kieselguhr-Träger besonders nützlich zu sein (Atherton et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1981, 1151). Eine andere geeignete Konfiguration ist diejenige, die auch bei dem Standard-Copoly(Styrol-1%-divinylbenzol)-Träger funktioniert hat (Krchnak et al., Tetrahedron Lett., 1987, 4469).
Obgleich die Festphasen-Technik in der vorliegenden Erfindung bevorzugt ist, können auch andere Verfahren oder Kombinationen davon eingesetzt werden. Beispielhafte Verfahren schließen (1) die klassischen Lösungs-Phasen-Verfahren zur Peptidsynthese mit ein (Bodanszky, „Principles of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, Berlin-New York, 1984), entweder durch einen schrittweisen Aufbau oder durch eine Segment-/Fragmentkondensierung, (2) die „Flüssigphasen"-Strategie, bei welcher lösliche Polymerträger wie lineares Polystyrol (Shemyakin et al., Tetrahedron Lett., 1965, 2323) und Polyethylenglykol (PEG) (Mutter und Bayer, Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 1974, 13, 88) eingesetzt werden, (3) zufällige Polymerisierung (Odian, „Principles of Polymerization", McGraw-Hill, New York, 1970), mit welcher Mischungen aus Peptiden oder PNA-Molekülen mit vielen unterschiedlichen Molekulargewichten („polydispers") gewonnen werden, und (4) eine Technik, die auf der Verwendung von Polymer-unterstützten Aminosäuren-aktiven Estern basiert (Fridkin et al., J. Am. Chem. Soc., 1965, 87, 4646), die auch manchmal als „inverse Merrifield-Synthese" oder „polymere Reagens-Synthese" bezeichnet wird. Darüber hinaus ist es vorstellbar, dass PNA-Moleküle auch enzymatisch durch Enzyme, wie bspw. Proteasen oder Derivaten davon, mit neuen Spezifitäten aufgebaut werden können (gewonnen bspw. durch künstliche Mittel, wie bspw. Protein-Gestaltung). Denkbar ist ferner die Entwicklung von „PNA-Ligasen" für die Kondensierung einer Anzahl von PNA-Fragmenten in sehr große PNA-Moleküle. Da darüber hinaus auch Antikörper gegen praktisch jedes Molekül von Interesse generiert werden können, sollten auch die kürzlich entwickelten katalytischen Antikörper (Abzyme) als potenzielle Kandidaten für den Aufbau von PNA-Molekülen in Betracht gezogen werden, die gleichzeitig von Tramontano et al., Science, 1986, 234, 1566 und Pollack et al., Science, 1986, 234, 1570 entdeckt wurden. Auf diese Weise hat es bereits bedeutende Erfolge bei der Produktion von Abzymen gegeben, die Acyl-Transfer-Reaktionen katalysieren (siehe Shokat et al., Nature, 1989, 338, 269, und die hierin zitierten Referenzen). Letztendlich können auch vollständig künstliche Enzyme für die PNA-Synthese entwickelt werden, wie kürzlich von Hahn et al., (Science, 1990, 248, 1544) berichtet wurde. Das Design von allgemein anwendbaren Enzymen, Ligasen und katalytischen Antikörpern, die dazu in der Lage sind, spezifische Bindungsreaktionen zu vermitteln, sollte leichter für die PNA-Synthese erreicht werden als für die „normale" Peptid-Synthese, da die PNA-Moleküle oftmals aus lediglich vier unterschiedlichen Aminosäuren zusammengesetzt sind (eines für jedes der vier nativen Nucleobasen).
Mögliche, in Frage kommende therapeutische und prophylaktische Ziele schließen das Herpes simplex-Virus (HSV) mit ein, das menschliche Papilloma-Virus (HPV), das menschliche Immunschwäche-Virus (HIV), Candida albicans, das Influenza-Virus, das Cytomegalo-Virus (CMV), interzelluläre Adhäsionsmoleküle (ICAM), 5-Lipoxygenase (5-LO), Phospholipase A₂ (PLA₂), Proteinkinase (PKC) und das ras-Onkogen. Die mögliche Behandlung solcher Ziele schließen Augen-, Lippen-, Genital- und systemische Infektionen mit Herpes simplex I und II mit ein; Genitalwarzen; Gebärmutterkrebs; gewöhnliche Warzen; Kaposi-Sarcome; AIDS; Haut- und systemische Pilzinfektionen; Grippe; Lungenentzündung; Netzhautentzündung und Lungenentzündung in immunsupprimierten Patienten; Mononucleose; Augen-, Haut- und systemi sche Entzündungen; Herz-Kreislauf-Erkrankungen; Krebs; Asthma; Psoriasis; Herz-Kreislauf-Kollaps; Herzinfarkt; Magen-Darm-Krankheiten; Nieren-Krankheiten; rheumatoide Arthritis; Osteoarthritis; akute Bauchspeicheldrüsenentzündung; septischer Schock; und Morbus Crohn.
Im Allgemeinen wird bei einer therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung einem Patienten, bei dem vermutet wird, dass er eine solche Therapie benötigt, eine Verbindung der vorliegenden Erfindung verabreicht, gewöhnlich in einem pharmazeutisch akzeptierbaren Träger, und zwar in Mengen und über einen Zeitraum hinweg, welche in Abhängigkeit von der Natur der jeweiligen Krankheit, deren Schwere und von dem Gesamtzustand des Patienten variieren werden. Die Peptidnucleinsäuren der vorliegenden Erfindung können in einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert werden, welche Träger, Verdickungsmittel, Verdünnungsmittel, Puffer, Konservierungsstoffe, oberflächenaktive Stoffe und Ähnliches mit einschließen können. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch einen oder mehrere aktive Inhaltsstoffe mit einschließen, wie bspw. antimikrobielle Wirkstoffe, entzündungshemmende Wirkstoffe, Anästhetika und Ähnliches, zusätzlich zu den Peptidnucleinsäuren.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann auf verschiedenen Wegen verabreicht werden, je nach dem, ob eine lokale oder systemische Behandlung erwünscht ist, und je nach zu behandelndem Gebiet. Die Verabreichung kann topisch sein (einschließlich ophthalmisch, vaginal, rektal, intranasal, transdermal), oral oder parenteral, bspw. durch eine intravenöse Tropfinfusion, eine subkutane, intraperitoneale oder intramuskuläre Injektion oder eine intrathecale oder intraventriculare Verabreichung.
Formulierungen für eine topische Verabreichung können transdermale Pflaster, Salben, Lotionen, Cremes, Gele, Tropfen, Zäpfchen, Sprays, Flüssigkeiten und Pulver mit einschließen. Herkömmliche pharmazeutische Träger, auf wässriger, pulverförmiger oder öliger Basis, Verdickungsmittel und Ähnliches können notwendig oder wünschenswert sein. Beschichtete Kondome, Handschuhe und Ähnliches können auch nützlich sein.
Zusammensetzungen für die orale Verabreichung schließen Pulver und Granulate, Suspensionen oder Lösungen in Wasser oder nicht-wässrigen Medien mit ein, Kapseln, Tütchen oder Tabletten. Verdickungsmittel, Geschmacksstoffe, Verdünnungsmittel, Emulgatoren, Dispergiersäuren oder Bindemittel können hinzugefügt werden.
Zusammensetzungen für die intrathecale oder intraventriculäre Verabreichung können sterile wässrige Lösungen mit einschließen, die darüber hinaus auch Puffer, Verdünnungsmittel und andere geeignete Additive enthalten können.
Formulierungen für die parenterale Verabreichung können sterile wässrige Lösungen mit einschließen, die darüber hinaus auch Puffer, Verdünnungsmittel und andere geeignete Additive enthalten können.
Die Dosierung ist von der Schwere und der Empfänglichkeit des zu behandelnden Zustandes abhängig, jedoch wird diese normalerweise eine oder mehrere Dosen pro Tag sein, wobei die Dauer der Behandlung von mehreren Tagen bis mehrere Monate dauern kann, oder bis eine Heilung bewirkt oder eine Verbesserung des Krankheitszustandes erreicht wird. Personen mit einem durchschnittlichen Können werden auf einfache Weise optimale Dosierungen, Verabreichungsverfahren und Wiederholungsraten bestimmen können.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorteilhafte Verwendung von PNA-Molekülen in der Festphasen-Biochemie (siehe „Solid Phase Biochemistry – Analytical and Synthetic Aspects", W. H. Scouten, Ed., John Wiley & Sons, New York, 1983), insbesondere Festphasen-Biosysteme, und insbesondere Bioassays oder Festphasen-Verfahren zur diagnostischen Detektion/Quantifizierung oder Affinitätsreinigung von komplementären Nucleinsäuren (siehe „Affinity Chromatography – A Practical Approach", P. D. G. Dean, W. S. Johnson und F. A. Middle, Eds., IRL Press Ltd., Oxford, 1986; „Nucleic Acid Hybridization – A Practical Approach", B. D. Harnes und S. J. Higgins, IRL Press Ltd., Oxford, 1987). Gegenwärtige Verfahren zur Durchführung solcher Bioassays oder Reinigungsverfahren setzen beinahe exklusiv „normale" oder leicht modifizierte Oligonucleotide ein, die entweder physisch adsorbiert oder über eine im Wesentlichen permanente kovalente Verankerungsbindung an Mikrosphären-Festträger gebunden sind, wie bspw. Cellulose, Glas-Kügelchen, einschließlich solcher mit kontrollierter Porosität (Mizutani et al., J. Chromatogr., 1986, 356, 202), „Sephadex", „Sepharose", Agarose, Polyacrylamid, poröse teilchenförmige Tonerde, Hydroxyalkylmethacrylatgele, Diol-gebundenes Silica, poröse Keramiken oder aneinander angrenzende Materialien, wie bspw. Filterscheiben aus Nylon und Nitrocellulose.
Alle oben genannten Verfahren sind im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung anwendbar. Jedoch ist – wenn möglich – das Verfahren der kovalenten Bindung gegenüber den physikali schen Adsorptionsverfahren bevorzugt, da der letztere Ansatz in das Auswaschen (Desorbierung) einiger der immobilisierten Moleküle während des Hybridisierungs- oder Affinitätsverfahrens resultieren kann. Die Ernsthaftigkeit dieses Problems wird selbstverständlich zum großen Maße von der Rate abhängen, bei welcher ein Gleichgewicht zwischen der adsorbierten und der „freien" Art etabliert wird. In bestimmten Fällen kann es praktisch unmöglich sein, ein quantitatives Assay mit einer akzeptierbaren Genauigkeit und/oder Reproduzierbarkeit durchzuführen. Die Verlustmenge der absorbierten Arten während der Behandlung des Trägers mit Körperflüssigkeiten, wässrigen Reagenzien oder mit Waschmedien wird im Allgemeinen bei Arten mit einem relativ niedrigen Molekulargewicht am ausgeprägtesten sein.
Im Gegensatz zu Oligonucleotiden sind PNA-Moleküle einfacher an feste Träger anzubringen, da sie starke nucleophile und/oder elektrophile Zentren besitzen. Darüber hinaus leidet ein direkter Aufbau von Oligonucleotiden an feste Träger an der extrem niedrigen Beladung des immobilisierten Moleküls (Beaucage und Caruthers, Tetrahedron Lett., 1981, 22, 1859; und Caruthers, Science, 1985, 232, 281). Darüber hinaus können nur relativ kurze Oligonucleotide gewonnen werden, da hierbei das alternative Phosphittriester-Verfahren eingesetzt wird (Letsinger und Mahadevan, J. Am. Chem. Soc., 1976, 98, 3655), das für feste Träger für eine hohe Oberflächen/Beladungskapazität geeignet ist.
Für eine konventionelle Festphasen-Peptidsynthese sind die letzteren Träger jedoch ausgezeichnete Materialien, um immobilisierte PNA-Moleküle aufzubauen. Dadurch wird ermöglicht, dass Seitenketten-Schutzgruppen von der synthetisierten PNA-Kette entfernt werden können, ohne die Verankerungsbindung spalten zu müssen, die die Kette an dem festen Träger hält. Ferner können sie in großen Mengen auf den festen Träger geladen werden, wodurch die Kapazität der festen Phasentechnik weiter gesteigert wird. Darüber hinaus können bestimmte Studienarten in Bezug auf die Verwendung von PNA in der Festphasen-Biochemie durchgeführt, erleichtert oder im großen Maßstab beschleunigt werden, und zwar durch Verwendung der kürzlich offenbarten Technologie der „Licht-ausgerichteten, räumlich adressierbaren, parallelen, chemischen Synthese" (Fodor et al., Science, 1991, 251, 767), die eine Technik darstellt, welche Festphasen-Chemie und Fotolithografie kombiniert, um Tausende von hoch unterschiedlichen, jedoch identifizierbaren, permanent immobilisierten Verbindungen (wie bspw. Peptide) im Wesentlichen simultan zu produzieren.
Synthese der Monomer-Untereinheiten
Die Monomer-Untereinheiten werden vorzugsweise durch das in 4 dargestellte allgemeine Schema synthetisiert. Dies beinhaltet die Herstellung von entweder dem Methyl- oder dem Ethylester von (BOC-Aminoethyl)glycin, und zwar durch ein Protektions-/Deprotektionsverfahren, wie in den Beispielen 20 bis 22 beschrieben. Die Synthese des Thymin-Monomers ist in den Beispielen 23 bis 24 beschrieben, und die Synthese des geschützten Cytosin-Monomers ist in Beispiel 25 beschrieben.
Bei der Synthese eines geschützten Adenin-Monomers ist die Alkylierung von Adenin mit Methylbromacetat (Beispiel 26) involviert, sowie die Verifizierung der Position der Substitution (d.h. an Position 9) durch Röntgenstrahlen-Kristallographie. Die N⁶-Aminogruppe wird anschließend durch die Verwendung des Reagens N-Ethyl-Benzyloxycarbonylimidazoltetrafluorborat (Beispiel 27) mit der Benzyloxycarbonyl-Gruppe geschützt. Eine einfache Hydrolyse des Esterproduktes (Beispiel 28) führte zu N⁶-Benzyloxycarbonyl-9-carboxymethyladenin, das im Standardverfahren eingesetzt wurde (Beispiele 29 bis 30). Das Adeninmonomer wurde in zwei unterschiedliche PNA-Oligomere eingebaut (Beispiele 52, 53, 56 und 57).
Zur Synthese des geschützten G-Monomers wurde das Ausgangsmaterial, nämlich 2-Amino-6-chlorpurin, mit Bromessigsäure (Beispiel 31) alkyliert und das Chloratom anschließend mit einer Benzyloxygruppe substituiert (Beispiel 32). Die resultierende Säure wurde mit dem Agens PyBrop^TM an den (BOC-Aminoethyl)glycinmethylester (aus Beispiel 22) gebunden, und der resultierende Ester hydrolysiert (Beispiel 33). Die O⁶-Benzylgruppe wurde im letzten HF-Spaltungsschritt bei der Synthese des PNA-Oligomers entfernt. Die Spaltung wurde mittels Massenspektrum des End-PNA-Oligomers verifiziert, und zwar nach Einbau in das PNA-Oligomer unter Verwendung von Diisopropylcarbodiimid als Kondensationsagens (Beispiele 51 und 56).
Zusätzliche Aufgaben, Vorteile und neue Merkmale der vorliegenden Erfindung werden den Fachleuten nach Durchsehen der nachstehenden Beispiele klar werden, die nicht begrenzend sein sollen.
Allgemeine Bemerkungen
Die folgenden Abkürzungen werden in den experimentellen Beispielen verwendet: DMF, N,N-Dimethylformamid; Tyr, Tyrosin; Lys, Lysin; DCC, N,N-Dicyclohexylcarbodiimid; DCU, N,N-Dicyclohexylharnstoff; THF, Tetrahydrofuran; aeg, N-Acetyl(2'-aminoethyl)glycin; Pfp, Pentafluorphenyl; BOC, t-Butoxycarbonyl; Z, Benzyloxycarbonyl; NMR, kernmagnetische Resonanz (nuclear magnetic resonance); s, Singulett; d, Dublett; dd, Dublett eines Dubletts; t, Triplett; q, Quartett; m, Multiplett; b, breit; δ, chemische Verschiebung; ppm, Teile auf eine Million (chemische Verschiebung.).
NMR-Spektren wurden entweder auf einem JEOL FX 90Q-Spektrometer oder einem Bruker 250 mHz mit Tretramethylsilane als internem Standard aufgezeichnet. Die Massenspektroskopie wurde auf einem MassLab VG 12–250 Quadropol-Instrument, ausgerüstet mit einer VG FAB-Quelle und -Sonde ausgeführt. Die Schmelzpunkte wurden auf einem Buchi-Schmelzpunkt-Apparat aufgezeichnet und stellen unkorrigierte Daten dar. N,N-Dimethylformamid wurde über 4-Å-Molekularsieben getrocknet, destilliert und über 4-Å-Molekularsieben gelagert. Pyridin (HPLC-Qualität) wurde getrocknet und über 4-Å-Molekularsieben gelagert. Andere verwendete Lösungsmittel wurden entweder in der höchstmöglichen Qualität eingesetzt oder wurden vor ihrem Einsatz destilliert. Dioxan wurde vor dessen Einsatz durch basische Tonerde hindurchgeleitet. BOC-Anhydrid, 4-Nitrophenol, Methylbromacetat, Benzyloxycarbonylchlorid und Pentafluorphenol wurden sämtlich von Aldrich Chemical Company käuflich erworben. Thymin, Cytosin und Adenin wurden von Sigma erworben.
Dünnschichtchromatographie (tlc) wurde unter Verwendung der folgenden Lösungsmittelsysteme durchgeführt: (1) Chloro form:Triethylamin:Methanol, 7:1:2; (2) Methylenchlorid:Methanol, 9:1; (3) Chloroform:Methanol:Essigsäure, 85:10:5. Die Punkte wurden durch UV-Licht (254 nm) sichtbar gemacht und/oder durch Besprühen mit einer Ninhydrin-Lösung (3 g Ninhydrin in 1000 ml 1-Butanol und 30 ml Essigsäure), nach Erhitzen bei 120°C für 5 Minuten und, nach einem Besprühen, wiederholtem Erhitzen.
BEISPIEL 1
Synthese von tert-Butyl-4-nitrophenylcarbonat.
Natriumcarbonat (29,14 g, 0,275 mol) und 4-Nitrophenol (12,75 g, 91,6 mmol) wurden mit Dioxan (250 ml) gemischt. BOC-Anhydrid (2 g, 91,6 mmol) wurde mit Dioxan (50 ml) zu der Mischung hinzugefügt. Die Mischung wurde unter Rückflusskühlung für 1 h erhitzt, auf 0°C abgekühlt, gefiltert und auf ein Drittel des Volumens konzentriert, und anschließend in Wasser (350 ml) bei 0°C gegeben. Nach Rühren für 0,5 h wurde das Produkt mittels Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen und anschließend über Sicapent im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 21,3 g (97 %). Schmelzpunkt: 73,0–74,5°C (Literatur 78,5–79,5°C). Analyse für C₁₁H₁₃NO₅, festgestellt (berechnet) C: 55,20(55,23), H: 5,61(5,48), N: 5,82(5,85).
BEISPIEL 2
Synthese von (N'-BOC-2'-Aminoethyl)glycin (2).
Die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde durch eine Modifizierung des Verfahrens von Heimer et al., (Int. J. Pept., 1984, 23, 203-211) hergestellt. N-(2-Aminoethyl)glycin (1,3 g, 25,4 mmol) wurde in Wasser (50 ml) gelöst, Dioxan (50 ml) wurde hinzugefügt und der pH-Wert mit 2 N Natriumhydroxid auf 11,2 angepasst. tert-Butyl-4-nitrophenylcarbonat (7,29 g, 30,5 mmol) wurde in Dioxan (40 ml) aufgelöst und über einen Zeitraum von 2 h tropfenweise hinzugefügt, wobei während dieser Zeit der pH-Wert mit 2 N Natriumhydroxid bei 11,2 aufrechterhalten wurde. Der pH-Wert wurde über drei weitere Stunden regelmäßig auf 11,2 angepasst und anschließend wurde die Lösung über Nacht stehen gelassen. Die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und der pH-Wert vorsichtig mit 0,5 M Salzsäure auf 3,5 angepasst. Die wässrige Lösung wurde mit Chloroform (3 × 200 ml) gewaschen, der pH-Wert mit 2 N Natriumhydroxid auf 9,5 angepasst und die Lösung im Vakuum (14 mm Hg) zur Trockenheit verdampft. Der Rest wurde mit DMF (25 + 2 × 10 ml) extrahiert und die Extrakte gefiltert, um überschüssiges Salz zu entfernen. Dies ergab eine Lösung der in der Überschrift angegebenen Verbindung mit ungefähr 60 % Ausbeute und mit einer Reinheit von mehr als 95 %, wie durch tlc ermittelt wurde (System 1 und mit Ninhydrin sichtbar gemacht, R_f = 0,3). Die Lösung wurde für die folgenden Herstellungsverfahren von BOC-aeg-Derivaten ohne weitere Reinigung eingesetzt.
BEISPIEL 3
Synthese von N¹-Carboxymethylthymin (4).
Dieses Verfahren unterscheidet sich von der in der Literatur angegebenen Synthese, es ist jedoch einfacher, erzielt höhere Ausbeuten und hinterlässt im Produkt kein unreagiertes Thymin. Zu einer Suspension von Thymin (3,40 g, 0,317 mol) und Kaliumcarbonat (87,7 g, 0,634 mmol) in DMF (900 ml) wurde Methylbromacetat (30 ml, 0,317 mmol) hinzugefügt. Die Mischung wurde über Nacht unter Stickstoff stark gerührt. Anschließend wurde die Mischung gefiltert und unter Vakuum zur Trockenheit verdampft. Der feste Rest wurde mit Wasser (300 ml) und 4 N Salzsäure (12 ml) behandelt, für 15 Minuten bei 0°C gerührt, gefiltert und mit Wasser (2 × 75 ml) gewaschen. Das Präzipitat wurde mit Wasser (120 ml) und 2 N Natriumhydroxid (60 ml) behandelt, und 10 Minuten durch Rückflusskühlung erhitzt. Die Mischung wurde auf 0°C abgekühlt, filtriert und die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde durch Hinzufügen von 4 N Salzsäure (70 ml) ausgefällt. Die Ausbeute nach einer Trocknung im Vakuum, über Sicapent, betrug 37,1 g (64 %). ¹H-NMR: (90 MHz; DMSO-d₆): 11,33 ppm (s, 1H, NH); 7,49 (d, J = 0,92 Hz, 1H, ArH); 4,38 (s, 2H, CH ₂); 1,76 (d, J = 0,92 Hz, T-CH ₃).
BEISPIEL 4
Synthese von N¹-Carboxymethylthyminpentafluorphenylester (5).
N¹-Carboxymethylthymin (4, 10 g, 54,3 mmol) und Pentafluorphenol (10 g, 54,3 mmol) wurden in DMF (100 ml) gelöst und in Eiswasser auf 5°C abgekühlt. DCC (13,45 g, 65,2 mmol) wurden hinzugefügt. Sobald die Temperatur unterhalb 5°C gesunken war, wurde das Eisbad entfernt und die Mischung für 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Das ausgefällte DCU wurde durch Filtration entfernt und zweimal mit DMF (2 × 10 ml) gewaschen. Das kombinierte Filtrat wurde in Ether (1400 ml) gegeben und auf 0°C gekühlt. Petrolether (1400 ml) wurde hinzugefügt und die Mischung über Nacht stehen gelassen. Die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde durch Filtration isoliert und gründlich mit Petrolether gewaschen. Ausbeute: 14,8 g (78 %). Das Produkt war rein genug, um den nächsten Reaktionsschritt auszuführen, jedoch wurde eine analytische Probe durch Umkristallisierung aus 2-Propanol erhalten. Schmelzpunkt 200,5–206°C; Analyse für C₁₃H₇F₅N₂O₄, festgestellt (berechnet): C: 44,79(44,59); H: 2,14(2,01) N: 8,13(8,00). FAB-MS: 443 (M+1+Glycerol), 351 (M+1). ¹H-NMR (90 MHz; DNSO-d₆): 11,52 ppm (s, 1H, NH); 7,64 (s, 1H, ArH); 4,99 (s, 2H, CH ₂); 1,76 (s, 3H, CH ₃).
BEISPIEL 5
Synthese von 1-(BOC-aeg)Thymin (6).
Zu einer DMF-Lösung des Produkts aus Beispiel 2 wurde Triethylamin (7,08 ml, 50,8 mmol) hinzugefügt, gefolgt von N¹-Carboxymethylthyminpentafluorphenylester (5, 4,45 g, 12,7 mmol). Die resultierende Lösung wurde für 1 h gerührt. Die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und mit einem Kationenaustauschermaterial („Dowex 50W X-8", 40 g) 20 Minuten lang behandelt. Das Kationenaustauschermaterial wurde durch Filtration entfernt, mit Dichlormethan (2 × 15 ml) gewaschen, und anschließend Dichlormethan (150 ml) hinzugefügt. Die resultierende Lösung wurde mit gesättigtem Natriumchlorid gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockenheit verdampft, zunächst mit einer Wasserstrahlpumpe und anschließend durch eine Ölpumpe. Der Rest wurde mit Wasser (50 ml) ausgeschüttelt und zur Trockenheit verdampft. Dieses Verfahren wurde wiederholt ausgeführt. Der Rest wurde anschließend in Methanol (75 ml) gelöst und in Ether (600 ml) und Petrolether (1400 ml) gegeben. Nach einem Rühren über Nacht wurde der weiße Feststoff durch Filtration isoliert und mit Petrolether gewaschen. Die Trocknung über Sicapent im Vakuum erzielte 3,50 g (71,7 %) der in der Überschrift angegebenen Verbindung. Schmelzpunkt: 142–147°C. Analyse für C₁₆H₂₄N₄O₇, festgestellt (berechnet): C: 49,59(50,00) H: 6,34(6,29), N: 14,58(14,58), ¹H-NMR (250 MHz, DMSO-d₆): auf Grund der beschränkten Rotation um die zweite Amidbindung waren einige der Signale im Verhältnis 2:1 verdoppelt (in der Liste durch gr. für größer und kl. für kleiner angedeutet): 12,73 ppm (b, 1H, CO₂H); 11,27 ppm (s, gr., Imid); 11,25 ppm (s, kl., Imid); 7,30 ppm (s, gr., ArH); 7,26 ppm (s, kl., ArH); 6,92 ppm (unres. t, gr., BOC-NH); 6,73 ppm (nicht-gel. t; kl., BOC-NH); 4,64 ppm (s, gr., T-CH₂-CO-); 4,47 ppm (s, kl., T-CH₂-CO-); 4,19 ppm (s, kl., CONRCH ₂CO₂H); 3,97 ppm (s, gr., CONRCH ₂CO₂H); 3,41-2,89 ppm (nicht-gel. m, -CH₂CH₂- und Wasser); 1,75 ppm (s, 3H, T-CH₃); 1,38 ppm (s, 9H, t-Bu). ¹³C-NMR: 170,68 ppm (CO); 170,34 (CO); 167,47 (CO); 167,08 (CO); 164,29 (CO); 150,9 (C5''); 141,92 (C6''); 108,04 (C2'); 77,95 und 77,68 (Thy-CH ₂CO); 48,96, 47,45 und 46,70 (-CH₂ CH₂- und NCH ₂CO₂H); 37,98 (Thy-CH ₃); 28,07 (t-Bu). FAB-MS: 407 (M+Na⁺); 385 (M+H⁺).
BEISPIEL 6
Synthese von 1-(BOC-aeg)Thyminpentafluorphenylester (7, BOC-Taeg.OPfp).
1-(BOC-aeg)Thymin (6) (2 g, 5,20 mmol) wurde in DMF (5 ml) gelöst und Methylenchlorid (15 ml) wurde hinzugefügt. Pentafluorphenol (1,05 g, 5,72 mmol) wurde hinzugefügt und die Lösung auf 0°C in einem Eisbad abgekühlt. Anschließend wurde DDC hinzugefügt (1,29 g, 6,24 mmol) und das Eisbad wurde nach 2 Minuten entfernt. Nach einem dreistündigen Rühren bei Raumtempera tur wurde das ausgefällte DCU durch Filtern entfernt und mit Methylenchlorid gewaschen. Die kombinierten Filtrate wurden zweimal mit wässrigem Natriumhydrogencarbonat und einmal mit gesättigtem Natriumchlorid gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockenheit verdampft. Der feste Rest wurde in Dioxan (150 ml) gelöst und zu Wasser (200 ml) bei 0°C hinzu gegeben. Die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde durch Filtrierung isoliert, mit Wasser gewaschen und über Sicapent im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 2,20 g (77 %). Durch Umkristallisierung aus 2-Propanol wurde eine analytische Probe gewonnen. Schmelzpunkt 174–175,5°C. Analyse für C₂₂H₂₃N₄O₇F₅ festgestellt (berechnet): C: 48,22(48,01); H 4,64(4,21); N: 9,67(10,18). ¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃): auf Grund der beschränkten Rotation um die sekundäre Amidbindung waren einige der Signale im Verhältnis 6:1 verdoppelt (in der Liste durch gr. für größer und kl. für kleiner angedeutet): 7,01 ppm (s, kl., ArH); 6,99 ppm (s, gr., ArH); 5,27 ppm (nicht-gel. t, BOC-NH); 4,67 ppm (s, gr., T-CH₂-CO-); 4,60 ppm (s, kl., T-CH₂-CO-); 4,45 ppm (s. gr., CONRCH ₂CO₂Pfp); 4,42 ppm (s., kl., CONRCH ₂CO₂Pfp); 3,64 ppm (t, 2H, BOC-NHCH₂CH ₂-); 3,87 ppm („q", 2H, BOC-NHCH₂CH ₂-); 1,44 (s, 9H, t-Bu). FAB-MS: 551 (10; M+1; 495 (10; M+1-tBu); 451 (80; -BOC).
BEISPIEL 7
Synthese von N⁴-Benzyloxycarbonylcytosin (9).
Zu einer Suspension von Cytosin (8, 20 g, 0,18 mol) in Trockenpyridin (1000 ml) wurde über einen Zeitraum von ungefähr 1 h Benzyloxycarbonylchlorid (52 ml, 0,36 mol) tropfenweise bei 0°C hinzugefügt, und zwar unter Stickstoffbedingungen in Gerä ten, die im Trockenschrank getrocknet wurden. Die Lösung wurde über Nacht gerührt und anschließend die Pyridinsuspension im Vakuum zur Trockenheit verdampft. Anschließend wurden Wasser (200 ml) und 4 N Salzsäure hinzugefügt, um einen pH-Wert von ~1 einzustellen. Das resultierende weiße Präzipitat wurde abgefiltert, mit Wasser gewaschen und durch Saugluft teilweise getrocknet. Das feuchte Präzipitat wurde unter Rückflusskühlung mit absolutem Ethanol (500 ml) 10 Minuten lang erhitzt, auf 0°C abgekühlt, filtriert und gründlich mit Ether gewaschen, sowie anschließend im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 24,7 g (54 %). Schmelzpunkt > 250°C. Analyse für C₁₂H₁₁N₃O₃ festgestellt (berechnet); C: 58,59(58,77); H: 4,55(4,52); N: 17,17(17,13). Da es nicht möglich war, das Produkt zu lösen, wurden keine NMR-Spektren aufgezeichnet.
BEISPIEL 8
Synthese von N⁴-Benzyloxycarbonyl-N¹-carboxymethylcytosin (10).
Methylbromacetat (7,82 ml, 82,6 mmol) und eine Suspension aus N⁴-Benzyloxycarbonylcytosin (9,21 g, 82,6 mmol) und Kaliumcarbonat (11,4 g, 82,6 mmol) in trockenem DMF (900 ml) wurden in einen dreihalsigen Rundkolben gegeben, unter mechanischem Rühren und einem Stickstoffeinlass. Die Mischung wurde über Nacht stark gerührt, filtriert und unter Vakuum zur Trockenheit verdampft. Anschließend wurden Wasser (300 ml) und 4 N Salzsäure (10 ml) hinzugefügt, die Mischung für 15 Minuten bei 0°C gerührt, gefiltert und mit Wasser (2 × 75 ml) gewaschen. Das isolierte Präzipitat wurde mit Wasser (120 ml), 2 N Natriumhydroxid (60 ml) behandelt, 30 Minuten lang gerührt, gefiltert und auf 0°C abgekühlt, sowie anschließend 4 N Salzsäure (35 ml) hinzugefügt. Die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde durch Filtration isoliert, gründlich mit Wasser gewaschen und aus Methanol (1000 ml) umkristallisiert und gründlich mit Ether gewaschen. Dies erzielte 7,70 g (31 %) der reinen, in der Überschrift angegebenen Verbindung. Die Stammflüssigkeit aus der Umkristallisierung wurde auf ein Volumen von 200 ml reduziert und auf 0°C abgekühlt. Dies ergab weitere 2,30 g Material, das gemäß tlc rein war, jedoch eine rötliche Farbe hatte. Schmelzpunkt 266–274°C. Analyse für C₁₄H₁₃N₃O₅ festgestellt (berechnet) C: 55,41(55,45); H: 4,23(4,32); N: 14,04(13,86). ¹H-NMR (90 MHz; DMSO-d₆): 8,02 ppm (d, J = 7,32 Hz, 1H, H-6); 7,39 (s, 5H, Ph); 7,01 (d, J = 7,32 Hz, 1H, H-5); 5,19 (s, 2H PhCH ₂-); 4,52 (s, 2H).
BEISPIEL 9
Synthese von N⁴-Benzyloxycarbonyl-N¹-carboxymethyl-cytosinpentafluorphenylester (11).
N⁴-Benzyloxycarbonyl-N¹-carboxymethyl-cytosin (10, 4 g, 13,2 mmol) und Pentafluorphenol (2,67 g, 14,5 mmol) wurden mit DMF (70 ml) gemischt, auf 0°C mit Eiswasser abgekühlt, sowie DCC (3,27 g, 15,8 mmol) hinzugefügt. Das Eisbad wurde nach 3 Minuten entfernt und die Mischung für 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Das ausgefällte DCU wurde durch Filtrierung entfernt, mit DMF gewaschen und das Filtrat unter Vakuum (0,2 mm Hg) zur Trockenheit verdampft. Der feste Rest wurde mit Methylenchlorid (250 ml) behandelt, 15 Minuten lang stark gerührt, filtriert, zweimal mit verdünntem Natriumhydrogencarbonat und einmal mit gesättigtem Natriumchlorid gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockenheit verdampft. Der feste Rest wurde aus 2-Propanol (150 ml) umkristallisiert und die Kristalle wurden gründlich mit Ether gewaschen. Ausbeute 3,40 g (55 %). Schmelzpunkt 241–245 °C. Analyse für C₂₀H₁₂N₃F₅O₅. Festgestellt (berechnet): C: 51,56(51,18); H: 2,77(2,58); N: 9,24(8,95). ¹H-NMR (90 MHz; CDCl₃): 7,66 ppm (d, J = 7,63 Hz, 1H, H-6); 7,37 (s, 5H, Ph); 7,31 (d, J = 7,63 Hz, 1H, H-5); 5,21 (s, 2H, PhCH ₂-); 4,97 (s, 2H, NCH ₂-). FAB-MS: 470 (M+1).
BEISPIEL 10
Synthese von N⁴-Benzyloxycarbonyl-1-BOC-aeg-cytosin (12).
Zu einer Lösung von (N-BOC-2-Aminoethyl)glycin (2) in DMF, wie oben beschrieben hergestellt, wurden Triethylamin (7 ml, 50,8 mmol) und N⁴-Benzyloxycarbonyl-N¹-carboxymethyl-cytosinpentafluorphenylester (11, 2,7 g, 5,75 mmol) hinzugefügt. Nach Rühren der Lösung für 1 h bei Raumtemperatur wurden Methylenchlorid (150 ml), gesättigtes Natriumchlorid (250 ml) und 4 N Salzsäure zur Einstellung des pH-Werts auf ~1 hinzugefügt. Die organische Schicht wurde abgetrennt und zweimal mit gesättigtem Natriumchlorid gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockenheit verdampft, zunächst mit einer Wasserstrahlpumpe und anschließend mit einer Ölpumpe. Der ölige Rest wurde mit Wasser (25 ml) behandelt und wiederum unter Vakuum zur Trockenheit verdampft. Dieses Vorgehen wurde anschließend wiederholt. Der ölige Rest (2,8 g) wurde dann in Methylenchlorid (100 ml) gelöst, Petrolether (250 ml) hinzugefügt und die Mischung über Nacht gerührt. Die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde durch Filtrieren isoliert und mit Petrolether gewaschen. Tlc (System 1) zeigte beträchtliche Mengen an Pentafluorphenol, jedoch wurde kein Versuch unternommen, es zu entfernen. Ausbeute 1,72 g (59 %). Schmelzpunkt 156°C (zers.). ¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃): Auf Grund der beschränkten Rotation um die sekundäre Amidbindung waren einige der Signale im Verhältnis 2 : 1 verdoppelt (in der Liste durch gr. für größer und kl. für kleiner angegeben): 7,88 ppm (dd, 1H, H-6); 7,39 (m, 5H, Ph); 7,00 (dd, 1H, H-5); 6,92 (b, 1H, BOC-NH); 6,74 (b, 1H, ZNH)-?; 5,19 (s, 2H, Ph-CH ₃); 4,81 ppm (s, gr., Cyt-CH₂-CO-); 4,62 ppm (s, kl., Cyt-CH₂-CO-); 4,23 (s, kl., CONRCH ₂CO₂H); 3,98 ppm (s, gr., CONRCH ₂CO₂H); 3,42-3,02 (nicht-gel, m, -CH₂CH₂- und Wasser); 1,37 (s, 9H, t-Bu). FAB-MS (M+1); 448 (M+1-t-Bu).
BEISPIEL 11
Synthese von N⁴-Benzyloxycarbonyl-1-BOC-aeg-cytosinpentafluorphenylester (13).
N⁴-Benzyloxycarbonyl-1-BOC-aeg-cytosin (12, 1,5 g, 2,98 mmol) und Pentafluorphenol (548 mg, 2,98 mmol) wurden in DMF (10 ml) gelöst. Anschließend wurde Methylenchlorid (10 ml) hinzugefügt, die Reaktionsmischung auf 0°C in einem Eisbad abgekühlt und DCC (676 mg, 3,28 mmol) hinzugefügt. Das Eisbad wurde nach 3 Minuten entfernt und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 3 h lang gerührt. Das Präzipitat wurde durch Filtrierung isoliert und einmal mit Methylenchlorid gewaschen. Anschließend wurde das Präzipitat in kochendem Dioxan (150 ml) gelöst und die Lösung auf 15°C abgekühlt, wodurch DCU ausfiel. Das ausgefällte DCU wurde durch Filtrierung entfernt und das resultierende Filtrat zu Wasser (250 ml) bei 0°C hinzugefügt. Die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde durch Filtrierung isoliert, mit Wasser gewaschen und unter Vakuum über Sicapent getrocknet. Ausbeute 1,30 g (65 %). Analyse für C₂₉H₂₈N₅O₈F₅. Festgestellt (berechnet): C: 52,63(52,02); H: 4,41(4,22); N: 10,55(10,46). ¹H-NMR (250 MHz; DMSO-d₆): zeigte im Wesentlichen das Spektrum der oben angegebenen Säure, was wahrscheinlich auf die Hydrolyse des Esters zurückzuführen war. FAB-MS: 670 (M+1); 614 (M+1-t-Bu).
BEISPIEL 12
Synthese von 4-Chlorcarboxy-9-chloracridin.
4-Carboxyacridon (6,25 g, 26,1 mmol), Thionylchlorid (25 ml) und 4 Tropfen DMF wurden vorsichtig unter Stickstofffluss erhitzt, bis sich sämtliches feste Material gelöst hatte. Anschließend wurde die Lösung unter Rückflusskühlung 40 Minuten lang erhitzt. Die Lösung wurde abgekühlt und das überschüssige Thionylchlorid wurde unter Vakuum entfernt. Die letzten Spuren an Thionylchlorid wurden durch zweimaliges Co-Verdampfen mit trockenem Benzol (getrocknet über Na-Pb) entfernt. Das verbleibende gelbliche Pulver wurde in der nächsten Reaktion direkt eingesetzt.
BEISPIEL 13
Synthese von 4-(5-Methoxycarbonylpentylamidocarbonyl)-9-chloracridin.
Methyl 6-Aminohexanoathydrochlorid (4,7 g, 25,9 mmol) wurde in Methylenchlorid (90 ml) gelöst, auf 0°C abgekühlt, anschließend Triethylamin (15 ml) hinzugefügt und die resultierende Lösung wurde anschließend sofort zu dem Säurechlorid aus Beispiel 12 hinzugefügt. Die Rundkolbenflasche mit dem Säure chlorid wurde auf 0°C in einem Eisbad gekühlt. Die Mischung wurde 30 Minuten lang bei 0°C und anschließend für 3 h bei Raumtemperatur stark gerührt. Die resultierende Mischung wurde filtriert, um die verbleibenden Feststoffe zu entfernen, die mit Methylenchlorid (20 ml) gewaschen wurden. Das rötlich-braune Methylenchlorid-Filtrat wurde anschließend zweimal mit gesättigtem Natriumhydrogencarbonat und einmal mit gesättigtem Natriumchlorid gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockenheit verdampft. Zu dem resultierenden öligen Rest wurde trockenes Benzol (35 ml) und Ligroin (60–80°C, getrocknet über Na-Pb) hinzugefügt. Die Mischung wurde anschließend unter Rückflusskühlung erhitzt. Aktivierter Kohlenstoff und Celit wurden hinzugefügt und die Mischung für 3 Minuten unter Rückflusskühlung erhitzt. Nach Filtrierung kristallisierte die in der Überschrift angegebene Verbindung nach Kühlen unter magnetischem Rühren aus. Sie wurde durch Filtrierung isoliert und mit Petrolether gewaschen. Das Produkt wurde über festem Kaliumhydroxid gelagert. Ausbeute 5 g (50 %).
BEISPIEL 14
Synthese von 4-(5-Methoxycarbonylpentyl)amidocarbonyl-9-[6'-(4''-nitrobenzamido)-hexylamino]-aminoacridin.
4-(5-Methoxycarbonylpentylamidocarbonyl)-9-chloracridin (1,3 g, 3,38 mmol) und Phenol (5 g) wurden 30 Minuten lang bei 80°C unter einem Stickstofffluss erhitzt, wonach 6-(4'-Nitrobenzamido)-1-hexylamin (897 mg, 3,38 mmol) hinzugefügt wurden. Anschließend wurde die Temperatur auf 120°C 2h lang erhöht. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt und Methylenchlorid (80 ml) hinzugefügt. Die resultierende Lösung wurde dreimal mit 2 N Natriumhydroxid (60-ml-Portionen) und einmal mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, und unter Vakuum zur Trockenheit verdampft. Das resultierende rote Öl (1,8 g) wurde in Methylenchlorid (40 ml) gelöst und auf 0°C abgekühlt. Ether (120 ml) wurde hinzugefügt und die resultierende Lösung über Nacht gerührt. Dies ergab eine Mischung aus festem Material und einem Öl. Der Feststoff wurde durch Filtrierung isoliert. Der Feststoff und das Öl wurden in Methylenchlorid (80 ml) wieder gelöst und tropfenweise zu kaltem Ether (150 ml) hinzugefügt. Nach 20 Minuten Rühren wurde die in der Überschrift angegebene Verbindung durch Filtrierung als orangefarbene Kristalle isoliert. Das Produkt wurde mit Ether gewaschen und unter Vakuum über Kaliumhydroxid getrocknet. Ausbeute 1,6 g (77 %). Schmelzpunkt 145–147°C.
BEISPIEL 15
Synthese von 4-(5-Carboxypentyl)amidocarbonyl-9-[6'-(4''-nitrobenzamido)-hexylamino]-aminoacridin.
4-(5-Methoxycarbonylpentyl)amidocarbonyl-9-[6'-(4''-nitrobenzamido)-hexylamino]-aminoacridin (503 mg, 0,82 mmol) wurde in DMF (30 ml) gelöst und 2 N Natriumhydroxid (30 ml) hinzugefügt. Nach 15-minütigem Rühren wurden 2 N Salzsäure (35 ml) und Wasser (50 ml) bei 0°C hinzugefügt. Nach 30-minütigem Rühren wurde die Lösung abgegossen, wodurch eine ölige Substanz zurückblieb, die in kochendem Methanol (150 ml) gelöst, gefiltert und auf ein Drittel des Volumens konzentriert wurde. Zu der Methanollösung wurden Ether (125 ml) und 5 bis 6 Tropfen HCl in Ethanol hinzugefügt. Die Lösung wurde nach 1 h Rühren bei 0°C abgegossen. Die ölige Substanz wurde in Methanol (25 ml) wieder gelöst und mit Ether ausgefällt (150 ml). Nach Rühren über Nacht wurde die in der Überschrift angegebene Verbindung als gelbe Kristalle isoliert. Ausbeute: 417 mg (80 %). Schmelzpunkt 173°C (zers.).
BEISPIEL 16
(a) Synthese von 4-(5-Pentafluorphenyloxycarbonylpentyl)-amidocarbonyl-9-[6'-(4''-nitrobenzamido)-hexylamino]-aminoacridin (Acr¹OPfp).
Die Säure aus Beispiel 15 (300 mg, 0,48 mmol) wurde in DMF (2 ml) gelöst und Methylenchlorid (8 ml) hinzugefügt. Pentafluorphenol (97 mg, 0,53 mmol) – mit 2 × 2 ml der Methylenchloridlösung transferiert – wurde hinzugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf 0°C abgekühlt, wonach DCC (124 mg, 0,6 mmol) hinzugefügt wurde. Das Eisbad wurde nach 5 Minuten entfernt und die Mischung über Nacht gerührt. Das ausgefällte DCU wurde durch Zentrifugierung entfernt und das Zentrifugat unter Vakuum zur Trockenheit verdampft, zuerst über eine Wasserstrahlpumpe und anschließend durch eine Ölpumpe. Der Rest wurde in Methylenchlorid (20 ml) gelöst, filtriert und unter Vakuum zur Trockenheit verdampft. Der Rest wurde wiederum in Methylenchlorid und Petrolether (150 ml) gelöst. Ein 1-ml-Anteil von 5 M HCl in Ether wurde hinzugefügt. Das Lösungsmittel wurde nach 30-minütigem Rühren bei 0°C durch Abgießen entfernt. Die restliche ölige Substanz wurde in Methylenchlorid (100 ml) aufgelöst. Anschließend wurde Petrolether (150 ml) hinzugefügt und die Mischung über Nacht gerührt. Das ausgefällte gelbe kristalline Material wurde durch Filtrierung isoliert und mit reichlichen Mengen an Petrolether gewaschen. Ausbeute (nach Trocknen): 300 mg (78 %). Schmelzpunkt 97,5°C (zers.). Sämtliche Proben zeigten eine ausreichende Elementaranalyse, ¹H- und ¹³C-NMR und Massenspektren.
(b) Experimentelles Verfahren zur Synthese von PNAs (3).
Materialien: BOC-Lys (ClZ), Benzhydrylamin-copoly(styrol-1%-divinylbenzol)-Harz (BHA-Harz) und p-Methylbenzhydrylamincopoly(styrol-1%-divinylbenzol)-Harz (MBHA-Harz) wurden von Peninsula Laboratories käuflich erworben. Andere Reagenzien und Lösungsmittel waren wie folgt: biologisch reine Trifluoressigsäure von Halocarbon Products; Diisopropylethylamin (99 %; wurde nicht weiter destilliert) und N-Acetylimidazol (98 %) von Aldrich; H₂O wurde zweimal destilliert; wasserfreies HF von Union Carbide; Synthese-reines N,N-Dimethylformamid und Analyse-reines Methylenchlorid (wurde nicht weiter destilliert) von Merck; HPLC-reines Acetonitril von Lab-Scan; purum-reines Anisol, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid und reinstes 2,2,2-Trifluorethanol von Fluka.
Allgemeine Verfahren und Bemerkungen
Außer wenn anders angegeben, wurde wie folgt vorgegangen. Die PNA-Verbindungen wurden mittels des schrittweisen Festphasen-Ansatzes (Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 2149) synthetisiert, wobei herkömmliche Peptid-Chemie unter Verwendung der TFA-labilen tert-Butyloxycarbonyl(BOC)-Gruppe zur „temporären" N-Protektion eingesetzt wurde (Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 1964, 86, 304) und die eher säurestabile Benzyloxycarbonyl(Z)- und 2-Chlorbenzyloxycarbonyl(ClZ)-Gruppen für einen „dauerhaften" Seitenkettenschutz. Um C-terminale Amide zu erhalten, wurden die PNAs an den HF-labilen BHA- oder MBHA-Harzen aufgebaut (das MBHA-Harz weist eine erhöhte Empfindlichkeit für die letzte HF-Spaltung gegenüber dem unsubstituierten BHA-Harz auf (Matsueda et al., Peptides, 1981, 2, 45)). Alle Reaktionen (außer den HF-Reaktionen) wurden in manuell gehandhabten, standardisierten Festphasen-Reaktionsgefäßen ausgeführt, die mit einer groben Glasfritte ausgestattet waren (Merrifield et al., Biochemistry, 1982, 21, 5020). Die quantitative Ninhydrin-Reaktion (Kaiser-Test), der ursprünglich von Sarin et al., (Anal. Biochem., 1981, 117, 147) für Peptide mit „normalen" Aminosäuren entwickelt wurde, wurde erfolgreich angewandt (siehe Tabelle I bis III), und zwar unter Verwendung des „normal" eingesetzten effektiven Extinktionskoeffizienten ε = 15000 M^–1cm^–1 für sämtliche Reste, um die Vollständigkeit der einzelnen Bindungen zu messen und um die Anzahl der wachsenden Peptidketten zu bestimmen. Die theoretische Substitution S_n–1 nach Verbindung des Rests mit der Nummer n (unter Annahme von sowohl einer vollständigen Deprotektion und Verbindung als auch unter Annahme, dass weder ein Kettenabbruch noch ein Verlust an PNA-Ketten während des Synthesezyklus stattgefunden hat) wird mit der folgenden Gleichung berechnet: Sn = Sn–1 × (1 + (Sn–1 × ΔMW × 10–3mmol/mol))–1 wobei ΔMW die Zunahme des Molekulargewichts ([ΔMW] = g/mol) und S_n–1 die theoretische Substitution nach Verbindung des vorhergehenden Restes n–1 ([S] = mmol/g) ist. Der geschätzte Wert (%) des Ausmaßes einer einzelnen Verbindung wird relativ zu der gemessenen Substitution bestimmt (außer wenn S nicht bestimmt wurde) und schließt die Korrektur für die Anzahl an verbleibenden freien Aminogruppen mit ein, welche auf den vorherigen Zyklus folgt. HF-Reaktionen wurden in einem Diaflon HF-Gerät von Toho Kasei (Osaka, Japan) durchgeführt. Vydac C₁₈ (5 μm, 0,46 × 25 cm und 5 μm, 1 × 25 cm) Umkehrphasensäulen wurden jeweils zur analytischen und semi-präparativen HPLC an einem SP8000-Instrument eingesetzt. Puffer A war 5 Vol.-% Acetonitril in Wasser mit 445 μl Trifluoressigsäure pro Liter, und Puffer B war 60 Vol.-% Acetonitril in Wasser mit 390 μl Trifluoressigsäure pro Liter. Der lineare Gradient betrug 0–100 % Puffer B über 30 Minuten hinweg, die Flussraten betrugen 1,2 ml/min (analytisch) und 5 ml/min (semi-präparativ). Die Eluate wurden bei 215 nm (analytisch) und 230 nm (semi-präparativ) beobachtet. Die Molekulargewichte der PNAs wurden mittels ²⁵²Cf-Plasma-Desorptions-Laufzeitmassenspektroskopie aus dem Mittelwert der am meisten vorliegenden Isotope bestimmt.
BEISPIEL 17
Festphasen-Synthese von Acr¹-[Taeg]₁₅-NH₂ und kürzerer Derivate.
(a) Schrittweiser Aufbau des BOC-[Taeg]₁₅-BHA-Harzes
Die Synthese wurde ausgehend von 100 mg vorgequollenem und neutralisiertem BHA-Harz begonnen (bestimmt durch die quantitative Ninhydrin-Reaktion, um 0,57 mmol NH₂/g zu enthalten), wobei Einzelverbindungen („Syntheseprotokoll 1") unter Verwendung von 3,2 Äquivalenten BOC-Taeg-OPfp in ungefähr 33 % DMF/CH₂Cl₂ eingesetzt wurden. Die einzelnen Verbindungsreaktionen wurden durch Schütteln über einen Zeitraum von mindestens 12 h in einem manuell gehandhabten 6-ml-standardisierten Festphasen-Reaktionsgefäß durchgeführt, wobei unreagierte Aminogruppen durch Acetylierung in bestimmten Stadien der Synthese blockiert wurden. Der Fortschritt der Kettenverlängerung wurde in mehreren Stadien durch die quantitative Ninhydrin-Reaktion beobachtet (siehe Tabelle I). Anteile an geschützten BOC-[Taeg]₅-BHA-, BOC-[Taeg]₁₀-BHA- und BOC-[Taeg]₁₅-BHA-Harzen wurden jeweils nach einem Aufbau von 5, 10 und 15 Resten entnommen.

