JP2528107B2 - ポリヌクレオチド測定試薬と方法 - Google Patents

ポリヌクレオチド測定試薬と方法

Info

Publication number
JP2528107B2
JP2528107B2 JP61502179A JP50217986A JP2528107B2 JP 2528107 B2 JP2528107 B2 JP 2528107B2 JP 61502179 A JP61502179 A JP 61502179A JP 50217986 A JP50217986 A JP 50217986A JP 2528107 B2 JP2528107 B2 JP 2528107B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
backbone
polymer
subunit
mmol
analyte
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP61502179A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS62502357A (ja
Inventor
ジェームス サマートン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sarepta Therapeutics Inc
Original Assignee
Antivirals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Antivirals Inc filed Critical Antivirals Inc
Publication of JPS62502357A publication Critical patent/JPS62502357A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2528107B2 publication Critical patent/JP2528107B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/548—Phosphates or phosphonates, e.g. bone-seeking
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C07K14/003—Peptide-nucleic acids (PNAs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6839—Triple helix formation or other higher order conformations in hybridisation assays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Polymers With Sulfur, Phosphorus Or Metals In The Main Chain (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は、ポリヌクレオチド診断システムおよび方法
に関する。
発明の背景 一般的な２タイプのポリヌクレオチド診断システム
は，ポリヌクレオチドプローブの相補的な断片と，一本
鎖ポリヌクレオチド分析物との間のハイブリダイゼーシ
ョンに基づいて，ともに発展してきた。第一のタイプで
は，このポリヌクレオチド分析物が一本鎖にされ，ニト
ロセルロースフィルターのような固体担体に固定されて
いる。この担体は，次いで，相補鎖のアニーリング条件
下で，この分析物の標的塩基配列領域と相補的なレポー
ターラベルされたプローブとの反応に供される。非結合
プローブを除去するために，数回洗浄した後，この固体
担体のレポーターの存在が分析される。このシステム
は，測定の簡便さおよび感度が要求されるような特に医
療的状況では，十分に満足のいくものではない。一本鎖
のポリヌクレオチド物質をこの固体担体に固定する際に
用いられる手順は，ある程度複雑でかつ時間がかかる。
このシステムの感度は制限されている。通常の場合で
は，各分析物分子は，単一のプローブ分子とハイブリダ
イズし，そして，各プローブは，一般に約100のレポー
ター部分を含んでいるからである。
ポリヌクレオチド診断システムの第二のタイプは，こ
の分析物ポリヌクレオチドの別々の領域に互いに相補的
な２つの分析物−特異的プローブを包含する。この第一
のプローブは，固体担体に連結されており，この第二の
プローブは，溶液中に遊離していて，多数のレポーター
分子を持っている。実際には，この分析物は，以下の条
件で２つのプローブと混合される。この条件では，ポリ
ヌクレオチド分析物に対して，相補的なポリヌクレオチ
ド鎖のアニーリング（このアニーリングは，固定化され
たプローブとレポーターを持ったプローブの両方のアニ
ーリング含む）により，このレポーターの，分析物を介
した固体担体への結合が可能となる。
この２つのプローブシステムは，試験する核酸物質
を，固体担体に固定するべきであるという問題点はとり
除いたが，それにもかかわらず，この方法はまだ多数の
制約条件を有する。まず第一に，試験する核酸物質が二
本鎖核酸から誘導されるとき，多くの場合，この分析物
ポリヌクレオチドと，その相補鎖とのハイブリダイズ
が，この分析物と２つのプローブとの間のハイブリダイ
ズと競合する。さらに，この２つのプローブシステム
は，単一プローブシステムの場合よりも，速度論に依存
するところが大きいので,2つのプローブシステムは，本
質的に単一プローブシステムよりも遅い。また,2種の異
なったプローブを必要とすることは，この系のコストを
増大させる。つまり，試験感度という点から言えば，こ
の２つのプローブシステムは，上で述べたように，各分
析物ポリヌクレオチドが唯一の“レポーター”プローブ
と結合するので，単一プローブシステムと同様の限界を
持っている。
発明の要旨 本発明の一般的な目的は，ポリヌクレオチドを検出す
る際の使用に対し，上で議論した問題や，先行技術に関
連した限界を実質的に，克服するような診察システムお
よび方法を提供することである。
本発明の他の目的としては，このようなシステムにお
いて，相補的なポリヌクレオチド鎖を一本鎖状態で残す
ような条件下で，一本鎖のポリヌクレオチド分析物と，
塩基特異的な二本鎖構造を形成するべく適合された，ポ
リヌクレオチド結合ポリマーを有する試薬を提供するこ
とにある。それゆえ，この分析物の結合は，測定反応混
合物中でアニールしている分析物に相補的な鎖と競合す
ることなく，試薬ポリマーと分析物とが配列特異的な対
をなす条件下で，達成される。
本発明のもう一つの目的は，このようなシステムにお
いて，レポーターが試薬ポリマーに結合することのない
条件下で，静電気的な力によって，分析物ポリヌクレオ
チドのバックボーンに結合するべく適合されるレポータ
ーを供給することにある。それゆえ，このシステムは，
比較的多数のレポーター分子が各ポリヌクレオチド分析
物分子に結合し得るという長所によって，非常に高い信
号レベルの許容量を持っている。
さらに，迅速で，便利でかつ感度の高いポリヌクレオ
チド診断方法を提供することも，本発明の他の目的であ
る。
本発明は，規定された標的塩基配列を有する分析物ポ
リヌクレオチドの検出に用いる診断試薬を含む。この試
薬は，固体担体を有し，この担体に多数のポリヌクレオ
チド結合ポリマーが連結されている。各ポリマーは，塩
基相補的な認識部分の配列を構成している。それぞれの
認識部分は，選択された結合条件下で，この分析物の標
的領域の対応する内部配列塩基と水素結合され得る。分
枝しておらず，実質的に立体規則的なバックボーンは，
（１）この認識部分が，それと対応する標的の配列中の
塩基と水素結合できるような位置に認識部分を支持し，
かつ（２）選択された結合条件下で，この分析物の電荷
密度よりも実質的に低いバックボーン電荷密度を有す
る。本発明のより好ましい実施態様では，この認識部分
は，プリン塩基およびピリミジン塩基を含んでいる。こ
のバックボーンは，アキラルで，ほとんど荷電のない連
鎖により連結された一連のバックボーンから構成され
る。本発明の他の実施態様では，同様の認識部分は，荷
電のない連鎖，立体異性体的に規定された連鎖またはア
キラルな連鎖を含みかつ負に荷電さた連鎖とアキラルな
連鎖とが交互になったバックボーン上に備えられる。
ポリヌクレオチド分析物を検出するための診断システ
ムには，診断試薬を含む限定された標的配列を有し，レ
ポーターは，ポリヌクレオチド分析物の荷電したバック
ボーンに静電気的引力によって結合するが，しかし，実
質的にほとんど荷電していないかまたは，まったく荷電
していない試薬ポリマーのバックボーンにはあらかじめ
設定された結合条件下では結合しないポリカチオン性テ
イルを有する。このポリカチオン性テイルに結合される
ひとつまたはそれ以上のレポーター基は，レポーターの
存在が検出され得るシグナルを生じるべく適用される。
本発明の方法では，分析物が一本鎖形状にありかつ分
析物と試薬ポリマーとの間において配列特異的な対を与
えるような条件下で，このポリヌクレオチド分析物が診
断試薬に加えられる。この分析物／ポリマーアニーリン
グ反応後，非結合試験物質を除去するため，この試薬が
洗浄される。次いで，この試薬および結合した分析物
は，あらかじめ設定された条件下でレポーターとの反応
に供される。この条件では，レポーター中のポリカチオ
ン性テイルが，このポリヌクレオチドの荷電したバック
ボーンに静電気的に，結合するが，実質的に，ほとんど
荷電していないかまたはまったく荷電していない試薬高
分子のバックボーンには結合しない。この試薬は，非結
合レポーターを除去するべく再び洗浄される。試薬と結
合した分析物の存在および／または量は，この試薬結合
分析物に関連したレポーターシグナルを測定することに
より，もとの位置で決定される。あるいは，このレポー
ターはレポーター／分析物から溶出され，そして溶出液
のレポーターシグナルが測定される。
本発明のこれらの目的および他の目的および特徴につ
いて，以下の本発明の詳細な説明を，添付の図面と関連
させて読むと，よりいっそう明らかになるであろう。
図面の簡単な説明 第１図は，本発明のポリマー分子を形成する際に用い
られるより好ましいプリン構造およびピリミジン構造を
示す。
第２図は，このポリマー分子を形成する際に用いられ
るより好ましいプリン類似物認識部分およびピリミジン
類似物認識部分を示す。
第３図は，このポリマー分子を形成する際に用いられ
るより好ましい環状バックボーン部分を示す。
第４図は，このポリマー分子を形成する際に用いられ
るより好ましい非環状バックボーン部分を示す。
第5A図および第5B図は，N1……N2タイプのサブユニッ
トバックボーンをカップリングするための２つのより好
ましいサブユニット組立てスキームを例示している。
第６図は，第5A図および第5B図に例示の方法に従って
形成されたＤ−Ｄを介してサブユニットダイマーＡ−Ａ
のバックボーン構造を示し，かつ第7A図および第7B図に
例示の方法に従って形成された２つの環状バックボーン
構造を示す。
第7A-7C図は，N1……Ｅタイプのサブユニットバック
ボーンをカップリングするための３つのより好ましいサ
ブユニット組立てスキームを例示している。そして， 第８図は，第7A-7C図に例示の方法に従って形成され
たサブユニットダイマーのより好ましい非環状バックボ
ーン構造を示す。
第９図は，ホスホトリエステル連鎖のかわりに，メチ
ルホスホネートバックボーン連鎖を有するテトラヌクレ
オチド類似物の合成を示す。
第10図は，固体担体へのスペーサーアーム分子の付加
反応を例示している。
第11図は,N−メチルアミノ酸からポリアミンを合成す
る一般的な方法を示す。
第12図は，末端１級アミノ基を有するポリアミンの合
成方法を示す。
第13図は，末端１級アミノ基を有する４級アンモニウ
ムカチオンテイルの調製を示す。
第14図は，本発明の一実施態様に従って，複数の荷電
を有する酵素レポーターの調製のための反応を例示す
る。
第15図は，本発明の一実施態様に従って,2価の螢光レ
ポーターの調製のための反応を例示する。
第16図は，診断システムおよび本発明方法に包含され
る種々の成分を例示する。
本発明の詳細な説明 本発明の診断システムは，多数のヌクレオチド結合ポ
リマー分子を備えた固体担体からなる固体担体試薬を含
んでいる。本発明のポリマー組成物は，選択された結合
親和性で，塩基の標的配列を含むポリヌクレオチドと結
合するように設計されている。この組成物は，非単独重
合性で実質的に立体規則的な分子または種（以下の形式
である）からなっている： ここで,B−Riは，バックボーン部分Ｂおよび認識部分
Riを含む一連の塩基特異的なサブユニットである。この
認識部分Riは，標的配列中の対応する内部配列塩基と，
ワトソン／クリック塩基対により特異的に結合するよう
に選択されている。このサブユニットは，これらバック
ボーン部分を介して，主としてアキラルであり実質的に
非荷電の結合と連結されている。このポリマー種を構成
する際の使用に適当なサブユニットの設計および選択
は，以下の第１節に記述されるだろう。アキラルな連鎖
を介したサブユニットのカップリング方法は，第２節に
記述されている。サブユニット保護基とともに，サブユ
ニット合成の際に包含される戦略は，第２節で論じられ
る。
このポリマー種は，連続して起こるサブユニットカッ
プリングにより合成され，選択された長さおよび配列の
ポリマー分子が形成される。第４節に記述のように，こ
の標的配列およびポリマー配列の長さは，所望の結合特
異性を達成するべく選択される。このポリマーの標的に
対する結合親和性は，第４節に論じるいくつかの戦略に
より選択的に変えられ得る。この戦略には認識部分の選
択が含まれる。この認識部分は，対応する標的塩基とと
もに,3つ（より大きな結合親和性のために）または２つ
（より小さな結合親和性のために）のいずれかの塩基と
対になった水素結合を形成し得る。この得られた組成物
は，ポリマー種またはポリマー分子を含む。これらのす
べては，実質的に同じサブユニット配列および実質的に
同じ内部サブユニット連鎖のタイプを有している。機能
的な言い方では，このポリマー種のすべては，この標的
ポリヌクレオチドに対し，実質的に同じ結合親和性を有
している。いったん所望のサブユニット配列が選択され
ると，このポリマーを組立てる方法は第５節に示され
る。
このポリマー組成物は，第６−７節に記述の新規な固
相診断システムに有用である。このシステムは，各結合
された分析分子に対し増幅されたレポーターシグナルを
与えるべく，分析ポリヌクレオチド分子の担体結合ポリ
マー分子への結合および続いて起こる多数のポリカチオ
ン性レポーター分子のこのポリヌクレオチドへの静電気
的な付加に基づいている。
I.サブユニット構造 A.認識部分 本発明のポリマー種を形成する際の使用に適当なサブ
ユニットＢ−Riの設計には，多数の構造上の規準および
／または立体化学的な規準が包含される。この規準は，
バックボーン部分および認識部分だけでなく，この２つ
の間の連鎖によっても達成されるに違いない。この認識
部分の設計上の必要条件がまず考慮されるだろう。
各サブユニットの認識部分は，確かな立体配置で保持
された２つまたは３つの水素結合基を供給するに違いな
い。この立体配置は，標的遺伝子配列の特異化された内
部配列塩基上の２つまたは３つのワトソン／クリック水
素結合部位に対する水素結合に適合する。認識部分とそ
れに対応する標的塩基との間の望ましくないミスペアリ
ングを避けるために，使用条件下において，（１）この
認識部分の互変異性状態を相対的に安定化すべきであ
り，そして（２）この認識部分は，水素結合基が相対的
に固定した配置となる構造を有するべきである。このよ
うな固定化は，最適には，極性の水素結合基を有する環
構造により提供される。この極性の水素結合基は，環の
一部を形成するかあるいは環に直接付加されるかいずれ
かである。
このより好ましい認識部分の構造は，プリン，プリン
類似物，ピリミジン，およびピリミジン類似物の構造を
含んでいる。この構造は,2つまたは３つのいずれかの水
素結合を介して，選択されたポリヌクレオチド塩基とワ
トソン／クリック塩基対を形成するように設計されてい
る。ポリマーの合成で用いられるサブユニットの基は，
少なくとも２つの認識部分を含んでおり，この認識部分
は，異なるポリヌクレオチド塩基に対し塩基特異的であ
る。好ましくは，天然のDNAヌクレオチドまたはRNAヌク
レオチド中の４つの塩基のそれぞれに対し,1つまたはそ
れ以上の認識部分がある。また，以下でわかるように，
認識部分の１つの基Ri（これは２つの水素結合を介して
ヌクレオチド塩基と塩基対になり得る）と,2番目の基Rj
（これは３つの水素結合を介して同じ塩基と結合し得
る）とを供給するのが望ましい。第１図に，典型的なプ
リン型の認識部分およびピリミジン型の認識部分を示
す。このプリン構造１および２は，チミン塩基またはウ
ラシル塩基と結合するべく設計されており，構造３−６
はグアニン塩基と，構造７−９はシトシン塩基と，そし
て構造10-12はアデニン塩基と結合するべく設計されて
いる。構造1,4,5,6,8および10-12は,2つの水素結合を介
して，対応する内部配列塩基と結合するように適合され
たRiタイプの部分である。残りの構造は，Rjタイプの部
分であり，これは塩基対上に３つの水素結合を形成す
る。以下でわかるように，プリンヌクレオシドおよびピ
リミジンヌクレオシドは，ポリマー合成での使用に適当
な種々の他のサブユニットを合成する際に有用である。
これらのサブユニットは，必要ならアミン保護基で修飾
される。これらは，市販の原料から得られるかまたは公
知方法（例えば，実施例１に記述されているかまたはそ
れに関連した方法）に従って調製され得る。
多くのプリン類似物構造またはピリミジン類似物構造
が第２図に示されている。これらの構造内では，認識部
分が環状炭素を介してバックボーンと連結されている。
これらの構造は，第１図に示される類似物構造の塩基対
特異性や水素結合特性と似かよった塩基対特異性や水素
結合特性を有する。炭素で連結された認識部分を含むポ
リマーの結合特性は，認識部分が窒素で結合されるポリ
マー（第１図のような）の結合特性と著しく変わらない
けれども，この炭素で結合した部分を含むサブユニット
は，一般に，実施されたプリンおよびピリミジンを含む
サブユニットよりも合成が困難である。しかしながら，
あるサブユニットの合成，例えば，実施例10に記述のア
キラルな非環状のバックボーンサブユニットの合成で
は，炭素で結合した認識部分が有用な出発物質を提供し
ている。
B.バックボーン部分 各サブユニットのバックボーン部分は，一般式N1……
ＥまたはN1……N2を有する。ここで，N1およびN2は求核
性基であり,Eは求電子性基である。以下で論じるよう
に，得られるサブユニット間連鎖に必要な安定性および
サブユニット結合の容易性に基づくと，より好ましい求
核性基はアミノ基，水酸基およびヒドラジノ基である。
そして，より好ましい求電子性基および／または求電子
性結合試薬は，炭酸，チオ炭酸，カルボン酸およびスル
ホン酸の誘導体である。
バックボーン部分は，環状構造または非環状構造のい
ずれかを有し得る。可能なバックボーン部分の構造の全
数は極めて多いものの，それにもかかわらず，多くの要
因のために，かなり限られた数の構造しか実際に実施す
るに値しない。都合のよいバックボーン部分を選択する
最初の手順を次に示した。
第一の条件としては，これら環状のバックボーン部分
だけは，デオキシリボースまたはリボースからなるかま
たはそこから容易に誘導され得ると考えられた。この制
約は実際的な制約であり，これは，多数のキラル中心を
もつ環構造を新生合成することが困難であるうえにそれ
に対応してより多くの経費がかかることを反映してい
る。一般に，ポリマーに適当と思われる可能性のあるバ
ックボーン部分およびサブユニット間連鎖は，以下の要
因の１つまたはそれ以上に基づいて選択された：公知の
反応に基づく合成の実行可能性；入手可能な出発物質か
らの合成の予期された容易性：構造の簡単さ；および最
終的なバックボーンの予期された安定性。
都合のよいバックボーン部分およびサブユニット間連
鎖の最初の選抜は，以下のように行われた。Ｂ型のオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドおよびＡ型のオリゴヌクレ
オチドのＸ線回折により決定されたパラメーターに従っ
て，二重のDNAおよびRNAの空間−充填CPK分子モデルが
構成された。これら構成された各二重構造において,2つ
の糖−リン酸塩バックボーンのうちの１つは除去され
た。次いで，可能であれば，この塩基形状における最初
の糖−リン酸塩バックボーンが除かれた部位に，各可能
性のあるバックボーンが付加された。得られた各ポリヌ
クレオチド／ポリマー二重構造は，次いで，そのワトソ
ン／クリック塩基対の同一平面性，可能性のあるポリマ
ーバックボーン中のねじれ歪みおよび角度歪み，この核
酸鎖上で付与される歪みの程度，および鎖間および鎖内
の非結合性相互作用について調べられた。各アミド基を
含むバックボーンについて，そのアミド部分が平面的な
コンホーメーションを容易に採用し得るかどうかに，特
に注目が払われた。
これら初期の研究から，次のことが立証された。必要
なユニットバックボーン長（すなわち、N1……Ｅ内のN1
……Ｅ間隔または活性化されたN1……N2−Ｅサブユニッ
ト内のN1……Ｅ間隔）は，デオキシリボースまたはリボ
ース（環状バックボーン構造）を構成するか，またはそ
こから誘導されるバックボーン部分に対し,5−７原子で
あり,6原子長さが最適である。
上記モデル研究で受入れ可能と判断されたサブユニッ
ト構造は，次いで，合成の実行可能性および集められた
ポリマーバックボーンの安定性に関して評価された。
（この合成の実行可能性は，文献で報告された主要な合
成反応またはモデル化合物に関して実施される反応に基
づくか，および／またはこのサブユニットの実際の合成
を媒介としている。）（この集められたポリマーバック
ボーンの安定性では，一般に，適当に連結されたモデル
化合物またはサブユニットダイマーを用いて予備の安定
性研究が実行された。）これらのタイプの研究は，候補
となるバックボーン構造の数をさらに制限するべく用い
られた。この制限された候補のプールから，より好まし
い構造として，第３図に示す環状バックボーン構造Ａ−
Ｇが最終的に選択された。
この図では，N1……N2タイプの環状バックボーン部分
を含むサブユニットＡ−Ｄは,2′−デオキシリボヌクレ
オシド（構造Ａ）:5′位置および３′位置がアミノ基で
置換された２′−デオキシリボヌクレオシド（それぞ
れ，構造ＢおよびＣ）；およびリボヌクレオシドのモル
ホリノ誘導体（構造Ｄ）を包含している。N1……Ｅタイ
プのバックボーン部分を含むサブユニットは，これらの
５′位置が１つまたは２つの炭素酸で置換された２′−
デオキシリボヌクレオシド（それぞれ，構造Ｅおよび
Ｆ）；および，これらの５′位置がカルボン酸で置換さ
れたリボヌクレオシドのＮ−アミノモルホリノ誘導体
（構造Ｇ）またはスルホン酸で置換されたリボヌクレオ
シドのＮ−アミノモルホリノ誘導体（構造Ｈ）を包含し
ている。
非環状（分岐していない鎖）のバックボーン部分に適
用される同じ分子モデルの方法では，一本鎖ポリヌクレ
オチドに対する塩基対水素結合内のポリマーコンホーメ
ーションに関して,4−６原子の範囲のユニットバックボ
ーン長が受け入れられ,5原子のバックボーン長が最適で
あることが示された。これは,6原子のユニットバックボ
ーン長が最適である環状バックボーンと対照的である。
さらに，このモデル化研究では，以下のことが示され
た。この環状の認識部分は，この相補的な塩基の同一平
面性を厳密に阻害することなく，しかもこの認識部分と
バックボーンとの間の望ましくない相互作用を導入する
ことなしでは，線状のバックボーン部分に直接付加し得
ない。この認識部分が１原子のスペーサーでこのバック
ボーン部分と連結されると，結合歪みが最小となった。
２原子スペーサーは許容されるが,3原子スペーサーは許
容され得ない。しかし，この認識部分と線状のバックボ
ーンとの間の自由度が増すと,2原子スペーサーでは標的
塩基と誤って対になり得る。
第４図に示される非環状バックボーン部分の構造Ｉ−
Ｎは，すべてバックボーン部分と認識部分との間に１原
子のメチレンスペーサーを含んでいる。この構造では，
相補的なポリヌクレオチドに好ましい塩基対に対する良
好なモデルが得られると予測された。２つの炭素スペー
サーを含む類似構造は受け入れ可能なことが示された
が，結合コンホーメーションは好ましくなかった。図に
示される構造および類似の２つの炭素スペーサー構造
は，一般に合成が容易なために，より好ましい非環状バ
ックボーン部分である。しかしながら，多くの他のバッ
クボーン部分もまた，一般に合成が容易でないかおよび
／または合成には安価ではないものの，まったく実行可
能でありかつ適当であることに触れておくべきである。
C.バックボーン／認識部分の結合 上記に示されるように，このポリマーサブユニット内
のバックボーンと認識部分とを接続する連鎖またはスペ
ーサーは，ある設計規準に適合するに違いない。この規
準は，ポリヌクレオチド塩基と結合する塩基対に対し，
この認識部分を位置決めするのに効果的である。第３図
に示される環状バックボーン部分の場合では，この認識
部分が，リボース構造またはリボース類似構造の１′炭
素に直接付加するときやモルホリノ構造の類似の１′位
置に直接付加するとき，このポリマー内の結合コンホー
メーションが最も好ましいことがモデル化研究により示
される。すなわち，この部分は，正規の結合位置におい
て，ヌクレオシドのリボース基またはデオキシリボース
基に対するプリン塩基またはピリミジン塩基の正しい立
体異性化立体配置で付加している。非環状の構造に関
し，この認識部分を好ましい結合位置に置くためには,1
つおよび２つの炭素原子スペーサーが必要である。１原
子スペーサーは，上記に論じられるごとくより好まし
い。
ポリヌクレオチド標的に対しこのポリマー分子が一定
の結合親和性を得るのに要する立体規則性ポリマーの立
体配置を達成するためには，このバックボーン／認識部
分の結合が，すべて一定のキラリティーを有するかまた
はアキラルかいずれかであることも必要である。もし，
各結合がこのすべてのポリマー分子のあるサブユニット
位置において，同じ立体異性化立体配置またはキラリテ
ィーを有するなら，ここでの定義のために，この結合は
一定のキラリティーを有すると考えられる。すなわち，
異なる配列位置でのサブユニットは，異なる内部の立体
異性化立体配置（特性の配列位置でのアキラリティーを
含む）を有し得るけれども，このポリマー分子間で与え
られた配列位置における結合は，すべて同じ立体異性化
立体配置を有する。ふつうに定義されたキラリティー
は，すべてのサブユニットに同じ立体異性化立体配置を
用いることにより，極めて容易に達成される。
この環状のバックボーン部分に対し，第３図に示され
る天然のＤ型立体異性化立体配置を有するヌクレオシド
類似物では，最も好ましい結合が起こる。このタイプの
サブユニットもまた，以下に論じられるごとく，天然の
Ｄ型ヌクレオシド出発物質を用いて，容易に合成され
る。第４図に関して，構造ＩおよびＬだけが，このバッ
クボーンと認識部分との間にキラルな連鎖を有すること
がわかる。これらのサブユニットは，記述のように，ホ
モキラルな出発物質を用いることにより，ホモキラルな
形状で容易に合成される。第４図に示される他の非環状
構造のすべてに対し，バックボーンの窒素原子にこの１
原子鎖が付加され，それゆえアキラルとなる。もちろ
ん，このメチレンスペーサーもまたそれ自体アキラルで
ある。
II.保護基の戦略 このサブユニットの活性化および／またはカップリン
グに用いられる化合物がかなり高い反応性を有するため
に，この認識部分の環外にあって環に結合した窒素を保
護することが，一般に望ましく，またしばしば必要であ
る。これら保護基の選択は，まず第１に，これらサブユ
ニットから組立てられるポリマー内で用いるサブユニッ
ト間結合のタイプにより決定される。２番目には，保護
されるべき窒素の相対的な反応性により決定される。
塩基保護されたヌクレオシドは，また，以下で述べら
れるような多くのサブユニット合成反応において，有用
な出発試薬である。実施例１の極くありふれた多数のリ
ボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを塩基
保護する方法は，実施例２に例示されている。この実施
例に詳述されている方法は，一般に，アミン保護基をも
ったヌクレオシドの形成に適用できる。
用いられるサブユニット間連鎖が求核剤，特に水酸化
アンモニウムに相対的に安定であると，核酸化学に用い
られる一般の塩基保護基が適している。このような求核
感度のないサブユニット間連鎖には，カルバミン酸塩連
鎖，アミド連鎖およびスルホンアミド連鎖が含まれる。
この認識部分に対し，対応する求核感度のある保護基に
は,CのN4に対するベンゾイル基,AのN6に対するベンゾイ
ル基またはｐ−ニトロベンゾイル基,GのN2に対するアセ
チル基またはイソブチリル基，および2,6−ジアミノプ
リン残基に対するN2,N6−ビスイソブチリル基がある。
ポリマー集合体の完成後において，水酸化アンモニウム
で処理することにより，これらの基の除去が達成され
る。
対照的に，用いられるサブユニット間連鎖が水酸化ア
ンモニウムのような求核剤に感度があると，適当な保護
基は，強力な非求核性塩基により，β脱離機構を経て除
去され得る保護基である。このような求核感度のあるサ
ブユニット間連鎖には，炭酸塩連鎖，エステル連鎖，お
よびより狭い範囲では，トリカルバミン酸塩連鎖が含ま
れる。この認識部分に対し，β脱離を経て除去可能な適
当な保護基には,CのN4およびＡのN6の両方に対する２−
（４−ニトロフェニル）エトキシカルボニル基または２
−（フェニルスルホニル）エトキシカルボニル基，およ
びＧのN2および2,6−ジアミノプリン残基のN2およびN6
に対する９−フルオレニルメトキシカルボニル基が包含
される。ポリマー集合体の完成後におけるこれらの基の
除去は，厳しい無水条件下での強力な非求核塩基1,8−
ジアザビシクロ〔5,4,O〕ウンデク−７−エン（DBU）の
処理により達成される。
このバックボーン部分（一般には上記構造のN1）の一
時的な求核保護に関して，一般的なポリマー集合戦略で
は，温和な酸により容易に取り除かれる選択されたバッ
クボーン保護基が用いられる。保護基の選択に関する１
つの主要な規準は，これらの基が充分に安定ではある
が，除去に要する条件が成長ポリマーを損なうほど安定
ではないことにある。環状のバックボーン部分から集め
られたポリマーの場合のおもな問題点は，保護されたプ
リン残基をこれらバックボーン部分のC1に連結させるグ
リコシド結合の著しい酸感度にある。このバックボーン
保護基の選択に関する第２の基準は，この保護基が容易
に導入されるところにある。上記に基づいて，以下のバ
ックボーン保護基がより好ましい;1級水酸基に対するジ
（ｐ−メトキシ）トリチル基;1級アミン基に対するｐ−
メトキシトリチル基；および２級アミン基（モルホリノ
タイプのバックボーン部分中におけるような）に対する
フェニルイソプロポキシカルボニル基。これら保護基
は，ジクロルメタン中で0.2Mのジクロル酢酸の処理によ
り，容易に除去され得る。
III.サブユニット合成 A.環状バックボーン部分 デオキシリボヌクレオシドサブユニット構造（第３図
の構造Ａ）を有するサブユニットは，市販の原料から得
られるかまたは実施例Ｉに記述のように，文献の方法に
より調製され得る。このサブユニットは，以下のリボシ
ドおよびデオキシリボシドを含んでおり，第１図で得ら
れる認識部分の構造数に従って同定される：アデノシン
およびデオキシアデノシン（構造１）;2,6−ジアミノプ
リンリボシドおよびデオキシリボシド（構造２）；シト
ジンおよびデオキシシトジン（構造３）;4−メトキシ−
２−ピリミジノンデオキシリボシド（構造４）;2−ヒド
ロキシ−５−メチルピリミジンデオキシリボシド（構造
５）;2−ヒドロキシピリミジンリボシド（構造６）；グ
アノシンおよびデオキシグアノシン（構造７）；イノシ
ンおよびデオキシイノシン（構造８）；チオグアノシン
およびデオキシチオグアノシン（構造９）；ウラジンお
よびデオキシウリジン（構造10）；チミジンおよび５−
メチルウリジン（構造11）；および５−ハロウリジンお
よび５−ハロデオキシウリジン（構造12）。
この５′−アミノ−２′,5′−ジデオキシリボヌクレ
オシド（第３図の構造Ｂ）は，実施例３に詳述の方法に
従って調製される。簡単に言えば，この選択されたデオ
キシリボヌクレオシド（必要に応じて塩基で保護され
た）は，トリフェニルホスフィン，四臭化炭素およびリ
チウムアジドとの反応に供され，対応する５′−アジド
ヌクレオシドが形成される。これは，次いで，炭素触媒
上のパラジウム存在下にて水素化により還元される。こ
のヌクレオシドは実施例１のように得られ，そして実施
例２のように塩基保護され得る。この反応物ヌクレオシ
ドの立体化学は５−アミノヌクレオシド類似物を形成す
る際に保存される。
他の還元方法は，実施例3.2に記述のように,5′−ア
ジド−５−ブロモウリジンのアジド基を還元する際に用
いられる。ここで，触媒なしの水素化は，環の臭素原子
の分離を妨げるために必要である。この５′−アミング
アノシン化合物を形成する際に，実施例3.2に詳述のよ
うに，まずこの５′水酸基のトシル化，次いでアジドで
の置換により，このアジドは５′位に配置される。
この３′−アミノ−２′,3′−ジデオキシリボヌクレ
オシド（第３図の構造Ｃ）は，実施例４に詳述の方法に
従って調製される。簡単に言えば,5′位の水酸基にて保
護されるチミジンは,3′位の水酸基にてトシル化され，
次いで,2オキシ塩基置換基により分子内置換される。得
られた環はアジドによる処理によりすぐに開環され，正
確な立体異性形状のアジド類似物が生じる。この類似物
は，このアジド化合物と，選択された塩基またはピリミ
ジン塩基との反応により，選択された塩基類似物に転化
され得る。この後者は，必要に応じて，以下に記述のよ
うに，続いて起こるサブユニットカップリング反応に対
し塩基保護されてもよい。このチミジンまたは他のアジ
ド類似物は，次いで還元され，所望の３′−アミンヌク
レオシドが生成する。このチミジン出発物質の立体化学
は，合成において保存される。
第３図の構造Ｄに示されるこのモルホリノタイプのサ
ブユニット誘導体の合成は，種々の異なる認識部分に対
し，実施例５で詳述されている。簡単に言えば，選択さ
れたヌクレオシド（必要に応じて塩基保護された）は，
重ホウ酸アンモニウムのようなアンモニウム塩に溶解さ
れ，次いで，過ヨウ素酸ナトリウムとの反応に供され
て，過渡的な２′,3′−ジアルデヒドが形成される。こ
れは，次いで，アンモニウムイオン上で閉環され,2′位
および４′位に水酸基を有するモルホリノ環が形成され
る。この化合物は，次いで，この環の水酸基を除去する
べく，シアノ水酸化ホウ素ナトリウムで処理される。こ
の環の窒素は，好ましくは，続いて起こるサブユニット
カップリングに対し,2−フェニルイソプロピルカルバミ
ン酸塩として保護される。このヌクレオシド出発物質の
立体化学は保持される。
５′−位に酢酸基を有するデオキシリボースサブユニ
ット構造（第３図の構造Ｆ）は，実施例６に記述の一般
的な合成スキームに従って調製され得る。このスキーム
は，構造Ｆで示される５′位が酢酸の化合物の合成を詳
述している。ここで,3′位が水酸基で保護されている選
択されたデオキシリボヌクレオシドは,5′位にアルデヒ
ドが転化され，続いて，不飽和な酢酸誘導体を与えるべ
く,2位に炭素のあるウィッティヒ試薬で処理される。こ
の側鎖オレフィンの還元により,5′位が酢酸である所望
の化合物が得られる。この反応は，出発ヌクレオシド物
質の立体化学を保存している。
この類似の５′位がギ酸塩の化合物（第３図の構造
Ｅ）は，上記５′ヌクレオシドアルデヒドを１個の炭素
のウィッティヒ試薬で処理し，得られたエノールを加水
分解して対応するホルムアルデヒド誘導体（これは所望
の酸に酸化される）を形成することにより，形成され
る。この反応は，出発ヌクレオシド物質の立体化学を保
存する。
B.サブユニット合成−非環状バックボーン 第４図の構造Ｉで示される５原子の鎖状アミノ酸サブ
ユニットは，実施例７−９で概説されている一般的な方
法に従って調製される。簡単に言えば，（Ｓ）−５−カ
ルボキシピロリドンが，公知方法により，立体化学的に
純粋な対応する（Ｓ）−５−トシルメチル−２−ピロリ
ドンに転化された。次いで，これは，選択されたプリン
またはピリミジンとの反応とに供され，対応する（Ｓ）
−５−メチルプリン（またはメチルピリミジン）ピロリ
ドンが形成される。この置換反応は最初の立体特異性を
保持し，その結果，形成されるサブユニットは，この認
識部分の結合部位において，このバックボーン炭素に対
し，同一異性である。
サブユニット合成に用いられるプリンは,1位および３
位の環窒素の反応性を減ずるべく，すなわち，環窒素に
ピロリドンがカップリングすることを最小にするべく，
好ましくは６位に電子吸引性基を含んでいる。このピロ
リドンが誘導されたプリンまたはピリミジンは，次い
で，以下に記述の開環ステップ前に，アミン誘導体に転
化され，必要に応じて塩基保護されてもよい。実施例7.
