CN102712928B - 反义抗病毒化合物及治疗流感病毒感染的方法 - Google Patents

反义抗病毒化合物及治疗流感病毒感染的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及反义抗病毒化合物以及在抑制正黏液病毒(Orthomyxoviridae)科的病毒生长和治疗病毒感染中的使用及产生它们的方法。该化合物在治疗哺乳动物的流感病毒感染中特别有用。示例性的反义抗病毒化合物为基本上不带电荷或部分地带正电荷的吗啉代寡核苷酸，其具有：1)耐核酸酶的主链，2)12‑40个核苷酸碱基，以及3)长度为至少12个碱基的靶向序列，该靶向序列与选自以下的靶区域杂交：a)甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒的负义病毒RNA节段的5’或3’末端的25个碱基；b)正义vcRNA的5’或3’末端的末端30个碱基；c)流感病毒mRNA的AUG起始密码子周围的45个碱基，以及d)受到选择性剪接的流感病毒mRNA的剪接供体或受体位点周围的50个碱基。

Description

反义抗病毒化合物及治疗流感病毒感染的方法
引用的相关申请
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2009年11月13日提交的美国临时专利申请第61/261,278号；2010年1月4日提交的美国临时专利申请第61/292,056号；及2010年8月26日提交的美国临时专利申请第61/377,382号的权益，在此通过引用将每一临时申请全文并入。
关于序列表的声明
以代替纸件形式的纯文本格式提供与本申请相关的序列表，并通过引用并入本说明书。含有所述序列表的该文本文件的名称是120178_456PC_SEQUENCE_LISTING.txt。该文本文件的大小为33KB，其创建于2010年11月11日，并经由EFS-Web与提交说明书的同时提交。
发明领域
本发明涉及用于治疗流感病毒感染的反义寡核苷酸和利用寡核苷酸的抗病毒治疗方法。
发明背景
纵观人类历史，流感病毒是导致人类死亡率和发病率的一个主要原因。在世界范围内，甲型流感病毒感染每年引起数以百万计的严重病例，导致多达500,000人丧生。流行性传染病在严重程度方面变化很大但每隔一定时间就会发生并且总会导致显著的死亡率和发病率，最频繁地发生在老年人群中。尽管针对匹配的流行性感冒病毒株的疫苗可以预防60-80%的健康成年人中的疾病，但是保护率在高危人群中要低得多。而且，疫苗接种并不提供针对非预期病毒株的保护，诸如1997年在香港以及2003年和2004年在欧洲与东南亚爆发的H5和H7禽流感。目前的抗流感病毒药物在它们提供保护及治疗效果方面的能力是有限的(Cox and Subbarao 1999;Cox and Subbarao 2000)。
甲型流感病毒为负极性的节段RNA病毒。通过4个蛋白的复合体复制基因组节段：3个聚合酶多肽(PA、PB1和PB2)和NP(核蛋白)。所有8个基因组节段的5’和3’末端的序列区域在一个基因型内是高度保守的(Strauss and Strauss 2002)。
根据它们表面糖蛋白的抗原和遗传特性，可将甲型流感病毒分型。迄今已经鉴定了15个红细胞凝集素(HA)与9个神经氨酸苷酶(NA)亚型。已经从禽类宿主分离出了衍生所有已知的HA与NA亚型的病毒，但是只有HlNl(1918)、H2N2(1957/58)以及H3N2(1968)亚型与人类中广泛传播的流行性传染病相关(Strauss and Strauss 2002)。
自从1997年以来，当时H5N1流感病毒传播至人类并且杀死了18个感染者中的6个人，已经有多重的禽流感病毒传播至哺乳动物。直接传播全部的病毒或通过哺乳动物株获得来自于禽流感病毒的基因节段。在亚洲禽类H5N1病毒广泛传播的感染已引起了日益增加的关注：该亚型可实现人-人的传播并且建立了种间传播。通过病毒糖蛋白的不同形式(HA,NA)确定不同类型的流感病毒能够感染的物种。这提供了鸟类与人类间相当大的不易克服的物种屏障。然而，猪却提供了“混合罐”-能够被这两种类型的病毒所感染并因此而允许禽类病毒-人类的传代。当个体的猪细胞与禽类和人类的流感病毒共感染时，可以出现携带禽类HA基因型但是易于感染人类的重组形式。禽类HA可以感染猪但是不感染人类。在猪中，基因组节段包装期间，创建带有几个禽类节段与人类HA和/或NA节段的病毒是可能的(Coxand Subbarao 2000)。
流感病毒感染人类和动物(例如猪、鸟、马)而且可能引起急性呼吸性疾病。已经有很多的生产有效针对流感病毒的疫苗的尝试，然而没有任何一个是完全成功的，尤其是在长期基础上。这可能是由于，至少部分地，流感病毒基因组的节段的特征，其使得通过节段的再分配而有许多形式的存在是可能的。例如，已经提出了存在着RNA节段在动物与人类流感病毒间的相互交换，这可以导致在这两种群体中引入新的抗原亚型。因此，由于新的亚型的出现(抗原“转移”)，长期的疫苗接种方法就失败了。此外，病毒的表面蛋白，红细胞血凝素与神经氨酸苷酶，不断地经历较小的抗原变化(抗原“转移”)。这种高程度的变异解释了为什么针对特别的流感病毒所发展的的特异性免疫不能针对新的变体建立保护。因此，需要可选择的抗病毒策略。尽管乙型和丙型流感病毒引起的临床疾病比甲型流感病毒所引起的少，但是新的抗病毒药物也应该有益于抑制由这些因子所引起的感染。
天然地发生在鸟类中的流感病毒被叫做禽流感(鸟流感)。鸟类在它们的肠道中携带病毒但通常不会被感染致病。然而，迁徙的鸟类可以携带鸟流感以感染驯养的鸡、鸭和火鸡，引起疾病甚至死亡。禽流感轻易不感染人类但是当人类暴露非常频繁时，诸如接触驯养的鸟类，人类感染就会发生。1961年在南非的燕鸥中首先鉴定出危险的鸟流感(H5N1)并且鉴定为潜在地致死的流感形式。2003年下半年和2004年，八个亚洲国家发生了H5N1的爆发。这些国家在那段时间内超过100,000,000只鸟类死亡或者被捕杀以便控制爆发。亚洲报道了开始于2004年6月的新的致死的H5N1的爆发，其目前正在进行中。已在泰国、越南和柬埔寨观察到约50%死亡率的人类H5N1感染。这些感染主要发生在接触感染的家禽的人身上，但是有少数的H5N1人-人传播的病例发生。
自从1998年以来，三元重组株甲型流感病毒(H1)与来源于猪(HA、NP、NA、M以及NS)、人类(PB1)以及鸟类(PB2和PA)的节段一起在传播。最近所述的新的猪起源的，是正在进行中的国际性疾病爆发原因的甲型流感(2009H1N1)病毒(S-OIV)为三元重组株病毒，其包括已与欧亚的猪流感病毒的神经氨酸苷酶(NA)和基质(M)节段重组的该早已存在的病毒的基因成分(S-OIV调查组,2009)。以前的甲型流感病毒(HI)三元重组株病毒偶尔传播至人类但是没有有效地在人-人间传播，但是新的S-OIV可非常高效地在人-人间传播。最近29个国家报道了3440个实验室确认的S-OIV感染病例。疫情爆发开始于墨西哥，该国记载了总计1364个病例，导致了45例死亡(3.3%病例-致死率)。墨西哥以外，只报道了有3例死亡(0.1%病例-致死率)。此时并不清楚这种死亡率在地理位置上不平衡的原因。
虽然目前的S-OIV对神经氨酸苷酶抑制剂奥司地韦(oseltamivir)和扎那米韦(zanamivir)敏感，却早已记载了季节性流感病毒进化为赋予耐神经氨酸苷酶抑制剂的变异。S-OIV将取代人类HI成为季节性流感病毒或S-OIV将与另一种病毒株重组以产生另一种新的变体？它将进化变得更致命？从新病毒的鉴定到新疫苗的生产和配送的时间间隔将这些不确定性混合起来。而且，足够的新病毒血凝素抗原可使大剂量免疫原和加强免疫方案的使用成为必要，这造成了必须迅速地引起保护性免疫的大规模预防接种的实际困难。鉴于这些考虑，存在着对创造新形式的预防和治疗的迫切需求，尤其是对于S-OIV，理想地是带有广泛的抗各种流感病毒株、亚型以及类型的活性。
存在对新形式的甲型流感治疗的迫切需求,这是由于(a)已知的该病毒经受连续的低水平抗原漂移及低频率但是不可预知的导致大流行性疾病的主要抗原漂移的倾向，(b)疫苗接种的明显失败，即使当病毒株适度匹配以预防相当大比例的疫苗接受者的流感相关疾病，以及(c)对已批准的流感疗法形式(例如金刚烷衍生物以及新近地神经氨酸苷酶抑制剂，奥司他韦)抵抗的频率增加。
鉴于流感病毒所引起的疾病的严重程度，存在着对治疗流感病毒感染的新疗法的即时需求。考虑到缺乏有效的预防或疗法，因此本发明的目标是提供用于治疗被流感病毒所感染的宿主的治疗化合物和方法。
发明概述
本发明的实施方案包括，在一方面，可有效地抑制具有单链负义基因组的RNA病毒在宿主细胞内复制的抗病毒化合物，该RNA病毒选自正黏液病毒科，包括甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒属。化合物可靶向于选自以下的区域内的病毒RNA序列：1)负义病毒RNA节段的5’或3’末端的25个碱基；2)正义cRNA的5’或3’末端的末端25个碱基；3)流感病毒mRNA的AUG起始密码子周围的45个碱基，以及4)受到选择性剪接的流感病毒mRNA的剪接供体或受体位点周围的50个碱基。
在某一实施方案中，抗病毒化合物可包括寡核苷酸，其表征为：a)耐核酸酶的主链，b)12-40个核苷酸碱基，以及c)长度为至少10个碱基的靶向序列，其与选自以下的靶区域杂交：i)甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒的负义病毒RNA节段的5’或3’末端的25个碱基，诸如包含M1或M2的节段，ii)甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒的正义cRNA的5’或3’末端的末端25个碱基；iii)流感病毒mRNA的AUG起始密码子周围的45个碱基，诸如M1或M2mRNA；以及iv)受到选择性剪接的甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒mRNA的剪接供体或受体位点周围的50个碱基，诸如M1或M2mRNA。
寡核苷酸也可表征为：a)被哺乳动物的宿主细胞主动地摄取的能力，和/或b)与病毒的靶区域形成异源双链体结构的能力，其中所述的异源双链体结构为：i)由病毒和寡核苷酸化合物的正义或负义链组成，以及ii)以至少45°C的离解Tm为特征。
在另一方面，本发明的实施方案包括抑制感染的流感病毒在哺乳动物宿主细胞内复制的抗病毒化合物，该流感病毒具有单链的、节段的、负义基因组并选自正黏液病毒科。化合物可以作为表征为上文所述元件的寡核苷酸给予受感染的宿主细胞。化合物可给予流感病毒感染的或处于流感病毒感染风险中的哺乳动物个体。
化合物可由通过不带电荷的、含磷的亚基间键连接的吗啉亚基组成，将一个亚基的吗啉氮连接到邻近亚基的5’环外碳原子。在一方面，亚基间键为磷二酰胺键，诸如具有以下结构的那些：
其中，Y1=O，Z=O，Pj为嘌呤或嘧啶或通过碱基特异的氢键有效结合到多核苷酸中一个碱基上的等价的碱基配对基，以及X为烷基、烷氧基、硫代烷氧基或烷基氨基，例如，其中X=NR2，其中每个R独立地为氢或甲基。
化合物可由通过以上所述的不带电荷键所连接的吗啉亚基组成，其中所述不带电荷键被插入着带正电荷键。带正电荷的键的总数在2-不超过键总数的一半。带正电荷的键具有以上的结构，其中X为1-哌嗪。
化合物可包括寡核苷酸对应物部分的共价连接以及有效增强宿主细胞对化合物摄取的富精氨酸多肽，该寡核苷酸对应物部分能够形成带有正义或负义的病毒RNA链的此类异源双链体结构。示例性多肽包含如SEQ ID NO:115-128的所鉴定的序列之一。
在一相关的方面，本发明的实施方案包括形成于下列之间的异源双链体复合物：
(a)负义病毒RNA的5’或3’末端的25个碱基，和/或；
(b)正义mRNA的5’或3’末端的末端25个碱基，和/或；
(c)病毒mRNA的AUG起始密码子周围的45个碱基，和/或；
(d)受到选择性剪接的流感病毒mRNA的剪接供体或受体位点周围的50个碱基，以及；
(e)以下列为特征的寡核苷酸：
(i)耐核酸酶的主链，
(ii)能够被哺乳动物的宿主细胞所摄取，
(iii)包含12-40个核苷酸碱基，
其中所述的异源双链体复合物具有至少45°C的离解Tm。
在某一实施方案中，示例性寡核苷酸可由通过不带电荷的、含磷的亚基间键连接的吗啉亚基所组成，将一个亚基的吗啉氮连接到邻近亚基的5’环外碳原子。化合物可具有磷二酰胺键，例如以结构：
其中，Y1=O，Z=O，Pj为通过碱基特异的氢键有效结合到多核苷酸中碱基上的嘌呤或嘧啶碱基配对基，以及X为烷基、烷氧基、硫代烷氧基或烷基氨基。在一优选的化合物中，X=NR2，其中每个R独立地为氢或甲基。化合物也可由通过以上所述的不带电荷键所连接的吗啉亚基组成，所述不带电荷键被插入着带正电荷键。带正电荷键的总数为2个-不超过键总数的一半。带正电荷的键具有以上的结构，其中X为1-哌嗪。
化合物可为单独的寡核苷酸或寡核苷酸与能够增强宿主细胞对化合物摄取的富精氨酸多肽的连接。示例性多肽具有如SEQ ID NO:115-128所鉴定的序列的其中之一。
仍然在另一方面，本发明的实施方案包括反义寡核苷酸以及抑制流感病毒在哺乳动物宿主细胞中复制的相关方法，该流感病毒具有单链的、节段的、负义的RNA基因组并且选自正黏液病毒科。化合物可通过本文所述的病毒RNA成分表征化。在某一实施方案中，细胞在个体中，通常为具有流感病毒感染的个体。
在一些实施方案中，个体具有继发性细菌感染，并且方法还包含单独地给予细菌抗生素，或与抗病毒的反义寡核苷酸同时给予。在具体的实施方案中，继发性细菌感染为链球菌(Streptococcal)的肺炎感染(例如肺炎链球菌(Streptococcus pneuomoniae))。在某一实施方案中，抗生素为β-内酰胺。在具体的实施方案中，抗生素选自盘尼西林、阿莫西林、头孢菌素、氯霉素以及克林霉素。
还包括减少流感病毒复制的方法，其包含单独地给予靶向编码CD200或CD200受体的RNA分子的反义寡核苷酸，或与一种或多种本文所述的抗病毒反义寡核苷酸同时给予。
包含本文所述的抗病毒反义寡核苷酸以及药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物还包含细菌抗生素，诸如盘尼西林、阿莫西林、头孢菌素、氯霉素或克林霉素。在优选的实施方案中，细菌抗生素为抑菌的。在一些实施方案中，药物组合物还包含靶向编码CD200或CD200受体的RNA分子的反义寡核苷酸。
为治疗诸如甲型流感病毒的流感病毒，靶向序列可与区域杂交，该区域与如SEQID NO:1-11所鉴定的序列组的其中之一有关。优选的靶向序列为与SEQ ID NO:4的负链靶标或SEQ ID NO:2的正链靶标互补的那些。靶向于这两个区域的示例性反义磷二酰胺吗啉基寡聚物(“PMO”)被各自地列为SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:23。
附图简要说明
图1A表示带有磷二酰胺键的示例性吗啉基寡聚物结构；
图1B表示如图1A中的吗啉基寡聚物，但是其中主链键包含(哌嗪基)磷二酰胺键形式的带正电荷的基团；
图1C表示根据本发明的一个实施方案，富精氨酸肽与反义寡聚物的连接；
图1D-G表示示例性吗啉基寡核苷酸的重复亚基节段，特指D至G。
图2表示PMOplusTM形式的优选的示例性本发明的反义化合物(Ml/M2-AUGplus;SEQID NO:13)。3个(哌嗪基)磷二酰胺(pip-PDA)键给予了净正电荷，因此术语PMOplusTM。
图3表示存在于感染的细胞中的三种不同流感病毒RNA：vRNA、mRNA和vcRNA以及靶向于本文所述的PMO的靶位置。
图4A表示来源于重要的流感病毒血清型：HlNl、HlNl(S-OIV)、H5N1、H3N2、H9N2以及H7N7的M1/M2节段的5’末端的60个核苷酸的序列保守性。
图4B表示分离群具有指定碱基的百分比，如对M1/M2-AUG靶标而言每个碱基后下标号码(SEQ ID NO:12)。
图5A-5B表示各自地相对于AUG起始密码子和vcRNA的5’末端，本发明的靶向序列的位置。
图6表示在H3N2鼠科模型系统中利用本发明的M1/M2-AUG靶向化合物(SEQ ID NO:12和13)的剂量依赖性病毒滴度下降。
图7A-7D表示M1/M2-AUG(SEQ ID NO:12和13)处理的雪貂在被2009H1N1(S-OIV)流行的猪流感分离群感染后具有降低的临床生命体征。
图7E表示S-OIV感染的与用本发明的M1/M2-AUG化合物(SEQID NO:12和13)处理的雪貂导致了2.3对数的病毒滴度抑制。
图8A-C表示各自地靶向于病毒的HA RNA、M1蛋白和M2蛋白表达上的剪接受体位点的PPMO的效果。
图9A-B表示靶向于病毒的HA RNA和M2蛋白表达上的M1/M2-AUG起始密码子的反义LNA寡聚物的效果。
图10A-B表示靶向于病毒的HA RNA和M2蛋白表达上的M1/M2-AUG起始密码子和剪接受体位点的反义2’OMe寡聚物的效果。
图11表示用靶向于M1/M2-AUG起始密码子在用PPMO处理的H1N1PR8感染的MDCK细胞中抑制M1和M2蛋白表达。
发明的详细描述
1.定义
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语都具有本领域技术人员通常理解的含义。尽管任一与本文所述的那些相似或等同的方法和材料都能够用于本发明的实践或试验，但优选的方法和材料为所述的。出于本发明的目的，下列的术语为以下所定义的。
本文所用的冠词“a(一)”和“an(一个)”指1个或多于1个(即至少1个)冠词的主语。仅为举例，“an element(一个元件)”指1个元件或多于1个元件。
本文所用的“大约”指数量、水平、数值、号码、频率、百分比、尺寸、大小、总数、重量或长度，其变化多达30,25,20,25,10,9,8,7,6,5,4,3,2或1%的参照的数量、水平、数值、号码、频率、百分比、尺寸、大小、总数、重量或长度。
本文所用的“编码序列”指贡献基因的多肽产物编码的任一核酸序列。例如术语“非编码序列”指不贡献基因的多肽产物编码的任一核酸序列。
本说明书自始至终，除非上下文另有要求，词语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”以及“包含(comprising)”将理解为意指包含陈述的步骤或成分，或步骤或成分的群组但是并不排除任一其他的步骤或成分，或步骤或成分的群组。
本文所用的“由--组成(consisting of)”指包括并且限于，跟随短语“由--组成(consisting of)”的无论什么。因此，短语“由--组成(consisting of)”表明所列举的成分为必须的或强制的，并且没有其他的成分可能存在。本文所用的“基本上由…组成(consisting essentially of)”指包括任一短语后所列举的成分并且限于不干扰或促进公开出版物中针对所列举的成分的指定的活性或作用。因此，短语“基本上由…组成(consisting essentially of)”表明所列举的成分为必须的或强制的，但是其他的成分为任选的并且可能或不可能取决于是否它们实质地影响所列举的成分的活性或作用。