ND

= Nicht bestimmt (Not Determined)

(b) Synthese von Acr¹-[Taeg]₁₅-BHA-Harz
Nach Deprotektion des restlichen BOC-[Taeg]₁₅-BHA-Harzes (geschätztes Trockengewicht ist ungefähr 30 mg, ~0,002 mmol wachsende Ketten) wurde das H-[Taeg]₁₅-BHA-Harz mit ungefähr 50 Äquivalenten (80 mg, 0,11 mmol) an Acr¹-OPfp in 1 ml von ungefähr 66 % DMF/CH₂Cl₂ (d.h. eine 0,11-M-Lösung des Pentafluorphenylesters) in einem 3-ml-Festphasen-Reaktionsgefäß reagiert. Nach Beurteilung durch quantitative Ninhydrin-Reaktion war die Bindung des Acridin-Anteils nahezu quantitativ.
(c) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]₅-NH₂
Ein Anteil des geschützten BOC-[Taeg]₅-BHA-Harzes wurde mit 50 % Trifluoressigsäure in Methylenchlorid behandelt, um die N-terminale BOC-Gruppe (die ein Vorläufer des möglicherweise schädigenden tert-Butylkations ist) vor der HF-Spaltung zu entfernen. Nach Neutralisieren und Waschen (auf ähnliche Art und Weise wie in den Schritten 2–4 im „Syntheseprotokoll 1" durchgeführt) sowie Trocknung für 2 h unter Vakuum, wurden die resultierenden 67,1 mg (Trockengewicht) des H-[Taeg]₅-BHA-Harzes mit 5 ml HF:Anisol (9:1, v/v) unter Rühren bei 0°C für 60 Minuten gespalten. Nach Entfernen des HF wurde der Rest mit trockenem Diethylether (4 × 15 ml, jeweils 15 Minuten) gerührt, um Anisol zu entfernen, mittels Schwerkraft durch einen Glasfilter mit Fritte gefiltert und getrocknet. Anschließend wurde die PNA in eine 60 ml (4 × 15 ml, jeweils 15-minütiges Rühren) 10 %ige wässrige Essigsäurelösung extrahiert. Anteile dieser Lösung wurden mittels analytischer Umkehrphasen-HPLC analysiert, um die Reinheit der Roh-PNA zu ermitteln. Das Maximum nach 13 Minuten entsprach ungefähr 93 % der Gesamtextinktion.
Die verbleibende Lösung wurde eingefroren und lyophilisiert, was ungefähr 22,9 mg des Rohmaterials ergab. Schließlich wurden 19 mg des Rohproduktes aus fünf Chargen, die jeweils 3,8 mg in 1 ml H₂O enthielten, gereinigt. Das Maximum wurde durch Verwendung einer semi-präparativen Umkehrphasensäule gesammelt. Acetonitril wurde über ein Geschwindigkeitsvakuum entfernt und die restliche Lösung eingefroren (Trockeneis) und nachfolgend lyophilisiert, wodurch 13,1 mg des > 99 % reinen H-[Taeg]₅-NH₂ gewonnen wurden. Das PNA-Molekül löste sich schnell in Wasser und besaß das korrekte Molekulargewicht, wie durch massenspektroskopische Bestimmung festgehalten wurde. Bezüglich (M+H)⁺ betrug der berechnete m/z-Wert 1349,3 und der gemessene m/z-Wert betrug 1347,8.
(d) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]₁₀-NH₂
Ein Anteil des geschützten BOC-[Taeg]₁₀-BHA-Harzes wurde, wie unter Abschnitt (c) beschrieben, behandelt, wodurch 11 mg des Rohmaterials nach HF-Spaltung von 18,9 mg trockenem H-[Taeg]₁₀-BHA-Harz gewonnen wurden. Das Maximum bei 15,5 Minuten entsprach ungefähr 53 % der Gesamtextinktion. Ca. 1 mg des Rohproduktes wurde wiederholt gereinigt (aus den nachstehend beschriebenen Gründen), wodurch ungefähr 0,1 mg des zumindest 80 %igen, jedoch vermutlich > 99 % reinen H-[Taeg]₁₀-NH₂ gewonnen wurden. Ein ziemlich breiter Schweif, der nach dem Zielmaximum eluierte und ungefähr 20 % der Gesamtextinktion entsprach, konnte auch nach wiederholter Reinigung nicht entfernt werden (lediglich leicht reduziert). Nach Beurteilung durch das Massenspektrum, welches lediglich das Vorliegen des H-[Taeg]₁₀-NH₂-Molekulargewichts bestätigte, wird das Schweifphänomen mehr oder weniger gut definierten Aggregations-/Konformations- Zuständen des Zielmoleküls zugeschrieben. Aus diesen Gründen enthält das Rohprodukt wahrscheinlich mehr als die oben erwähnten 53 % des Zielmoleküls. H-[Taeg]₁₀-NH₂ löste sich leicht in Wasser. Bezüglich (M+H)⁺ betrug der berechnete m/z-Wert 2679,6 und der gemessene m/z-Wert 2681,5.
(e) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]₁₅-NH₂
Ein Anteil des geschützten BOC-[Taeg]₁₅-BHA-Harzes wurde wie unter Abschnitt (c) behandelt, wodurch 3,2 mg des Rohmaterials nach HF-Spaltung von 13,9 mg trockenem H-[Taeg]₅-BHA-Harz gewonnen wurden. Das Maximum bei 22,6 Minuten lag in einer breiten Ausbuchtung, die ungefähr 60 % der Gesamtextinktion entsprach (12a). Diese Ausbuchtung wird wiederum (siehe vorherstehender Abschnitt) den Aggregations-/Konformations-Zuständen des Zielmoleküls H-[Taeg]₁₅-NH₂ zugeschrieben, da die Massenspektrenanalyse der gesammelten „Ausbuchtung" das Vorliegen anderer Moleküle nicht bedeutend aufdeckte. Das gesamte Rohprodukt wurde gereinigt, indem die „Ausbuchtung" gesammelt wurde, wodurch ungefähr 2,8 mg Material gewonnen wurden. Bezüglich (M+Na)⁺ betrug der berechnete m/z-Wert 4033,9 und der gemessene m/z-Wert 4032,9.
(f) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von Acr¹-[Taeg]₁₅-NH₂.
Ein Anteil des geschützten Acr¹-[Taeg]₁₅-BHA-Harzes wurde, wie unter Abschnitt (b) beschrieben, behandelt, wodurch 14,3 mg des Rohmaterials nach HF-Spaltung von 29,7 mg trockenem Acr¹[Taeg]₁₅-BHA-Harz gewonnen wurden. Insgesamt macht das Maximum bei 23,7 Minuten und ein „Dimer" (siehe unten) bei 29,2 Minuten ungefähr 40 % der Gesamtextinktion aus (12b). Das Rohprodukt wurde wiederholt gereinigt, wodurch ungefähr 1 mg von ungefähr > 99 % reinem Acr¹[Taeg]₁₅-NH₂ gewonnen wurde, „kontaminiert" mit selbst-aggregierenden Molekülen, die bei 27,4 Minuten und 29,2 Minuten eluierten, und schließlich eine sehr riesige Ausbuchtung, die mit 100 % Puffer B eluierte (12c). Diese Interpretation stimmt mit der Beobachtung überein, dass diese Maxima nach einem (stundenlangen) Stehenlassen in wässriger Essigsäurelösung wachsen, und schließlich quantitativ ausfällen. Bezüglich (M+H)⁺ betrug der berechnete m/z-Wert 4593,6 und der gemessene m/z-Wert 4588,7.
(g) Syntheseprotokoll 1
(1) BOC-Deprotektion mit TFA/CH₂Cl₂ (1:1, v/v), 3 ml, 3 × 1 Minute und 1 × 30 Minuten; (2) Waschen mit CH₂Cl₂, 3 ml, 6 × 1 Minute; (3) Neutralisieren mit DIEA/CH₂Cl₂ (1:19, v/v), 3 ml, 3 × 2 Minuten; (4) Waschen mit CH₂Cl₂, 3 ml, 6 × 1 Minute und Trockenlegen für 1 Minute; (5) eine 2–5 mg-Probe des PNA-Harzes kann entfernt und gründlich getrocknet werden, um mittels einer quantitativen Ninhydrin-Analyse die Substitution zu bestimmen; (6) Hinzufügen von 3,2 Äquivalenten (0,18 mmol, 100 mg) Boc-Taeg-OPfp, gelöst in 1 ml CH₂Cl₂, gefolgt durch Hinzufügen von 0,5 ml DMF (Endkonzentration von Pentafluorphenylester ~0,12 M); die Bindungsreaktion wurde fortgeführt für insgesamt 12 bis 24 h Schütteln bei Raumtemperatur; (7) Waschen mit DMF, 3 ml, 1 × 2 Minuten; (8) Waschen mit CH₂Cl₂, 3 ml, 4 × 1 Minute; (9) Neutralisieren mit DIEA/CH₂Cl₂ (1:19, v/v), 3 ml, 2 × 2 Minuten; (10) Waschen mit CH₂Cl₂, 3 ml, 6 × 1 Minute; (11) eine 2–5-mg-Probe des geschützten PNA-Harzes wird für einen schnellen qualitativen Ninhydrin-Test entnommen und weitere 2–5 mg werden gründlich getrocknet, um mittels quantitativer Ninhydrin-Analyse das Ausmaß der Bindung zu bestimmen (nach den Zyklen 7, 10 und 15 wurden unreagierte Aminogruppen durch Acetylierung mit N-Acetylimidazol in Methylenchlorid blockiert).
BEISPIEL 18
Festphasen-Synthese von ACR¹-[Taeg]₁₅-Lys-NH₂ und kürzeren Derivaten.
(a) Schrittweises Aufbauen des BOC-[Taeg]₁₅-Lys(ClZ)-BHA-Harzes
Die Synthese wurde durch ein quantitatives Laden (standardisiertes DCC in situ-Verbinden in sauerem CH₂Cl₂) von BOC-Lys(ClZ) auf 100 mg vorgequollener und neutralisiertem BHA-Harz (0,57 mmol NH₂/g) begonnen. Zur weiteren Extension der PNA-Kette wurden Einzelverbindungen eingesetzt („Syntheseprotokoll 2"), und zwar für die Zyklen 1 bis 5 und die Zyklen 10 bis 15, unter Verwendung von 3,2 Äquivalenten an BOC-Taeg-OPfp in ungefähr 33 % DMF/CH₂Cl₂. Bei den Zyklen 5 bis 10 wurde zusätzliches DCC-(d.h., in situ)-Verbinden der freien Säure BOC-Taeg-OH in ungefähr 33 % DMF/CH₂Cl₂ eingesetzt. Alle Bindungsreaktionen wurden durch Schütteln für mindestens 12 h in einem manuell betriebenen 6-ml-standardisierten Festphasen-Reaktionsgefäß durchgeführt. Unreagierte Aminogruppen wurden durch Acetylierung in denselben Stadien der Synthese blockiert, wie es in Beispiel 17 vorgenommen wurde. Anteile an geschütztem BOC-[Taeg]₅-Lys(ClZ)-BHA- und BOC-[Taeg]₁₀-Lys(ClZ)-BHA-Harzen wurden nach Zusammenfügen von 5 und 10 PNA-Resten jeweils entfernt. Wie durch das analytische HPLC-Chromatogramm des rohen Spaltungsprodukts aus dem BOC-[Taeg]₁₀-Lys(ClZ)-BHA-Harz be stimmt wurde (siehe Abschnitt (e)), erzielte eine zusätzliche „freie Säuren"-Verbindung der PNA-Reste 5 bis 10 eine bedeutende Verbesserung der Syntheseausbeute im Vergleich zu den durchgehend einzel-verbundenen Resten aus Beispiel 17.
(b) Synthese des Acr¹-[Taeg]₁₀-Lys(ClZ)-BHA-Harzes
Nach Deprotektion eines Teiles des BOC-[Taeg]₁₀-Lys(ClZ)-BHA-Harzes (geschätztes Trockengewicht ist ungefähr 90 mg, ~0,01 mmol wachsende Ketten) wurde das H-[Taeg]₁₅-BHA-Harz mit ungefähr 20 Äquivalenten (141 mg, 0,19 mmol) an Acr¹-OPfp in 1 ml von ungefähr 66 % DMF/CH₂Cl₂ in einem 3-ml-Festphasen-Reaktionsgefäß reagiert. Wie durch eine qualitative Ninhydrin-Reaktion festgestellt wurde, war die Verbindung des Acridin-Anteils nahezu quantitativ.
(c) Synthese des ACR¹[Taeg]₁₅-Lys(ClZ)-BHA-Harzes
Nach Deprotektion des restlichen BOC-[Taeg]₁₅-Lys(ClZ)-BHA-Harzes (geschätztes Trockengewicht ungefähr 70 mg, ~0,05 mmol wachsende Ketten) wurde das H-[Taeg]₁₅-Lys(ClZ)-BHA-Harz mit ungefähr 25 Äquivalenten (91 mg, 0,12 mmol) Acr¹-OPfp in 1 ml von ungefähr 66 % DMF/CH₂Cl₂ in einem 3-ml-Festphasen-Reaktionsgefäß reagiert. Wie durch qualitative Ninhydrin-Reaktion bestimmt wurde, war die Verbindung des Acridinanteils nahezu quantitativ.
(d) Spaltung, Reinigung und Identifizierung des H-[Taeg]₁₅-Lys-NH₂
Ein Anteil des geschützten BOC-[Taeg)₅-Lys(ClZ)-BHA-Harzes wurde, wie in Beispiel 17(c) beschrieben, behandelt, wodurch 8,9 mg des Rohmaterials nach HF-Spaltung von 19 mg trockenem H-[Taeg]₅-Lys(ClZ)-BHA-Harz gewonnen wurden. Das Maximum bei 12,2 Minuten (eluiert bei 14,2 Minuten, wenn es aus einer wässrigen Lösung anstelle der 10 %igen wässrigen Essigsäurelösung injiziert wurde) machte ca. 90 % der Gesamtextinktion aus. Ungefähr 2,2 mg des Rohproduktes wurden gereinigt, wodurch ungefähr 1,5 mg des 99 % reinen H-[Taeg]₅-Lys-NH₂ gewonnen wurden.
(e) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]₁₀-Lys-NH₂
Ein Anteil des geschützten BOC-[Taeg]₁₅-Lys(ClZ)-BHA-Harzes wurde wie in Beispiel 17(c) behandelt, wodurch 1,7 mg des Rohmaterials nach HF-Spaltung von 7 mg trockenem H-[Taeg]₁₅-Lys(ClZ)-BHA-Harz gewonnen wurden. Das Maximum bei 15,1 Minuten (eluiert nach 16 Minuten, wenn es ausgehend von einer wässrigen Lösung anstelle der 10 %igen wässrigen Essigsäurelösung injiziert wurde) machte ungefähr 50 % der Gesamtextinktion aus. Ungefähr 1,2 mg des Rohproduktes wurden gereinigt, wodurch ungefähr 0,2 mg von > 95 % reinem H-[Taeg]₁₀-Lys-NH₂ gewonnen wurden (4). Bezüglich (M+H)⁺ betrug der berechnete m/z-Wert 2807,8 und der gemessene m/z-Wert 2808,2.
(f) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von Acr¹-[Taeg]₁₀-Lys-NH₂
Geschütztes Acr¹-[Taeg]₁₀-Lys(ClZ)-BHA-Harz (99,1 mg, Trockengewicht) wurde, wie in Beispiel 17(c) beschrieben, gespalten, wodurch 42,2 mg des Rohmaterials gewonnen wurden. Das Maximum bei 25,3 Minuten (bei 23,5 Minuten eluiert, wenn ausgehend von einer wässrigen Lösung anstelle der 10 % wässrigen Essigsäurelösung injiziert wurde) machte ungefähr 45 % der Gesamtextinktion aus. Ein 8,87-mg-Anteil des Rohproduktes wurde gereinigt, wodurch ungefähr 5,3 mg an > 97 % reinem Acr¹-[Taeg]₁₀-Lys-NH₂ gewonnen wurden. Bezüglich (M+H)⁺ betrug der berechnete m/z-Wert 2850,8 und der gemessene m/z-Wert 2849,2.
(g) Spaltung und Reinigung von Acr¹-[Taeg]₁₅-Lys-NH₂
Ein 78,7-mg-Anteil an geschütztem Acr¹-[Taeg]₁₅-Lys(ClZ)-BHA-Harz (Trockengewicht) wurde, wie in Beispiel 18 beschrieben, gespalten, wodurch 34,8 mg des Rohmaterials gewonnen wurden. Das Maximum bei 23,5 Minuten (ungefähr die gleiche Elutionszeit, wenn ausgehend von einer wässrigen Lösung anstelle der 10 % wässrigen Essigsäurelösung injiziert wurde) und ein „Dimer" bei 28,2 Minuten machten ungefähr 35 % der Gesamatextinktion aus. Ca. 4,5 mg des Rohproduktes wurden gereinigt, wodurch ungefähr 1,6 mg von vermutlich > 95 % reinem Acr¹-[Taeg]₁₅-Lys-NH₂ gewonnen wurden. Diese Verbindung konnte nicht von dem „Dimer"-Maximum befreit werden, welches auf Grund des Stehenlassens in wässriger Essigsäurelösung entstand.
(h) Syntheseprotokoll 2
(1) BOC-Deprotektion mit TFA/CH₂Cl₂ (1:1, v/v), 3 ml, 3 × 1 Minute und 1 × 30 Minuten; (2) Waschen mit CH₂Cl₂, 3 ml, 6 × 1 Minute; (3) Neutralisieren mit DIEA/CH₂Cl₂ (1:19, v/v), 3 ml, 3 × 2 Minuten; (4) Waschen mit CH₂Cl₂, 3 ml, 6 × 1 Minute und Austrocknen lassen für 1 Minute; (5) eine 2–5 mg-Probe des PNA-Harzes kann entfernt und für eine qualitative Ninhydrinanalyse gründlich getrocknet werden; (6) bezüglich der Zyklen 1 bis 5 und Zyklen 10 bis 15 wurde die Verbindungsreaktion durch Hinzufügen von 3,2 Äquivalenten (0,18 mmol, 100 mg) BOC-Taeg-OPfp, gelöst in 1 ml CH₂Cl₂ durchgeführt, gefolgt von einem Hinzufügen von 0,5 ml DMF (Endkonzentration des Pentafluorphenylesters 0,12 M). Die Verdingungsreaktion wurde für insgesamt 12–24 Stunden unter Schütteln durchgeführt; bei den Zyklen 5 bis 10 wurde zusätzlich eine 0,12 M DCC-Verbindung von 0,12 M BOC-Taeg-OH in 1,5 ml DMF/CH₂Cl₂ (1:2, v/v) eingesetzt; (7) Waschen mit DMF, 3 ml, 1 × 2 Minuten; (8) Waschen mit CH₂Cl₂, 3 ml, 4 × 1 Minute; (9) Neutralisieren mit DIEA/CH₂Cl₂ (1:19, v/v), 3 ml, 2 × 2 Minuten; (10) Waschen mit CH₂Cl₂, 3 ml, 6 × 1 Minute; (11) eine 2–5 mg-Probe eines geschützten PNA-Harzes wird für einen qualitativen Ninhydrintest (nach den Zyklen 7, 10 und 15) entfernt, und unreagierte Aminogruppen wurden durch Acetylierung mit N-Acetylimidazol in Methylenchlorid blockiert).
BEISPIEL 19
Verbesserte Festphasensynthese von H-[Taeg]₁₀-Lys-NH₂.
Die geschützte PNA wurde an einem MBHA-Harz aufgebaut, wobei ungefähr die Hälfte der Ladung des BHA-Harzes verwendet wurde, welches in den vorherigen Beispielen eingesetzt wurde. Darüber hinaus folgte auf allen Zyklen bis auf einen eine Acetylierung der unverbundenen Aminogruppen. Im Folgenden wird die Synthese detailliert beschrieben:
(a) Herstellung von BOC-Lys(ClZ)-NH-CH(p-Ch₃-C₆H₄)-C₆H₄-Harz (MBHA-Harz) mit einer anfänglichen Substitution von 0,3 mmol/g
Die gewünschte Substitution des BOC-Lys(ClZ)-MBHA-Harzes betrug 0,25–0,30 mmol/g. Um diesen Wert zu erreichen, wurden 1,5 mmol von BOC-Lys(ClZ) an 5 g neutralisiertem und vorgequollenem MBHA-Harz gebunden (durch quantitative Ninhydrin-Reaktion auf einen Gehalt von 0,64 mmol NH₂/g bestimmt) unter Verwendung einer einzelnen in situ-Bindung (1,5 mmol DCC) in 60 ml CH₂Cl₂. Die Reaktion wurde durch 3-stündiges Schütteln in einem manuell gehandhabten, 225 ml Standard-Festphasenreaktionsgefäß durchgeführt. Unreagierte Aminogruppen wurden anschließend durch Acetylierung mit einer Mischung aus Acetanhydrid/Pyridin/CH₂Cl₂ (1:1:2, v/v/v) über 18 Stunden blockiert. Eine quantitative Ninhydrin-Reaktion an dem neutralisierten Harz zeigte, dass lediglich 0,00093 mmol/g freies Amin zurückblieb (siehe Tabelle I), d.h. 0,15 % der ursprünglichen Aminogruppen. Der Grad der Substitution wurde durch Deprotektion und Ninhydrinanalyse geschätzt, und betrug 0,32 mmol/g bezüglich des neutralisierten H-Lys(ClZ)-MBHA-Harzes. Dies passt gut zu dem Maximumwert von 0,28 mmol/g bezüglich einer quantitativen Verbindung von 0,30 mmol BOC-Lys(ClZ)/g Harz (siehe Tabelle II).
(b) Schrittweiser Aufbau des BOC-[Taeg]₃-Lys(ClZ)-MBHA-Harzes
Die gesamte Charge H-Lys(ClZ)-MBHA-Harz, die in Abschnitt (a) hergestellt wurde, wurde direkt (im gleichen Reaktionsgefäß) eingesetzt, um BOC-[Taeg]₃-Lys(ClZ)-MBHA-Harz durch einzelne Verbindungen („Syntheseprotokoll 3") zusammenzufügen, wobei 2,5 Äquivalente von BOC-Taeg-OPfp in sauberem CH₂Cl₂ verwendet wurden. Die quantitative Ninhydrin-Reaktion wurde über die gesamte Synthese hindurch angewendet (siehe Tabelle II).
(c) Schrittweiser Aufbau des BOC-[Taeg]₈-Lys(ClZ)-MBHA-Harzes
Ca. 4,5 g des nassen BOC-[Taeg]₃-Lys(ClZ)-MBHA-Harzes (~0,36 mmol wachsende Ketten, entnommen von ungefähr insgesamt ~19 g nassem, unter Abschnitt (b) hergestellten Harz) wurden in ein 55 ml Festphasenpeptidsynthese-(SPPS)-Reaktionsgefäß eingebracht. Das BOC-[Taeg]₈-Lys(ClZ)-MBHA-Harz wurde durch einzelne Verbindungen („Syntheseprotokoll 4") zusammengefügt, wobei 2,5 Äquivalente des BOC-Taeg-OPfp in ungefähr 30 % DMF/CH₂Cl₂ verwendet wurden. Der Fortschritt der Synthese wurde in allen Stadien mittels quantitativer Ninhydrin-Reaktion beobachtet (siehe Tabelle II).
(d) Schrittweiser Aufbau des BOC-[Taeg]₁₀-Lys(ClZ)-MBHA-Harzes
Ungefähr 1 g nasses BOC-[Taeg]₈-Lys(ClZ)-MBHA-Harz (~0,09 mmol wachsende Ketten, entnommen von insgesamt ~4 g nassem Harz, hergestellt unter Abschnitt (c)), wurde in ein 20 ml SPPS-Reaktionsgefäß eingeführt. Das BOC-[Taeg]₁₀-Lys(ClZ)-MBHA-Harz wurde durch das Einzel-Bindungs-Protokoll, wie in dem vorherigen Abschnitt angewendet – zusammengefügt, wobei 2,5 Äquivalente von BOC-Taeg-OPfp in ungefähr 30 % DMF/CH₂Cl₂ verwendet wurden. Das Reaktionsvolumen betrug 3 ml (starkes Schütteln). Die Synthese wurde durch die quantitative Ninhydrin-Reaktion beobachtet (siehe Tabelle II).
(e) Synthese des Ac-[Taeg]₁₀-Lys(ClZ)-MBHA-Harzes
Nach Deprotektion eines Teils des BOC-[Taeg]₁₀-Lys(ClZ)-MBHA-Harzes (geschätztes Trockengewicht ungefähr 45 mg) wurde das Harz in einem nächsten Schritt quantitativ mit einer 2 ml Mischung auf Acetanhydrid/Pyridin/CH₂Cl₂ (1:1:2, v/v/v) über 2 Stunden in einem 3 ml Festphasenreaktionsgefäß acetyliert.
(f) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]₁₀-Lys-NH₂
Ein Anteil des geschützten BOC-[Taeg]₁₀-Lys(ClZ)-BHA-Harzes wurde, wie in Beispiel 17(c) beschrieben, behandelt, wodurch ungefähr 24 mg des Rohmaterials nach HF-Spaltung von 76 mg trockenem H-[Taeg]₅-Lys(ClZ)-BHA-Harz gewonnen wurden. Das Maximum bei 15,2 Minuten (das Unreinheiten wie Deletionspeptide und verschiedene Nebenprodukte mit einschließt) machte ungefähr 78 % der Gesamtextinktion aus. Das Maximum machte auch ungefähr 88 % der „Maximums plus Deletions-Maximums"-Extinktion aus, was in guter Übereinstimmung mit der insgesamt geschätzten Bindungsausbeute von 90,1 % steht, welche durch Zusammenzählen der einzelnen Bindungsprodukte aus Tabelle II erhalten wird. Ein 7,2 mg-Anteil des Rohproduktes wurde aus zwei Chargen unter Verwendung einer semi-präparativen Umkehrphasensäule gereinigt (wobei das Maximum in einem Becherglas, gekühlt mit Trockeneis/2-Propanol gesammelt wurde). Jede Charge enthielt 3,6 mg in 1 ml H₂O. Die gefrorene Lösung wurde direkt lyophilisiert (ohne zuvor das Acetonitril über ein Geschwindigkeitsvakuum zu entfernen), wodurch 4,2 mg des 82 % reinen H-[Taeg]₁₀-Lys-NH₂ gewonnen wurden.
(g) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von Ac-[Taeg]₁₀-Lys-NH₂
Ein 400 mg-Anteil von geschütztem Ac-[Taeg]₁₀-Lys(ClZ)-BHA-Harz (Trockengewicht) wurde wie in Beispiel 17(c) gespalten, mit Ausnahme der TFA-Behandlung, wodurch 11,9 mg Rohmaterial gewonnen wurden. Das Maximum bei 15,8 Minuten machte 75 % der Gesamtextinktion aus. Ein 4,8 mg-Anteil des Rohproduktes wurde gereinigt, wodurch ungefähr 3,5 mg von > 95 % reinem Ac-[Taeg]₁₀-Lys-NH₂ gewonnen wurden. Bezüglich (M+H)⁺ betrug der berechnete m/z-Wert 2849,8 und der gemessene m/z-Wert 2848,8.
(h) Syntheseprotokoll 3
(1) Boc-Deprotektion mit TFA/CH₂Cl₂ (1:1, v/v), 100 ml, 3 × 1 Minute und 1 × 30 Minuten; (2) Waschen mit CH₂Cl₂, 100 ml, 6 × 1 Minute; (3) Neutralisieren mit DIEA/CH₂Cl₂ (1:19, v/v), 100 ml, 3 × 2 Minuten; (4) Waschen mit CH₂Cl₂, 100 ml, 6 × 1 Minute, und Trocknen lassen für 1 Minute; (5) eine 2–5 mg-Probe des PNA-Harzes wurde entnommen und für eine quantitative Ninhydrinanalyse gründlich getrocknet, um die Substitution zu bestimmen; (6) Hinzufügen von 2,5 Äquivalenten (3,75 mmol; 2,064 g) BocTaeg-OPfp, gelöst in 35 ml CH₂Cl₂ (Endkonzentration des Pentafluorphenylesters ~0,1 M); die Bindungsreaktion wurde für insgesamt 20–24 Stunden unter Schütteln durchgeführt; (7) Waschen mit DMF, 100 ml, 1 × 2 Minuten (um Präzipitate von BOC-Taeg-OH zu entfernen); (8) Waschen mit CH₂Cl₂, 100 ml, 4 × 1 Minute; (9) Neutralisieren mit DIEA/CH₂Cl₂ (1:19, v/v), 100 ml, 2 × 2 Minuten; (10) Waschen mit CH₂Cl₂, 100 ml, 6 × 1 Minute; (11) eine 2–5 mg-Probe des geschützten PNA-Harzes wurde für einen schnellen qualitativen Ninhydrintest entnommen und weitere 2,5 mg wurden für eine quantitative Ninhydrinanalyse getrocknet, um das Ausmaß der Bindung zu bestimmen; (12) Blockieren der unreagierte Aminogruppen durch Acetylierung mit einer 100 ml-Mischung aus Acetanhydrid/Pyridin/CH₂Cl₂ (1:1:2, v/v/v) für 2 Stunden; (13) Waschen mit CH₂Cl₂, 100 ml, 6 × 1 Minute; (14) 2 × 2–5 mg-Proben des geschützten PNA-Harzes wurden entfernt, mit DIEA/CH₂Cl₂ (1:19, v/v) neutralisiert und mit CH₂Cl₂ für die qualitative und quantitative Ninhydrinanalyse gewaschen.
(i) Syntheseprotokoll 4
(1) Boc-Deprotektion mit TFA/CH₂Cl₂ (1:1, v/v), 25 ml, 3 × 1 Minute und 1 × 30 Minuten; (2) Waschen mit CH₂Cl₂, 25 ml, 6 × 1 Minute; (3) Neutralisieren mit DIEA/CH₂Cl₂ (1:19, v/v), 25 ml, 3 × 2 Minuten; (4) Waschen mit CH₂Cl₂, 25 ml, 6 × 1 Minute, und Trocknen lassen für 1 Minute; (5) eine 2–5 mg-Probe des PNA-Harzes wurde entnommen und für eine quantitative Ninhydrinanalyse gründlich getrocknet, um die Substitution zu bestimmen; (6) Hinzufügen von 2,5 Äquivalenten (0,92 mmol; 0,506 g) BocTaeg-OPfp, gelöst in 6 ml CH₂Cl₂, gefolgt von einer Hinzufügung von 3 ml DMF (Endkonzentration des Pentafluorphenylesters ~0,1 M); die Bindungsreaktion wurde für insgesamt 20–24 Stunden unter Schütteln durchgeführt; (7) Waschen mit DMF, 25 ml, 1 × 2 Minuten; (8) Waschen mit CH₂Cl₂, 25 ml, 4 × 1 Minute; (9) Neutralisieren mit DIEA/CH₂Cl₂ (1:19, v/v), 25 ml, 2 × 2 Minuten; (10) Waschen mit CH₂Cl₂, 25 ml, 6 × 1 Minute; (11) eine 2–5 mg-Probe des geschützten PNA-Harzes wurde für einen schnellen qualitativen Ninhydrintest entnommen und weitere 2,5 mg wurden für eine quantitative Ninhydrinanalyse getrocknet, um das Ausmaß der Bindung zu bestimmen; (12) Blockieren der unreagierte Aminogruppen durch Acetylierung mit einer 25 ml-Mischung aus Acetanhydrid/Pyridin/CH₂Cl₂ (1:1:2, v/v/v) für 2 Stunden (außer nach dem ersten Zyklus); (13) Waschen mit CH₂Cl₂, 25 ml, 6 × 1 Minute; (14) 2 × 2–5 mg-Proben des geschützten PNA-Harzes wurden entfernt, mit DIEA/CH₂Cl₂ (1:19, v/v) neutralisiert und mit CH₂Cl₂ für die qualitative und quantitative Ninhydrinanalyse gewaschen.
BEISPIEL 20
Synthese von N-Benzyloxycarbonyl-N'-(BOC-Aminoethyl)glycin Aminoethylglycin (52,86 g, 0,447 mol) wurden in Wasser (900 ml) gelöst und Dioxan (900 ml) hinzugefügt. Der pH-Wert wurde mit 2 N NaOH auf 11,2 eingestellt. Während der pH-Wert bei 11,2 gehalten wurde, wurde tert-Butyl-p-nitrophenylcarbonat (128,4 g, 0,537 mol) in Dioxan (720 ml) gelöst und im Verlauf von 2 Stunden tropfenweise hinzugefügt. Der pH wurde für mindestens drei weitere Stunden bei 11,2 gehalten und anschließend unter Rühren über Nacht stehen gelassen. Die gelbe Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und der pH-Wert mit 2 N HCl auf 3,5 eingestellt. Die Mischung wurde mit Chloroform (4 × 100 ml) gewaschen und der pH-Wert der wässrigen Phase wurde mit 2 N NaOH bei 0°C wieder auf 9,5 eingestellt. Benzyloxycarbonylchlorid (73,5 ml, 0,515 mol) wurde über eine halbe Stunde hinweg hinzugefügt, wobei der pH-Wert mit 2 N NaOH bei 9,5 gehalten wurde. Innerhalb der nächsten 4 Stunden wurde der pH-Wert ständig angepasst, und die Lösung wurde unter Rühren über Nacht stehen gelassen. Am folgenden Tag wurde die Lösung mit Ether (3 × 600 ml) gewaschen und der pH-Wert der Lösung danach mit 2 N HCl bei 0°C auf 1,5 angepasst. Die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde durch Extraktion mit Ethylacetat (5 × 1000 ml) isoliert. Die Ethylacetatlösung wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockenheit verdampft. Dies erzielte 138 g des Produkts, das in Ether (300 ml) gelöst und durch die Hinzufügung von Petrolether (1800 ml) ausgefällt wurde. Ausbeute 124,7 g (79 %). Schmelzpunkt 64,5–85°C. Analyse für C₁₇H₂₄N₂O₆ festgestellt (berechnet) C: 58,40(57,94); H: 7,02(6,86); N: 7,94(7,95). ¹H-NMR (250 MHz, CDl₃) 7,33 & 7,32 (5H, Ph); 5,15 & 5,12 (2H, PhCH ₂); 4,03 & 4,01 (2H, NCH ₂CO₂H); 3,46 (b, 2H, BOC-NHCH₂CH ₂); 3,28 (b, 2H, BOC-NHCH ₂CH₂); 1,43 & 1,40 (9H, t-Bu). HPLC (260 nm) 20,71 Minuten (80,2 %) und 21,57 Minuten (19,8 %). Die UV-Spektren (200 nm–300 nm) sind identisch, was darauf hinwies, dass der kleine Spitzenwert aus Bis-Z-AEG besteht.
BEISPIEL 21
Synthese von N'-BOC-Aminoethylglycinethylester
N-Benzyloxycarbonyl-N'-(BOC-aminoethyl)glycin (60 g, 0,170 mol) und N,N-Dimethyl-4-aminopyridin (6 g) wurden im absoluten Ethanol (500 ml) gelöst und vor Hinzufügung von DCC (42,2 g, 0,204 mol) auf 0°C abgekühlt. Das Eisbad wurde nach 5 Minuten entfernt und das Rühren über weitere 2 Stunden fortgesetzt. Das ausgefällte DCU (32,5 g, getrocknet) wurde durch Filtrierung getrennt und mit Ether (3 × 100 ml) gewaschen. Die kombinierten Filtrate wurden nacheinander mit verdünntem Kaliumhydrogensulfat (2 × 400 ml), verdünntem Natriumhydrogencarbonat (2 × 400 ml) und gesättigtem Natriumchlorid (1 × 400 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde filtriert und anschließend über Magnesiumsulfat getrocknet, sowie im Vakuum zur Trockenheit verdampft, wodurch 66,1 g einer öligen Substanz gewonnen wurden, die DCU enthielt.