1および7.2はシトシンピロリドンおよびその塩基保護さ
れた誘導体の形成方法を詳述している。実施例7.3−7.5
で形成されるアデノシンピロリドンは，出発物質として
６−クロロプリンを用いている。この対応するピロリド
ンは，記述のように，アジド形成を経て，アデノシン誘
導体に転化される。このアデノシンは，実施例7.6のよ
うに開環前に塩基保護される。実施例7.7−7.9に記述の
ように,2−アミノ−６−クロロプリンから出発して，塩
基保護されたグアニンピロリドンを生ずるべく，類似の
方法が用いられる。2,6−ジアミノプリンピロリドン，
イノシンピロリドンおよび２−ヒドロキシピリミジンピ
ロリドンの合成にもまた，実施例７に詳述のように，類
似の方法が用いられる。
このピロリドンは，次いで,t−BOCで保護されたアミ
ンを用いてピロリドン環を開裂し，アミノ酸を形成する
一連の反応を経て処理される。実施例8.1−8.4は，多数
の選択された認識部分を有するこのようなｔ−BOCアミ
ノ酸の合成を記述している。最終ステップ（実施例５）
では，このｔ−BOC保護基は，第４図の構造Ｉで示され
る対応するアミノ酸を形成するべく，除去されてもよ
い。このアミノ酸は，以下の反応に従って，サブユニッ
トカップリングに対し直接用いられ得る。他方，このｔ
−BOCで保護された化合物は，サブユニットカップリン
グ反応で使用するために，その酸基において活性化され
得る。
第４図の構造Ｊで示されるサブユニット形成方法は，
それぞれシトジン類似物サブユニットおよびウリジン類
似物サブユニットを形成するために，実施例10.1と10.2
に概説される。簡単に言うと，ピリミジンタイプのサブ
ユニットを形成する際には，ピリミジンまたはニコチン
酸塩のような６員環の複素環が，バックボーンへの付加
がうまくできる炭素環部位で，反応性のあるメチレンを
含むように修飾される。。実施例10.1に詳説されるよう
に，このシトシン類似物は,5−アミノ−５−ブロモピリ
ミジンを反応させて対応する５−位のカルボキシアルデ
ヒドを形成することにより形成される。実施例12にある
ように，このウリジン類似物は,6−ヒドロキシニコチン
酸エステルを対応するベンジリックアルコールに転化す
ることにより，形成される。この化合物は，二酸化マン
ガン存在下の反応により，アルデヒドに転化される。
このアルデヒド化合物は，次いで,4−アミノ酪酸のよ
うな所望のアミノ酸との反応に供される。安定なアミン
サブユニット形成のために還元される不安定なイミンを
生成するアミン基で反応がなされる。この２級アミン
は，実施例10.1に記述のように,t−BOC基により，酸基
の活性化を含むサブユニットカップリングに対して保護
され得る。バックボーン窒素においてメチレンスペーサ
ーを通じて，バックボーンに塩基が付加され，このサブ
ユニットがキラル中心を持たず，それゆえ立体規則的で
ないようにされる。
第４図のＫに示されるサブユニット構造を形成するた
めに，上記化合物のＣ−炭素バックボーン類似物が,3−
アミノプロピオン酸を用いて調製され，この化合物はさ
らに，酸化窒素で処理され，対応するＮ−ニトロソ化合
物が形成される。この化合物は，鉄塩存在下でH2IPdに
より，順に還元されて，ヒドラジノ酸サブユニットが得
られる。
III.バックボーンカップリング反応 本発明のポリマー分子の形成に用いられるカップリン
グ反応は，ひとつの選択されたサブユニットまたはサブ
ユニット配列を，もうひとつの選択されたサブユニット
またはサブユニット配列に結合させる段階的反応であ
る。この議論をするため，このカップリング反応は，一
般に，選択された認識部分R1を有する単一のサブユニッ
トＢ−R1が，同一または相異なる選択された認識部分R2
を有するもう１つの単一のサブユニットＢ−R2とカップ
リングして以下の形状の２量体を形成することに関して
記述されるだろう。
ここでR1およびR2は示された特異的配列を有する。
A:サブユニットのカップリング；N1……N2バックボーン
立体配置 N1……N2バックボーン立体配置を有するサブユニット
のカップリングの一般的な方法は，第5A図および第5B図
に例示される。上記第Ｉ節から想起されるように，N1お
よびN2は，水酸基やアミン基のような求核性のバックボ
ーン基である。この基は，求電子基Ｅによって活性化さ
れ得，活性化されたN1−Ｅバックボーン基またはN2−Ｅ
バックボーン基が形成される。これらの基は，次いで，
第２のN1……N2タイプのバックボーン部分と反応してN1
……N2−Ｅ−N1……N2バックボーン結合された２量体を
形成する。このタイプのサブユニットバックボーンは，
上記に特に記述されており，第３図の構造Ａ−Ｄの環状
バックボーンである。構造ＡおよびＢでは，この活性化
されたN2求核基が３′水酸基であり，構造Ｃでは５′水
酸基，そして，構造Ｄでは構造Ｃの５′位の水酸基に相
当する６′位の水酸基である。
第5A図に例示されるより好ましいカップリング方法で
は，選択された認識部分R1を有するサブユニットは，求
電子基Ｅによって活性化される。この認識部分の星印
は，必要な塩基保護を示す。この図からわかるように，
この選択されたサブユニットは，N1求核基で保護されて
おり，（ａ）N2求核基だけが活性化される。および
（ｂ）この活性化されたサブユニットは，それ自体で重
合し得ないことを保証している。第３図の構造A,Cおよ
びＤでは，このバックボーン保護基が５′水酸基であ
り，この保護基は，好ましくはジメトキシトリチル（DM
TO）のような酸不安定基である。
第5A図に示される活性化試薬や以下の一般式を有す
る： ここでＸは，酸素または硫黄，そしてＣは，求核基（例
えば，水酸基の酸素かアミンの窒素）と反応しＹと置換
して活性化されたサブユニットを形成し得る活性な求電
子基である。
活性化剤（例えば，ビス−ｐ−ニトロフェニルカーボ
ネート）は，カルボニルで活性化されたサブユニット
（Ｘ＝０）を与え，カーボネートやカルバメートサブユ
ニット連鎖を形成する際に使用される。同様に，チオカ
ルボニル−ジ−（1,2,4−トリアゾール）（Ｘ＝Ｓ）の
ような活性化剤は，チオカルバメート連鎖を形成する際
に使用される。
カルボニルで活性化されたサブユニットを含むサブユ
ニット活性化反応は，第４図のＡで示される５′位が保
護された２′−デオキシヌクレオシドに対し，実施例11
に詳述されている；実施例12では，第４図のＢで示され
る５′位が保護されたアミノヌクレオシド；実施例13で
は，第４図のＤに示されるＮが保護されたモルホリノタ
イプのサブユニットについて詳述されている。これらの
構造中の水酸基の活性化に用いられる一般的な反応条件
は，一般に適用可能である；チオカルボニル活性化サブ
ユニットを含むサブユニット活性化反応は,Bに示される
５′−アミノヌクレオシドに関し実施例14で，そして第
３図のＤに示されるモルホリノタイプのサブユニットは
実施例15に示した。
この活性化反応に続いて，シリカゲルクロマトグラフ
ィーのような通常の方法により，活性化複合体が精製さ
れる。次いで，これは２番目のサブユニットとの反応に
供される。このサブユニットの選択された認識部分R
2は，完成したポリマー中の次の配列中の認識部分を形
成する。このカップリング反応は，好ましくは，活性基
がバックボーンのN2アミン基とは反応し得るが，N1水酸
基とは反応し得ないような，温和な条件下で実行され
る。それゆえ，この方法は，第４図の構造Ｂ−Ｄに示さ
れるタイプのサブユニットのカップリングには適してい
るが，構造Ａのサブユニットには適さない。このカップ
リング方法の有利な点は，第２のサブユニット−これ
は，アミンN1の求核基および水酸基N2の求核基を含む−
が，最初に活性化されたサブユニットと，このN1アミン
を介してのみカップリングし，それゆえN2バックボーン
基を保護する必要がないことにある。従って，得られる
２量体サブユニットは，図に示されるように，N2−Ｅ−
N1結合を通じてカップリングされる。
（ａ）この第２のサブユニットの遊離のN2求核基を活
性化し，活性化剤からこの活性化された種を分離し，そ
して活性化された化合物を，バックボーンが保護されて
いない次の配列中のサブユニットとカップリングさせる
という上記のステップをくり返すことにより，このオリ
ゴマーが伸長され得る。この方法は，固相ブロックの集
合に適した溶液法（下記で記述されている）によって，
短いオリゴマーブロックを形成するのに特に使用され
る。
固相の連続的なサブユニット添加によってポリマーを
形成するために，第5B図に概説される第２のカップリン
グ法が，より好ましい。この第２の方法は，存在するサ
ブユニットまたはポリマー鎖に，活性化された過剰のサ
ブユニットを付加することにより，ポリマーの成長が起
こる点で，最初の方法とは異なっている。むしろ最初の
方法では，活性化されていないサブユニットを活性化さ
れた鎖に付加することにより，ポリマーの成長が生じ
る。第5B図には，認識部分がR1（第5B図の２列め）のサ
ブユニットにより，存在するサブユニットまたはサブユ
ニット鎖が示される。このサブユニットは，遊離のN1バ
ックボーン求核基およびN2求核基を有する。このN2求核
基は，固体担体との比較的酸に安定な結合により，また
は固体担体と結合するサブユニット鎖に連結されること
により，保護されている。このようにN2が保護された環
状バックボーンサブユニットを形成する方法は，一般的
に実施例12〜15に述べられている。この最初のサブユニ
ット（成長するポリマー中で最も最近付加されたサブユ
ニット）は，ポリマー中の次の配列内のサブユニットに
なる活性化されたサブユニットとの反応にすぐに供され
る。この活性化されたサブユニットは，N2バックボーン
部位で活性化され，そして比較的酸に不安定な保護基に
よってN1部位が保護されている。このサブユニットは，
第６図に関連して上記で述べた方法により調製される。
第5B図でわかるように，このカップリング反応によ
り，N2−活性化した第２のサブユニットが，N1−保護さ
れた第１のサブユニットに付加され，N2−Ｅ−N1結合を
介して両者がカップリングされ，そして遊離のバックボ
ーン求核部位の両方が保護された化合物が形成される。
この化合物は，例えば酸と反応させることによりすぐに
処理され，最後に付加されたサブユニット上の酸に不安
定なN1保護基が脱保護される。この手順は，所望の配列
ポリマーを構築するべく繰り返される。
上記のことから，このN2活性化されたサブユニット
（これは，最後の配列中のサブユニットを形成する）
は，そのN1バックボーン部位で保護され，それによりN2
部位での選択的な活性化を可能にするとともに活性化さ
れた化合物の自己重合を防止するに違いない。また，こ
のN1−脱保護されたサブユニットは，活性化サブユニッ
トとカップリングし得る。このサブユニットは，N2−活
性化されたサブユニットとそのN1部分との選択的な反応
を可能にするべく，N2部位が保護されるだろう。それゆ
え，この反応するサブユニットは,1つのバックボーン部
位がともに保されているので，この方法は，ヌクレオシ
ド（第４図の構造Ａ）のカップリングだけでなく，アミ
ンと水酸基バックボーン求核基の両方を含んだ環状バッ
クボーンを有するサブユニット（例えば，この図の構造
Ｂ−Ｄ）のカップリングにも適している。構造Ａのサブ
ユニットを，カーボネート結合を介してカップリングす
るのに用いられる反応方法は，実施例12に詳述される。
簡単に言うと,5′位が保護されたバックボーン部分を含
むサブユニットが,3′位の水酸基にて活性化され,3′位
の水酸基を保護した他のサブユニット（または成長鎖）
との反応に供される。このカップリング反応は,N−メチ
ルイミダゾールまたはN,N−ジメチルアミノピリジンの
ような，カーボネート結合を形成するのに必要な触媒の
存在下で実行される。構造Ｂ〜Ｄの環状バックボーンを
含むサブユニットのカップリングには，サブユニット間
のカーバメート結合またはチオカーバメート結合が形成
される場合において，最初の方法に関して上に記述のよ
うなより温和な，触媒のないカップリング条件が適して
いる。
この第２のカップリング方法の，固相サブユニット添
加によるポリマーの形成に対する有利な点は，実質的に
過剰のモル数の活性化されたサブユニットが，各ポリマ
ーの添加段階において，成長している担体結合ポリマー
に加えられ，その結果，非常に高い割合で担体結合ポリ
マーにカップリングしているサブユニットが得られる点
にある。このことは，大部分の担体結合ポリマーが，所
望のサブユニットの完全な配列を含むことを保証してい
る。第１の方法と比較すると，この成長しているポリマ
ーが，最後に添加されたサブユニットで活性化される場
合には，サブユニット添加の効率は，活性化段階の効率
によって制限される。
第６図は，第４図でＡ−ＡからＤ−Ｄまで示される環
状バックボーンサブユニットのカップリングにより形成
される２量体構造を示す。この図の構造Ａ中のヌクレオ
シドサブユニットは，カーボネート（Ｙ＝Ｏ）により結
合される。残った３つの構造Ｂ−Ｄでは，このサブユニ
ットは，カーバメート（Ｙ＝Ｏ）結合またはチオカーバ
メート（Ｙ＝Ｓ）結合により連結される。この図からわ
かるように，すべてのサブユニット連鎖は，荷電してお
らずしかもアキラルである。すなわちキラル中心を含ん
でいない。添付に際し，この連鎖は，水系媒質中で安定
である。このことは，中性の水系溶液中において，長期
間にわたって加水分解に耐性があるというポリマーの性
能から判断される。
本発明の他の重要な特徴によれば，この構造は，ポリ
マーを形成するべく結合されるとき，相補的なポリヌク
レオチドとともに正しいワトソン／クリック塩基対を示
す。
最後に，もう１つの本発明の重要な特徴によれば，こ
のサブユニットから形成されるポリマーは，立体規則性
である。これは，（ａ）天然のヌクレオシドまたはヌク
レオシド誘導体または天然の立体異性化立体配置を有す
る合成ヌクレオシドをサブユニットとして用いること，
および（ｂ）アキラルなサブユニット間連鎖によりこの
サブユニットを連結すること，により達成される。カッ
プリング方法の例は，実施例11〜15に詳述される。
B.サブユニットカップリング；N1……Ｅバックボーン立
体配置 N1……Ｅバックボーン立体配置を有するサブユニット
の一般的なカップリング方法は，第7A図，第7B図および
第7C図に例示される。上記第Ｉ節から想起されるよう
に，N1は水酸基またはアミン基のような求核性バックボ
ーン基であり,Eは，カルボキシル基またはスルホニル基
のような求電子基である。このN1は，活性化されると，
第２のN1……Ｅタイプのバックボーンと反応して，N1…
…Ｅ−N1……Ｅバックボーン結合２量体を形成し得る。
このタイプのサブユニットバックボーン，特に上記に述
べられるバックボーンは，第３図の環状バックボーン構
造Ｅ〜H,および第４図の非環状バックボーン構造Ｉ〜Ｎ
である。この環状構造ＥおよびＦにおいて，このN1求核
基は,3′位の水酸基であり，構造ＧおよびＨでは，モル
ホリノ環上の３′位の窒素に付加されたアミンである。
すべての環状構造において，このＥ基は，リボース環の
５′位かまたはモルホリノ環の６′位に付加したカルボ
キシル基または対応するスルホニル基である。第４図に
示されるすべての構造では，このN1基およびＥ基は，そ
れぞれバックボーンアミンまたはヒドラジンおよびバッ
クボーン部分末端のカルボキシル基またはスルホン酸基
である。
この第１のカップリング方法は，第7A図に例示されて
おり，第5A図に関連して上記に述べた方法と類似してい
る。ここでは，第１のN1−保護されたサブユニットが活
性化され，次いで，バックボーン−非保護サブユニット
と直接カップリングされる。このサブユニットは，成長
しているポリマー中の次の配列内のサブユニットを形成
する。このサブユニットN1のP1保護基は，好ましくは，
固体担体に結合した開裂可能なリンカーか,t−ブトキシ
カルボニル基のような酸に不安定な保護基である。環状
バックボーン構造のN1−保護の方法は，環状構造Ａ〜Ｄ
に対し上記に述べた手順に類似している。同様の方法
が，非環状バックボーン構造中のアミンの窒素の保護に
効果的である。他方，もしこのポリマーが固相の担体上
で構成され得るなら，下記に述べるように，このバック
ボーンのN1部位は，成長ポリマーへのサブユニットの添
加に伴うN1部の固体担体への結合により保護され得る。
この成長ポリマーは，最後に添加されるサブユニットの
活性化された求電子基Ｅにより生じる。
この活性化反応は，活性化された部分または鎖の末端
部分が，N1……Ｅ−Ｘを形成するように設計される。こ
こで,Xは第６図に関連して上記に記述されている。この
活性化されたサブユニットは，バックボーン求核基に対
して，以前に述べた方法で活性化されたサブユニット
と，ほとんど同様の反応性を有する。すなわち，この活
性化は，N1……N2タイプのバックボーンとほとんど同様
の活性化カップリング基を生成するべく設計されてい
る。しかし，その場合，この反応性のカルボニル基また
はスルホニル基が，第６図に示される方法のように，活
性化試薬のカルボニル基またはスルホニル基よりむしろ
バックボーン自身により供給される。この活性化は，バ
ックボーンの求電子基がカルボニル基の場合,p−ニトロ
フェノールの存在下で，N1……Ｅタイプのサブユニット
をカルボジイミドと反応させることにより，容易に達成
され得る。または，このバックボーンがスルホニルの場
合には，イミダゾール,1,2,4−トリアゾールまたはテト
ラゾールの存在下でこのサブユニットをカルボジイミド
と反応させることにより達成され得る。カルボニル求電
子基を含むサブユニット活性化反応は，実施例16および
17に詳述される。このＮ−アミノ−モルフィリノ基およ
び線状鎖バックボーンのカルボニル基を活性化するのに
用いられる一般的な反応条件は，一般に，第３図および
第４図に示される他のN1……Ｅタイプのバックボーン構
造にも適用できる。
この活性化反応につづいて，この活性化複合体は，シ
リカクロマトグラフィーのような通常の方法により精製
される。または担体結合され活性化された鎖の場合に
は，単に洗浄される。次いで，選択された認識部分R2が
完全なポリマー中の配列内の次の認識部分を形成するよ
うな第２のサブユニットとの反応に供される。このカッ
プリング反応によって，図に示されるような２量体が得
られる。この２量体のサブユニットは，それゆえ,E−N1
結合を介してカップリングされている。上記のように，
両方のサブユニットは，活性化反応およびカップリング
反応の間に，適切に塩基保護されなければならない。
このポリマーは，上記の段階をくり返して伸長し得
る。この段階は，（ａ）第２のサブユニット中の遊離の
Ｅ求電子基を活性化すること，（ｂ）この活性化剤から
活性化された種を分離すること，および（ｃ）この活性
化された化合物と，次の配列中のサブユニット（これ
は，バックボーンが保護されていない）とをカップリン
グさせることである。
この第２のカップリング方法は，第7B図に例示され
る。この方法は，第5B図に関連して上記に記述の方法
と，直接的に類似している。ここでは,E−保護されたバ
ックボーンを有する最初のサブユニットが，活性化され
たＥ基および保護されたN1求核基を有する第２のサブユ
ニットとの反応に供され,E−N1結合により連結されかつ
両方の遊離したバックボーン末端基が保護された２量体
が形成される。このポリマーが，固相合成によって形成
される場合には，このP2保護“基”は，固体担体と酸安
定性の連鎖を形成する。このN1−保護されたサブユニッ
トは，上記のように調製されそして活性化される。カッ
プリングの条件は，一般に，上記の環状サブユニットカ
ップリング反応で用いられる条件に従う。
第7C図に示される第３のカップリング方法では，この
N1−保護されかつＥ−非保護のサブユニット（またはポ
リマーユニット）が，指示されるごとく，カルボジイミ
ドのような適当なＥ−活性化試薬の存在下で，ともに反
応に供される。
第８図は，環状および非環状のバックボーンサブユニ
ット（これらは，それぞれ第３図および第４図のＥ−K,
およびＥ−ＥからＫ−Ｋで示される）をカップリングす
ることにより生成する２量体構造を示す。第３図の構造
Ｆ−Ｆのヌクレオシドサブユニットは，エステル結合で
連結されている。環状バックボーン構造のままで，この
サブユニットＧ−Ｇは，ヒドラジド結合あるいはスルホ
ニルヒドラジド結合を介して連結されている。Ｉ−I,J
−ＪおよびＫ−Ｋに示される非環状バックボーンサブユ
ニットの全ては，アミド結合（Ｅ＝カルボニル）または
スルホンアミド結合（Ｅ＝スルホニル）を介して連結さ
れている。上記に述べられた環状バックボーンサブユニ
ット構造におけるように，すべてのサブユニット連鎖
は，エステル結合，ヒドラジド結合およびアミド結合の
溶液中での公知の安定性から推定されるように，水系媒
質中にてかなり安定である。
本発明の他の重要な特徴によれば，この構造は，ポリ
マーを形成するべく連結されるとき，相補的ポリヌクレ
オチドと，ワトソン／クリック塩基対を示す。
最後に，上に述べたN1……N2バックボーンサブユニッ
トとともに示されているすべてのN1……Ｅバックボーン
構造は立体規則性である。これは，（ａ）認識部分のバ
ックボーン部分への付加のホモモラル（第３図のＥ〜Ｈ
および第４図のＩとＬな性質またはアキラル（第４図の
J,K,MおよびＮ）な性質，および（ｂ）アキラルなサブ
ユニット連鎖による。
C.サブユニットのカップリング；交互に荷電され荷電さ
れてないアキラルな連鎖 いくらかの応用において，ひとつかあるいはそれ以上
の荷電されたアキラルなサブユニット連鎖をポリマー分
子中に導入することが望ましい。以下でさらに記述され
るように，このバックボーンの電荷は，多くの溶液への
適用に際しポリマーの溶解度を促進し，あるいはポリマ
ーの標的結合定数を調整するために用いられ得る。荷電
されたアキラルなバックボーン連鎖，例えば,2番目かあ
るいは３番目のサブユニット間に規則的に配置したポリ
マーは，以下に述べるような新規な診察システムに適し
ている。現在議論している目的のために，アキラルな非
荷電連鎖によって内部に連結される２つかそれ以上のサ
ブユニットから構成されるポリマーユニットは，荷電さ
れたアキラルな連鎖により連結されうる。これらの非荷
電ユニットは，上記のＡ節およびＢ節に記述の方法の１
つにより形成される。
連結されうる２量体サブユニットは次のように選択さ
れる。ひとつの２量体の遊離したN2基が，もうひとつの
２量体の遊離のN1基と，適当に荷電されたアキラルな連
鎖を介して，カップリングされ得る。この望ましい連鎖
は，ひとつのサブユニットの遊離N2基と，もうひとつの
サブユニットの遊離のN1基がともに水酸基であることを
必要とするホスホジエステル結合である。第３図を見れ
ばわかるように，この条件では，構造Ａおよび構造Ｂの
いずれかのサブユニットから形成される２量体（その両
方は遊離のN2水酸基を有する）が，構造A,C,またはＤの
サブユニットから形成された２量体（これらは，全て遊
離のN1水酸基を有する）と結合するならば適当である。
典型的なカップリング方法では，N1を保護した２量体
Ａは，第９図に示されるように，ホスホエステル結合を
介してN2水酸基と連結された反応性ホスホエステルカッ
プリング種に誘導される一連の反応の間保たれる。より
好ましいカップリング方法は，米国特許出願“ポリヌク
レオチド測定試薬と方法”連続番号712,396（1985年３
月15日出願）に詳述されている。この方法は,4量体の形
成に関して，非荷電の立体特異的なメチルホスホネート
結合および荷電されたアキラルなホスホジエステル結合
を交互に有する。簡単に言うと，この例示された方法
は，まずメチルホスホネート結合により連結された方法
は，まずメチルホスホネート結合により連結されたヌク
レオチド２量体を形成し，この２量体を立体異性型を単
離し，そして立体異性型２量体のひとつを活性化して，
N1−保護された反応性のN2−（ｐ−クロロフェニル−２
−シアノエチル）−ホスフェートを形成することを包含
する。この活性化された２量体は，次いで，第２の２量
体との反応に供され，非荷電で立体異性型の連鎖および
荷電されたアキラルなサブユニット間連鎖により交互に
連結される４量体を形成する。
このホスホジエステル連結方法は，アキラルであるが
非荷電の結合反応を含むポリマーカップリングに関し,A
節およびＢ節に概説される一般的な方法に従って，溶液
タイプのポリマー合成方法か担体タイプのポリマー合成
方法のいずれかを組み合わせていてもよい。示されるよ
うに，このホスホジエステル結合は，非荷電のアキラル
な結合によりそれ自体カップリングされる２量体ユニッ
トあるいは多量体ユニットのカップリングに使用され得
る。あるいは，この結合は，非荷電でキラルだが立体異
性的な結合（メチルホスホネートが連結された２量体の
分離された立体異性形状）により連結される２量体ユニ
ットのカップリングに対し形成され得る。
下記に述べられる診断への応用のために，一般に，水
系媒質中で充分なポリマー溶解度を得るのに要するのと
同程度にほとんど荷電されていない連鎖を導入すること
がより好ましい。この溶解性の促進は，一般に，約20サ
ブユニットのポリマーあたり１〜３の荷電されたバック
ボーン連鎖，好ましくは,4サブユニットあたり約１つを
越えない荷電された連鎖で達成される。ここで定義され
るように，アキラルなバックボーン連鎖は，もしそれが
２量体ユニットあたり約１つの荷電バックボーン連鎖よ
り少ないバックボーン連鎖を含み，好ましくは,4量体ユ
ニットあたり１つか2,3のバックボーン連鎖を含むなら
ば，実質的に非荷電であると考えられる。
IV.ポリマー標的化の考察 本発明に用いられるポリヌクレオチド結合ポリマーを
調製する際に適用される設計上の考察は，標的分析物の
性質およびこの分析物が検定され得る反応条件に支配さ
れる。
最初の考察としては，選択された非単独重合性の標的
塩基配列（これに対し，ポリマーが指示されている）が
ある。この標的配列は，好ましくは，検定される分析物
に対して特有である。すなわち，この配列は，既知の多
数の配列塩基を含む検定混合物中にて，ある限定された
わずかの確率（例えば１％またはそれ以下）でのみ生じ
るべく算出される。既知のｎ−塩基標的配列の出現確率
は，およそ1/4nである。すなわち，既知のｎ−塩基標的
配列は，4n個の塩基を含むポリマー中において，約１回
出現すると推測されるだろう。それゆえ，既知のｎ−塩
基配列が,N個の特有の配列塩基全体を含むポリヌクレオ
チドで生じる確率Ｐは，およそＰ＝N/4nである。例示の
ために,9−塩基標的配列が20キロベースのヌクレオチド
内に見出される確率Ｐは，約20×103/2×105すなわち0.