术语“互补的”和“互补性”指通过碱基配对规则所相关的多肽(即核苷酸的序列)。例如序列“A-G-T”与序列“T-C-A”互补。互补性可以为“部分的”，其中根据碱基配对规则只有一些核酸的碱基为匹配的。或者，核酸间可能存在“完全的”或“全部的”互补性。互补性在核酸链间的程度对核酸链间杂交的功效和强度具有显著的影响。虽然最佳的互补性经常是理想的，但是一些实施方案可以包括一个或多个但是优选6,5,4,3,2或1个不匹配，就靶RNA而言。包括寡聚物中位于任何位置上的变体。在某一实施方案中，靠近寡聚物的终点的序列中的变体通常优选内含子中的变体，并且如果存在，变体通常在5’和/或3’末端的约6,5,4,3,2或1个核苷酸中。
术语“细胞穿透肽”或“CPP”可互换地使用并且指阳离子细胞穿透肽，也称作转运肽，载体肽或肽转导域。如本文所示，肽具有诱导30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%或100%给定的细胞培养群的细胞内细胞穿透的能力，包括所有在中间的整数，并且允许基于全身用药在体内多种组织中大分子易位。
术语“反义寡聚物”或“反义化合物”或“反义寡核苷酸”或“寡核苷酸”可互换地使用并且指环状亚基的序列，每个都带有碱基配对基，通过亚基间键连接，该亚基间键允许碱基配对基与核酸中的靶序列(通常为RNA)通过沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对杂交以形成靶序列内的核酸：寡聚物异源双链体。环状亚基可基于核糖或另外的戊糖，或在某些实施方案中，吗啉基团(见下列的吗啉基寡聚物的描述)。还考虑的是肽核酸(PNA)，锁核酸(LNA)，2’-O-甲基寡核苷酸和RNA干扰剂(siRNA剂)以及其他的本领域中已知的反义剂。
此类反义寡聚物可以被设计用于阻断或抑制mRNA翻译或抑制天然的信使RNA剪接处理或诱导靶向的mRNA的降解，并且可以说是“导向”或“靶向”与其所杂交的靶序列。在某些实施方案中，靶序列包括一区域，该区域包括mRNA的AUG起始密码子或预处理的mRNA的3’或5’剪接位点，分支点。靶序列可以在外显子内或在内含子内。针对剪接位点的靶序列可包括mRNA序列，该序列具有在预处理的mRNA中的正常的剪接受体连接的其5’末端下游地1个-约25个碱基对。优选的剪接位点靶序列为任一预处理的mRNA的区域，该区域包括剪接位点，或完全地包含在编码序列的外显子内，或跨越剪接受体或供体位点。更普遍地，寡聚物被称为“靶向”生物学上相关的靶标，诸如蛋白、病毒或细菌，当它以上文所述的方式靶向靶标的核酸时。
包含基本上由，或由一个或多个SEQ ID NO:12-114组成的反义寡核苷酸。这些反义寡聚物的变体也包括在内，其包括具有与任一SEQID NO:12-11480%,85%,90%,95%,97%,98%或99%(包括中间所有的整数)序列同一性或序列同源性的变体寡聚物，和/或通过约1,2,3,4,5,6,7,8,9或10个核苷酸与这些序列不同的变体，优选抑制细胞内流感病毒复制的那些变体。任一或多个SEQ ID NO:12-114的寡核苷酸也包括在内，其包含如本文所述的适当数目的带电荷的键，例如多达约1个/2-5个不带电荷的键，诸如约4-5个/10个不带电荷的键，和/或其包含也如本文所述的附加于其中的富精氨酸肽。
术语“吗啉基寡聚物”或“PMO”(氨基磷酸酯-或磷二酰胺吗啉基寡聚物)指由吗啉亚基结构组成的寡核苷酸对应物，其中(i)结构通过含磷的键连接在一起，1个-3个原子长度，优选2个原子长度，并且优选不带电荷的或阳离子的，将一个亚基的吗啉氮连接到邻近亚基的5’环外碳，并且(ii)每个吗啉基环都具有嘌呤或嘧啶或等价的通过碱基特异的氢键有效地结合多核苷酸的碱基配对基。例如见图1A中的结构，其显示了优选的磷二酰胺键类型。可以制造变体至该键，只要它们不干扰结合或活性。例如，附加到磷的氧可以被硫取代(硫代磷二酰胺)。5’氧可以被氨基或低级烷基取代的氨基取代。附加到磷的悬垂的氮可以是未取代的、被低级烷基单基取代的或双基取代的(任选地取代的)。下文还可见阳离子键的讨论。嘌呤或嘧啶碱基配对基通常为腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶或肌苷。吗啉基寡聚物的合成、结构以及结合特征详述于美国专利申请第5,698,685,5,217,866,5,142,047,5,034,506,5,166,315,5,521,063和5,506,337号以及PCT专利申请PCT/US07/11435号(阳离子键)和PCT专利申请US2008/012804号(改进的合成)，在此通过引用将所有的专利申请并入。
术语“寡核苷酸对应物”指寡核苷酸其具有(i)修饰的主链结构，例如不同于天然的寡核苷酸和多核苷酸中找到的标准的磷酸二酯键的主链，并且(ii)任选地，修饰的糖基，例如吗啉基而不是核糖或脱氧核糖基。寡核苷酸对应物支持能够通过沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对氢键结合标准的多核苷酸碱基的碱基，其中对应物主链在某种程度上呈递碱基以允许此类氢键以序列特异的方式在寡核苷酸对应物分子与标准的多核苷酸中碱基间结合(例如单链的RNA或单链的DNA)。优选的对应物为具有基本上不带电荷的、含磷的主链的那些。
寡核苷酸对应物中基本上不带电荷的、含磷的主链为一个其中大多数的亚基键，例如50-100%间，通常至少60%-100%或75%或80%的它的键为不带电荷的或基本上不带电荷的并且包含单一的磷原子。反义寡核苷酸和寡核苷酸对应物可包含约8个-40个亚基，通常约8个-25个亚基，并且优选约12个-25个亚基。在某些实施方案中，寡核苷酸可以具有精确的对靶序列的序列互补性或近似于互补性，如下文所定义的。
寡核苷酸的“亚基”指核苷酸(或核苷酸对应物)单元。该术语可指带有或不带有附加的亚基间键的核苷酸单元，尽管，当提及“带电荷的亚基”时，电荷通常属于亚基间键(例如磷酸或硫代磷酸键或阳离子键，如图1B中所示)。
嘌呤或嘧啶碱基配对基通常为腺嘌呤，胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶或肌苷。还包括碱基诸如吡啶-4-酮，吡啶-2-酮，苯基，假尿嘧啶，2,4,6-trimell5thoxy苯，3-甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶核苷，萘基，氨基苯，5-烷基胞嘧啶核苷(例如5-甲基胞嘧啶核苷)，5-烷基尿嘧啶核苷(例如核糖胸腺嘧啶)，5-卤代尿嘧啶核苷(例如5-溴尿嘧啶核苷)或6-硫唑嘌呤嘧啶或6-烷基嘧啶(例如6-甲基尿嘧啶核苷)，丙炔、辫苷，2-硫代尿嘧啶核苷，4-硫代尿嘧啶核苷，怀丁苷，wybutoxosine，4-乙酰替丁，5-(羧基羟甲基)尿嘧啶核苷，5-羧基甲基氨基甲基-3-硫代尿嘧啶核苷，5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶核苷，β-D-半乳糖基辫苷，1-甲基腺嘌呤核苷，1-甲基肌苷，2,2-二甲基鸟嘌呤核苷，3-甲基胞嘧啶核苷，2-甲基腺嘌呤核苷，2-甲基鸟嘌呤核苷，N6-甲基腺嘌呤核苷，7-甲基鸟嘌呤核苷，5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶核苷，5-甲基氨基甲基尿嘧啶核苷，5-甲基羰基乙基尿嘧啶核苷，5-甲氧基尿嘧啶核苷，5-甲基-2-硫代尿嘧啶核苷，2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤核苷，β-D-甘露糖基辫苷，尿嘧啶核苷-5-羟乙酸，2-硫代胞嘧啶核苷，苏氨酸衍生物以及其他(Burgin et al,1996,Biochemistry,35,14090;Uhlman&Peyman,supra)。本文所用的“修饰的碱基”在这一方面意指核苷酸碱基除了腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)以及尿嘧啶(U)，如以上所例证的；此类碱基可以用于反义分子中的任一位置。本领域中的技术人员应理解取决于寡聚物的用途，Ts和Us为可互换的。例如，随着其他的反义化学过程诸如更类似RNA的2’-0-甲基反义寡核苷酸，T碱基可以显示为U(例如见序列表)。
“氨基酸亚基”或“氨基酸残基”可指α-氨基酸残基(-CO-CHR-NH-)或β-或其他的氨基酸残基(例如-CO-(CH2)nNCHR-NH-)，其中R为侧链(其可以包括氢)并且n为1-7，优选1-4。
术语“天然存在的氨基酸”指存在于自然界中发现的蛋白中的氨基酸，诸如蛋白质的生物合成期间所利用的20(L)-氨基酸以及诸如4-羟基脯氨酸，羟基赖氨酸，锁链素，异锁链素，同型半胱氨酸，瓜氨酸和鸟氨酸。术语“非天然的氨基酸”指不存在于自然界中发现的蛋白中的那些氨基酸，实例包括β-丙氨酸(β-Ala)，6-氨基己酸(Ahx)以及6-氨基戊酸。“非天然的氨基酸”额外的实例包括但不限于(D)-氨基酸，正亮氨酸，正缬氨酸，对氟苯丙氨酸，乙硫氨基酪酸等，其为本领域中技术人员已知的。
本文所用的“分离的”意指基本上或基本上游离于天然状态下正常伴随它的成分的物质。例如“分离的多核苷酸”或“分离的寡核苷酸”，如本文所用的，指已纯化或天然存在的状态中移除位于它的侧面的序列的多核苷酸，例如已移除通常邻近该片段的序列的DNA片段。
“有效量”或“治疗上有效的量”指诸如反义寡聚物或RNA干扰剂(例如siRNA)的治疗化合物的量，给予哺乳动物个体单次剂量或一系列剂量的部分，其有效地产生理想的治疗效果。对反义寡聚物而言，通常通过抑制所选的靶序列的翻译或天然的剪接过程导致该效果。“有效量”，靶向感染的流感病毒，也涉及可降低感染病毒的复制率和/或病毒负荷，和/或与病毒感染相关症状的有效量。
本文所用的“增强(enhance)”或“增强(enhancing)”，或“增加(increase)”或“增加(increasing)”，或“激发(stimulate)”或“激发(stimulating)”，通常指一个或反义或RNAi化合物或组合物产生或引起细胞或个体内，与无反义化合物或对照的化合物相比，更强的生理反应(即下游效应)的能力。“增加的”或“增强的”量通常为“统计学意义的”量，并且可包括1.1,1.2,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,30,40,50或更多倍的(例如500,1000倍)(包括所有在1之间以及1以上的整数和小数点)，例如1.5,1.6,1.7.1.8等)无反义化合物(制剂缺乏)或对照的化合物所产生的量的增加。
术语“降低”或“抑制”通常可涉及本发明的一种或多种反义或RNAi化合物“减少”诸如疾病的症状或本文所述的状态，如根据诊断学领域中常规技术所测量的相关的生理或细胞的反应的能力。本领域中技术人员对生理或细胞的反应(体内或体外)是明确的，并且可以包括流感病毒感染的症状或病理学的减弱，或病毒复制或病毒负荷的减弱。与通过无反义化合物或对照的组合物所产生的反应相比，反应的“降低”可为“统计学意义的”，并且可以包括1%,2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%,12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%或100%降低，其包括这中间所有的整数。
术语“靶序列”指针对寡核苷酸或反义制剂所导向的靶RNA的一部分，即寡核苷酸通过互补序列的沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对与之杂交的序列。在某些实施方案中，靶序列可以为病毒的负链RNA或病毒的mRNA的连续区，或可以由病毒的基因组的或病毒的互补RNA的5’与3’末端的序列组成。
术语“靶向序列”或“反义靶向序列”指与RNA基因组中的靶序列互补的(意思是，另外，基本上互补的)寡核苷酸或其他的反义制剂中的序列。反义化合物的整条序列或只有一部分可与靶序列互补。例如，在具有20-30个碱基的寡核苷酸中，约6个,7个,8个,9个,10个,11个,12个,13个,14个,15个,16个,17个,18个,19个,20个,21个,22个,23个,24个,25个,26个,27个,28个或29个可为与靶区域互补的靶向序列。通常，靶向序列由连续碱基组成，但是可选择性地由非连续的序列组成，当放置在一起时，例如自寡核苷酸的另一端，组成跨越靶序列的序列。
可选择靶序列和靶向序列，从而使得反义化合物的结合将在以下区域内：1)负义病毒RNA的5’或3’末端的25个碱基；2)正义mRNA的5’或3’末端的末端30个碱基；3)病毒mRNA的AUG起始密码子周围的45个碱基，和/或4)受到选择性剪接的病毒mRNA的剪接供体或受体位点周围的50个碱基。在某些实施方案中，靶区域可包括1)负义的病毒RNA的M1或M2区域的5’或3’末端的25个碱基；2)正义的M1或M2mRNA的5’或3’末端的末端30个碱基；3)M1或M2mRNA的AUG起始密码子周围的45个碱基，和/或4)M1或M2病毒mRNA的剪接供体或受体位点周围的50个碱基。在某些实施方案中，靶区域可包含AUG密码子和病毒RNA的剪接供体位点周围或参与病毒RNA的剪接供体位点的碱基(例如M1或M2mRNA)，诸如多嘧啶区或套索形成序列。在某些实施方案中，利用单一的反义寡聚物或RNAi制剂以靶向AUG起始密码子与M1/M2RNA近侧的剪接供体序列(例如多嘧啶区)可提供协同效应，就降低靶蛋白表达，减少病毒复制或这两者而言。
当杂交发生在反平行构型中时，靶序列与靶向序列被描述为彼此“互补”。出于本发明的目的，靶向序列可具有与靶序列“近似的”或“实质的”互补性但是还发挥功能，即它可以仍然为功能性“互补的”。在某些实施方案中，寡核苷酸可具有10个核苷酸与靶序列至多1个错配，优选地20个至多1个错配。可选择地，寡核苷酸可具有与本文所述的示例性反义靶向序列至少90%序列同源性，并且优选至少95%序列同源性。
如果寡聚物与靶标在生理状态下杂交，并伴有基本上大于45°C，优选至少50°C，通常60°C-80°C或更高的Tm，那么寡核苷酸与靶多核苷酸“特异地杂交”。此类杂交优选对应严格的杂交状态。给定的离子强度和pH下，Tm为50%靶序列与互补的多核苷酸在该温度下杂交的温度。而且，此类杂交可以反义寡聚物与靶序列“近似的”或“实质的”互补性以及精确的互补性出现。
“同源性”指相同的或由保守取代组成的氨基酸的百分比数字。同源性利用诸如GAP的序列比较程序(Deveraux et al,1984,Nucleic Acids Research 12,387-395)可测定同源性。用这种方法，可通过缺口插入到比对中比较本文所引用的相似的或基本上不同的长度的那些，例如通过GAP所用的比较算法测定此类缺口。
如本文所用的，详述“序列同一性”或例如，包含“序列50%相同的”，指基于核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸，通过比较窗，序列为相同的程度。因此，“序列同一性百分比”可通过在比较窗(comparison window)中比较两条最佳比对的序列来计算，测定两条序列中存在相同的核苷酸碱基(例如A,T,C,G，I)或相同的氨基酸残基(例如Ala,Pro,Ser,Thr,Gly,Val,Leu,He,Phe,Tyr,Trp,Lys,Arg,His,Asp,Glu,Asn,Gin,Cys以及Met)的位置的数量以产生匹配位置的数量，匹配位置的数量除以参照序列中位置的总数(即窗口大小)，并将结果乘以100产生序列同一性百分比。
用于描述两条或多条多核苷酸或多肽间序列关系的术语包括“参照序列”、“比较窗(comparison window)”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”以及“实质同一性”。“参照序列”为至少8条或10条，但是时常15条-18条，经常至少25个单体单元，包括核苷酸和氨基酸残基长度。因为两个多核苷酸可各自包含(1)两条多核苷酸间相似的序列(即只有完整的多核苷酸序列的一部分)以及(2)两条多核苷酸间相异的序列，两条(或多条)多核苷酸间序列比较通常通过在比较窗(comparison window)内比较序列以确定和比较序列相似性的局部区域。“比较窗”指至少6个、通常约50个-约100个、更通常约100个-约150个连续位置的概念上的节段，其中在将两条序列进行最佳比对后，可将序列可与相同数量连续位置的参照序列进行比较。与用于两条序列的最佳比对的参照序列(其并不包含添加或缺失)比较，比较窗可包含约20%或更小的添加或缺失(即缺口)。用于比对比较窗的序列的最佳比对可通过计算机执行算法(威斯康辛遗传学软件包第7版中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group(GCG),575Science Drive Madison,WI,USA)或检查以及通过任一所选择的各种方法所产生的最好的比对(即通过比较窗导致最高的同源性百分比)来进行。作为一个实例，参考文献也通过Altschul et al,1997,Nucl.Acids Res.25:3389公开了所创造的程序的BLAST家族。序列分析的详细讨论可以在Ausubel et al,“CurrentProtocols in Molecular Biology”的19.3单元，John Wiley&Sons Inc,1994-1998,第15章(Chapter 15)中找到。
“耐核酸酶的”寡聚物分子(寡聚物)指其主链为基本上耐核酸酶分裂，非杂交的或杂交的形式；通过体内普遍的细胞外和细胞内核酸酶；即在寡聚物暴露于体内正常的核酸酶状态下寡聚物表现出很少或无核酸酶分裂。
“异源双链体”指反义寡核苷酸与靶RNA的互补部分间的双链体。“耐核酸酶的异源双链体”指通过反义寡聚物与它的互补靶标结合所形成的异源双链体，从而使得异源双链体为基本上耐细胞内或细胞外核酸酶的体内降解，诸如核糖核酸酶(RNAeH)，其能够切割双链的RNA/RNA或RNA/DNA复合物。
“涉及靶RNA的碱基特异的细胞内结合事件”指反义寡核苷酸与细胞内的靶RNA序列的特异结合。此类结合的碱基特异性为序列依赖的。例如，单链的多核苷酸能够特异地结合序列互补的单链的多核苷酸。
本文所用的术语“体液”包含从个体获得的各种样品类型，其包括尿液、唾液、血浆、血液、脊髓液或其他的诸如皮肤细胞或皮屑的生物学来源的样品，并且可指悬浮在其中的细胞或细胞片段，或液态介质以及它的溶质。
术语“相对量”用于试验测量与对照测量间进行比较之处。反应中形成复合物的试剂的相对量为相比较与对照样本反应的量，与试验样本反应的量。对照样本可在同一测定中单独地运行，或它可为同一样品的一部分(例如组织切片中恶性区域周围的正常组织)。