Das Öl wurde in absolutem Ethanol (600 ml) gelöst und 10 % Palladium auf Kohlenstoff (6,6 g) hinzugefügt. Die Lösung wurde bei Atmosphärendruck hydriert, wobei das Reservoir mit 2 N Natriumhydroxid gefüllt wurde. Nach 4 Stunden waren 3,3 l der theoretischen 4,2 l verbraucht. Die Reaktionsmischung wurde durch Celit filtriert und zur Trockenheit unter Vakuum verdampft, wodurch 39,5 g (94 %) einer öligen Substanz gewonnen wurden. Ein Anteil von 13 g der öligen Substanz wurde über Silica-Gel-(SiO₂, 600 g)-Chromatographie gereinigt. Nach Elution mit 300 ml 20 % Petrolether in Methylenchlorid wurde die in der Überschrift angegebene Verbindung mit 1700 ml 5 % Methanol in Methylenchlorid eluiert. Das Lösungsmittel wurde aus den Fraktionen mit genügender Reinheit unter Vakuum entfernt, und die Ausbeute betrug 8,49 g. Alternativ wurden 10 g des Rohmaterials durch eine Kugel-Rohrdestillation gereinigt. ¹H-NMR (250 MHz, CD₃OD); 4,77 (b. s, NH); 4,18 (q, 2H, MeCH ₂-); 3,38 (s, 2H, NCH ₂CO₂Et); 3,16 (t, 2H, BOC-NHCH ₂CH₂); 2,68 (t, 2H, BOC-NHCH₂CH ₂); 1,43 (s, 9H, t-Bu) und 1,26 (t, 3H, CH₃) ¹³C-NMR 171,4 (COEt); 156,6 (CO); 78,3 ((CH₂ C); 59,9 (CH₂); 49,0 (CH₂); 48,1 (CH₂); 39,0 (CH₂); 26,9 (CH₂) und 12.6 (CH₃).
BEISPIEL 22
Synthese von N'-BOC-Aminoethylglycinmethylester
Das oben beschriebene Verfahren wurde eingesetzt, wobei Methanol durch Ethanol ersetzt wurde. Das Endprodukt wurde durch eine Säulenreinigung gereinigt.
BEISPIEL 23
Synthese von 1-(BOC-aeg)Thyminethylester
N'-BOC-Aminoethylglycinethylester (13,5 g, 54,8 mmol), DhbtOH (9,84 g, 60,3 mmol) und 1-Carboxymethylthymin (11,1 g, 60,3 mmol) wurden in DMF (210 ml) gelöst. Anschließend wurde Methylenchlorid (210 ml) hinzugefügt. Die Lösung wurde in einem Ethanol/Eisbad auf 0 °C abgekühlt und DCC (13,6 g, 65,8 mmol) wurden hinzugefügt. Nach 1 Stunde wurde das Eisbad entfernt und das Rühren wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur fortgeführt. Das ausgefällte DCU wurde durch Filtrierung entfernt und zweimal mit Methylenchlorid (2 × 75 ml) gewaschen. Zu den kombinierten Filtraten wurde weiteres Methylenchlorid (650 ml) hinzugefügt. Die Lösung wurde nacheinander mit verdünntem Natriumhydrogencarbonat (3 × 500 ml), verdünntem Kaliumhydrogensulfat (2 × 500 ml) und gesättigtem Natriumchlorid (1 × 500 ml) gewaschen. Von dem Präzipitat wurde einiges aus der organischen Phase durch Filtration entfernt. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockenheit verdampft. Der ölige Rest wurde in Methylenchlorid (150 ml) gelöst, filtriert und die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde durch Hinzufügen von Petrolether (350 ml) bei 0 °C ausgefällt. Das Methylenchlorid/Petrolether-Verfahren wurde einmal wiederholt. Dies erzielte 16 g (71 %) eines Materials, das mehr als 99 % rein war, wie durch HPLC ermittelt wurde.
BEISPIEL 24
Synthese von 1-(BOC-aeg)Thymin
Das Material aus dem vorherigen Schritt wurde in THF (194 ml, ergibt eine 0,2 M-Lösung) aufgenommen und 1 M wässriges Lithiumhydroxid (116 ml) wurde hinzugefügt. Die Mischung wurde 45 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt und anschließend filtriert, um wässriges DCU zu entfernen. Zu der Lösung wurde Wasser (40 ml) hinzugefügt, und anschließend wurde die Lösung mit Methylenchlorid (300 ml) gewaschen. Weiteres Wasser (30 ml) wurde hinzugefügt und die alkalische Lösung wurde ein weiteres Mal mit Methylenchlorid (150 ml) gewaschen. Die wässrige Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und der pH-Wert durch tropfweises Hinzufügen von 1 N HCl (ungefähr 110 ml) auf 2 angepasst. Die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde mit Ethylacetat (9 × 200 ml) extrahiert, die kombinierten Extrakte wurden über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockenheit verdampft. Der Rest wurde einmal aus Methanol verdampft, wonach – nach Trocknen über Nacht – ein farbloser, glasiger Feststoff gewonnen wurde. Ausbeute: 9,57 g (64 %). HPLC > 98 % R_T = 14, 8 Minuten. Analyse für C₁₆H₂₄N₄O₇·0,25 H₂O festgestellt (berechnet) C: 49,29(49,42); H: 6,52(6,35); N: 14,11(14,41). Auf Grund der beschränkten Rotation um das sekundäre Amid waren einige der Signale im Verhältnis 2:1 verdoppelt (in der Liste mit gr. für größer und kl. für kleiner angezeigt). ¹H-NMR (250 MHz, DMSO-d₆) δ: 12,75 (bs, 1H, CO₂H); 11,28 (s, 1H, gr. Imid NH); 11,26 (s, 1H, kl. Imid NH); 7,30 (s, 1H, gr. T H-6); 7,26 (s, 1H, kl., T H-6); 6,92 (bt, 1H, gr., BOC-NH); 6,73 (bt, 1H, kl., BOC-NH); 4,64 (s, 2H, gr., CH ₂CON); 4,46 (s, 2H, gr., CH ₂CON); 4,19 (s, 2H, kl., CH ₂CO₂H); 3,97 (s, 2H, gr., CH ₂CO₂H); 3,63-3,01 (unaufgelöst m, Wasser mit eingeschlossen, CH ₂CH ₂); 1,75 (s, 3H, CH ₃) und 1,38 (s, 9H, t-Bu).
BEISPIEL 25
Synthese von N⁴-Benzyloxycarbonyl-1-(BOC-aeg)cytosin
N'-BOC-Aminoethylglycinethylester (5 g, 20,3 mmol), DhbtOH (3,64 g, 22,3 mmol) und N⁴-Benzyloxycarbonyl-1-carboxymethylcytosin (6,77 g, 22,3 mmol) wurden in DMF (100 ml) suspendiert.
Anschließend wurde Methylenchlorid (100 ml) hinzugefügt. Die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und DCC (5,03 g, 24,4 mmol) hinzugefügt. Nach 2 Stunden wurde das Eisbad entfernt und das Rühren wurde für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur fortgesetzt. Anschließend wurde die Reaktionsmischung im Vakuum zur Trockenheit verdampft. Der Rest wurde in Ether (100 ml) aufgenommen und 30 Minuten lang stark gerührt. Das feste Material wurde durch Filtrierung isoliert und der Ether-Waschschritt wurde zweimal wiederholt. Anschließend wurde das Material 15 Minuten lang mit verdünntem Natriumhydrogencarbonat (ca. 4 %-Lösung, 100 ml) stark gerührt, gefiltert und mit Wasser gewaschen. Dieses Verfahren wurde anschließend einmal wiederholt, wobei nach der Trocknung 17 g eines gelblichen festen Materials übrig blieben. Der Feststoff wurde unter Rückflusskühlung mit Dioxan (200 ml) erhitzt und gefiltert, solange er heiß war. Nach dem Abkühlen wurden 200 ml Wasser hinzugefügt. Das ausgefallene Material wurde durch Filtrieren isoliert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Gemäß der HPLC (Beobachtung bei 260 nm) besaß das Material eine Reinheit von > 99 %, neben dem DCU. Der Ester wurde dann in THF (100 ml) suspendiert, auf 0°C abgekühlt und 1 N LiOH (61 ml) wurden hinzugefügt. Nach 15-minütigem Rühren wurde die Mischung gefiltert und das Filtrat wurde mit Methylenchlorid (2 × 150 ml) gewaschen. Die alkalische Lösung wurde dann auf 0°C abgekühlt und der pH mit 1 N HCl auf 2,0 eingestellt. Die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde durch Filtrieren isoliert und einmal mit Wasser gewaschen, wonach nach einem Trocknungsschritt 11,3 g eines weißen Pulvers übrig blieben. Das Material wurde in Methylenchlorid (300 ml) aufgenommen und Petrolether (300 ml) hinzugefügt. Nach Filtrieren und Waschen sowie einem Trocknungsschritt wurden 7,1 g (69 %) erzielt. HPLC zeigte eine Reinheit von 99 % R_T = R_T = 19,5 Minuten, und eine kleinere Unreinheit bei 12,6 Minuten (ca. 1 %), die sehr wahrscheinlich das Z-deprotektierte Monomer darstellt. Die Analyse für C₂₃H₂₉N₅O₈ festgestellt (berechnet) C: 54,16(54,87); H: 5,76(5,81) und N: 13,65(13,91). ¹H-NMR (250 MHz, DMSO-d₆). 10,78 (bs, 1H, CO₂ H); 7,88 (2 überlappende Dupletts, 1H, Cyt H-5); 7,41-7,32 (m, 5H, Ph); 7,01 (2 überlappende Doublets, 1H, Cyt H-6); 6,94 & 6,78 (nicht aufgelöste Tripletts, 1H, BOC-NH); 5,19 (s, 2H, PhCH ₂); 4,81 & 4,62 (s, 2H, CH ₂CON); 4,17 & 3,98 (s, 2H, CH ₂CO₂H); 3,42-3,03 (m, schließt Wasser mit ein, CH ₂CH ₂) und 1,38 & 1,37 (s, 9H, ¹-Bu). ¹³C-NMR. 150,88; 128,52; 128,18; 127,96; 93,90; 66,93; 49,58 und 28,22. IR: Frequenz in cm^–1 (Intensität). 3423 (26,4), 3035 (53,2), 2978(41,4), 1736(17,3), 1658(3,8), 1563(23,0), 1501(6,8) und 1456 (26,4).
BEISPIEL 26
Synthese von 9-Carboxymethyladeninethylester
Adenin (10 g, 74 mmol) und Kaliumcarbonat (10,29 g, 74 mmol) wurden in DMF aufgenommen und Ethylbromacetat (8,24 ml, 74 mmol) hinzugefügt. Die Suspension wurde 2,5 Stunden lang unter Stickstoff bei Raumtemperatur gerührt und anschließend filtriert. Der feste Rest wurde dreimal mit DMF (10 ml) gewaschen). Das kombinierte Filtrat wurde im Vakuum zur Trockenheit verdampft. Zu dem gelblich-orangen festen Material wurde Wasser (200 ml) hinzugefügt und der pH-Wert mit 4 N HCl auf 6 eingestellt. Nach 10-minütigem Rühren bei 0°C wurde der Feststoff abgefiltert, mit Wasser gewaschen und aus 96 %igem Ethanol (150 ml) umkristallisiert. Die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde durch Filtrieren isoliert und gründlich mit Ether gewaschen. Ausbeute: 3,4 g (20 %). Schmelzpunkt 215,5–220°C. Analyse für C₉H₁₁N₅O₂ festgestellt (berechnet): C: 48,86(48,65); H: 5,01(4,91); N: 31,66(31,42). ¹H-NMR 250 MHz; DMSO-d₆): 7,25 (bs, 2H, NH₂), 5,06 (s, 2H, NCH₂), 4,17 (q, 2H, J = 7,11 Hz, OCH₂) und 1,21 (t, 3H, J = 7,13 Hz, NCH₂). ¹³C-NMR. 152,70, 141,30, 61,41, 43,97 und 14.07. FAB-MS. 222 (MH+). IR: Frequenz in cm^–1 (Intensität). 3855(54,3), 3274(10,4), 3246(14,0), 3117(5,3), 2989(22,3); 2940(33,9), 2876(43,4), 2753(49,0), 2346(56,1), 2106(57,1), 1899(55,7), 1762(14,2), 1742(14,2), 1742(1,0), 1671(18,8), 1644(10.9), 1606(0,6), 1582(7,1), 1522(43,8), 1477(7,2), 1445(35,8) und 1422(8,6). Die Position der Alkylierung wurde durch Röntgenstrahlenkristallographie auf Kristallen verifiziert, die durch Umkristallisieren aus 96 %igem Alkohol gewonnen wurden.
Alternativ kann 9-Carboxymethyladeninethylester durch das folgende Verfahren hergestellt werden. Zu einer Suspension aus Adenin (50 g, 0,37 mol) in DMF (1100 ml) in einer 2 l-dreihalsigen Flasche mit einem Stickstoffeinlass, einem mechanischen Rührer und einem Tropftrichter wurden 16,4 g (0,407 mol) einer mit Hexan gewaschenen Natriumhydrid-Mineralöldispersion gegeben. Die Mischung wurde 2 Stunden lang gerührt, und danach Ethylbromacetat (75 ml, 0,67 mol) im Verlauf von 3 Stunden tropfenweise hinzugefügt. Die Mischung wurde für eine weitere Stunde gerührt, wonach mit tlc die vollständige Umwandlung von Adenin gezeigt werden konnte. Die Mischung wurde zur Trockenheit bei 1 mm Hg verdampft und Wasser (500 ml) wurde zu dem öligen Rest hinzugefügt, wodurch die Kristallisierung der in der Überschrift angegebenen Verbindung verursacht wurde. Der Feststoff wurde aus 96 % Ethanol (600 ml) umkristallisiert.
Ausbeute (nach Trocknen): 53,7 g (65,6 %). HPLC (215 nm) Reinheit > 99,5 %.
BEISPIEL 27
Synthese von N⁶-Benzyloxycarbonyl-9-carboxymethyladeninethylester
9-Carboxymethyladeninethylester (3,4 g, 15,4 mmol) wurden durch vorsichtiges Erhitzen in trockenem DMF (50 ml) erhitzt, auf 20°C abgekühlt und anschließend zu einer Lösung aus N-Ethylbenzyloxycarbonylimidazoltetrafluorborat (62 mmol) in Methylenchlorid (50 ml) über einen Zeitraum von 15 Minuten hinweg in einem Eisbad hinzugefügt. Ein leichtes Ausfällen wurde beobachtet. Das Eisbad wurde entfernt und die Lösung über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit gesättigtem Natriumhydrogencarbonat (100 ml) behandelt. Nach 10-minütigem Rühren wurden die Phasen getrennt und die organische Phase wurde nacheinander mit einem Volumen Wasser, verdünntem Kaliumhydrogensulfat (zweimal) und mit gesättigtem Natriumchlorid gewaschen. Die Lösung wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockenheit verdampft, was 11 g eines öligen Materials ergab. Das Material wurde in Methylenchlorid (25 ml) gelöst, auf 0°C abgekühlt und mit Petrolether (50 ml) ausgefällt. Dieses Verfahren wurde einmal wiederholt, wodurch 3,45 g (63 %) der in der Überschrift angegebenen Verbindung gewonnen werden konnte. Schmelzpunkt 132–35 °C. Analyse für C₁₇H₁₇N₅O₄ festgestellt (berechnet): C: 56,95(57,46); H: 4,71(4,82); N: 19,35(19,71). ¹H-NMR (250 MHz; CDCl₃): 8,77 (s, 1H, H-2 oder H-8); 7,99 (s, 1H, H-2 oder H-8); 7,45-7,26 (m, 5H, Ph); 5,31 (s, 2H, N-CH ₂); 4,96 (s, 2H, Ph-CH ₂); 4,27 (q, 2H, J = 7,15 Hz, CH ₂,CH₃) und 1,30 (t, 3H, J = 7,15 Hz, CH₂CH ₃), ¹³C-NMR: 153,09; 143,11; 128,66; 67,84; 62,51; 44,24 und 14,09. FAB-MS: 356 (MH+) und 312 (MH+-CO₂). IR: Frequenz in cm^–1 (Intensität). 3423 (52,1); 3182 (52,8); 3115(52,1); 3031(47,9); 2981(38,6); 1747(1,1); 1617(4,8); 15,87(8,4); 1552(25,2); 1511(45,2); 1492(37,9); 1465(14,0) und 1413(37,3).
BEISPIEL 28
Synthese von N⁶-Benzyloxycarbonyl-9-carboxymethyladenin
N⁶-Benzyloxycarbonyl-9-carboxymethyladeninethylester (3,2 g, 9,01 mmol) wurde mit auf 0°C abgekühltem Methanol (50 ml) gemischt. Anschließend wurde eine Natriumhydroxidlösung (2 N, 50 ml) hinzugefügt, wodurch sich das Material schnell löste. Nach 30 Minuten bei 0°C wurde die alkalische Lösung mit Methylenchlorid (2 × 50 ml) gewaschen. Der pH-Wert der wässrigen Lösung wurde mit 4 N HCl bei 0°C auf 1 angepasst, wodurch die in der Überschrift angegebene Verbindung ausfällte. Die Ausbeute nach Filtrierung, Waschen mit Wasser und Trocknen betrug 3,08 g (104 %). Das Produkt enthielt Salz, was durch die Elementaranalyse gezeigt werden konnte. Die Analyse für C₁₅H₁₃N₅O₄ festgestellt (berechnet): C: 46,32(55,05); H: 4,24(4,00); N: 18,10(21,40) und C/N: 2,57(2,56). ¹H-NMR (250 MHz; DMSO-d₆): 8,70 (s, 2H, H-2 und H-8); 7,50-7,35 (m, 5H, Ph); 5,27 (s, 2H, N-CH ₂); und 5,15 (s, 2H, Ph-CH ₂). ¹³C-NMR. 168,77, 152,54, 151,36, 148,75, 145,13, 128,51, 128,17, 127,98, 66,76 und 44,67. IR (KBr) 3484(18,3); 3109(15,9); 3087(15,0); 2966(17,1); 2927(19,9); 2383(53,8); 1960(62,7); 1739(2,5); 1688(5,2); 1655(0.9); 1594(11,7); 1560(12,3); 1530(26,3); 1499(30,5); 1475(10,4); 1455(14,0); 1429(24,5) und 1411(23,6). FAB-MS: 328 (MH+) und 284 (MH+-CO₂). HPLC (215 nm, 260 nm) im System 1:15,18 Minuten, geringe Unreinheiten, alle niedriger als 2 %.
BEISPIEL 29
Synthese von N⁶-Benzyloxycarbonyl-1-(BOC-aeg)adeninethylester
N'-BOC-Aminoethylglycinethylester (2 g, 8,12 mmol), DhbtOH (1,46 g, 8,93 mmol) und N⁶-Benzyloxycarbonyl-9-carboxymethyladenin (2,92 g, 8,93 mmol) wurden in DMF (15 ml) gelöst. Anschließend wurde Methylenchlorid (15 ml) hinzugefügt. Die Lösung wurde in einem Ethanol/Eisbad auf 0°C abgekühlt. Anschließend wurde DCC (2,01 g, 9,74 mmol) hinzugefügt. Nach 2,5 Stunden wurde das Eisbad entfernt und das Rühren über 1,5 Stunden bei Raumtemperatur fortgesetzt. Das ausgefällte DCU wurde durch Filtrierung entfernt und einmal mit DMF (15 ml) und zweimal mit Methylenchlorid (2 × 15 ml) gewaschen. Zu dem kombinierten Filtrat wurde weiteres Methylenchlorid (100 ml) hinzugefügt. Die Lösung wurde nacheinander mit verdünntem Natriumhydrogencarbonat (2 × 100 ml), verdünntem Kaliumhydrogensulfat (2 × 100 ml) und gesättigtem Natriumchlorid (1 × 100 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde im Vakuum zur Trockenheit verdampft, was 3,28 g (73 %) einer gelblichen-öligen Substanz ergab. Die HPLC des Rohproduktes zeigte, dass dieses eine Reinheit von lediglich 66 % mit mehreren Unreinheiten aufwies, sowohl mehr als auch weniger polar als das Maximum. Das Öl wurde in absolutem Ethanol (50 ml) gelöst und aktivierter Kohlenstoff hinzugefügt. Nach 5-minütigem Rühren wurde die Lösung filtriert. Das Filtrat wurde mit Wasser (30 ml) gemischt und über Nacht rühren gelassen. Am nächsten Tag wurde das weiße Präzipitat durch Filtrieren entfernt, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wo durch 1,16 g (26 %) des Materials mit einer Reinheit größer als 98 % – ermittelt durch HPLC – erzielt wurde. Durch Hinzufügen von Wasser zu der Stammflüssigkeit konnten weitere 0,53 g des Produktes mit einer Reinheit von ungefähr 95 % gewonnen werden. Die Analyse für C₂₆H₃₃N₇O₇·H₂O festgestellt (berechnet) C: 55,01(54,44; H: 6,85(6,15) und N: 16,47(17,09). ¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃) 8,74 (s, 1H, Ade H-2); 8,18 (b. s, 1H, ZNH); 8,10 & 8,04 (s, 1H, H-8); 7,46-7,34 (m, 5 H, Ph); 5,63 (nicht-gel. t, 1H, BOC-NH); 5,30 (s, 2H, PhCH₂); 5,16 & 5,00 (s, 2H, CH ₂CON); 4,29 & 4,06 (s, 2H, CH ₂CO₂H); 4,20 (q, 2H, OCH ₂CH₃); 3,67-3,29 (m, 4H, CH ₂CH ₂); 1,42 (s, 9H, t-Bu) und 1,27 (t, 3H, OCH ₂CH₃). Das Spektrum zeigt Spuren von Ethanol und DCU.
BEISPIEL 30
Synthese von N⁶-Benzyloxycarbonyl-1-(BOC-aeg)adenin
N⁶-Benzyloxycarbonyl-1-(BOC-aeg)adeninethylester (1,48 g, 2,66 mmol) wurde in THF (13 ml) suspendiert und die Mischung auf 0°C abgekühlt. Anschließend wurde Lithiumhydroxid (8 ml, 1 N) hinzugefügt. Nach 15-minütigem Rühren wurde die Reaktionsmischung filtriert, weiteres Wasser (25 ml) hinzugefügt und die Lösung mit Methylenchlorid (2 × 25 ml) gewaschen. Der pH-Wert der wässrigen Lösung wurde mit 1 N HCl auf 2 eingestellt. Das Präzipitat wurde durch Filtrieren isoliert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch 0,82 g (58 %) des Produktes gewonnen wurden. Das Produkt wurde darüber hinaus zweimal. mit Methylenchlorid/Petrolether gefällt. Ausbeute (nach Trocknen): 0,77 g (55 %). Schmelzpunkt 119°C (zers.). Analyse für C₂₄H₂₉N₇O₇·H₂O festgestellt (berechnet) C: 53,32(52,84); H: 5,71(5,73), N: 17,68(17,97). FAB.MS. 528,5 (MH+). ¹H-NMR (250 MHz), DMSO-d₆). 12,75 (sehr b, 1h, CO₂H); 10,65 (b. s, 1H, ZNH); 8,59 (d, 1H, J = 2,14 Hz, Ade H-2); 8,31 (s, 1H, Ade H-8); 7,49-7,31 (m, 5H, Ph); 7,03 & 6,75 (nicht gelöst t, 1H, BOC-NH); 5,33 & 5,16 (s, 2H, CH₂CON); 5,22 (s, 2H, PhCH ₂); 4,34-3,99 (s, 2H, CH₂CO₂H); 3,54-3,03 (m's, schließt Wasser mit ein, CH ₂CH ₂) und 1,39 & 1,37 (s, 9H, t-Bu). ¹³C-NMR. 170,4; 166,6; 152,3; 151,5; 149,5; 145,2; 128,5; 128,0; 127,9; 66,32; 47,63; 47,03; 43,87 und 28,24.
BEISPIEL 31
Synthese von 2-Amino-6-chlor-9-carboxymethylpurin
Zu einer Lösung mit 2-Amino-6-chlorpurin (5,02 g, 29,6 mmol) und Kaliumcarbonat (12,91 g, 93,5 mmol) in DMF (50 ml) wurde Bromessigsäure (4,7 g, 22,8 mmol) hinzugefügt. Die Mischung wurde 20 Stunden lang unter Stickstoff stark gerührt. Anschließend wurde Wasser (150 ml) hinzugefügt und die Lösung durch Celit gefiltert, wodurch eine klare gelbe Lösung gewonnen wurde. Die Lösung wurde mit 4 N Salzsäure auf ein pH-Wert von 3 gebracht. Das Präzipitat wurde gefiltert und im Vakuum über Sicapent getrocknet. Ausbeute: 3,02 g (44,8 %). ¹H-NMR(DMSO-d₆) δ: 4,88 ppm (s, 2H); 6,95 (s, 2H); 8,10 (s, 1H).
BEISPIEL 32
Synthese von 2-Amino-6-benzyloxy-9-carboxymethylpurin
Natrium (2 g, 87 mmol) wurde in Benzylalkohol (20 ml) gelöst und 2 Stunden lang bei 130°C erhitzt. Nach Abkühlen auf 0°C wurde eine Lösung aus 2-Amino-6-chlor-9-carboxymethylpurin (4,05 g, 18 mmol) in DMF (85 ml) langsam hinzugefügt, und die resultierende Suspension über Nacht bei 20°C gerührt. Natriumhydroxidlösung (1 N, 100 ml) wurde hinzugefügt und die klare Lösung mit Ethylacetat (3 × 100 ml) gewaschen. Die wässrige Phase wurde anschließend mit 4 N Salzsäure auf einem pH-Wert von 3 sauer gemacht. Das Präzipitat wurde in Ethylacetat (200 ml) aufgenommen und die wässrige Phase mit Ethylacetat (2 × 100 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden mit einer gesättigten Natriumchloridlösung (2 × 75 ml) gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockenheit verdampft. Der Rest wurde aus Ethanol (300 ml) umkristallisiert. Nach Trocknen im Vakuum über Sicapent betrug die Ausbeute 2,76 g (52 %). Schmelzpunkt 159–65°C. Analyse (berechnet; festgestellt): C(56,18; 55,97), H(4,38; 4,32), N(23,4; 23,10). ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 4,82 (s, 2H); 5,51 (s, 2H); 6,45 (s, 2H); 7,45 (m, 5H); 7,82 (s, 1H).
BEISPIEL 33
Synthese von N-([2-Amino-6-benzyloxy-purin-9-yl]-acetyl)-N-(2-BOC-aminoethyl)glycin[BOC-Gaeg-OH Monomer]
2-Amino-6-benzyloxy-9-carboxymethyl-purin (0,5 g, 1,67 mmol), Methyl-N(2-[tert-butoxycarbonylamino]ethyl)-glycinat (0,65 g, 2,8 mmol), Diisopropylethylamin (0,54 g, 4,19 mmol) und Brom-tris-pyrrolidino-phosphonium-hexafluor-phosphat (PyBroP^®) (0,798 g, 1,71 mmol) wurden in DMF (2 ml) 4 Stunden lang gerührt. Anschließend wurde die klare Lösung in eine eisgekühlte Lösung aus Natriumhydrogencarbonat (1 N, 40 ml) gegeben und mit Ethylacetat (3 × 40 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Kaliumhydrogensulfatlösung (1 N, 2 × 40 ml), Natriumhydrogencarbonat (1 N 1 × 40 ml) und gesättigter Natriumchloridlösung (60 ml) gewaschen. Nach Trocknen mit wasserfreiem Natriumsulfat und Verdampfen im Vakuum wurde der feste Rest aus 2:1 Ethylacetat/Hexan (20 ml) umkristallisiert, wodurch der Methylester mit einer 63 %-Ausbeute erzielt wurde (MS-FAB 514 (M+1). Die Hydrolyse wurde durch Lösen des Esters in 1:2 Ethanol/Wasser (30 ml) vorgenommen, welches konzentriertes Natriumhydroxid (1 ml) enthielt. Nach 2-stündigem Rühren wurde die Lösung filtriert und durch Hinzufügen von 4 N Salzsäure auf einen pH-Wert von 3 angesäuert. Die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde durch Filtrieren gewonnen. Ausbeute: 370 mg (72 % für die Hydrolyse). Gemäß HPLC betrug die Reinheit mehr als 99 %. Auf Grund der beschränkten Rotation um das sekundäre Amid waren mehrere Signale im Verhältnis 2:1 verdoppelt (in der Liste durch gr. für größer und kl. für kleiner angegeben). ¹H-NMR(250 MHz, DMSO-d₆) δ: 1,4 (s, 9H); 3,2 (m, 2H); 3,6 (m, 2H); 4,1 (s, gr., CONRCH ₂COOH); 4,4 (s, kl., CONRCH ₂COOH); 5,0 (s, kl., Gua-CH ₂CO-); 5,2 (s, gr., Gua-CH ₂CO): 5,6 (s, 2H); 6,5 (s, 2H); 6,9 (m, kl., BOC-NH); 7,1 (m, gr., BOC-NH); 7,5 (m, 3H); 7,8 (s, 1H); 12,8 (s, 1H). ¹³C-NMR. 170,95; 170,52; 167,29; 166,85; 160,03; 159,78; 155,84; 154,87; 140,63; 136,76; 128,49; 128,10; 113,04; 78,19; 77,86; 66,95; 49,22; 47,70; 46,94; 45,96; 43,62; 43,31 und 28,25.
BEISPIEL 34
Synthese von 3-BOC-Amino-1,2-propandiol
3-Amino-1,2-propandiol (1 Äquivalent, 40 g, 0,44 mol) wurde in Wasser (1000 ml) gelöst und auf 0°C abgekühlt. Di-tert-butyldicarbonat (1,2 Äquivalente, 115 g, 0,526 mol) wurde in einem Teil hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde unter Rühren in einem Wasserbad auf Raumtemperatur gebracht. Der pH-Wert wurde mit einer Lösung aus Natriumhydroxid (1 Äquivalent, 17,56 g, 0,44 mol) in Wasser (120 ml) bei 10,5 gehalten. Sobald das Hinzufügen der wässrigen Natriumhydroxidlösung vervollständigt war, wurde die Reaktionsmischung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde Ethylacetat (750 ml) zu der Reaktionsmischung gegeben, gefolgt von einem Abkühlen auf 0 °C. Der pH-Wert wurde mit 4 N Schwefelsäure unter starkem Rühren auf 2,5 eingestellt. Die Phasen wurden getrennt und die Wasserphase mit weiterem Ethylacetat (6 × 350 ml) gewaschen. Das Volumen der organischen Phase wurde auf 900 ml durch Verdampfen unter reduziertem Druck reduziert. Die organische Phase wurde anschließend mit einer gesättigten wässrigen Lösung aus Kaliumhydrogensulfat, verdünnt auf das zweifache seines Volumens (1 × 1000 ml) und mit gesättigtem wässrigen Natriumchlorid (1 × 500 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄) und unter reduziertem Druck verdampft, wodurch 50,12 g (60 %) der in der Überschrift angegebenen Verbindung erzielt wurden. Das Produkt konnte durch Verdampfen aus Methylenchlorid und anschließendem Einfrieren verfestigt werden. ¹H-NMR (CDCl₃/TMS) δ: 1,43 (s, 9H, Me₃C), 3,25 (m, 2H, CH₂), 3,57 (m, 2H, CH₂), 3,73 (m, 1H, CH). ¹³C-NMR (CDCl₃/TMS) ppm: 28,2 (Me₃C), 42,6 (CH₂), 63,5, 71,1 (CH₂OH, CHOH), 79,5 (Me₃C), 157,0 (C=O).
BEISPIEL 35
Synthese von 2-(BOC-Amino)ethyl-L-alaninmethylester
3-BOC-Amino-1,2propandiol (1 Äquivalent, 20,76 g, 0,109 mol) wurde in Wasser (150 ml) aufgenommen. Kaliumperiodat (1 Äquivalent, 24,97 g, 0,109 mol) wurde hinzugefügt und die Reaktionsmischung 2 Stunden lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Die Reaktionsmischung wurde gefiltert und die wässrige Phase mit Chloroform (6 × 250 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄) und verdampft, wobei eine beinahe quantitative Ausbeute an BOC-Aminoacetaldehyd als farbloses Öl gewonnen wurde, welches ohne weitere Reinigung in dem folgenden Verfahren eingesetzt wurde.
Zu MeOH (250 ml) wurde Palladium auf Kohlenstoff (10 %, 0,8 g) unter Stickstoff und unter Kühlen (0°C) sowie starkem Rühren hinzugefügt. Wasserfreies Natriumacetat (2 Äquivalente, 4,49 g, 54,7 mmol) und L-Alaninmethylester, Hydrochlorid (1 Äquivalent, 3,82 g, 27,4 mmol) wurden hinzugefügt. Anschließend wurde BOC-Aminoacetaldehyd (4,79 g, 30,1 mmol, 1,1 Äquivalent) in MeOH (150 ml) gelöst und die Reaktionsmischung hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde bei atmosphärischem Druck und Raumtemperatur hydriert bis die Wasserstoffaufnahme stoppte. die Reaktionsmischung wurde durch Celit gefiltert, das anschließend mit weiterem MeOH gewaschen wurde. Das MeOH wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der Rest wurde in Wasser (150 ml) aufgenommen und der pH-Wert durch tropfweises Hinzufügen von 0,5 N NaOH unter starkem Rühren auf 8 eingestellt. Die wässrige Phase wurde mit Methylenchlorid (4 × 250 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄), durch Celit gefiltert und unter reduziertem Druck verdampft, wodurch 6,36 g (94 %) der in der Überschrift angegebenen Verbindung als ein klares, schwach gelbes Öl erzielt wurden. MS (FAB-MS): m/z(%) = 247 (100, M+1, 191 (90), 147 (18). ¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃) δ: 1,18 (d, J = 7,0 Hz, 3H, Me), 1,36 (s, 9H, Me₃C), 1,89 (b, 1H, NH), 2,51 (m, 1H, CH₂), 2,66 (m, 1H, CH₂), 3,10 (m, 2H, CH₂), 3,27 (q, J = 7,0 Hz, 1H, CH), 3,64 (s, 3H, OMe), 5,06 (b, 1H, Carbamat NH). ¹³C-NMR (ppm); 18,8 (Me), 28,2 (Me₂C), 40,1, 47,0 (CH₂), 51,6 (OMe), 56,0 (CH), 155,8 (Carbamat C=O), 175,8 (Ester C=O).
BEISPIEL 36
Synthese von N-(BOC-Aminoethyl)-N-(1-thyminylacetyl)-L-alaninmethylester
Zu einer Lösung aus BOC-Aminoethyl-(L)-alaninmethylester (1,23 g, 5 mmol) in DMF (10 ml) wurde Dhbt-OH (0,9 g, 5,52 mmol) und 1-Thyminylessigsäure (1,01 g, 5,48 mmol) hinzugefügt. Nach Lösung der 1-Thyminylessigsäure wurde Dichlormethan (10 ml) hinzugefügt und die Lösung in einem Eisbad abgekühlt. Nachdem die Reaktionsmischung 0°C erreicht hatte, wurde DCC (1,24 g, 6,01 mmol) hinzugefügt. Innerhalb von 5 Minuten nach dem Hinzufügen wurde ein DCU-Präzipitat beobachtet. Nach weiteren 5 Minuten wurde das Eisbad entfernt. Zwei Stunden später wurde mittels tlc-Analyse gezeigt, dass die Reaktion vervollständigt war. Die Mischung wurde filtriert und das Präzipitat mit Dichlormethan (100 ml) gewaschen. Die resultierende Lösung wurde zweimal mit 5 % Natriumhydrogencarbonat (150 ml) und zweimal mit gesättigtem Kaliumhydrogensulfat (25 ml) in Wasser (100 ml) extrahiert. Nach der letzten Extraktion mit gesättigtem Natriumchlorid (150 ml) wurde die Lösung mit Magnesiumsulfat getrocknet und verdampft, was zu einem weißen Schaum führte. Der Schaum wurde über Säulenchromatographie auf Silica-Gel unter Verwendung von Dichlormethan mit einem Methanolgradienten als Elutionsmittel gereinigt. Dies ergab eine reine Verbindung (> 99 %), ermittelt durch HPLC) (1,08 g, 52,4 %).