08であり,16−塩基標的配列が存在する確率は約20×103
/4.3×109すなわち0.0000047である。これらの計算か
ら,9〜16個の一定の塩基標的配列に対し特異的な９〜16
個の認識部分を有するポリマーは，ウイルス性ゲノムだ
けを含む検定混合物（この最大の複合体は，約400Kの特
有の配列塩基に対応している）中の標的配列に対し，高
い特異性を有するべきことが見出されている。
類似のタイプの計算では,12〜16個のサブユニットポ
リマーが，ウイルス性およびバクテリア性のゲノム物質
（最大のゲノムサイズは約5000キロベース）だけを含む
検定混合物中にて，ウイルス性またはバクテリア性の標
的配列に対し充分な特異性を提供し得ることが示されて
いる。また,16〜22個のサブユニットポリマーは，動物
性のゲノミックDNA物質（ゲノムサイズは，特有の配列D
NAの約50億塩基対である）を含むポリヌクレオチド混合
物中にて，標的配列に対し充分な特異性を提供し得るこ
とも示されている。
このポリマー／分析物の結合親和性，および特にこの
ポリマーが標的配列とうまく結合する温度（融解温度す
なわちTm）は，（ａ）ポリマーの長さ，（ｂ）認識部分
とそれに対応する分析物の標的配列の配列内塩基との間
に形成されうる水素結合の数，（ｃ）バックボーンの荷
電密度，によって選択的に変化させ得る。モデルホモポ
リマー二本鎖における多くの研究から，オリゴヌクレオ
チド二本鎖の融解温度は,10〜20bpの範囲で，この相補
的な塩基が水素結合を２つ形成し得る場合には，添加さ
れる塩基対あたり，および３℃，この塩基が水素結合を
３つ形成し得る場合には，約６℃上昇する事が知られて
いる。それゆえ，最初にこのポリマーとの高い結合特異
性を保証するべく選択された標的配列の長さは，選択さ
れた検定条件での相補的な塩基ポリマーとの所望の融解
温度を得るために伸長されてもよい。また，上記に例示
のように，このポリマーを構成する際に用いられる認識
部分が標準的な核酸塩基であるなら，この標的配列は，
比較的高いポリマー／分析物の融解温度を達成するため
に，グアニン塩基にシトシン塩基を加えた割合を高くよ
うに選択されてもよい。または，この標的配列は，比較
的低い融解温度を達成するために，アデニン塩基にチミ
ン塩基を加えた割合を高くするよう選択されてもよい。
このポリマーのバックボーンの荷電密度は，このポリ
ヌクレオチド分析物の荷電密度より実質的に低くなけれ
ばならない。それは，すでに言及されているように，レ
ポーターのポリマーへの結合がおこらない条件下で，ポ
リカチオン性レポーター分子を分析物に優先的に結合さ
せるためである。この必要条件は，ポリマーバックボー
ンの隣接する負電荷の間隔が，分析物の隣接するホスホ
ジエステル結合の負電荷の間隔の少なくとも２倍あれば
満たされる。このバックボーンの荷電密度もまた，ポリ
マー／分析物の融解温度に重要な影響を与える。特に，
塩濃度が低い条件では，分析物とポリマーバックボーン
との電荷間の反発も,2つがアニールできる温度を低下さ
せるように作用し得る。それゆえ，一般に，電荷のより
少ないバックボーンを有するポリマーは，（１）分析物
／ポリマーの融解温度がより高くなること，および
（２）この融解温度の塩濃度への依存がより低くなるこ
と，を示すと期待されるだろう。これらの考察に基づく
と，第６図および第８図に関連して上記に記述される数
種のポリマーのような非荷電でアキラルなポリマーは，
交互に荷電されたアキラルなホスホジエステル結合およ
びアキラルまたはキラルのいずれかである非荷電の連
鎖，から形成されるポリマーのような部分的に荷電され
かつ立体特異的に限定されたポリマーより広範囲の塩濃
度で，診断方法におけるポリマーより広範囲の塩濃度
で，診断方法におけるポリマー／分析物のアニーリング
反応の実行を可能にさせるだろう。
V.ポリマー集合方法 A.幾何学的集合方法 第IV節で考察される要因によれば，所望のポリマー長
および認識部分の配列を選択した後，上記に詳述の一般
的なサブユニットカップリング手順を用いて，このポリ
マーが集められる。ポリマーを集める一つの方法には，
はじめに適当な一組の２量体を調製し，選択された２量
体を連結させて４量体を形成し，それらを連結して８量
体を形成するなど，が含まれる。この方法は溶液中で実
行され，第5A図および第7A図に関連して上記に記述され
る方法に実質的に従う。すべてのカップリングが必ずし
も同じサイズのオリゴマーの間で行われる必要がない事
に注目すべきである。例えば，しばしば，最後のカップ
リングでは,20量体を得るには,16量体と４量体とを連結
させること，あるいは24量体を得るには16量体と８量体
とを連結させることが望ましい。
この集合方法で特に有利な点は，それぞれのカップリ
ング生成物が，その前駆体のおよそ２倍の質量をもつの
で，それぞれのカップリング生成物の精製が簡単な事で
ある。下記の実施例18では,8サブユニットのカルバミン
酸塩が連結されたポリマーのこの方法により形成される
集合体について詳細に述べる。
B.固体担体上での段階的集合 ポリマー合成のための一つの好ましい方法として，固
体担体上での段階的な集合がある。ここでは，ポリマー
中の最初のサブユニットが，そのN2バックボーン基を介
して固体担体に付加される。典型的には，開裂可能であ
り好ましくは酸に安定な長鎖のリンカーによって誘導さ
れたガラスビーズのような固体担体が，この担体材料と
して用いられる。実施例19で記述のごとく，この固体担
体は，ヌクレオシドの５′水酸基のようなN2求核基の付
加のために調製される。このガラスビーズは，好ましく
は酸に不安定なN1保護基，および活性化されたN2基また
はＥバックボーン基を有するサブユニットと，第III節
に詳述のように反応に供される。種々のタイプのサブユ
ニットのガラスビーズ担体へのカップリングは，一般
に，実施例20〜22に記述されている。
この二番目のサブユニット（または，溶液中で集合さ
れうるポリマーユニット）の担体へのカップリングの
後，すべての未反応のリンカー求核基は,p−ニトロフェ
ニル酢酸塩のような適当なキャッピング試薬の付加によ
り，キャップされる。その後，担体は洗浄され濾過され
る。このN1末端サブユニット上の保護基は，典型的には
酸処理により除去される。中和の後，この担体は，次い
で，遊離のN2バックボーン部分で活性化される次の配列
中のサブユニット（またはポリマーユニット）の過剰量
との反応に供される。活性化された過剰のサブユニット
により，鎖を伸長されている多数の担体結合サブユニッ
トの数が最大になる。すなわち，この固体担体の集合方
法の一つの特徴は，各サブユニット付加段階において，
高いカップリング効率が必要なところにある。付加され
活性化されたサブユニットの濃度は，この効率を最大に
するように選択される。鎖の伸長は，各サブユニットの
付加の後，不足配列のキャッピングとともに，所望の長
さおよび配列のポリマーが得られるまで続けられる。こ
の一般的な方法は,14サブユニットの炭酸塩が連結され
たポリマーの調製に対し実施例20に,19サブユニットの
カルバミン酸塩が連結されたポリマーの合成に対し実施
例21に，そして19サブユニットのアミドが連結されたポ
リマーの集合に対して実施例22に示されている。
この最後の配列中のサブユニットの付加の後，このポ
リマーは，末端のN1基にカップリングされている適当な
荷電または非荷電の基とともにキャップされてもよい。
もしこのバックボーンの集合が非荷電のアキラルな連鎖
ばかりで行われるなら，このキャッピング試薬は，好ま
しくはポリマーに末端の電荷を与える荷電された一群で
ある。ポリマーのキャピングの後，このポリマーは，た
とえば水酸化アンモニウムのような求核剤を用いた処理
により切り離される。そして，このポリマーは，例えば
陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製される。こ
の集められ精製されたポリマーは，以下に考察される方
法により，固体担体に付加される。
上記に論じされたポリマー設計の原則は，あらかじめ
集められた２量体ユニットからの溶液中の合成に関し実
施例18に，種々の非荷電のアキラルな連鎖の調製に関し
実施例20〜23に，そして，交互に荷電したタイプのポリ
マーの調製に関し実施例24に例示されている。
VI.診断試薬 A.固体担体試薬 本発明の試薬は，上記物質から，固体担体への多数の
結合ポリマーのカップリングにより形成される。他方，
このポリマーは，カルバミン酸塩で連結されたポリマー
に関し上記に記述のように，段階的形式またはブロック
形式で，担体上にて合成されてもよい。このポリマー
は，担体に直接カップルされても良い。（または担体上
に直接形成されてもよい。）例えば，このポリマーは，
ポリマー上のOH末端基を介して，活性化したアガロー
ス，セルロースまたはその類似物のような固体担体上の
OH反応基にカップリングされてもよい。しかしながら，
直接のカップリングは，しばしば，この担体に近いサブ
ユニットを担体に近すぎる所におくため，この分析物と
この近接したサブユニット認識部分との間の相補的な塩
基の結合ができない。従って，このポリマー分子は，好
ましくは，スペーサーアームを介して，この固体担体に
それぞれ連結される。このスペーサーアームは，このポ
リマーと分析物の標的配列との間の結合が実質的に妨げ
られないように，この担体の表面領域からこのポリマー
に距離をおくべく適合される。
このスペーサーアームは，好ましくは，少なくとも６
原子の全体鎖長を有する分枝していない鎖である。そし
て，このスペーサーアームは,1つの末端には担体との結
合のために，また他の末端にはポリマーとの結合のため
に，適当な反応性末端基を有する。種々のタイプのスペ
ーサーアーム，特に，種々の長さと親水性の炭素を含む
鎖は，スペーサーアームのカップリング反応に使われる
反応性基のように公知である。下記の実施例25は，アミ
ノヘキシルスペーサーアームの合成，そのメチルホスホ
ネート／ホスホジエステル混合物ポリマーの５′末端へ
の結合，および固体担体へのカップリングを記述してい
る。下記の実施例26は，カルバミン酸塩で連結されたポ
リマーを有する診断試薬を形成する際の使用に対し，多
数の表面結合された直鎖スペーサーアームを有するポリ
マー担体の調製について詳述する。実施例26の方法は，
第10図に例示される。この図に示される担体は，アミノ
メチル化したポリスチレンであり，これは無水コハク酸
と最初に反応に供されてカルボキシル化された誘導体を
形成する。この担体のジ（スクシンイミド）カーボネー
トによる活性化および６−アミノヘキサノールとの反応
により，示したような13原子の末端ヒドロキシルスペー
サーアームが生じる。
より好ましい固体担体には，アガロース，セルロー
ス，ニトロセルロース，ラテックス，ポリスチレンおよ
び他の市販の細長い担体物質または粒子状ビーズの担体
物質（これは，表面に反応性の基または活性化され得る
基を有する）が含まれる。これらの基は，特にポリマー
と結合するスペーサーアームを介して，ポリマー分子と
効果的にカップリング可能である。この担体の表面にカ
ップリングされるポリマーの濃度は，下記に記述のよう
に，この診断方法において，適当なサンプル容量の検定
材料が担体と混合されるとき，分析物分子に対しポリマ
ー分子を10〜1000倍モル過剰になるように選択するのが
好ましい。実施例25からのアミノヘキシルスペーサーア
ームを介して，標的と結合したポリマーをアガロースビ
ーズとカップリングする方法は，同じ実施例中に記述さ
れている。
B.レポーター 本発明の診断システムでのレポーターは,2つの部分か
ら構成される：これは，（１）このレポーターが，診断
試薬上にある。より荷電の少ない結合ポリマーに結合し
ないという条件下で，完全に荷電したポリヌクレオチド
に静電気的に結合するべく設計されたポリカチオン性部
分またはテイル，および（２）レポーターの存在が検出
され得るシグナルを生じるべく適合されたこのテイルに
結合されている１つまたはそれ以上のレポーター基であ
る。ポリカチオン性とは，この用語がここで用いられる
とき,2つまたはそれ以上の適当な間隔を持った複数のカ
チオン性基を有するテイルを包含する。
このカチオン性テイルは，好ましくは，少なくとも２
つの正に荷電された基を供給するように構成される。こ
れらの基は，ポリヌクレオチド分析物の糖−リン酸塩バ
ックボーン上の隣接した負電荷に結合するように間隔を
あけて配置されている。同時に，このカチオン性テイル
上の隣接する電荷の間隔は，このレポーターの電荷の半
分以上の電荷を含む試薬ポリマーバックボーンとの静電
気的な結合がエネルギー的に好ましくないような間隔で
ある。例えば，非荷電のリン酸塩連鎖と荷電されたリン
酸連鎖とを交互に有する上記に記述のポリマーでは，こ
のポリマーバックボーン中の隣接する負電荷間の距離
は，ポリヌクレオチドバックボーン中の距離のおよそ２
倍である。それゆえ，このカチオン性テイルの荷電され
た基の実質的に全てと，このポリマーバックボーンの交
互に間隔をあけている負電荷との間で結合すれば，この
ポリマーバックボーンのエネルギー的に好ましくないゆ
がみを必要とするだろう。このポリマーバックボーンが
荷電された／非荷電の立体配置を交互に有する場合，こ
のカチオン性テイルの隣接する正電荷の間隔は，このポ
リヌクレオチドバックボーンとこのレポーターテイルと
の間の強い静電気的な結合を供給する最小の間隔にまで
狭められるべきだと評価され得る。もちろん，この試薬
ポリマーが２つのサブユニット連鎖あたり１つ以下の負
電荷密度を有するか，またはこの試薬ポリマーが非荷電
のバックボーンを有する場合，このレポーター内の電荷
の間隔に関する必要条件はほとんど重要でなくなる。
このポリマーバックボーンが，荷電された／非荷電の
立体配置を交互に有する，例えば，荷電されたホスホジ
エステル連鎖と非荷電のメルホスホネート連鎖とが交互
になった立体配置を有するとき，このカチオン性レポー
ターは，完全に荷電したポリヌクレオチドとポリマーと
の間には，そのポリマーのカチオン性部分がこの非荷電
の連鎖（例えばメチルホスホネート連鎖の二重結合した
酸素）と水素結合ができない場合，最も効果的に識別さ
れうることも注目される。この理由のために，このよう
なレポーター中のカチオン性基に４級アンモニウムイオ
ンを用いることが，一般的に有利である。
このレポーターテイル内のカチオ性部分の数は，レポ
ーターが試薬ポリマーバックボーンに結合しない結合条
件下において，レポーターがポリヌクレオチド分析物に
結合するのに要する全静電気引力に従って,2個から８個
またはそれ以上まで変化してもよい。酵素のような比較
的大きなレポーター基を有するレポーターに関しては，
このレポーターテイルを分析物バックボーンに付加させ
るのに，多くの静電気的結合が必要とされるかも知れな
い。間隔をあけた多数のカチオン性部分を有するレポー
ターテイルは，特に，次の試薬とともに用いるのに適し
ている。この試薬は，そのポリマーバックボーンが荷電
されずそれゆえこのテイルと静電気的な結合を形成し得
ない。本発明での使用に適するカチオン性テイルの構成
方法は，第11〜13図に概説されている。まず最初に第11
図に関しては,N−メチルアミノ酸がジ−ｔ−ブチルジカ
ーボネート（BOC）でＮを保護され，カルボニルジイミ
ダゾールで活性化される。次いで，これはアミド連鎖を
介してジメチルアミドにカップルされる。保護をはずし
た後，このアミドは,Nを保護されたカルボニルジイミダ
ゾールで活性化された上記からのアミノ酸との反応に供
され，第11図の中央に示されるジアミド化合物が形成さ
れる。この保護基をはずす反応およびＮを保護されジイ
ミダゾールで活性化されたアミノ酸との反応は，所望の
長さのポリアミドが形成されるまでくり返される。この
合成反応の詳細は，実施例28〜30中に説明される。
レポーター基は，典型的には，このポリカチオン中の
第一アミン基に極めて容易に付加される。第11図の化合
物の二級アミン末端に一級アミンを付加させるには，あ
る適当な方法に従って，アミノ酸，例えば４−アミノ酪
酸が，第12図に例示のようにBOCで保護され，ジイミダ
ゾールで活性化され，そして保護をはずしたポリアミン
との反応に供される。その結果得られるBOCで保護され
た化合物は，次いで，このBOC基を除くためトリフルオ
ロ酢酸で処理された後，ボラン−テトラヒドロフランと
の反応によって還元される。これらの方法は，実施例31
〜32に記述されている。
第13図は，上記で合成されるようなポリアミンのポリ
４級アンモニウム塩への転化に対する反応スキームを示
す。この方法には，末端のアミンの保護とそれに続くヨ
ウ化メチルとの反応によるポリ４級アンモニウム塩の形
成，およびトリフルオロ酢酸による脱保護が含まれる。
以下の実施例33にはこの方法の詳細を示す。
このレポーター中の１つまたはそれ以上のレポーター
基は，このレポーターがポリヌクレオチドバックボーン
に結合されるとき，またはこのレポーターが分析物から
溶出されるとき，またはこのレポーターが分析物から溶
出された後のいずれかにおいて，（１）容易にカチオン
性テイルに付加され，そして（２）容易に検出されるシ
グナルを発生し得るべきである。発色団（ニトロアニリ
ンまたは他の強く吸着する色素），および螢光団（ダン
シルベースまたはローダミンベースの螢光分子）を含む
小さなレポーター基は，適しており，光度計によりまた
は色素の場合は視覚検査によって容易に検出できるとい
う有利な点を有する。放射性同位体のレポーター基は診
断の感度に有利性を供給するかもしれない。しかし，レ
ポーターの検出はより複雑で高価になるだろう。ニトロ
キシドスピンラベルのような安定な常磁性分子もまた使
用されうる。このレポーターのポリヌクレオチドへの結
合は，固定化された常磁性種の電子スピン共鳴（esr）
の吸着線特性の広がりによって検出される。
適当なレポーター基のもう一つのクラスには，リガン
ド分子，および好ましくは小さな抗原分子が含まれる。
この抗原分子は，抗リガンド分子に高い親和性で特異的
に結合し得る。模範的なリガンド／抗リガンド対には，
抗原／抗体，レクチン／炭化水素，およびビオチン／ア
ビジンが含まれる。この抗リガンド分子は，シグナルを
生成する結合共役物の一部であり，この共役物はまた，
発色団，螢光団，または酵素のようなシグナル生成基を
含む。このシグナル生成基により，リガンド／抗リガン
ドの結合が起こるとき，リガンド基の存在を検出され得
る。
このレポーターは、特に，上記で言及されるように，
レポーターテイルが２つ以上のカチオン性基を有する場
合には，酵素レポーター部分を有していても良い。酵素
の代表的なクラスには，ルシフェラーゼ，グルコースオ
キシダーゼ，ガラクトースオキシダーゼおよびカタラー
ゼに代表される酸化還元酵素，種々のホスファターゼに
代表される加水分解酵素，β−ガラクトシダーゼ，ペプ
チダーゼおよびリアーゼのようなグリコシル加水分解酵
素がある。
１つまたは複数のレポーター基は，典型的には，公知
のカップリング方法に従って，ポリカチオン性テイルの
アミン，好ましくは一級アミンにカップリングされる。
第15図に例示されるより好ましい方法では，ポリアミン
は,4−フルオロ−３−ニトロフェニルアジドのような適
当な二官能性カップリング試薬との反応に供され，次い
で，酵素のようなレポーター基とカップルされる。アミ
ン，カルボキシル基,OH基およびサルヒドラル基のよう
な反応性のレポーター基にアミン類をカップリングさせ
るための種々の二官能性試薬がよく知られている。アル
カリホスファターゼレポーター基とテトラカチオン性レ
ポーターを形成するための詳細な方法は，実施例38に示
される。第15図に例示のもう一つのより好ましい方法で
は，ビス−3,3′−アミノプロピルメチルアミンと，ア
ミンと反応性のダンシル基とを反応させることにより，
レポーターが調製される。この図中の反応スキームは，
このテイルにレポーターをカップリングする前または後
に，どのようにしてこのレポーターテイルのアミノ部分
が完全にアルキル化され得るかも示している。この方法
の詳細は実施例34に示される。
VII.診断方法 この節では，ポリヌクレオチド分析物の検出に関して
上記に記述される診断システムの使用を記述する。この
分析物は，メッセンジャー−RNA（mRNA），リボゾーマ
ルRNA（rRNA），または一本鎖RNAまたはDNAウイルス性
ゲノムのような一本鎖の形で通常存在する分析物か；ま
たは二本鎖ウイルス性RNA,RNA/DNAウイルス性複製中間
体，およびウイルス，細菌，真核細胞から誘導されるよ
うな二重DNAのような二本鎖または重複した形で生理的
条件下にて存在する分析物である。試薬ポリマーが標的
化される分析物ポリヌクレオチド中の標的配列を選択す
る際に用いられる考察および原理は，第Ｉ節で考察され
る。
この診断を行う際，分析物とされるサンプルが，典型
的には，通常の臨床のサンプルを採取する技術により，
集められる。この分析物がウイルスまたは細菌由来のポ
リヌクレオチドの場合は，より長い非分析細胞物質を除
くのが，最初のサンプルの処理としてしばしば有用であ
る。例えば，ウイルスの病原の存在を検定する際に，細
菌物質を除くために0.2ミクロンの穴のサイズの膜でサ
ンプルを濾過することがしばしば有用である。細菌の病
原の存在を検定する場合，サンプル中に存在するであろ
う真核細胞をも除去するため,1.0ミクロンの穴のサイズ
の膜でサンプルを濾過することがしばしば有用である。
典型的なサンプル調製法は，ウイルス病原の診断に関し
て実施例36および37に記述されている。
この試薬ポリマーに結合するのに適した形でこのサン
プル分析物材料を調製するために，このサンプルは，生
物の核酸が遊離するよう処理されるべきである。細胞膜
を欠いた生物には，界面活性剤および／またはカオトロ
ピック性塩が一般に適当である。細胞膜を有する生物に
は，アルカリ（分析物がDNAのとき）または適当な酵素
（例えば，多くの細菌に対するリゾチーム）が使用可能
である。必要に応じて，この遊離の核酸は，カオトロピ
ック性塩（トリクロロ酢酸ナトリウム）を加え，続いて
エタノールで選択的に核酸を沈澱させることにより，タ
ンパクおよび他の混入物から簡便に分離され得る。
ウイルス，または細胞成分から核酸を遊離および単離
する一つの有効な方法は，Anal Biochem（1983）133:79
で，本発明者により記述されている。実施例36に詳述の
方法には，サンプルを4Mトリクロロ酢酸,100mM EDTAで
懸濁してタンパク性物質を変性および可溶化すること，
次いで，等容量の冷エタノールを加えることにより，遊
離の核酸物質を塩溶液中に沈澱させること，が包含され
る。ポリウリジル酸のような担体ポリヌクレオチドが，
核酸の沈澱を容易にするために加えられてもよい。短時
間の冷却の後，この沈澱された核酸は遠心分離により，
ペレット化される。そして，この核酸は，塩を除去する
べく，洗浄される。
この核酸の分画は，選択された塩濃度であり二価カチ
オン性のキレート剤を含むアニーリング緩衝液に再懸濁
される。約100mMまたはそれ以下の一価塩（例えばNaC
l）および約10mMのキレート剤（例えばEDTA）を含むア
ニーリング緩衝液が，一般に，二本鎖DNAの形で正常に
存在するポリヌクレオチドの結合に適している。100mM
より著しく低い塩濃度は，正確に達成するのが困難であ
る。より高い塩濃度，特に約0.5M以上の塩濃度では，相
補的ポリヌクレオチド鎖間で二本鎖を形成させる傾向に
あり，この分析物ポリヌクレオチドとの結合に対し試薬
ポリマーと相補鎖との間で競合が生じる。相補的ポリヌ
クレオチド間での二本鎖の形成は，またキレート剤によ
り阻害される。このキレート剤は，アニーリング混合液
中のMg+2イオンおよびCa++イオンを引き離すように作用
する。この分析物がRNAの場合，解離されたDNAとRNA分
析物との間の試薬ポリマーへの結合に対する競合を避け
るため，サンプルをDNアーゼで処理することが有利であ
り得る。
このアニーリング反応は，反応中に形成される分析物
／ポリマー二重構造の融解温度より約５〜15℃低い温度
で行われるのが好ましい。このアニーリング温度は，分
析物標的配列とこのポリマーとの間の正確な塩基−配列
対合に好ましい。上記に示されるごとく，この分析物ポ
リヌクレオチドが二本鎖構造としてその相補鎖とともに
正常に存在する場合には，その反応温度は，分析物と試
薬ポリマーの所望の対合に競合する分析物とその相補ポ
リヌクレオチドとの望ましくない対合を避けるため，本
来のポリヌクレオチド二本鎖の融解温度より高い反応温
度が好ましい。約100mMの一価カチオン濃度のアニーリ
ング緩衝液濃度においては,24〜60℃の範囲のアニーリ
ング温度が一般に適している。以前に注目したように，
この正確に最適なアニーリング温度は，結合するポリマ
ーの長さ，その認識部分のＡ＋ＴのＣ＋Ｇに対する比，
および部分的に荷電されたポリマーではこの塩濃度の関
数である。
上記に論じたように，このポリマーの構造的特徴に依
存して，この分析物／ポリマー二重構造の融解温度は,1
00mMの一価塩のようなアニーリング緩衝液中では，例え
ば37℃のような好ましい反応温度より実質的に高くなり
得る。このような場合では，ホルムアミドのような変性
剤を加えることにより，ポリマー／分析物二重構造の融
解温度を加えることにより，ポリマー／分析物二重構造
の融解温度を所望の温度まで低くすることが便利であり
得る。所望の融解温度を達成するのに必要なホルムアミ
ドの量を決定するため，分析物標的配列を有する合成オ
リゴヌクレオチドであろう標的配列とポリマーとの融解
曲線が，常法に従って，多くの異なる変性剤濃度におい
て決定される。ホルムアミドを添加する場合には，典型
的には，約５〜50％の範囲の変性剤容量で行われる。こ
の決定から，所望の反応温度より約５〜15℃高い融解温
度を達成するために，アニーリング緩衝液中に必要なホ
ルムアミドの量が決定される。
この反応緩衝液中の分析物サンプルは，好ましくは，
この試薬の結合ポリマーが，検定混合液中の分析物分子
のモル濃度10〜1000倍過剰に存在する条件下にて，診断
試薬に加えられる。このポリマー／ポリヌクレオチドの
アニーリング反応は，選択された反応温度で，ポリマー
／分析物のアニーリングが実質的に充分に行われる期
間、典型的には10分間と３時間との間で行われる。この
固体担体試薬は，結合していない物質を除くため，一回
またはそれ以上洗浄される。
次いで，試薬に結合した分析物の完全に荷電したバッ
クボーンにレポーター分子を結合させるためのあらかじ
め選択された条件下で，レポーターがこの洗浄された試
薬に加えられる。このレポーターのポリヌクレオチドバ
ックボーンへの選択された結合を可能にするこのレポー
ターの空間的／荷電の特徴は，上記で論じられている。
この試薬ポリマーがある負の荷電のバックボーンを有す
る場合，一つの重要な要因は，結合媒質の塩濃度であ
る。非常に低い塩濃度では，静電気的な相互作用はより
強い。それは，試薬ポリマーの広く間隔をあけたアニオ
ン性基へのレポーターの望ましくない結合を生じえる。
反対に，非常に高い塩濃度では，静電気的な荷電の遮蔽
が，分析物バックボーンの狭い間隔で存在するアニオン
性基とのこのレポーターの所望の結合を妨害し得る。こ
の結合媒質の最適塩濃度は，完全に荷電された分析物バ
ックボーンへのこのレポーターの十分に静電気的な結合
を可能にする最大または最大に近い一価塩の濃度であ
る。この最適塩濃度は，平衡透析法によって決定され得
る。この平衡透析法においては，拡散可能なレポーター
の拡散不可能なポリヌクレオチドへの結合が，この懸濁
した媒質の塩濃度の関数として測定される。この分析物
へのレポーターの結合のための最適イオン強度の条件
は，また，低い塩濃度条件での固定化されたポリヌクレ
オチドへのレポーターの結合，および塩勾配によるレポ
ーターの溶出によって容易に決定され得る。
この診断システムにおける結合成分は，本発明の診断
方法で機能するように，以下の第16図に示される。ここ
でＳは，鋸歯状の線で示されるスペーサーアームを介し
て，多くの結合ポリマーをその表面に結合させた固体担
体である。この“m"と“p"のサブユニット連鎖は，それ
ぞれ，非荷電で，立体異性的に規定されたメチルホスホ
ネート連鎖および荷電されたホスホ酸ジエステル連鎖を
示している。このレポーターは二価のカチオン性テイル
およびＲレポーター基を有する。例示の目的のため，各
ポリマーは，実施例21で記述されるように，Herpes sim
plexウイルス，タイプＩおよびタイプ二中の選択した16
塩基標的配列に相補的な認識部分の配列を有する。これ
らのポリマーのうちの一つの，Herpes simplex分析物ポ
リヌクレオチド中の標的配列への塩基−相補的な結合が
示されている。
この図に示されるレポーターは，実施例34からの二価
のカチオン性レポーターである。各レポーターは，隣接
するホスホジエステル結合との静電引力を介して，静電
引力によってポリヌクレオチド中の一対の隣接したホス
ホジエステル結合と結合するべく適合される。このレポ
ーター分子はそれらの予期される結合コンフィギュレー
ションで示される。ここでは，実質的にいずれのホスホ
ジエステル連鎖も，レポーターのカチオンと対合し，こ
のレポーター分子はヘッドとヘッド，テイルとテイルで
並んでいる。結合しているレポーター分子の最大密度を
推測すると,N塩基分析物は，約N/2レポーター分子まで
結合し得ると評価できる。さらに一般的には，分析物の
サイズおよびレポーターあたりのレポーター部分とカチ
オン性基との両方の相対的な数に依存して，この検定方
法により，数十万またはそれ以上のレポーター分子の試
薬結合分析物各分子への結合が容易に生じる。それゆ
え，分析物の検出が，一般に，分析物分子あたり１つか
数個のプローブに基づく場合，それぞれのプローブが，
典型的には約100のレポーター部分を含むので，既存の
タイプのポリヌクレオチドに基づく診断より２〜４桁検
出の感度が高い。
このレポーター溶液との反応（典型的には室温で１〜
２分）の後，この試薬は，結合していないレポーターを
除くために洗浄される。次いで，結合したレポーターに
対し直接評価され得る。この試薬と結合したレポーター
の量の決定に際し，特に螢光レポーター基または発色レ
ポーター基の場合には，このレポーターを高塩濃度の溶
液を用いてこの試薬から溶出し，次いで溶離液をレポー
ターについて評価するのが望ましいかもしれない。酵素
のような，他のタイプのレポーター基では，この試薬に
結合したレポーターまたは，試薬から溶出されたレポー
ターにより容易に評価され得る。上記に言及されるよう
な種々の異なるレポーター基の検出方法はよく知られて
いる。実施例36および37は，それぞれ螢光レポーターお
よび酵素レポーターの検出に基づく診断方法を例示して
いる。
前述のことから，本発明によりいかに種々の目的およ
び特徴が達成されるか理解され得る。この診断試薬は，
試薬ポリマーの設計により，特有の塩基対配列を有する
どのようなリボポリヌクレオチドまたはデオキシリボポ
リヌクレオチドの検出に対しても，容易に適合され得
る。さらに，この試薬ポリマーは，適した温度で，高い
配列特異性をもった一定の標的配列と結合するように適
合させ得る。
二本鎖ポリヌクレオチドの検出のため，この反応は，
低い塩濃度条件および／または変性条件（これは，試薬
に結合する分析物に対する相補的なポリヌクレオチド鎖
との競合を妨げる）下で実行されうる。それゆえ，この
診断システムは，従来技術の固体担体，シングルプロー
ブポリヌクレオチド診断システムの有利な点を提供す
る。この有利な点は，相補鎖との競合は削除されるが，
この診断システムでは固体担体への一本鎖テスト核酸の
付加に際し，かなり困難なステップが回避されることで
ある。同時に，このシステムは，以前に記述した二重の
プローブポリヌクレオチド診断システムに関連した問題
を回避する。この問題は，分析物の検出は，偽一次の速
度論に基づいており,1つの配列特異的な結合ポリマーの
みが必要である点にある。
本発明のもう一つの重要な特徴によれば，この分析物
へのレポーターの結合は，既存のタイプのポリヌクレオ
チド診断とのような，配列特異的な結合より，むしろ配
列には無関係の静電気的相互作用に基づいている。従っ
て，このレポーター自体は比較的安価に調製され得，分
析物とすぐにそして広範囲の条件下で反応し得る。そし
て，最も重要なことには，このレポーターは，この分析
物中のポリヌクレオチドサブユニットあたり，多数のレ
ポーター部分までの範囲の密度で，この分析物に結合し
得る。従って，この診断システムの感度は，既存のテス
トより,2〜４桁またはそれ以上のオーダーのちがいで高
くなり得る。既存のテストは，分析物分子あたり限られ
た数のレポーター部分を含む，一つまたは少数のプロー
ブの検出に依存しているからである。
以下の実施例は，本発明の特定の実施態様に従って構
成される検定システムの調製および使用について例示す
る。しかしこれらの実施例により，決して本発明の範囲
は限定されない。
実施例１ リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドの
調製 次のヌクレオシドは,Sigma Chemical Co.,St.Louis,M
Oから得られる：デオキシウリジン，デオキシグアノシ
ン，チミジン，デオキシアデノシン，デオキシシチジ
ン,5−ブロモデオキシウリジン，デオキシイノシン,2,6
−ジアミノ−９−（２−デオキシ−β−D−エリスロ−
ペントフラノシル）9H−プリン（2,6−ジアミノプリン
デオキシリボシド），ウリジン，グアノシン,5−メチル
ウリジン，アデノシン，シチジン,5−ブロモウリジン，
イノシン。
2,6−ジアミノ−９−（β−D−リボフラノシル）−9H
−プリン（2,6−ジアミノプリンリボシド）は,Pfaltz a
nd Bauer,Inc.,Division of Aceto Chemical Co.,Inc.,
Waterbury,CTから得られる。
次のヌクレオシドは，次に示す文献の方法で調製され
る： １−（２−デオキシ−β−D−エリスロ−ペントフラ
ノシル−２−ピリミジノン（２−ヒドロキシピリミジン
デオキシリボシド）は,John Wiley and Sons,Inc.のNuc
leic Acid Chemisty;L.B.Townsend and R.S.Tipson,eds
（1976）に記載されたP.Kohler,E.Volz,U.Sequinおよび
C.Tammの方法により調製される。
１−（２−デオキシ−β−D−エリスロ−ペントフラ
ノシル）−４−メトキシ−２−ピリミジノンは，次の方
法で調製される： １−（３′,5′−ジ−Ｏ−ベンゾイル−２−デオキシ
−β−D−エリスロ−ペントフラノシル−４−メチルチ
オ−２−ピリミジノン〔Collection of Czechoslov Che
m Comm（1977）42:2246のD.CechおよびA.Holyの方法に
より調製〕を,0.2Mナトリウムメトキシド溶液200mlで処
理する。処理後の溶液を一夜室温に放置する。この溶液
を次に，ダウエックス50×８（Dowex50×8;H+型）で中
和し，濾過する。残渣を水100mLに溶解し，エーテル2.5
0mLで抽出し，水相をエバポレートする。その残渣はア
モルファス状の物質であり，直接次の反応に用いられ
る。
２−アミノ−９−（２−デオキシ−β−D−エリスロ
−ペントフラノシル）−1,9−ジヒドロ−6H−プリン−
６−チオン（デオキシチオグアノシン）は，J Med Chem
（1963）6:684のR.H.Iwamoto,E.M.Acton,およびL.Goodm
anの方法により調製される。
１−（β−D−リボフラノシル）−２−ピリミジノン
（２−ヒドロキシピリミジンリボシド）は，J Org Chem
（1974）39:3668のU.NiedballaおよびH.Vorbruggenの方
法により調製される。
１−（２−デオキシ−β−D−リボフラノシル）−４
−メトキシ−２−ピリミジノン（２−ヒドロキシピリミ
ジンデオキシリボシド）は，Collection of Czechoslov
Chem Comm（1973）38:1381のR.WightmanおよびD.Holy
の方法により調製される。
２−アミノ−９−（β−D−リボフラノシル）−1,6−