个体或细胞的“治疗”为作为改变个体或细胞中疾病或病理学的天然过程的方法所提供的任一类型的干预。治疗包括但不限于，例如，药物组合物，并且可预防性地或继启动病理学事件或接触病因学因子之后进行。治疗包括任一对疾病的症状或病理学或流感病毒感染相关状态有理想的影响。相对于被诊断为特殊病毒感染的患者，相关的术语“改进的治疗结果”可指病毒生长、或病毒负荷或可检测的那种特殊病毒感染相关症状减慢或减少。
还包括“预防的”治疗，其可针对降低疾病或被治疗的状态的进展率，延迟疾病或状态的发作，或减弱它发作的严重程度。“治疗”或“预防”不一定预示着疾病或状态，或其相关症状的彻底的根治，治愈或预防。
当制剂可以通过机制而不是被动扩散穿过细胞膜进入细胞。例如制剂可通过“主动转运”被转运，指制剂穿过哺乳动物细胞膜的转运，例如通过ATP依赖的转运机制，或通过“易化转运”，指反义制剂穿过细胞膜通过需要制剂与转运蛋白结合，然后该转运蛋白可使结合的制剂穿过膜的通道变得容易的转运机制的转运。对主动转运和易化转运而言，寡核苷酸对应物优选具有如下文所定义的基本上不带电荷的主链。
可选择地，反义化合物可配制成复合的形式，诸如具有与阳离子脂质或脂质体复合的阴离子主链的制剂，其可以通过内吞机制被摄入到细胞内。反义寡核苷酸也可以，例如在它的5’或3’末端，连接富精氨酸肽，诸如HIV TAT蛋白的部分、多聚精氨酸或连接精氨酸与其他的包括非天然的氨基酸、6-氨基己酸(Ahx)以及β-丙氨酸(PAla)的氨基酸组合。示例性的富精氨酸递送肽被列为SEQ ID NO:115-128。这些示例性的富精氨酸的递送肽促进转运至如所述的靶宿主细胞内(Moulton,Nelson et al.2004)。
因此，包括治疗流感病毒感染的方法，通过给予需要其的个体一种或多种本发明的反义寡聚物(例如SEQ ID NO:12-114及其变体)，任选地作为药物制剂的一部分或剂型。本文所用的“个体”可包括任一展现症状或处于展现症状的危险中的动物，其可用本发明的反义化合物治疗，诸如具有或处于具有流感病毒感染的危险中的个体。合适的个体(患者)包括实验室动物(诸如小鼠、大鼠、兔子或豚鼠)、农畜以及家畜或宠物(诸如猫或狗)。包括非人类的灵长类动物，优选人类患者。
还关注的是RNA干扰(RNAi)的替代方法，诸如涉及双链RNA分子或dsRNA那些。术语“双链的”意指两个单独的核酸链，其包含其中至少链的一部分为与氢键充分地互补并且形成双链体结构的部分。术语“双链体”或“双链体结构”指双链分子的区域，其中两个单独的链为基本上互补的，并且因此彼此杂交。
“dsRNA”指具有包含两个互补的并且反向平行的核酸链的双链体结构(即正义链和反义链)的核糖核酸分子。并非所有的dsRNA的核苷酸都必须显示沃森-克里克(Watson-Crick)碱基对；两个RNA链可以基本上互补的。RNA链可具有相同或不同数量的核苷酸。术语“dsRNA”还包括“siRNA”或小分子干扰核糖核酸(short interfering RNA)。
应理解的是术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”可以，在修饰的RNA或核苷酸替代的情况下，也指修饰的核苷酸或一个或多个位置上的替代置换部分。因此，dsRNA为或包括与靶RNA至少部分地互补的区域。在某些实施方案中，dsRNA与靶RNA为完全地互补的。不需要dsRNA与靶标之间存在完美的互补性，但是对应性必须足够以使dsRNA或其裂解产物能够指导序列特异的沉默，诸如通过靶RNA的RNAi裂解。与靶标链的互补性或同源性的程度在反义链中是最关键的。虽然有完美的互补性，尤其在反义链中，经常理想的是一些实施方案能够包括1个或多个但是优选6,5,4,3,2或更少的与靶RNA的错配。错配在末端区域中是最可接受的，并且如果存在，优选在一个末端区域或区域，例如5’和/或3’末端的6,5,4或3个核苷酸内。正义链仅需要与反义链基本上互补以维持总体的分子双链的特征。
如本文所用的，“修饰的dsRNA”指dsRNA分子，其包含至少一个改变从而使得它比识别同一靶RNA的相同的dsRNA分子更耐核酸酶(例如蛋白激酶)。修饰的dsRNA可包括单链的核苷酸悬垂和/或至少1个取代的核苷酸。
如本文所用的，“核苷酸悬垂”指未配对的核苷酸或当一条RNA链的3’末端延伸超过另一条互补链的5’末端，反之亦然时，从双链体结构突出的核苷酸。“平的”或“平末端”意指dsRNA的末端不存在没有配对的核苷酸，即没有核苷酸悬垂。“平末端的”dsRNA为双链超过它的全长的dsRNA，即分子的任一末端没有核苷酸悬垂。
如本文所用的术语“末端的碱基对”指双链分子的双链体区域的一个末端上的核苷酸碱基对。例如，如果dsRNA或其他的分子为平末端的(即没有核苷酸悬垂)，那么在分子两端的最后的核苷酸碱基对为末端的碱基对。在dsRNA或其他的分子在双链体结构的一端或两端具有核苷酸悬垂的地方，即刻邻近核苷酸悬垂的最后的核苷酸碱基对为在分子那一末端的末端的碱基对。
还包括能够表达本发明的寡聚物的，流感病毒靶向序列的载体递送系统，诸如表达包含任一个或多个SEQ ID NO:12-114的如本文所述的多核苷酸序列及其变体的载体，或表达与任一个或多个SEQ IDNO:1-11的靶序列互补的多核苷酸序列的载体。包括表达siRNA或其他的形成双链体的RNA干扰分子的载体。
本文所用的“载体”或“核酸构建体”意指多核苷酸分子，优选DNA分子，例如衍生于质粒、噬菌体、酵母或病毒，多核苷酸可以插入或克隆到其中。载体优选包含一个或多个唯一的限制性位点而且能够在确定的包括靶细胞或组织或前体细胞或其组织的宿主细胞中自主复制，或可与确定的宿主的基因组积分的从而使得所克隆序列为可复制的。因此，载体可以为自主复制载体，即载体以染色体外实体存在，其复制不受染色体复制的支配，例如，线性或闭环质粒，染色体外成分，微型染色体或人工染色体。载体可包含任一种用于保证自主复制的方法。可选择地，载体可以为一个，当其被引入到宿主细胞中时，它融入到基因组中并且与它所融入的染色体一起复制。
载体或核酸构建体系统可以包含单一的载体或质粒，两个或多个载体或质粒，其可共同包含全部DNA以被引入到宿主细胞的基因组或转位子中。载体的选择通常取决于载体与其将被引入到的宿主细胞的相容性。在目前的情况下，载体或核酸构建体优选在诸如肌细胞的哺乳动物细胞中可操作地功能性的一个。载体还可以包括诸如抗生素或耐药性基因或报告基因(即绿荧光蛋白，荧光素酶)的筛选标记，其可以用于筛选或鉴定合适的转化子或转染子。示例性递送系统可包括病毒的载体系统(即病毒介导的转导)，其包括但不限于逆转录病毒的(例如慢病毒)载体，腺病毒载体，腺相关的病毒载体以及疱疹病毒载体，除此以外本领域中已知的载体。
如本文所用的术语“可操作地连接”意指在启动子的调节控制下定位寡聚物编码序列，然后其控制寡聚物的转录。
野生型基因或基因产物为在群体中最频繁地观察到的那些，因此被任意地设计成“正常的”或“野生型”基因形式。
“烷基”指包含碳和氢的完全饱和的单价基，其可为支链的、直链的或环状的(环烷基)。烷基基团的实例为甲基、乙基、正丁基、叔丁基、正庚基、异丙基、环丙基、环戊基、乙基环戊基以及环己基。通常优选的为具有1个-6个碳原子的烷基基团，称为“低级烷基”，通过甲基、乙基、正丁基、异丁基、叔丁基、异戊基、正戊基以及异戊基示例。在一实施方案中，低级烷基指C1-C4烷基。
“烯基”指包含碳和氢的不饱和的单价基，其可为支链的、直链的或环状的。烯基基团可为单不饱和的或多不饱和的。通常优选的是具有1个-6个碳原子的烯基基团，称为“低级烯基”。
“炔基”指包含2个-18个碳的不饱和的直链或支链的烃基，其包含至少一个碳与碳的三键。实例包括但不限于乙炔基、丙炔基、异丙炔基、丁炔基、异丁炔基、叔丁炔基、戊炔基以及己炔基。术语“低级炔基”指如本文所确定的包含2个-8个碳的炔基基团。
“环烷基”指单个的或多个的环状的烷基。实例包括但不限于环丁基、环戊基、环己基、环庚基以及环辛基。
“芳基”指取代的或未取代的单价的芳基，通常具有单环(例如苯基)或两个缩合的环(例如萘基)。该术语包括杂环芳基基团，其为环中具有一个或多个氮、氧或硫原子的芳香环基团，诸如呋喃基、吡咯基以及吲哚基。本文所用的“取代的”意指芳基中一个或多个环上的氢被诸如氟、氯或溴的卤化物替换；被包含一个或两个碳原子的低级烷基替换；被硝基、氨基、甲氨基、二甲氨基、甲氧基、卤代甲氧基、卤代甲基或卤代乙基替换。优选的取代基包括卤素、甲基、乙基以及甲氧基。通常优选的是具有单环的芳基。
“芳烷基”指烷基，优选低级的(C1-C4，更优选C1-C2)烷基，其进一步地被芳基所取代；实例为苄基(CH2C6H5)以及苯乙基(-CH2CH2C6H5)。
“硫代烷氧基”指通式-SRc的基，其中Rc为如本文所定义的烷基基团。术语“低级硫代烷氧基”指如本文所定义的包含1个-8个碳的烷氧基。
“烷氧基”指通式-ORda的基，其中Rd为如本文所定义的烷基。术语“低级烷氧基”指如本文所定义的包含1个-8个碳的烷氧基。烷氧基的实例包括但不限于甲氧基和乙氧基。
“烷氧基烷基”指任一被烷氧基取代的烷基。
“羰基”指-C(=O)-基。
“脒基”指H2N(C=NH2)CH-基。
“氨基”指-NH2基。
“烷氨基”指通式-NHRd或-NRdRd基，其中每个Rd独立地为如本文所定义的烷基。术语“低级烷氨基”指如本文所定义的包含1个-8个碳的烷氨基。
“杂环”意指5-7元单价的或7-10元双价的杂环，其为饱和的、不饱和的或芳香族的，并且其包含1个-4个杂原子，该杂原子独立地选自氮、氧和硫，其中氮和硫杂原子可为任选地氧化的，并且氮杂原子可为任选地季胺化，其包括任一以上的杂环其中的双环与苯环融合。杂环可经由任一杂原子或碳原子被附加。优选地，环原子包括3个-6个碳原子。此类杂环包括，例如吡咯烷、哌啶、哌嗪以及吗啉。
杂环包括如下文所定义的杂环芳基。因此，除了下文所列的杂环芳基以外，杂环还包括吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、乙内酰脲基、戊内酰胺基、环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢嘧啶基、四氢噻喃基等。
“杂环芳基”意指5-10元芳香族杂环并且具有至少一个选自氮、氧和硫的杂原子，包含至少1个碳原子，包括单环和双环系统。代表性的杂环芳基为吡啶基、呋喃基、苯并呋喃基、苯硫基、苯并噻吩基、噻啉基、吡咯基、吲哚基、噁唑基、苯并噁唑基、咪唑基、苯并咪唑基、噻唑基、苯并噻唑基、异噁唑基、吡唑基、异噻唑基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、噌啉基、酞嗪基以及噻唑啉基。
就烷基、烯基、芳基、芳烷基或烷芳基而言，术语“取代的”指用含杂原子的取代基替换氢原子，诸如，例如卤素、羟基、烷氧基、巯基、烷巯基、氨基、烷氨基、亚氨基、含氧基(酮基)、硝基、氰基、或各种的酸或酯诸如羧基、磺酸或膦酸。
特别地就烷基、烷氧基、硫代烷氧基或烷氨基而言，术语“取代的”指用含杂原子的取代基替换碳上的氢原子，诸如，例如卤素、羟基、烷氧基、巯基、烷巯基、氨基、烷氨基、亚胺基、含氧基(酮基)、硝基、氰基、或各种的酸或酯诸如羧基、磺酸或膦酸。它也可以指用烷基、羰基或其他的含碳的基团。
在某些实施方案中，术语“任选地取代的烷基”、“任选地取代的烯基”、“任选地取代的烷氧基”、“任选地取代的硫代烷氧基”、“任选地取代的烷基氨基”、“任选地取代的低级烷基”、“任选地取代的低级烯基”、“任选地取代的低级烷氧基”、“任选地取代的低级硫代烷氧基”、“任选地取代的低级烷氨基”以及“任选地取代的杂环基”意指，当被取代时，至少一个氢原子被取代基替换。在含氧取代基(=0)的情况下，两个氢原子被替换。就这一点而言，取代基包括：氘、任选地取代的烷基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔基、任选地取代的芳基、任选地取代的杂环、任选地取代的环烷基、含氧基、卤素、-CN、-ORx、NRxRy、NRxC(=O)Ry、NRxSO2Ry、-NRxC(=O)NRxRy、C(=O)Rx、C(=O)ORx、C(=O)NRxRy、-SOmRx以及-SOmNRxRy，其中m为0,1或2，Rx和Ry为相同的或不同的，并且独立地氢、任选地取代的烷基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔基、任选地取代的芳基、任选地取代的杂环或任选地取代的环烷基并且所述的每个任选地取代的烷基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔基、任选地取代的芳基、任选地取代的杂环并且任选地取代的环烷基取代基还可以被一个或多个含氧基、卤素、-CN、-ORx、NRxRy、NRxC(=O)Ry、NRxSO2Ry、-NRxC(=O)NRxRy、C(=O)Rx、C(=O)ORx、C(=O)NRxRy、-SOmRx以及-SOmNRxRy。
能够抑制流感病毒基因组复制的靶向序列的选择如下文所讨论的。
靶病毒
本发明的实施方案基于，部分地，以下发现：单链的、节段的、负义的RNA病毒能够通过将感染流感病毒的动物暴露于反义寡核苷酸化合物而获得有效抑制，该反义寡核苷酸化合物(i)靶向1)负义的病毒RNA的5’或3’末端的25个碱基；2)正义的mRNA的5’或3’末端的末端30个碱基；3)病毒mRNA的AUG起始密码子周围的45个碱基，和/或；4)受到选择性剪接的流感病毒mRNA的剪接供体或受体位点周围的50个碱基以及(ii)具有允许反义化合物与宿主细胞内的病毒有效地相互作用的生理和药代动力学特征。
某些实施方案靶向具有(i)单链的，(ii)节段的以及(iii)负极性的RNA病毒。靶向病毒还合成两种不同的带有正极性的负义的病毒体RNA(vRNA)基因组的互补版本：1)用作负义病毒体RNA复制的模板的cRNA，以及2)用于病毒蛋白翻译的互补的正义的RNA(mRNA)。图3为显示这些不同的RNA种类和本发明中所述的反义PMO的靶标定位的示例性示意图。
靶向病毒家族包括正黏液病毒(Orthomyxoviridae)科的成员，其包括甲型流感病毒、乙型流感病毒以及丙型流感病毒属。例如在教科书Human Virology,R.Belshe,ed.,2ndEdition,Mosby,1991,at the Universal Virus Database of the InternationalCommittee on Taxonomy of Viruses(www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/index.htm)和人类病毒学教科书(例如见(Strauss and Strauss 2002))可以找到正黏液病毒科的成员的各种物理学的、形态学的以及生物学的特征。正黏液病毒科病毒的一些关键的生物学特征如下文所述。
甲型流感病毒、乙型流感病毒以及丙型流感病毒分别为甲型流感病毒、乙型流感病毒以及丙型流感病毒属的唯一成员。这些病毒为膜包裹的病毒，它们的基因组为RNA的节段的负义(负的)链((-)RNA)。10个流感病毒基因存在于甲型与乙型株的单链的RNA的8个节段，丙型株的7个节段上。节段大小不同(890个-2341个核苷酸长度)并且每个都是用于不同的mRNA合成的模板。流感病毒病毒体包含从这些模板合成mRNA所必需的病毒特异的核糖核酸聚合酶(RNApolymerases)，并且缺少此类特异的聚合酶时，流感病毒RNA的负链没有感染性。当流感病毒mRNA聚合酶从细胞的mRNA或mRNA前体的5’末端减少12个-15个核苷酸，并且使用借来的寡核苷酸作为引物时，mRNA转录的启动发生。该过程被称为“帽抢(cap-snatching)”，因为它占据了病毒mRNA上的5’帽结构。通常，mRNA完成该过程编码唯一的蛋白。M基因与NS基因病毒RNA节段也编码用于剪接mRNA，这导致了产生两个不同的蛋白用于这两个节段的每个。
流感病毒RNA的复制发生在细胞核中并且涉及三种不同RNA的合成。该过程的示意图显示于图3中。初始细胞感染后，负链病毒体RNA(vRNA)被转运到细胞核，该细胞核为利用通过来源于去帽的细胞的前体信使RNA(pre-mRNA)分子(即帽抢(cap-snatching))的编码病毒的酶所裂解的5’末端的10个-13个核苷酸引物合成注定用于翻译的RNA(mRNA)之处。每个mRNA的合成继续靠近基因组节段的末端，在该处遇到寡聚(U)延伸以及添加多聚(A)尾。专用的病毒mRNA被转运到细胞质用于翻译并且在充足的病毒蛋白被转运后回到细胞核后，启动注定用于初期病毒体的vRNA的合成。合成vRNA的精确的抗基因组拷贝(成为cRNA)，其为基因组vRNA的完美的互补并且用作用于新的vRNA产生的模板。流感病毒复制期间所合成的不同RNA示意性地显示于图3中。
用于代表甲型流感病毒基因组节段的示例性病毒核酸靶序列的GenBank登录号列举在下文的表1中。表1中的核苷酸序列号码来源于针对正链RNA的GenBank登录号。应理解的是这些序列只是正黏液病毒科中其他序列的例证，这可能从文献或专利资源的可获得的基因-序列数据库中为可获得的。鉴定为SEQ ID NO:l-11的下文的序列，也列举在本说明书最后的序列表中。
表1列举了针对甲型流感病毒基因的靶标，基因组节段7所编码的M1与M2。表1中的靶序列代表：1)负义病毒RNA(SEQ ID NO:4)的3’末端的25个碱基；2)正义mRNA(SEQ ID NO:3)的5’末端的末端25个碱基；3)指示的流感病毒基因(SEQ ID NO:2)的AUG起始密码子周围的45个碱基。所示的序列为5’-3’方向的正链(即抗基因组的或mRNA)序列，除了SEQ ID NO:4以外，其为负链序列(即基因组的或病毒体RNA)。很明显地是当靶标为负链vRNA时，靶向序列为表1中所列的序列的互补，除非另有说明，例如SEQ ID NO:4。
M1与M2蛋白各自为病毒基质蛋白和离子通道活性的组分。这两种蛋白产生于利用相同的AUG起始位点的vcRNA节段7的选择性剪接形式。M2蛋白为两种当前的抗流感病毒疗法，金刚烷胺(amantadine)与金刚烷乙胺(rimantadine)的靶标。M1/M2基因的用于AUG起始密码子区域(-20-+25相对于AUG起始密码子)的示例性靶序列表示为SEQID NO:2，其为列为SEQ ID NO:1的末端的60个核苷酸区域的子序列。M1/M2节段的3’末端的靶序列(25个核苷酸)表示为SEQ ID NO:3，其也是末端的60个核苷酸区域的子序列并且能够靶向节段的正链(vcRNA)与负链(vRNA)。5’末端的序列(SEQ ID NO:3)可以成功地靶向如下文所示的SEQ IDNO:4的负链。SEQ ID NO:1-4来自于2009HIN1病毒(S-OIV)并且衍生于病毒的示例性分离，该病毒可在GenBank数据库中登录号GQ332646下找到。其他参照的甲型流感病毒亚型的5’末端的60个核苷酸区域列举于表1中，针对H1N1,H5N1,H3N2以及H2N2，分别为SEQ ID NO:5,6,7,8。利用上文所述的指导，相应的AUG和末端的靶区域可衍生于这些病毒序列。