FAB-MS: 413 (M+1) und 431 (M+1 + Wasser). ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 4,52 (s, 2H, CH'₂); 3,73 (s, 3H, OMe); 3,2-3,6 (m, 4H, Ethyl CH₂s); 1,90 (s, 3H, Me in T); 1,49 (d, 3H, Me in T); 1,49 (d, 3H, Me in Ala, J = 7,3 Hz); 1,44 (s, 9H, BOC).
BEISPIEL 37
Synthese von N-(BOC-Aminoethyl)-N-(1-thyminylacetyl)-L-alanin
Der Methylester der in der Überschrift angegebenen Verbindung, nämlich Beispiel 36, (2,07 g, 5,02 mmol) wurde in Methanol (100 ml) gelöst und in einem Eisbad gekühlt. Anschließend wurden 2 M Natriumhydroxid (100 ml) hinzugefügt. Nach 10-minütigem Rühren wurde der pH-Wert der Mischung mit 4 M Chlorwasserstoff auf 3 eingestellt. Anschließend wurde die Lösung mit Ethylacetat (3 × 100 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Verdampfen wurde der resultierende Schaum in Ethylacetat (400 ml) und 5 ml Methanol gelöst, um das feste Material zu lösen. Anschließend wurde Petrolether hinzugefügt, bis das Ausfällen einsetzte. Nach Stehenlassen der Mischung über Nacht bei –20°C wurde das Präzipitat durch Filtrieren entfernt. Dies ergab 1,01 g (50,5 %) der reinen Verbindung (> 99 %, ermittelt durch HPLC). Die Verbindung wurde aus 2-Propanol umkristallisiert. FAB-MS: 399 (M+1). ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 11,35 (s, 1H, COO); 7,42 (s, 1H, H'₆); 4,69 (s, 2H, CH'₂); 1,83 (s, 3H, Me in T); 1,50-1,40 (m, 12H, Me in Ala + BOC).
BEISPIEL 38
(a) Synthese von N-(BOC-Aminoethyl)-N-(1-thyminylacetyl)-D-alaninmethylester
Zu einer Lösung von BOC-Aminoethylalaninmethylester (2,48 g, 10,1 mmol) in DMF (20 ml) wurde Dhbt-OH (1,8 g, 11 mmol) und Thyminylessigsäure (2,14 g, 11,6 mmol) hinzugefügt. Nach Lösen der 1-Thyminylessigsäure wurde Methylenchlorid (20 ml) hinzugefügt und die Lösung in einem Eisbad abgekühlt. Sobald die Reaktionsmischung eine Temperatur von 0°C erreicht hatte, wurde DCC (2,88 g, 14 mmol) hinzugefügt. Innerhalb von 5 Minuten nach dem Hinzufügen konnte ein Ausfällen von DCU beobachtet werden. Nach 35 Minuten wurde das Eisbad entfernt. Die Mischung wurde 3,5 Stunden später filtriert und das Präzipitat mit Methylenchlorid (200 ml) gewaschen. Die resultierende Lösung wurde zweimal mit 5 % Natriumhydrogencarbonat (200 ml) und zweimal mit gesättigtem Kaliumhydrogensulfat in Wasser (100 ml) extrahiert. Nach der letzten Extraktion mit gesättigtem Natriumchlorid (250 ml) wurde die Lösung mit Magnesiumsulfat getrocknet und verdampft, wodurch ein Öl produziert wurde. Das Öl wurde über eine kurze Silica-Gel-Chromatographie unter Verwendung von Methylenchlorid mit einem Methanolgradienten als Elutionsmittel gereinigt. Dies ergab eine Verbindung, die zu 96 % rein war, gemessen mittels HPLC (1,05 g, 25,3 %) nach Fällen mit Petrolether. FAB-MS- 413 (M+1). ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 5,64 (t, 1H, BOC-NH, J = 5,89 Hz); 4,56 (d, 2H, CH'₂); 4,35 (q, 1H, CH in Ala, J = 7,25 Hz); 3,74 (s, 3H, OMe); 3,64-3,27 (m, 4H, Ethyl H's); 1,90 (s, 3H, Me in T); 1,52-1,44 (t, 12H, BOC + Me in Ala).
(b) Synthese von N-(BOC-Aminoethyl)-N-(1-thyminylacetyl)-D-alanin
Der Methylester der in Überschrift angegebenen Verbindung (1,57 g, 3,81 mmol) wurde in Methanol (100 ml) gelöst und in einem Eisbad gekühlt. Natriumhydroxid (2 M, 100 ml) wurde hinzugefügt. Nach 10-minütigem Rühren wurde der pH-Wert der Mischung mit 4 M Chlorwasserstoff auf 3 eingestellt. Die Lösung wurde anschließend mit Ethylacetat (3 × 100 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Verdampfen wurde das Öl in Ethylacetat (200 ml) gelöst. Anschließend wurde Petrolether hinzugefügt (auf ein Gesamtvolumen von 600 ml), bis das Ausfällen begann. Nach Stehenlassen über nacht bei –20°C wurde das Präzipitat durch Filtrieren entfernt. Dies ergab 1,02 g (67,3 %) der in der Überschrift angegebenen Verbindung, welche zu 94 % rein war, gemessen durch HPLC. FAB-MS: 399 (M+1). ¹H-NMR, δ: 11,34 (s, 1H, COOH); 7,42 (s, 1H, H'₆); 4,69 (s, 2H, CH'₂); 4,40 (q, 1H, CH in Ala, J = 7,20 Hz); 1,83 (s, 3H, Me in T); 1,52-1,40 (m, 12H, BOC + Me in Ala).
BEISPIEL 39
Synthese von N-(N'-BOC-3'-Aminopropyl)-N-[(1-thyminyl)-acetyl]glycinmethylester
N-(N'-BOC-3'-Aminopropyl)glycinmethylester (2,84 g, 0,0115 mol) wurde in DMF (35 ml) gelöst, gefolgt von einer Hinzufügung von DhbtOH (2,07 g, 0,0127 mol) und 1-Thyminylessigsäure (2,34 g, 0,0127 mol). Anschließend wurde Methylenchlorid (35 ml) hinzugefügt und die Mischung in einem Eisbad auf 0°C abgekühlt. Nach Hinzufügen von DCC (2,85 g, 0,0138 mol) wurde die Mischung 2 Stunden lang bei 0°C gerührt, gefolgt von einem Rühren von 1 Stunde bei Raumtemperatur. Das ausgefallene DCU wurde durch Filtrieren entfernt, mit Methylenchlorid (25 ml) gewaschen und eine weitere Menge Methylenchlorid (150 ml) zu dem Filtrat hinzugefügt. Die organische Phase wurde mit Natriumhydrogencarbonat (1 Volumen, gesättigt, verdünnt mit 1 Volumen Wasser, 6 × 250 ml), Kaliumsulfat (10 Volumen, gesättigt, verdünnt mit 4 Volumen Wasser, 3 × 250 ml) und gesättigtem wässrigen Natriumchlorid (1 × 250 ml) extrahiert, über trockenem Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockenheit verdampft. Der feste Rest wurde in Methylenchlorid (35 ml) aufgenommen und 1 Stunde lang gerührt. Das ausgefallene DCU wurde durch Filtrieren entfernt und mit Methylenchlorid (25 ml) gewaschen. Das Filtrat wurde im Vakuum zur Trockenheit verdampft und der Rest durch eine Säulenchromatographie auf Silica-Gel gereinigt, wobei mit einer Mischung aus Methanol und Methylenchlorid (Gradient von 3–7 % Methanol in Methylenchlorid) eluiert wurde. Dies ergab die in der Überschrift angegebene Verbindung als weißen Feststoff (3,05 g, 64 %). Schmelzpunkt 76–79°C (zers.). Analyse für C₁₈H₂₈N₄O₇, festgestellt (berechnet) C: 52,03(52,42) H: 6,90(6,84) N: 13,21(13,58). Die Verbindung zeigte zufrieden stellende ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren.
BEISPIEL 40
Synthese von N-(N'-BOC-3'-Aminopropyl)-N-[(1-thyminyl)-acetyl]-glycin
N-(N'-BOC-3'-Aminopropyl)-N-[(1-thyminyl)-acetyl]glycinmethylester (3,02 g, 0,00732 mol) wurde in Methanol (25 ml) ge löst und über 1,5 Stunden mit 2 M Natriumhydroxid (25 ml) gerührt. Das Methanol wurde durch Verdampfen im Vakuum entfernt und der pH-Wert mit 4 M Salzsäure bei 0°C auf 2 eingestellt. Das Produkt wurde durch Filtrieren als weiße Kristalle isoliert, mit Wasser (3 × 10 ml) gewaschen und im Vakuum über Sicapent getrocknet. Ausbeute: 2,19 g (75 %). Analyse für C₁₇H₂₆N₄O₇, H₂O, festgestellt (berechnet) C: 49,95(49,03) H: 6,47(6,29) N: 13,43(13,45). Die Verbindung zeigte zufrieden stellende 1H- und ¹³C-NMR-Spektren.
BEISPIEL 41
Synthese von 3-(1-Thyminyl)propansäuremethylester
Thymin (14 g, 0,11 mol) wurde in Methanol aufgenommen. Methylacrylat (30,6 ml, 0,44 mol) wurde hinzugefügt, zusammen mit katalytischen Mengen an Natriumhydroxid. Die Lösung wurde unter Rückflusskühlung im Dunklen für 45 Stunden erhitzt, im Vakuum zur Trockenheit verdampft und der Rest unter Erhitzen in Methanol (8 ml) gelöst. Nach Abkühlen in einem Eisbad wurde das Produkt durch Hinzufügen von Ether (20 ml) ausgefällt, durch Filtrieren isoliert, mit Ether (3 × 15 ml) gewaschen und im Vakuum über Sicapent getrocknet. Ausbeute: 11,23 g (48 %). Schmelzpunkt 112–119°C. Analyse für C₉H₁₂N₂O₄ festgestellt (berechnet) C: 51,14(50,94) H: 5,78(5,70) N: 11,52(13,20). Die Verbindung zeigte zufrieden stellende ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren.
BEISPIEL 42
Synthese von 3-(1-Thyminyl)propansäure
3-(1-Thyminyl)propansäuremethylester (1 g, 0,0047 mol) wurde in 2 M Natriumhydroxid (15 ml) aufgenommen und für 10 Minuten unter Rückflusskühlung erhitzt. Der pH-Wert mit konzentrierter Salzsäure auf 0,3 eingestellt. Die Lösung wurde mit Ethylacetat (10 × 25 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde mit gesättigtem wässrigen Natriumchlorid extrahiert, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockenheit verdampft, wodurch die in der Überschrift angegebene Verbindung als weißer Feststoff (0,66 g, 71 %) gewonnen wurde. Schmelzpunkt 118–121°C. Analyse für C₈H₁₀N₂O₄ festgestellt (berechnet) C: 48,38(48,49) H: 5,09(5,09) N: 13,93(14,14). Die Verbindung zeigte zufrieden stellende ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren.
BEISPIEL 43
Synthese von N-(M'-BOC-Aminoethyl)-M-[(1-thyminyl)-propanoyl]glycinethylester
N-(N'-BOC-Aminoethyl)glycinethylester (1 g, 0,0041 mol) wurde in DMF (12 ml) gelöst. DhbtOH (0,73 g, 0,0045 mol) und 3-(1-Thyminyl)propansäure (0,89 g, 0,0045 mol) wurden hinzugefügt. Anschließend wurde Methylenchlorid (12 ml) hinzugefügt und die Mischung in einem Eisbad auf 0°C abgekühlt. Nach Hinzufügen von DCC (1,01 g, 0,0049 mol) wurde die Mischung zunächst 2 Stunden lang bei 0°C und anschließend 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Das ausgefallene DCU wurde durch Filtrieren entfernt, mit Methylenchlorid (25 ml) gewaschen und eine weitere Menge an Methylenchlorid (50 ml) dem Filtrat hinzugefügt. Die organische Phase wurde mit Natriumhydrogencarbonat (1 Volumen, gesättigt, verdünnt mit 1 Volumen Wasser, 6 × 100 ml), Kaliumsulfat (1 Volumen, gesättigt, verdünnt mit 4 Volumen Wasser, 3 × 100 ml) und gesättigtem wässrigen Natriumchlorid (1 × 100 ml) extrahiert, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockenheit verdampft. Der feste Rest wurde in Methylenchlorid (15 ml) aufgenommen und 1 Stunde lang gerührt. Das ausgefallene DCU wurde durch Filtrieren entfernt und mit Methylenchlorid gewaschen. Das Hydrat wurde im Vakuum zur Trockenheit verdampft und der Rest durch Säulenchromatographie auf Silica-Gel gereinigt, wobei mit einer Mischung aus Methanol und Methylenchlorid (Gradient von 1 bis 6 % Methanol in Methylenchlorid) eluiert wurde. Dies ergab in der Überschrift angegebene Verbindung als weißer Feststoff (1,02 g, 59 %). Analyse für C₁₉H₃₀N₄O₇ festgestellt (berechnet) C: 53,15(53,51) H: 6,90(7,09) N: 12,76(13,13). Die Verbindung zeigte zufrieden stellende ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren.
BEISPIEL 44
Synthese von N-(N'-BOC-Aminoethyl)-N-[(1-thyminyl)-propanoyl]glycin
N-(N'-BOC-Aminoethyl)-N-[(1-thyminyl)-propanoyl]glycinethylester (0,83 g, 0,00195 mol) wurde in Methanol (25 ml) gelöst. Anschließend wurde Natriumhydroxid (2 M, 25 ml) hinzugefügt. Die Lösung wurde für 1 Stunde gerührt. Das Methanol wurde durch Verdampfen im Vakuum entfernt und der pH-Wert mit 4 M Salzsäure bei 0°C auf 2 eingestellt. Das Produkt wurde durch Filtrieren isoliert, mit Ether (3 × 15 ml) gewaschen und im Vakuum über Sicapent getrocknet. Ausbeute: 0,769 g, 99 %). Schmelzpunkt 213°C (zers.).
BEISPIEL 45
Synthese von Mono-BOC-ethylendiamin (2)
tert-Butyl-4-nitrophenylcarbonat (1,10 g, 0,0418 mol), gelöst in DMF (50 ml) wurde über einen Zeitraum von 30 Minuten tropfenweise zu einer Lösung aus Ethylendiamin (27,9 ml, 0,418 mol) und DMF (50 ml) hinzugefügt und über Nacht gerührt. Die Mischung wurde im Vakuum zur Trockenheit verdampft und das resultierende Öl in Wasser gelöst (250 ml). Nach Abkühlen auf 0°C wurde der pH-Wert mit 4 M Salzsäure auf 3,5 eingestellt. Anschließend wurde die Lösung filtriert und mit Chloroform (3 × 250 ml) extrahiert. Der pH-Wert mit 2 M Natriumhydroxid auf 12 eingestellt (bei 0°C), und die wässrige Lösung mit Methylenchlorid (3 × 300 ml) extrahiert. Nach Behandeln mit einer Lösung aus gesättigtem wässrigen Natriumchlorid (250 ml) wurde die Methylenchloridlösung über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Filtrieren wurde die Lösung im Vakuum zur Trockenheit verdampft, wodurch 4,22 g (63 %) des Produktes als Öl gewonnen wurden. ¹H-NMR (90 MHz, CDCl₃) δ: 1,44 (s, 9H); 2,87 (t, 2H); 3,1 (1, 2H); 5,62 (sb).
BEISPIEL 46
Synthese von (N-BOC-Aminoethyl)-β-alaninmethylester. HCl
Mono-BOC-ethylendiamin (2) (16,28 g, 0,102 mol) wurde in Acetonitril (400 ml) gelöst und Methylacrylat (91,5 ml, 1,02 mol) wurde mit Acetonitril (200 ml) zu der Mischung hinzugefügt. Die Lösung wurde über Nacht durch Rückflusskühlung unter Stickstoff im Dunkeln erhitzt, um eine Polymerisierung von Methylacrylat zu vermeiden. Nach Verdampfen im Vakuum zur Trockenheit wurde eine Mischung aus Wasser und Ether (200 ml + 200 ml) hinzugefügt und die Lösung filtriert, sowie stark gerührt. Die wässrige Phase wurde ein weiteres Mal mit Ether extrahiert und anschließend gefriergetrocknet, wodurch ein gelber Feststoff gewonnen wurde. Eine Umkristallisierung aus Ethylacetat führte zu 13,09 g (46 %) der in der Überschrift angegebenen Verbindung. Schmelzpunkt 138–140°C. Analyse für C₁₁H₂₃N₂O₄Cl festgestellt (berechnet) C: 46,49(46,72) H: 8,38(8,20) N: 9,83(9,91) Cl: 12,45(12,54). ¹H-NMR (90 MHz; DMSO-d₆) δ: 1,39 (s, 9H); 2,9 (m, 8H); 3,64 (s, 3H).
BEISPIEL 47
Synthese von N-[(1-Thyminyl)acetyl]-N'-BOC-aminoethyl-β-alaninmethylester.
(N-BOC-aminoethyl)-β-alaninmethylester HCl (3) (2 g, 0,0071 mol) und 1-Thyminylessigsäurepentafluorphenylester (5) (2,828 g, 0,00812 mol) wurden in DMF (50 ml) gelöst. Anschließend wurde Triethylamin (1,12 ml, 0,00812 mol) hinzugefügt und die Mischung über Nacht gerührt. Nach Hinzufügen von Methylenchlorid (200 ml) wurde die organische Phase mit wässrigem Natriumhydrogencarbonat (3 × 250 ml), einer halb-gesättigten Lösung aus wässrigem Kaliumhydrogensulfat (3 × 250 ml) und einer gesättigten Lösung aus wässrigem Natriumchlorid (250 ml) extrahiert und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Filtrierung und die Verdampfung zur Trockenheit im Vakuum ergab eine Ausbaute von 2,9 g (99 %) des Produktes (Öl). ¹H-NMR (250 MHz; CDCl₃; aufgrund der begrenzten Rotation um das sekundäre Amid waren einige der Signale verdoppelt) δ: 1,43 (s, 9H); 1,88 (s, 3H); 2,63 (t, 1H); 2,74 (t, 1H); 3,25-3,55 (4xt, 8H); 3,65 (2xt, 2H); 3,66 (s, 1,5); 3,72 (s, 1,5); 4,61 (s, 1H); 4,72 (s, 2H); 5,59 (s, 0,5H); 5,96 (s, 0,5H); 7,11 (s, 1H); 10,33 (s, 1H).
BEISPIEL 48
Synthese von N-[(1-Thyminyl)acetyl]-N'-BOC-aminoethyl-β-alanin
N-[(1-Thyminyl)acetyl]-N'-BOC-aminoethyl-β-alaninmethylester (3 g, 0,0073 mol) wurde in 2 M Natriumhydroxid (30 ml) gelöst, der pH-Wert bei 0°C mit 4 M Salzsäure auf 2 eingestellt und die Lösung für 2 Stunden gerührt. Anschließend wurde das Präzipitat durch Filtrierung isoliert, dreimal mit kaltem Wasser gewaschen und im Vakuum über Sicapent getrocknet. Ausbeute: 2,23 g (77 %). Schmelzpunkt 170–176 °C. Analyse für C₁₇H₂₆N₄O₇, H₂O, festgestellt (berechnet) C: 49,49(49,03) H: 6,31(6,78) N: 13,84(13,45). ¹H-NMR (90 MHz; DMSO-d₆) δ: 1,38 (s, 9H); 1,76 (s, 3H); 2,44 und 3,29 (m, 8H); 4,55 (s, 2H); 7,3 (s, 1H); 11,23 (s, 1H). FAB-MS: 399 (M+1).
BEISPIEL 49
Synthese von N-[(1-(N⁴-Z)-Cytosinyl)acetyl]-N'-BOC-aminoethyl-β-alaninmethylesters
(N-BOC-Aminoethyl)-β-alaninmethylester HCl (3) (2 g, 0,0071 mol) und 1-(N-4-Z)-Cytosinylessigsäurepentafluorphenylester (5) (3,319 g, 0,0071 mol) wurden in DMF (50 ml) gelöst. Anschließend wurde Triethylamin (0,99 ml, 0,0071 mol) hinzugefügt und die Mischung über Nacht gerührt. Nach Hinzufügen von Methylenchlorid (200 ml) wurde die organische Phase mit wässri gem Natriumhydrogencarbonat (3 × 250 ml), einer halb-gesättigten Lösung aus wässrigem Kaliumhydrogensulfat (3 × 250 ml) und einer gesättigten Lösung aus wässrigem Natriumchlorid (250 ml) extrahiert und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach einer Filtrierung und bei Vakuum-Verdampfung zur Trockenheit wurden 3,36 g einer festen Verbindung gewonnen, die aus Methanol umkristallisiert wurde. Ausbeute: 2,42 g (64 %). Schmelzpunkt 158–161°C. Analyse für C₂₅H₃₃N₅O₈ festgestellt (berechnet) C: 55,19(56,49) H: 6,19(6,26) N: 12,86(13,18). ¹H-NMR (250 MHz; CDCl₃; aufgrund einer begrenzten Rotation um das sekundäre Amid waren einige der Signale verdoppelt) δ: 1,43 (s, 9H); 2,57 (t, 1H); 3,60-3,23 (m's, 6H); 3,60 (s, 5H); 3,66 (s, 1,5H); 4,80 (s, 1H); 4,88 (s, 1H); 5,20 (s, 2H); 7,80-7,25 (m's, 7H). FAB-MS: 532 (M+1).
BEISPIEL 50
Synthese von N-[(1-(N⁴-Z)-Cytosinyl)acetyl]-N'-BOC-aminoethyl-β-alanin
N-[(1-(N-4-Z)-Cytosinyl)acetyl]-N'-BOC-aminoethyl-β-alaninmethylester (0,621 g, 0,0012 mol) wurde in 2 M Natriumhydroxid (8,5 ml) gelöst und 2 Stunden lang gerührt. Anschließend wurde der pH-Wert bei 0°C mit 4 M Salzsäure auf 2 eingestellt und die Lösung 2 Stunden lang gerührt. Das Präzipitat wurde durch Filtrierung isoliert, dreimal mit kaltem Wasser gewaschen und im Vakuum über Sicapent getrocknet. Ausbeute: 0,326 g (54 %). Der weiße Feststoff wurde aus 2-Propanol umkristallisiert und mit Petrolether gewaschen. Schmelzpunkt 163°C (zersetzt). Analyse für C₂₄H₃₁N₅O₈ festgestellt (berechnet) C: 49,49(49,03) H: 6,31(6,78) N: 13,84(13,45). ¹H-NMR (250 MHz; CDCl₃, aufgrund der begrenzten Rotation um das sekundäre Amid waren einige der Signale verdoppelt) δ: 1,40 (s, 9H); 2,57 (t, 1H); 2,65 (t, 1H); 3,60-3,32 (m's, 6H); 4,85 (s, 1H); 4,98 (s, 1H); 5,21 (s, 2H); 5,71 (s, 1H, breit); 7,99-7,25 (m's 7H). FAB-MS: 518 (M+1).
BEISPIEL 51
Festphasensynthese von H-[Taeg]₅-[Gaeg]-[Taeg]₄-Lys-NH₂
Die geschützte PNA wurde auf einem BOC-Lys(ClZ)-modifizierten MBHA-Harz mit einer Substitution von ungefähr 0,15 mmol/g (bestimmt durch quantitative Ninhydrin-Reaktion) zusammengefügt. Der Schutz von lediglich unverbundenen Aminogruppen wurde vor Einbau des BOC-Gaeg-OH-Monomers durchgeführt.
Schrittweiser Aufbau von H-[Taeg]₅-[Gaeg]-[Taeg]₄-Lys-NH₂ (synthetisches Protokoll)
Die Synthese wurde auf 102 mg (Trockengewicht) von vorgequollenem (über Nacht in DCM) und neutralisiertem BOC-Lys(ClZ)-MBHA-Harz initiiert. Die durchgeführten Schritte waren wie folgt: (1) BOC-Deprotektion mit TFR/DCM (Dichlormethan) (1:1, v/v), 1 × 2 Minuten und 1 × 0,5 h, 3 ml; (2) Waschen mit DCM, 4 × 20 Sekunden, 3 ml; Waschen mit DMF, 2 × 20 Sekunden, 3 ml; Waschen mit DCM, 2 × 20 Sekunden, 3 ml und Trocknen lassen für 30 Sekunden; (3) Neutralisieren mit DIEA/DCM (1:19 v/v), 2 × 3 Minuten, 3 ml; (4) Waschen mit DCM, 4 × 2 Sekunden, 3 ml, und Trocknen lassen für 1 Minute; (5) Hinzufügen von 4 Äquivalenten an Diisopropylcarbodiimid (0,06 mmol, 9,7 μl) und 4 Äquivalenten an BOC-Taeg-OH (0,06 mmol, 24 mg) oder BocGaeg-OH (0,06 mmol, 30 mg), gelöst in 0,6 ml von 1:1 (v/v) DCM/DMF (Endkonzentration des Monomers 0,1 M), die Bindungsreaktion wurde anschließend für 0,5 h fortgeführt, und zwar unter gleichzeitigem Schütteln bei Raumtemperatur; (6) Trocknen lassen für 20 Sekunden; (7) Waschen mit DMF, 2 × 20 Sekunden und 1 × 2 Minuten, 3 ml; Waschen mit DCM 4 × 20 Sekunden, 3 ml; (8) Neutralisieren mit DIEA/DCM (1:19 v/v), 2 × 3 Minuten, 3 ml; (9) Waschen mit DCM 4 × 20 Sekunden, 3 ml und Trocknen lassen für 1 Minute; (10) qualitativer Kaiser-Test; (11) Blockieren der unreagierten Aminogruppen durch Acetylierung mit Ac₂/O/Pyridin/DCM (1:1:2, v/v), 1 × 0,5 h, 3 ml; und (12) Waschen mit DCM, 4 × 20 Sekunden, 2 × 2 Minuten und 2 × 20 Sekunden, 3 ml. Die Schritte 1–12 wurden solange wiederholt, bis die gewünschte Sequenz erhalten wurde. Alle qualitativen Kaiser-Tests waren negativ (stroh-gelbe Farbe ohne Einfärbung der Kügelchen) was auf eine beinahe 100 %ige Bindungsausbeute hindeutet. Das PNA-Oligomer wurde gespalten und über das normale Verfahren gereinigt. FAB-MS: 2832,11 [M⁺+1] (berechnet 2832,15).
BEISPIEL 52
Festphasensynthese von H-Taeg-Aaeg-[Taeg]₈-Lys-NH₂
(a) Schrittweiser Aufbau von BOC-Taeg-A(Z)aeg-[Taeg]₈-Lys(ClZ)-MBHA-Harz
Ungefähr 0,3 g an nassem BOC-[Taeg]₈-Lys(ClZ)-MBHA-Harz wurden in ein 3 ml-SPPS-Reaktionsgefäß gegeben. Das BOC-Taeg-A(Z)aeg-[Taeg]₈-Lys(ClZ)-MBHA-Harz wurde durch in situ-DCC-Bindung (einfach) des A(Z)aeg-Rests unter Verwendung von 0,19 M an BOC-A(Z)aeg-OH zusammen mit 0,15 DCC in 2,5 ml 50 % DMF/CH₂Cl₂ und einer einfachen Bindung mit 0,15 M BOC-Taeg-OPfp in sauberem CH₂Cl₂ („Syntheseprotokoll 5") zusammengefügt. Die Synthese wurde durch die quantitative Ninhydrin-Reaktion beobachtet, was einen ca. 50%-igen Einbau an A(Z)aeg und ein ungefähr 96 %igen Einbau von Taeg zeigte.
(b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-Taeg-Aaeg-[Taeg]₈-Lys-NH₂
Das geschützte BOC-Taeg-A(Z)aeg-[Taeg]₈-Lys(ClZ)-BHA-Harz wurde wie in Beispiel 17(c) behandelt, wodurch ungefähr 15,6 mg des Rohmaterials nach HF-Spaltung von 53,1 mg trockenem H-Taeg-A(Z)aeg-[Taeg]₈-Lys(ClZ)-BHA-Harz gewonnen wurden. Das Maximum bei 14,4 Minuten machte weniger als 50 % der Gesamtextinktion aus. Ein 0,5 mg-Anteil des Produktes wurde gereinigt, wodurch ungefähr 0,1 mg des H-Taeg-Aaeg-[Taeg]₈-Lys-NH₂ gewonnen wurden. Bezüglich (MH+)* betrug der berechnet m/z-Wert 2816,16 und der gemessene m/z-Wert 2816,28.
(c) Syntheseprotokoll 5
(1) BOC-Deprotektion mit TFA/CH₂Cl₂ (1:1, v/v), 2,5 ml, 3 × 1 Minute und 1 × 30 Minuten; (2) Waschen mit CH₂Cl₂, 2,5 ml, 6 × 1 Minute; (3) Neutralisieren mit DIEA/CH₂Cl₂ (1:19, v/v), 2,5 ml, 3 × 2 Minuten; (4) Waschen mit CH₂Cl₂, 2,5 ml, 6 × 1 Minute und Trocknen lassen für 1 Minute; (5) eine 2–5 mg-Probe des PNA-Harzes wurde entnommen und für eine quantitative Ninhydrin-Analyse gründlich getrocknet, um die Substitution zu bestimmen; (6) Hinzufügen von 0,47 mmol (0,25 g) BOC-A(Z)aeg-OH, gelöst in 1,25 ml DMF, gefolgt von einer Hinzufügung von 0,47 mmol (0,1 g) DCC in 1,25 ml CH₂Cl₂ oder 0,36 mmol (0,2 g) BOC-Taeg-OPfp in 2,5 ml an CH₂Cl₂; die Bindungsreaktion wurde für weitere 20–24 Stunden unter Schütteln fortgeführt; (7) Waschen mit DMF, 2,5 ml, 1 × 2 Minuten; (8) Waschen mit CH₂Cl₂, 2,5 ml, 4 × 1 Minute; (9) Neutralisieren mit DIEA/CH₂Cl₂ (1:19, v/v), 2,5 ml, 2 × 2 Minuten; (10) Waschen mit CH₂Cl₂, 2,5 ml, 6 × 1 Minute; (11) eine 2,5 mg-Probe an geschütztem PNA-Harz wurde entnommen und für eine quantitative Ninhydrin-Analyse gründlich getrocknet, um das Ausmaß der Bindung zu bestimmen; (12) Blockieren der unreagierten Aminogruppen durch Acetylierung einer 25 ml-Mischung aus Acidanhydrid/Pyridin/CH₂Cl₂ (1:1:2, v/v/v) über 2 Stunden (mit Ausnahme des letzten Zyklus); und (13) waschen mit CH₂Cl₂, 2,5 ml, 6 × 1 Minute; (14) 2 × 2–5 mg-Proben an geschütztem PNA-Harz wurden entnommen, mit DIEA/CH₂Cl₂ (1:19, v/v) neutralisiert und mit CH₂Cl₂ für die Ninhydrin-Analyse gewaschen.
BEISPIEL 53
Festphasensynthese von H-[Taeg]₂-Aaeg-[Taeg]₅-Lys-NH₂
(a) Schrittweiser Aufbau von BOC-[Taeg]₂-A(Z)aeg-[Taeg]₅-Lys(ClZ)-MBHA-Harz
Ungefähr 0,5 g an nassem BOC-[Taeg]₅-Lys(ClZ)-MBHA-Harz wurden in ein 5 ml-SPPS-Reaktionsgefäß gegeben. Das BOC-[Taeg]₂-A(Z)aeg-[Taeg]₅-Lys(ClZ)-MBHA-Harz wurde durch in situ-DCC-Bindung von sowohl den A(Z)aeg- und den Taeg-Resten unter Verwendung von 0,15 M bis 0,2 M an geschütztem PNA-Monomer (freie Säure) zusammen mit einer äquivalenten Menge an DCC in 2 ml sauberem CH₂Cl₂ („Syntheseprotokoll 6") zusammengefügt. Die Synthese wurde durch die quantitative Ninhydrin-Reaktion beobachtet, was insgesamt ca. 82 % Einbau an A(Z)aeg nach dreimaligem Verbinden zeigte (die erste Bindung erzielte ca. 50 % Einbau; eine vierte HOBt-vermittelte Bindung in 50 % DMF/CH₂Cl₂ konnte die Gesamtbindungausbeute nicht bedeutend ansteigen lassen) und einen quantitativen Einbau (einfache Bindungen der Taeg-Reste.
(b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]₂-Aaeg-[Taeg]₅-Lys-NH₂
Das geschützte BOC-[Taeg]₂-A(Z)aeg-[Taeg]₅-Lys(ClZ)-BHA-Harz wurde wie in Beispiel 17(c) beschrieben behandelt, wodurch ungefähr 16,2 mg des Rohmaterials nach HF-Spaltung von 102,5 mg trockenem H-[Taeg]₂-A(Z)aeg-[Taeg]₅-Lys(ClZ)-BHA-Harz gewonnen wurden. Ein kleiner Anteil des Rohproduktes wurde gereinigt. Bezüglich (MH+)⁺ betrug der berechnete m/z-Wert 2050,85 und der gemessene m/z-Wert 2050,90.
(c) Syntheseprotokoll 6
(1) BOC-Deprotektion mit TFA/CH₂Cl₂ (1:1, v/v), 2 ml, 3 × 1 Minute und 1 × 30 Minuten; (2) Waschen mit CH₂Cl₂, 2 ml, 6 × 1 Minute; (3) Neutralisieren mit DIEA/CH₂Cl₂ (1:19, v/v), 2 ml, 3 × 2 Minuten; (4) Waschen mit CH₂Cl₂, 2 ml, 6 × 1 Minute, und Trocknen lassen für 1 Minute; (5) eine 2–5 mg-Probe des PNA-Harzes wurde entfernt und für eine quantitative Ninhydrin-Analyse gründlich getrocknet, um die Substitution zu bestimmen; (6) Hinzufügen von 0,44 mmol (0,23 g) BOC-A(Z)aeg-OH, gelöst in 1,5 ml CH₂Cl₂, gefolgt von einer Hinzufügung von 0,44 mmol (0,09 g) DCC in 0,5 ml an CH₂Cl₂ oder 0,33 mmol (0,13 g) BOC- Taeg-OH in 1,5 ml CH₂Cl₂, gefolgt von einer Hinzufügung von 0,33 mmol (0,07 g) DCC in 0,5 ml CH₂Cl₂; die Bindungsreaktion wurde für insgesamt weitere 20–24 Stunden unter Schütteln fortgeführt; (7) Waschen mit DMF, 2 ml, 1 × 2 Minuten; (8) Waschen mit CH₂Cl₂, 2 ml, 4 × 1 Minute; (9) Neutralisieren mit DIEA/CH₂Cl₂ (1:19, v/v), 2 ml, 2 × 2 Minuten; (10) Waschen mit CH₂Cl₂, 2 ml, 6 × 1 Minute; (11) eine 2–5 mg-Probe an geschütztem PNA-Harz wurde entnommen und für eine quantitative Ninhydrin-Analyse gründlich getrocknet, um das Ausmaß der Bindung zu bestimmen; (12) Blockieren der unreagierten Aminogruppen durch Acetylieren mit einer 25 ml-Mischung an Acidanhydrid/Pyridin/CH₂Cl₂ (1:1:2, v/v/v) über 2 Stunden (mit Ausnahme des letzten Zyklus); (13) Waschen mit CH₂Cl₂, 2 ml, 6 × 1 Minute; und (14) 2 × 2–5 mg-Proben an geschütztem PNA-Harz wurden entnommen, mit DIEA/CH₂Cl₂ (1:19, v/v) neutralisiert und mit CH₂Cl₂ für die Ninhydrin-Analysen gewaschen.
BEISPIEL 54
Hybridisierungsversuche
Das PNA-Oligomer H-T4C2TCT-LysNH₂ wurde gemäß dem Beispiel 51 beschriebenen Verfahren hergestellt. Die Hybridisierungsversuche mit dieser Sequenz sollten das Problem der Orientierung lösen, da es in Wahrheit asymmetrisch ist. Solche Versuche sollten auch Probleme der pH-Abhängigkeit vom T_m und der Stöichiometrie der gebildeten Komplexe lösen.
Die Hybridisierungsversuche mit den PNA-Oligomer H-T₄C₂TCTC-LysNH₂ wurden wie folgt durchgeführt:

§

= stoichiometrisch bestimmt durch UV-Mischkurven

–

= nicht bestimmt

Diese Ergebnisse zeigen, dass eine genau gemischte Sequenz zu gut-definierten Schmelzkurven führte. Die PNA-Oligomere können tatsächlich in beiden Orientierungen binden (vgl. Reihe 1 und 4), obwohl es hinsichtlich der N-Terminalen/5'-Orientierung einen Vorzug gibt. Das Einführen einer einzelnen Fehlanpassung gegenüber entweder T oder C verursachte ein Absenken des T_m bei mehr als 16°C bei einem pH-Wert von 7,2; bei einem pH-Wert von 5,0 wurde der T_m um mehr als 27°C abgesenkt. Dies zeigt, dass es einen sehr hohen Grad an Sequenz-Selektivität gibt, der ein allgemeines Merkmal aller PNA C/T-Sequenzen sein sollte.
Wie oben dargestellt, besteht eine sehr starke pH-Wert-Abhängigkeit für den T_m, was darauf hinweist, dass die Hoogsteen-Basenpaarung für die Bildung von Hybriden wichtig ist. Daher ist es nicht überraschend, dass die Stöchiometrie 2:1 betrug.
Das Fehlen der Symmetrie in der Sequenz und die starke Abnahme im T_m, wenn Fehlanpassungen vorhanden waren, zeigt, dass der Watson-Crick-Strang und der Hoogsteen-Strang parallel sind, wenn sie an komplementäre DNA gebunden sind. Dies ist der Fall für beide Orientierungen, d.h. 5'/N-Terminal und 3'/N-Terminal.
BEISPIEL 55
T_ms von PNA-Oligomere
Die Ergebnisse der Hybridisierungsversuche mit H-T₅GT₄-LysNH₂ betrugen wie folgt:
Wie durch Vergleichen der Reihen 1, 3 und 6 mit den Reihen 2, 4, 5 und 7 beobachtet werden, kann G – auf diese Weise – zwischen C/A und G/T im DNA-Strang unterscheiden, d.h. eine Sequenz-Unterscheidung wird beobachtet. Bezüglich des Komplexes in Reihe 3 wurde ferner durch UV-Mischungskurven festgestellt, dass dieser ein Komplex 2-PNA : 1-DNA war.
BEISPIEL 56
Synthese eines PNA-15-mer, enthaltend vier natürlich vorkommene Nucleobasen: H-[Taeg]-[Aaeg]-[Gaeg]-[Taeg]-[Taeg]-[Aaeg]-[Taeg]-[Caeg]-[Taeg]-[Caeg]-[Taeg]-[Aaeg]-[Taeg]-[Caeg]-[Taeg]-Lys-NH₂
Die geschützte PNA wurde an einem BOC-Lys(ClZ)-modifizierten MBHA-Harz mit einer Substitution von ungefähr 0,145 mmol/g aufgebaut. Das Schützen nur der ungebundenen Aminogruppen wurde vor Einbau des BOC-Gaeg-OH-Monomers durchgeführt.
Die Synthese wurde auf 100 mg (Trockengewicht) an neutralisiertem BOC-Lys(ClA)-MBHA-Harz initiiert, die zuvor über Nacht in DCM vorgequollen worden war. Der Einbau der Monomere wurde gemäß dem Protokoll von Beispiel 28 durchgeführt, mit Ausnahme an Schritt 5 bezüglich des Einbaus des BOC-Aaeg-OH-Monomers. Schritt 5 der vorliegenden Synthese beinhaltete das Hinzufügen von 4 Äquivalenten von Diisopropylcarbodiimid (0,06 mM, 9,7 μl) und 4 Äquivalenten an BOC-Aaeg-OH (0,06 mmol, 32 mg), gelöst in 0,6 ml DCM/DMF (1:1, v/v) (Endkonzentration des Monomers 0,1 M). Die Bindungsreaktion wurde für weitere 1 × 15 Minuten und 1 × 60 Minuten (Wiederbindung) fortgeführt.
Alle qualitativen Kaiser-Tests waren negativ (stroh-gelbe Farbe ohne Färbung der Kügelchen). Das PNA-Oligomer wurde gespalten und mittels des Standardverfahrens gereinigt. FAB-MS-Durchschnittsmasse festgestellt (berechnet) (M+H) 4145,1(4146,1).
BEISPIEL 57
Festphasensynthese von H-[Taeg]₂-Aaeg-Taeg-Caeg-Aaeg-Taeg-Caeg-Taeg-Caeg-Lys-NH₂
(a) Schrittweiser Aufbau von BOC-[Taeg]₂-A(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-A(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-Lys(ClZ)-MBHA-Harz
Ungefähr 1 g nasses BOC-Lys(ClZ)-MBHA (0,28 mmol Lys/g) Harz wurde in ein 5 ml SPPS-Reaktionsgefäß gegeben. Das BOC-[Taeg]₂-A(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-A(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-Lys(ClZ)-MBHA-Harz wurde durch in situ-DCC-Bindung der ersten fünf Reste zusammengefügt, und zwar unter Verwendung von 0,16 M an BOC-C[Z]-OH, BOC-Taeg-OH oder BOC-A(Z)aeg-OH, zusammen mit 0,16 M DCC in 2 ml an 50 % DMF/CH₂Cl₂ und durch analoge in situ- DIC-Bindung der letzten fünf Reste. Jede Bindungsreaktion wurde für insgesamt 20–24 Stunden unter Schütteln fortgeführt. Die Synthese wurde durch die Ninhydrin-Reaktion beobachtet, was einen beinahe quantitativen Einbau aller Reste mit Ausnahme des ersten A(Z)aeg-Rests zeigte, der zweimal gebunden werden musste. Die Gesamtbindungsausbeute betrug 96 % (erste Bindung, ca. 89 % Effizienz).
(b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]2-Aaeg-Taeg-Caeg-Aaeg-Taeg-Caeg-Taeg-Caeg-Lys-NH₂
Das geschützte BOC-[Taeg]2-A(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-A(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-Lys(ClZ)-MBHA-Harz wurde wie in Beispiel 17(c) beschrieben behandelt, was ungefähr 53,4 mg des Rohmaterials nach HF-Spaltung von 166,1 mg an trockenem BOC-[Taeg]2-A(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-A(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-Taeg-C(Z)aeg-Lys(ClZ)-MBHA-Harz ergab. Das Rohprodukt (53,4 mg) wurde gereinigt, wodurch sich 18,3 mg H-[Taeg]2-Aaeg-Taeg-Caeg-Aaeg-Taeg-Caeg-Taeg-Caeg-Lys-NH₂ ergab. Bezüglich (M+H)⁺ betrug der berechnete m/z-Wert 2780,17 und der gemessene m/z-Wert 2780,07.
BEISPIEL 58
Festphasensynthese von H-[Taeg]₅-Lys(ClZ)-MBHA-Harz
Das PNA-Oligomer wurde an 500 mg (Trockengewicht) MBHA-Harz aufgebaut, das über Nacht in DCM vorgequollen worden war. Das Harz wurde anfänglich mit ungefähr 0,15 mmol/g BOC-Lys(ClZ) substituiert, wie durch quantitative Ninhydrin-Reaktionen bestimmt wurde. Die schrittweise Synthese des Oligomers wurde wie in dem Syntheseprotokoll aus Beispiel 28 beschrieben durchge führt, wobei 0,077 g (0,2 mmol) BOC-Taeg-OH und 31,3 μl (0,2 mmol) Diisopropylcarbodiimid in 2 ml 50 % DMF/CH₂Cl₂ bei jeder Bindung eingesetzt wurden. Der Schutz der umgebundenen Aminogruppen wurde vor der Deprotektion in jedem Schritt durchgeführt. Alle qualitativen Kaiser-Tests waren negativ, was auf eine beinahe 100 %ige Bindungsausbeute hindeutete.
BEISPIEL 59
Synthese des Grundgerüstsanteils zur Vergrößerung des Maßstabs durch reduzierende Aminierung
(a) Herstellung von BOC-Aminoacetaldehyd
3-Amino-1,2-propandiol (80 g, 0,88 mol) wurde in Wasser (1500 ml) gelöst und die Lösung auf 4°C abgekühlt, wonach BOC-Anhydrid (230 g, 1,05 mol) in einem Anteil hinzugefügt wurde. Die Lösung wurde vorsichtig auf Raumtemperatur in einem Wasserbad erhitzt. Der pH-Wert wurde durch tropfweises Hinzufügen von Natriumhydroxid auf 10,5 gehalten. Im Laufe der Reaktion wurde insgesamt 70,2 g NaOH, gelöst in 480 ml Wasser, hinzugefügt. Nach Rühren über Nacht wurde Ethylacetat (1000 ml) hinzugefügt, die Mischung auf 0°C abgekühlt und der pH-Wert durch das Hinzufügen von 4 M Salzsäure auf 2,5 eingestellt. Die Ethylacetatschicht wurde entfernt und die saure wässrige Lösung mit weiterem Ethylacetat (8 × 500 ml) extrahiert. Die kombinierte Ethylacetatlösung wurde unter Verwendung eines Protektionsverdampfers auf ein Volumen von 1500 ml reduziert. Die resultierende Lösung wurde mit halb-gesättigtem Kaliumhydrogensulfat (1500 ml) und anschließend mit gesättigtem Natriumchlorid gewaschen. Anschließend wurde es über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockenheit verdampft. Ausbeute: 145,3 g (86 %).
3-BOC-Amino-1,2-propandiol (144,7 g, 0,757 mol) wurde in Wasser (750 ml) aufgenommen und Kaliumperiodat (191,5 g, 0,833 mol) hinzugefügt. Die Mischung wurde unter Stickstoff 2,5 Stunden gerührt und das ausgefallene Kaliumiodat durch Filtrieren entfernt und einmal mit Wasser gewaschen (100 ml). Die wässrige Phase wurde mit Chloroform (6 × 400 ml) extrahiert. Die Chloroformextrakte wurden getrocknet und im Vakuum zur Trockenheit verdampft. Aubeute: 102 g (93 %) eines Öls. BOC-Aminoacetaldehyd wurde durch Kugelrohr-Destillation bei 84°C und 0,3 mmHg in zwei Portionen gereinigt. Ausbeute: 79 g (77 %) als ein farbloses Öl.
(b) Herstellung von (N'-BOC-Aminoethyl)glycinmethylester
Palladium auf Kohlenstoff (10 %, 2,00 g) wurde zu einer Lösung aus BOC-Aminoacetaldehyd (10 g, 68,9 mmol) in Methanol (150 ml) bei 0°C hinzugefügt. Natriumacetat (11,3 g, 138 mmol) in Methanol (150 ml) sowie Glycinmethylesterhydrochlorid (8,65 g, 68,9 mmol) in Methanol (75 ml) wurden hinzugefügt. Die Mischung wurde bei atmosphärischem Druck 2,5 Stunden hydriert, anschließend durch Celit gefiltert und im Vakuum zur Trockenheit verdampft. Das Material wurde in Wasser (150 ml) gelöst und der pH-Wert mit 0,5 N NaOH auf 8 eingestellt. Die wässrige Lösung wurde Methylenchlorid (5 × 150 ml) extrahiert. Die kombinierten Extrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockenheit verdampft. Dies ergab eine Ausbeute von 14,1 g (88 %) des (N'-BOC-Aminoethyl)glycinmethylester. Das rohe Material wurde durch Kugelrohr-Destillation bei 120°C und 0,5 mm Hg gereinigt, wodurch 11,3 g (70 %) eines farblosen Öls gewonnen wurden. Das Produkt wies eine Reinheit auf, die höher war als die des in Beispiel 26 hergestellten Materials, was durch tlc-Analyse (10 % Methanol in Methylenchlorid) bestimmt wurde.
Alternativ kann Natriumcyanborwasserstoff anstelle von Wasserstoff (mit Pd(C) als Katalysator) als Reduktionsmittel eingesetzt werden, obwohl die Ausbete (42 %) niedriger war.
(b) Herstellung von (N'-BOC-Aminoethyl)glycinethylester
Die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde mit dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt, wobei Glycinethylesterhydrochlorid mit Glycinmethylesterhydrochlorid ersetzt wurde. Ferner war das eingesetzte Lösungsmittel Ethanol. Die Ausbeute war 78 %.
BEISPIEL 60
Festphasensynthese von H-Tyr-[Taeg]₁₀-Lys-NH₂
(a) Schrittweiser Aufbau von BOC-Tyr(BrZ)-[Taeg]₁₀-Lys(ClZ)-MBHA-Harz
Ungefähr 0,2 g an nassem BOC-[Taeg]₁₀-Lys(ClZ)-MBHA-Harz wurde in ein 5 ml SPPS-Reaktionsgefäß gegeben. BOC-Tyr(BrZ)-[Taeg]₁₀-Lys(ClZ)-MBHA-Harz wurde durch eine Standard-in situ-DCC-Bindung aufgebaut, und zwar über Nacht, unter Verwendung von 0,32 M an BOC-CTyr(BrZ)-OH, zusammen mit 0,32 M DCC in 3 ml saugerem CH₂Cl₂. Die Ninhydrin-Reaktion zeigte einen Einbau von ungefähr 97 % von BOC-Tyr(BrZ).
(b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-Tyr-[Taeg]₁₀-Lys-NH₂
Das geschützte BOC-Tyr(BrZ)-[Taeg]₁₀-Lys(ClZ)-MBHA-Harz wurde wie in Beispiel 17(c) beschrieben, behandelt, was ungefähr 5,5 mg des Rohmaterials nach HF-Spaltung von 20,7 mg an trockenem H-Tyr(BrZ)-[Taeg]₁₀-Lys(ClZ)-MBHA-Harz ergab. Das Rohprodukt wurde gereinigt, was 2,5 mg an H-Tyr-[Taeg]₁₀-Lys-NH₂ ergab.
BEISPIEL 61
Festphasensynthese von Dansyl-[Taeg]₁₀-Lys-NH₂
(a) Schrittweiser Aufbau von Dansyl-[Taeg]₁₀-Lys(ClZ)-MBHA-Harz
Ca. 0,3 g des nassen BOC-[Taeg]₁₀-Lys(ClZ)-MBHA-Harz wurden in ein 5 ml SPPS-Reaktionsgefäß gegeben. Dansyl-[Taeg]₁₀-Lys(ClZ)-MBHA-Harz wurde durch Bindung von 0,5 M Dansyl-Cl in 2 ml Pyridin über Nachr gebunden. Die Ninhydrin-Reaktion zeigte einen Einbau der Dansyl-Gruppe von ungefähr 95 5.
(b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von Dansyl-[Taeg]₁₀-Lys-NH₂
Das geschützte Dansyl-[Taeg]₁₀-Lys(ClZ)-MBHA-Harz wurde wie in Beispiel 17(c) behandelt, das ungefähr 12 mg des Rohmateri als nach HF-Spaltung von 71,3 mg trockenem Dansyl-[Taeg]₁₀-Lys(ClZ)-MBHA-Harz ergab. Das Rohprodukt wurde gereinigt, wodurch 5,4 mg Dansyl-[Taeg]₁₀-Lys-NH₂ gewonnen wurden.
BEISPIEL 62
Festphasensynthese von H-[Taeg]₃-Caeg-[Taeg]₄-NH₂
(a) Schrittweiser Aufbau von BOC-[Taeg]₃-C(Z)aeg-[Taeg]₄-MBHA-Harz
Ungefähr 0,2 g des oben erwähnten MBHA-Harzes wurden in ein 5 ml SPPS-Reaktionsgefäß gegeben und neutralisiert. BOC-[Taeg]₃-C(Z)aeg-[Taeg]₄-MBHA-Harz wurde durch in situ-DCC-Einfachbindung des C(Z)aeg-Restes aufgebaut, unter Verwendung von 0,13 M BOC-C[Z]aeg-OH, zusammen mit 0,13 M DCC in 2,5 ml 50 % DMF/CH₂Cl₂ und durch Verbinden der Taeg-Reste mit 0,13 M BOC-Taeg-OPfp in 2,5 ml CH₂Cl₂. Jede Bindungsreaktion wurde durch Schütteln über Nacht fortgeführt. Die Synthese wurde durch die Ninhydrin-Reaktion beobachtet, was einen nahezu quantitativen Einbau aller Reste zeigte.
(b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]₃-Caeg-[Taeg]₄-NH₂
Das geschützte BOC-[Taeg]₃-C(Z)aeg-[Taeg]₄-MBHA-Harz wurde wie in Beispiel 17(c) beschrieben behandelt, was ungefähr 44,4 mg des Rohmaterials nach HF-Spaltung von ungefähr 123 mg des trockenen H-[Taeg]₃-C(Z)aeg-[Taeg]₄-MBHA-Harzes ergab. Das Rohprodukt (11 mg) wurde gereinigt, wodurch 3,6 mg H-[Taeg]₃-Caeg-[Taeg]₄-NH₂ erzielt wurden.
BEISPIEL 63
Festphasensynthese von H-[Taeg]₂-Caeg-[Taeg]₂-Caeg-[Taeg]₄-Lys-NH₂
a) Schrittweiser Aufbau von BOC-[Taeg]₂-C(Z)aeg-[Taeg]₂-C(Z)aeg-[Taeg]₄-Lys(ClZ)-MBHA-Harz
Ungefähr 0,3 g des nassen H-[Taeg]₂-C(Z)aeg-[Taeg]₄-Lys(ClZ)-MBHA-Harzes aus der vorherigen Synthese von BOC-[Taeg]₅-C(Z)aeg-[Taeg]₄-Lys(ClZ)-MBHA-Harz wurde in ein 5 ml SPPS-Reaktionsgefäß gegeben. Nach fünfmaligem Binden der nächsten Reste wurde ein Gesamteinbau von BOC-C(Z)aeg von 87 % erhalten. Die fünf wiederholten Bindungen wurden mit 0,18 M BOC-C(Z)aeg-OPfp in 2 ml TFE/CH₂Cl₂ (1: 2, v/v), 2 ml von TFE/CH₂Cl₂ (1:2, v/v), 2 ml TFE/CH₂Cl₂ 1:2, v/v) mit zwei Tropfen Dioxanund zwei Tropfen DIEA (diese Bedingung erzielte lediglich nur wenige Prozent Bindungsausbeute), 2 ml TFE/CH₂Cl₂ (1:2 v/v) plus 0,5 g Phenol und 1 ml CH₂Cl₂ plus 0,4 g Phenol durchgeführt. Die zwei letzten Taeg-Reste wurden beinahe quantitativ durch Doppelbindungen mit 0,25 M BOC-Taeg-OPfp in 25 % Phenol/Ch₂Cl₂. Alle Bindungen über Nacht durchgeführt.
(b) Spaltung, Reinigung und Identifizierung von H-[Taeg]₂-Caeg-[Taeg]₂-Caeg-[Taeg]₄-Lys-NH₂
Das geschützte BOC-[Taeg]₂-C(Z)aeg-[Taeg]₂-C(Z)aeg-[Taeg]₄-Lys(ClZ)-MBHA-Harz wurde wie in Beispiel 17(c) beschrieben behandelt, was ungefähr 7 mg des Rohmaterials nach HF-Spaltung von 80,7 mg des trockenen H-[Taeg]₂-C(Z)aeg-[Taeg]₂-C(Z)aeg-[Taeg]₄-Lys(ClZ)-MBHA-Harzes ergaben. Das Rohprodukt wurde gereinigt, wodurch 1,2 mg H-[Taeg]₂-Caeg-[Taeg]₂-Caeg-[Taeg]₄-Lys-NH₂ (> 99,9 % Reinheit) gewonnen wurden.
BEISPIEL 64
Alternative Schutzgruppenstrategie für die PNA-Synthese
(a) Synthese der Testverbindungen
2-Amino-6-O-benzyl-purin:
Zu einer Lösung von 2,5 g (0,109 mol) Natrium in 100 ml Benzylalkohol wurde 10,75 g (0,063 mol) an 2-Amino-6-Chlorpurin hinzugefügt. Die Mischung wurde bei 120°C 2 Stunden lang gerührt. Die Lösung wurde anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Essigsäure neutralisiert, sowie mit 10 Anteilen 50 ml 0,2 N Natriumhydroxid extrahiert. Die gesammelten Natriumhydroxidphasen wurden mit 100 ml Diethylether gewaschen und mit Essigsäure neutralisiert, wodurch das Ausfällen initiiert wurde. Die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt, und das gelbliche Präzipitat durch Filtrierung gesammelt. Umkristallisieren aus Ethanol erzielte 14,2 g (92 %) an reinen weißen Kristallen der Zielverbindung. ¹H-NMR (250 MHz, DMSO-d₆) δ: 7,92 (h); 7,60-7,40 (Benzyl-aromatisch); 6,36 (2-NH₂); 5,57 (Benzyl-CH₂).
(2-Amino-6-O-benzylpurinyl)methylethanoat:
Eine Mischung aus 5 g (0,0207 mol) von 2-Amino-6-O-benzylpurin, 30 ml an DMF und 2,9 g (0,021 mol) an Kaliumcarbonat wurden bei Raumtemperatur gerührt. Methylbromacetat (3,2 g, 1,9 ml, 0,0209 mol) wurde tropfenweise hinzugefügt. Die Lösung nach 4 Stunden filtriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck (4 mm Hg, 40°C) entfernt. Der Rest wurde zweimal aus Ethylacetat umkristalli siert, wodurch 3,7 g (57 %) der Zielverbindung gewonnen wurden. ¹H-NMR (250 MHz, DMSO-d₆) δ: 7,93 (8H); 7,4-7,6 (Benzyl-aromatisch); 6,61 (2-NH₂); 5,03 (Benzyl-CH₂); 5,59 (CH₂); 3,78 (OCH₃).
(2-N-p-Toluolsulfonamido-6-O-benzylpurinyl)methylethanoat:
Zu einer Lösung von 0,5 g (1,5 mmol) an (2-Amino-6-O-benzylpurinyl)methylethanoat in 25 ml Methylenchlorid wurde 0,53 g (1,62 mmol) an p-Toluolsulfonsäureanhydrid und 0,22 g (1,62 mmol) Kaliumcarbonat hinzugefügt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde die Mischung gefiltert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck (15 mm Hg, 40°C) entfernt. Zu dem öligen Rest wurde Diethylether hinzugefügt. Die resultierende Lösung wurde über Nacht gerührt, wodurch die Zielverbindung (0,415 mg, 55 %) ausfielen, und welche durch Filtrieren gesammelt wurde. ¹H-NMR (250 MHz, DMSO-d₆) δ: 8,97 (8H); 7,2-7,8 (aromatisch); 5,01 (Benzyl-CH₂); 4,24 (CH₂); 3,73 (OCH₃); 2,43 (CH₃).
(b) Stabilität des Tosyl-geschützten Basenrest in TFA und HF
Das Material wurde den Standards-Deprotektionsbedingungen unterzogen (RFA-Deprotektion) und den letzten Spaltungsbedingungen mit HF. Anschließend wurden die Produkte einer HPLC-Analyse unter Verwendung von 4 μ RCM 8 × 10 Novapack-Säule und in Lösungsmitteln A (0,1 % TFA in Wasser) und B (0,1 % TFA in Acetonitril) unterzogen, und zwar nach dem folgenden Zeitgradienten mit einem Fluss von 2 ml/Minute.
Die folgenden Retentionszeiten wurden beobachtet: (a) Verbindung 1: 30,77 Minuten; (b) Verbindung 2: 24,22 Minuten, und (c) Verbindung 3: 11,75 Minuten. Die Analyse zeigte, dass die O⁶-Benzylgruppe sowohl durch TFA als auch durch HF entfernt wurde, wohingegen es keine Spaltung der Tosyl-Gruppe in TFA gab, jedoch eine quantitative Entfernung in HF, unter den Standardsspaltungsbedingungen.
BEISPIEL 65
Synthese von 5-Bromuracil-N¹-Methylacetat
5-Bromuracil (5 g, 26,2 mmol) und Kaliumcarbonat (7,23 g, 52, 3 mmol) wurden in DMF (75 ml) aufgenommen. Methylbromacetat (2,48 ml, 26,1 mmol) wurde über einen Zeitraum von 5 Minuten hinzugefügt. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt und anschließend filtriert. Der feste Rest wurde zweimal mit DMF gewaschen und die kombinierten Filtrate im Vakuum zur Trockenheit verdampft. Der Rest stellte ein Öl dar, das die in der Überschrift angegebene Verbindung enthielt, sowie DMF und einige unidentifizierte Unreinheiten. Es war nicht notwendig, die in der Überschrift angegebene Verbindung vor der Hydrolyse zu reinigen. ¹H-NMR (DMSO-d₆, 250 MHz) δ: 8,55 (Unreinheit); 8,27 (CBr=CHN); 8,02 (Unreinheit); 4,76 (Unreinheit); 4,70 (Unreinheit); 4,62 (NCH ₂COOCH₃); 3,78 (COOCH ₃); 2,96 (DMF); 2,80 (DMF). ¹³C-NMR (DMSO-d₆, 250 MHz) ppm; 168,8 (COOCH₃); 172,5 (CH=CBrCON); 161,6 (DMF); 151,9 (NCON); 145,0 (CO-CBr=CHN); 95,6 (COCBr=CHN); 52,6 (Unreinheit); 52,5 (OCH₃); 49,7 (Unreinheit); 48,8 (NCH₂COOMe); 43,0 (Unreinheit); 36,0 (DMF). UV(Methanol; nm_max); 226; 278. IR (KBr; cm^–1_; 3158s (_NH); 1743vs (_C=O, COOMe); 1701vs (_C=O, CONH); 1438vs (∂ CH, CH₃O); 1223vs (_C-O, COOMe); 864 m (∂ CH, Br=C-H). FAB-MS m/z (Zuordnung); 265/263 (M+H).
BEISPIEL 66
Synthese von (5-Bromuracil)essigsäure
Zu dem Öl des Rohprodukts aus Beispiel 65 wurde Wasser (30 ml) hinzugefügt und die Mischung durch Hinzufügen von Natriumhydroxid (2 M, 60 ml) gelöst. Nach 10-minütigem Rührem bei 0°C wurde Salzsäure (4 M, 45 ml) hinzugefügt, um den pH-Wert der Lösung auf 2 einzustellen, wodurch die in der Überschrift angegebene Verbindung ausfällte. Nach 50 Minuten wurde der feste Rest durch Filtrieren isoliert, einmal mit kaltem Wasser gewaschen und im Vakuum über Sicapent getrocknet. Ausbeute: 2,46 g (38 %). Schmelzpunkt 250°–251°C. Analyse für C₆H₅BrN₂O₄ festgestellt (berechnet): C: 28,78(28,94); H: 2,00(2,02); Br: 32,18(32,09); N: 11,29(11,25). ¹H-NMR (DMSO-d₆, 250 MHz) δ: 12,55 (1H, s, COOH); 11,97 (1H, s, NH); 8,30 (1H, s, C=C-H); 4,49 (2H, s, NCH ₂COOH). ¹³C-NMR (DMSO-d₆, 250 MHz) ppm: 169,4 (COOH); 159,8 (NHCOCBr=CH); 150,05 (NCON); 145,8 (COCBr=CHN); 94,6 (COCBr=CHN); 48,8 (NCH₂COOH). UV (Methanol; nm_max); 226; 278. IR (KBr; cm^–1); 3187s (_NH); 1708vs (_C=O,COOH); 1687vs; 1654VS (_C=O, CONH); 1192s (_C-O, COOH); 842 m (∂ CH, Br-C=C-H). FAB-MS m/z (Zuordnung, relative Intensität); 251(249 (M+H, 5).