ジヒドロ−6H−プリン−６−チオン（チオグアノシン）
は，J Amer Chem Soc（1958）80:1669のJ.J.Fox,I.Wemp
en,A.HamptonおよびI.L.Doerrの方法で調製される。
実施例２ 塩基保護されたヌクレオチドの調製 ジメトキシトリチルクロリド,N−ベンゾイルアデノシ
ン,N−ベンゾイル−２′−デオキシアデノシン,N−ベン
ゾイルシチジン,N−ベンゾイル−２′−デオキシシチジ
ンおよびＮ−イソブチリル−２′−デオキシグアノシン
は,Sigma Chemicals,St.Louis,Missouriから得られる。
９−フルオレニルメトキシカルボニルクロリド（FMOCク
ロリド），トリメチルクロロシラン，無水イソ酪酸,4−
ニトロベンゾイルクロリド，および有機溶媒のすべて
（反応およびクロマトグラフィー用）は,Aldrich Chemi
cal Co.,Milwaukee,Wisconsinから得られる。シリカゲ
ルは,EM Science,Cherry Hill,New Jerseyから得られ
る。
2.1グアノシン Ｎ−2 9−フルオレニルメトキシカルボニル誘導体
は，次に示すヌクレオシドのアミノ基の保護の一般的な
手法により調製される： グアノシン（1mmol）をピリジン（5mL）に懸濁させ，
トリメチルクロロシラン（5mmol）で処理する。この溶
液を15分間攪拌した後,9−フルオレニルメトキシカルボ
ニルクロリド（5mmol）を加え，この溶液を室温に３時
間保持する。反応液を氷浴中で冷却し，水（1mL）を加
える。５分間攪拌後，濃アンモニア（1mL）を加え，反
応液を15分間攪拌する。この溶液をほぼ乾固状態近くに
までエバポレートし，残渣をクロロホルム（10mL）に溶
解させる。この溶液を重炭酸ナトリウム溶液（5mL,10
％）で洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥し，エバポレート
する。残渣をトルエンとともに数回エバポレートし，生
成物をメチレンクロライド中メタノール勾配（０〜50
％）を用いてシリカゲルのクロマトグラフィーにかけ
る。
Ｎ−イソブチリルグアノシンは，J Amer Chem Soc（1
969）91:3356のLetsingerおよびMillerの方法により調
製される。
Ｎ−アセチルグアノシンは，J Chem Soc Perkin Tran
s（1972）1:2937のC.B.ReeseおよびR.S.Saffhillの方法
で得られる。
2.2 デオキシグアノシン Ｎ−2 9−フルオレニルメトキシカルボニル誘導体
は，Acta Chem Scand（1983）B 37:263のJ.Heikklaおよ
びJ.Chattopadhyayaの方法で調製される。
Ｎ−２ アセチル誘導体は,Research Plus Inc.,Bayo
nne,N.J.から得られる。
2.3 デオキシアデノシン Ｎ−6 2−（４−ニトロフェニル）エトキシカルボニ
ル誘導体は，Tetrahedron Lett（1983）24:3583のF.Him
melsbachおよびW.Pfleidererの方法により調製される。
Ｎ−6 4−ニトロベンゾイル−２′−デオキシアデノ
シンは,FMOCクロリドの代わりに４−ニトロベンゾイル
クロリドを用いたこと以外は上記FMOC−グアノシンの調
製法により調製される。
Ｎ−6 2（フェニルスルホニル）エトキシカルボニル
誘導体は，アシル化剤として２−（フェニルスルホニ
ル）−エチルクロロフォーメート〔Tetrahedron Lett
（1981）22:3667のN.Balgobin,s.JosephsonおよびB.Cha
ttopadhyayaの方法により得られる〕を用い，溶媒とし
てＮ−メチルイミダゾールまたはピリジンを用いたこと
以外は,FMOCグアノシンの調製法により調製される。
2.4 アデノシン Ｎ−6 2−（４−ニトロフェニル）−エトキシカルボ
ニル誘導体は，Tetrahedron Lett（1983）24:3583のF.H
immelsbachおよびW.Pfleidererの方法により調製され
る。
Ｎ−6 4−ニトロベンゾイルアデノシンは,FMOCクロリ
ドの代わりに４−ニトロベンゾイルクロリドを用いたこ
と以外はFMOC−グアノシンの調製法により調製される。
Ｎ−6 2−（フェニルスルホニル）エトキシカルボニ
ル誘導体は，アシル化剤として２−（フェニルスルホニ
ル）−エチルクロロフォーメート〔Tetrahedron Lett
（1981）22:3667のN.Balgobin,s.JosephsonおよびB.Cha
ttopadhyayaの方法により得られる〕を用い，溶媒とし
てＮ−メチルイミダゾールまたはピリジンを用いたこと
以外は,FMOCグアノシンの調製法により調製される。
2.5 デオキシシチジン Ｎ−4 2−（４−ニトロフェニル）−エトキシカルボ
ニル誘導体は，Tetrahedron Lett（1983）24:3583のF.H
immelsbachおよびW.Pfleidererの方法により調製され
る。
Ｎ−6 2−（フェニルスルホニル）エトキシカルボニ
ル誘導体は，アシル化剤として２−（フェニルスルホニ
ル）−エチルクロロフォーメート〔Tetrahedron Lett
（1981）22:3667のN.Balgobin,s.JosephsonおよびB.Cha
ttopadhyayaの方法により得られる〕を用い，溶媒とし
てＮ−メチルイミダゾールまたはピリジンを用いたこと
以外は,FMOCグアノシンの調製法により調製される。
2.6 シチジン Ｎ−4 2−（４−ニトロフェニル）−エトキシカルボ
ニル誘導体は，Tetrahedron Lett（1983）24:3583のF.H
immelsbachおよびW.Pfleidererの方法により調製され
る。
Ｎ−6 2−（フェニルスルホニル）エトキシカルボニ
ル誘導体は，アシル化剤として２−（フェニルスルホニ
ル）−エチルクロロフォーメート〔Tetrahedron Lett
（1981）22:3667のN.Balgobin,s.JosephsonおよびB.Cha
ttopadhyayaの方法により得られる〕を用い，溶媒とし
てＮ−メチルイミダゾールまたはピリジンを用いたこと
以外は,FMOCグアノシンの調製法により調製される。
2.7 2.6 −ジアミノプリンリボシド 2,6−ジアミノプリンリボシドのＮ−2,N−６ビス（９
−フルオレニルメトキシカルボニル）誘導体は，一般的
な手法で調製される。
Ｎ−2,N−６−ビス（イソブチリル）誘導体は，通常
の手法により調製される。
2.8 2,6−ジアミノプリン−２′−デオキシリボシド 2,6−ジアミノプリン−２′−デオキシリボシドのビ
スＮ−2,N−６−（９−フルオレニルメトキシカルボニ
ル）誘導体は，通常の手法により調製される。
2.9 チオグアノシン チオグアノシンのＮ−2 9−フルオレニルメトキシカ
ルボニル誘導体は通常の手法により調製される。
2.10 ２′−デオキシチオグアノシン ２′−デオキシチオグアノシンのＮ−2 9−フルオレ
ニルメトキシカルボニル誘導体は，通常の手法により調
製される。
実施例３ ５′−アミノ−２′,5−ジデオキシリボヌクレオシド
サブユニットの調製 四臭化炭素，ナトリウムアジド,p−トルエンスルホニ
ルクロリド（トシルクロリド），トリフェニルホスフィ
ンおよび10％パラジウム−炭は,Aldrich Chem Co.で購
入される。リチウムアジドは,Kodak Laboratory and Sp
ecialty Chemicalsで得られる。
3.1 一般的手法 この実施例で用いられるヌクレオシドは，チミジン,N
6−ベンゾイル−２′−デオキシアデノシン,N4−ベンゾ
イル−２′−デオキシシトジン，および２′−デオキシ
イノシン,2−ヒドロキシ−ピリミジン−２′−デオキシ
リボシドおよび2,6−ジアミノプリン−２′−デオキシ
リボシドのN2-N6−ビスイソブチリル誘導体（実施例１
参照）である。所望の乾燥したヌクレオシド（1mmol）
を計量し，トリフェニルホスフィン（1.01mmol）および
リチウムアジド（5mml）を入れた反応容器に添加する。
固形物をDMFに懸濁させた後，四臭化炭素（1.0mmol）を
容器に加える。この溶液を室温で24時間攪拌する。反応
をメタノールで止めた後，この溶液をエバポレートして
乾固させる。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにか
け，メタノール／クロロホルム混合液で溶出すると，所
望の５′−アジド−２′,5′−デオキシヌクレオシドが
得られる。
この５′−アジドヌクレオシド（1mmol）をエタノー
ルに溶解させる。触媒量の10％パラジウム−炭の存在
下，水素圧35psiで10時間にわたり水素化を行う。この
溶液を濾過し，減圧下でエバポレートすると粗固形物が
得られる。この固形分は適当な溶媒を加えてこねること
により精製される。
3.3 ５′−アジドウリジン誘導体 ５−ブロモ−２′−デオキシウリジンの５′−アジド
誘導体は，上記方法により調製される。５′−アジド−
ｔ−ブロモ−２′−デオキシウリジン（1mmol）は，ト
リフェニルホスフィン（1.5mmol）とピリジン中室温で
２時間にわたり処理される。この反応容器に濃アンモニ
ア（1mL）を加える。14時間後，溶媒を真空下で除去す
る。残渣をTHFに溶解させ，この溶液をヘキサンに加え
る。沈澱物を集め，この固形成分を適当な溶剤でこねる
と,5′−アミノ−５−ブロモ−２′−デオキシウリジン
が得られる。
3.5 ５′−アジドグアノシン ５′−アミノ−２′,5′−ジデオキシグアノシンの他
の調製法は，保護された２′−デオキシグアノシン（Ｎ
−２−アセチルかＮ−２−FMOC誘導体で保護されてい
る）（1mmol）をピリジン中トシルクロリド（1.3mmol）
で０℃にて一夜処理することである。この溶液をエバポ
レートして乾固し，残渣をクロロホルムに溶解させる。
得られた溶液を重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄し，硫酸
ナトリウムで乾燥する。この溶液をエバポレートし，残
渣をシリカゲルクロマトグラフィーにかけメタノール／
クロロホルム混合液で溶離する。得られたトシレート
（1mmol）は,DMF中ナトリウムアジド（6mmol）で80〜10
0℃にて数時間処理する。溶媒をロータリーエバポレー
ターで除去し，残渣をシリカゲルクロマトグラフィーに
かけクロロホルム／メタノール混合溶媒で溶離する。こ
のアジドは，上記手法を用いて目的とするアミンに還元
される。
２′−デオキシシチジン,2′−デオキシアデノシン,
2′−デオキシグアノシン，および2,6−ジアミノプリン
デオキシリボシドの塩基窒素の保護基としては,2′−デ
オキシシチジンおよび２′−デオキシアデノシンに対し
ては２−（フェニルスルホニル）エトキシカルボニル基
が，そして２′−デオキシグアノシンおよび2,6−ジア
ミノプリンデオキシリボシドを保護するためには９′−
フルオレニルメトキシカルボニル（FMOC）基が，実施例
２に示されるように，使用される。
実施例４ ３′−アミノ−２′,3′−ジデオキシリボヌクレオシド
サブユニットの調製 チミジンを５′−Ｏ−アセチル−３′−アジド−
２′,3′−ジデオキシチミジンに変換し，これをJ Org
Chem（1978）43:3044のM.ImazawaおよびF.Ecksteinの方
法により３′−アジド−２′,3′−ジデオキシアデノシ
ンおよび３′−アジド−２′,3′−ジデオキシグアノシ
ンに変換する。３′−アジドアデノシンの塩基部分は，
ベンゾイル誘導体または２−（フェニルスルホニル）エ
トキシカルボニル誘導体（実施例１に示す）として保護
される。３′−アジドグアノシンのＮ−２は，アセチル
誘導体またはFMOC誘導体（実施例１参照）として保護さ
れる。これらの３′−アジド基の３′−アミノ−２′−
３′−ジデオキシリボヌクレオシドへの還元は実施例３
に示されるようになされる。
実施例５ リボヌクレオシドから誘導されるモルホリン型サブユニ
ットの調製 重ホウ酸アンモニウム,m−過ヨウ素酸ナトリウム，ナ
トリウムシアノボロハイドライド，ウリジン,N4−ベン
ゾイル シチジン，およびN6−ベンゾイルアデノシン
は,Sigma Chemical Co.,で得られる。N2−イソブチリル
グアノシンは,LetsingerおよびMiller（J Amer Chem So
C（1969）91:3356）の一般的手法により調製される。２
−フェニル−２−プロパノールおよびビス（ｐ−ニトロ
フェニル）カーボネートは,Aldrich Chemical Co.で得
られる。
ウリジンのモルフォリン誘導体は，ウリジン1mmolと
重ホウ酸アンモニウム，（NH4)2B2O72mmolとを水5mlに
溶解させて調製される。氷浴下で攪拌し直射日光を避け
ながら,m−過ヨウ素酸ナトリウム1.2mmolを水5mlに溶解
させた溶液を添加する。90分後に1,2−プロパンジオー
ル0.2mlを加え，室温で10分間攪拌を続ける。その後，
換気の充分なフードの中で充分に攪拌しながらナトリウ
ムシアノボロハイドライド0.25gを水3mlに溶解した溶液
を添加し，混合物を室温で４時間攪拌する。次に，反応
混合物を温水浴中真空下で濃縮してオイル状とし，これ
を最小量のメタノールで再分散してシリカゲルクロマト
グラフィーカラム上に積層し，メタノール/1％トリエチ
ルアミンで溶離する。モルフォリン型生成物はシャープ
なバンドでカラムから溶離される。この生成物は，もと
のリボヌクレオシドおよびその酸化生成物に比較しては
るかにゆっくりと移動する。このモルフォリン型生成物
は，もとのリボヌクレオシドとほとんど同一のUVスペク
トルを有する。しかし，マススペクトルは,17ダルトン
だけ低い（高速原子衝撃活性化によるマススペクトル分
析により決定）。
次に，生成物を２−フェニルイソプロピルフェニルカ
ーボネートと反応させることによりモルフォリンの窒素
を保護する。所望の活性カーボネートを調製し，これ
を，Int J Peptide Protein Res（1974）6:111のSandbe
rg and Ragmarssonの方法に基本的に従い，モルフォリ
ン型サブユニットと反応させる。最終的に，必要に応じ
て（サブユニット アセンブリーをポリマーへ組み込む
方法に依存する），もとの５′に対応する位置の水酸基
は，次の方法により活性化され得る。その方法とは,N−
保護化サブユニットを最小容量の乾燥ジメチルホルムア
ミドに溶解させ，ビス（ｐ−ニトロフェニル）カーボネ
ート２等量とトリエチルアミン,N−メチルイミダゾー
ル，またはN,N−ジメチルアミノピリジン0.2等量とを加
えることである。室温で３時間保持した後，反応混合物
を温浴中で真空下濃縮する。この濃厚なシロップを少容
量のジクロロメタンに再懸濁し，シリカゲルカラム上に
積層し,N,N−ジメチルアニリンを0.2容量％の割合で含
有するジクロロメタン／エーテル（容量比1:1）混合物
で溶離する。この溶媒系において，活性化生成物は,p−
ニトロフェノールおよびビス（ｐ−ニトロフェニル）カ
ーボネートよりも実質的にゆっくりと移動するが，未反
応の出発物質よりもはるかに速く移動する。活性化され
た生成物は，アンモニアを噴霧することによりシリカゲ
ルTLCプレート上で簡単に目視観察することができる。
アンモニアの噴霧により，黄色のニトロフェノレートイ
オンが１〜２分間で現れる。
他のリボヌクレオシド（必要に応じて実施例２のよう
に塩基が保護されている）は，基本的には同様の手法
で，対応するモルフォリン型誘導体に変換される。ただ
し，最初の過ヨウ素酸塩による酸化の段階の前の，保護
されたリボヌクレオシドの溶解性に応じて，メタノール
を適当量添加する必要がある。
モルフォリン型サブユニットがチオカーボメート結合
を介して結合されるとき，通常の出発リボヌクレオシド
に対する好適な塩基保護基は次のとおりである：シチジ
ンおよびアデノシンにはフェニルスルホニルエトキシカ
ルボニル基，およびグアノシンには９−フルオレニルメ
トキシカルボニル基。
実施例６ ５′−酢酸−２′,5′−ジデオキシリボヌクレオシド
サブユニットの調製 トリエチルアミン，ピリジン／三酸化イオウ錯体,p−
ニトロフェノール，ジシクロヘキシルカルボジイミド，
および40％ジメチルアミン水溶液はAldrichで得られ
る。
実施例12.1で調製される３′−Ｏ−tert−ブチルジメ
チルシリル−Ｎ−２−（フェニルスルホニル）エトシキ
カルボニルアデノシン（1mmol）をメチレンクロリドお
よびジメチルスルホキシド（1/1,v/v;10mL）に０℃で溶
解させる。これに，トリエチルアミン（3mmol）および
ピリジン／三酸化イオウ錯体（3mmol）を加える。この
混合液をこの温度で１時間攪拌し，水洗する。硫酸ナト
リウムで乾燥し，減圧下でエバポレートする。残渣を乾
燥ピリジン（10mL）に溶解させ，ベジルオキシカルボニ
ルメチレントリフェニルホスホラン（1.5mmol）と37℃
で24時間処理する。この混合物を，次に，減圧下でエバ
ポレートして乾固し，残渣をメチレンクロリドに溶解さ
せ，希HClでそして水で洗浄する。次に，有機相を硫酸
ナトリウムで乾燥し，溶媒を減圧下で留去する。残渣を
クロロホルム中メタノール勾配（０〜20％）を用いてシ
リカクロマトグラフィーにかける。
前段で得られる不飽和エステル（1mmol）をシクロヘ
キサンジエン（5mL）および10％パラジウム−炭（100m
g）を含む酢酸エチル／エタノール（40mL,1/1,v/v）に
溶解させ，この懸濁液を窒素気流下５〜24時間にわたり
激しく攪拌する。この混合物を濾過し，溶媒を減圧で留
去する。残渣をクロロホルム中メタノール勾配（５〜50
％）を用いてシリカゲルクロマトグラフィーにかける。
前段で得られる酸の0.2〜0.5M酢酸エチル（またはメ
チレンクロライド）溶液にｐ−ニトロフェノールを約20
％過剰に加える。この溶液に０℃でジシクロヘキシルカ
ルボジイミドを計算量加える。0.5時間後に，この溶液
を室温に戻し,1時間保持した。分離したジシクロヘキシ
ル尿素を濾過し，溶媒で洗浄する。濾液と洗液とを合わ
せたものを減圧下でエバポレートし乾固する。このエス
テルはそのままカップリング反応に使用され得，また，
クロロホルム中イソプロパノール勾配（０〜50％）を用
いて，シリカの短いカラムで精製することもできる。
適切に保護された他の２′−デオキシヌクレオシドに
ついても類似の一連の反応を行うことができる。
この活性エステル（1mmol）を,40％ジメチルアミン水
溶液（2mmol）とメタノール中で処理すると,N−保護化
３′−Ｏ−tert−ブチルジメチルシリル−２′,5′−ジ
デオキシアデノシン−５′−酢酸のN,N−ジメチルアミ
ドが生成する。溶媒を減圧下でエバポレートして除去
し，残渣を2M HF/1M tert−ブチルアンモニウムフルオ
ライド（TBAF）試薬を用いて脱着シリル化する。このTB
AF試薬は，Tetrahedron Lett（1982）23:2257にB.L.Gaf
fneyおよびR.A.Jonesにより記載されている。ピリジン
中の2M HF/1M tert−ブチルアンモニウムフルオライド
（TBAF1mmol）に，前段で得られる脱保護化ヌクレオシ
ドを加える。24時間攪拌後，反応液をメチレンおよび重
炭酸ナトリウム水溶液に分離する。有機層を水洗し，硫
酸ナトリウムで乾燥し，エバポレートし乾固する。残渣
をメチレンクロライド中メタノール勾配（５〜25％）を
用い，シリカクロマトグラフィーで精製する。
実施例７ プリンおよびピリミジンピロリドンの調製 カリウムｔ−ブトキシド，アニソイルクロリド,6−ク
ロロプリン,10％パラジウム−炭，フタロイルクロリド,
2−アミノ−６−クロロプリン,20％テトラエチルアンモ
ニウムヒドロキシド水溶液,25％トリメチルアミン水溶
液,2−ピリミジノン,N−ブロモコハク酸イミド，トリフ
ルオロ酢酸,4−ニトロフェノール，およびN,N−ジスク
シイミジルカーボネートはAldrichで得られる。リチウ
ムアジドはEastman Kodak,Rochester,New York,で得ら
れる。C18逆相シリカゲルは,Whatman,Hillsboro,Orego
n,で得られる。
7.1.（Ｓ）−５−〔（４−アミノ−２−オキソピリミジ
ニル）−メチル〕−ピロリドンの調製（以下，シトシン
ピロリドンとして述べる） シトシン（2.2mmol）を，カリウムtert−ブトキシド
（2mmol）を含むジメチルスルホキシド（2mL）に溶解さ
せる。この溶液を（Ｓ）−５−（トシルオキシメチル）
−２−ピロリドン（1mmol）を含むフラスコに加える。
この（Ｓ）−５−（トシルオキシメチル）−２−ピロリ
ドンは,E,HardeggerおよびH.Ott.の方法（Helv Chim Ac
ta（1955）38:312）により調製される。溶解後，この混
合物を25℃で６時間攪拌する。この混合物を酢酸（2mmo
l）で中和し，減圧下でエバポレートする。残渣をジメ
チルホルムアミド（5mL）中に取り，減圧下でエバポレ
ートする。この工程を３度繰り返す。
7.2.N−４ アニソイルシトシンピロリドンの調製 前段で得られる混合物をピリジンまたはＮ−メチルイ
ミダゾール（10mL）に溶解させ，室温にてアニソイルク
ロリド（2.8mmol）と処理する。２時間攪拌後，混合物
を氷（0.5g）で反応を止める。５分後,29％アンモニウ
ム1mLを加える。15分間室温に保持した後，その溶液を
酢酸エチル（15mL）に溶解させ，塩水（15mL）を用いて
２度洗浄する。洗液を合併し，酢酸エチル（２×30mL）
で洗浄する。有機層を合併し，硫酸ナトリウムで乾燥
し，減圧下でエバポレートする。残渣はトルエンととも
に数度エバポレートし，得られた残渣を，メチレンクロ
リド中メタノール勾配（０〜20％）でシリカゲルクロマ
トグラフィーにかける。
7.3.6−クロロプリンピロリドンの調製 この化合物は，シトシンのアルキル化の方法により調
製される。シトシンのアルキル化の条件と異なるのは，
アルキル化は６−クロロプリンに対して行い，混合物を
35〜95℃に数時間加熱することである。その混合物を室
温に冷却し，酢酸（2mmol）で中和し，減圧下でエバポ
レートする。これを,20％メタノール／クロロホルムお
よび10％重炭酸ナトリウム混合物とともに振盪する。水
層をクロロホルムで洗浄し，合併した有機層を硫酸ナト
リウムで乾燥し，減圧下でエバポレートする。残渣を，
クロロホルム中メタノール勾配（０〜25％）を用いてシ
リカゲルクロマトグラフィーにかける。
7.4.6−アジドプリンピロリドンの調製 ６−クロロプリンピロリドン（1mmol）を，リチウム
アジド（2mmol）を含むジメチルスルホキシド（2mL）中
で30〜100℃にて数時間処理する。処理後，この混合物
を減圧下でエバポレートし，クロロホルムに溶解させ
る。10％重炭酸ナトリウムで洗浄し，有機層を硫酸ナト
リウムで乾燥し，減圧下で濃縮する。残渣を，クロロホ
ルム中メタノール勾配（０〜25％）を用いてシリカクロ
マトグラフィーにかける。
7.5.アデノシンピロリドンの調製 前記実施例で得られるアジドを水素化する。この水素
化は，該アジド（1mmol）のパラジウム−炭（100mg,Pd
10重量％）を含むエタノール（10mL）溶液に30ポンドの
水素圧をかけて24時間振盪することにより行われる。こ
の溶液をセライトを用いて濾過し，濾液をエバポレート
する。残渣を直接次のステップに用いる。
7.6.N−６ フタロイルアデノシンピロリドンの調製 アデノシンピロリドン（1mmol）をフタロイルクロリ
ド（1.4mmol）でアシル化することによりＮ−６ 位に
フタロイル基を導入する。この反応は，反応液中にアン
モニアを加えないこと以外は，上記シチジンのアニソイ
ル化と同様の方法を用いて行われる。
7.7.2−アミノ−６−クロロプリンピロリドンの調製 ピロリドントシレートを,6−クロロプリン誘導体の調
製に示された方法で２−アミノ６−クロロプリンを用い
てアルキル化する。
7.8.グアニンピロリドンの調製 前段で得られるクロロプリンピロリドン（1mmol）を
ジグリム（10mL）および25％トリメチルアミン水溶液
（2mL）中に溶解させる。その溶液を室温で５時間攪拌
し，水（10mL）を加え，その混合物を減圧下で10mLにま
で濃縮する。酢酸（2mL）を加え，その混合液を減圧下
でエバポレートし，オイル状物を得た。酢酸四エチルア
ンモニウムを含む残渣は，直接，次のステップに使用さ
れる。
7.9.N−２ アセチルグアニンピロリドンの調製 前段で得られるグアニンピロリドン（1mmol）を無水
酢酸（5mL）と，還流下で２時間反応させる。その溶媒
をエバポレートし，その残渣をジメチルホルムアミドと
共にエバポレートする。その残渣を,0℃にてアンモニア
で飽和させたエタノール（5mL）に溶解させ，溶液をこ
の温度で２時間攪拌する。その溶媒を減圧下でエバポレ
ートし，残渣をクロロホルム中メタノール勾配（５〜50
％）を用い，短いカラムのシリカクロマトグラフィーに
より精製する。
7.10.2−アミノ−６−アジドプリンピロリドンの調製 この化合物は，実施例7.4.の手法を用い,2−アミノ−
６−クロロプリンピロリドンから調製される。実施例7.
4.の方法と異なるのは，反応がより長い時間を必要と
し，かつより高い温度で行われることである。
7.11.2,6−ジアミノプリンピロリドンの調製 この化合物は,2−アミノ−６−アジド誘導体の還元に
より，アデノシンピロリドンと同様に調製される。
7.12.N−２ アセチル Ｎ−６ フタロイル 2,6−ジ
アミノプリンピロリドンの調製 メタノール性アンモニア処理を８時間にわたって行う
ことを除き，上記Ｎ−２ アセチルグアニンピロリドン
の調製と同様の方法により，アセチル基が導入される。
溶媒をエバポレートし，残渣をアデノシン誘導体の場合
と同様にフタロイル化する。
7.13.イノシンピロリドンの調製 ６−クロロプリンピロリドン（1mmol）は，グアニン
ピロリドン誘導体の調製に用いられる方法によりイノシ
ン誘導体に変換された。その化合物は，クロロホルム中
メタノール勾配（５〜25％）を用いて，シリカクロマト
グラフィーによって精製される。
7.14.2−ヒドロキシピリミジンピロリドンの調製 この化合物は,6−クロロプリン誘導体の調製に用いら
れる手法により,2−ピリミジンのアルキル化により得ら
れる。
実施例８ プリンおよびピリミジン Ｔ−BOCアミノ酸の調製 シトシンピロリドンの下記一般的手法は，すべての適
切に保護されたピロリドン誘導体に適用することができ
る。ｔ−BOC酸として言及されるその生成物は，ピロリ
ドン環が開裂して酸およびｔ−BOCアミンとなることに
より形成される。
8.1.シトシン ｔ−BOC酸の調製 Ｎ−４−アニソイルシトシンピロリドン（1mmol）
を，ジ−tert−ブチルジカーボネート（2mmol），トリ
エチルアミン（1mmol）およびジメチルアミノピリジン
（1mmol）を含むメチレンクロライドに溶解させる（0.5
M溶液）。その溶液を，室温で10時間攪拌する。揮発性
物質を除去し，残渣をクロロホルム中メタノール勾配
（０〜20％）を用いて，シリカで精製する。その残渣を
テトラヒドロフランに溶解させ（0.2M溶液），次に，水
酸化リチウムを加える（3mmol,1M溶液として）。室温で
５時間保持した後，その溶液を10％酢酸（3mmol）を添
加することにより中和し，溶媒を減圧下で除去する。そ
の残渣を9Nアンモニアに溶解させ，室温で１〜10時間攪
拌した。その溶媒を減圧下で除去し，残渣を水およびメ
タノール（またはトリフルオロエタノール）の混合液を
用いて,C18逆相シリカゲルのクロマトグラフィーにより
精製する。
8.2.ウラシル ｔ−BOC酸の調製 これは，次の操作によりシトシンｔ−BOC酸から調製
する： シトシン ｔ−BOC酸（1mmol）を酢酸水溶液に溶解さ
せ，亜硫酸ナトリウム（1mmol）と４℃で処理する。そ
の混合物を１時間攪拌し，減圧下エバポレート・乾固す
る。その生成物を，水およびメタノール（またはトリフ
ルオロエタノール）混合液を用い,C18逆相シリカゲルの
クロマトグラフィーにより精製する。
8.3.5−ブロモウラシル ｔ−BOC酸の調製 この化合物は次の手法により，ウラシル ｔ−BOC酸
から得る： ウラシル ｔ−BOC酸（1mmol）をDMF（3ml）に溶解さ
せ,N−ブロモコハク酸イミド（1.2mmol）で処理する。
その溶液を,16時間室温で放置する。溶媒を減圧下で除
去した後，その生成物を，水およびメタノール（または
トリフルオロエタノール）混合液を用い,C18逆相シリカ
ゲルのクロマトグラフィーにより精製する。
8.4.N−保護化 ｔ−BOC酸の調製 認識部分も環外のアミノ基をアシル化するためのこの
一般的な手法もまた，アデノシン誘導体の保護に適用さ
れる。
前段で得られるシトシン ｔ−BOC酸（1mmol）をＮ−
メチルイミダゾールあるいはピリジン（5mL）に溶解さ
せて，クロロトリメチルシラン（5mmol）で処理する。
室温で15分間保持した後，その溶液を２−（４−ニトロ
フェニル）エチルクロロフォーメート3mmol〔F.Himmels
bachおよびW.Pfleiderer（Tetrahedron Lett（1983）2
4:3583）の方法により得られる〕で処理する。その反応
液を室温で８時間保持し，次に氷浴で冷却し，そして水
（1mL）を加えた。５分後，濃アンモニア1mLを加えて，
混合物を室温で15分間攪拌する。その反応液を次に，エ
バポレート・乾固し，その残渣を水に溶解させる。その
溶液を2M塩酸で酸性にして，クロロホルムで抽出する。
合併した有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下
でエバポレートする。その残渣をクロロホルム中メタノ
ール勾配（５〜50％）を用いてシリカクロマトグラフィ
ーにより精製する。
グアニンおよび2,6−ジアミノプリン誘導体の保護の
ために，上の操作を改変し，反応をピリジン中で行い，
アシル化試薬を９−フルオレニルメチルクロロフォーメ
イトとした。
実施例９ プリンおよびピリミジンアミノ酸の調製 次の手法は，すべての誘導体に適用される。それはｔ
−BOC基を取り除き，バックボーンの第一アミノ基をフ
リーにする。
ｔ−BOC酸（1mmol）を20％のトリフルオロ酢酸を含む
メチレンクロライド5mLに溶解させ，室温で30分間攪拌
した。トルエン（3mL）を加え，溶媒を減圧下でエバポ
レートすると，アミノ酸トリフルオロ酢酸塩が得られ
る。これを直接，カップリング反応に用いる。
実施例10 アキラルな非環状ポリヌクレオチド類似物の組立てのた
めのサブユニットの調製 10.1シチジン類似物の調製 水素化ホウ素リチウム，ジ−tert−ブチルジカーボネ
ートおよびビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム
IIクロライドは,Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,WI.
から得た。２−アミノ−５−ブロモピリミジンは,T.Nis
hikawa〔Chem.Pharm.Bull. 9:38（1961）〕の方法によ
り調製される。
２−アミノ−５−ブロモピリミジンは，ベンゾイルク
ロライドを用いる実施例２の一般的手法により，環外の
アミノ基がベンゾイル化される。生成物のベンズアミド
（25mmol）を，トリエチルアミン（10mL），ベンゼン
（10mL）およびビス（トリフェニルホスフィン）パラジ
ウムIIクロライド（0.375mmol）を含む45mLの耐圧容器
に加える。その容器にアルゴンを吹き込み，密閉し，そ
して，一酸化炭素で600psiに加圧し，次に，水素で1200
psiにまで加圧する。攪拌しながらその反応容器に油浴
中145℃に加熱する。気体の吸収がすべて終わった後，
その反応物を冷却し，気体をゆっくりと排気する。無水
エーテルの添加後，その反応混合物を濾過し真空下でエ
バポレートする。次に，その生成物を，メチレンクロラ
イド中イソプロパノール勾配（０〜20％）を用いて，シ
リカゲルクロマトグラフィーで単離した。
前段で得られる２−ベンズアミドピリミジン−５−カ
ルボキシアルデヒド（1mmol）をエタノール（5mL）に溶
解させ,4−アミノ酪酸（1mmol）およびトリエチルアミ
ン（1mmol）で処理する。１時間攪拌後，その混合物を1
0％パラジウム−炭（100mg）を用いて30psiで水素化す
る。水素の吸収が終わった後，その反応液を濾過し，溶
媒を減圧下で除去する。その残渣を０℃にてアンモニア
で飽和したメタノールに溶解させ，室温で10時間攪拌す
る。溶媒をエバポレートした後，その残渣を酢酸アンモ
ニウム（0.2M）でpH7に緩衝化したメタノール−水混合
液を用い,C18シリカゲルのクロマトグラフィーにより精
製する。
前段で得られるアミノ酸（1mmol）をジ−tert−ブチ
ルジカーボネート（1mmol）を含むエタノール（3mL）に
溶解させる。トリエチルアミン（1.5mmol）を室温でゆ
っくりと加える。二酸化炭素の発生が終わった後，その
溶媒を真空下で除去し，そして残渣を直接次の反応に用
いる。
前段で得られるｔ−BOCアミノ酸の環外のアミノ基を,
2−（フェニルスルホニル−エトキシカルボニルクロラ
イドを用いる実施例２の一般的手法により，アシル化す
る。その生成物は，クロロホルム中メタノール勾配（０
〜50％）を用い，シリカゲルクロマトグラフィーによっ
て精製され得る。
前段で得られる２−（フェニルスルホニル）−エトキ
シカルボニル−保護化BOCアミノ酸を，実施例11.3およ
び11.4中の手法により,p−ニトロフェニルまたはＮ−ヒ
ドロキシサクシイミドイル活性エステルへ変換した。
10.2.ウリジン類似物の調製 ６−ヒドロキシニコチン酸エチルを,H.Gault,J.Gilbe
rt,およびD.Briaucourt〔C.R.Acad.Sci.,Paris,Ser.C,2
66:131（1968）〕の方法により調製する。水素化ホウ素
リチウムはAldrichから得られる。二酸化マンガンは,Ve
reshchaginら〔Zhurnal Arganicheskoi Khimil，8:1129
（1972）〕の方法により調製する。Dowex樹脂は,Bio-Ra
d Laboratories,Richmond,CAから得られる。
６−ヒドロキシニコチン酸エチル（49mmol）のテトラ
ヒドロフラン（10mL）溶液を，窒素雰囲気下，室温で水
素化ホウ素リチウム（100mmol）のテトラヒドロフラン
（THF）（75mL）懸濁液へ滴下する。この粘性の混合物
を25℃で16時間攪拌する。次に,20％酢酸60mlを，冷却
したその懸濁液に加える。THFを減圧下でエバポレート
し，残留した水性溶液を，リチウムイオンを取り除くた
めに，イオン交換カラム（Dowex-50W-X8）にかける。カ
ラムを注意深く250mLの水で洗浄し，次にエバポレート
する。メタノールと共に繰り返しエバポレートすること
によって，得られた残渣からホウ酸が除去される。生成
物を減圧下で蒸留することにより精製する。
前段で調製されたベンジリックアルコール（66mmol）
をエーテル（100ml）スラリーで，ゆっくりと処理（発
熱を伴う）する。室温で12時間保持した後，その混合物
を濾過し，減圧下で溶媒を除去し，その残渣を真空で蒸
留すると,6−ヒドロキシニコチンアルデヒドを得る。
前段で得られるアルデヒドを，実施例11.1のシチジン
類似物の調製と同様に,4−アミノ酪酸と反応させる。
前段で得られるアミノ酸を，実施例10.1のシチジン類
似物の調製と同様に，対応するBOC−誘導体へ変換し
た。
前段で得られるBOC−アミノ酸は，実施例11.3および1
1.4中の手法により,p−ニトロフェニルまたは,N−ヒド
ロキシサクシイミドイル活性エステルへ変換する。
実施例11 ５′−保護化,3′−活性化２′−デオキシヌクレオシド
の調製 11.12′−デオキシヌクレオシド５′−Ｏ−ジメトキシ
トリチル誘導体 ２′−デオキシヌクレオシド５′−Ｏ−ジメトキシト
リチル誘導体の調製には，次の手法が一般的である。
Ｎ−2 9−フルオレニルメトキシカルボニル−２′−
デオキシグアノシン（1mmol）を無水ピリジン（2mL）に
溶解させ,0℃に保つ。ジメトキシトリチルクロリド（1.