将M1/M2节段的剪接供体及受体区域作为靶标也是可能的。剪接供体及剪接受体位点分别位于核苷酸51和740。关注利用本发明的反义化合物靶向于任一剪接点。而且，利用适当地设计的反义化合物(例如SEQ ID NO:12-16以及19-22)阻断AUG起始位点和剪接供体位点是可能的。下文显示了针对2009H1N1(S-OIV)亚型的作为SEQ ID NO:10的剪接受体靶区域。针对H5N1亚型的相应区域作为SEQ ID NO:9列举于表1中，
而且，应关注的是利用本发明的化合物可以靶向于任一M1/M2节段的翻译敏感的、剪接敏感的或复制敏感的区域。针对原型的H1N1亚型(Puerto Rico/8/34)的参照的M1/M2(节段7)序列作为SEQ ID NO:11显示于表1中，并且可以在GenBank参照序列数据库NC002016下找到。相应的M1/M2节段序列可自公众可获得的序列数据库获取。应关注的是本发明的反义化合物可靶向于该节段的其他区域，期待可以鉴定额外的翻译、剪接和/或复制敏感的靶区域。
表1：示例性的流感病毒核酸靶序列
图4A显示了来自于重要的甲型流感病毒亚型：H1N1,HlNl(S-OIV),H5N1,H3N2,H9N2以及H7N7的M1/M2节段的5’末端的60个核苷酸的保守。图4B显示了流感病毒的一个重要的血清型，H1N1(2009)，也称为猪源性的甲型流感病毒(S-OIV)中的针对基于基因组序列的NCBI流感病毒数据库的优选的PMO(M1/M2-AUG；SEQID NO:12)的每个碱基的靶序列的保守(Bao Y.,P.Bolotov,D.Dernovoy,B.Kiryutin,L.Zaslavsky,T.Tatusova,J.Ostell,andD.Lipman.The Influenza Virus Resource at the National Center forBiotechnology Information.J.Virol.2008Jan;82(2):596-601)。大写字母表示靶碱基并且紧挨着碱基的下标表示如上述的序列所表示的，针对数据库中H1N1(2009)分离的那个碱基的保守百分比。这些数据表明针对用于H1N1(2009)的M1/M2-AUG靶标，没有碱基位显示出任何有意义的变异。
在某些实施方案中，反义靶向序列被设计为与表1中所列举的一个或多个靶序列的区域杂交。挑选的反义靶向序列可以制造得短一些，例如约12个碱基，或更长，例如约40个碱基，并且包括少量的错配，只要序列充分地互补以影响与靶标杂交并且与病毒的RNA形成具有45°C或更高的Tm的异源双链体的翻译的、剪接和/或复制抑制。
在某些实施方案中，靶标与反义靶向序列间的互补性的程度足以形成稳定的双链体。反义寡聚物与靶RNA序列的互补性区域可短至8个-11个碱基，但是优选12个-15个碱基或更多，例如12个-20个碱基或12个-25个碱基，包括这些范围间所有的整数。约14个-15个碱基的反义寡聚物通常足够长以具有病毒基因组中唯一的互补序列。在某些实施方案中，要求互补碱基的最小长度以实现如下文所讨论的必需的结合Tm。
在某些实施方案中，长至40个碱基的寡聚物可能是适合的，其中至少最小数量的碱基，例如10个-12个碱基，与靶序列互补。然后，通常细胞中促进或主动摄取最佳的是寡聚物长度小于约30个碱基。就下文进一步所述的PMO寡聚物而言，结合稳定性与摄取的最佳的平衡发生在18个-25个碱基的长度。包括在内有反义寡聚物(例如PNA，LNA，2’-OMe)以及由约10个,11个,12个,13个,14个,15个,16个,17个,18个,19个,20个,21个,22个,23个,24个,25个,26个,27个,28个,29个,30个,31个,32个,33个,34个,35个,36个,37个,38个,39个或40个碱基组成的PMO寡聚物，其中至少约6个,8个,9个,10个,11个,12个,13个,14个,15个,16个,17个,18个,19个,20个,21个,22个,23个,24个,25个,26个,27个,28个,29个,30个,31个,32个,33个,34个,35个,36个,37个,38个,39个或40个连续的或非连续碱基与SEQ IDNO:1-11或其变体的靶序列互补。
在某些实施方案中，反义寡聚物可与病毒核酸靶序列100%互补，或例如它可以包括错配以适应变体，只要寡聚物与病毒核酸靶序列间形成的异源双链体足够稳定以耐受细胞核酸酶的作用以及可能发生在体内的其他的降解模式。下文讨论了不易受核酸酶裂解的寡聚物主链。错配，如果存在，对杂交双链体的末端区域比中间区域的不稳定更小。所允许的错配的数量取决于寡聚物的长度、双链体中G:C碱基对的百分比以及错配在双链体中的位置，根据易懂的双链体稳定性的原理。尽管此类反义寡聚物未必与病毒核酸靶序列100%互补，但是它对稳定地及特异性结合靶序列是有效的，从而使得核酸靶标的生物学活性，例如病毒蛋白的表达，被调整。
寡聚物与靶序列间形成的双链体的稳定性为结合Tm的功能以及双链体对细胞酶裂解的敏感性。就互补的序列RNA而言，可通过常规方法，诸如Hames et al,Nucleic AcidHybridization,IRL Press,1985,pp.107-108所描述的那些或如Miyada C.G.andWallaceR.B.,1987,Oligonucleotide Hybridization Techniques,MethodsEnzymol.Vol.154pp.94-107中所描述的，测量反义化合物的Tm。在某些实施方案中，就互补的序列RNA而言，反义寡聚物可具有比体温高的结合的Tm，并且优选高于约45°C或50°C。优选处于60-80°C范围或更高的Tm，根据熟知的原理，就基于互补的RNA杂交而言，可通过增加双链体中C:G配对的碱基的比率和/或通过增加异源双链体的长度(碱基对)增长寡聚物化合物的Tm。同时，出于使细胞摄取最佳化的目的，限制寡聚物的大小应是有利的。因此，显示在25个碱基或更小的长度上高Tm(45-50°C或更高的)的化合物通常优选越过要求针对高Tm值大于25个碱基那些。
在某些实施方案中，诸如PMO寡聚物，可通过利用如图1B中示例的不带电荷的与阳离子的磷二酰胺的混合物增强寡聚物的反义活性。寡聚物中阳离子键的总数可自1-10(包括在中间所有的整数)变化，并且可在寡聚物各处插入。优选地，带电荷的键的数量为至少2个并且不超过全部主链键的一半，例如在2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个带正电荷的键间，并且优选通过至少1个、2个、3个、4个或5个不带电荷的键沿着主链分隔每个带电荷的键。可通过将寡聚物靶区域与5’末端报告基因(例如萤火虫荧光素酶)融合在体外，然后测量融合基因mRNA转录在无细胞翻译测定中的翻译的抑制测量各种寡聚物的反义活性。包含不带电荷的与阳离子的键的混合物的寡聚物的抑制特性在无细胞翻译测定中可增强大约5-100倍。优选的本发明的反义寡聚物(M1/M2-AUG)显示为下文表2中SEQ ID NO:13，其以包含如图1B和图2中所例证的三种阳离子键，遍及寡聚物插入的形式呈现。靶向于M1/M2AUG并且包含三个插入的阳离子键的一系列示例性反义寡聚物显示为SEQ ID NO:34-47。
下文的表2显示了与甲型流感病毒互补的5’-3’方向的示例性靶向序列。所列举的序列提供了一批靶向序列，根据上文所讨论的常规分类规则，可自其中选择靶向序列。尽管所列举的靶向序列可用于任何反义对应寡核苷酸化学(例如PNA、LNA或2’-OMe)，表2中的序列优选用作PMO反义寡聚物。SEQ ID NO:12-22,25-29以及34-47与病毒的正链(mRNA或vcRNA)反义而SEQ ID NO:23和24与负链(vRNA)反义。因此，例如在选择靶向M1/M2编码节段(甲型流感病毒的节段7)的负链的3’末端中，可以选择SEQ ID NO:4或有效阻断负链的3’末端的功能的序列的一部分。SEQ ID NO:12-29以及34-47靶向甲型流感病毒亚型H1N1(S-OIV)的M1/M2节段而SEQ ID NO:30-33靶向如所示的PB1或NP节段。
表2.示例性反义靶向序列
反义寡核苷酸化合物
如上文详述的，反义寡核苷酸(术语“反义”指靶向病毒的正义链RNA或负义或负链的化合物)通常包含靶向于区域的碱基序列，该区域包括下列的一个或多个：1)负义病毒RNA的5’或3’末端的25个碱基；2)正义vcRNA的5’或3’末端的末端30个碱基；3)病毒mRNA的AUG起始密码子周围的45个碱基，和/或4)受到选择性剪接的流感病毒mRNA的剪接供体或受体位点周围的50个碱基。另外，当将其给予宿主细胞，例如，在受感染的哺乳动物个体中时，寡聚物能够，诸如通过降低靶蛋白表达(例如M1或M2或两者)，通过减少病毒复制，或通过降低靶蛋白表达(例如M1或M2或两者)以及减少病毒复制有效地靶向感染病毒。当寡聚物化合物(a)具有被哺乳动物细胞主动摄取的能力，和(b)一旦被摄取，就与靶RNA形成带有高于约45°C的Tm的双链体时，通常就满足该要求。
在某些实施方案中，寡聚物主链可基本上不带电荷的，并且优选可被公认为是用于活化或促进穿过细胞膜转运的基质。寡聚物与靶RNA形成稳定的双链体的能力也与寡聚物主链的其他特征有关，其包括就靶标而言反义寡聚物的互补性的长度和程度，G:C与A:T碱基匹配的比率以及任一错配的碱基的位置。反义寡聚物耐细胞核酸酶的能力可促进存活以及制剂至细胞质的最终的递送。利用PMO主链化学，本发明的示例性反义寡聚物靶向序列列举于上文的表2中。利用可选择的化学方法，靶向序列列举于下文的表3和4，分别用于PNA和LNA化学方法。通常，由于它们与PMO和2’O-Me寡聚物比较有相对高的靶标结合能力，PNA和LNA化学方法利用更短的靶向寡聚物。
肽核酸(PNA)为DNA的对应物，其中主链在结构上与脱氧核糖主链同型，由N-(2-氨乙基)甘氨酸单元组成，嘧啶或嘌呤碱基附加于其上。包含天然的嘧啶与嘌呤碱基的PNA服从沃森-克里克碱基配对规则与互补的寡核苷酸杂交以及在碱基配对识别方面模拟DNA(Egholm,Buchardt et al.1993)。PNA的主链通过肽键而不是磷酸二酯键所形成，这使得它们非常适于反义应用(见下文的结构)。主链为不带电荷的，这导致PNA/DNA或PNA/RNA双链体展现出比正常的热稳定性更高。PNA不被核酸酶或蛋白酶所识别。
可利用本领域中已知的技术合成地产生PNA。PNA为DNA对应物，其中聚酰胺主链取代了DNA传统的磷酸核糖环，如下文所例证的。
尽管存在着基团结构与天然的结构的变化，但是PNA在双链形式中能够序列特异地结合DNA或RNA。PNA的特征包括与互补的DNA或RNA的高结合亲和力，单个的碱基错配所引起的不稳定效应，耐核酸酶和蛋白酶，与DNA或RNA不依赖于盐浓度的杂交以及与同型DNA所形成的三链体。PANAGENETM已研发了它的BtsPNA单体(Bts；苯并噻唑-2-磺酰基)的发明专利以及寡聚过程的发明专利。利用BtsPNA单体的PNA寡聚过程由脱保护、连接以及帽化的重复循环组成。该技术的示例性发明专利包括美国专利申请第6,969,766,7,211,668,7,022,851,7,125,994,7,145,006以及7,179,896号。教导PNA化合物制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利申请第5,539,082;5,714,331;以及5,719,262号，在此通过引用将每一个并入本文。PNA化合物的进一步的教导可在Nielsen et al,Science,254:1497-1500,1991中找到。
用于实践本发明的示例性PNA化合物列举于下文的表3中。基本上可根据本文所引用的参考文献中阐明的程序制备这些寡核苷酸。
表3.示例性PNA反义靶向序列
本发明的寡核苷酸化合物也可包含“锁核酸”亚基(LNA)。LNA的结构可在，例如Wengel,et al,Chemical Communications(1998)455;Tetrahedron(1998)54:3607和Accounts of Chem.Research(1999)32:301);Obika,et al.,Tetrahedron Letters(1997)38:8735;(1998)39:5401以及Bioorganic Medicinal Chemistry(2008)16:9230中找到。非限制的示例性LNA结构如下文所例证：
本发明的化合物可包含一个或多个LNA；在一些情况下，化合物可完全地由LNA组成。用于合成单独的LNA核苷亚基以及它们整合到寡核苷酸的方法是本领域中已知的：美国专利申请第7,572,582,7,569,575,7,084,125,7,060,809,7,053,207,7,034,133,6,794,499以及6,670,461号。典型的亚基间键包括磷酸二酯和硫代磷酸部分；可选择地，可应用含非磷的键。优选的实施方案为包含其中每个LNA亚基被DNA亚基分隔的化合物的LNA。还优选的化合物由交互的LNA与DNA亚基组成，其中亚基间键为硫代磷酸的。
基本上根据上文所引用的参考文献中阐明的程序制备下列的化合物。包含LNA亚基(LNA为大写的，DNA为小写的并且序列读取为5’-3’)的示例性化合物显示于下列的表4中。
表4.示例性LNA反义靶向序列
LNA名称 序列(5’-3’) SEQ ID NO
LNA-AUG1 CgGtTaGaAgAcTcAtCtTt 63
LNA-AUG2 GaAgAcTcAt 64
LNA-AUG3 GAaGaCtCAT 65
LNA-AUG4 GAAGACTCAT 66
LNA-AUG5 AGAAGACTCA 67
LNA-AUG6 TAGAAGACTC 68
LNA-AUG7 TTAGAAGACT 69
LNA-AUG8 AAGACTCATC 70
LNA-AUG9 AGACTCATCT 71
LNA-AUG10 gAcTcAtCtT 72
LNA-AUG11 ACTCATCTTT 73
LNA-AUG12 CgGtTaGaAgAcTcAt 74
LNA-AUG13 GtTaGaAgAcTcAt 75
LNA-AUG14 GTTAGAAGACT 76
LNA-AUG15 CATCTTTAAAT 77
LNA-AUG16 CaTcTtTaAaTaTcTaC 78
LNA-AUG17 CGGTTAGAAGACTCAT 79
LNA-AUG18 GGTTAGAAGACTCATC 80
LNA-AUG19 GTTAGAAGACTCATCT 81
LNA-AUG20 TTAGAAGACTCATCTT 82
LNA-AUG21 TAGAAGACTCATCTTT 83
LNA-AUG22 AGAAGACTCATCTTTA 84
LNA-AUG23 GAAGACTCATCTTTAA 85
LNA-AUG24 AAGACTCATCTTTAAA 86
LNA-AUG25 AGACTCATCTTTAAAT 87
LNA-AUG26 GACTCATCTTTAAATA 88
LNA-AUG27 ACTCATCTTTAAATAT 89
LNA-AUG28 CTCATCTTTAAATATC 90
LNA-AUG29 TCATCTTTAAATATCT 91
LNA-AUG30 CATCTTTAAATATCTA 92
LNA-AUG31 ATCTTTAAATATCTAC 93
LNA-AUG32 TCTTTAAATATCTACC 94
LNA-AUG33 CTTTAAATATCTACCA 95
LNA-AUG34 TTTAAATATCTACCAG 96
LNA-AUG35 CgGgT aGaAgAcTcAt 97
LNA-AUG36 GgTtAgAaGaCtCaTc 98
LNA-AUG37 GtTaGaAgAcTcAtCt 99
LNA-AUG38 TtAgAaGaCtCaTcTt 100
LNA-AUG39 TaGaAgAcTcAtCtTt 101
LNA-AUG40 AgAaGaCtCaTcTtTa 102
LNA-AUG41 GaAgAcTcAtCtTtAa 103
LNA-AUG42 AaGaCtCaTcTtTaAa 104
LNA-AUG43 AgAcTcAtCtTtAaAt 105
LNA-AUG44 GaCtC aTcTtTaAaTa 106
LNA-AUG45 AcTcAtCtTtAaAtAt 107
LNA-AUG46 CtCaTcTaTaAaTaTc 108
LNA-AUG47 TcAtCtTtAaAtAtCt 109
LNA-AUG48 C aTcTtTaAaTaTcTa 110
LNA-AUG49 AtCtTtAaAtAtCtAc 111
LNA-AUG50 TcTtTaAaTaTcTaCc 112
LNA-AUG51 CtTtAaAtAtCtAcCa 113
LNA-AUG52 TtTaAaTaTcTaCcAg 114
优选的寡聚物结构应用通过如上文所述的不带电荷的键连接的产生碱基配对部分的基于吗啉基的亚基。特别优选的为基本上不带电荷的磷二酰胺连接的吗啉基寡聚物。吗啉基寡核苷酸，其包括反义寡聚物，例如详述于共同拥有的美国专利申请第5,698,685,5,217,866,5,142,047,5,034,506,5,166,315,5,185,444,5,521,063以及5,506,337号和PCT申请US2008/012804号，在此通过引用将所有的专利申请清楚地并入。
基于吗啉亚基的某些特性包括：通过稳定的、不带电荷的主链键被连接在寡聚物形式中的能力；支持核苷酸碱基(例如腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或尿嘧啶)的能力从而使得所形成的多聚物可以与互补碱基的靶核酸杂交，其包括具有高Tm，甚至短至10个-14个碱基的寡聚物的靶RNA；寡聚物被主动转运至哺乳动物细胞的能力；以及寡聚物：RNA异源双链体耐受核糖核酸酶降解的能力。
具有含磷的主链键的吗啉基寡核苷酸的实例例证于图1A-1C。特别优选的是磷二酰胺连接的吗啉基寡核苷酸，如图1B中所示，其根据本发明的一方面，被修饰以包含位于优选地10%-15%它的主链键上的带正电荷的基团，包括例如反义寡核苷酸详述于(Summertonand Weller,1997)以及共同拥有的美国专利申请第5,698,685,5,217,866,5,142,047,5,034,506,5,166,315,5,185,444,5,521,063和5,506,337号，PCT申请第US2008/012804号，所有这些通过引用并入。带有带电荷的主链键和/或修饰的末端基团的包括反义寡核苷酸的示例性吗啉基寡核苷酸，详述于PCT专利申请US2007/011435号，未决的美国临时专利申请61/349,783号以及未决的美国临时专利申请61/361,878号，在此通过引用将每一个全文并入。