BEISPIEL 67
Synthese von N-(BOC-Aminoethyl)-N-(5-bromuracil)methylencarbonoylglycinethylester
BOC-Aminoethylglycinethylester (1,8 g, 7,30 mmol) wurde in DMF (10 ml) gelöst. Dhbt-OH (1,31 g, 8,03 mmol) wurden hinzugefügt, wodurch sich ein Präzipitat bildete. DMF (2 × 10 ml) wurde hinzugefügt, bis sich das Präzipitat gelöst hatte. Das Produkt des Beispiels 66 (2 g, 8,03 mmol) wurde langsam hinzugefügt, um ein Ausfällen zu vermeiden. Es wurde Methylenchlorid (30 ml) hinzugefügt, und die Mischung auf 0°C abgekühlt sowie anschließend gefiltert. Das Präzipitat (DCU) wurde zweimal mit Methylenchlorid gewaschen. Zu den kombinierten Filtraten wurde Methylenchlorid (100 ml) hinzugefügt. Die Mischung wurde mit 3 × 100 ml halb-gesättigter NaHCO₃-Lösung (H₂O: gesättigte NaHCO₃-Lösung, 1:1, v/v), anschließend mit 2 × 100 ml verdünnter KHSO₄-Lösung (H₂O: gesättigte KHSO₄-Lösung, 4:1, v/v) und schließlich gesättigter NaCl-Lösung (1 × 100 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum zur Trockenheit verdampft (ungefähr 15 mm Hg und anschließend ungefähr 1 mm Hg). Der Rest wurde in Methylenchlorid (35 ml) aufgenommen, für 45 Minuten bei Raumperatur gerührt und das DCU anschließend gefiltert. Petrolether (2 Volumen) wurde zu dem Filtrat bei 0°C tropfenweise hinzugefügt, wodurch ein Öl ausfiel. Die Flüssigkeit wurde dekantiert und das verbleibende Öl in Methylenchlorid (20–50 ml) gelöst. Ein Ausfällen wurde durch Hinzufügen von Petrolether (2 Volumen) bewirkt. Dieses Verfahren wurde fünfmal wiederholt, bis eine Unreinheit beseitigt war.
Die Unreinheit kann mittles tlc mit 10 % MeOH/CH₂Cl₂ als Entwicklungslösungsmittel beobachtet werden. Das resultierende Öl wurde in Methylenchlorid (25 ml) gelöst und im Vakuum zur Trockenheit verdampft, wodurch sich die in der Überschrift angegebene Verbindung verfestigte. Ausbeute: 2,03 g (58 %). Schmelzpunkt 87°–90°C. Analyse für C₁₇H₂₅BrN₄O₇ festgestellt (berechnet): C: 42,33(42,78); H: 5,15(5,28); Br: 17,20(16,74); N: 1,69(11,74). ¹H-NMR (DMSO-d₆, 250 MHz, J in Hz) δ: 1,93 & 11,92 (1H, s, C=ONHC=O); 8,09 & 8,07 (1H, s, C=C-H); 7,00 & 6,80 (1H, t, BOC-NH); 4,80 & 4,62 (2H, s, NCH ₂CON); 4,35 & 4,24 (2H, s, NCH ₂COOEt); 4,27-4,15 (2H, m, COOCH ₂CH₃O); 3,47-3,43 (2H, m, BOC-NHCH₂CH ₂N); 3,28-3,25 & 3,12-3,09 (2H, m, BOC-NHCH ₂CH-₂N): 1,46 & 1,45 (9H, s, t-Bu); 1,26 & 1,32 (3H, t, J = 7,1, COOCH₂CH ₃). ¹³C-NMR (DMSO-d₆, 250 MHz) ppm: 169,3 & 169,0 (t-BuOC=O); 167,4 & 167,1 (COOEt); 159,8 (C=C-CON); 155,9 (NCH₂ CON); 150,4 (NCON); 145,9 (COCBr-CHN); 94,5 (COCBr=CHN); 78,2 (Me₃ C); 61,3 & 60,7 (COCH₂CH₃); 49,1 & 48,0 (NCH₂COOH); 48,0 & 47,0 (NCH₂CON); 38,6 (BocNHCH₂ CH₂N); 38,2 (BocNHCH₂CH₂N); 26,3 (C(CH₃)₃); 14,1 (COCH₂ CH₃). UV (Methanol; _maxNM): 226; 280. IR (KBr, CM^–1): 3200ms, breit (_NH); 168vs, vbreit (C_C=O, COOH, CONH); 1250s (_C-O, COOEt); 1170s (_C-O, COOt-BU); 859 m (∂ CH, Br-C=C-H). FAB-MS m/z (Zuordnung, relative Intensität): 479/477 (M+H, 5); 423/421 (M+2H-t-Bu, 8); 379/377 (M+2H-Boc, 100); 233/231 (M – Grundgerüst, 20).
BEISPIEL 68
Synthese von N-(BOC-Aminoethyl)-N-(5-Bromuracyl-N¹-Methylencarbonyl)glycin
Das Produkt aus Beispiel 67 (1,96 g, 4,11 mmol) wurde in Methanol (30 ml) durch Erhitzen gelöst, und anschließend auf 0°C abgekühlt. Anschließend wurde Natriumhydroxid (2 M, 30 ml) hinzugefügt und die Mischung 30 Minuten lang gerührt. HCl (1 M, 70 ml) wurde für einen pH-Wert von pH 2 hinzugefügt. Die Wasserphase wurde mit Ethylacetat (3 × 65 ml + 7 × 40 ml) extrahiert. Die kombinierten Ethylacetatextrakte wurden mit gesättigter NaCl-Lösung (500 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, gefiltert und im Vakuum zur Trockenheit verdampft. Ausbeute: 1,77 g (96 %). Schmelzpunkt 92–97°C. Analyse für C₁₅H₂₁BrN₄O₇ festgestellt (berechnet): C: 40,79(40,10); H: 5,15(4,71); Br: 14,64(17,70); N: 11,35(12,47). ¹H-NMR (DMSO-d₆, 250 MHz, J in Hz) δ: 12,83 (1H, s, COOH); 11,93 & 11,91 (1H, s, C=ONHC=O); 8,10 & 8,07 (1H, s, C=C-H); 7,00 & 6,81 (1H, t, BOC-NH); 4,79 % 4,61 (2H, s, NCH ₂CON); 4,37 & 4,25 (''H, s, NCH ₂COOH); 3,46-3,39 (2H, m, BOC-NHCH₂CH ₂N); 3,26-3,23 & 3,12-3,09 (2H, m, BOC-NHCH ₂CH₂N); 1,46 (9H, s, t-Bu). ¹³C-NMR 9DMSO-d₆ 250 MHz) ppm: 170,4 (t-BuOC=O); 166,9 (COOH); 158,7 (C=C-CON); 155,8 (NCH₂ CON); 150,4 (NCON); 145,9 (COBr=CHN); 94,4 (COCBr=CHN); 78,1 (Me₃ C); 49,1 & 48,0 (NCH₂COOH); 47,7 & 47,8 (NCH₂CON); 38,6 (BOC-NHC₂ CH₂N); 28,2 (C(CH₃)₃). UV (Methanol; nm_max); 226; 278. IR (KBr, cm^–1): 3194 ms, breit (_NH); 1686vs, vbreit (_C=O COOH, CONH); 1250s (_C-O,COOH); 1170s (_C-O,COOt-Bu); 863m (∂ CH, Br-C=C-H). FAB-MS m/z (Zuordnung, relative Intensität): 449/451 (M+H, 70); 349/351 (M+2H-BOC, 100); 231/233 (M – Grundgerüst, 20).
BEISPIEL 69
Synthese von Uracil-N¹-methylacetat
Uracil (10 g, 89,2 mmol) und Kaliumcarbonat (24,7 g, 178 mmol) wurden in DMF (250 ml) aufgenommen. Methylbromacetat (8,45 mol, 89,2 mmol) wurden über einen Zeitraum von 5 Minuten hinzugefügt. Die Suspension wurde unter Stickstoff über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und anschließend filtriert. Eine Dünnschichtchromatographie (10 % Methanol in Ethylenchlorid) zeigte eine unvollständige Umwandlung von Uracil. Der feste Rest wurde zweimal mit DMF gewaschen, und die kombinierten Filtrate im Vakuum zur Trockenheit verdampft. Das Präzipitat wurde in Wasser (60 ml) aufgenommen und HCl (2,5 ml, 4 M) hinzugefügt (pH 2). Die Suspension wurde 30 Minuten lang bei 0°C gerührt und anschließend filtriert. Die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde mit Wasser gewaschen und im Vakuum über Sicapent getrocknet. Ausbeute: 9,91 g (60 %). Schmelzpunkt 182–183°C. Analyse für C₆H₈N₂O₄ festgestellt (berechnet): C: 45,38(45,66); H: 4,29(4,38); N: 15,00(15,21). ¹H-NMR (DMSO-d₆, 250 MHz, J in Hz) δ: 1,47 (1H, s, NH); 7,68 (1H, d, J_H-C=C-H = 7,9), CH=CHN); 5,69 (1H, d, J_H-C=C-H = 7,9, CH=CHN); 4,59 (2H, s, NCH ₂COOMe); 3,76 (3H, s, COOCH ₃), ¹³C-NMR (DMSO-d₆, 250 MHz) ppm: 168,8 (COOMe); 164,0 (C=C-CON); 151,1 (NCON); 146,1 (COCH=CHN); 101,3 (COCH=CHN); 52,5 (COOCH₃); 48,7 (NCH₂COOMe). UV (Methanol; nm_max); 226; 261. IR (KBr, cm^–1): 3164 s (_NH); 1748vs (_C=O, COOMe); 1733vs (_C=O, CONH); 1450vs (∂ CH, CH₃O); 1243VS (_C-O,COOMe); 701m (∂ CH, H-C=C-H). FAB-MS m/z (Zuordnung); 185 (M+H).
BEISPIEL 70
Synthese von Uralcilessigsäure
Wasser (90 ml) wurde zu dem Produkt aus Beispiel 69 (8,76 g, 47,5 mmol) hinzugefügt, gefolgt von Natriumhydroxid (2 M, 40 ml). Die Mischung wurde 40 Minuten lang erhitzt, bis sämtlicher Methylester reagiert hatte. Nach 15-minütigem Rühren bei 0°C wurde Salzsäure (4 M, 25 ml) hinzugefügt (pH 2). Die in der Überschrift angegebene Verbindung fiel aus und die Mischung wurde nach 2–3 Stunden filtriert. Das Präzipitat wurde einmal mit der Stammflüssigkeit und zweimal mit kaltem Wasser gewaschen und im Vakuum über Sicapent getrocknet. Ausbeute: 6,66 g (82 %). Schmelzpunkt 288°–289°C. Analyse für C₆H₆N₂O₄ festgestellt (berechnet): C: 42,10 (42,36); H: 3,43 (3,55); n: 16,25 (16,47)/¹H-NMR (DMSO-d₆), 250 MHz, J in Hz) δ: 13,19 (1H, s, COOH); 11,41 (1H, s, NH); 7,69 (1H, d, J_H-C=C-H = 7,8, J_H-C-C-N-H = 2,0, COOCH=CHN); 4,49 (2H, s, NCH ₂COOH). ¹³C-NMR (DMSO-d₆, 2509 MHz) ppm: 169,9 (COOH); 163,9 (CH=CHCON); 151,1 (NCON); 151,1 (NCON); 146,1 (COCH=CHN); 100,9 (COCH=CHN); 48,7 NCH ₂COOH. UV (Methanol; nm_max): 246; 264. IR (KBr; cm^–1): 3122s (_NH); 1703vs (_C=O, COOH); 1698vs, 1692vs (_C=O, CONH); 1205s (_C-O,COOH); 676 (∂ CH, H-C=C-H). FAB-MS m/z (Zuordnung): 171 (M+H).
BEISPIEL 71
Synthese von N-(BOC-Aminoethyl)-N-(uracil-N¹-methylen-carbonyl)glycinethylester
(BOC-Aminoethyl)glycinethylester (2 g, 8,12 mmol) wurde in DMF (10 ml) gelöst. Dhbt-OH (1,46 g, 8,93 mmol) wurde hinzugefügt und ein Präzipitat bildete sich. DMF (2 × 10 ml) wurde hinzugefügt, bis sich alles gelöst hatte. Das Produkt aus Beispiel 70 (1,52 g, 8,93 mmol) wurde langsam hinzugefügt, um ein Ausfällen zu vermeiden. Methylenchlorid (30 ml) wurde hinzugefügt und die Mischung auf 0°C abgekühlt, wonach DDC (2,01 g, 9,74 mmol) hinzugefügt wurde. Die Mischung wurde 1 Stunde lang bei 0°C gerührt, anschließend 2 Stunden bei Raumtemperatur sowie filtriert. Das ausgefallene DCU wurde zweimal mit Methylenchlorid gewaschen. Methylenchlorid wurde zu den kombinierten Filtraten hinzugefügt (100 ml) und die Lösung mit 3 × 100 ml halb-gesättigter NaHCO3-Lösung (H₂O: gesättigte NaHCO₃-Lösung, 1:1, v/v), anschließend mit 2 × 100 ml verdünnter KHSO₄-Lösung (H₂O: gesättigte KHSO₄-Lösung, 4:1, v/v) und schließlich mit gesättigter NaCl-Lösung (1 × 100 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum zur Trockenheit verdampft (ungefährt 15 mm Hg und anschließend ungefähr 1 mm Hg). Der Rest wurde in Methylenchlorid (32 ml) aufgenommen und 35 Minuten bei Raumtemperatur sowie 30 Minuten bei 0°C gerührt und anschließend filtriert. Das Präzipitat (DCU) wurde mit Methylenchlorid gewaschen. Anschließend Petrolether (2 Volumen) tropfenweise zu dem kombinierten Filtrat bei 0°C hinzugefügt, wodurch sich das Öl trennte. Die Mischung wurde dekantiert, das zurückbleibende Öl in Methylenchlorid (20 ml) gelöst und anschließend wieder durch Hinzufügen von Petrolether (2 Volumen) ausgefällt. Dieses Verfahren wurde fünfmal wiederholt, bis eine Unreinheit entfernt war. Die Unreinheit konnte durch tlc mit 10 % MeOH/CH₂Cl₂ als Entwicklungslösungsmittel beobachtet werden. Das resultierende Öl wurde in Methylenchlorid (20 ml) gelöst und im Vakuum zur Trockenheit verdampft, wodurch die in der Überschrift angegebene Verbindung verfestigt wurde. Ausbeute: 1,71 g (53 %), Schmelzpunkt 68,5°–75,7°C. Analyse für C₁₇H₂₆N₄O₇. Festgestellt (berechnet): C: 50,61(51,25); H: 6,48(6,58); N: 13,33(14,06). ¹H-NMR (DMSO-d₆, 250 MHz, J in Hz) δ: 11,36 (1H, s, C=ONHC=O); 7,51 & 7,47 (1H, d, J_H-C=C-H + 6,1; COCH=X-H); 7,00 & 6,80 (1H, t, BOC-NH); 5,83 & 5,66 (1H, d, J_H-C=C-H = 5,7, COCH=CH); 4,78 & 4,60 (2H, s, NCH ₂CON); 4,37 & 4,12 (2H, s, NCH ₂COOEt); 4,30-4,15 (2H, m, COOCH ₂CH₃); 3,49-3,46 (2H, m, BOC-NHCH₂CH ₂n); 3,27 3,23 & 3,11-3,09 (2H, m, BOC-NHCH ₂CH₂N; 1,46 (9H, s, t-Bu); 1,39-1,23 (3H, m, COOCH₂CH ₃), ¹³C-NMr (DMSO-d₆, 250 MHz) ppm: 169,4 & 169,0 (t-BuOC=O); 167,6 & 167,3 (COOEt); 163,8 (CH=CHCON); 155,8 (NCH₂ CON); 151,0 (NCON); 146,3 (COCH=CHN); 100,8 (COCH=CHN); 78,1 (Me₃ C); 61,2 & 60,6 (COOCH₂CH₃); 49,1 (NCH₂COOEt); 47,8 & 47,0 (NCH₂CON); 38,6 (BOC-NHCH₂ CH₂N); 38,1 & 37,7 (BOC-NHCH₂N); 28,2 (C(CH₃)₃); 14,1 (CO-OCH₂ CH₃. UV (Methanol; _maxnm); 226; 264. IR (KBr; cm^–1): 3053m (_NH); 1685vs, vbreit (_C=O, COOH, CONH); 1253s (_C-O, COOEt); 1172s (_C-O, COOt-Bu); 718w (∂ CH, C-C-C-H), FAB-MS m/z (Zuordnung, relative Intensität); 399 (M+H, 35); 343 (M+2H-t-Bu, 100); 299 (M+2H-BOC, 100); 153 (M-Grundgerüst, 30).
BEISPIEL 72
Synthese von N-(BOC-Aminoethyl)-N-(uracilmethylen-carbonyl)glycin
Das Produkt aus Beispiel 71 (1,56 g, 3,91 mmol) wurde in Methanol (20 ml) gelöst und anschließend auf 0°C abgekühlt. Natriumhydroxid (2 M, 20 ml) wurde hinzugefügt und die Mischung für 75 Minuten bei 0°C gerührt. Salzsäure (1 M, 46 ml) wurde hinzugefügt (pH 2). Die wässrige Phase wurde mit Ethylacetat (3 × 50 ml + 7 × 30 ml) extrahiert. Die kombinierten Ethylacetatextrakte wurden mit gesättigter NaCol-Lösung (360 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum zur Trockenheit verdampft. Der Rest wurde in Methanol gelöst und im Vakuum zur Trockenheit ver dampft. Ausbeute: 0,55 g (38 %). Schmelzpunkt 164°–170°C. Analyse für C₁₅H₂₂N₄O₇ festgestellt (berechnet): C: 46,68(48,65); H: 6,03(5,99); N: 1461(15,13). ¹H-NMR (DMSO-d₆, 250 MHz, J in Hz) δ: 12,83 (1H, s, COOH); 11,36 (1H, s, C=ONHC=O); 7,52-7,45 (1H, m, COCH=CHN); 7,00 & 6,82 (1H, t, BOC-NH); 5,67-5,62 (1H, m, COCH=CHN); 4,76 & 4,58 (2H, s, NCH₂CON); 4,26 & 4,05 (2H, s, NCH ₂COOH); 3,46-3,39 (2H, m, BOCNHCH₂CH ₂N); 3,25-3,23 & 3,15-3,09 (2H, m, BOCNHCH ₂CH₂N); 1,46 (9H, s, t-Bu). ¹³C-NMR (DMSO-d₆, 250 MHz) ppm: 170,5 (t-BuOC); 167,2 (COOH); 163,9 (C=CCON); 155,8 (NCH₂ CON); 151,1 (NCON); 146,4 (COCH=CHN); 100,8 (COCH=CHN); 78,1 (Me₃ C); 49,1 & 47,8 (NCH₂COOH); 47,6 & 46,9 (NCH₂CON); 38,6 (BOC-NHCH₂ CH₂N); 38,1 & 37,6 (BOC-NHCH₂N); 38,1 & 37,6 (BOC-NHCH₂CH₂N); 28,1 (C(CH₃)₃), UV (Methanol; _maxnm)); 226; 264. IR (KBr; cm^–1); 3190 (_NH); 1685vs, vbreit (_C=O, COOH, CONH); 1253s (_C-O, COOH); 1171s (_C-O, COOt-Bu); 682w (∂ CH, H-C=C-H). FAB-MS m/z (Zurdonung, relative Intensität); 371 (M+H, 25); 271 (M+H-Boc, 100).
BEISPIEL 73
Synthese von H-U10-LysNH₂
Die Synthese der in der Überschrift angegebenen Verbindung wurde unter Verwendung des folgenden Protokolls durchgeführt:
(1) BOC-Deprotektion mit TFA/CH₂Cl₂ (1:1, v/v), 3 × 1 Minute und 1 × 30 Minuten; (2) Waschen mit CH₂Cl₂, 6 × 1 Minute; (3) Neutralisieren mit DIEA/CH₂Cl₂ (1:19, v/v), 3 × 2 Minuten; (4) Waschen mit CH₂Cl₂, 6 × 1 Minute, und Trocknen lassen für 1 Minute; (5) an einigen Schritten der Synthese wurde eine 2–5 mg-Probe des PNA-Harzes entnommen und für die Ninhydrin-Analyse gründlich getrocknet, um die Substitution zu bestimmen; (6) Hinzufügen von BOC-geschütztem PNA-Monomer (freie Säure) in DMF, gefolgt durch Hinzufügen von DCC in CH₂Cl₂; die Bindungsreaktion wurde für insgesamt 24 Stunden unter Schütteln durchgeführt; (7) Waschen mit DMF, 1 × 2 Minuten; (8) Waschen mit CH₂Cl₂, 4 × 1 Minute; (9) Neutralisierung mit DIEA/CH₂Cl₂ (1:19, v/v), 2 × 2 Minuten; (10) Waschen mit CH₂Cl₂, 6 × 1 Minute; (11) gelegentlich wurde eine 2–5 mg-Probe des geschützten PNA-Harzes entfernt und für eine Ninhydrin-Analyse gründlich getrocknet, um das Ausmaß der Bindung zu bestimmen; (12) bei manchen Schritten der Synthese wurden unreagierte Aminogruppen durch Acetylierung mit einer Mischung aus Acetanhydrid/Pyridin/CH₂Cl₂ (1:1:2, v/v/v) für 2 Stunden blockiert, gefolgt von einem Waschschritt mit CH₂Cl₂, 6 × 1 Minute, und gelegentlicher Ninhydrin-Analyse.
Die Synthese wurde auf ungefähr 100 mg Lys(ClZ)-MHBA-Harz gestartet. Das Rohprodukt (12 mg) war für Hydridisierungsstudien rein genug. Das Hybrid zwischen 5'-(dA)10 und H-U10 wies einen T_m von 67,5°C auf.
BEISPIEL 74
Synthese von Ethyl-N₆-(benzyloxycarbonyl)-2,6-diaminopurin-9-yl-acetat (14, 7a)
Zu einer Suspension aus 2,6-Diaminopurin (3 g, 19,46 mmol) in trockenem DMF (90 ml) wurde NaH (60 % in Öl, 0,87 g, 21,75 mmol) hinzugefügt. Nach 1 Stunden wurde Ethylbromacetat (4,23 g, 25,34 mmol) hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde nach 30 Minuten homogen und wurde zu weiteren 90 Minuten rühren gelassen. Das DMF wurde im Vakuum entfernt, was zu einem Lohpulver führte. Der Lohpulver wurde anschließend mit 1,4-Dioxan (200 ml) über 10 Minuten durch Rückflusskühlung erhitzt und durch Celit gefiltert. Die Lösung wurde konzentriert, wodurch ein leicht gelbliches Pulver entstand. Zu dem leicht gelblichen Pulver (5,52 g) in 1,4-Dioxan (150 ml) wurde frisch hergestelltes N-Benzyloxycarbonyl-N'-methylimidazoliumtriflat (10,7 g, 29,2 mmol) hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde 16 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, was zu einer rötlichen Lösung führte. Das Dioxan wurde im Vakuum entfernt und das Rohmaterial aus MeOH:Diethylester umkristallisiert, wodurch 4,56 g (63 %) der in der Überschrift angegebenen Verbindung als cremefarbiger Feststoff erzielt wurden.
¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 10,12 (bs, 1H), 7,43 (m, 5H), 6,40 (bs, 2H), 5,17 (s, 2H), 4,94 (s, 2H), 4,18 (q, J = 7,2, 3H), 1,21 (t, J = 7,2, 3H). ¹³C-NMR (DMSO-d₆) ppm: 167,81, 159,85, 154,09, 152,07, 149,77, 140,62, 136,42, 128,22, 127,74, 127,61, 166,71, 65,87, 61,21, 43,51, 13,91.
BEISPIEL 75
Synthese von N⁶-(Benzyloxycarbonyl)-2,6-diaminopurin-9-yl-Essigsäure (15, 7a)
Ethyl-N⁶-(benzyloxycarbonyl)-2,6-diaminopurin-9-yl-acetat (14, 3 g, 8,1 mmol) wurde in NaOH (2 N, 30 ml) gelöst. Nach 1 Stunde wurde die Lösung mit 2 M HCl auf pH 2,5 angesäuert. Das Präzipitat wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch 2,82 g (98 %) der in der Überschrift angegebenen Verbindung als weißer Feststoff gewonnen wurden.
IR (KBr); 3300, 3095, 1750, 1630, 1590, 1410. ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 10,11 (s, 1H), 7,91 (s, 1H), 7,45-7,33 (m, 5H), 6,40 (s, 2H), 5,17 (s, 2H), 4,83 (s, 2H).
BEISPIEL 76
Synthese von BOC-Aminoacetaldehyd (16, 7b)
Die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde gemäß einem in der Literatur veröffentlichen Verfahren hergestellt (Dueholm et al., Organic Preparations and Procedures Intl., 1993, 25, 457).
BEISPIEL 77
Synthese von Lysin-(2-chlorbenzyloxy)-allylsester (17, 7b)
Die in der Überschrift angegebene Verbindung wurde gemäß einem in der Literatur veröffentlichen Verfahren hergestellt (Waldmann und Horst, Liebigs Ann. Chem., 1983, 1712).
BEISPIEL 78
Synthese von N-(BOC-Aminoethyl)-lysin-(2-chlorbenzyloxy)-allylester (18, 7b)
p-Toluolsulfonsäure-geschütztes Lysin (11 mmol) wurde in CH₂Cl₂ (100 ml) gelöst und mit gesättigtem wässrigen NaHCO₃ (100 ml) gewaschen. Die wässrige Schicht wurde mit CH₂Cl₂ zurückextrahiert und die CH₂Cl₂-Schichten kombiniert, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wodurch das Lysin als ein Öl freigesetzt wurde. Das resultierende Öl wurde in Methanol (50 ml) aufgenommen und auf 0°C abgekühlt. Zu der resultierenden Lösung wurde Natriumcyanbor-Wasserstoff (5,9 mmol), gefolgt von Essigsäure (0,75 ml) hinzugefügt. Nach 5 Minuten wurde BOC-Aminoacetaldehyd (13,3 mmol) hinzugefügt und die Reaktionsmischung für eine weitere Stunde gerührt. Das Methanol wurde im Vakuum entfernt und das Öl in Ethylacetat (40 ml) gelöst, mit gesättigtem wässrigen NaHCO₃, Sole gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wodurch ein klares farbloses Öl entstand. Dieses Öl wurde in hochgrädigem Ether (80 ml) gelöst, auf –20°C abgekühlt und ein molares Äquivalent HCl in Ether langsam hinzugefügt. Der resultierende weiße Feststoff wurde durch Filtrieren gesammelt und Luft-getrocknet. Das Ausfällen des Luft-getrockneten weißen Feststoffs aus hochgrädigem Ether ergab die in der Überschrift angegebene Verbindung in analytisch reiner Form.
BEISPIEL 79
Synthese von N-(BOC-Aminoethyl)-N-[N⁶-(benzyloxycarbonyl)-2,6-diaminopurin-9-yl-acetyl]-lysin-(2-chlorbenzyloxy)-allysester (19, 7b)
Zu N⁶-(Benzyloxycarbonyl)-2,6-diaminopurin-9-yl-Essigsäure (15, 3,6 g, 10,5 mmol) in DMF (150 ml) wurde N,N-Diisopropylethylamin (2,75 ml, 21 mmol) und N-(BOC-Aminoethyl)-lysin-(2-chlorbenzyloxy)-allylesterhydrochlorid (7,31 mg, 15,8 mmol) hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde 20 Minuten lang unter Stickstoff gerührt und Brom-tris-pyrolidin-phosphoniumhexafluorphosphat (PyBrop, 5,4 mg, 11,6 mmol) hinzugefügt. Die Reaktinsmischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht unter einer Stickstoffgasatmosphäre gerührt. Die resultierende Mischung wurde konzentriert und in Ethylacetat gelöst. Die Ethylacetatlösung wurde mit wässrigem gesättigtem Natriumbicarbonat gewaschen, getrennt und konzentriert. Das rohe Material wurde durch Silica-Gel-Flash-Säulenchromatographie unter Verwendung von Ethylacetat zu Hexan zu Methanol (6:3:1, v/v/v) als Elutionsmittel gereinigt. Die Konzentrierung und Trocknung der geeigneten Fraktionen ergab 3,1 g (37 %) der in der Überschrift angegebenen Verbindung.
BEISPIEL 80
Synthese von N-(BOC-Amincethyl)-N-[N⁶-(benzyloxycarbonyl)-2,6-diaminopurin-9-yl-acetyl]-lysin-(2-chlorbenzyloxy)-allysester (20, 7c)