2mmol）を0.15mmolずつ８時間にわたり添加する。さら
に２時間後，メタノール（0.5mL）を加え，溶液を減圧
下で濃縮する。残渣を重炭酸ナトリウム（2mL,0.5％）
および塩化メチレン（5mL）の混合液で処理する。
水層で塩化メチレン（２×5mL）で抽出し，合併した
有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し，エバポレートする。
残渣をトルエンとともに数回エバポレートし，生成物を
塩化メチレン中メタノール勾配（０〜10％）を用い，シ
リカゲルクロマトグラフィーで精製する。
11.2.5′−ジメトキシトリチル−２′−デオキシヌクレ
オシド３′−０−（４−ニトロフェニル）カーボネート ５′−０−ジメトキシトリチル−２−デオキシシチジ
ン３′−０−（４−ニトロフェニル）カーボネートの調
製法は,4−ニトロフェニルカーボネートの一般的調製法
である以下の操作法の中に記載されている。ビス（４−
ニトロフェニル）カーボネートおよびN,N−ジメチルア
ミノピリジンはSigmaより得られる。
５′−０−ジメトキシトリチル−Ｎ−２−（４−ニト
ロフェニル）−エトキシカルボニル−２′−デオキシシ
チジン（1mmol）を，無水ジメチルホルムアミド（5mL）
に室温で溶解させ，ビス（４−ニトロフェニル）カーボ
ネート（2mmol）で処理し，次に，減圧下でエバポレー
トする。残渣をジメチルホルムアミド（5mL）に溶解さ
せ,N,N−ジメチルアミノピリジン（0.1mmol）を加え
る。黄色の溶液をエバポレートし,1時間反応させる。反
応混合物をクロロホルム（10mL）に溶かし，塩酸水溶液
（5mL,0.1M）で洗浄する。有機層を水酸化ナトリウム水
溶液（5mL,0.1M），水（2mL）で２度洗浄し，硫酸ナト
リウムで乾燥し，エバポレートする。残渣をシリカゲル
カラムにかけ，クロロホルム中イソプロパノール勾配
（０〜10％）で溶離させる。生成物を含む分画を集め，
エバポレートし，クロロホルム（10mL）に溶かし，痕跡
量の４−ニトロフェノールを除くために水酸化ナトリウ
ム水溶液での洗浄を繰り返す。この有機層を水で洗浄
し，硫酸ナトリウムで乾燥しエバポレートする。生成物
は,TLCによれば均一であり，二量化カーボネートの調製
に直接用いられる。
FMOC基を含むヌクレオシドのカーボネートの調製に
は,N,N−ジメチルアミノピリジンよりもむしろ,N−メチ
ルイミダゾームを触媒として使用するのが時として優れ
ている。
11.3.N−保護化 ｔ−BOC p−ニトロフェニルエステル サブユニット結合用の活性化エステルは，以下の２つ
の操作法により調製される。これは，すべてのｔ−BOC
酸誘導体において一般的なものである。
実施例8.4.で得られるｔ−BOC酸の0.2〜0.5M酢酸エチ
ル（または塩化メチレン）溶液にｐ−ニトロフェノール
を約20％過剰量だけ加える。０℃において，ジシクロヘ
キシルカルボジイミドを計算量だけその溶液に加える。
0.5時間後，混合物を室温にもどし,1時間保持する。分
離したジシクロヘキシル尿素を濾過し，溶媒で洗う。濾
液と洗浄液とを合併し，減圧下でエバポレートし乾固す
る。このエステルはカップリング反応に直接使用され得
る。または，シリカの短いカラムでクロロホルム中イソ
プロパノール勾配（０〜50％）で精製され得る。
11.4N−保護化−ｔ−BOC N−ヒドロキシスクシイミドイ
ルエステル 実施例8.4.で得られるｔ−BOC酸（1mmol）のアセトニ
トリル（5mL）溶液に，ピリジン（1mmol）およびN,N′
−ジスクシイミジルカーボネート（1mmol）を加える。
この溶液を室温で３時間攪拌する。溶媒を減圧下で除
き，残渣をクロロホルムに溶解する。有機相を0.1M HCl
および水で洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥し，エバポレ
ートして乾固する。このエステルは，直接使用し得るだ
け充分に純粋なものである。
実施例12 カーボネート分子間サブユニット結合の形成 シチジニル−（３′−５′）−シチジンカーボネート
の調製法は，次の操作法の中で記載されている。これ
は，カーボネート分子間サブユニットの形成およびオリ
ゴカーボネートの脱保護において一般的な操作法であ
る。塩基を保護している基は,2−（４−ニトロフェニ
ル）エトキシカルボニル,2−（フェニルスルホニル）エ
トキシカルボニル，またはFMOCでなければならないこと
に注意されたい。tert−ブチルジメチルシリルクロライ
トはAldrichから得られる。
12.1 ２′−デオキシヌクレオシド３′−Ｏ−tert−ブ
チルジメチルシリル誘導体の調製 ３′−Ｏ−tert−ブチルジメチルシリル−Ｎ−２−
（４−ニトロフェニル）エトキシカルボニル−２′−デ
オキシシチジンの調製法を以下に示す。これは,2′−デ
オキシヌクレオシド−３′−Ｏ−tert−ブチルジメチル
シリル誘導体の調製のための一般的操作法である。
乾燥ジメチルホルムアミドまたはテトラヒドロフラン
10mLに５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−４−（４−
ニトロフェニル）−エトキシカルボニル−２′−デオキ
シシチジン（1mmol）とイミダゾール（3.5mmol）とを溶
かした溶液に，攪拌しながらtert−ブチルジメチルシリ
ルクロライド（3mmol）の乾燥DMF（10mL）溶液を滴下す
る。反応液を１時間攪拌した後，氷で反応を止め，塩化
メチレンで抽出する。水で洗浄し，硫酸ナトリウムで乾
燥する。有機層を減圧下でエバポレート乾固し，シリカ
ゲルクロマトグラフィーで塩化メチレンを溶離剤として
精製する。
前段で得られる５′−Ｏ−ジメトキシトリチル誘導体
（1mmol）の塩化メチレン（5mmol）溶液に，臭化亜鉛の
メタノール（15％v/v）含有塩化メチレン（10mL,1M）溶
液を加える。反応混合物を30分間攪拌し，氷で反応を止
め，塩化メチレンで抽出する。有機層を水で洗浄し，硫
酸ナトリウムで乾燥し，減圧下でエバポレート乾固す
る。生成物を，塩化メチレン中メタノール勾配（０〜10
％）を用いシリカゲルクロマトグラフィーで精製する。
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−２−（４−ニト
ロフェニル）エトキシカルボニル−２′−デオキシシチ
ジン−３′−Ｏ−（４−ニトロフェニル）カーボネート
（1.5mmol）および３′−Ｏ−tert−ブチルジメチルシ
リル−Ｎ−４−（４−ニトロフェニル）エトキシカルボ
ニル−２′−デオキシシチジン（1mmol）をジメチルホ
ルムアミド（5mL）に溶かし，減圧下で溶媒を除去す
る。これを２度繰り返す。残渣を再びジメチルホルムア
ミド（5mL）に溶かし,N,N′−ジメチルアミノピリジン
（0.5mmol）またはＮ−メチルイミダゾール（1mmol）で
処理する。溶媒を減圧下でエバポレートすることにより
除去し，反応物を室温にて終夜放置する。残渣をクロロ
ホルム（20mL）に溶かし,HCl水溶液（2mL,0.1M），水
（2mL）,NaOHナトリウム水溶液（２×2mL,0.2M），水
（2mL）で洗浄し，有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し，
エバポレートする。この残渣を，クロロホルム中イソプ
ロパノール勾配（０〜30％）を用いてシリカゲルで精製
する。単離した生成物は,TLC（および400MHzのNMRにお
いて均一である。
残渣を,B.L.GaffneyおよびR.A.Jones〔Tetrahedron L
ett（1982）23:2257〕の記述に従い,2M HF/1M tert−ブ
チルアンモニウムフルオライド（TBAF）試薬を用いて脱
シリル化する。この2M HF/1M tert−ブチルアンモニウ
ムフルオライドを含むピリジン（TBAF 1mmol）に，前段
で得られる脱保護化ヌクレオシドを加える。24時間攪拌
後，反応液を塩化メチレンと重炭酸ナトリウム水溶液と
の間で分配する。その有機層を水洗し，硫酸ナトリウム
で乾燥し，エバポレートし乾固する。残渣を塩化メチレ
ン中メタノール勾配（５〜25％）を用い，シリカクロマ
トグラフィーで精製する。
３′−ヒドロキシジヌクレオシドカーボネートを，実
施例11の方法により３′−（４−ニトロフェニル）−カ
ーボネートに変換する。これらの誘導体は，ヌクレオシ
ドまたはオリゴヌクレオシドカーボネートの５′−水酸
基と反応し，より高級のオリゴヌクレオシドカーボネー
トが調製され得る。
実施例13 カーバメート分子間サブユニット結合の形成 ビス（ｐ−ニトロフェニル）カーボネート,p−アニソ
イルジフェニルメチルクロライド,N,N−ジメチルアニリ
ン（DMA），およびトリエチルアミンは,Aldrich Chemic
al Co.で得られる。
上記実施例３で調製される目的とする５′−アミノ
２′,5′−ジデオキシリボヌクレオシド（必要に応じて
塩基の保護のためにアセチル基またはベンゾイル基を使
用する）を，ピリジン中でｐ−アニソイルジフェニルメ
チルクロライド（1.2mmol）と処理する。12時間後，溶
媒をエバポレートし，残渣を再びクロロホルムに溶解さ
せる。この溶液をNaHCO3水溶液と水とで各々１回洗浄
し，Na2SO4で乾燥する。溶媒をエバポレートし，残渣を
シリカゲルクロマトグラフィーにかけてクロロホルム／
メタノール/1％トリエチルアミン混合液で溶出させる。
５′−トリチル化アミノヌクレオシド（1mmol）をDMF
から２度エバポレートする。次に，溶媒としてDMFを使
用し，トリエチルアミン（またはN,N−ジエチルアミノ
ピリジン，またはＮ−メチルイミダゾール）の触媒量の
存在下でビス（ｐ−ニトロフェニル）カーボネート（2m
mol）と処理する。３時間後，溶媒をエバポレートし，
残渣をクロロホルムに溶解させる。この溶液を0.01N水
酸化ナトリウム水溶液で２度洗浄し，水で１度洗浄し，
次いでNa2SO4で乾燥する。この溶媒をロータリーエバポ
レーターで除去する。残渣をシリカゲルクロマトグラフ
ィーにかけ，まず，クロロホルム/0.1％DMA混合液で溶
出させ，次いで，クロロホルム／メタノール/0.1％DMA
溶媒系で溶離させる。適当な分画を集め，エバポレート
・乾固させる。残渣を最小量のTHFに溶かし，この溶液
を過剰量のヘキサンに加える。沈澱した活性化ヌクレオ
シドを濾過して集め，真空下で乾燥する。
目的とする５′−アミノヌクレオシド（1.1mmol）
は，上記実施例３のように,DMFで２度エバポレートす
る。活性化ヌクレオシド（1mmol）を反応器に加え，固
形物をDMFに溶解させる。溶液を小容量に濃縮し，一晩
放置する。溶媒を真空下で完全に除去し，残渣をクロロ
ホルムに溶解させる。この溶液を0.01N水酸化ナトリウ
ム水溶液で２度洗浄し，水で１度洗浄し，次に，固体の
硫酸ナトリウムで乾燥する。溶媒をロータリーエバポレ
ーターで除去し，残渣をシリカゲルのクロマトグラフィ
ーにかけ，適当なメタノール／クロロホルム/1％トリエ
チルアミン溶媒系で溶出する。二量体のヌクレオシドを
含む分画を合併し，エバポレート・乾固する。残渣を最
小量のTHFに溶解し，この溶液をヘキサンに加える。沈
澱物を集め，真空下で乾燥させる。
実施例14 チオカーバメートサブユニット間結合の形成 N,N−ジメチルアミノピリジン（DMAP）は,Aldrich Ch
emical Co.で購入する。
実施例３で調製した５′−アミノヌクレオシドのサブ
ユニット間結合のチオカルバメートの生成は，上記の実
施例13に記載したのと同様の方法で行なわれる。操作法
において異なる点は次のとおりである。用いられた５′
−アミノヌクレオシドは塩基保護部分として,2−（フェ
ニルスルホニル）エトキシカルボニル（デオキシシチジ
ンおよびデオキシアデノシン用）または９−FMOC（グア
ノシンおよび2,6−ジアミノ−２′−ジオキシリボミド
用）基を有する。これらの分子の調製法は上記（実施例
３）に記載されている。５′−トリチルアミノヌクレオ
シド（1mmol）の活性化は,DMF中，トリエチルアミン（2
mmol）およびDMAP（触媒量）の存在下でｐ−ニトロフェ
ニルクロロチオフォーメート（Monatsber Deut Akad Wi
ss Berlin（1964）6:897のG Hilgetagおよびr.Phillipp
sonの方法により調製）によりなされる。カップリング
ステップでは，この活性化モノマー（1mmol）と所望の
５′−アミノヌクレオシド（1.1mmol）とを用いる。触
媒としてはDMAPまたはＮ−メチルイミダゾールを，そし
て，溶媒としてはDMFを使用する。このステップでの水
性の処理物において,0.01N水酸化ナトリウム水溶液によ
る洗浄は省き水で洗浄を行う。
実施例15 モルフォリン型サブユニット間のカーバメートおよびチ
オカーバーメート分子間サブユニット結合の形成 Ｎ−メチルイミダゾールはAldrich Chemical Co.から
購入する。
実施例５で調製した目的とする乾燥Ｎ′−保護化,5′
−フリーアルコールモルフォリン型のヌクレオシド（必
要に応じて塩基保護のためにアセチル基またはベンゾイ
ル基を使用）を，無水条件下でDMF中のビス−（ｐ−ニ
トロフェニル）カーボネートおよびトリエチルアミン
（またはDMAPまたはＮ−メチルイミダゾール）（触媒
量）で処理する。この溶液を３時間攪拌し，次にエバポ
レートし乾固する。残渣をクロロホルムに溶かし，その
溶液を0.01N水酸化ナトリウム水溶液で２度，水で１度
洗浄し，次にNa2SO4で乾燥する。溶媒をロータリーエバ
ポレーターで除去し，残渣をシリカゲルクロマトグラフ
ィーにかけ，適当なクロロホルム／イソプロパノール/
0.1％DMA混合液で溶出する。目的とする活性化ヌクレオ
シドを含む分画をあわせて，エバポレートし，得られた
固形物を最小量のTHFに溶解させる。このTHF溶液を過剰
量のヘキサンに加え，得られた沈澱物を採取して乾燥す
る。
DMFで２度エバポレートした後，目的とする５′−フ
リーヒドロキシ,N′−フリーモルフォリン型ヌクレオシ
ド（この実施例の中で挙げたのと同一の塩基保護基を使
用）（1.1mmol）を,5′−（ｐ−ニトロフェノキシカル
ボニル）モルフォリンサブユニット（1mmol）のDMF溶液
で処理する。反応溶液の容量を真空下で減じ，小容量と
する。必要であれば,N−メチルイミダゾールまたはトル
エチルアミンを触媒量反応容器中へ加える。得られた溶
液を室温で終夜放置する。残留した溶媒をエバポレート
し，残渣をクロロホルムに溶かす。クロロホルム溶液を
0.01N水酸化ナトリウム水溶液で２度，水で１度洗浄
し，そしてNa2SO4で乾燥する。この溶媒をロータリーエ
バポレーターで除去し，残渣でシリカゲルクロマトグラ
フィーにかけ，クロロホルム／メタノールの混合溶媒で
溶出させる。目的とするダイマーを含む分画をあわせ，
エバポレート乾固する。残渣を最小量のTHFに溶かし，
この溶液を過剰量のヘキサンに加える。沈殿物を集め，
真空下で乾燥する。
チオカーバメート部分により結合したモルフォリンサ
ブユニットは，上記この実施例に関連して，次のように
操作を変更して調製する。塩基の保護基は,1−（フェニ
ルスルホニル）エトキシカルボニル基（デオキシシチジ
ンおよびデオキシアデノシン用），または９−FMOC基
（デオキシグアノシンおよび2,6−ジアミノ−２′−デ
オキシリボシド用）である。これらの分子の調製は，上
記（実施例５）に記載されている。Ｎ−保護化モルフォ
リンヌクレオシド（1mmol）は,DMF中で，トリエチルア
ミン（2mmol）とDMAPまたはＮ−メチルイミダゾール
（触媒量）との存在下,p−ニトロフェニルクロロチオフ
ォーメート（1.2mmol）で活性化される。カップリング
ステップには，この活性モノマー（1mmol）および所望
のＮ′−フリーモルフォリンヌクレオシド（1.1mmol）
を用いる。触媒としてDMAPまたはＮ−メチルイミダゾー
ルを，そして，溶媒としてDMFを用い，溶液を35〜40度
に加温して行う。これらのステップの水性の処理物にお
いては,0.01N NaOH水溶液による洗浄を省き，水で洗浄
する方法を採用する。
実施例16 エステルサブユニット結合の調製 N,N−ジメチルアミノピリジンおよびＮ−メチルイミ
ダゾールはAldrichから得られる。
２つのサブユニットの結合は,5′−N,N−アセトアミ
ド−３′−ヒドロキシ誘導体と３′−シリル化−５′−
活性化エステルとの反応により行う。これらは実施例６
と同様に調製される。その試薬（各1mmol）をジメチル
ホルムアミドと数回にわたり共にエバポレートし，次
に，ジメチルホルムアミド（5mL）に溶かし,N,N−ジメ
チルアミノピリジン（0.2mmol）またはＮ−メチルイミ
ダゾール（1mmol）で処理する。溶媒を減圧下で除き，
反応物を室温で２時間放置する。残渣をクロロホルムに
溶かし，希HCl,水で洗浄し，有機層を硫酸ナトリウムで
乾燥し，そして，溶媒を減圧下でエバポレートする。残
渣をクロロホルム中メタノール勾配を用いてシリカゲル
クロマトグラフィーにより精製する。
その鎖は実施例６のように脱シリル化し，そして，前
段に示すように得られた３′−フリーヒドロキシ化合物
を活性化エステルで処理することにより伸長させてもよ
い。
実施例17 ｔ−BOCアミド結合ダイマーの形成 完全に保護されたｔ−BOC N−ヒドロキシスクシイミ
ドイルエステルまたはｐ−ニトロフェニルエステル（1m
mol）を，実施例11.3および11.4に従って調製し，乾燥
ジメチルホルムアミドで数回，共にエバポレートし乾燥
させる。実施例９で調製した保護化アミノ酸トリフルオ
ロ酢酸塩（1mmol）を同様に処理する。この２つの成分
を，別々に乾燥ジメチルホルムアミド（2mL）に溶解さ
せ，混合し，そして，ジイソプロピルエチルアミン（1.
0mmol）で処理する。この溶液を室温で１時間攪拌し，
次に溶媒を減圧下でエバポレートすることにより除去す
る。この残渣をクロロホルムに溶解させ，希塩酸で洗浄
する。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下でエバ
ポレート・乾固する。この残渣をクロロホルム中メタノ
ール勾配（15〜50％）を用いてシリカゲルクロマトグラ
フィーにより精製する。ｔ−BOCダイマー酸を水−メタ
ノール（トリフルオロエタノール）混合液を用いてC18
逆相クロマトグラフィーにより精製することもできる。
17.1t−BOCダイマー活性化エステルの調製 前段で得られた酸を，実施例11.3および11.4の一般的
手法を用いてＮ−ヒドロキシスクシイミドイルエステル
またはｐ−ニトロフェニルエステルに変換する。
17.2t−BOCダイマーアミノ酸トリフルオロ酢酸塩の調製 実施例９の一般的操作法によりｔ−BOCダイマー酸を
トリフルオロ酢酸塩で処理する。
17.3t−BOCテトラマー酸の調製 ｔ−BOCダイマー活性化エステルおよびダイマー酸ト
リフルオロ酢酸塩を一般的操作法により結合させ,t−BO
Cテトラマー酸を得る。精製については,C18逆相シリカ
ゲルクロマトグラフィーで，水およびメタノール（また
はトリフルオロエタノール）混合液をトリエチルアンモ
ニウムアセテートによりpHを7.0に調整したものを用い
て溶出させる方法が，最も効果的である。このようにし
て，活性化エステルとフリーのアミン成分とを結合させ
ることによりどのような長さの鎖も調製され得る。
実施例18 ８−サブユニットカーボネート結合ポリマーの幾何的組
み立て DEAEセルロースはSigma Chemical Co.から購入する。
調製TLCプレートはEM Scienceの製品であり,VWR Scient
ificから購入する。HPLC装置，カラムおよび供給装置
は,Beckman Instruments,Inc.で得られる。
実施例12に記載した方法で調製した所望のカーバメー
ト結合ダイマー（0.2mmol）を，メタノール/THF/氷酢酸
（1:1:1）の混合液4mLで室温にて12時間で処理する。溶
媒を真空下で除き，残渣を最小量のTHFに溶解させる。
このTHF溶液を大容量のヘキサンに加え，得られた沈澱
物を採取し乾燥する。この酢酸塩をTHF/エタノール（4/
1）混合物に溶解させ,DEAEセルロース（塩基0.8mmol）
をこの容器に加える。20分間攪拌後，不均一な混合物を
濾過し，濾液をエバポレート・乾固する。残渣を最小量
のTHF/エタノール（4:1）に溶かし，この溶液をヘキサ
ンに加える。固形物を採取し乾燥する。沈澱操作をもう
一度繰りかえす。
所望のＮ−５′−トリチルダイマー（0.1mmol）（実
施例12で調製される）をDMFで２度エバポレートし，次
いで,DMFを溶媒とし，トリエチルアミン（またはDMAPま
たはＮ−メチルイミダゾール）（触媒量）の存在下で，
ビス（ｐ−ニトロフェニル）カーボネート（2mmol）で
処理する。３時間後，溶媒をエバポレートし，残渣をク
ロロホルムに溶解させる。この溶液を0.01N水酸化ナト
リウム水溶液で２度，水で１度洗浄し，次に，Na2SO4で
乾燥する。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し，
残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにかけ，クロロホ
ルム／イソプロパノールまたはメタノール/0.1％DMA混
合液で溶出させる。適当な分画を合併し，エバポレート
・乾固する。この残渣を最小量のTHFに溶解させ，そし
てこの溶液を過剰量のヘキサンに加える。沈澱した活性
化ダイマーを濾過して集め，真空下で乾燥させる。
上記調製した５′−アミノダイマーヌクレオシド（0.
11mmol）をDMFで２度エバポレートする。この活性化ダ
イマー（0.1mmol）を反応容器に加え，固形物をDMFに溶
解させる。溶液を小容量に濃縮し，終夜放置する。溶媒
を真空下で完全に除去し，得られた残渣をクロロホルム
に溶解させる。この溶液を0.01N水酸化ナトリウム水溶
液で２度，水で１度洗浄し，次に硫酸ナトリウム水溶液
で２度，水で１度洗浄し，次に硫酸ナトリウムで乾燥す
る。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し，残渣を
調製TLCプレートにかけて適当なメタノール／クロロホ
ルム/1％トリエチルアミン溶媒系で溶出させる。テトラ
マーヌクレオシドを含むバンドを溶離させ，溶媒をエバ
ポレートする。残渣を最小量にTHFに溶かし，この溶液
をヘキサンに加える。沈澱を集め真空下で乾燥させる。
この実施例の中で挙げた操作法を用い，次のような転
換を行う。所望のＮ−５′−トリチルエトラマーヌクレ
オシド（0.06mmol）を,THF/メタノール／氷酢酸（1/1/
1）で処理し精製して５′−アミノテトラマーヌクレオ
シド（0.05mmol）を得る。他のＮ−５′−トリチルテト
ラマーヌクレオシド（0.05mmol）をビス（ｐ−ニトロフ
ェニル）カーボーネートで活性化し，次いで精製する。
この２つのテトラマーを結合させ，処理し，さらに調製
TLCプレートまたはHPLCクロマトグラフィーにより精製
する。クロマトグラフィーで得られる物質を固形物とし
て単離し，最小量のTHFにとかし，ヘキサンにより沈澱
させる。そのオクタマー（８量体）ヌクレオシドを集
め，乾燥させる。
オクタマーを以下で使用するために，次のように形成
する。Ｎ−５′−トリチルオクタマーヌクレオシドをTH
F/メタノール／氷酢酸（1/1/1）で処理し，上に挙げた
条件で精製する。５′−アミノオクタマーヌクレオシド
（0.01mmol）をピリジン中無水コハク酸（0.02mmol）で
室温にて２時間処理する。溶媒をロータリーエバポレー
ターで除去し，残渣をエタノールで数回エバポレートす
る。残渣をTHF/エタノール（3/1）に溶かし，ヘキサン
／ベンゼン混合液（2/1）に加える。固形物を集め乾燥
させる。Ｎ−５′−スクシニル化オクタマーヌクレオシ
ド（0.01mmol）をピリジン／濃アンモニア（1/1）（1m
L）で処理する。終夜放置後，溶媒をロータリーエバポ
レーターで除去し，残渣をエタノールの数回エバポレー
トする。粗固形物を逆相（RP-18）HPLCを用い精製す
る。溶出物をエバポレートし，残渣をDMSOに加え，ヘキ
サン／ベンゼン（1/1）溶液で沈澱させる。固形物を採
取し，乾燥させる。
実施例19 ポリマーの段階的および段階的／ブロック組み立てに適
切な担体に結合した開裂可能なリンカーの調製：担体の
活性化およびリンカーの結合 長鎖アルキルアミン誘導体化制御細孔グラス（Cat.N
o.24875）は,Pierce Chemical Co.から得られる。2,2−
スルホニルジエタノールおよびジシクロヘキシルカルボ
ジイミドはAldrich Chemical Co.から得られる。
グラス担体のアミノ基（担体1gあたり約40mmol）を，
実質的にMatteucciおよびCaruthers（J Amer Chem Soc
（1981）103;3185）の方法により，無水コハク酸と反応
させ，フリーのカルボン酸末端を得る。2,2−スルホニ
ルジエタノール（60重量％水溶液）1/10molを次のよう
にして乾燥させる。まず,3倍容のジメチルホルムアミド
（DMF）と混合し，温水浴中で真空下濃縮して濃いシロ
ップとする。次に同容量のDMFを加えて濃縮し，濃いシ
ロップとし，さらにこの操作をもう１度繰り返す。次
に，乾燥DMFを加え，最終的に2Mのスルホニルジエタノ
ールを得る。スルホニルジエタノール1mlおよびジシク
ロヘキシルカルボジイミド0.2gの混合液を，カルボン酸
残基をもつ乾燥制御多孔グラス担体1gに加え，スラリー
を前後左右に動揺させて（攪拌しない）室温で終夜混合
する。その後，グラス担体をメタノールで充分に洗浄し
乾燥する。
実施例20 エイズ（AIDS）ウイルス染色体における保存された配列
に対する14−サブユニットカーボーネート結合ポリマー
の調製：固体担体上での段階的な組立て：第１サブユニ
ットの付加および鎖の伸長 Ｎ−メチルイミダゾール,4−（N,N−ジメチルアミ
ノ）ピリジン（DMAP），および1,8−ジアザビシクロ
〔5,4,0〕ウンデク−７−エン（DBU）は,Aldrich Chemi
cal Co.で得られる。メチルｐ−ニトロフェニルカーボ
ーネートは，メチルクロロフォーメートとｐ−ニトロフ
ェノールとから調製される。
実施例4.2で調製される２′−デオキシシチジン サ
ブユニット（N4はｐ−ニトロフェネトキシカルボニル部
分を,5′酸素はジ（ｐ−メトキシ）トリチル部分（DM
T）を，そして３′酸素はｐ−ニトロフェノキシカルボ
ニル部分を有する）（0.1mmol）を，最小容量の乾燥テ
トラヒドロフラン（THF）またはジメチルホルムアミド
に溶解させ，実施例19で調製される充分に乾燥した制御
多孔グラス担体（1mmol N−メチルイミダゾールまたは
0.1mmol DMAPのいずれか）を加え，このスラリーを前後
左右に動揺させて（攪拌しない）２時間にわたり混合す
る。次にこのスラリーを濾過し，固形物をTHFで洗浄す
る。
1Mのメチルｐ−ニトロフェニルカーボーネートと0.5M
のDMAPとを含むTHF2mlを加えて20分間室温で混合するこ
とにより，未反応の水酸基をキャップする。その後，グ
ラス担体をTHFで洗浄し，濾過する。
ジクロロメタンで担体を洗浄して５′末端のジメトキ
シトリチルを除き，次に,0.2Mジクロロ酢酸ジクロロメ
タン溶液5mlで室温にて５分間処理する。次にグラス担
体をジクロロメタンで洗い濾過する。
次に，実施例１で調製され実施例２で活性化したサブ
ユニットを同様にして，次の順序で加える:G,A,T,A,A,
C,A,T,T,T,T,T,C,（ＧはFMOC部分で保護され,AおよびＣ
はｐ−ニトロフェネトキシカルボニル部分で保護されて
いる）。
実施例21 エイズウイルス染色体における保存された配列に対する
19−サブユニットカーバメート結合ポリマーの調製。固
体担体上におけるオリゴマーブロックの段階的組み立
て：第１サブユニットの付加および鎖の伸長。
実施例３で調製した５′−アミノ−２′,5′−ジデオ
キシシチジン サブユニット（0.2mmol）（ここでN4は
ベンゾイル部分を有し,5′−アミンは,p−メトキシトリ
チル部分を有し,3′酸素は,p−ニトロフェノキシカルボ
ニル部分を有する）を最小量の乾燥THFに溶かし，実施
例19で調製した開裂可能なリンカーを有する乾燥制御細
孔グラス担体0.5gに加える。触媒（1mmolのＮ−メチル
イミダゾールまたは0.1mmolのDMAP）を加え，このスラ
リーを前後左右に２時間揺動させて混合する。次にスラ
リーを濾過し，固形物をTHFで充分に洗浄する。
モノ−ｐ−メトキシトリチルをジクロロメタンで洗浄
して除き，続いて,0.2Mジクロロ酢酸のジクロロメタン
溶液5mlで室温にて１分間処理する。次に，担体をジク
ロロメタンで洗浄し，濾過する。１％容量のジイソプロ
ピルエチルアミンを含むTHF3mlで簡単に洗浄し,5′−ア
ミノ末端をフリーのアミンに変換する。これをTHFで洗
浄し，濾過する。
５′−Ａ−Ｇ−３′配列をもつ３′−ｐ−ニトロフェ
ノキシカルボニル−活性化ダイマー（実施例13で調製さ
れる）0.1mmol（グアニンN2は，アセチル部分で保護さ
れ，アデニンN6はベンゾイルまたはｐ−ニトロベンゾイ
ル部分で保護されている）を最小量の乾燥THFに溶か
し，ガラス担体に加え，混合を２時間にわたり行う（こ
の反応および次のカップリングステップには触媒を加え
ない）。次に，スラリーをTHFで洗浄し濾過する。
ｐ−ニトロフェニル酢酸2Mを含むTHFを2ml加えて20分
間室温で混合することにより未反応のアミン部分をキャ
ップする。その後，ガラス担体をTHFで洗い，濾過す
る。
５′−末端のモノ−メトキシトリチルを，前述のよう
にジクロロ酢酸により除去する。
実施例17で調製される活性化２量体サブユニット（こ
こでシトシンの環外の窒素はベンゾイル部分で保護され
ており,Aの環外の窒素はベンゾイルまたは,p−ニトロベ
ンゾイル部分で保護されている）を同様にして，次の順
序で加える:A−T,C−A,T−A,T−T,T−T,A−C,A−C,C−
Ａ（５′から３′）。
強い非求核塩基（例えば,AおよびＣにはｐ−ニトロフ
ェネトキシカルボニルまたはフェニルスルホニルエトキ
シカルボニルそしてＧにはFMOC）により除去され得る環
外の塩基性窒素保護基を有するサブユニットも，上記操
作法によりポリマーを組み立てるために使用され得る。
しかし，これらのどちらか一方の保護基を有するポリマ
ーは，通常，これらのどちらか一方の保護基を有するポ
リマーは，通常，水酸化アンモニウムで処理するよりも
DBUで処理することによって脱保護される。
実施例22 エイズウイルス染色体における保存された配列に対する
19−サブユニットアミド結合ポリマーの調製。固体担体
上におけるオリゴマーブロックの段階的組み立て：第１
サブユニットの付加および鎖の伸長 実施例11.3と同様に調製されるシトシン含有非環状バ
ックボーンサブユニット（ここで，シトシンのN4は２
（ｐ−ニトロフェニル）エトキシカルボニル部分を有
し，バックボーンのアミンはｔ−ブトキシカルボニル部
分を有し，そして，カルボキシルは,p−ニトロフェニル
エステルの形態である）を最小容量の乾燥THFに溶解さ
せる。これを，実施例19で調製され，開裂可能なリンカ
ーを有する乾燥制御細孔グラス担体0.5gに加える。触媒
（1mmolのＮ−メチルイミダゾールまたは0.1mmolのDMA
P）を加え，担体を２時間にわたり混合し，濾過し，固
形物をTHFで充分に洗浄する。
担体をジクロロメタンで洗浄し，続いて,20％のトリ
フルオロ酢酸を含む塩化メチレン5mlで室温にて30分間
処理することによりｔ−BOCを除去する。担体をジクロ
ロメタンで洗浄し，濾過する。担体に結合しているアミ
ノ末端を,1容量％ジイソプロピルエチルアミンを含むTH
F3mlで簡単に洗浄しフリーのアミンに変換し，さらにTH
Fで洗浄する。
実施例17で調製される（アミノ末端）−Ｇ−Ａ（カル
ボキシ末端）の配列を有する活性化２量体サブユニット
（ここでグアニンのN2はFMOC部分を有し，アデニンのN6
はｐ−ニトロフェネトキシカルボニル部分を有し，バッ
ク−ボンのアミノ末端はｔ−BOC部分を有し，そして，
カルボキシ末端は,p−ニトロフェニルエステルの形態で
ある）0.1mmolを最小容量の乾燥THFに溶かしてグラス担
体に加え，混合を２時間にわたり行う（この反応および
続くカップリングステップでは触媒を加えない）。その
担体をTHFで洗浄する。
2M p−ニトロフェニルアセテートを含むTHF2mlを加
え，室温で20分間混合することにより未反応のアミン部
分のいずれをもキャップする。その後，グラス担体をTH
Fで洗浄する。
上記のように，末端ｔ−BOC部分をTFAで除去し，そし
て担体を中和する。
続いて，実施例17で調製される２量体サブユニットを
次の順序で加える：（Ｃ末端）Ｔ−A,A−C,A−T,T−T,T
−T,C−A,C−A,A−Ｃ（Ｎ末端）。
環外窒素の保護基〔その保護基は，適切な求核試薬
（例えば,Cに対してはベンゾイル,Aに対してはベンゾイ
ルまたはニトロベンゾイル，そしてＧに対してはアセチ
ルまたはイソブチルにより除去されうる〕を有するサブ
ユニットも，上の操作法によりポリマーを組み立てるた
めに使用され得る。しかし，これらのいずれかの保護基
を有するポリマーは，通常,DBUで処理するよりむしろ水
酸化アンモニウムで処理することにより脱保護される。
実施例23 ヌクレオシド ３′−Ｏ−（ｐ−クロロフェニル−２
−シアノエチル）−リン酸の調製 23.13′の保護基の付いたヌクレオシドの調製 チミジン,N−ベンゾイルデオキシアデノシン,N−ベン
ゾイルデオキシシチジン,N−イソブチリルデオキシグア
ノシンおよびそれらの５′−Ｏ−（ジ−ｐ−メトキシト
リチル）５′−ODMT−ヌクレオシド）派生物はファルマ
シア Ｐ−Ｌバイオケミカル（Piscataway,NJ）より入
手する。β−ベンゾイルプロピオン酸とジシクロヘキシ
ルカルボジイミド（DCCD）は販売会社より入手する。
選択された５′−Ｏ−ジメトキシトリチルヌクレオシ
ド（1mmol）を,6mlのピリジン中でβ−ベンゾイルプロ
ピオン酸（3mmol）およびDCCD（4mmol）と反応させる。
反応混合液を25℃で３時間攪拌し，その後1.5mlの水を
加え，その混合液を25℃で５時間攪拌する。反応混合液
を濾過し，濾液の蒸発後，エタノールを用いた数回の共
蒸発により残留物からピリジンを除去する。精製した残
留物を酢酸エチル中に取り，酢酸エチルを用いてシリカ
ゲル上でクロマトグラフィーを行う。濃縮した酢酸エチ
ル溶出物をヘキサンで処理し，生成した３′−Ｏ−β−
ベンゾイルプロピオニル−ヌクレオシド（３′−ＯβＢ
−ヌクレオシド）を沈澱させる。
23.2ヌクレオシドの活性化 ホスホロジクロル酸ｐ−クロロフェニルはアルドリッ
チ（Milwaukee,WI）より入手する。ベンゼンスルホン
酸，テトラヒドロフラン，トリエチルアミン，および３
−ヒドロキシプロパンニトリルは販売会社より入手す
る。
テトラヒドロフラン10ml中3mmolのトリアゾールと3mm
olのトリエチルアミンおよび1.5mmolのホスホロジクロ
ル酸ｐ−クロロフェニルとの連続反応により,p−クロロ
フェニルホスホロジトリアゾリドの溶液を調製する。25
℃で10分反応後，乾燥ピリジン2ml中の選択された５′
−ODMTヌクレオシド1mmolをその反応混合液に加える。
長くて２時間,25℃で放置後，混合液を3mlの無水ピリジ
ン中のベンゼンスルホン酸（4mmol）とトリエチルアミ
ン（4mmol）の溶液で処理し，続いて３−ヒドロキシプ
ロパンニトリル（2mmol）を加える。反応混合液を真空
下で4mlに濃縮し，長くて２時間まで25℃で放置し，次
に長くて24時間まで４℃で放置する。０℃,20mlの５％
重炭酸ナトリウム水溶液中へ混合液を注ぎ，クロロホル
ムで完全に抽出し，硫酸ナトリウムで抽出物を乾燥さ
せ，そして溶媒を減圧下で除去することにより，反応を
終結させる。５′−ODMTヌクレオシド３′−Ｏ−（ｐ−
クロロフェニル−（２−シアノエチル））−リン酸生成
物を，エーテル，酢酸エチル，およびテトラヒドロフラ
ンの連続溶出を用いたシリカゲルでのクロマトグラフィ
ーにより得る。
実施例24 荷重された結合と荷重されていない結合とを交互に有す
るテトラマー調製 ホスホノジクロル酸メチルはアルドリッチから入手す
る。
ベンゼンスルホニルテトラゾリドはStawinski et al,Nu
cleic Acids Research（1977）4:353に従って調製す
る。
24.1二量体の合成 無水テトラヒドロフラン20ml中の1,2,4−トリアゾー
ル（3mmol）とトリエチルアミン（3mmol）を，ホスホノ
ジクロル酸メチル（1.2mmol）の存在下で25℃,2〜10時
間反応させることにより，メチルホスホノジトリアゾリ
ド溶液を調製する。濾過に続いて，選択された５′−OD
MTヌクレオシド（1mmol）の10ml乾燥ピリジン溶液を濾
液に加え，混合液を8mlまで濃縮し，長くて２時間まで2
5℃で放置する。その溶液に，ベンゼンスルホニルテト
ラゾリド（1.2mmol）と選択した３′−ＯβＢヌクレオ
シドを加える。25℃で2.5時間保温後，−78℃の50％重
炭酸ナトリウムを20ml加えることにより反応を止め，ク
ロロホルムで完全に抽出する。溶媒を硫酸ナトリウムで
乾燥し蒸発させる。その反応はまた，実施例IIからの
３′−Ｏ−PO−（OpCP）（OCE）−保護のヌクレオシド
リン酸から開始して，実質的には前述同様に行ってよ
い。
24.2立体異性ホスホン酸メチル二量体の分離 酢酸エチル：テトラヒドロフラン混合液（０〜100％
テトラヒドロフラン）またはクロロホルム／メタノール
混合液（０〜20％メタノール）を用いて，シリカゲル60
を充填したガラスカラムで大気圧で行うシリカゲル・カ
ラムクロマトグラフィーにより，前節で生成した立体異
性二量体を分離する。より速く移動する立体異性体の画
分を合わせ，ヘキサンを加えることによりテトラヒドロ
フラン溶液から沈澱させる。より遅く移動する立体異性
体はそれ以後用いられない。
24.3ホスホジエステル／ホスホン酸メチル−連結四量体 それぞれ，選択された２塩基結合，および３′ＯβＤ
と５′ODMTの保護基をもつ，第１と第２の立体特異的ホ
スホン酸メチル二量体は，おのおの実施例24.1と24.2の
ようにして調製する。メシチレンスルホニルテトラゾリ
ドはStawinski,et al,Nuc Acids Res（1977）4:353に従
って調製する。
純粋な５′ヒドロキシ化合物を得るために第１の二量
体の５′ODMT保護基を除く。第２の二量体のシアノエチ
ル基を,1mmolの二量体をピリジン溶液（8.5ml），水
（2.9ml）およびトリエチルアミン（2.9ml）と25℃で１
時間処理することにより除き，溶媒を蒸発させることに
より３′ヒドロキシヌクレオチドを得る。
５′−OH二量体（1mmol）と３′−ヒドロキシヌクレ
オチド二量体（1mmol）を8mlのピリジン中に溶解し，メ
シチレンスルホニルテトラゾリド（３〜6mmol）を加え
て25℃で3.5時間処理することにより，二量体縮合反応
を行う。反応混合液を4mlの冷50％ピリジン水溶液と加
え合わせ,80mlの重炭酸ナトリウム水溶液中に注ぐ。反
応生成物をクロロホルムで完全に抽出し，硫酸ナトリウ
ムでの乾燥および有機溶媒の蒸発の後，メタノール／ク
ロロホルム混合液を用いたシリカゲルで精製する。溶出
させた生成物はヘキサンを用いて沈澱させる。３′−Ｏ
−P0−（OpCP）（OCE）保護基を有する四量体は,3′−
Ｏ−P0−（OpCP）（OCE）基を有する二量体から始めて
実質的には同様な方法により調製してもよい。
実施例25 リンカーアームによるポリマーの固体担体への付着 25.1二機能性ヘキサンリンカーアームの調製 Dowex 50Xピリジニウム樹脂はバイオ−ラッド（Richm
ond,CA）から入手し，そして６−アミノヘキサノール，
ジメチルホルムアミドおよび３−ヒドロキシプロパンニ
トリルは販売業者から入手する。６−（２−メチルスル
ホニル）−エチルｐ−ニトロフェニルカルボネートはEb
erle,et al,Helvetica Chimica Acta（1975）58:2106に
従って調製する。
二機能性のヘキサンリンカーアーム ６−（２−メチ
ルスルホニル−エトキシカルボニルアミノ）−ヘキサノ
ールは,1mlのジメチルホルムアミド中で６−アミノヘキ
サノール（1mmol）を２−（メチルスルホニル）エチル
ｐ−ニトロフェニルカルボネート（1mmol）と25℃で長
くて４時間まで反応させることにより調製する。反応混
合液を水中に注ぎ，ベンゼンで完全に抽出し，そのベン
ゼンを水で洗浄し，その有機溶媒を次に硫酸ナトリウム
で乾燥させ，そして蒸発させてカルバメートアルコール
を得る。これはメタノール／クロロホルム溶媒混合液を
用いたシリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
25.25′−Ｏ−（６−アミノヘキシル）のリンカーアー
ムを持つオリゴヌクレオチド類似物の調製 重炭酸トリエチルアンモニウムとフッ化テトラブチル
アンモニウムは販売業者から入手する。完全に保護され
ているオリゴヌクレオチド類似物は，実施例VIで記述さ
れているホスホン酸メチル二量体の縮合スキームにより
調製する。２％のベンゼンスルホン酸を含む10mlのクロ
ロホルム：メタノール（7:3,v/v）中に，オリゴヌクレ
オチド（1mmol）を溶解させ，約40分,0℃で放置する。
反応混合液を５％重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し，次に
水で洗浄する。クロロホルム層を硫酸ナトリウムで乾燥
し，濾過し，そして減圧下で蒸発させる。その物質をク
ロロホルムに溶解し，残留物をクロロホルム／メタノー
ル混合液を用いてシリカゲルでクロマトグラフィーを行
って,5′−ヒドロキシオリゴヌクレオチド化合物を得
る。
６−（２−メチルスルホニル）−エトキシ−カルボニ
ルアミノ）−ヘキシルメチルホスホニルトリアゾリド
（5mmol）のピリジン（10ml）溶液は，実施例25.1から
のカルバメートアルコールを，実施例24.1に述べられて
いるようにして調製したメチルホスホノジトリアゾリド
で処理することにより調製する。この溶液に，前節の
５′ヒドロキシ化合物（1mmol）とベンゼンスルホニル
テトラゾリド（4mmol）を加える。反応を継続し，実施
例24.1のように仕上げる。
残留物をクロロホルム／メタノール溶媒混合液を用い
てシリカゲルでのクロマトグラフィーにかける。保護さ
れたオリゴヌクレオチド（1mmol）を,14mlの20％酢酸／
ピリジン中で,4mlのヒドラジン水和物で25℃にて16〜24
時間処理する。蒸発後，残留物を30mlのテトラヒドロフ
ラン／ピリジン／水（8:1:1,v/v/v）中で,0.017Mのフッ
化テトラブチルアンモニウムを含む溶液で25℃にて24時
間処理する。この溶液を次に,60mlのピリジン中50％濃
縮水酸化アンモニウムで４℃にて10時間処理する。その
結果生成するオリゴマーを,0.1M酢酸アンモニウムバッ
ファー,pH5.8中の水・アセトニトリル混合液をクロマト
グラフィー溶媒として用いた逆相HPLCカラムで調製す
る。
25.35′−Ｏ−（アミノヘキシル）−オリゴヌクレオチ
ド類似物の同体担体への付着 アフィーゲル10はバイオ−ラッド（Richmond,CA）か
ら入手する。10mlの充填ゲルを，イソプロピルアルコー
ル（３ベッド容量），そして次に氷冷脱イオン水（３ベ
ッド容量）で洗浄する。５′−Ｏ−（６−アミノヘキシ
ル）−オリゴヌクレオチド（150mmol）は，実施例26で
述べられているようにして調製する。0.1M重炭酸ナトリ
ウムバッファー,pH8.0,5ml中のオリゴヌクレオチド（15
0M）を,25℃で１〜４時間，洗浄したゲルを加えてスラ
リー化する。その混合液を次に,1mlの1Mエタノールアミ
ン：塩酸バッファー（pH8.0）で処理して，ゲル上のあ
らゆる未反応の活性エステルをおおう。そのゲルを，す
べてのバッファーが除かれるまで水で洗浄し,0.02％の
アジ化ナトリウムの存在下で４℃で保存する。
実施例26 試薬担体の調製 アミノメチル化したポリスチレンは,B.A.Mukhitdinov
a,E.E.Eighozin,とG.A.Makhmudova,Izv Akad Nauk Kaz
SSR.,Ser Khim（1980）48により記述されているように
調製する。重炭酸ジスクシンイミドと６−アミノヘキサ
ノールはアルドリッチより入手する。
アミノメチル化したポリスチレン（1g,3.0meq/g）を
水／アセトニトリル（10ml,3:1 v/v）中に懸濁し，無水
コハク酸（20mmol）を加えて４℃で処理する。溶液のpH
は20％NaOHを加えることにより6.0に保つ。溶液のpHを
一定にして，反応を24時間続ける。ビーズを濾過し,2N
HCl,水で（洗浄液のpHが中性になるまで）洗浄し，ジオ
キサンで繰り返し洗浄することにより脱水する）。
前節からの（固定した酸性基をもつ）担体を，アセト
ニトリル（10ml）中で重炭酸ジスクシンイミド（20mmo
l）と25℃で24時間反応させる。その担体を濾過により
単離し，固定したスクシンイミドエステルをもつ担体を
アセトニトリルで完全に洗浄する。
前出からの担体をジメチルホルムアミド（10ml）に懸
濁し,6−アミノヘキサノール（20mmol）を加えて25℃で
24時間反応させる。その担体を濾過により単離し，固定
したアルコール鎖をもつ担体をジメチルホルムアミドで
完全に洗浄する。
実施例27 アミノヌクレオシドの担体へのカップリングの手順 Ｎ−メチルイミダゾール，塩化テトラブチルアンモニ
ウム，フッ化テトラブチルアンモニウム，およびイミダ
ゾールはアルドリッチから入手する。ビス（ｐ−ニトロ
フェニル）カルボネートはシグマ（St.Louis,MO）から
入手する。
支持化アルコール（10mmol）を，ジメチルホルムアミ
ド（30ml）中でカルボニルジイミダゾール（50mmol）の
ようなカップリング試薬を加えて25℃にて３時間反応さ
せる。活性化させた担体を濾過により単離し，ジメチル
ホルムアミドで完全に洗浄する。その担体を30mlのジメ
チルホルムアミドで完全に洗浄する。その担体を30mlの
ジメチルホルムアミド中に再懸濁し，実施例21のように
調製した選択されたポリカルバメートポリマー（50mmo
l）を加えて処理する。３時間後，支持化アルコールを
濾過し，ジメチルホルムアミドで完全に洗浄する。
選択したプローブは,ARV−２のORF−２遺伝子の8441
から8456までの残基を含有する標的配列に特異的であ
り,AIDSの病因学的因子（Sanchez-Pescador et al,Scie
nce（1985）227:484）は次の５′−アミノヌクレオチド
（早い導入順）でゲルにカップリングさせることにより
合成する:C,T,G,C,T,C,C,C,A,C,C,C,C,A,T,C, ここでC,G,およびＡはそれぞれ,N−（β−（トリメチ
ルシリル）エトキシカルボニル）保護の５′−アミノ−
２′,5′−ジデオキシ シチジン，グアノシンおよびア
デノシンを表し，またＴは５′−アミノ−２′,5′−ジ
デオキシチミジンを表す。
支持化ポリカルバメート（10mmol）をアセトニトリル
（30mmol）中に懸濁し，塩化テトラブチルアンモニウム
（1meq保護基あたり3mmol）とフッ化カリウム二水和物
（1meq保護基あたり4mmol）を加えて処理し,50℃で12時
間加熱する。この時間の終わりに水（30ml）を加え，支
持化プローブを水で完全に洗浄する。保護基を同様な条
件で，テトラヒドロフラン中フッ化テトラブチルアンモ
ニウム（1meq保護基あたり3mmol）で除いてもよい。
実施例28 BOC誘導体 ４−（Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−Ｎ
−メチルアミノ）−ブチル酸としてのアミノ基の保護 ４−（メチルアミノ）−ブチル酸はアルドリッチから
入手する。ジ−tert−ブチルジカルボネートはピアス
（Rockford,IL）より入手する。
４−（メチルアミノ）−ブチル酸（10mmol）をジオキ
サン／水（30ml,2/1）に溶解し,1N NaOH（10ml）を加え
る。この溶液を０℃に冷やし，ジ−tert−ブチルカルボ
ネート（11mmol）を攪拌しながら加える。25℃で30分
後，減圧下でジオキサンを除去し，硫酸水素カリウムを
加えることにより，溶液のpHをpH-2.5に合わせる。水相
を酢酸エチルで完全に抽出し，有機層を加え合わせ，硫
酸ナトリウムで乾燥する。減圧下での溶媒の除去により
遊離酸が得られ，これはクロロホルム／ヘキサンからの
再結晶化，またはクロロホルム／メタノール混合液を用
いたシリカゲルでのクロマトグラフィーにより精製す
る。
実施例29 末端ジメチルアミノ基の導入，イミダゾールへの変換
による酸の活性化の一般的手順，およびアミンとのカッ
プリングの一般的手順 N,N′−カルボニルジイミダゾールはアルドリッチか
ら入手する。
BOCで保護されたアミノ酸（またはオリゴペプチド酸,
1mmol）の溶液を，カルボニルジイミダゾール（1mmol）
を加え，−20℃で６時間処理する。この時期に，実施例
30のように調製したジメチルアミン（過剰）またはオリ
ゴペプチド酸（1mmol）のDMF溶液（1ml）を−20℃で加
え，反応物を次に25℃で12時間攪拌する。溶媒を減圧に
より除去し，残留物をメタノール／クロロホルムを用い
たシリカゲルでのクロマトグラフィーにかけて,N,N−ジ
メチル４−（Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−Ｎ−メチ
ルアミノ）−ブチルアミドを得る。
実施例30 N,N−ジメチル４−（メチルアミノ）−ブチルアミドのB
OC保護基の除去の一般的手順 トリフルオロ酢酸はアルドリッチから入手する。（BO
C保護されたオリゴペプチド,1mmolの）N,N−ジメチル４
−（Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−Ｎ−メチルアミ
ノ）−ブチルアミド（実施例XV）をトリフルオロ酢酸5m
l）に溶解し,25℃で１時間攪拌する。溶媒を除去し，残
留物を1N NaOH/飽和NaCl（1/10）およびクロロホルムに
分割する。水相をクロロホルムで完全に抽出し，加え合
わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下で蒸発