基于吗啉基的亚基的特性包括：1)通过稳定的、不带电荷的或带正电荷的主链链连接在寡聚物形式的能力；2)支持核苷酸碱基(例如腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶以及次黄嘌呤)的能力从而使得所形成的多聚物可以与互补碱基的靶核酸杂交，包括靶RNA、相对短的寡核苷酸(例如10个-15个碱基)中高于约45°C的Tm值；3)寡核苷酸被主动或被动地转运到哺乳动物细胞的能力；以及4)反义寡核苷酸：RNA异源双链体分别耐受核糖核酸酶和核糖核酸酶降解的能力。
用于所要求主题的反义寡核苷酸的示例性主链结构包括图1D-1G中所示的吗啉亚基类型，其每个都通过不带电荷的或带正电荷的含磷的亚基键连接。图1D显示了含磷的键，其形成了五个原子重复单元的主链，其中吗啉基环通过1-原子磷酰胺键连接。图1E显示了产生6-原子重复单元主链的键。在该结构中，连接5’吗啉基碳至磷酸基团的原子Y可为硫、氮、碳或优选地氧。来自于磷的X部分悬垂可为氟、烷基或取代的烷基、烷氧基或取代的烷氧基、硫代烷氧基或取代的硫代烷氧基、或未取代的、单取代的或双取代的氮，其包括环状结构，诸如吗啉或哌啶。烷基、烷氧基以及硫代烷氧基优选地包括1个-6个碳原子。Z部分为硫或氧，并且优选氧。
图1F和1G中所示的键为设计用于7-原子单元-长度的主链。结构1F中，X部分为如结构1E中，并且Y部分可为亚甲基、硫或优选地氧。结构1G中，X与Y部分为如结构1E中。特别优选的吗啉基寡核苷酸包括由图1E中所示的形式的吗啉亚基结构组成的那些，其中X=NH2、N(CH3)2或1-哌嗪或其他的带电荷的基团，Y=0，并且Z=0。
如上所述，根据本发明的一方面，基本上不带电荷的寡核苷酸可被修饰以包括带电荷的键，例如多达约1个/每2个-5个不带电荷的键，诸如约4-5个/每10个不带电荷的键。在某些实施方案中，当约25%主链键为阳离子的时，可见到反义活性的最佳的改进。在某些实施方案中，可见到带有少量，例如10-20%阳离子的键或其中阳离子键的数量在50-80%范围内，诸如约60%的增强。
额外进行的支持本发明的实验表明所见到的带有附加的阳离子的主链电荷可，在一些情况下，通过分配靠近反义寡核苷酸的“中心区”主链键的大多数电荷，例如在带有8个阳离子的主链键的20个单体的寡核苷酸中，具有集中于10个最里面的键的至少70%这些带电荷的键，进一步地增强。
在某些实施方案中，可通过逐步地固相合成，应用上文所引用的参考文献中详述的方法以及下文关于具有混合物或不带电荷的和阳离子的主链键的寡核苷酸的合成制备反义化合物。在一些情况下，理想的是添加额外的化学部分至反义化合物，例如以增强药代动力学或促进化合物的捕获或检测。根据标准的合成方法，此类部分通常可共价附加至寡聚物的末端。例如，聚乙二醇部分或其他的亲水聚合物例如一个具有10个-100个单体的亚基的添加可用于增加溶解度。一个或多个带电荷的基团，例如阴离子的带电荷的基团诸如有机酸，可增强细胞摄取。
报告基因部分，诸如荧光素或放射性标记的基团，可出于检测的目的而被附加其上。可选择地，附加于寡聚物的报告基因标记可为配体，诸如抗原或生物素，能够结合标记的抗体或链霉亲和素。在选择用于反义化合物附加或修饰的部分中，通常理想的是选择为生物相容性的并且很可能被没有不良副作用的个体所耐受的基团的化学化合物。
如上文所述，某些反义化合物可被构建成包含精选数量的被上文所述类型的不带电荷的键插入的阳离子键。亚基间键，不带电荷的和阳离子的，优选为含磷的键，其具有以下结构：
其中
W为S或O，并且优选为O，
X=NR1R2或OR6，
Y=O或NR7，
以及每个所述的寡聚物中的键选自：
(a)不带电荷的键(a)，其中R1、R2、R6和R7各自独立地为选自氢和低级烷基；
(b1)阳离子键(b1)，其中X=NR1R2，Y=O，并且NR1R2代表任选地取代的哌嗪基，从而使得R1R2=-CHRCHRN(R3)(R4)CHRCHR-，其中
每个R独立地为H或CH3，
R4为H、CH3或电子对，以及
R3选自H、低级烷基，例如CH3、C(=NH)NH2、Z-L-NHC(=NH)NH2和[C(O)CHR'NH]mH，其中Z为C(O)或直键，L为任选的长度达18个原子，优选长度达12个原子并且更优选长度达8个原子的连接体，具有选自烷基、烷氧基和烷氨基的键。R’为天然存在的氨基酸或其1个或2个碳同系物的侧链，以及m为1-6，优选1-4；
(b2)阳离子键(b2)，其中X=NR1R2，Y=O，R1=H或CH3，并且R2=LNR3R4R5，其中L、R3和R4如上文所定义的，R5为H、低级烷基或低级(烷氧基)烷基；以及
(b3)阳离子键(b3)，其中Y=NR7，X=OR6，R7=LNR3R4R5，其中L、R3、R4和R5如上文所定义的，R6为H或低级烷基；
以及至少一个所述的键选自阳离子键(b1)、(b2)和(b3)。
在某些实施方案中，寡聚物可包括至少两个连续类型(a)的键(即不带电荷的键)。在另一实施方案中，寡聚物中至少5%键为阳离子键(即类型(b1)、(b2)或(b3))；例如，10%-60%并且优选地20-50%键可为阳离子键。
在一实施方案中，至少一个键为类型(b1)，其中优选地，每个R为H，R4为H、CH3或电子对，R3选自H、低级烷基，例如CH3、C(=NH)NH2以及C(O)-L-NHC(=NH)NH2。R3的后两个实施方案提供了胍基部分，每个各自直接附加至哌嗪环或连接体基团L悬垂。为了便于合成，R3中可变的Z优选如所示的C(O)(羰基)。
如上文所述，连接体基团L包含选自烷基(例如-CH2-CH2-)、烷氧基(-C-O-)以及烷氨基(例如-CH2-NH-)的主链中的键，前提条件是L中的末端原子(例如邻近羰基或氮的那些)为碳原子。尽管支链键(例如-CH2-CHCH3-)是可能的，连接体优选无支链的。在一实施方案中，连接体为碳氢化合物连接体。此类连接体可具有结构-(CH2)n-，其中n为1-12，优选2-8并且更优选2-6。
吗啉亚基具有结构：
其中Pi为碱基配对的部分并且上文所述的键将(i)的氮原子连接至邻近亚基的5’碳。碱基配对的部分Pi可以为相同的或不同的，并且通常被设计为提供结合靶核酸的序列。
上文(b1)、(b2)和(b3)类型的键的实施方案用于连接吗啉亚基可用图表例证如下：
优选地，所有寡聚物中的阳离子键为相同的类型，即所有都是类型(b1)，所有都是类型(b2)或所有都是类型(b3)。
在另一实施方案中，阳离子键选自如下文所示的键(b1’)和(b1”)，其中(b1”)在本文中被称作“Pip”键以及(b1”)在本文中被称作“GuX”键：
在上文的结构中，W为S或O，并且优选O；R1与R2均独立地选自氢和低级烷基，并且优选甲基；A代表氢或(b1’)和(b1”)中一个或多个碳原子上的互不干扰的取代基。优选地，哌嗪环中的环碳原子为未取代的；然而，它们可以包括互不干扰的取代基，诸如甲基或氟。优选地，至多一个或两个碳原子为如此取代的。在另一实施方案中，至少10%键为类型(b1’)或(b1”)；例如，10%-60%并且优选20%-50%键可为类型(b1’)或(b1”)。
在某些实施方案中，寡聚物不包含上文类型(b1’)的键。可选择地，寡聚物不包含类型(b1)的键，其中每个R为H，R3为H或CH3并且R4为H、CH3或电子对。
吗啉亚基也可通过基于非磷的亚基间键连接，如下文所进一步所述的，其中至少一个键被如上文所述的悬垂的阳离子基团修饰。
可使用其他的寡核苷酸对应物键，其在它们未修饰的状态中为不带电荷的但是其也可带有悬垂的胺取代基。例如，吗啉环上的5’氮原子可应用于磺酰胺键或脲键(其中磷分别被碳或硫替换)并且以对应于上文结构(b3)中5’氮原子的形式被修饰。
提供了具有任何数量的阳离子键的寡聚物，其包括完全地阳离子连接的寡聚物。然而，优选地，寡聚物为部分带电荷的，例如具有10%-80%。在优选的实施方案中，约10%-60%，并且优选20%-50%键为阳离子的。
在一实施方案中，沿着主链插入阳离子键。部分带电荷的寡聚物优选包含至少两个连续的不带电荷的键；即，寡聚物优选沿着其全长不具有严格的交替模式。
还考虑具有阳离子键块和不带电荷的键块的寡聚物。例如，不带电荷的键的中心块与阳离子键块从侧面连接或反之亦然。在一实施方案中，寡聚物具有大约等长5’，3’和中心区，并且中心区内阳离子键的百分比大于约50%，优选大约约70%。
用于反义应用的寡聚物通常长度范围在约10个-约40个亚基，更优选约10个-30个亚基并且通常为15个-25个碱基。例如，本发明的具有对于反义化合物有用的长度的19个-20个亚基的寡聚物理想地可具有2个-10个，例如4个-8个阳离子键以及剩余的不带电荷的键。具有14个-15个亚基的寡聚物理想地可具有2个-7个，例如3个、4个或5个阳离子键以及剩余的不带电荷的键。
每个吗啉环结构支持碱基配对部分以形成碱基配对部分的序列，其通常设计为与细胞或被治疗的个体中选择的反义靶标杂交。碱基配对部分可为天然DNA或RNA(例如A,G，C,T或U)或诸如次黄嘌呤(次黄嘌呤核苷的碱基组分)或5-甲基胞嘧啶的对应物中找到的嘌呤或嘧啶。
肽转运蛋白
在某些实施方案中，本发明的反义化合物可包括连接至富精氨酸肽转运部分的寡核苷酸，该肽转运部分有效增强化合物至细胞的转运。转运部分可附加至寡聚物的末端，例如如所示的，在图1C中。肽转运部分优选地包含6个-16个选自X’亚基、Y’亚基以及Z’亚基的亚基，其中
(a)每个X’亚基独立地代表赖氨酸、精氨酸或精氨酸对应物，所述的对应物为包含R1N=C(NH2)R2结构的侧链的阳离子的氨基酸，其中R1为H或R；R2为R、NH2、NHR或NR2，其中R为低级烷基或低级烯基并且还可包括氧或氮；R1与R2可共同来自于一个环；并且侧链经由R1或R2连接至所述的氨基酸；
(b)每个Y’亚基独立地代表中性氨基酸-C(O)-(CHR)n-NH-，其中n为2-7并且每个R独立地为H或甲基；以及
(c)每个Z’亚基独立地代表具有中性烷基侧链的氨基酸；
其中肽包含被(X’Y’X’)P、(X’Y’)m、(X')m以及(X’Z’Z’)p其中之一所代表的序列，其中p为2-5并且m为2-9。某些实施方案包括各种独立地选自(X’YX’)P、(X’Y’)m、(X’)m和/或(X’Z’Z’)p的组合物，例如其包括具有序列(X’YX’)、(X’Z’Z’)、(X’Y’X’)和/或(X’Z’Z’)(SEQ ID NO:129)的肽。
在选择的实施方案中，对每个X’而言，侧链部分为胍基，如氨基酸亚基精氨酸(Arg)中。在另一实施方案中，每个Y’为-CO-(CH2)n-CHR-NH-，其中n为2-7并且R为H。例如，当n为5并且R为H时，Y’为6-氨基己酸亚基，本文缩写为Ahx；当n为2并且R为H时，Y’为β-丙氨酸亚基，本文缩写为B。某些实施方案涉及具有不同中性氨基酸组合的载体肽，例如其包括包含序列-RAhxRRBRRAhxRRB RAhxB-(SEQ ID NO:124)的肽，该肽包含β-丙氨酸和6-氨基己酸。
该类型的优选的肽包括包含被单一的Y’亚基相间的精氨酸二聚物，其中Y’优选Ahx。实例包括具有通式(RY’R)P或通式(RRY’)P的肽，其中Y’优选Ahx。在一实施方案中，Y’为6-氨基己酸亚基，R为精氨酸并且p为4。
某些实施方案包括各种直线的至少两个(RY’R)P与(RRY’)P的组合，例如包括具有序列(RY’R)(RRY’)(RY’R)(RRY’)(SEQ ID NO:130)或(RRY’)(RY’R)(RRY’)(SEQ ID NO:131)的例证的肽。关注其他的组合。在另一例证的实施方案中，每个Z’为苯丙氨酸并且m为3或4。
连接的肽优选经由连接体Ahx-B连接至寡聚物的末端，其中Ahx为6-氨基己酸亚基并且B为β-丙氨酸亚基，例如如图1C中所示。肽与寡聚物间的可选择的连接体包括甘氨酸和半胱氨酸。这些与相关的连接体可通过酰胺键或二硫键连接。
在选择的实施方案中，对每个X’而言，侧链部分独立地为选自由胍基12-氨基二氢嘧啶基、2-氨基三氢嘧啶基、2-氨基嘧啶基以及2-氨基嘧啶酮基组成的基团，并且它优选选自胍基和脒基。在一实施方案中，侧链部分为胍基，如在氨基酸亚基精氨酸(Arg)中。
在某些实施方案中，Y’亚基可为连续的，在其中X’亚基插入至Y’亚基，或个别地散布在X’亚基间。在某些实施方案中，连接的亚基可在Y’亚基间。在一实施方案中，Y’亚基位于转运蛋白的末端；在其他的实施方案中，它们通过X’亚基从侧链连接。在进一步优选的实施方案中，每个Y’为-CO-(CH2)n-CHR-NH-，其中n为2-7并且R为H。例如，当n为5并且R为H时，Y’为6-氨基己酸亚基，本文缩写为Ahx。
在该基团的选择的实施方案中，每个X’包含胍基侧链部分，如在精氨酸亚基中。该类型优选的肽包括包含单一的Y’亚基相间的精氨酸二聚物的那些，其中Y’优选Ahx。实例包括具有通式(RY’R)4(SEQ IDNO:132)或通式(RRY’)4(SEQ ID NO:133)的肽，其中Y’优选Ahx。在后一种情况下，核酸对应物优选连接至末端的Y’亚基，优选位于C末端，例如如图1C中所示。一个示例性连接体具有结构AhxB，其中Ahx为6-氨基己酸亚基并且B为β-丙氨酸亚基。可选择的连接体包括半胱氨酸和甘氨酸。
本文所述的转运部分已显示了相对于在附加的转运部分不存在的情况下寡聚物的摄取以及相对于通过缺乏疏水性亚基Y’的附加的转运部分，极大地增强附加的寡聚物进入细胞。此类增强的摄取优选被化合物至哺乳动物细胞的摄取中至少两倍的增加并且优选四倍的的增加，相对于通过缺乏疏水性亚基Y’的附加的转运部分的制剂的摄取，所证实。相对于未连接的化合物，摄取优选增强至少20倍，并且更优选40倍。
转运部分的另一个优势是它的稳定反义化合物与它的靶核酸序列间双链体的预期能力，大概借助带正电荷的转运部分与带负电荷的核酸间静电相互作用。转运蛋白中带电荷的亚基的数量少于14个，如上文所述，并且优选8个-11个。
富精氨酸肽转运蛋白的使用(即细胞穿透肽)在实践本发明的某些实施方案中特别有用。某些肽转运蛋白已显示出高效递送反义化合物至包括造血细胞与肌细胞的初始细胞(Marshall,Oda etal.2007;Jearawiriyapaisarn,Moulton et al.2008;Wu,Moulton etal.2008)。而且，与其他的已知的诸如Penetratin和Tat肽的肽转运蛋白比较，本文所述的肽转运蛋白，当与反义PMO连接时，展现出改变几个基因转录的剪接的增强的的能力(Marshall,Oda et al.2007)。这些研究中示例性肽包括P007(SEQ ID NO:118),CP04057(SEQ ID NO:123)以及CP06062(SEQ ID NO:124)。
示例性肽转运蛋白，包括连接体(B、AhxB、C或G)，如下文表5中所给予的。在某些实施方案中，表5中所列举的示例性肽转运蛋白可以通过二硫键或酰胺键连接至PMO。
表5.示例性肽转运蛋白
肽 序列(N末端至C末端) SEQ ID NO：
rTAT RRRQRRKKRC 115
R9F2C RRRRRRRRRFFC 116
R5F2R4C RRRRRFFRRRRC 117
(RAhxR)4AhxB；(P007) RAhxRRAhxRRAhxRRAhxRAhxB 118
R8C RRRRRRRRC 119
R9C RRRRRRRRRC 120
R8G RRRRRRRRG 121
R9G RRRRRRRRRG 122
(RAhxR)5AhxB(CP04057) RAhxRRAhxRRAhxRRAhxRRAhxRAhxB 123
(RAhxRRBR)2AhxB；(CP06062) RAhxRRBRRAhxRRBRAhxB 124
(RAR)4F2C RARRARRARRARFFC 125
(RGR)4F2C RGRRGRRGRRGRFFC 126
R9F2G RRRRRRRRRFFG 127
R9F2XB RRRRRRRRRFFAhxB 128
RNA干扰剂
也可通过各种基于RNA干扰的方法靶向于本文所述的流感病毒靶区域(例如M1、M2；SEQ ID NO:1-11)。RNA干扰(RNAi)为进化上保守的基因剪接机制，最初在秀丽隐杆线虫(nematode Caenorhabditis elegans)的研究(Lee et al.,Cell 75:843,1993;Reinhartet al.,Nature403:901,2000)中发现。通过引入dsRNA至表达适当的分子机械(molecularmachinery)的细胞，然后降解相应的内源性mRNA而触发RNA干扰。机制涉及dsRNA转换至短的RNA，该短的RNA引导核糖核酸酶至同源的mRNA靶标(例如通过Ruvkun,Science 2294:797,2001所总结的)。
在某些实施方案中，本文所提供的方法可利用双链的核糖核(dsRNA)分子如调制子，用于减少流感病毒复制，诸如通过M1或M2蛋白表达干扰。dsRNA通常包含两条单一的链。dsRNA的一条链包含基本上与靶基因或靶区域的一部分相同的核苷酸序列(“有意义的”链)而另一条链(“互补的”或“反义”链)包含基本上与靶区域的一部分互补的序列。链足以互补杂交以形成双链体结构。在某些实施方案中，互补的RNA链可小于30个核苷酸，小于25个核苷酸的长度，或甚至19个-24个核苷酸的长度。在某些方面，互补的核苷酸序列可为20个-23个核苷酸的长度或22个核苷酸的长度。
在某些实施方案中，至少一条RNA链包含1个-4个核苷酸长度的核苷酸悬垂。在其他的实施方案中，dsRNA还可包含至少一个化学上修饰的核苷酸。在某些方面，包含1个-4个核苷酸的单链悬垂的dsRNA可包含一个其中单链悬垂的未配对的核苷酸包含嘌呤碱基的分子，该未配对的核苷酸直接邻近末端的核苷酸对。在其他的方面，dsRNA两个末端上最后一个互补的核苷酸对为G-C对或至少最后四个末端的核苷酸对的两个为G-C对。
本发明的某些实施方案可包含微RNA(micro-RNA)。微RNA代表一大组生物体中天然产生的小RNA，其中一些调节靶基因的表达。微RNA由大约70个核苷酸单链的发卡状前体转录产物通过Dicer构成(V.Ambros et al.Current Biology 13:807,2003)。微RNA并不翻译成蛋白，但是反而结合特异的信使RNA，从而阻断翻译。据认为微RNA碱基对与它们的靶标不严密地以抑制翻译。某些微RNA可被转录为发卡状RNA前体，其然后通过Dicer酶被处理成它们的成熟形式。
在某些实施方案中，调节剂或RNAi寡核苷酸为单链的。在其他的实施方案中，调节剂或RNAi寡核苷酸为双链的。某些实施方案也可应用短的干扰RNA(siRNA)。在某些实施方案中，双链的寡核苷酸的第一条链比第二条链包含多两个核苷残基。在其他的实施方案中，第一条链和第二条链具有相同数量的核苷；然而，第一条链和第二条链为抵消的从而使得在第一条和第二条链上的两个末端的核苷与互补链上的残基为不配对的。在某些情况下，不配对的两个核苷为胸腺嘧啶核苷。