Zu N-(BOC-Aminoethyl)-N-[N⁶-(benzyloxycarbonyl)-2,6-diaminopurin-9-yl-acetyl]-lysin-(2-chlorbenzyloxy)-allysesterhydrochlorid (19, 3,1 mg, 3,93 mmol) wurde THF (100 ml) Morpholin (3,5 ml, 39,3 mmol), sowie Tetrakis(triphenylphosphin)-palladium(0) (0,45 mg, 0,393 mmol) hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde unter Stickstoffatmosphäre 2,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die resultierende Mischung wurde konzentriert und in Etyhlacetat gelöst. Die Ethylacetatlösung wurde mit wässrigem gesättigtem Kaliumhydrogensulfat (das mit Wasser halb verdünnt war) gewaschen, getrennt und konzentriert. Das Rohmaterial wurde durch Silica-Gel-Flash-Säulenchromatographie unter Verwendung von Chloroform zu Methanol (9:1, v/v) als Elutionsmittel gereinigt. Die Konzentrierung und Trocknung der geeigneten Fraktionen ergab 1,25 g (42 %) der in der Überschrift angegebenen Verbindung. BEISPIEL 81 Standardprotokoll für PNA-Synthese und Charakterisierung

Instrument:	PerSeptive Biosystems 809 Expedite
Syntheseskala:	2 μmol
Reagenzien:
Waschen A:	20 % DMSO in NMP
Waschen B:	2 M Collidin in 20 % DMSO in NMP
Entblocker:	5 % m-Cresol, 95 % TFA
Neutralisierer:	1 M DIEA in 20 % DMSO in NMP
Kaple:	0,5 M Acetanhydrid, 1,5 M Collidin in 20 % DMSO in NMP
Aktivator:	0,2 M HATU in DMF
Monomere:	0,22 M in 2 M Collidin (50 % Pyridin in DMF)
Synthese:	Der feste Träger (BOC-BHA-PEG-Harz) wurde mit 708 μl der Waschlösung A gewaschen.

Der Entblocker (177 μl) wurde dreimal in einem Zeitraum über 6,3 Minuten über die Säule gegeben. Das Harz wurde anschließend mit 1416 μl der Waschlösung A gewaschen. Das freie Amin wurde mit 1063 μl des Neutralisierers neutralisiert. Das Harz wurde mit 1062 1 an Waschlösung B gewaschen. Monomer und Aktivator (jeweils 141 μl) wurden über 14 Minuten hinweg langsam auf die Säule gegeben. Das Harz wurde mit 708 μl Waschlösung B und 708 μl Waschlösung A gewaschen. Unreagiertes Amin wurde durch langsames Hinzufügen von 708 μl der Schutzlösung über einen Zeitraum von 5 Minuten geschützt. Das Harz wurde anschließend mit 2124 μl der Waschlösung A gewaschen. Der Zyk lus wurde wiederholt, bis die Synthese der gewünschten PNA-Sequenz vervollständigt ist.
Spaltung: Das PNA-Harz wurde mit 5 ml MeOH gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Das getrocknete Harz wurde in eine 1,5 ml-Durapore-Ultrafree-Filtereinheit gegeben. Thioanisol (25 μl), 25 μl m-Cresol, 100 μl an TFA und 100 μl an TFMSA wurden zu dem Harz hinzugefügt, ungefähr 30 Sekunden gevortext und 2 Stunden lang stehen gelassen. Die Reaktionsmischung wurde anschließend 5 Minuten lang bei 10 K zentrifugiert und das innere Röhrchen mit dem Harz wurde entnommen. Ungefähr 1,5 ml des Ethers wurden zu der TFA-Lösung hinzugefügt, um das Produkt auszufällen. Die TFA-Lösung wurde gevortext, und anschließend bei 10 K 2 Minuten lang zentrifugiert. Der Ether wurde im Vakuum entfernt. Die Ether-Fällung und die Zentrifugation wurden noch zwei weitere Male wiederholt. Das trockene Pellet wurde im Heizblock (55°C) 15 bis 30 Minuten lang erhitzt, um überschüssigen Ether zu entfernen und anschließend in 200 μl H₂O gelöst. Das Lösungsmittel wurde zu 100 mg an Dowex-Acetatharz in einer 1,5 ml Durapore-Ultrafree-Filtereinheit hinzugefügt, gevortext und 30 Minuten lang stehen gelassen, sowie bei 10 K 2 Minuten lang zentrifugiert.
Charakterisierung: Die Extinktion einer 1 μl-Probe in 1 ml H₂O wurde bei 260 nm gemessen. Isopropanol (50 %) in H₂O mit 1 % Essigsäure (100 μl) wurde zu 4 μl der Probe hinzugefügt. Diese Probe wurde durch Elektronenspray-Massenspektrometrie charakterisiert.
Allgemeine Abkürzungen

NMP:

N-Methylpyrrolidon

TFA:

Trifluor-Essigsäure

DIEA:

N,N-Diisopropylethylamin

HATU:

O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronhexafluorphosphat

TFMSA:

Trifluormethansulfonsäure

BEISPIEL 82
PNA-Oligomere enthaltend 2,6-Diaminopurin, gebunden an das Aminoethyl-Lysin-Grundgerüst.
Unter Verwendung der in der Überschrift des Beispiels 80 angegebenen Verbindung, ferner der Aminoethylglicin-PNA-Monomere der Beispiele 24 bis 34, und anhand des Standardprotokolls für die PNA-Synthese wie in Beispiel 81 dargestellt, wurden die folgenden PNA-Oligomere hergestellt:
SEQ ID Nr.: 1 TTT-CGC-GDkC-CCDk
SEQ ID Nr.: 2 GCDk-DkDkC-GC
C, G and T sind die Nucleobasen Cytosin, Guanin und Thymin, jeweils verbunden an das Aminoethylglycin PNA-Grundgerüst. Dk ist 2,6-Diaminopurin, verbunden an das Aminoethyl-Lysin-Grundgerüst wie in den vorherigen Beispielen dargestellt. Das Aminoethyl-Lysin-Grundgerüst ist ein Aminoethyl-Glycin-Grundgerüst mit einem Butylamin-Substituenten an der α-Position, d.h. mit einer Lysin-Seitenkette.
BEISPIEL 83
Synthese von PNA-Oligomeren mit zumindest einem von A, G, C oder T, gebunden an ein Lysin-enthaltenes Grundgerüst Unter Verwendung der Verfahren aus Beispiel 81, ferner der Aminoethylglycin-PNA-Monomere der Beispiele 24 bis 34 sowie der Monomere aus dem Beispiel 74–80 wurden die folgenden PNA-Oligomere synthetisiert (Tk ist Thymin, gebunden an ein Aminoethyl-Lysin-Grundgerüst; Gk ist Guanin, gebunden an ein Aminoethyl-Lysin-Grundgerüst; Ck ist Cytosin, gebunden an ein Aminoethyl-Lysin-Grundgerüst):
SEQ ID Nr.: 3 GCK-TkTkG-GCA-GTkC-TkC
SEQ ID Nr.: 4 CgkC-TkTkGk-GkCA-GkTkC-TkC
SEQ ID Nr.: 5 CkGkCk-TkTkG-GkCkA-GkTkCk-TkCk
SEQ ID Nr.: 6 TkTkTk-AGG-ATkTk-CGTk-GCTk-C
SEQ ID Nr.: 7 TkCG-TkGC-TkCA-TkGG
SEQ ID Nr.: 8 GCG-TkTkTk-GC
SEQ ID Nr.: 9 CGC-TkGC-AGA-TkGC-GGTk-Tk
SEQ ID Nr.: 10 CCG-CCG-GCTk-CAG-TkCTk-Tk
SEQ ID Nr.: 11 CATk-CGTk-GGC-GGTk-TkAG-G
SEQ ID Nr.: 12 TkCG-GGTk-GAG-TkGG-TkAG
SEQ ID Nr.: 13 CAC-TkCA-GTkG-CAA-CTkC-Tk
SEQ ID Nr.: 14 CCTk-CCA-CTkC-CCG-CCTk-C
SEQ ID Nr.: 15 CkATk-CkGTk-GGCk-GGTk-TkAG-G
SEQ ID Nr.: 16 CAC-TkCA-GTkG-CAA-CTkC-Tk
SEQ ID Nr.: 17 CCTk-CCR-CTkC-CCG-CCTk-C
SEQ ID Nr.: 18 CAGk-CCA-TkGG-TTkC-CCC-CkCA-AC
SEQ ID Nr.: 19 Fla-GTkG-AGG-GTkC-TkCTk-CTC
SEQ ID Nr.: 20 Cy5-GTkG-AGG-GTkC-TkCTk-CTC
SEQ ID Nr.: 21 Fla-CAA-ATkG-GTkTk-CTkC-GAA
SEQ ID Nr.: 22 Cy5-CAA-ATkG-GTkTk-CTkC-GAA
SEQ ID Nr.: 23 Fla-ACC-TGkR-GkGGk-AGkC-CAG
SEQ ID Nr.: 24 Cy5-ACC-TGkA-GkGGk-AGkC-CAG
SEQ ID Nr.: 25 Fla-TkTkG-GCC-ACG-TkCC-TkGA
SEQ ID Nr.: 26 Cy5-TkTkG-GCC-ACG-TkCC-TkGA
SEQ ID Nr.: 27 Fla-TGkC-CCG-GkGkA-AAA-CGkT
SEQ ID Nr.: 28 Cy5-TGkC-CCG-GkGkA-AAA-CGkT
SEQ ID Nr.: 29 Fla-CCTk-CGTk-GCA-CGTk-TkCTk
SEQ ID Nr.: 30 Cy5-CCTk-CGTk-GCA-CGTk-TkCTk
SEQ ID Nr.: 31 Fla-TkGG-ATkG-TkCG-ACC-TkCTk
BEISPIEL 84
Synthese von Methyl-α-Formylsuccinat
Dieses Verfahren stellt eine Modifizierung eines bereits veröffentlichten Verfahrens dar (Fissekis et al., Biochemistry 1970, 9, 3136). Natriummethoxid (40,5 g, 0,75 mol) wurde in trockenem Ether (500 ml) suspendiert und unter Stickstoff bei 0°C gerührt. Eine Mischung aus Dimethylsuccinat (65,4 ml, 0,5 mol) und Methylformat (123 ml, 2 mol) wurde über einen Zeitraum von 30 Minuten tropfenweise hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunden lang bei 0°C und anschließend bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Anschließend die Reaktionsmischung zu einem viscosen-braunen Rest verdampft, der einmal mit Petrolether gewaschen und anschließend in 3 M Salzsäure (160 ml) gelöst wurde. Diese Lösung wurde mit konzentrierter Salzsäure schwach sauer gemacht und anschließend mit Dichlormethan extrahiert (4 × 250 ml). Die organische Phase wurde anschließend getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter reduziertem Druck verdampft. Der resultierende Rest wurde in einem Kugel rohr-Apparat bei 60°C und 0,6 mbar destilliert, was 52,3 g einer Mischung der in der Überschrift angegebenen Verbindung und Dimethylsuccinat in einem molaren Verhältnis von 80:20 (durch NMR bestimmt) als ein farbloses Öl ergab. Dieses Produkt wurde durch eine kontinuierliche Extraktion mit Diethylether von Dimethylsuccinat gereinigt. Alternativ kann die Mischung direkt für den nächsten Schritt eingesetzt werden.
¹H-NMR (DMSO-d₆, TMS) δ: 3,2 (s, 2H, CH₂), 3,59 (s, 3H, OMe), 3,61 (s, 3H, OMe), 7,73 (s, 1H, CHOH), 10,86 (br s, 1H, CHOH). ¹³C-NMR (DMSO-d₆, TMS) ppm: 28,9 (CH₂), 51,0 (OMe), 51,6 (OMe), 102,1 (C=CHOH), 156,6 (CHOH), 168,3 (COO), 171,7 (COO).
BEISPIEL 85
Synthese von Pseudoisocytosin-5-yl-Essigsäure
Dieses Verfahren ist eine Modifizierung eines bereits veröffentlichte Verfahrens (Beran et al., Collect. Czech, Chem. Commun., 1983, 48, 292). Natriummethoxid (41,9 g, 0,78 mol) wurde in trockenem Methanol (200 ml) gelöst und Guanidinhydrochlorid (49,4 g, 0,52 mol) hinzugefügt. Die Mischung wurde 10 Minuten lang unter Stickstoff bei Raumtemperatur gerührt. Eine Lösung aus Methyl-α-formylsuccinat (30 g, 0,17 mol) in trockenem Methanol (100 ml) wurde zu der Mischung hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde 3 Stunden lang unter Stickstoff durch Rückflusskühlung erhitzt und anschließend bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde filtriert und der filtrierte Rest einmal mit Methanol gewaschen. Das gesammelte Filtrat und der Waschrest wurde unter reduziertem Druck verdampft. Der resultierende Rest wurde in Wasser (80 ml) gelöst und die Lösung mit konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von 4,2 angesäuert. Nach Rühren lassen bei 0°C wurde die Mischung filtriert, das Präzipitat einmal mit Wasser gewaschen und anschließend gefriergetrocknet, wodurch 28,29 g (97 %) der in der Überschrift angegebenen Verbindung als ein weißer Feststoff zurückblieb.
Analyse berechnet für C₆H₇N₃N₃ 1/2 H₂O: C, 40,45; H, 4,53; N, 23,59. Festgestellt: C, 40,13; H, 4,22; N, 23,26. Aufgrund der schlechten Löslichkeits-Eigenschaften des Produktes wurde es als ein Natriumsalz weiter charakterisiert. Die in der Überschrift angegebene Verbindung (0,42 g, 2,5 mmol) und Natriumbicarbonat wurden in kochendem Wasser (35 ml) gelöst. Die Lösung wurde abgekühlt und verdampft. Der Rest wurde in Wasser (6 ml) gelöst und Ethanol (4 ml) und Isopropanol (8 ml) wurden hinzugefügt. Das Natriumsalz wurde durch Filtrieren gesammelt, mit absoluten Ethanol und Petrolether gewaschen sowie getrocknet, wodurch 0,31 g des Produktes (65 %) als weiße Kristalle gewonnen wurden.
¹H-NMR (D₂O, TMS) δ: 3,10 (s, 2H, CH₂COO), 7,40 (s, 1H, H6). ¹³C-NMR (DMSO-d₆, TMS) ppm: 34,8 (CHCOO), 112,0 (C-5), 145,6-146,5 (m, C-2), 155,1 (C-6), 169,4 (C-4), 179,3 (COOH). MS (FAB) m/z (%): 192 (100, M+H).
BEISPIEL 86
Synthese von Methyl-pseudoisocytosin-5-yl-acetat Thionylchlorid (3,6 ml, 50 mmol) wurde bei –40°C unter Stickstoff zu gerührtem Methanol (210 ml) hinzugefügt. An schließend wurde Pseudoixocytosin-5-yl-Essigsäure (7 g, 41 mmol) hinzugefügt und die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur 1 Stunde lang, anschließend bei 60°C, und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde zur Trockenheit verdampft und der Rest in gesättigtem wässrigen Natriumbicarbonat (80 ml) gelöst, wodurch ein schaumiges Präzipitat gewonnen wurde. 4 M Salzsäure wurde hinzugefügt (Lösung pH 6,5) und die Lösung wurde 1 Stunde lang gerührt. Das Präzipitat wurde durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen, aus Wasser umkristallisiert und gefriergetrocknet, wodurch 4,66 g (62 %) an Methyl-isocytosin-5-ylacetat als weiße Kristalle gewonnen wurden.
¹H-NMR (DMSO-d₆, TMS) δ: 3,28 (s, 2H, CH₂COO), 3,64 (s, 3H, COOMe), 6,87 (br s, 2H, NH₂), 7,54 (s, 1H, H-6). ¹³C-NMR (DMSO-d₆, TMS) ppm: 32,0 (CH ₂COO), 51,5 (COOMe), 108,4 (C-5), 153,3 (C-2), 156,4 (C-6), 164,0 (C-4), 171,8 (CH₂ COO). MS (FAB+) m/z (%): 184 (100, M+H), Analyse, berechnet für C₇H₉N₃O₃ 3/2 H₂O: C, 40,00; H, 5,75; N, 19,99. Festgestellt: C, 40,18; H, 5,46; N, 20,30.
BEISPIEL 87
Synthese von Methyl-N²-(benzyloxycarbonyl)pseudoisocytosin-5-ylacetat
Methyl-pseudoisocytosin-5-ylacetat (9,5 g, 52 mmol) wurde in trockenem DMF (95 ml) gelöst und die Lösung unter Stickstoff bei 0°C gerührt. N-Benzyloxycarbonyl-N'-methylimidazolliumtriflat (37,99 g, 104 mmol) wurde langsam hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten bei 0°C gerührt und anschlieißend über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Dichlormethan (800 ml) wurde hinzugefügt und die resultierende Mischung mit halb-gesättigtem wässrigen Natriumbicarconat (2 × 400 ml), halb-gesättigtem wässrigen Kaliumhydrogensulfat (2 × 400 ml) und Sole (1 × 400 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄), filtriert und unter reduziertem Druck verdampft. Der Rest wurde aus Methanol umkristallisiert, wodurch 13,32 g (81 %) der in der Überschrift angegebenen Verbindung als weiße Kristalle erzielt wurden.
¹H-NMR (DMSO-d6, TMS) δ: 3,43 (s, 2H, CH₂COO), 3,67 (s, 3H, COOMe), 5,30 (s, 2H, PhCH ₂), 7,43-7,52 (m, 5H, PhCH₂), 7,77 (s, 1H, H-6). ¹³C-NMR (DMSO-d6, TMS) ppm: 31,9 (CH ₂COO), 51,6 (COOMe), 67,0 (pHCH ₂), 128,1-128,5 (m, PhCH₂), 135,7 (pHCH₂), 150,7 (Z-CO), 170,8 (COO), MS (FAB+) m/z (%): 318 (3,5, M+H). Analyse, berechnet für C₁₅H₁₅N₃O₅: C, 56,78; H, 4,76; N, 13,24. Festgestellt: C, 56,68; H, 4,79; N, 13,28.
BEISPIEL 88
Synthese von N²-(Benzyloxycarbonyl)pseudoisocytosin-5-yl-Essigsäure
Methyl N²-(Benzyloxycarbonyl)pseudoisocytosin-5-yl-acetat (5,2 g, 16 mmol) wurde in THF (52 ml) gelöst und auf 0°C abgekühlt. 1 M Lithiumhydroxid (49 ml, 49 mmol) wurde hinzugefügt und die Reaktionsmischung 25 Minuten lang bei 0°C gerührt. Zusätzliches 1 M Lithiumhydroxid (20 ml, 20 mmol) wurde hinzugefügt und die Mischung 90 Minuten lang bei 0°C gerührt. Das Produkt wurde durch Ansäuern auf einen pH-Wert von 2 mit 1 M Salzsäure ausgefällt, durch Filtrieren gesammelt, einmal mit Wasser gewaschen und getrocknet. Die Ausbeute betrug 4,12 g (83 %) in Form von weißen Kristallen.
¹H-NMR (DMSO-d₆, TMS) δ: 3,33 (s, 2H, CH₂COO), 5,29 (s, 2H, pHCH ₂), 7,43-7,52 (m, 5H, PhCH₂), 7,74 (s, 1H, H-6), 11,82 (br s, 3H, austauschbare Protonen). MS (FAB+) m/z (%): 304 (12, M+H). Analyse, berechnet für C₁₄H₁₃N₃O₅: C, 55,45; H, 4,32; N, 13,86. Festgestellt: C, 55,55; H, 4,46; N, 13,84.
BEISPIEL 89
Herstellung von Pseudoisocytosin, verbunden an ein Aminoethyl-Lysin-Grundgerüst
N²-(Benzyloxycarbonyl)pseudoisocytosin-5-yl-Essigsäure wurde an N-(BOC-Aminoethyl)-lysin-(2-chlorbenzyloxy)-allylester (18) durch das in Beispiel 79 beschriebene Verfahren gebunden. Die resultierende Monomer-Verbindung wird wie im Verfahren des Beispiels 80 behandelt, wodurch die deprotektierte Verbindung für einen Einsatz in der Oligomer-Synthese vorbereitet wurde.
BEISPIEL 90
Synthese eines PNA-Oligomers mit einem Pseudoisocytosin gebunden an ein Aminoethyl-Lysin-Grundgerüst
Aminoethyl-lysin-pseudoisocytosin-Monomer wurde in PNAs unter Verwendung des in Beispiel 81 beschriebenen Verfahrens eingebaut.
BEISPIEL 91
Herstellung von PNA-Monomeren mit Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin gebunden an ein Aminoethyl-Lysin-Grundgerüst
a) Herstellung des Guanin-Monomers: Zu N⁶-Benzyl-9-carboxymethylen-guanin (2,63 g, 8,78 mmol) wurde DIEA (2,6 ml, 20 mmol), DMF (30 ml), Dichlormethan (70 ml) und N-(BOC-Aminoethyl)-lysin-(2-chlorbenzyloxy)-allylester (18, 3,7 g, 8,04 mmol) hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde 20 Minuten lang unter Stickstoff gerührt. PyBrop (4 g, 8,58 mmol) wurden hinzugefügt und die Reaktionsmischung für weitere 16 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert und der Rest durch Silica-Gel-Flash-Säulenchromatographie unter Verwendung von Chloroform/Hexan/Methanol (12:7:1, v/v/v) gereinigt, wodurch 4 g (60 %) der in der Überschrift angegebenen Verbindung als Allylester gewonnen wurden.
Zu dem Allylester (4 g, 5,37 mmol) wurde THF (100 ml), Tetrakispalladium(0) (0,18 g, 0,15 mmol) und Morpholin (6,1 mol, 70 mmol) hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde 2,5 Stunden lang unter Stickstoff gerührt und konzentriert. Der Rest wurde durch Silica-Gel-Flash-Säulenchromatographie unter Verwendung von Chloroform/Hexan/Methanol (11:1:1, v/v/v) gereinigt, wodurch 2,67 g (60 %) der in der Überschrift angegebenen Verbindung erzielt wurden.
b) Herstellung des Adenin-Monomers: Das für die Herstellung des Guanin-Monomers in Beispiel 91(a) wie oben beschriebene Verfahren, wurde für die Synthese des Adenin-Monomers unter Verwendung von N⁶-Benzyl-9-carboxymethylen-adenin entsprechend angewandt.
c) Herstellung des Cytosin-Monomers: Zu N-(BOC-Aminoethyl)-lysin-(2-chlorbenzyloxy)-allylester (18, 8,21 g, 17,7 mmol) wurden Triethylamin (10 ml, 98 mmol) und Dichlormethan (200 ml) hinzugefügt. Die Lösung wurde in einem Eisbad unter Stickstoff auf ungefähr 0°C abgekühlt. Zu der abgekühlten Lösung wurde Chloracetylchlorid (2,2 ml, 27,6 mmol) über einen Zeitraum von 10 Minuten hinzugefügt, und die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur 16 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert und der Rest durch Silica-Gel-Flash-Säulenchromatographie unter Verwendung von Ethylacetat/Hexan (1:1, v/v) gereinigt, wodurch 6,54 g (68 %) des N-acetylierten Lysin-Grundgerüsts gewonnen wurden.
Cytosin wird an der N-4-Position durch Behandlung mit Benzylchlorformat in Pyridin bei 0°C geschützt, wodurch N4-Benzyl-cytosin hergestellt wurde.
Zu N⁴-Benzyl-cytosin (1,31 g, 5,34 mmol) wurde DMF (200 ml) und 60 % NaH in Mineralöl (0,22 g, 5,4 mmol) hinzugefügt und die resultierende Mischung 30 Minuten lang unter Stickstoff gerührt. Zu der resultierenden Mischung wurde das N-acetylierte Lysin-Grundgerüst (2,9 g, 5,34 mmol) in DMF (25 ml) hinzugefügt und die Mischung 16 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert und der Rest in Dichlormethan (250 ml) gelöst. Die Dichlormethanphase wurde mit Wasser (200 ml) gewaschen und konzentriert. Der resultierende Rest wurde durch Silica-Gel-Flash-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan:Hexan:Methanol (8:2:1) gereinigt, wodurch 2,4 g (85 %) des Cytosins gewonnen wurden, gebunden an das Aminoethyl-Lysin-Grundgerüst als Allylester.
Der Allylester wird durch Deprotektion unter Verwendung von Palladium gefolgt von dem Verfahren, welches in Beispiel 91(a) beschrieben, in das aktive Monomer umgewandelt, wodurch 1,05 g (46 %) der in der Überschrift angegebenen Verbindung gewonnen wurden.
Siehe auch die Beispiele 84–89.
d) Herstellung des Thymin-Monomers: Das Thymin-Monomer wurde entsprechend dem Verfahren aus dem obigen Beispiel 91(c) hergestellt.
BEISPIEL 92
Thermische Stabilität von PNA-Duplexen
Duplex-bindende PNAs wurden, wie in Beispiel 83 beschrieben, synthetisiert. Das PNA mit der Sequenz H-GTxA-GATx-CAC-Tx-R (SEQ ID Nr.32), wobei Tx ein Thymin-Monomer eine Aminosäurenseitenkette darstellt) wurde mit einer komplementären DNA mit der Sequenz 5'-AGT-GAT-CTA-C-3' (SEG ID Nr. 33) sowie der komplementären PNA mit der Sequenz H-AGT-GAT-CTA-C-LysNH₂ (SEQ ID Nr. 34) hybridisieren gelassen, und die thermalen Stabilitäten (T_m) der Duplexe wurden in 10 mM Phosphat, 100 mM NaCl und 1 mM EDTA bei einem pH-Wert von 7 bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt.

NC

= nicht kooperativ (keine Duplexbildung trat auf)

N/D

= nicht bestimmt
*Das Grundgerüst an der Tx-Position trägt die angezeigte Aminosäurenseitenkette.
#In der PNA der SEQ ID Nr. 32 zeigt a, dass R = NH₂ und b zeigt, dass R = LysNH₂.

Die Ergebnisse zeigen, dass das Glycin im Grundgerüst durch andere Aminosäuren ersetzt werden kann, wobei ein gerin ger Verlust in der Fähigkeit zur Hybridisierung beobachtet wird. Nach Vergleichen von D-Lysin gegenüber L-Lysin und D-Serin gegenüber L-Serin, zeigte sich, dass D-Aminosäuren im Grundgerüst der PNAs besser passten. Darüber hinaus senkte das Einführen von negativ-geladenen Seitenketten im PNA-Grundgerüst (wie bspw. Glutaminsäure und Asparadinsäure) die Fähigkeit zur Hybridisierung, wie durch eine abgesenkte T_m dargestellt ist, wohingegen eine positiv-geladene Seitenkette (wie bspw. Lysin) die Fähigkeit zur Hybridisierung steigert, die durch eine höhere T_m gezeigt ist. Darüber hinaus haben die PNAs besser an antiparallele DNA als an parallele DNA gebunden.
BEISPIEL 93
Thermale Stabilitäten von PNA:DNA-Duplexen mit einzelnen Fehlanpassungen
Die Sequenzspezifität von PNAs mit Aminosäurenseitenketten im Grundgerüst wurde durch Bestimmung der Auswirkung einer einzelnen Basenpaar-Fehlanpassung (T_PNA-G_DNA) im komplementären DNA-Strang untersucht. Hierzu wurden PNAs mit der Sequenz H-GTxA-GATx-CAC-Tx-R (SEQ ID Nr. 32) für den Versuch eingesetzt. Die komplementäre DNA mit der einzelnen Fehlanpassung hatte die Sequenz 5'-AGT-GGT-CTA-C-3' (SEQ ID Nr.: 35), wobei die fehlangepasste Base unterstrichen ist. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt.

*Das Grundgerüst an der Tx-Position trägt die angezeigte Aminosäureseitenkette.
#In der PNA der SEQ ID Nr. 32 zeigt a, dass R = NH₂ und b zeigt, dass R = LysNH₂.

Die Ergebnisse zeigen, dass die PNAs mit Aminosäurenseitenketten im Grundgerüst eine verstärkte Sequenzspezifität für komplementäre DNA aufweisen, da sie besser zwischen Fehlanpassungen unterscheiden, als die PNAs mit einem Glycin im Grundgerüst.
BEISPIEL 94
In vitro-Bestimmung von PNAs, die auf HCV abzielen
Eine HCV-Replikation in Zellkultur konnte bis jetzt nicht erzielt werden. Daher wurden in vitro-Translationsassays als Standardassays verwendet, um die Testverbindungen für deren Anti-HCV-Aktivität zu evaluieren. Ein solches Standard-in-vitro-Translationsassay wurde verwendet, um die PNAs der vorliegenden Erfindung bezüglich deren Fähigkeit zu untersuchen, die Synthese von HCV-Protein in einem Kaninchen-Reticulocyten-Assay zu inhibieren.
Plasmide, die die Gesamt-cDNA-Sequenz für den gewünschten Abschnitt der HCV mRNA enthielten, wurden hergestellt. Ein T7-Promoter wurde in das Plasmid unmittelbar angrenzend and die 5'-Kappenstelle eingeführt. Eine ähnliche Strategie wurde zur Aufrechterhaltung einer Kontrolle eingesetzt, wobei ein cDNA-Plasmid mit codierenden Sequenzen für ein gekürztes, interzelluläres Adhäsionsmolekül vom Typ I, modifiziert wurde. Als Ergebnis einer Deletion an der Base 554 bezüglich des ICAM-1 AUG, trat ein Frameshift mit einem an Base 679 generierten Stopcodon auf. Der resultierende offene Leseraster codierte für ein verkürztes ICAM-1-Polypeptid mit einem niedrigeren Molekulargewicht.
Ungecapte Transcripte für die in-vitro-Translation wurden durch T7-Transcription des Plasmids hergestellt, wobei das Megscript-Transcriptions-Kit (Ambion, Inc.) gemäß den Vorschriften des Herstellers verwendet wurde. Das Plasmid wurde durch Restrictions-Endonucleasen-Verdauung an der Stelle in der Linker-Region des Plasmids linearisiert, welche sich unmittelbar stromabwärts der 3'-nicht-translatierten Sequenzen des cDNA-Inserts befand, um ein Transcript zu gewinnen, das in seiner Sequenz mit der wirklichen mRNA beinahe identisch ist. Nach der Transcription wurden freie Nucleotide unter Verwendung von G-50-Quickspin-Säulen (Boehringer-Mannheim) entfernt und die vorliegende Menge an Transcript durch optische Dichtenbestimmung quantifiziert.
Die in-vitro-Translationsreaktionen enthielten 300 ng des HCV-Transcripts (Endkonzentration 10 nM), 7 μl Kaninchen-Reticulocytenlysat (RRL, Promega), 8,8 μCi an [³⁵S]-Methionin (1175 Ci/mmol, Amersham), 13 μM IVT Aminosäurenmix ohne Methio nin (Promega), 8 Einheiten an RNasin (Promega) und PNAs in einem Gesamtvolumen von 15 μl. Eine ähnliche Kontrollreaktion enthielt 100 ng (30 nM) des gekürzten ICAM-1-Transcripts anstelle des HCV-Transcripts. Die Ziel- und die Kontroll-RNA wurden 5 Minuten lang bei 65°C erhitzt, 15 Minuten lang bei 37°C inkubiert und anschließend mit den Lysat-Komponenten gemischt. Der Translationsmix wurde 60 Minuten lang bei 37°C inkubiert und die Reaktion durch Hinzufügen von 2× Laemmli-Gelladepuffer beendet. Nach einem Kochschritt wurden die Proteina auf vorgegossenen 14 %-igen Acrylamidgelen (Novex, San Diego) fraktioniert, in 10 % Propanol, 5 % Essigsäure, 3 % Glycerol fixiert, getrocknet und mit einem PhosphorImager analysiert.
Die PNAs blockierten die in-vitro-Translation des HCV-Proteins effektiv. PNAs, die in einem in-vitro-Translationsassay untersucht wurden, sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt (Dk und Tk sind jeweils 2,6-Diaminopurin und Thymin, gebunden an Aminoethyl-Lysin-Grundgerüst).
Die Ergebnisse des in-vitro-Translationsassays sind in der 8 gezeigt. Es wurde beobachtet, dass 13642 (welches ein 12-mer PNA ist, mit zwei 2,6-Diaminopurinnucleobasen mit Lysin-Seitenketten) mit einer EC₅₀ von ungefähr 29 nM effektiver im Blocken der in-vitro-Translation des HCV-Proteins ist als 26512 (welches keine Lysin-Seitenketten aufweist) mit einem EC₅₀ von ungefähr 57 nM. Darüber hinaus zeigte sich, nach Vergleichen von 11908 und 13639, mit einer niedrigen Konzentration von 30 nM, die PNA mit Lysin-Seitenketten (d.h. 13639) effektiver im Blocken der in-vitro-Translation des HCV-Proteins ist als 11908, welche keine Lysin-Seitenketten enthält. Dies zeigt eindeutig, dass das Vorliegen einer Seitenkette in der PNA deren Fähigkeit verstärkt, die in-vitro-Translation von HCV-Protein zu blockieren.
BEISPIEL 95
PNAs mit einer erhöhten Löslichkeit
PNAs können sowohl Purin als auch Pyrimidin-Nucleobasen enthalten. Da jedoch – mit steigendem Purin-Nucleobasen-Gehalt einer PNA, diese verstärkt unlöslich wird, kann es durchaus passieren, dass PNAs mit einem hohen Puringehalt unlöslich werden. Überraschenderweise zeigten PNAs mit Lysin-Seitenketten unerwartete Eigenschaften dahingehend, dass sie im Vergleich zu PNAs ohne Lysin-Seitenketten eine erhöhte Löslichkeit aufwiesen.
Eine PNA mit der Sequenz TGC-GGG-TGA-GTG-GTR-G (SEQ ID Nr. 39) wurde synthetisiert und deren Löslichkeit derjenigen einer entsprechenden PNA mit einer Lysin-Seitenkette vergli chen, d.h. TkGC-GGG-TkGA-GTkG-GTkA-G (SEQ ID Nr. 40), wobei Tk ein Thymin mit einer Lysin-Seitenkette darstellt. Die erzielten Ergebnisse waren unerwartet, da die PNA mit Lysin-Seitenketten in physiologisch geeigneten Lösungen sowie in Testlösungsmitteln mit N-Methylpyrrolidon, DMF und Dichlormethan löslich war, wogegen die PNA ohne Lysin-Seitenketten unlöslich war. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Einführen von Lysin-Seitenketten in PNAs diese mit einer verbesserten Löslichkeit versehen, was deren weitere Verwendung vereinfachen würde.
In den Beispielen 96–101 beziehen sich alle Nummern innerhalb von Klammern auf die 9.
BEISPIEL 96
Nα-Fmoc-π-Benzyloxymethyl-L-histidin-methylester (32)
Zu Nα-Fmoc-π-Benzyloxymethyl-L-histidin (Sigma Chemical Company, 9,0 mg, 18,1 mmol) in DMF (150 ml) wurde (Trimethylsilyl)diazomethan (20 ml, 40 mmol/2,0 M/THF) hinzugefügt. Die Mischung wurde ungefähr 12 Stunden unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, wodurch die in der Überschrift angegebene Verbindung (32) als ein Öl gewonnen wurde. Das Öl wurde im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung eingesetzt.
BEISPIEL 97
π-Benzyloxymethyl-L-histidin-methylester (33)
Zu Nα-Fmoc-π-Benzyloxymethyl-L-histidin-methylester (32) (wie viel) Dichlormethan (100 ml) wurde Piperidin (2,0 ml, 20 mmol) hinzugefügt. Die Mischung wurde 3 Stunden lang unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Die Mischung wurde anschließend unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rest wurde mit Methanol (50 ml) verdünnt und der pH-Wert mit HCl auf 7,0 eingestellt. Die Filtrierung erzielte die in der Überschrift angegebene Verbindung (33) als ein Öl. Das Öl wurde im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung eingesetzt.
BEISPIEL 98
π-Benzyloxymethyl-L-histidin-methylester (34)
Zu -π-Benzyloxymethyl-L-histidin-methylester (33) in Methanol (200 ml) wurde Natriumcyanbor-Wasserstoff (5,65 mg, 90 mmol) hinzugefügt. Der pH-Wert der Mischung wurde unter Verwendung von Essigsäure auf zwischen 5 und 6 eingestellt. Boc-Aminoacetaldehyd (5,54 mg, 35,0 mmol) in Methanol (15 ml) wurde hinzugefügt und die Mischung 1 Stunde lang unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Weitere Mengen an Boc-Aminoacetaldehyd (14,4 mg, 91,3 mmol) in Methanol (50 ml) wurde unter Rühren für weitere 12 Stunden hinzugefügt. Die Mischung wurde unter reduziertem Druck konzentriert. Die Mischung wurde mit Ethylacetat (500 ml) verdünnt und mit wässrigem Natriumbicarbonat (2 × 200 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und anschließend unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch ein Rest entstand. Das Öl wurde durch Silica-Gel-Flash-Säulenchromatographie unter Verwendung von Ethylacetat/Methanol/Hexan (5:1:5) als Elutionsmittel wei ter gereinigt, wodurch 5,33 g (68 %) der in der Überschrift angegebenen Verbindung als ein Öl gewonnen wurden.
¹H-NMR (CDCl₃) δ 1,43 (s, 9H), 1,718 (6x, 1H, NH), 2,55 (m, 2H), 271 (m, 2H), 2,99 (m, 2H), 3,11 (m, 2H), 3,53 (t, 1H), 3,68 (s, 3H), 4,42 (s, 2H), 4,80 (bs, 1H, NH), 5,33 (S, 2H), 6,88 (s, 1H), 7,31 (m, 5H) und 7,48 (s, 1H). MS-FAB im negativen Modus, (berechnet); festgestellt (432,5); 431,1.
BEISPIEL 99
Nα-(N-Boc-2-Aminoethyl)π-benzyloxymethyl-L-histidin-methylester (35)
Zu π-Benzyloxymethyl-L-histidin-methylester (34) (5,33 mg, 12,3 mmol) in DMF (100 ml) und Dichlormethan (50 ml) wurde N,N-Diisopropylethylamin (3,5 ml, 25 mmol) und Thymin-1-yl-Essigsäure (1,75 mg, 9,5 mmol) hinzugefügt. Nach 20-minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde PyBrop (8,85 mg, 19 mmol) hinzugefügt und die Mischung für weitere 12 Stunden unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt und der Rest durch Silica-Gel-Flash-Säulenchromatographie unter Verwendung von Hexan/Methanol/Ethylacetat (4:1:5) als Elutionsmittel gereinigt, wodurch 1,5 g (20 %) der in der Überschrift angegebenen Verbindung gewonnen wurden.
Die Protonen-NMR stimmte mit der Struktur überein.
BEISPIEL 100
Nα-(N-Boc-2-Aminoethyl)π-benzyloxymethyl-L-histidin (36)
Zu Nα-(N-Boc-2-Aminoethyl)π-Benzyloxymethyl-L-histidin-methylester-Verbindung (5) (1,5 mg, 2,5 mmol) in Methanol (100 ml) wurde Natriumhydroxid (0,8 mg, 20 mmol) hinzugefügt. Die Mischung wurde 12 Stunden lang stehen gelassen und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Der Rest wurde durch Silica-Gel-Flash-Säulenchromatographie unter Verwendung von Ethylacetat/Methanol (4:1) als Elutionsmittel gereinigt, wodurch 1,1 g (75 %) der in der Überschrift angegebenen Verbindung gewonnen wurden.
Die Protonen-NMR stimmte mit der Struktur überein. MS-FAB im negativen Modus, (berechnet); festgestellt: 584,6); 582,6.
BEISPIEL 101
Nα-(N-Boc-2-Aminoethyl)π-benzyloxymethyl-D-histidin (D-36)
Gemäß den in den Beispielen 1–5 dargestellten Verfahren und ausgehend von Nα-Fmoc-π-Benzyloxymethyl-D-histidin (Sigma Chemical Company, 9,0 mg, 18,1 mmol) wurde das D-Isomer synthetisiert.
Die Protonen-NMR stimmte mit der Struktur überein. MS-FAB im negativen Modus, (berechnet); festgestellt: (584,6); 582,1.
BEISPIEL 102
Verstärkte Stabilität des Duplexes zwischen PNA mit 2,6-Diaminopurin und DNA
Vier PNA-Decamere (H-GTAGATCACT-LysNH₂, H-GTAGDTCACT-LysNH₂, H-GTDGDTCDCT-LysNH₂ und H-AGTGATCTAC-LysNH₂; D ist 2,6-Diaminopurin) wurden gemäß dem oben beschriebenen Verfahren synthetisiert. Die PNA-Decamere wurden mit komplementären DNA hybridisieren gelassen und die thermalen Schmelzprofile der PNA:DNA-Duplexe wurden gemessen und mit Kontroll-DNA:DNA-Duplexen und mit PNA:DNA-Duplexen verglichen, wobei die DNA eine einzelne T‣C-Fehlanpassung gegenüber einen D-Rest in der PNA enthielt.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt.

* DNA-1 ist 5'-dAGTGATCTAC-3' (SEQ ID Nr.: 7),
DNA-2 ist 5'-dAGTGACCTAC-3' (SEQ ID Nr.: 8)
PNA-1 ist H-AGTGATCTAC-LysNH₂ (SEQ ID Nr.: 9)
** ND = Nicht bestimmt

Das Vorliegen von 2,6-Diaminopurin erhöht die T_m um 4–5°C in PNA-DNA-Duplexen, wohingegen der Anstieg in DNA-DNA-Duplexen lediglich 3–4°C betrug. Dieser Unterschied kann eine erhöhte Stapelung in dem vorherigen Duplex reflektieren. Diese Tendenz wird auch dann beobachtet, wenn unmodifizierte Homoduplexe aus PNA:PNA und DNA:DNR mit Duplexen verglichen werden, die drei D:T-Basenpaare besitzen, was jeweils in T_m-Anstiege von 12°C und 10,5°C resultiert. Nach Vergleich der Bindung von PNA-3 an DNA-1 und DNA-2 wurde ein Absinken in der T_m von 23,5°C beobachtet, wenn eine D:C-Fehlanpassung in einen PNA:DNA-Duplex eingeführt werde, der lediglich eine 2,6-Diaminopurin-Nucleobase enthielt, wohingegen ein Absinken in der T_m von lediglich 18°C im Falle von PNA-2 beobachtet wurde, welche keine 2,6-Diaminopurin-Nucleobasen enthielt. Die erhöhte Spezifität im Sinne eines Absinkens in der Schmelztemperatur (T_m) des Duplexes wurde nicht beobachtet wenn zusätzliche D:T-Basenpaare eingeführt wurden. Dieses Erkenntnisse reflektieren die erhöhte Stabilität des Duplexes mit mehr als einer einzelnen 2,6-Diaminopurin-Nucleobase, was darauf hinweist, dass der stabilere Duplex die Fehlanpassungs-induzierte Strukturänderung in dem Duplex besser ausgleichen kann.
BEISPIEL 103
Binden von PNA mit 2,6-Diaminopurin an DNA
Ein PNA-Decamer mit sechs 2,6-Diaminopurin-Nucleobasen wurde an komplementäre DNA hybridisieren gelassen. Die thermale Stabilität dieses Duplexes wurde bestimmt und mit der thermalen Stabilität eines Duplexes verglichen, der zwischen DNA- und einem PNA-Decamer ohne 2,6-Diaminopurin-Nucleobasen gebildet wurde. Die T_m-Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt.

*DNA-6 ist 5'-CTCTCCTTTT-3' (SEQ ID Nr. 12)
DNA-7 ist 5'-TTTTCCTCTC-3' (SEQ ID Nr. 13)

Der Einbau von 2,6-Diaminopurin-Nucleobasen in die PNA erhöht die thermale Stabilität (dargestellt durch die T_m) der Duplexe zwischen DNA und der PNA mit einer 2,6-Diaminopurin-Nucleobase auf 85°C, im Vergleich mit der thermalen Stabilität (T_m = 71°C) des Duplexes zwischen DNA und einer PNA ohne 2,6-Diaminopurin-Nucleobasen.
Den Fachleuten ist klar, dass verschiedene Änderungen und Modifizierungen der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung vorgenommen werden können, und dass solche Änderungen und Modifizierungen gemacht werden können, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen. Es ist daher beabsichtigt, dass die nachstehenden Ansprüche sämtliche dieser äquivalenten Variationen beinhalten, insoweit sie innerhalb des tatsächlichen Sinns und des Rahmens der Erfindung liegen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verbindung mit der Formel
in welcher: L eine Nukleobase ist; R^7' ein C₁-C₈ Alkylamin ist; E COOH oder ein aktiviertes oder geschütztes Derivat davon ist; und Z NH₂ oder NHPg ist, wobei Pg eine Amin-Schutzgruppe ist.
Peptidnukleinsäure mit der Formel:
in welcher: jedes L unabhängig voneinander eine Nukleobase ist; jedes R^7'unabhängig voneinander Wasserstoff oder ein C₁-C₈ Alkylamin ist, mit der Maßgabe, dass zumindest ein R^7' ein C₁-C₈ Alkylamin ist; R^h OH, NH₂ oder NHLysNH₂ ist; Rⁱ H, COCH₃ oder t-Butoxycarbonyl ist; und n eine ganze Zahl von 1 bis 30 ist.
Peptidnukleinsäure nach Anspruch 2 oder Verbindung nach Anspruch 1, wobei zumindest ein L eine 2,6-Diaminopurinnukleobase ist.
Peptidnukleinsäure oder Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei zumindest ein R^7' ein C₃-C₆ Alkylamin ist.
Peptidnukleinsäure oder Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei zumindest ein R^7' ein C₄-C₅ Alkylamin ist.
Peptidnukleinsäure oder Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei zumindest eine R^7'-Gruppe Butylamin ist.
Peptidnukleinsäure oder Verbindung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Kohlenstoffatom, an welches zumindest ein R^7'-Substituent gebunden ist, stereo zumindest ein R^7'-Substituent gebunden ist, stereochemisch angereichert ist.
Peptidnukleinsäure nach Anspruch 7, wobei die stereochemische Anreicherung die R-Konfiguration hat oder die Verbindung nach Anspruch 7 ist, wobei das Kohlenstoffatom, an welches die R^7'-Gruppe gebunden ist, die R-Konfiguration hat.
Peptidnukleinsäure nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei jede der R^7'-Gruppen Butylamin ist.
Peptidnukleinsäure oder Verbindung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Peptidnukleinsäure oder die Verbindung von D-Lysin abstammt.
Verbindung nach Anspruch 1 oder nach Anspruch 3, wobei Pg t-Butoxycarbonyl ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine Peptidnukleinsäure nach einem der Ansprüche 2 bis 11 und zumindest einen pharmazeutisch akzeptierbaren Träger, Bindemittel, Verdickungsmittel, Verdünnungsmittel, Puffer, Konservierungsstoff oder oberflächenaktives Agens.
Verfahren zur Verbesserung der DNA- oder RNA-Sequenzspezifität einer Peptidnukleinsäure durch Einbau einer C₁-C₈ Alkylamin-Seitenkette in die Peptidnukleinsäure, wobei die Peptidnukleinsäure eine Peptidnukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 2 bis 10 ist.