させ，遊離アミンを得た。これは，以後のカップリング
反応に直接用いることができ，また１％トリエチルアミ
ンを含むメタノール／クロロホルム混合液を用いてシリ
カゲルで精製できる。
カップリングの手順およびBOC非保護配列を用いて，
いろいろな長さのポリアミドを調製してもよい。例え
ば,4−（Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−Ｎ−メチルア
ミノ）−ブチリルイミダゾリドとN,N−ジメチル４−
（メチルアミノ）−ブチルアミドとの反応により二量体
のモノアミドが生成する。BOC基の除去，そして他のイ
ミダゾリド等価物とのカップリングにより三量体のジア
ミドが生成し，この過程は目的の長さが得られるまで繰
り返される。
代わりに,4−（Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−Ｎ−
メチルアミノ）−ブチリルイミダゾリドを４−（メチル
アミノ）−ブチル酸と反応させ，そしてその結果生成す
る二量体の酸をN,N−カルボニルジイミダゾールで活性
化し，遊離アミノオリゴアミドとカップリングさせる。
実施例31 アミド結合のアミンへの還元のための一般的手順 AG-50およびDowex-50Wはバイオ−ラッド（Richmond,C
A）から入手する還元されるべきオリゴマーポリアミド
を,BOC基を除去するために，一般的手順のようにトリフ
ルオロ酢酸で処理する。単離および精製後，テトラヒド
ロフラン（1ml）中遊離アミン（1mmol）を25℃でテトラ
ヒドロフラン（3ml）中ボラン（アミド残基当り2mmol）
溶液に滴定的に加える。無色の溶液を１時間還流し,0℃
まで冷却し，そして6N HCl（1ml）で滴定処理する。気
体の放出を全て終えた後，溶液を減圧下で蒸発させて，
テトラヒドロフランを除き，残存する水溶液をAG-50イ
オン交換樹脂にかけ，そして水（10ml）でカラムを洗い
酢酸ナトリウム（0.1-2.0M）と食塩（0.1-2.0M）から成
るpH5のバッファーでポリアミンを溶出させることによ
り精製する所望の生成物を含む画分を集めて蒸発させた
後，残留物を1N HCl（4ml）に溶解し，そしてDowex-50W
イオン交換カラムにかける。水，そして2M HClで洗った
後，生成物は,6N HClで溶出させ，また減圧下で溶媒を
除去することにより，塩酸塩として回収する。
ポリアミンの一級アミノ基はBOC−誘導体として保護
され，実施例33のようにメチルヨウ化物を用いてアンモ
ニウム塩に交換される。
実施例33 ポリアミンへの末端一級アミノ基組込みの一般的手順 ４−アミノブチル酸をBOC−誘導体に交換する。これ
を実施例28のようにカルボニルジイミダゾールと反応さ
せ，そして実施例29からの二量体アミドで処理する。実
施例31のようなBOC−基の切断と還元によりポリアミン
が生じる。
ポリアミンの一級アミノ基は一般的手順のようにBOC
−誘導体として保護され，実施例33のようにメチルヨウ
化物を用いてアンモニウム塩に交換される。
実施例33 ポリアミンのポリ（第４アンモニウム）塩（３−アミノ
プロピル−）−ジメチル（３−（５′−ジメチルアミノ
−１−ナフタレン−スルホニルアミノ）−プロピル）−
アンモニウムクロライドへの変換の一般的手順 メチルヨウ化物とエチルジイソプロピルアミンはアル
ドリッチから入手する。
ジオキサン／水（3ml,2/1）中のビス（３−アミノプ
ロピル）メチルアミン（1mmol）の溶液に,1NNaOH（1m
l）を加える。０℃で攪拌しながら，ジ−tert−ブチル
ジカーボーネート（1.1mmol）を加え，その混合液を25
℃で30分攪拌する。塩基性溶液を徹底的にクロロホルム
で抽出し，一緒にした有機相を硫酸ナトリウムで乾燥さ
せ，蒸発させる。生成物は，無水ジメチルホルムアミド
（5ml）からの蒸発により乾燥させる。残留物をDMFに溶
解させ，そして溶液を,25℃で１時間，メチルヨウ化物
（12mmol）で処理する。溶媒を蒸発させ，そして残留物
をトリフルオロ酢酸（5ml）に溶解させる。１時間後，
溶媒を蒸発させ，そして残留物はピリジン（5ml）に溶
解させる。この溶液にエチルジイソプロピルアミン（１
級,2級，および３級アミン官能基1mmol当り2mmol）を加
え，そしてこの溶液を０℃にて５−ジメチルアミノ−１
−ナフタレン−スルホニル クロライド（0.9mmol）
（実施例20のようにして得られたもの）で処理し，次い
でこの混合液を４℃で一晩放置することにより，ダンシ
ル基を導入する。反応生成物を前節のように，イオン交
換クロマトグラフィーにより精製し，そして塩酸塩とし
て単離する。
代わりに，ダニシル化リポーターを直接ジメチルホル
ムアミド中のメチルヨウ化物で処理し，上記のようにイ
オン交換クロマトグラフィーにより精製してもよい。
実施例34 フロオロフォア導入の一般的手順 ５−ジメチルアミノ−１−ナフタレン−スルホニルク
ロライドはアルドリッチより入手する。
０℃で，ピリジン（5ml）中の出発ポリアミン（1mmo
l）の溶液に５−ジメチルアミノ−１−ナフタレン−ス
ルホニルクロライド（0.85mmol）を加え，混合液を４℃
で一晩攪拌する。次いでピリジンを25℃，減圧下で除去
し，残留物を1NHCl（5ml）に溶解させ，そしてAG-50Wイ
オン交換カラムにかける。水（10ml）で洗った後，生成
物を酢酸ナトリウム（0.1-2.0M）と食塩（0.1-2.0M）か
ら成るpH5のバッファーで溶出させる。生成物を含む分
画を集めて濃縮した後，残留物を水（10ml）に溶解さ
せ,Dowex-50W（バイオ−ラッド）イオン交換カラムにか
け，水（10ml）と0.5N HCl（5ml）で洗い，そして最終
的に生成物を6N HClで溶出させる。生成物の塩酸塩を，
減圧下での溶媒の除去により得る。
実施例35 ヘルペスシンプレックス，タイプＩおよびIIの検出用診
断試薬の調製 ヘルペスシンプレックスウイルス，タイプＩおよびII
の2gD遺伝子の位置462から477までの16−塩基配列５′
−GCGGGGCTGCGTTCGG−３′は選択された標的配列を含む
（Lasky＆Downbenko,DNA（1984）3:23）。交互のメチル
ホスフェートホスホジエステル結合から成る相補的試薬
ポリマーは，実質的には実施例23および実施例24の方法
に従い構築する。
ポリマーを５′−Ｏ−（６−アミノヘキシル）−オリ
ゴヌクレオチド類似物に交換し，そして従来のカップリ
ング方法により,Affi-Gel 10固体担体物質にアミノヘキ
シル スペーサー アームを介してカップリングさせ
る。
ポリマー／分析物デュプレックスの融解温度は,5′−
GCGGGGCTGCGTTCGG−３′の標的配列を持つ合成オリゴヌ
クレオチドを用いて決定する。この標的配列は，これは
購入するかもしくは従来法で構築するのだが，アニーリ
ングバッファー（10mM EDTA,100mMリン酸ナトリウム,pH
7.2）中で実質的に等モル量のポリマーと混合する（ポ
リマーが固体担体に付着する前に）。この溶液を90℃に
加熱し，そしてゆっくり室温まで冷やしてアニーリング
を行わせる。温度をその後ゆっくり上昇させ，そして吸
光度を温度の関数として記録する。融解温度（Tm）は，
全吸光度変化の半分となった点の温度とする。
実施例36 ヘルペスシンプレックスタイプＩおよびIIの検出 感染領域の皮膚の傷口として取った分析用試料を0.1m
lのEDTA−界面活性溶液（10mM EDTA,1％w/vドデシル硫
酸ナトリウム,pH7.0）に懸濁し，微量組織破砕器（Kont
es＃Ｋ−885470）で簡単にホモジナイズし，そしてその
ホモジネートをマイクロフィルター（VWR Scientific
＃28151-807）により遠心濾過する。4.5Mトリクロロ酢
酸ナトリウム0.5mlを加え,2,3秒以内に0.6mlエタノール
を加える。この調合液を氷浴中に30分間置き，それから
10,000gで５分間遠心分離する。上澄液を慎重にデカン
テーションして捨て，そして管を80％水性エタノールに
より緩やかに洗浄する。ペレットになった物質（しばし
ば見えない）を0.05mlのアニーリングバッファー（10mM
EDTA,100mMリン酸ナトリウム,pH7.2）に再懸濁し，実
施例21からの適量の診断試薬に加える（試薬ポリマー／
分析物のモル比は100を上まわると見積もられる）。ア
ニーリングは，ポリマー／標的のデュプレックスのTm
（実施例35に記載のようにしてあらかじめ決定してあ
る）より８℃低い温度で30分間行われ，次いで診断試薬
を2ml容量のアニーリングバッファーで３回洗う。この
洗浄は便宜上，マイクロフィルターにより遠心的に行わ
れる。洗浄後，診断試薬を,1mgのフルオレセント−ジ４
級アンモニウム リポーター（この合成は実施例34に記
載）を含むリポーター溶液0.2mlに懸濁する。リポータ
ー溶液は，上述のようにあらかじめ決定してある適当な
濃度のNaClだけを含む。診断試薬は次に，リポーターを
含まない結合溶液で2ml容量で３回洗う。最後に，リポ
ーターを2M NaCl 0.1mlで診断試薬から溶出させ，溶出
液を分光光度計により螢光を査定する。分析物を含まな
い対照試料からの螢光を引いて，初期試料中に存在する
分析物に比例した量的測定を得る。
実施例37 エイズウイルス検出用診断試薬の調製 エイズ関連レトロウイルス（ARV−２）のORF−２遺伝
子の位置8441-8456の16塩基配列５′−GATGGGGTGGGAGCA
G−３′は選択された標的配列を含有する（Sanchez-Pes
cador,et al,Science（1985）227:484）。カルバメート
に結合したサブユニットを持つ相補的ポリマーは，実質
的には実施例21に詳細に示した方法により構築される。
簡単に言えば,2′−デオキシリボヌクレオシドdA,dCお
よびdGを，実施例10のように保護する。これらの保護さ
れたヌクレオシドとチミジンを，次いで,5′−アミノ誘
導体に変換する。次に重合体の担体を，実施例25または
実施例26にあるように調製し，そしてサブユニットをこ
れら実施例に記載の方法によりこの担体に実質的に結合
して，担体……CTGCTCCCACCCCATC−３′の配列を持つ，
担体と結合した保護されたポリマーを得る。最終段階に
おいて塩基の保護基は除去され，所望のカルバメート結
合診断試薬が得られる。
ポリマー／分析物の融解温度は以下のように決定され
る。
RNA転写物を，標的配列に相補的な配列を含む一本鎖ポ
リヌクレオチドから調製する。この標的含有RNAをアニ
ーリングバッファー（10mM EDTA,100mMリン酸ナトリウ
ム,pH7.0）に懸濁し，そして上記の診断試薬に加える。
混合液を90℃まで温め，そしてゆっくり室温まで冷却し
て，アニーリングを行わせる。その後，診断試薬を小さ
い水ジャケットクロマトグラフィーカラムに置き，これ
を通してアニーリングバッファーがゆっくりとポンプ注
入される。遊離RNAの流出をモンヌーリングしている
間，温度をゆっくりと上昇させる。遊離温度（Tr）はRN
Aがカラムから溶出される温度である。このTr値は，実
施例21に記載の濃色シフト法により決定される対応Tm値
と１℃から数℃違うことがしばしばある。
実施例38 荷電されていない診断試薬を用いたシステムで使用され
る酵素的リポーターの調製 一つの末端に一級アミンを持つポリ陽イオン性テイル
は，実施例14-18に記載のように調製され，その構造は
以下の通りである： H2N(CH2)4 N(CH2)4 N(CH3)2 CH3 3 この生成物1mmolを，過剰の４−フルオロ−３−と，暗
所で室温にて24時間反応させる。
低光条件下で，溶媒を減圧下で除去し，そして固体を
ヘキサンで粉砕して未反応のフェニルアジドを除く。次
に固体を0.1M NaCl 10mlに懸濁し，そしてカコジル酸を
加えてpH7.2に低下させる。次に,5mgのアルカリ性ホス
ファターゼ（Sigma Chem Co.,＃P5778）を前述のテイル
溶液1mlに加え，そして高流量の366nm光を１時間照射さ
せる。得られたリポーターを多容量のバッファー（0.1M
NaCl,0.05Mコカジル酸ナトリウム,pH7.0）に対して18
時間透析して，酵素と結合しない陽イオン性テイルを除
く。ウシ血清アルブミン（１％w/v）とアジ化ナトリウ
ム（0.02％w/v）を加えて，このテトラ陽イオン性リポ
ーターの酵素部分を安定化させる。このリポーター溶液
の保存は暗所,4℃で行う。
実施例39 エイズウイルスの検出 エイズウイルスを含むと思われる血液5mlを遠心分離
し，そして無細胞血清2mlを,0.1mgポリアデニル酸（Sig
ma Chem Co.,＃P9403）を含む4.5Mトリクロロ酢酸ナト
リウム8mlに加える。2,3秒後,10mlのエタノールを加
え，そしてこの調合液を30分間氷浴中で冷やし，次いで
10,000gで５分間遠心分離する。上澄液を慎重にデカン
テーションして捨てる。ペレットになった核酸（しばし
ば見えない）を80％水性エタノールで洗浄し，よく排水
し，そして0.1mlのアニーリングバッファー（10mM EDT
A,100mMリン酸ナトリウム,pH7.2）に再懸濁する。これ
を，実施例37からの適当量の診断試薬に加える。（ポリ
マー／標的のモル比は100を上まわると見積もられ
る）。アニーリングは，ポリマー／標的のデュプレック
スのTr（実施例37のようにあらかじめ決定してある）よ
り７℃低い温度で１時間行われ，次いで診断試薬を2ml
容量のアニーリングバッファーで３回洗浄する。この洗
浄は便宜上，マイクロフィルターにより遠心的に行われ
る。
洗浄後，診断試薬を実施例38の調製された酵素的−テ
トラ陽イオン性リポーター溶液の0.2mlに懸濁する。30
秒後，診断試薬を，リポーターを含まない結合溶液2ml
容量で３回洗浄する。その後，診断試薬を展開液（15mM
p−ニトロフェニルホスフェート,0.5mM MgCl,1.0Mジエ
タノールアミン,pH9.8）に懸濁し,37℃で３時間保温す
る。リポーターにより生ずるｐ−ニトロフェノールを分
光光度計で定量する。分析物を欠く対照試料の対応吸光
度を引いて初期試料に存在する分析物に比例する量的測
定を供する。
本発明を特別な実施態様に関して述べたが，本発明か
らはずれることなく種々の変化や改変がなされうること
は正しく評価されよう。例えば，診断試薬は，多種の担
体結合ポリマーを含んでよく，ここで各種は，異なる分
析物からのポリヌクレオチド鎖中の異なる選択された標
的配列に結合するように設計されている。あるいは，診
断試薬は２種の担体結合ポリマーを含んでよく，ここで
各種は，デュプレックス分析物の異なる相補鎖に結合す
るように設計されている。これらの多量の試薬は,1つの
診断テストにおいて１つ以上の分析物の検出能を提供
し，また単一のデュプレックス分析物の検出感度を倍増
させる可能性をもたらす。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭60−36496（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−206766（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−227785（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−93355（ＪＰ，Ａ) Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａａｄｓ Ｒｅｓｅ ａｒｃｈ，Ｖ．12，Ｎｏ．８（1984) Ｐ．3435 Ｊｏｕｒ．ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ ｌ Ｃｈｅｍ．Ｖ．255，Ｎｏ．20 （1980）Ｐ．9659

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】選択された標的塩基配列を含む一本鎖ポリ
    ヌクレオチド分析物の検出に用いるための診断用試薬で
    あって、該試薬は、固体担体および該固体担体に付着し
    た多数のポリマー分子からなり、 該ポリマー分子は、選択された結合条件下で標的塩基配
    列を含む一本鎖ポリヌクレオチドに結合し；非単独重合
    体で分枝してなく；実質的に立体規則性であり；次の構
    造を有し： ここで、 （ａ） R1〜Rnは、該標的配列の対応内部配列塩基に、
    ワトソン／クリック対により結合するのに効果的なプリ
    ン、プリン類似、ピリミジンおよびピリミジン類似の複
    素環物から選択された認識部分であり、 （ｂ） ｎは、該ポリマー分子と該標的配列との間で形
    成されるワトソン／クリック水素結合の総数であり少な
    くとも約15であり、 （ｃ） Ｂは、主として実質的に非荷電でかつアキラル
    な連鎖により連結され得るバックボーン部分であり、 （ｄ） ユニットバックボーン長は５から７原子の範囲
    であり、そして該バックボーン部分が次の基から選択さ
    れる環状構造を有し： （ｅ） 該バックボーン部分は該認識部分と該標的配列
    の対応する内部配列塩基との間を水素結合させ得る位置
    に該認識部分を支持し；そして 該選択された条件下で該分析物のバックボーン電荷密度
    よりも実質的に小さいバックボーン電荷密度を有する、 診断用試薬。
  2. 【請求項２】請求の範囲第１項に記載の診断用試薬であ
    って、前記ポリマー分子の前記認識部分が以下の群から
    選択される、診断用試薬： ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素であ
    り、
  3. 【請求項３】請求の範囲第１項に記載の診断用試薬であ
    って、前記ポリマー分子のバックボーン部分Ｂが環状構
    造であり、そしてＢ〜Ｂが化学的に安定で、非荷電で、
    アキラル連鎖により優先的に連結された以下の構造の中
    の一つを有する、診断用試薬： ここでＹはＯ、Ｓ、そしてＥは である。
  4. 【請求項４】選択された標的塩基配列を含む一本鎖ポリ
    ヌクレオチド分析物の検出に用いるための診断用試薬で
    あって、該試薬は、固体担体、および該固体担体に付着
    した多数のポリマー分子を有し、 該ポリマー分子は、選択された結合条件下で標的塩基配
    列を含む一本鎖ポリヌクレオチドに結合し；非単独重合
    体で分枝してなく；実質的に立体規則性であり；次の構
    造を有し： ここで、 （ａ） R1〜Rnは、該標的配列の対応内部配列塩基に、
    ワトソン／クリック対により結合するのに効果的なプリ
    ン、プリン類似、ピリミジンおよびピリミジン類似の複
    素環物から選択された認識部分であり、 （ｂ） ｎは、該ポリマー分子と該標的配列との間で形
    成されるワトソン／クリック水素結合の総数であり少な
    くとも約15であり、 （ｃ） Ｂは、主として実質的に非荷電でかつアキラル
    な連鎖により連結され得るバックボーン部分であり、 （ｄ） ユニットバックボーン長は５から７原子の範囲
    であり、そして該バックボーン部分が次の環状構造を有
    し： （ｅ） 該バックボーン部分は該認識部分と該標的配列
    の対応する内部配列塩基との間を水素結合させ得る位置
    に該認識部分を支持し；そして 該選択された条件下で該分析物のバックボーン電荷密度
    よりも実質的に小さいバックボーン電荷密度を有する、 診断用試薬。
  5. 【請求項５】請求の範囲第４項に記載の診断用試薬であ
    って、前記ポリマー分子の前記認識部分が以下の群から
    選択される、診断用試薬： ここで、Ｘはフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素であ
    り、
JP61502179A 1985-03-15 1986-03-14 ポリヌクレオチド測定試薬と方法 Expired - Lifetime JP2528107B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US71239685A 1985-03-15 1985-03-15
US712396 1985-03-15

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP7220944A Division JP2670434B2 (ja) 1985-03-15 1995-08-29 ポリヌクレオチド測定試薬と方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS62502357A JPS62502357A (ja) 1987-09-10
JP2528107B2 true JP2528107B2 (ja) 1996-08-28

Family

ID=24861936

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP61502179A Expired - Lifetime JP2528107B2 (ja) 1985-03-15 1986-03-14 ポリヌクレオチド測定試薬と方法
JP61501967A Expired - Lifetime JP3022967B2 (ja) 1985-03-15 1986-03-14 立体規則性ポリヌクレオチド結合ポリマー
JP7220944A Expired - Lifetime JP2670434B2 (ja) 1985-03-15 1995-08-29 ポリヌクレオチド測定試薬と方法

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP61501967A Expired - Lifetime JP3022967B2 (ja) 1985-03-15 1986-03-14 立体規則性ポリヌクレオチド結合ポリマー
JP7220944A Expired - Lifetime JP2670434B2 (ja) 1985-03-15 1995-08-29 ポリヌクレオチド測定試薬と方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US5142047A (ja)
EP (3) EP0639582B1 (ja)
JP (3) JP2528107B2 (ja)
AT (3) ATE171185T1 (ja)
AU (2) AU5698186A (ja)
CA (1) CA1268404A (ja)
DE (3) DE3687030T2 (ja)
WO (2) WO1986005519A1 (ja)

Families Citing this family (425)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5185444A (en) * 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5521063A (en) * 1985-03-15 1996-05-28 Antivirals Inc. Polynucleotide reagent containing chiral subunits and methods of use
US5506337A (en) * 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US5235033A (en) * 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5470974A (en) * 1985-03-15 1995-11-28 Neu-Gene Development Group Uncharged polynucleotide-binding polymers
US5034506A (en) * 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5405938A (en) * 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5166315A (en) * 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
WO1988006633A1 (en) * 1987-03-02 1988-09-07 Arnold Lyle John Jr Polycationic supports for nucleic acid purification, separation and hybridization
US5599667A (en) * 1987-03-02 1997-02-04 Gen-Probe Incorporated Polycationic supports and nucleic acid purification separation and hybridization
IL86164A0 (en) * 1987-04-28 1988-11-15 Tamir Biotechnology Ltd Improved dna probes
CA1308516C (en) * 1987-07-06 1992-10-06 J. William Lown Oligopeptide anticancer and antiviral agents
EP0333832B1 (en) * 1987-09-22 1992-06-03 Temple University Artificial dna base pair analogues
US6054266A (en) * 1987-12-21 2000-04-25 Applied Biosystems, Inc. Nucleic acid detection with separation
FR2627590A1 (fr) * 1988-02-24 1989-08-25 Ire Celltarg Sa Sonde d'acides nucleiques comportant un nucleotide terminal modifie chimiquement en 5(prime) (oh) en vue de son marquage non radioactif et procedes de preparation
CA1337639C (en) * 1989-08-01 1995-11-28 Joseph Eugene Celebuski Dna probe assay using neutrally charged probe strands
AU658562B2 (en) 1989-10-24 1995-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2' modified oligonucleotides
US5378841A (en) * 1989-12-20 1995-01-03 Antivirals Inc. Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
CA2069869C (en) * 1989-12-20 1995-12-19 James E. Summerton Uncharged morpholino-based polymers having phosphorous-containing chiral intersubunit linkages
US6011020A (en) * 1990-06-11 2000-01-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US6465188B1 (en) * 1990-06-11 2002-10-15 Gilead Sciences, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US6121433A (en) * 1990-07-27 2000-09-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds having nitrogen-containing linkages
US5783682A (en) * 1990-07-27 1998-07-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide mimics having nitrogen-containing linkages
US5618704A (en) * 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5610289A (en) * 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
DE69126530T2 (de) * 1990-07-27 1998-02-05 Isis Pharmaceutical, Inc., Carlsbad, Calif. Nuklease resistente, pyrimidin modifizierte oligonukleotide, die die gen-expression detektieren und modulieren
US5596086A (en) * 1990-09-20 1997-01-21 Gilead Sciences, Inc. Modified internucleoside linkages having one nitrogen and two carbon atoms
US5175266A (en) * 1991-04-19 1992-12-29 Triplex Pharmaceutical Corporation Nucleosides and oligonucleosides with a phosphate-free internucleoside backbone and process for preparing the same
DK51092D0 (da) 1991-05-24 1992-04-15 Ole Buchardt Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf
US6414112B1 (en) 1991-05-24 2002-07-02 Ole Buchardt Peptide nucleic acids having 2,6-diaminopurine nucleobases
US6713602B1 (en) * 1991-05-24 2004-03-30 Ole Buchardt Synthetic procedures for peptide nucleic acids
US5714331A (en) * 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US6228982B1 (en) * 1992-05-22 2001-05-08 Benget Norden Double-stranded peptide nucleic acids
US6451968B1 (en) * 1991-05-24 2002-09-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acids
US5719262A (en) * 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5766855A (en) * 1991-05-24 1998-06-16 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity and sequence specificity
US6441130B1 (en) 1991-05-24 2002-08-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Linked peptide nucleic acids
US5539082A (en) * 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US7223833B1 (en) * 1991-05-24 2007-05-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid conjugates
US5877160A (en) * 1991-05-31 1999-03-02 Genta Incorporated Compositions and methods of treatment of androgen-associated baldness using antisense oligomers
EP0616612A4 (en) 1991-12-12 1995-01-11 Gilead Sciences Inc NUCLEASE-STABLE OLIGOMERS SUITABLE FOR BINDING AND METHODS OF USE.
US5792608A (en) * 1991-12-12 1998-08-11 Gilead Sciences, Inc. Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use
US5359044A (en) * 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
MX9207334A (es) * 1991-12-18 1993-08-01 Glaxo Inc Acidos nucleicos peptidicos y formulacion farma- ceutica que los contiene
US6277603B1 (en) 1991-12-24 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
EP0618925B2 (en) * 1991-12-24 2012-04-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotides
US5700922A (en) * 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US6521601B1 (en) * 1992-04-14 2003-02-18 Signal Pharmaceuticals, Inc. Method and composition for inhibition of viral replication
US5428148A (en) * 1992-04-24 1995-06-27 Beckman Instruments, Inc. N4 - acylated cytidinyl compounds useful in oligonucleotide synthesis
US6770738B1 (en) * 1992-05-22 2004-08-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Higher order structure and binding of peptide nucleic acids
US5817781A (en) 1992-06-01 1998-10-06 Gilead Sciences, Inc. Modified internucleoside linkages (II)
US5434257A (en) * 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
EP1258492A1 (en) * 1992-09-24 2002-11-20 Chiron Corporation N-substituted oligomers and methods for their synthesis, e.g. polyglycine bearing nucleic acid bases
JPH08508491A (ja) * 1993-03-31 1996-09-10 スターリング ウインスロップ インコーポレイティド ホスホジエステル結合をアミド結合に置き換えたオリゴヌクレオチド
US7825215B1 (en) * 1993-04-26 2010-11-02 Peter E. Nielsen Substituted nucleic acid mimics
DE4331011A1 (de) * 1993-09-13 1995-03-16 Bayer Ag Nukleinsäuren-bindende Oligomere mit C-Verzweigung für Therapie und Diagnostik
DE4331012A1 (de) * 1993-09-13 1995-03-16 Bayer Ag Nukleinsäuren-bindende Oligomere mit N-Verzweigung für Therapie und Diagnostik
US7375198B2 (en) 1993-10-26 2008-05-20 Affymetrix, Inc. Modified nucleic acid probes
US6156501A (en) * 1993-10-26 2000-12-05 Affymetrix, Inc. Arrays of modified nucleic acid probes and methods of use
US6710164B1 (en) 1993-11-22 2004-03-23 Peter E. Nielsen Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US6133444A (en) * 1993-12-22 2000-10-17 Perseptive Biosystems, Inc. Synthons for the synthesis and deprotection of peptide nucleic acids under mild conditions
US5705333A (en) * 1994-08-05 1998-01-06 The Regents Of The University Of California Peptide-based nucleic acid mimics(PENAMS)
DE4427980A1 (de) * 1994-08-08 1996-02-15 Bayer Ag Nukleinsäuren-bindende Oligomere für Therapie und Diagnostik
US5552471A (en) * 1994-08-17 1996-09-03 The Perkin-Elmer Corporation Solid support reagents for the synthesis of 3'-Nitrogen containing polynucleotides
US6045995A (en) * 1994-08-24 2000-04-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Capillary electrophoretic detection of nucleic acids
ATE222589T1 (de) * 1994-10-06 2002-09-15 Isis Pharmaceuticals Inc Peptid-nukleinsäure-konjugate
UA48150C2 (uk) * 1994-11-02 2002-08-15 Ай-Сі-Ен Фармасьютикалз Похідні амінокислот або аміноспиртів, олігонуклеотид
EP0817787A4 (en) 1995-03-27 2000-09-13 Isis Pharmaceuticals Inc NITROGEN MACROCYCLIC COMPOUNDS
US8071737B2 (en) * 1995-05-04 2011-12-06 Glead Sciences, Inc. Nucleic acid ligand complexes
DE69632324T2 (de) * 1995-06-07 2005-06-16 PerSeptive Biosystems, Inc., Framingham Pna-dna-chimäre und pna-synthone zu deren herstellung
WO1996040726A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Genta Incorporated Novel carbamate-based cationic lipids
JPH11506605A (ja) * 1995-06-07 1999-06-15 アボツト・ラボラトリーズ 増幅反応におけるバックグラウンドを減少させるためにプローブをマスキングする方法
ATE362546T1 (de) 1995-10-12 2007-06-15 Lansdorp Peter M Verfahren zum nachweis von mehrfachkopien einer wiederholungssequenz in einem nukleinsäuremolekül
JP3346976B2 (ja) * 1996-03-18 2002-11-18 理化学研究所 完全長ｃＤＮＡライブラリーの作成方法
US9096636B2 (en) 1996-06-06 2015-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US7812149B2 (en) 1996-06-06 2010-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US20040161777A1 (en) * 1996-06-06 2004-08-19 Baker Brenda F. Modified oligonucleotides for use in RNA interference
US5898031A (en) * 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US20050032068A1 (en) * 2002-11-05 2005-02-10 Prakash Thazha P. Sugar and backbone-surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
US20040266706A1 (en) * 2002-11-05 2004-12-30 Muthiah Manoharan Cross-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation
EP0960121B1 (en) * 1996-07-24 2005-11-30 BUCHARDT, Dorte Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5919638A (en) * 1996-10-08 1999-07-06 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting prostate tumors
US5908845A (en) * 1996-10-30 1999-06-01 Segev; David Polyether nucleic acids
US20030165971A1 (en) * 1996-10-31 2003-09-04 Billing-Medel Patricia A. Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast
US20050202499A1 (en) 1996-10-31 2005-09-15 Billing-Medel Patricia A. Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast
US20050153373A1 (en) * 1996-10-31 2005-07-14 Billing-Medel Patricia A. Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast
US6060246A (en) * 1996-11-15 2000-05-09 Avi Biopharma, Inc. Reagent and method for isolation and detection of selected nucleic acid sequences
US6127533A (en) * 1997-02-14 2000-10-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-aminooxy-modified oligonucleotides
US6172209B1 (en) 1997-02-14 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same
US6576752B1 (en) 1997-02-14 2003-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy functionalized oligomers
US6251591B1 (en) 1997-02-27 2001-06-26 Lorne Park Research, Inc. Quantitative method for detecting nucleotide concentration
US6046004A (en) * 1997-02-27 2000-04-04 Lorne Park Research, Inc. Solution hybridization of nucleic acids with antisense probes having modified backbones
US20020137904A1 (en) * 1998-03-27 2002-09-26 Patricia A. Billing-Medel Reagents and methods useful for detecting diseases of the gastrointestinal tract
US20050208567A1 (en) * 1997-04-25 2005-09-22 Billing-Medel Patricia A Reagents and methods useful for detecting diseases of the prostate
US5962665A (en) 1997-06-16 1999-10-05 Abbott Laboratories Nucleic acid primers and probes for detecting HIV-1 and HIV-2
JP4313861B2 (ja) 1997-08-01 2009-08-12 キヤノン株式会社 プローブアレイの製造方法
WO1999011820A1 (en) * 1997-09-02 1999-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the identification and quantitation of deletion sequence oligonucleotides in synthetic oligonucleotide preparations
US6300318B1 (en) * 1997-09-16 2001-10-09 Peter E. Nielsen Antibacterial and antibiotic methods using peptide nucleic acids and pharmaceutical compositions therefor
US6989270B1 (en) 1997-10-17 2006-01-24 Mayo Foundation For Medical Education And Research Using polyamide nucleic acid oligomers to engender a biological response
US6723560B2 (en) * 1998-10-08 2004-04-20 Mayo Foundation For Medical Education And Research Using polyamide nucleic acid oligomers to engender a biological response
US6472209B1 (en) 1997-10-17 2002-10-29 Mayo Foundation For Medical Education And Research Using polyamide nucleic acid oligomers to engender a biological response
US6326479B1 (en) 1998-01-27 2001-12-04 Boston Probes, Inc. Synthetic polymers and methods, kits or compositions for modulating the solubility of same
US6255050B1 (en) 1998-05-22 2001-07-03 Lorne Park Research, Inc. Dynamic hybridization system
JP2002520008A (ja) 1998-07-09 2002-07-09 バイオセプト インコーポレイテッド Ｄｎａ配列ハイブリッド形成を最適化するための改良されたペプチド核酸汎用ライブラリーの使用法
US6867294B1 (en) 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
US6043352A (en) 1998-08-07 2000-03-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides
US6673912B1 (en) 1998-08-07 2004-01-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2′-O-aminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides
US6175004B1 (en) * 1998-09-01 2001-01-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for the synthesis of oligonucleotides incorporating 2-aminoadenosine
US7935805B1 (en) 1998-12-31 2011-05-03 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
US6720139B1 (en) 1999-01-27 2004-04-13 Elitra Pharmaceuticals, Inc. Genes identified as required for proliferation in Escherichia coli
EP1173561A2 (en) * 1999-01-29 2002-01-23 Avi Biopharma, Inc. Non-invasive method for detecting target rna
AU4366000A (en) 1999-04-14 2000-11-14 Chiron Corporation Compositions and methods for generating an immune response utilizing alphavirus-based vector systems
US6348583B1 (en) * 1999-08-30 2002-02-19 Bio-Rad Laboratories, Inc. Poly(ether-thioether), poly(ether-sulfoxide) and poly(ether-sulfone) nucleic acids
US6589738B1 (en) 1999-11-09 2003-07-08 Elitra Pharmaceuticals, Inc. Genes essential for microbial proliferation and antisense thereto
JP2003518386A (ja) * 1999-12-23 2003-06-10 エリトラ ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 大腸菌の増殖に必要であることが同定された遺伝子
AU2001233114A1 (en) * 2000-02-04 2001-08-14 Aeomica, Inc. Methods and apparatus for predicting, confirming, and displaying functional information derived from genomic sequence
US6593092B2 (en) 2000-04-04 2003-07-15 Abbott Laboratories Beta 2 adrenergic polymorphism detection
US7211381B1 (en) 2000-04-04 2007-05-01 Abbott Laboratories β2 andrenergic polymorphism detection
US6784291B2 (en) 2000-05-04 2004-08-31 Avi Biopharma, Inc. Splice-region antisense composition and method
AU2001271873A1 (en) 2000-07-06 2002-01-21 Avi Biopharma, Inc. Transforming growth factor beta (TGF-beta) blocking agent-treated stem cell composition and method
US6867349B2 (en) * 2000-07-31 2005-03-15 Regents Of The University Of Minnesota Inhibition of gene expression using polynucleotide analogues
US8071740B2 (en) 2000-11-17 2011-12-06 Vascular Biogenics Ltd. Promoters exhibiting endothelial cell specificity and methods of using same for regulation of angiogenesis
US6838452B2 (en) 2000-11-24 2005-01-04 Vascular Biogenics Ltd. Methods employing and compositions containing defined oxidized phospholipids for prevention and treatment of atherosclerosis
WO2002061110A2 (en) 2001-01-29 2002-08-08 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleic acid derivatives
EP1372741B1 (en) * 2001-03-30 2006-08-09 University of Massachusetts Morpholino imaging and therapy
JP2004528847A (ja) * 2001-04-24 2004-09-24 ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー 精神分裂症の一塩基多型診断
EP1925672A1 (en) 2001-06-22 2008-05-28 Syngeta Participations AG Abiotic stress responsive polynucleotides and polypeptides
AU2002320314A1 (en) 2001-07-05 2003-01-21 Chiron, Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
US20030198621A1 (en) 2001-07-05 2003-10-23 Megede Jan Zur Polynucleotides encoding antigenic HIV type B and/or type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
EP1423536A2 (en) * 2001-08-28 2004-06-02 PHARMACIA & UPJOHN COMPANY Single nucleotide polymorphisms diagnostic for schizophrenia
US20040115699A1 (en) * 2001-08-28 2004-06-17 Kaytes Paul S. Single nucleotide polymorphisms diagnostic for schizophrenia
US6852491B2 (en) 2001-09-04 2005-02-08 Abbott Laboratories Amplification and detection reagents for HIV-1
US20030224353A1 (en) * 2001-10-16 2003-12-04 Stein David A. Antisense antiviral agent and method for treating ssRNA viral infection
CN100506284C (zh) 2001-10-19 2009-07-01 脉管生物生长有限公司 多核苷酸构建体、药物组合物以及靶向的下调血管生成和抗癌的治疗方法
US20040029129A1 (en) * 2001-10-25 2004-02-12 Liangsu Wang Identification of essential genes in microorganisms
AU2002343604C1 (en) 2001-10-30 2009-09-17 Conforma Therapeutics Corporation Purine analogs having HSP90-inhibiting activity
WO2003042226A2 (en) * 2001-11-09 2003-05-22 Pharmacia & Upjohn Company Single nucleotide polymorphisms in gh-1
US20030170694A1 (en) * 2001-12-21 2003-09-11 Daniel Wall Stabilized nucleic acids in gene and drug discovery and methods of use
US20050037962A1 (en) * 2002-01-18 2005-02-17 Ekker Stephen C. Syndecans and angiogenesis
AU2003209054A1 (en) * 2002-02-07 2003-09-02 Discovery Genomics, Inc. Factors for angiogenesis, vasculogenesis, cartilage formation, bone formation and methods of use thereof
US20040038303A1 (en) * 2002-04-08 2004-02-26 Unger Gretchen M. Biologic modulations with nanoparticles
US7026120B2 (en) 2002-04-15 2006-04-11 Abbott Laboratories Probes for detecting tumor cells
US7015317B2 (en) * 2002-05-02 2006-03-21 Abbott Laboratories Polynucleotides for the detection and quantification of hepatitis B virus nucleic acids
US20040249130A1 (en) * 2002-06-18 2004-12-09 Martin Stanton Aptamer-toxin molecules and methods for using same
JP2005533794A (ja) * 2002-06-18 2005-11-10 アーケミックス コーポレイション アプタマー−毒素分子およびこれを使用する方法
US9150606B2 (en) 2002-11-05 2015-10-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2'-modified nucleosides for use in gene modulation
US9150605B2 (en) 2002-11-05 2015-10-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2′-modified nucleosides for use in gene modulation
WO2004041889A2 (en) 2002-11-05 2004-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
WO2004044139A2 (en) 2002-11-05 2004-05-27 Isis Parmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides for use in rna interference
US7807802B2 (en) 2002-11-12 2010-10-05 Abbott Lab Polynucleotides for the amplification and detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae
US8853376B2 (en) 2002-11-21 2014-10-07 Archemix Llc Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics
AU2003299441A1 (en) * 2002-12-19 2004-07-14 Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs Nf-hev compositions and methods of use
US7002006B2 (en) 2003-02-12 2006-02-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Protection of nucleosides
EP2216407B1 (en) 2003-03-07 2016-01-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic compositions
CA2522637C (en) 2003-04-17 2014-01-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified irna agents
CA2523831C (en) 2003-04-29 2008-11-18 Pfizer Inc. 5,7-diaminopyrazolo[4,3-d]pyrimidines useful in the treatment of hypertension
EP1629105B1 (en) 2003-04-29 2010-09-01 AVI BioPharma, Inc. Compositions for enhancing transport and antisense efficacy of nucleic acid analog into cells
US20050026189A1 (en) * 2003-05-29 2005-02-03 Liangsu Wang Microbial operons
US7276599B2 (en) 2003-06-02 2007-10-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide synthesis with alternative solvents
AU2004263124B2 (en) * 2003-08-07 2009-01-15 Avi Biopharma, Inc. Sense antiviral compound and method for treating ssRNA viral infection
AU2004273828A1 (en) * 2003-09-12 2005-03-31 Avi Biopharma, Inc. Compound and method for treating androgen-independent prostate cancer
US7138401B2 (en) 2003-09-18 2006-11-21 Conforma Therapeutics Corporation 2-aminopurine analogs having HSP90-inhibiting activity
US7125945B2 (en) 2003-09-19 2006-10-24 Varian, Inc. Functionalized polymer for oligonucleotide purification
US20050222068A1 (en) * 2003-10-23 2005-10-06 Mourich Dan V Method and antisense composition for selective inhibition of HIV infection in hematopoietic cells
US7572799B2 (en) 2003-11-24 2009-08-11 Pfizer Inc Pyrazolo[4,3-d]pyrimidines as Phosphodiesterase Inhibitors
ES2711313T3 (es) 2003-12-26 2019-05-03 Masatoshi Hagiwara Método de regulación de la fosforilación de la proteína SR y agentes antivirales que comprenden el regulador de la actividad de la proteína SR como ingrediente activo
CN1910289B (zh) 2004-01-07 2012-05-23 日立化成研究中心公司 用于检测hiv的引物和探针
US20050234002A1 (en) * 2004-01-23 2005-10-20 Mourich Dan V Antisense oligomers and methods for inducing immune tolerance and immunosuppression
US8569474B2 (en) 2004-03-09 2013-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand
DK1742950T3 (da) 2004-04-07 2009-03-16 Pfizer Ltd Pyrazolo-[4,3-D]-pyrimidiner
WO2005121372A2 (en) * 2004-06-03 2005-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double strand compositions comprising differentially modified strands for use in gene modulation
US8394947B2 (en) 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
USRE48960E1 (en) 2004-06-28 2022-03-08 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
EP1766010B1 (en) 2004-06-28 2011-02-16 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
ATE510914T1 (de) 2004-07-02 2011-06-15 Avi Biopharma Inc Antisinn antibakterielle verfahren und verbindungen
US7729761B2 (en) 2004-07-14 2010-06-01 Cardiac Pacemakers, Inc. Method and apparatus for controlled gene or protein delivery
EP1791567B1 (en) 2004-08-10 2015-07-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Chemically modified oligonucleotides
WO2006023880A2 (en) 2004-08-23 2006-03-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for the characterization of oligonucleotides
WO2006025154A1 (ja) * 2004-08-30 2006-03-09 Gifu University 修飾オリゴヌクレオチド
US7884086B2 (en) 2004-09-08 2011-02-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays
US8129352B2 (en) * 2004-09-16 2012-03-06 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating ssRNA viral infection
US8357664B2 (en) 2004-10-26 2013-01-22 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating influenza viral infection
US7524829B2 (en) * 2004-11-01 2009-04-28 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compounds and methods for treating a filovirus infection
EP1814583A2 (en) 2004-11-01 2007-08-08 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Combination approaches for generating immune responses
WO2006048262A2 (en) * 2004-11-04 2006-05-11 Roche Diagnostics Gmbh Classification of acute myeloid leukemia
ES2852549T3 (es) 2005-02-09 2021-09-13 Sarepta Therapeutics Inc Composición antisentido para tratamiento de la atrofia muscular
CA2602257A1 (en) 2005-03-30 2006-10-05 Conforma Therapeutics Corporation Alkynyl pyrrolopyrimidines and related analogs as hsp90-inhibitors
US20060240032A1 (en) * 2005-03-31 2006-10-26 Hinrichs David J Immunomodulating compositions and methods for use in the treatment of human autoimmune diseases
EP1888780A4 (en) * 2005-05-06 2009-11-11 Applera Corp MULTIPLE CAPILLARY DEVICE AND METHOD FOR SYNTHESIS AND DELIVERY
US7790694B2 (en) * 2005-07-13 2010-09-07 Avi Biopharma Inc. Antisense antibacterial method and compound
US8067571B2 (en) 2005-07-13 2011-11-29 Avi Biopharma, Inc. Antibacterial antisense oligonucleotide and method
CA2614191C (en) 2005-07-13 2015-06-30 Avi Biopharma, Inc. Antisense antibacterial method and compound
WO2007014348A2 (en) * 2005-07-29 2007-02-01 North Carolina University Photocrosslinking probes and uses of the same
EP1915461B1 (en) 2005-08-17 2018-08-01 Dx4U GmbH Composition and method for determination of ck19 expression
EP1937278B1 (en) * 2005-09-08 2012-07-25 AVI BioPharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating picornavirus infection
WO2007030691A2 (en) * 2005-09-08 2007-03-15 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating picornavirus infection
US8906609B1 (en) 2005-09-26 2014-12-09 Arrowhead Center, Inc. Label-free biomolecule sensor based on surface charge modulated ionic conductance
EP2357000A1 (en) 2005-10-18 2011-08-17 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Mucosal and systemic immunizations with alphavirus replicon particles
US8501704B2 (en) * 2005-11-08 2013-08-06 Sarepta Therapeutics, Inc. Immunosuppression compound and treatment method
US7582615B2 (en) * 2006-03-07 2009-09-01 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating arenavirus infection
RU2394915C2 (ru) * 2006-03-24 2010-07-20 Александр Борисович Четверин Бесконтактные способы обнаружения молекулярных колоний, наборы реагентов и устройство для их осуществления
US8785407B2 (en) * 2006-05-10 2014-07-22 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense antiviral agent and method for treating ssRNA viral infection
HUE035799T2 (en) * 2006-05-10 2018-05-28 Sarepta Therapeutics Inc Cationic oligonucleotide analogues containing subunits
US20070265215A1 (en) * 2006-05-11 2007-11-15 Iversen Patrick L Antisense restenosis composition and method
US7592009B2 (en) * 2006-10-10 2009-09-22 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Polypeptide ligands for targeting cartilage and methods of use thereof
US7884194B2 (en) * 2007-06-06 2011-02-08 Avi Biopharma Inc. Soluble HER2 and HER3 splice variant proteins, splice-switching oligonucleotides, and their use in the treatment of disease
WO2009005793A2 (en) 2007-06-29 2009-01-08 Avi Biopharma, Inc. Tissue specific peptide conjugates and methods
CA2930393C (en) 2007-12-04 2022-11-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides
US7989608B2 (en) * 2007-12-28 2011-08-02 Avi Biopharma Inc. Immunomodulatory agents and methods of use
EP3604533A1 (en) 2008-04-11 2020-02-05 Arbutus Biopharma Corporation Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
AU2009298802A1 (en) 2008-09-23 2010-04-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chemical modifications of monomers and oligonucleotides with cycloaddition
KR20180118828A (ko) 2008-10-24 2018-10-31 사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 Dmd를 위한 다중 엑손 스키핑 조성물
EP3757090B1 (en) 2008-11-10 2024-06-12 Arbutus Biopharma Corporation Novel lipids and compositions for the delivery of therapeutics
AU2009335740B2 (en) 2008-12-17 2016-04-21 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense compositions and methods for modulating contact hypersensitivity or contact dermatitis
US8975389B2 (en) 2009-03-02 2015-03-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid chemical modifications
JP5548852B2 (ja) * 2009-05-29 2014-07-16 国立大学法人東京農工大学 疎水性基結合ヌクレオシド、疎水性基結合ヌクレオシド溶液、及び疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法
WO2010141511A2 (en) 2009-06-01 2010-12-09 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. Polynucleotides for multivalent rna interference, compositions and methods of use thereof
SG10201912450XA (en) 2009-06-10 2020-03-30 Arbutus Biopharma Corp Improved lipid formulation
DK2462230T3 (en) * 2009-08-03 2015-10-19 Recombinetics Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETED RE-MODIFICATION
CA2780741C (en) 2009-10-12 2023-04-04 Smith Holdings, Llc Methods and compositions for modulating gene expression using oligonucleotide based drugs administered in vivo or in vitro
EP3431603A1 (en) 2009-11-12 2019-01-23 The University Of Western Australia Antisense molecules and methods for treating pathologies
CA2779830C (en) 2009-11-13 2020-07-21 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating influenza viral infection
AU2010328336B2 (en) 2009-12-07 2017-03-02 Arbutus Biopharma Corporation Compositions for nucleic acid delivery
CA2784568A1 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Martin A. Maier Lipid particles for delivery of nucleic acids
US9198972B2 (en) 2010-01-28 2015-12-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Monomers and oligonucleotides comprising cycloaddition adduct(s)
WO2011094580A2 (en) 2010-01-28 2011-08-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chelated copper for use in the preparation of conjugated oligonucleotides
EP2547328B1 (en) * 2010-02-11 2017-06-07 Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL) Ccr7 ligand delivery and co-delivery in immunotherapy
WO2011112516A1 (en) 2010-03-08 2011-09-15 Ico Therapeutics Inc. Treating and preventing hepatitis c virus infection using c-raf kinase antisense oligonucleotides
EP2545173A2 (en) 2010-03-12 2013-01-16 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense modulation of nuclear hormone receptors
US9102938B2 (en) 2010-04-01 2015-08-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 2′ and 5′ modified monomers and oligonucleotides
US9597326B2 (en) 2010-04-13 2017-03-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa Benzonapthyridine compositions and uses thereof
WO2011133876A2 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising acyclic and abasic nucleosides and analogs
US9725479B2 (en) 2010-04-22 2017-08-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc. 5′-end derivatives
US20130260460A1 (en) 2010-04-22 2013-10-03 Isis Pharmaceuticals Inc Conformationally restricted dinucleotide monomers and oligonucleotides
AU2011248625B2 (en) 2010-04-26 2017-01-05 Pangu Biopharma Limited Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of cysteinyl-tRNA synthetase
WO2011139799A2 (en) 2010-04-27 2011-11-10 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of isoleucyl trna synthetases
EP2563911B1 (en) 2010-04-28 2021-07-21 aTyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of alanyl trna synthetases
JP5991963B2 (ja) 2010-04-29 2016-09-14 エータイアー ファーマ， インコーポレイテッド バリルｔＲＮＡ合成酵素のタンパク質フラグメントに関連した治療用、診断用および抗体組成物の革新的発見
AU2011248490B2 (en) 2010-04-29 2016-11-10 Pangu Biopharma Limited Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of Asparaginyl tRNA synthetases
AU2011248355B2 (en) 2010-05-03 2017-01-19 Pangu Biopharma Limited Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of Arginyl-tRNA synthetases
JP6008841B2 (ja) 2010-05-03 2016-10-19 エータイアー ファーマ， インコーポレイテッド メチオニルｔＲＮＡ合成酵素のタンパク質フラグメントに関連した治療用、診断用および抗体組成物の革新的発見
WO2011140132A2 (en) 2010-05-03 2011-11-10 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of phenylalanyl-alpha-trna synthetases
WO2011140267A2 (en) 2010-05-04 2011-11-10 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of p38 multi-trna synthetase complex
WO2011143608A1 (en) 2010-05-13 2011-11-17 Avi Biopharma, Inc. Antisense modulation of interleukins 17 and 23 signaling
US9050373B2 (en) 2010-05-13 2015-06-09 The Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority Pharmaceutical compositions comprising antisense oligonucleotides and methods of using same
CA2799197C (en) 2010-05-14 2019-10-29 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of phenylalanyl-beta-trna synthetases
WO2011146410A2 (en) 2010-05-17 2011-11-24 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of leucyl-trna synthetases
JP6046607B2 (ja) 2010-05-27 2016-12-21 エータイアー ファーマ， インコーポレイテッド グルタミニルｔＲＮＡ合成酵素のタンパク質フラグメントに関連した治療用、診断用および抗体組成物の革新的発見
CN107353317A (zh) 2010-05-28 2017-11-17 萨勒普塔医疗公司 具有修饰的亚基间键和/或端基的寡核苷酸类似物
KR20130121699A (ko) 2010-05-28 2013-11-06 테트리스 온라인, 인코포레이티드 상호작용 혼성 비동기 컴퓨터 게임 기반구조
US9192661B2 (en) 2010-07-06 2015-11-24 Novartis Ag Delivery of self-replicating RNA using biodegradable polymer particles
AU2011289831C1 (en) 2010-07-12 2017-06-15 Pangu Biopharma Limited Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of glycyl-tRNA synthetases
US20130323269A1 (en) 2010-07-30 2013-12-05 Muthiah Manoharan Methods and compositions for delivery of active agents
US20130202652A1 (en) 2010-07-30 2013-08-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
US8198429B2 (en) 2010-08-09 2012-06-12 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compounds and methods for treating a filovirus infection
CA2808539C (en) 2010-08-25 2021-05-25 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of tyrosyl-trna synthetases
WO2012031243A2 (en) 2010-09-03 2012-03-08 Avi Biopharma, Inc. dsRNA MOLECULES COMPRISING OLIGONUCLEOTIDE ANALOGS HAVING MODIFIED INTERSUBUNIT LINKAGES AND/OR TERMINAL GROUPS
EP2638161A1 (en) 2010-11-12 2013-09-18 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense antibacterial compounds and methods
US9999673B2 (en) 2011-01-11 2018-06-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. PEGylated lipids and their use for drug delivery
EP2672977A1 (en) 2011-02-08 2013-12-18 The Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority d/b/a Carolina Healthcare System Antisense oligonucleotides
US9528124B2 (en) 2013-08-27 2016-12-27 Recombinetics, Inc. Efficient non-meiotic allele introgression
US10920242B2 (en) 2011-02-25 2021-02-16 Recombinetics, Inc. Non-meiotic allele introgression
WO2012150960A1 (en) 2011-05-05 2012-11-08 Avi Biopharma, Inc. Peptide oligonucleotide conjugates
US20140227293A1 (en) 2011-06-30 2014-08-14 Trustees Of Boston University Method for controlling tumor growth, angiogenesis and metastasis using immunoglobulin containing and proline rich receptor-1 (igpr-1)
WO2013006842A2 (en) 2011-07-06 2013-01-10 Novartis Ag Immunogenic compositions and uses thereof
EP2729165B1 (en) 2011-07-06 2017-11-08 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunogenic combination compositions and uses thereof
US10100305B2 (en) 2011-07-15 2018-10-16 Sarepta Therapeutics, Inc. Methods and compositions for manipulating translation of protein isoforms from alternative initiation of start sites
WO2013044116A1 (en) 2011-09-21 2013-03-28 Yale University Antimicrobial compositions and methods of use thereof
WO2013049328A1 (en) 2011-09-27 2013-04-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Di-aliphatic substituted pegylated lipids
US20130085139A1 (en) 2011-10-04 2013-04-04 Royal Holloway And Bedford New College Oligomers
JP2015500204A (ja) 2011-11-18 2015-01-05 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド 機能的に修飾されたオリゴヌクレオチドおよびそのサブユニット
US10066228B2 (en) 2011-11-30 2018-09-04 Sarepta Therapeutics, Inc. Oligonucleotides for treating expanded repeat diseases
AU2012345638C1 (en) 2011-11-30 2018-10-18 Sarepta Therapeutics, Inc. Induced exon inclusion in spinal muscle atrophy
WO2013082529A1 (en) 2011-12-02 2013-06-06 Yale University Enzymatic synthesis of poly(amine-co-esters) and methods of use thereof for gene delivery
US9895451B2 (en) 2011-12-02 2018-02-20 Yale University Formulations for targeted release of agents to low pH tissue environments or cellular compartments and methods of use thereof
US10465042B2 (en) 2011-12-02 2019-11-05 Yale University Poly(amine-co-ester) nanoparticles and methods of use thereof
PL2788487T3 (pl) 2011-12-08 2018-10-31 Sarepta Therapeutics, Inc. Analogi oligonukleotydów ukierunkowane na ludzki LMNA
ES2706198T3 (es) 2012-03-20 2019-03-27 Sarepta Therapeutics Inc Conjugados de ácido borónico de análogos de oligonucleótidos
WO2013151771A1 (en) 2012-04-05 2013-10-10 Massachusetts Institute Of Technology Immunostimulatory compositions and methods of use thereof
EP2869842A1 (en) 2012-07-06 2015-05-13 Novartis AG Immunogenic compositions and uses thereof
US10111962B2 (en) 2012-09-25 2018-10-30 Genzyme Corporation Peptide-linked morpholino antisense oligonucleotides for treatment of myotonic dystrophy
EA201591178A1 (ru) 2012-12-20 2015-11-30 Сарепта Терапьютикс, Инк. Улучшенные композиции для пропускания экзона для лечения мышечной дистрофии