当调节剂包含siRNA时，制剂应包括与靶区域足够同源的区域，并且在核苷酸方面具有足够的长度，从而使得siRNA制剂或其片段可以介导靶RNA的下调。应懂得术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”可以，在修饰的RNA或核苷酸替代的情况下，也指修饰的核苷酸或一个或多个位置上的替代置换部分。因此，siRNA制剂为或包括一个至少部分地与靶RNA互补的区域。不需要siRNA制剂与靶标间存在完美的互补性，但是对应性必须足以使siRNA制剂或其裂解产物能够引导序列特异的剪接，诸如通过靶RNA的RNAi裂解。互补性或与靶链的同源性的程度为反义链中最关键的。虽然特别在反义链中有完美的互补性，还是经常要求一些实施方案包括一个或多个但是优选10,8,6,5,4,3,2或更少的错配，就靶RNA而言。末端区域中的错配是最可以接受的，并且如果存在的话，优选在末端区域中，例如5端和/或3’末端的6,5,4或3个核苷酸内。有意义链只需要与反义链足够地互补性以维持分子的总体双链特征。
另外，siRNA调节剂可被修饰或包括核苷替代。siRNA制剂的单一链区域可被修饰或包括核苷替代，例如未配对的区域或发卡状区域，例如连接两个互补的区域的区域可以具有修饰或核苷替代。使一个或多个siRNA制剂的3’-或5’-末端稳定的修饰，例如耐受核酸外切酶或有利于反义siRNA制剂进入RISC也是有用的。修饰可以包括C3(或C6,C7,C12)氨基键，巯基键、羰基键、非核苷酸间隔区(C3、C6、C9、C12、脱碱基的、三甘醇、六乙二醇)、特殊的生物素或荧光素试剂，其尽可能是亚磷酰胺并且具有另一个DMT保护的羟基以允许RNA合成期间多重连接。
siRNA剂可包括，例如，长到可以触发干扰素反应(其可被Dicer所裂解(Bernsteinet al,Nature,409:363-366,2001)并且进入RISC(RNAi诱导的沉默复合体)的分子，除了足够短的它们不触发干扰素反应的分子(其分子也可被Dicer裂解和/或进入RISC)以外，例如允许进入RISC的大小一样的分子，例如类似于Dicer裂解产物的分子。短到它们不触发干扰素反应的分子在本文被称为siRNA剂或较短的RNAi剂。如所用的“siRNA剂或较短的RNAi剂”指足够短的siRNA剂，其在人体细胞中不诱导有害的干扰素反应，例如，它具有小于60个但是优选地小于50个、40个或30个核苷酸对的双链的区域。siRNA调节剂或其裂解产物可以下调靶基因，例如，通过诱导RNAi，就靶RNA而言，优选诸如M1或M2的流感病毒靶RNA。
siRNA调节剂的每条链可以等于或小于35个,30个,25个,24个,23个,22个,21个或20个核苷酸长度。链优选至少19个核苷酸长度。例如，每条链可在21个-25个核苷酸长度。优选的siRNA剂具有17个,18个,19个,29个,21个,22个,23个,24个或25个核苷酸对的双链体区域，以及一个或多个悬垂，优选2个-3个核苷酸的一个或两个3个悬垂。
除了靶RNA同源性和下调靶基因的能力以外，siRNA调节剂可具有一个或多个下列的特性：尽管有甚至非常大量或所有核苷的修饰，它可具有在适当的三维框架中显示碱基(或修饰的碱基)的反义链，以便能够形成正确的碱基对并且形成与同源的靶RNA的双链体结构，其足以允许下调靶标，例如通过靶RNA的裂解；尽管有甚至非常大量或所有核苷的修饰，它仍然具有“RNA样”特性，即它可具有RNA分子的总体结构、化学以及物理学特性，即使不是唯一地或甚至部分地基于核苷酸的内容物。例如，siRNA剂可包含，例如，有意义的和/或反义链，其中所有的核苷酸糖都包含，例如取代2代羟基的2’氟。该含脱氧核苷酸的制剂仍然可期待展现RNA样的特性。虽然不希望被理论所束缚，当被附加至核糖的C2的位置时，带负电荷的氟优选轴向定位。氟的空间优选性转而又促进糖采用C3’末端折叠。这与在RNA分子中所观察到的折叠模式是一样的，并且产生RNA特征的A族类型螺旋。而且，既然氟为良好的氢键结合受体，那么它可以参与相同的氢键结合与水分子的相互作用，该相互作用为稳定RNA结构。通常优选地是2’糖位置上的修饰部分将能够进入到氢键，其核苷酸的OH部分比脱氧核苷酸的H部分更表征化。
本文所用的“单链的RNAi剂”为由单一的分子所组成的RNAi剂。可包括通过链内配对所形成的双链体区域，例如它可以为或包括发卡状或盘手柄状结构。单链的RNAi调节剂优选反义，就靶分子而言。单链的RNAi剂应足够长从而使得它可以进入RISC并且参与RISC介导的靶mRNA的裂解。单链的RNAi剂为至少14个，更优选至少15个、20个、25个、29个、35个、40个或50个核苷酸长度。优选小于200个、100个或60个核苷酸长度。
发卡状RNAi调节剂可具有等于或至少17个,18个,19个,29个,21个,22个,23个,24个或25个核苷酸对的双链体区域。双链体区域可优选等于或小于200个、100个或50个核苷酸长度。某些针对双链体区域的范围为15个-30个、17个-23个、19个-23个以及19个-21个核苷酸对长度。发卡可具有单链的悬垂或末端未配对的区域，优选3悬并且优选发卡的反义侧。在某些实施方案中，悬垂为2个-3个核苷酸长度。
根据本文所提供的方法所利用的某些调节剂可包含RNAi寡核苷酸诸如嵌合的寡核苷酸或“嵌合体”，其包含两个或多个化学上的不同区，每个都由至少一个单体单元，即就寡核苷酸化合物而言一个核苷酸组成。这些寡核苷酸通常包含至少一个区域，其中寡核苷酸被修饰以便赋予寡核苷酸增强的对核酸酶降解的耐受性，增强的细胞摄取和/或增强的对靶核酸的结合亲和力。因此，经常用较短的寡核苷酸获取可比较的结果，当使用嵌合的寡核苷酸时，与硫代磷酸的寡脱氧核苷酸比较。嵌合的寡核苷酸可形成两个或多个如上文所述的寡核苷酸、修饰的寡核苷酸、寡核苷酸和/或寡核苷酸模拟体的复合结构。此类寡核苷酸在本领域中也被称为杂交体或博弈体。
教导此类杂交结构制备的代表性美国专利申请包括但不限于美国专利申请5,013,830,5,149,797,5,220,007,5,256,775,5,366,878,5,403,711,5,491,133,5,565,350,5,623,065,5,652,355,5,652,356,5,700,922以及5,955,589号，在此通过引用将每一专利申请并入。在某些实施方案中，嵌合的寡核苷酸为RNA-DNA，DNA-RNA，RNA-DNA-RNA，DNA-RNA-DNA或RNA-DNA-RNA-DNA，其中寡核苷酸长度在5个-60个核苷酸。
在本发明的一方面，诸如RNAi剂的调节剂涉及包含至少一个系于改变的或非天然的核碱基的配体的寡核苷酸。大量的化合物可具有改变的碱基的功能。改变的碱基的结构对于改变的碱基不应基本上阻止寡核苷酸与它的例如mRNA的靶标结合具有重要的意义。在某些实施方案中，改变的碱基为二氟代基、硝基吡咯基、硝基咪唑基、硝基吲哚基、萘炔基、蒽基、吡啶基、喹啉基、芘基或任一本文所述的非天然的核碱基的二阶基。在某些实施方案中，非天然的核碱基为二氟代基、硝基吡咯基或硝基咪唑基。在某些实施方案中，非天然的核碱基为二氟代基。广泛多样的配体为本领域中已知的并且可经得起本发明的检验。例如，配体可为类固醇、胆汁酸、脂质、叶酸、吡哆酸、B 12、核黄素、生物素、芳香族化合物、多环化合物、冠醚、嵌入剂、剪切分子、蛋白结合剂或碳水化合物。在某些实施方案中，配体为类固醇或芳香族化合物。在某些实施方案中，配体为胆甾醇基。
在其他的实施方案中，出于改进细胞的靶向及摄取的目的，RNAi剂为系于配体的寡核苷酸。例如，RNAi剂可系于抗体或其抗原结合片段。作为额外的实例，RNAi剂可系于诸如多肽或多肽片段的特异的配体结合分子，该配体结合分子特异地结合特定的细胞表面受体。
在其他的实施方案中，调节剂包含非天然的核碱基。在某些实施方案中，非天然的核碱基为二氟代基、硝基咪唑基、硝基吲哚基或硝基吡咯基。在某些实施方案中，本文所提供的调节剂涉及双链的寡核苷酸序列，其中只有两条链的一条包含非天然的核碱基。在某些实施方案中，本文所用的调节剂涉及双链的寡核苷酸序列，其中两条链独立地包含至少一个非天然的核碱基。
在某些情况下，天然出现在核苷中的核糖部分被己糖替换。在某些方面，己糖为阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古罗塘、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖或其衍生物。在一优选的实施方案中，己糖为右型己糖。在某些情况下，天然出现在核苷中的核糖部分被多环的异烷基环或环己烯基替换。在某些情况下，多环的异烷基为环中含有一个氧原子的二环。在某些情况下，多环的异烷基为二环的(2.2.1)庚烷、二环的(3.2.1)辛烷或二环的(3.3.1)壬烷。在某些实施方案中，寡核苷酸的主链已被修饰以改进寡核苷酸化合物的治疗或诊断的特性。在某些实施方案中，寡核苷酸的至少一个碱基或至少一个糖已被修饰以改进寡核苷酸化合物的治疗或诊断的特性。当寡核苷酸为双链时，这两条链为互补的，部分互补的或嵌合的寡核苷酸。
预想用于本发明的方法所使用的修饰的RNAi剂的实例包括含修饰的主链或非天然的核苷内键的寡核苷酸。如此处所定义的，具有修饰的主链或核苷内键的寡核苷酸包括主链中保留一个磷原子的那些以及主链中没有磷原子的那些。它们的糖内主链中没有磷原子的修饰的寡核苷酸也可被认为是寡核苷酸。下文描述了特有的寡核苷酸化学修饰。不一定需要给定化合物中所有的位置都被一致地修饰，并且实际上，不只一个的下列修饰可并入至单一的寡核苷酸化合物或甚至其单一的核苷酸。
修饰的核苷内键或主链的实例包括，例如，硫代磷酸酯、嵌合的硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、包括3’烯基磷酸酯和嵌合的磷酸酯的甲基及其他的烷基磷酸酯、次磷酸酯、包括3’氨基磷酰胺酯的磷酰胺酯以及氨烷基磷酰胺酯、巯代磷酰胺酯、巯代烷基磷酰胺酯、巯代烷基磷酸三酯以及具有正常的3’-5’键的硼烷磷酸、这些的2’-5’连接的对应物以及具有反相极性的那些，其中邻近的核苷单元对连接为3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’。还包括各种盐、混合的盐以及游离酸的形式。
教导上述含磷原子键制备的代表性美国专利申请包括但不限于美国专利申请第3,687,808,4,469,863,4,476,301,5,023,243,5,177,196,5,188,897,5,264,423,5,276,019,5,278,302,5,286,717,5,321,131,5,399,676,5,405,939,5,453,496,5,455,233,5,466,677,5,476,925,5,519,126,5,536,821,5,541,306,5,550,111,5,563,253,5,571,799,5,587,361,5,625,050以及5,697,248号，在此通过引用将每一个专利申请并入。
其中不包括磷原子的修饰的核苷内键或主链(即寡核苷酸)的实例具有通过短链烷基或环烷基的糖内键、混合的杂原子与烷基或环烷基糖内键、或一个或多个短链杂原子的或杂环的糖内键所形成的主链。这些包括具有吗啉键(部分地形成于核苷的糖部分)的那些；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲乙酰基和巯代甲乙酰基主链；甲烯甲乙酰基和巯代甲乙酰基主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；氨基主链以及具有混合的N、O、S的其他主链和3/4组分部分。
教导上述的寡核苷酸制备的代表性美国专利申请包括但不限于美国专利申请第5,034,506,5,166,315,5,185,444,5,214,134,5,216,141,5,235,033,5,264,562,5,264,564,5,405,938,5,434,257,5,466,677,5,470,967,5,489,677,5,541,307,5,561,225,5,596,086,5,602,240,5,610,289,5,602,240,5,608,046,5,610,289,5,618,704,5,623,070,5,663,312,5,633,360,5,677,437以及5,677,439号，在此通过引用将每一个专利申请并入。
在寡核苷酸模拟物的其他实例中，糖与核苷内键，即核苷单元的主链可被新的基团替换。保持核碱基单元与适当的核酸靶化合物杂交。此类的一个寡核苷酸，已显示具有极好的杂交特性的寡核苷酸模拟物被称为肽核酸(PNA)。PNA化合物中，寡核苷酸的糖主链被含氨基的主链，特别是氨基乙基甘氨酸主链替换。保留后面的核碱基并且直接或间接地结合主链的酰胺部分的原子。教导PNA化合物制备的代表性美国专利申请包括但不限于美国专利申请第5,539,082,5,714,331以及5,719,262号，在此通过引用将每一个专利申请并入。PNA化合物的更进一步的教导可以在Nielsen et al.,Science,1991,254,1497中找到。
本发明还包括应用核糖酶的寡核苷酸。催化高度特异的核糖核酸内切酶活性的合成的RNA分子及其衍生物被称为核糖酶(通常见美国专利申请第5,543,508号-Haseloff etal以及美国专利申请第5,545,729号-Goodchild et al)。通过RNA分子它们自己催化裂解反应。天然存在的RNA分子中，自催化的裂解的位点位于RNA二级结构的高度保守的区域内(Buzayan et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83:8859-62,1986;Forster et al,Cell.50:9-16,1987)。天然存在的自身催化的RNA分子已被修饰以产生核糖酶可靶向于特定的带有高度特异性的细胞的或病原的RNA分子。因此，核糖酶出于相同的通用用途，用作反义寡核苷酸(即特异基因的表达的调节)以及，像寡核苷酸，为具有单链的重要的一部分的核酸。
在某些情况下，用于供本文所提供的方法的使用的RNAi剂可通过非配体基团被修饰。许多非配体的分子已与寡核苷酸连接以便增强寡核苷酸的活性，细胞定位，细胞靶向或细胞摄取并且用于进行此类的连接的程序在科学文献中可获得的。此类非配体部分已包括脂质部分，诸如胆固醇(Letsinger et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:6553-56,1989)、胆酸(Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.4:1053,1994)、硫醚、例如己基-5-三苯甲基(Manoharan et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,660:306,1992;Manoharan et al,Bioorg.Med.Chem.Let.,3:2765,1993)、巯基胆固醇(Oberhauser et al.,Nucl.AcidsRes.,20:533,1992)、脂肪链、例如十二基或十一基残基(Saison-Behmoaras et al.,EMBOJ.10:111,1991;Kabanov et al,FEBS Lett.259:327,1990;Svinarchuk et al.,Biochimie.75:49,1993)、磷脂、例如二-十六基-外消旋-丙三醇或三乙胺l,2-双-O-十六基-外消旋-甘油酸-3-氢-磷酸酯(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett,36:3651,1995;Shea et al,Nucl.Acids Res.18:3777,1990)，多胺或聚乙二醇链(Manoharan et al,Nucleosides&Nucleotides.14:969,1995)或金刚烷乙酸(Manoharan et al.,TetrahedronLett.36:3651,1995)，棕榈基部分(Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta.1264:229,1995)或十八烷基胺或己胺-羰基-羟胆甾醇部分(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.277:923,1996)。教导此类寡核苷酸连接制备的代表性美国专利申请已列举在上文。典型的连接协议涉及产生序列的一个或多个位置上的氨基键的寡核苷酸的合成。然后利用适当的匹配的或活化的试剂，氨基与连接的分子起作用。可与仍然结合于固相载体的寡核苷酸或溶液相中核苷酸的下列的裂解进行连接反应。通过HPLC连接的寡核苷酸的纯化通常提供纯化的连接。
诸如RNAi寡核苷酸的调节剂的额外的实例可在美国专利申请第2007/0275465,2007/0054279,2006/0287260,2006/0035254,2006/0008822号找到，通过引用将这些专利申请并入。
抑制流感病毒复制
上文详述的反义化合物在抑制正黏液病毒科的单链的、负义的、节段的RNA病毒的复制中有用。在一实施方案中，此类抑制为有效治疗被这些病毒感染的宿主细胞。因此，方法包含，在一实施方案中，用有效抑制特定的病毒复制的反义制剂接触被病毒感染的细胞。在该实施方案中，在合适的药物载体中给予被给定的病毒感染的、例如人类或家畜的哺乳动物个体反义制剂。值得关注的是反义寡核苷酸阻止RNA病毒在宿主中生长。RNA病毒可在数量上降低或被对宿主的正常生长或发育几乎没有或无损害效应去除。
在如实例所述的本发明中，磷酰二胺吗啉基寡核苷酸(PMO)，设计用于与甲型流感病毒的M1/M2基因节段(即节段7)杂交，被评估它们在两个动物模型中抑制流感病毒产生的能力。PMO与短的富精氨酸肽连接以促进进入细胞或被做成含阳离子键的PMOplusTM化合物。化合物靶向于M1基质蛋白(M1)的AUG翻译起始位点和离子通道蛋白(M2)，这两个利用M1/M2mRNA的可选择的剪接形式，表达于相同的AUG起始密码子。
本发明的M1/M2-AUG靶向的反义化合物导致如实施例1中所述的病毒滴度在H3N2的小鼠模型中的抑制。本发明的M1/M2-AUG靶向的化合物也证明了如实施例2中所述的减少的流感感染的临床体征以及降低的洗鼻液中的在2009H1N1(S-OIV)全国流行的猪流感的雪貂模型中的病毒滴度。因此，本文示例的反义寡核苷酸和RNAi剂可用于病毒感染所引起的那些治疗中，主要地是由正黏液病毒科的单链的、负义的、节段的RNA病毒所引起的那些治疗中。
本发明的实施方案也包括组合疗法和相关的组合物。例如，本文提供的抗病毒的(即病毒靶向的)反义寡核苷酸和RNAi剂可用于宿主分子靶向的反义寡核苷酸或RNAi剂的组合。就这一点而言，宿主免疫应答基因和/或它的受体的反义或RNAi靶向可用于改进免疫应答并且因此预防或降低随后的感染，无论病毒的还是细菌的(例如继发性细菌感染)。作为一个实例，已表明CD200/R-/-小鼠没有发展到流感病毒感染继发的败血症。CD200为固有性免疫应答的负调节剂，通常导致固有性免疫应答下调。因此，某些治疗方法可包括给予反义和/或RNAi剂靶向编码CD200和/或CD200受体的宿主RNA分子(例如见Hatherly et al,Eur J Immunol.34:1688-94,2004)与给予任一或多个本文所述的流感病毒靶向的反义剂的组合(同时地或单独地)。还包括的是包含靶向CD200和/或CD200受体的反义或RNAi剂的组合物(例如靶向于它的AUG起始密码子或剪接位点)与如本文所述的靶向流感病毒的反义或RNAi剂的组合。这些方法和组合可用于治疗独立的流感病毒感染和/或与流感病毒感染相关继发性细菌感染(例如链球菌肺炎(Streptococcal pneumonia))。
本发明的实施方案也包括用于治疗病毒感染(例如流感病毒感染)伴随继发性细菌感染的组合疗法。1918-1919年流感大流行中死亡案例的大多数很可能起因于由普通的上呼吸道细菌所引起的继发性细菌肺炎，诸如链球菌肺炎，并且最近的来源于2009年H1N1大流行的证据显示继发性细菌感染依然为死亡的重要原因(例如见Louie et al,ClinInfect Disease.50:e59-62,2010;Jain et ah,N Engl J Med.361:1935-44,2009;Jamieson et al,Cell Host Microbe.7:103-14,2010)。对链球菌肺炎的护理标准包括抗生素。主要的抗生素包括诸如盘尼西林(penicillin)和阿莫西林(amoxicillin)的杀菌的β-内酰胺剂，二线制剂包括头孢菌素(cephalosporins)以及三线制剂包括氯霉素(chloramphenicol)或克林霉素(clindamycin)。因此，本发明的实施方案包括与一种或多种抑菌的或杀菌的抗生素(例如盘尼西林、阿莫西林、头孢菌素、氯霉素、克林霉素)给药(同时地或单独地)与本文所提供的一种或多种流感病毒靶向的反义或RNAi剂组合相关方法和组合物，主要用于治疗或处理流感病毒感染相关继发性细菌感染。
作为另一个实例，本发明的反义寡核苷酸和RNAi剂可与其他的诸如磷酸奥司他韦的流感病毒靶向的疗法组合给予(同时地或单独地)。在某些方面，一种或多种反义寡核苷酸(例如AVI-7100)与奥司他韦的组合可以相对于奥司他韦单独的或抗病毒的反义寡核苷酸单独的使用，获得在降低流感病毒滴度和/或其他的流感病毒感染的症状(例如肺泡炎、侵润性免疫细胞)方面的协同效应。还包括包含奥司他韦与本文所述的靶向流感病毒的抗病毒的反义寡核苷酸或RNAi剂组合的组合物。在具体的实施方案中，这些组合物和方法可以用于治疗否则耐受奥司他韦的流感病毒感染。
感染因子的鉴定
通过本领域中已知的方法，例如血清学的或培养的方法可检测引起感染的特定病毒。
血清学鉴定应用病毒样品或自生物学样本分离的培养物，例如个体的唾液粪便、尿液、脑脊液、血液等。通常通过本领域中技术人员常规应用的方法，例如ELISA或蛋白印迹法(Western blot)进行用于病毒检测的免疫测定。另外，针对特定的病毒株或物种的单克隆抗体为商购可获得的。
培养方法可用于分离以及鉴定特定的病毒类型，通过应用包括但不限于比较特征，诸如各种培养状态下生长速度和形态学的技术。
用于鉴定受感染的个体中病毒感染因子的另一个方法应用来自于生物学样本的分离的RNA，随后利用特异的PCR引物扩增核酸，该引物将疑似的病毒因子作为靶标，例如季节性H1N1流感病毒，大流行的H1N1S-OIV，H5N1禽流感或H3N2猪流感。
制剂和给药
在某些实施方案中，本发明提供了适于本文所述的反义寡聚物的治疗递送的制剂或组合物。因此，在某些实施方案中，本发明提供了药学上可接受的组合物，其包含一种或多种本文所述的寡聚物治疗上有效的量，与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂配制在一起。虽然本发明的寡聚物单独给药是可能的，但是优选地是给予作为药物制剂的化合物(组合物)。
用于核酸分子递送的方法例如，描述于Akhtar et al.,1992,Trends Cell Bio.,2:139；以及反义寡核苷酸疗法的递送策略(Delivery Strategies for AntisenseOligonucleotide Therapeutics),ed.Akhtar;Sullivan et al.,PCT WO 94/02595中。利用这些和其他的协议用于几乎任一核酸分子的递送，包括本发明的分离的寡聚物。
如下文所详述的，本发明的药物组合物可特异地配制以固体或液体的形式给药，包括适合于下列的那些：(1)口服给药，例如，浸液(水的或无水的溶液或悬浮液)，片剂，例如靶向于口腔的、舌下的以及全身吸收的那些，丸剂、粉剂、颗粒剂、应用于舌头的糊剂；(2)胃肠外给药，例如通过皮下的、肌肉内的、静脉内的或硬膜外注射，例如作为无菌的溶液或悬浮液或缓释制剂；(3)局部应用，例如作为乳剂、膏剂或控释的应用于皮肤的膜贴或喷雾；(4)阴道内地或直肠内地，例如作为阴道药栓、乳剂或泡沫；(5)舌下给药；(6)经眼睛地；(7)经皮肤地；或(8)经鼻地。
本文所用的短语“药学上可接受的”通常指那些化合物、材料、组合物和/或剂型，其在充分的医疗判断范围内适用于接触人和动物的组织而没有过多的毒性、刺激、过敏反应或其他的问题或并发症，具有合理的效益/风险比。
本文所用的短语“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的物质、组合物或媒介，诸如液体或固体的填充剂、稀释剂、赋形剂、生产辅料(例如润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或锌或硬脂酸)或参与运载或转运个体的化合物从一个器官或身体的一部分至另一个器官或身体另一部分的灌封物质的溶剂。每个载体必须为“可接受的”，从其与制剂的其他成分相容的并且对患者无害的意义上说。
用作药学上可接受的载体的物质的一些实例包括但不限于：(1)糖，诸如乳糖、葡萄糖以及蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素以及它的衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素以及醋酸纤维素；(4)粉状的黄芪胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；(9)油类，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油以及大豆油；(10)二醇类，诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇以及聚乙二醇；(12)酯类，诸如乙基油酸酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)褐藻酸；(16)无热原的水；(17)生理盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；以及(22)药物制剂中应用的其他的无毒的可相容的物质。
适于与本发明的反义寡聚物配制的制剂的额外的非限制性实例包括：连接核酸的PEG、连接核酸的磷脂、含亲脂性部分的核酸、硫代磷酯、可以增强药物进入各种组织的P-糖蛋白抑制剂(诸如普朗尼克P85(Pluronic P85))；可生物降解的聚合物，诸如用于植入后缓释递送的聚乳酸-聚羟基乙酸微球(Emerich,DF et al,Cell Transplant.8:47-58,1999)Alkermes,Inc.Cambridge,Mass.；装载的纳米粒子，诸如由聚氰基丙烯酸正丁酯组成的那些，其可以递送药物穿过血脑屏障并且可以改变神经元摄取机制(ProgNeuropsychopharmacol Biol Psychiatry,23,941-949,1999)。
本发明也表征了包含表面修饰的脂质体的组合物的使用，该脂质体包含聚(乙烯乙二醇)脂质(PEG修饰的，支链的或无支链的或其组合，或长循环脂质体或隐性脂质体)。本发明的寡聚物也可以包含共价地附加的各种分子量的PEG分子。这些制剂提供了一种用于增加药物在靶组织中积聚的方法。该类药物载体耐受单核吞噬系统(NPS或RES)的调理素作用以及消除，从而能够促进更长的血液循环时间以及增强组织暴露于封装的药物(Lasicet al.Chem.Rev.1995,95,2601-2627;Ishiwata et al.,Chem.Pharm.Bull.1995,43,1005-1011)。此类脂质体已显示了在肿瘤中选择性积聚，大概通过在新形成血管的靶组织中外溢和捕获(Lasic et al.,Science.267:1275-1276,1995;Oku et al.,Biochim.Biophys.Acta.1238:86-90,1995)。长循环的脂质体增强DNA和RNA的药代动力学及药效学，特别是与已知的积聚于MPS组织中的常规的阳离子脂质体比较(Liu etal.J.Biol.Chem.42:24864-24870,1995;Choi et al.,国际的PCT出版物WO 96/10391号;Ansell et al,国际的PCT出版物WO 96/10390号;Holland et al.,国际的PCT出版物WO96/10392号)。长循环的脂质体也很可能保护药物免受核酸酶降解至更大的程度，与阳离子脂质体比较，基于它们避免在诸如肝脏和脾脏的新陈代谢活跃的MPS组织中积聚的能力。
在另一实施方案中，本发明包括制备用于递送的寡聚物组合物，如美国专利申请第6,692,911,7,163,695及7,070,807号所述。就这一点而言，在一实施方案中，本发明提供了在包含赖氨酸与组氨酸的共聚物(HK)的组合物中的本发明的寡聚物，如美国专利申请第7,163,695,7,070,807及6,692,911号所述，单独的或与PEG(例如支链的或无支链的PEG或两者的混合物)的组合，与PEG及靶向部分或任一上述的与交联剂组合。在某些实施方案中，本发明提供了组合物中的反义寡聚物，该组合物包含葡萄糖酸修饰的聚组氨酸或葡萄糖基的-聚组氨酸/转铁蛋白-聚赖氨酸。本领域中技术人员也应意识到带有类似于His与Lys特性的氨基酸可在组合物中被取代。
本文所述的某些寡聚物的实施方案包含基本的功能性基团，诸如氨基或烷氨基，并且因此能够形成带有药学上可接受的酸的药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”在此方面指本发明的化合物相对无毒的、无机的及有机的酸加成盐。这些盐可以在给药媒介原位或剂型生产过程中制备，或通过分别以其带有合适的有机酸或无机酸的游离碱形式与本发明纯化的化合物起反应并且在随后的纯化期间分离因此形成的盐。代表性盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、醋酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐以及十二烷基磺酸盐等(例如见Berge et al..Pharm.Sci.66:1-19,1977)。
个体的寡聚物的药学上可接受的盐包括化合物的常规无毒的盐或季铵盐，例如来自于无毒的有机酸或无机酸。例如，此类常规的无毒的盐包括衍生于无机酸的那些，诸如盐酸盐、氢溴酸的、硫酸的、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；自有机酸制备的盐，诸如醋酸的、丙酸的、琥珀酸的、甘醇酸的、硬脂酸的、乳酸的、苹果酸的、酒石酸的、柠檬酸的、抗坏血酸的、棕榈酸的、顺丁烯二酸的、草酰乙酸的、苯乙酸的、谷氨酸的、苯甲酸的、水杨酸的、磺胺酸的、2-乙酸基苯甲酸的、反丁烯二酸的、甲苯亚磺酸的、甲磺酸的、乙烷二磺酸的、草酸的、异硫酸的等。
在某些实施方案中，本发明的寡聚物可包含一个或多个酸性的功能基团，并且因此能够形成带有药学上可接受的碱基的药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”在这些情况下指本发明的化合物相对无毒的、无机的及有机的碱加成盐。这些盐同样在给药媒介原位或剂型生产过程中制备，或通过分别以游离酸形式与纯化的化合物起反应，该游离酸带有诸如羟化物、药学上可接受的金属阳离子的碳酸盐或碳酸氢盐的合适的碱，带有氨，或带有药学上可接受的有机的一级、二级或三级胺。代表性碱或碱土盐包括锂、钠、钾、钙、镁以及铝盐等。对碱加成盐的形成有用的代表性有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等(例如见Berge et ah,supra)。
湿润剂、乳化剂和诸如十二烷基硫酸钠与硬脂酸镁的润滑剂以及着色剂、脱模剂、涂层剂、甜味剂、香精香料剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中。
药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基苯甲醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、丙基没食子酸、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
本发明的制剂包括适用于口服、经鼻的、局部的(包括口腔的和舌下的)、直肠的、阴道的和/或胃肠外给药的那些。制剂可常规以单位剂型存在并且可通过任一药学领域熟知的方法制备。可以与载体物质组合以产生单一的剂型的活性成分的量因被治疗的宿主、给药的特别模式而不同。可以与载体物质组合以产生单一的剂型的活性成分的量通常为产生治疗效果的化合物的量。通常，出于100%，该量范围从约0.1%-约99%活性成分，优选从约5%-约70%，最优选从约10%-约30%。
在某些实施方案中，本发明的制剂包含选自环糊精、纤维素、脂质体、胶束形成剂的赋形剂，例如胆汁酸与聚合物载体，例如聚酯与聚酸酐；以及本发明的寡聚物。在某些实施方案中，上述的制剂提供口服地生物相容性的本发明的寡聚物。
这些制剂或组合物的制备方法包括将本发明的寡聚物与载体以及任选地一种或多种配合成分开始联系起来的步骤。通常，通过统一紧密地将本发明的化合物与液体载体或细小分散的固体载体或这两者开始联系起来，然后，如有必要，形成产物来制备制剂。
本发明适用于口服给药的制剂可呈现以下形式：胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(利用香味基础，通常是蔗糖与阿拉伯胶或黄芪胶)、粉剂、颗粒剂、或作为水性或非水性液体中的溶液或悬浮液、或作为水包油或油包水的液体乳剂、或作为酏剂或糖浆、或作为锭剂(利用惰性基础，诸如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)和/或作为漱口药等，每个都包含预定量的本发明的化合物作为活性成分。本发明的寡聚物也可以大药丸、药糖剂或糊剂给药。
在本发明用于口服给药的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、粉剂、颗粒剂、锭剂等)中，活性成分可与一种或多种药学上可接受的载体混合，诸如柠檬酸钠或磷酸氢钙，和/或任一下列的：(1)填充剂或增量剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)结合剂，诸如，例如羧甲基纤维素、褐藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)湿润剂，诸如甘油；(4)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸盐以及碳酸钠；(5)溶液缓凝剂，诸如石蜡；(6)吸收加速剂，诸如季铵化合物以及表面活性剂，诸如泊咯沙姆和十二烷基硫酸钠；(7)湿润剂，诸如，例如鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯以及非离子表面活性剂；(8)吸收剂，诸如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体的聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、硬脂酸锌、硬质酸钠、硬脂酸及其混合物；(10)着色剂；以及(11)控释剂，诸如交联聚维酮或乙基纤维素。在胶囊、片剂以及丸剂的情况下，药物组合物也可包含缓冲剂。利用诸如乳糖或牛奶糖以及高分子量的聚乙二醇等赋形剂，相似类型的固体组合物也可用作软壳及硬壳的明胶胶囊中的填充剂。
片剂可通过压缩或塑模来制造，任选地带有一个或多个配合成分。可利用结合剂(例如明胶或羧丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如羧甲淀粉钠或交联的羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂制备压缩的片剂。通过在合适的机器中塑模被惰性液体稀释剂弄湿的粉末状的化合物的混合物制造塑模的片剂。
本发明药物组合物的片剂以及其他的固体剂型，诸如糖锭、胶囊、丸剂以及颗粒剂，可任选地被包衣和壳刻痕或制备，诸如肠溶衣和其他的药物配制领域中熟知的包衣。它们也可被配制以便提供活性成分慢的或控制的释放，在其中利用，例如不同比例的羟丙基甲基纤维素以提供理想的释放行为、其他的聚合物基质、脂质体和/或微球体。它们可被配制用于快速释放，例如冷冻干燥。例如可通过细菌滤器过滤或通过以无菌的固体组合物形式掺入杀菌剂来对它们杀菌，该无菌的固体组合物在使用前就溶入无菌水或其他的无菌的可注射的介质。这些组合物也可任选地包含乳浊剂并且可具有它们只或优选地在胃肠消化道的某一部分任选地以延迟的方式释放活性成分的组合物。可以使用的植入组合物的实例包括聚合物和蜡。活性成分也可呈现微胶囊化的形式，任选地带有一种或多种上文所述的赋形剂。
本发明化合物用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆以及酏剂。除了活性成分以外，液体剂型可包含本领域中常用的惰性稀释剂，诸如，例如水或其他的溶剂，增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(尤其是棉籽、花生、玉米、胚芽、橄榄、蓖麻以及芝麻油)、甘油、四氢呋喃甲醇、聚乙二醇、山梨聚糖的脂肪酸酯以及其混合物。
除了惰性稀释剂之外，口服地组合物也可包括佐剂，诸如湿润剂、乳化及悬浮剂、甜味剂、香精、着色剂、香料以及防腐剂。
悬浮液，除了活性化合物以外，还可包含悬浮剂，例如乙氧基异十八醇、聚氧乙烯山梨糖醇及山梨糖醇酯、微晶纤维素、间氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄芪胶、以及其混合物。
用于直肠或阴道给药的制剂可以栓剂呈现，可通过将一个或多个本发明化合物与一个或多个合适的无刺激性的赋形剂或例如包含可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸盐的载体混合制备栓剂，其在室温下为固体，体温下为液体，因此，将在直肠或阴道腔中融化并且释放活性化合物。