EP2946013A1 (en) 2013-01-16 2015-11-25 Iowa State University Research Foundation, Inc. A deep intronic target for splicing correction on spinal muscular atrophy gene
EP2968504B1 (en) 2013-03-12 2019-12-18 University Of Utah Research Foundation Compositions and methods for inducing apoptosis
CN110066793A (zh) 2013-03-14 2019-07-30 萨勒普塔医疗公司 用于治疗肌肉萎缩的外显子跳跃组合物
KR20230116945A (ko) 2013-03-14 2023-08-04 사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 근육 이영양증의 치료를 위한 엑손 스키핑 조성물
BR112015022998A2 (pt) 2013-03-15 2017-11-14 Sarepta Therapeutics Inc composições melhoradas para o tratamento de distrofia muscular
WO2014160871A2 (en) 2013-03-27 2014-10-02 The General Hospital Corporation Methods and agents for treating alzheimer's disease
IL300444A (en) 2013-09-05 2023-04-01 Sarepta Therapeutics Inc Inclusion of exon 2 is induced by antisense in acid alpha-glucosidase
EP3480312A1 (en) 2013-09-11 2019-05-08 Synthena AG Nucleic acids and methods for the treatment of pompe disease
IL312865B2 (en) 2013-09-11 2025-06-01 Eagle Biologics Inc Liquid protein formulations containing viscosity-lowering agents
EP3052512A4 (en) 2013-09-30 2017-02-22 Geron Corporation Phosphorodiamidate backbone linkage for oligonucleotides
EP3060682B1 (en) 2013-10-25 2023-08-30 Livestock Improvement Corporation Limited Genetic markers and uses therefor
CA2948373A1 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Oregon State University Antisense antibacterial compounds and methods
EP3146047A4 (en) 2014-05-19 2018-04-04 Oregon State University Antisense antibacterial compounds and methods
TWI787678B (zh) 2014-05-23 2022-12-21 美商健臻公司 藉由使用反義寡核苷酸創造提前終止密碼子抑制或下調肝醣合成酶
GB201410693D0 (en) 2014-06-16 2014-07-30 Univ Southampton Splicing modulation
ES2752761T3 (es) 2014-07-24 2020-04-06 Abbott Molecular Inc Composiciones para la detección y análisis de mycobacterium tuberculosis
CN107072963B (zh) 2014-09-03 2020-07-07 吉倪塞思公司 治疗性纳米粒子和相关的组合物、方法和系统
KR102617137B1 (ko) 2014-09-15 2023-12-27 칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션 히스톤 h3-리신 트리메틸화를 제거함으로써 체세포 핵 이식(scnt) 효율을 증가시키는 방법 및 조성물
CA2962768C (en) 2014-10-01 2023-10-10 Alyssa M. Larson Polysaccharide and nucleic acid formulations containing viscosity-lowering agents
WO2016057693A1 (en) 2014-10-10 2016-04-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for inhalation delivery of conjugated oligonucleotide
WO2016081621A1 (en) 2014-11-18 2016-05-26 Yale University Formulations for targeted release of agents under low ph conditions and methods of use thereof
US10682422B2 (en) 2014-11-18 2020-06-16 Yale University Formulations for targeted release of agents under low pH conditions and methods of use thereof
US11293024B2 (en) 2014-12-31 2022-04-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Antisense antibacterial compounds and methods
CN107106694B (zh) 2015-01-13 2020-09-22 西格亚有限公司 在水中用于制备透明质酸钠盐的丁酸酯类的方法
MA41795A (fr) 2015-03-18 2018-01-23 Sarepta Therapeutics Inc Exclusion d'un exon induite par des composés antisens dans la myostatine
WO2016168197A1 (en) 2015-04-15 2016-10-20 Yale University Compositions for enhancing delivery of agents across the blood brain barrier and methods of use thereof
EP3297649B1 (en) 2015-05-19 2023-10-11 Sarepta Therapeutics, Inc. Peptide oligonucleotide conjugates
MA50829A (fr) 2015-06-01 2018-04-11 Sarepta Therapeutics Inc Exclusion d'exon induite pat technologie antisens dans le collagène de type vii
US11020417B2 (en) 2015-06-04 2021-06-01 Sarepta Therapeutics, Inc Methods and compounds for treatment of lymphocyte-related diseases and conditions
WO2017011565A1 (en) 2015-07-14 2017-01-19 Abbott Molecular Inc. Compositions and methods for identifying drug resistant tuberculosis
WO2017035278A1 (en) 2015-08-24 2017-03-02 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. Polynucleotide nanoparticles for the modulation of gene expression and uses thereof
EP3653216A1 (en) 2015-09-30 2020-05-20 Sarepta Therapeutics, Inc. Methods for treating muscular dystrophy
WO2017062835A2 (en) 2015-10-09 2017-04-13 Sarepta Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating duchenne muscular dystrophy and related disorders
US10370667B2 (en) 2015-11-18 2019-08-06 Rosalind Franklin University Of Medicine And Science Antisense compounds targeting leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) for the treatment of parkinsons disease
EP3377629B1 (en) 2015-11-18 2023-07-05 Rosalind Franklin University of Medicine and Science Antisense compounds targeting leucine-rich repeat kinase 2 (lrrk2) for the treatment of parkinsons disease
ES2901772T3 (es) 2015-12-15 2022-03-23 Sarepta Therapeutics Inc Conjugados de péptido oligonucleótido
US10907158B2 (en) 2015-12-23 2021-02-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Antisense antibacterial compounds and methods
CA3009342A1 (en) 2015-12-23 2017-06-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Antisense antibacterial compounds and methods
JP2019508037A (ja) 2016-02-16 2019-03-28 イェール ユニバーシティーＹａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ 標的化遺伝子編集を増強するための組成物およびその使用方法
JP2019512014A (ja) 2016-02-26 2019-05-09 イェール ユニバーシティーＹａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ がん診断法および治療法におけるｐｉＲＮＡを使用する組成物および方法
EP3423106B1 (en) 2016-03-01 2022-07-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Biodegradable activated polymers for therapeutic delivery
MA45469A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Acides nucléiques de bêta-caténine et leurs utilisations
MA45328A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Compositions acide nucléique-polypeptide et utilisations de celles-ci
MA45470A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Acides nucléiques kras et leurs utilisations
MA45471A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Acides nucléiques de phosphatidylinositol-3-kinase et leurs utilisations
MA45349A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Acides nucléiques egfr et leurs utilisations
WO2017173453A1 (en) 2016-04-01 2017-10-05 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Stimuli-responsive nanoparticles for biomedical applications
US11060089B2 (en) 2016-04-18 2021-07-13 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense oligomers and methods of using the same for treating diseases associated with the acid alpha-glucosidase gene
EP3449000A1 (en) 2016-04-29 2019-03-06 Sarepta Therapeutics, Inc. Oligonucleotide analogues targeting human lmna
WO2017197128A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Yale University Poly(amine-co-ester) nanoparticles and methods of use thereof
WO2017213854A1 (en) 2016-05-24 2017-12-14 Sarepta Therapeutics, Inc. Pharmaceutical composition comprising eteplirsen
US11472824B2 (en) 2016-05-24 2022-10-18 Sarepta Therapeutics, Inc. Processes for preparing phosphorodiamidate morpholino oligomers
BR112018074346B1 (pt) 2016-05-24 2023-01-03 Sarepta Therapeutics, Inc. Composto oligomérico e processo para preparar um composto oligomérico
SG10202101836TA (en) 2016-05-24 2021-03-30 Sarepta Therapeutics Inc Processes for preparing phosphorodiamidate morpholino oligomers
MA45362A (fr) 2016-05-24 2019-04-10 Sarepta Therapeutics Inc Procédés de préparation d'oligomères morpholino de phosphorodiamidate
HUE066393T2 (hu) 2016-05-24 2024-07-28 Sarepta Therapeutics Inc Eljárás foszfordiamidát morfolino oligomerek elõállítására
US10925973B2 (en) 2016-06-15 2021-02-23 University Of Utah Research Foundation Compositions and methods for using albumin-based nanomedicines
CN109152792B (zh) 2016-06-30 2021-09-14 萨勒普塔医疗公司 制备磷酸二酰胺吗啉代寡聚物的方法
TW201811807A (zh) 2016-06-30 2018-04-01 美商薩羅塔治療公司 用於肌肉萎縮症之外顯子跳躍寡聚物
JP6920411B2 (ja) * 2016-07-25 2021-08-18 ネルビアーノ・メデイカル・サイエンシーズ・エツセ・エルレ・エルレ コリンキナーゼ阻害剤としてのプリン及び３−デアザプリンアナログ
CN109937042B (zh) 2016-09-20 2023-06-27 科罗拉多州立大学董事会法人团体 使用亚磷酰胺化学法合成主链修饰的吗啉代寡核苷酸和嵌合体
US20200085758A1 (en) 2016-12-16 2020-03-19 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Co-delivery of nucleic acids for simultaneous suppression and expression of target genes
MX2019006882A (es) 2016-12-19 2019-08-16 Sarepta Therapeutics Inc Conjugados de oligomeros de omision de exon para distrofia muscular.
CN110337308B (zh) 2016-12-19 2023-09-01 萨勒普塔医疗公司 用于肌肉萎缩症的外显子跳跃寡聚体缀合物
SMT202200403T1 (it) 2016-12-19 2022-11-18 Sarepta Therapeutics Inc Coniugati di oligomeri per salto di esone per distrofia muscolare
MX2019008199A (es) 2017-01-06 2019-11-25 Avidity Biosciences Llc Composiciones de acido nucleico polipeptido y metodos de induccion de la omision de exon.
WO2018187493A1 (en) 2017-04-04 2018-10-11 Yale University Compositions and methods for in utero delivery
EP3612215B1 (en) 2017-04-20 2024-08-28 aTyr Pharma, Inc. Compositions for treating lung inflammation
GB201711809D0 (en) 2017-07-21 2017-09-06 Governors Of The Univ Of Alberta Antisense oligonucleotide
NL2019390B1 (en) 2017-08-04 2019-02-21 Univ Leiden Screening Method
WO2019032827A1 (en) 2017-08-09 2019-02-14 Massachusetts Institute Of Technology PEPTIDE ALBUMIN BINDING CONJUGATES AND METHODS THEREOF
EA201991450A1 (ru) 2017-09-22 2019-12-30 Сарепта Терапьютикс, Инк. Конъюгаты олигомеров для пропуска экзона при мышечной дистрофии
WO2019058393A1 (en) 2017-09-22 2019-03-28 Jubilant Biosys Limited HETEROCYCLIC COMPOUNDS AS INHIBITORS OF PAD
WO2019067975A1 (en) 2017-09-28 2019-04-04 Sarepta Therapeutics, Inc. POLYTHERAPIES FOR TREATING MUSCLE DYSTROPHY
WO2019067981A1 (en) 2017-09-28 2019-04-04 Sarepta Therapeutics, Inc. POLYTHERAPIES FOR TREATING MUSCLE DYSTROPHY
WO2019067979A1 (en) 2017-09-28 2019-04-04 Sarepta Therapeutics, Inc. POLYTHERAPIES FOR TREATING MUSCLE DYSTROPHY
WO2019071028A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 Avidity Biosciences Llc NUCLEIC ACID-POLYPEPTIDE COMPOSITIONS AND USES THEREOF
US11555189B2 (en) 2017-10-18 2023-01-17 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense oligomer compounds
FI3697785T3 (fi) 2017-10-18 2023-04-03 Jubilant Epipad LLC Imidatsopyridiiniyhdisteitä pad:n estäjinä
AU2018362046B2 (en) * 2017-11-06 2023-04-13 Jubilant Prodel LLC Pyrimidine derivatives as inhibitors of PD1/PD-L1 activation
GB201718804D0 (en) * 2017-11-14 2017-12-27 Nuclera Nucleics Ltd Novel use
WO2019100053A1 (en) 2017-11-20 2019-05-23 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for modulating hif-2α to improve muscle generation and repair
BR112020010322A2 (pt) 2017-11-24 2020-11-17 Jubilant Episcribe Llc composto da fórmula i; composto da fórmula ia; composto da fórmula ib; processo de preparação de compostos da fórmula i; composição farmacêutica; método para o tratamento e/ou prevenção de várias doenças; uso dos compostos; método para o tratamento de câncer; e método para o tratamento e/ou prevenção de uma afecção mediada por prmt5 ou um distúrbio proliferativo ou câncer
WO2019113393A1 (en) 2017-12-06 2019-06-13 Avidity Biosciences Llc Compositions and methods of treating muscle atrophy and myotonic dystrophy
WO2019118325A1 (en) 2017-12-11 2019-06-20 Rosalind Franklin University Of Medicine And Science Antisense compounds targeting leucine-rich repeat kinase 2 (lrrk2) for the treatment of parkinsons disease
US20190298857A1 (en) 2018-01-09 2019-10-03 Trucode Gene Repair, Inc. Polymer-based nanoparticles, related formulations methods, and apparatus
CN112105610B (zh) 2018-03-13 2024-01-26 朱比连特普罗德尔有限责任公司 作为pd1/pd-l1相互作用/活化的抑制剂的双环化合物
US10758629B2 (en) 2018-05-29 2020-09-01 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
EP4219717A3 (en) 2018-06-13 2023-12-20 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomers for muscular dystrophy
TW202449155A (zh) 2018-07-27 2024-12-16 美商薩羅塔治療公司 用於肌肉萎縮症之外顯子跳躍寡聚物
US10857174B2 (en) 2018-07-27 2020-12-08 United States Government As Represented By The Department Of Veterans Affairs Morpholino oligonucleotides useful in cancer treatment
WO2020028133A1 (en) 2018-07-30 2020-02-06 Trucode Gene Repair, Inc. Lipid nanoparticle formulations comprising nucleic acid mimics
US11939593B2 (en) 2018-08-01 2024-03-26 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for improving embryo development
JP2021534101A (ja) 2018-08-09 2021-12-09 ヴェルソー セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｃｃｒ２及びｃｓｆ１ｒを標的とするためのオリゴヌクレオチド組成物ならびにその使用
WO2020051507A1 (en) 2018-09-06 2020-03-12 The Broad Institute, Inc. Nucleic acid assemblies for use in targeted delivery
CA3122281A1 (en) 2018-12-13 2020-06-18 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
IL319265A (en) 2018-12-21 2025-04-01 Avidity Biosciences Inc Anti-transferrin receptor antibodies and their uses
US20220098578A1 (en) 2019-01-31 2022-03-31 Bar Ilan University Neoantigens created by aberrant-induced splicing and uses thereof in enhancing immunotherapy
MA55515A (fr) 2019-03-28 2022-02-09 Sarepta Therapeutics Inc Procédés de traitement de la dystrophie musculaire avec casimersen
EP3955966A1 (en) 2019-04-18 2022-02-23 Sarepta Therapeutics, Inc. Compositions for treating muscular dystrophy
AU2020263487A1 (en) 2019-04-25 2021-12-16 Avidity Biosciences, Inc. Nucleic acid compositions and methods of multi-exon skipping
US11814464B2 (en) 2019-04-29 2023-11-14 Yale University Poly(amine-co-ester) polymers and polyplexes with modified end groups and methods of use thereof
JP7581252B2 (ja) 2019-06-06 2024-11-12 アビディティー バイオサイエンシーズ，インク． Ｕｎａアミダイトおよびその使用
US11578090B2 (en) 2019-06-06 2023-02-14 Avidity Biosciences, Inc. Nucleic acid-polypeptide compositions and uses thereof
EP3987029A1 (en) 2019-06-19 2022-04-27 Sarepta Therapeutics, Inc. Methods for treating muscular dystrophy
WO2021025899A1 (en) 2019-08-02 2021-02-11 Sarepta Therapeutics, Inc. Phosphorodiamidate morpholino oligomer pharmaceutical compositions
US12485180B2 (en) 2019-08-30 2025-12-02 Yale University Compositions and methods for delivery of nucleic acids to cells
WO2021154705A1 (en) 2020-01-27 2021-08-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Rab13 and net1 antisense oligonucleotides to treat metastatic cancer
KR20220139366A (ko) 2020-02-12 2022-10-14 에이에스오큐라 파마슈티칼스 쑤저우 캄파니, 리미티드 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 펜드리드 증후군 치료를 위한 이의 용도
TW202144572A (zh) 2020-03-19 2021-12-01 美商亞維代堤生物科學公司 治療臉肩胛肱骨肌肉失養症之組合物及方法
WO2021195469A1 (en) 2020-03-27 2021-09-30 Avidity Biosciences, Inc. Compositions and methods of treating muscle dystrophy
EP4150092A4 (en) 2020-05-11 2024-11-06 Stoke Therapeutics, Inc. OPA1 ANTISENSE OLIGOMERS FOR THE TREATMENT OF DISEASES AND CONDITIONS
AU2021293780A1 (en) 2020-06-19 2023-02-02 Yale University Poly(amine-co-ester) polymers with modified end groups and enhanced pulmonary delivery
KR20230079367A (ko) 2020-08-31 2023-06-07 예일 유니버시티 핵산을 세포에 전달하기 위한 조성물 및 방법
JP2024501800A (ja) 2020-12-23 2024-01-16 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド 筋ジストロフィーを治療するためのエクソンスキッピングオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む組成物
US12472148B2 (en) 2021-04-26 2025-11-18 Celanese Eva Performance Polymers Llc Implantable device for sustained release of a macromolecular drug compound
EP4330395A1 (en) 2021-04-30 2024-03-06 Sarepta Therapeutics, Inc. Treatment methods for muscular dystrophy
GB202107553D0 (en) 2021-05-27 2021-07-14 Univ Oxford Innovation Ltd Method
US12378267B2 (en) 2021-06-17 2025-08-05 Entrada Therapeutics, Inc. Synthesis of FMOC-protected morpholino monomers and oligomers
GB202111250D0 (en) 2021-08-04 2021-09-15 Univ Oxford Innovation Ltd Method
US20250011777A1 (en) 2021-09-03 2025-01-09 Sarepta Therapeutics, Inc. Delivery of anitsense oligomers by mirror image peptides
CN118265544A (zh) 2021-09-16 2024-06-28 艾维迪提生物科学公司 治疗面肩肱型肌营养不良的组合物和方法
IL311568A (en) 2021-09-30 2024-05-01 Sarepta Therapeutics Inc Antisense oligonucleotides having one or more abasic units
EP4419680A1 (en) 2021-10-22 2024-08-28 Sarepta Therapeutics, Inc. Morpholino oligomers for treatment of peripheral myelin protein 22 related diseases
WO2023159189A1 (en) 2022-02-18 2023-08-24 Yale University Branched poly(amine-co-ester) polymers for more efficient nucleic expression
WO2023168427A1 (en) 2022-03-03 2023-09-07 Yale University Compositions and methods for delivering therapeutic polynucleotides for exon skipping
CA3252177A1 (en) 2022-03-17 2023-09-21 Sarepta Therapeutics, Inc. MORPHOLINO PHOSPHORODIAMIDATE OLIGOMER CONJUGATE
US12071621B2 (en) 2022-04-05 2024-08-27 Avidity Biosciences, Inc. Anti-transferrin receptor antibody-PMO conjugates for inducing DMD exon 44 skipping
WO2024015924A2 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Entrada Therapeutics, Inc. Hybrid oligonucleotides
JP2025533454A (ja) 2022-09-21 2025-10-07 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｄｍｄアンチセンスオリゴヌクレオチド介在性エクソンスキッピング効率
WO2024081736A2 (en) 2022-10-11 2024-04-18 Yale University Compositions and methods of using cell-penetrating antibodies
JP2025539043A (ja) 2022-11-14 2025-12-03 バイオンテック・エスイー Ｒｎａキャッピング効率アッセイ
WO2024197302A1 (en) 2023-03-23 2024-09-26 Yale University Compositions and methods for delivering antibody oligonucleotide conjugates for exon skipping
US20250066776A1 (en) 2023-04-27 2025-02-27 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense oligomers for treatment of chronic kidney disease
WO2024231285A1 (en) 2023-05-05 2024-11-14 BioNTech SE Method of analysing contaminants in rna products by ion-pair chromatography
US12491257B2 (en) 2023-06-27 2025-12-09 Avidity Biosciences, Inc. Compositions and methods of using PRKAG2-targeting antibody-oligonucleotide conjugates
US12409230B2 (en) 2023-06-30 2025-09-09 Avidity Biosciences, Inc. Compositions comprising PLN-targeting anti-transferrin receptor antibody-polynucleotides and methods of use thereof to treat cardiomyopathy
US20250171776A1 (en) 2023-08-02 2025-05-29 Sarepta Therapeutics, Inc. Non-canonical cell-penetrating peptides for antisense oligomer delivery
WO2025072672A2 (en) 2023-09-27 2025-04-03 Judo Bio, Inc. Slc6a19-targeting modulatory nucleic acid agents
WO2025072699A1 (en) 2023-09-27 2025-04-03 Judo Bio, Inc. Aminoglycosides for delivery of agents to the kidney
WO2025072713A1 (en) 2023-09-27 2025-04-03 Judo Bio, Inc. Polymyxins for delivery of agents to the kidney
WO2025085810A2 (en) 2023-10-18 2025-04-24 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense oligomers for treatment of centronuclear myopathies
WO2025085868A2 (en) 2023-10-20 2025-04-24 Radiation Control Technologies, Inc. Cd47-targeting morpholinos

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3211732A (en) * 1965-10-12 Pyrazolob:x-d]pyrlil/hdines
US468950A (en) * 1892-02-16 Commutator-brush for electric motors and dynamos
US3225042A (en) * 1962-07-31 1965-12-21 Lilly Co Eli Hydroxymorpholines
US3797414A (en) * 1970-10-29 1974-03-19 M Ahrend Canted vortex open pit incinerator
US4123610A (en) * 1977-03-09 1978-10-31 The United States Government Nucleic acid crosslinking agent and affinity inactivation of nucleic acids therewith
US4430496A (en) * 1980-01-17 1984-02-07 Varian Associates, Inc. Strong anion exchange composition and methods
AU543007B2 (en) * 1980-04-15 1985-03-28 Technicon Instruments Corportion Agglutination immunoassay
US4395486A (en) * 1981-08-19 1983-07-26 Medical College Of Ga. Research Inst., Inc. Method for the direct analysis of sickle cell anemia
US4515781A (en) * 1983-02-23 1985-05-07 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services 2',5'-Riboadenylate-morpholinoadenylate nucleotides
CA1254525A (en) * 1983-04-13 1989-05-23 Christine L. Brakel Kit for terminally chemically labeling dna
GB8311228D0 (en) * 1983-04-25 1983-06-02 Fujisawa Pharmaceutical Co Morpholine derivatives
US4713326A (en) * 1983-07-05 1987-12-15 Molecular Diagnostics, Inc. Coupling of nucleic acids to solid support by photochemical methods
EP0139489A3 (en) * 1983-09-26 1988-01-13 Ortho Diagnostic Systems Inc. Sandwich hybridization method for nucleic acid detection
US4507433A (en) * 1983-10-07 1985-03-26 The Johns Hopkins University Preparation of oligodeoxyribonucleoside alkyl or arylphosphonates
US4734363A (en) * 1984-11-27 1988-03-29 Molecular Diagnostics, Inc. Large scale production of DNA probes
DE3515529A1 (de) * 1985-04-30 1986-11-06 Dr. Helmut Bayer Chemisch-technische Betriebsberatung, 6052 Mühlheim Verfahren zur festphasensynthese von oligonucleotiden definierter sequenz
JPS62172384A (ja) * 1986-01-24 1987-07-29 Sanyo Electric Co Ltd トナ−濃度検出装置
JPH09118898A (ja) * 1995-08-23 1997-05-06 Kao Corp 硬質表面用漂白剤組成物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｊｏｕｒ．ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍ．Ｖ．２５５，Ｎｏ．２０（１９８０）Ｐ．９６５９
ＮｕｃｌｅｉｃＡａｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｖ．１２，Ｎｏ．８（１９８４）Ｐ．３４３５

Also Published As

Publication number Publication date
JPS62502338A (ja) 1987-09-10
ATE124999T1 (de) 1995-07-15
JPS62502357A (ja) 1987-09-10
US5142047A (en) 1992-08-25
WO1986005519A1 (en) 1986-09-25
AU5698186A (en) 1986-10-13
EP0639582B1 (en) 1998-09-16
EP0216860B1 (en) 1992-10-28
EP0216860A1 (en) 1987-04-08
EP0639582A2 (en) 1995-02-22
CA1268404A (en) 1990-05-01
JP3022967B2 (ja) 2000-03-21
DE3650699D1 (de) 1998-10-22
EP0639582A3 (en) 1995-09-06
DE3650349T2 (de) 1995-12-14
EP0215942A4 (en) 1988-08-23
JP2670434B2 (ja) 1997-10-29
EP0215942B1 (en) 1995-07-12
DE3687030T2 (de) 1993-03-11
EP0216860A4 (en) 1989-02-22
DE3650699T2 (de) 1999-04-15
DE3687030D1 (ja) 1992-12-03
ATE171185T1 (de) 1998-10-15
JPH08193998A (ja) 1996-07-30
DE3650349D1 (de) 1995-08-17
EP0215942A1 (en) 1987-04-01
WO1986005518A1 (en) 1986-09-25
AU5661386A (en) 1986-10-13
ATE81872T1 (de) 1992-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2528107B2 (ja) ポリヌクレオチド測定試薬と方法
US5217866A (en) Polynucleotide assay reagent and method
JP3379064B2 (ja) オリゴヌクレオチドの合成用担体
US4948882A (en) Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US5235033A (en) Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
EP1003762B1 (en) Base analogues
EP0135587B2 (en) Defined sequence single strand oligonucleotides incorporating reporter groups, process for the chemical synthesis thereof, and nucleosides useful in such synthesis
JP3172174B2 (ja) アキラル内部サブユニット結合を有する非帯電モルホリノに基づくポリメラーゼ
KR100225090B1 (ko) 이중가닥 핵산을 위한 서열특이적 결합 중합체
US5378841A (en) Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
WO1997012896A1 (en) Selective binding complementary oligonucleotides
JP2006055170A (ja) バックグランドノイズの減少を伴う液相核酸サンドイッチアッセイ
EP0767668A1 (en) Polynucleoside chain having multiple nucleosides, the nucleosides coupled by guanidyl linkages

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term