用于局部或经皮肤给药的如本文所提供的寡聚物的制剂或剂型包括粉末、喷雾剂、膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、溶液、贴片以及吸入剂。活性寡聚物可在无菌状态下与药学上可接受的载体，任一可能需要的防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。除了本发明的活性化合物以外，膏剂、糊剂、乳膏剂和凝胶可包含赋形剂，诸如动物和植物油脂、油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌或其混合物。
除了本发明的寡聚物以外，粉末剂与喷雾剂可包含赋形剂，诸如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末，或这些物质的混合物。喷雾剂可额外地包含通常的推进剂，诸如含氯氟烃和诸如丁烷与丙烷的挥发性的未取代的烃类。
透皮贴剂具有提供本发明寡聚物的控制递送至身体的更多的优势。此类剂型可通过将寡聚物溶解或分散在适当的介质中来制造。吸收增强剂也可用于增加制剂穿过皮肤的通量。可通过提供控制速率的膜或在聚合物基质或凝胶中分散制剂控制此类通量的速率，本领域中已知的其他方法中。
适用于胃肠外给药的药物组合物可包含一个或多个本发明寡聚物与一个或多个药学上可接受的无菌等渗水或非水溶液、分散液、悬浮液或乳化剂、或恰在使用前重组成无菌可注射的溶液或分散液的无菌粉末组合，其可包含糖、醇类、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使得制剂与预期接受者的血液等渗的溶质、悬浮剂或增稠剂。可应用于本发明的药物组合物的合适的水的和非水的载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙烯乙二醇、聚乙二醇等)以及其合适的混合物，诸如橄榄油的植物油，诸如油酸乙酯的可注射的有机酯。例如通过诸如卵磷脂的包衣物质的使用，通过维持在分散情况下的所需的颗粒大小以及通过表面活性剂的使用，可以维持适当的流动性。
这些组合物也可包含佐剂，诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂，例如尼泊金、氯丁醇、苯酚山梨酸等确保预防微生物对个体寡聚物的作用。理想的是包括等渗剂，诸如糖、氯化钠等在组合物内。另外，可通过包含延迟吸收的制剂诸如单硬脂酸铝和明胶引起可注射的药物形式的延长的吸收。
在某些情况下，为延长药物效应，理想的是减慢药物从皮下或肌肉内注射的吸收。这可以通过使用具有不良的水溶性的晶体或非晶体物质的液体悬浮液的使用来实现，在本领域中已知的其他方法中。然后药物的吸收速率取决于它的溶解率，其反过来又取决于晶体大小和结晶形状。可选择地，不经肠道给药的药物形式的延迟吸收通过药物在油状媒介物中溶解或悬浮实现。
可通过在诸如聚交酯-聚乙二醇的可生物降解的聚合物中形成个体的寡聚物的微胶囊基质制造可注射的药性持久形式。取决于寡聚物与聚合物的比率以及所应用的特定聚合物的性质，寡聚物释放的速率为可控制的。其他的可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。药性持久的可注射的制剂也可通过将药物裹入与身体组织相容的脂质体或微乳剂来制备。
当本发明的寡聚物作为药物给予人类和动物时，它们可以自身给予或作为例如包含0.1-99%(更优选10-30%)活性成分与药学上可接受的载体组合的药物组合物给予。
如上文所述，本发明的制剂或制备可口服地、不经肠道地、局部地或直肠地给予。它们通常以适用于每一给药途径的形式给予。例如，它们以片剂或胶囊形式给药，通过注射、吸入、眼用洗剂、膏剂、栓剂等。通过注射、输注或吸入给药；局部通过洗剂或膏剂；以及直肠通过栓剂。
本文所用的“胃肠外给药”和“不经肠道给药”意指不同于直肠和局部给药的给药模式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内的、肌肉内的、动脉内的、鞘内的、囊内的、眼眶内的、心脏内的、皮肤内的、腹膜内的、经气管的、皮下的、表皮下的、关节内的、被膜下的、蛛网膜下的、椎管内的、胸骨内的注射以及输注。
本文所用的短语“全身给药”、“系统地给药”、“外围的给药”以及“外围地给药”意指化合物、药物或其他的物质的给药不同于直接到达中枢神经系统，从而使得它进入患者的系统并且因此受到新陈代谢及其他相似的过程，例如皮下给药。
不管所选择的给药途径，可用于合适的水合形式的本发明的寡聚物和/或本发明的药物组合物可通过本领域中技术人员已知的常规方法，被配制成药学上可接受的剂型。本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平是多变的以便获取有效的针对特定患者实现理想的治疗反应的活性成分的量以及给药模式，没有不能被患者接受的毒性。
选择的剂量水平将取决于各种因素，包括本发明所应用的特定寡聚物或其酯、盐或酰胺的活性，给药途径，给药时间，所应用的特定的寡聚物的排泄或新陈代谢的速率，吸收的速率和程度，治疗的持续时间，其他的药物、化合物和/或所使用的与应用的特定的寡聚物组合的物质，年龄，性别，体重，状态，健康状况以及被治疗患者的早前的治疗史以及医学领域中熟知的相似的因素。
具有普通技能的内科医师或兽医可容易地确定及开具所需的药物组合物的有效量。例如，内科医师或兽医开始药物组合物中应用的本发明的化合物的剂量水平低于所需的以便实现理想的治疗效果并且逐渐地增加剂量直到获得理想的效果。通常，本发明化合物的合适的每日剂量为有效产生治疗效果的最低的剂量的化合物的量。此类有效剂量通常取决于上文所述的因素。通常，本发明化合物用于患者的口服的、静脉内的、脑室内的以及皮下的剂量，当用于显示效应时，范围从约0.0001-约100mg/kg体重/天。
若需要，活性化合物的有效的每日剂量可以适当的整天间隔，任选地以单位剂型分别给药，给予2个、3个、4个、5个、6个或更多的亚剂量。在某些情况下，剂量为1给药/天。在某些实施方案中，剂量为1个或多个给药/每2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14天或每1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12个周或每1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12个月，如所需要的，以减少流感病毒复制。
通过各种本领域中熟悉的那些已知的方法给予细胞核酸分子，包括但不限于封装在脂质体中，通过离子导入法或通过掺入到其他的媒介物，诸如水凝胶、环糊精、可生物降解的纳米胶囊以及生物黏附微球，如本文所述的，本领域中已知的。在某些实施方案中，可利用微乳化技术以改进亲脂性的(非水溶性)药物制剂的生物利用度。实例包括Trimetrine(Dordunoo,S.K.,et al.,Drug Development and Industrial Pharmacy,17:1685-1713,1991)和REV5901(Sheen,P.C,et al.Pharm Sci.80:712-714,1991)。在其他的利益中，微乳化提供了通过将吸收优选导向淋巴系统取代循环系统，其因此绕开肝脏及预防化合物在肝胆循环中摧毁提供了增强的生物利用度。
在本发明的一方面，制剂包含形成于本文所提供的胶束并且至少一个两性分子的载体，其中胶束具有小于约100nm的平均直径。更优选的实施方案提供了具有小于约50nm的平均直径的胶束和甚至更优选的实施方案提供了具有小于约30nm的平均直径，或甚至小于约20nm的胶束。
虽然关注所有合适的两性分子的载体，但是目前优选的载体通常为具有一般认为安全(GRAS)状态的那些，使本发明的化合物溶解并且在稍后的阶段使其微乳化，当溶液进入与复合的水相接触时(诸如人类胃肠道中所发现的一个)。通常，满足这些要求的两性分子的成分具有2-20个HLB(亲水亲油均衡)值，并且它们的结构包含范围C-6-C-20直链脂肪族基团。实例为聚乙烯-乙酰胺的脂肪酸甘油酯和聚乙二醇。
两性分子的载体实例包括饱和的及单不饱和的聚乙二醇的脂肪酸甘油酯，诸如获取自完全地或部分地氢化的各种各样的植物油的那些。此类油可有利地由相应的脂肪酸的三元的、二元的、单元的脂肪酸甘油酯及二元的和单元的聚乙二醇酯，带有特别优选的脂肪酸组合物包括癸酸4-10，癸酸3-9，月桂酸40-50，肉豆蔻酸14-24，棕榈酸4-14以及硬脂酸5-15%。另一有用的两性分子的载体类别包括部分酯化的山梨糖醇酐和/或山梨醇，带有饱和的或单不饱和的脂肪酸(SPAN系列)或相应的乙氧基的对应物(TWEEN系)。
可商购的两性分子的载体可为特别有用的，包括Gelucire系列、Labrafil、酸甘油酯(Labrasol)或Lauroglycol(所有都通过Gattefosse Corporation,Saint Priest,France生产和分布)、PEG-单一-油酸盐、PEG-二元-油酸盐，PEG-单一-月桂酸盐以及二元-月桂酸盐、卵磷脂、聚山梨醇酯80等(许多美国和世界各地的公司生产及分布)。
在某些实施方案中，通过脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等的使用可发生递送，将本发明的组合物引入至合适的宿主细胞。尤其本发明的组合物可配制用于递送封装在液体颗粒、脂质体、囊泡、纳米球、纳米颗粒等。此类递送媒介物的配制及使用可利用已知的常规的技术进行。
适用于本发明的亲水聚合物为易于溶于水的的那些，可共价地附加至形成囊泡的脂质并且其在体内没有毒性作用，可接受的(即生物相容性)。合适的聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(也称为聚交酯)、聚乙醇酸(也称为聚乙交酯)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物以及聚乙烯醇。在某些实施方案中，共聚物具有分子量约100或120道尔顿-约5000或10000道尔顿，或约300道尔顿-约5000道尔顿。在其他的实施方案中，共聚物为具有分子量约100-约5000道尔顿或具有分子量约300-约5000道尔顿的聚乙二醇。在某些实施方案中，共聚物为750道尔顿的聚乙二醇(PEG(750))。共聚物也可通过其中的单体数量所定义；本发明优选的实施方案利用至少约3个单体的共聚物，由3个单体组成的此类PEG共聚物(大约150道尔顿)。
可适用于本发明的其他的亲水聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚甲氧基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟丙基、甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺以及衍生的纤维素，诸如羟甲基纤维素或羟乙基纤维素。
在某些实施方案中，本发明的制剂包含选自由以下组成的生物相容性聚合物：聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯烃、丙烯酸与甲基丙烯酸酯的聚合物、聚乙烯聚合物、聚乙二醇、聚硅氧烷、聚氨酯以及其共聚物、纤维素、聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、乳酸与乙醇酸的聚合物、聚酸酐、聚(邻)酯、聚(butic酸)、聚(戊酸)、聚(乳酸-共-己内酯)、多聚糖、蛋白、聚透明质酸、聚丙烯酸氰基酯以及其融合物、混合物或共聚物。
环糊精为环状的寡聚糖，由6个、7个或8个葡萄糖单元组成，各自被称为希腊字母α、β或γ。葡萄糖单元通过α-1,4糖苷键连接。由于糖单元椅型构象的结果，所有的仲醇羟基(C2,C3上)都位于环的一侧，而C6上所有的伯醇羟基都位于另一侧。因此，外表面为亲水的，这使得环糊精为水溶性的。相反，环糊精的腔为疏水性的，因为它们通过C3与C5原子的氢键以及类醚的氧连接。这些基质允许与各种各样相对疏水性化合物络合，例如包括诸如17α-雌二醇的类固醇化合物。络合通过范德华力(Van der Waals interactions)和形成氢键发生。为进行环糊精的化学综述，见Wenz,Agnew,Chem.Int.Ed.Engl,33:803-822,1994。
环糊精衍生物的理化性质强烈地取决于取代的种类与程度。例如，它们的水溶性范围自不可溶的(例如三乙酰-β-环糊精)-147%可溶的(w/v)(G-2-β-环糊精)。另外，它们在许多有机溶剂中是可溶的。环糊精的特性使得能够通过增加或减少它们的溶解度控制各种制剂组分的溶解度。
已描述了众多的环糊精以及他们的制备方法。例如，Parmeter(I)et al.(U.S.Pat.No.3,453,259)和Gramera et al.(U.S.Pat.No.3,459,731)描述了电中性的环糊精。其他的衍生物包括带有阳离子特性的环糊精(Parmeter(II),U.S.Pat.No.3,453,257)，不可溶解的交联的环糊精(Solms,U.S.Pat.No.3,420,788)以及带有阴离子特性的环糊精(Parmeter(III),U.S.Pat.No.3,426,011)。在带有阴离子特性的环糊精衍生物中，羧酸、磷酸、三价膦酸、膦酸、含磷的酸、硫代膦酸、硫代硫酸以及硫酸已被添加到母体的环糊精(见Parmeter(III),supra)。而且，磺烷基醚环糊精衍生物已被Stella et al.(U.S.Pat.No.5,134,127)描述。
脂质体由至少一层封闭水内部隔间的脂质双层膜组成。脂质体通过膜的类型和大小而表征化。小单层囊泡(SUVs)具有单一的膜并且通常范围在0.02-0.05μπι直径；大单层囊泡(LUVs)通常大于0.05μπι。寡聚层的大囊泡与多层的囊泡具有多重的，通常同心的薄膜层并且通常大于0.1μπι。带有几层非同心膜的脂质体，即被包含在较大的囊泡内的几个较小的囊泡，被称为多泡的囊泡。
本发明的一方面涉及包含脂质体的制剂，该脂质体含本发明的寡聚物，其中配制脂质体膜以提供带有增强运输能力的脂质体。可选择地或另外，本发明的化合物可被包含在脂质体双分子层内或吸附到脂质体的脂质体双分子层上。本发明的寡聚物可与脂质表面活性剂聚合并且被运至脂质体的内部空间内；在这种情况下，配制脂质体膜以耐受活性剂-表面活性剂聚合的破坏性影响。
根据本发明的一个实施方案，脂质体的脂质双分子层包含与聚乙二醇衍生的脂质，从而使得PEG链从脂质双分子层的内表面延伸至脂质体所封装的内部空间，并且从脂质双分子层的外部延伸至周围环境。
本发明的脂质体内所包含的活性剂为溶解的形式。根据本发明，表面活性剂与活性剂(诸如包含感兴趣的活性剂的乳剂或胶束)的聚合可被裹入脂质体的内部空间内。表面活性剂采取作用使活性剂分散及溶解，并且可选自任一合适的脂肪族的、脂环族的或芳香族的表面活性剂，包括但不限于不同链长(例如约C14-约C20)的生物相容性溶血磷脂胆碱(LPCs)。也可利用聚合物衍生的脂质，诸如PEG-脂质用于胶束形成，因为它们将作用抑制胶束/膜融合，并且因为聚合物添加至表面活性剂降低了表面活性剂的CMC并且有助于胶束形成。优选的是微摩尔范围内带有CMCs的表面活性剂；可利用较高的CMC表面活性剂以制备裹入到本发明的脂质体内的胶束。
根据本发明，可通过任一本领域中已知的各种技术制备脂质体，例如见美国专利申请第4,235,871号；出版的PCT专利申请WO96/14057；新的RRC，脂质体：实用方法，IRL出版，牛津(1990)，33-104页(Liposomes:A Practical Approach,IRL Press,Oxford(1990),pages33-104)；Lasic DD,Liposomes from physics to applications,Elsevier SciencePublishers BV，Amsterdam,1993)。例如，制备本发明的脂质体可通过将衍生于亲水聚合物的脂质扩散进预先形成的脂质体，诸如通过将预先形成的脂质体暴露于由接合脂质的聚合物组成的胶束，与脂质体中理想的衍生的脂质最终的摩尔百分数一致的脂质浓度。包含亲水聚合物的脂质体也可通过如本领域中已知的均化作用、脂质场水合作用或挤压技术而形成。
在另一示例性形成程序中，首先通过溶血卵磷脂或其他的易于使疏水性分子溶解的低CMC表面活性剂(包括接合聚合物的脂质)中声波降解法分散活性剂。然后将由此得到的活性剂的胶束悬浮液用于再水化干燥的包含合适的摩尔百分数的接合聚合物的脂质或胆固醇的脂质样品。然后利用如本领域中已知的挤压技术将脂质与活性剂的悬浮液形成脂质体，并且通过标准的柱分离将由此得到的脂质体从未封装的溶液中分离出来。
在本发明的一方面，制备脂质体以具有在选择的大小范围内基本上均匀的大小。有效的分筛方法涉及通过一系列具有选择的均一孔径的聚碳酸酯膜挤压脂质体的水悬浮液；膜的孔径大致对应通过穿过那个膜的挤压所产生的脂质体的最大孔径。例如见美国专利申请第4,737,323号。在某些实施方案中，可利用诸如与的试剂以将多核苷酸或蛋白引入至细胞。
本发明制剂的释放特征取决于封装材料、被封装药物的浓度以及释放改变剂的存在。例如，控制释放可为pH依赖性的，例如，利用只在如在胃里的低pH下或如在肠道里的较高pH下释放的pH敏感的包衣。肠溶包衣可用于预防释放发生直至穿过胃之后。多重包衣或封装在不同材料中氨腈的混合物可用于获得胃中的最初释放，随后肠道中更迟的释放。也可通过内含盐或造孔剂控制释放，造孔剂可以通过从胶囊扩散增加水分摄取或药物释放。改变药物溶解度的赋形剂也可用于控制释放率。也可掺入增强基质降解或从基质释放的制剂。它们被添加至药物，作为单独相(即如微粒)添加，或可在聚合物相中为共溶解的，取决于化合物。在大部分情况下，量应该在0.1-30%(w/w聚合物)。降解增强剂的类型包括诸如硫酸铵和氯化铵的无机盐，诸如柠檬酸、苯甲酸以及抗坏血酸的有机酸，诸如碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、碳酸锌以及氢氧化锌的无机碱，诸如硫酸鱼精蛋白、精胺、胆碱、乙醇胺、二乙醇胺以及三羟乙基胺的有机碱，诸如与的表面活性剂。增加微结构至基质的造孔剂(即水溶性化合物，诸如无机盐与糖)作为微粒被添加。通常范围在1%-30%(w/w聚合物)。
通过改变微粒在消化道的停留时间也可控制摄取。例如可以通过用或选择作为封装材料、粘膜粘附聚合物包裹微粒实现这一目的。实例包括大部分带有游离羧基的聚合物，诸如壳聚糖、纤维素以及特别是聚丙烯酸酯(如本文所用的，聚丙烯酸酯指包括丙烯酸酯和诸如氨基丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的修饰的丙烯酸酯)。
配制寡聚物以通过外科或医疗器械或移植包含入或适合释放。在某些方面，包裹植入物或相反用寡聚物治疗植入物。例如，水凝胶或其他的聚合物，诸如生物相容性和/或可生物降解的聚合物，可用于用本发明的组合物包裹植入物(即通过使用水凝胶或其他的聚合物使组合物适合于医疗器械使用)。用于用制剂包裹医疗器械的聚合物与共聚物为本领域中熟知的。植入物的实例包括但不限于支架、药物涂层支架、缝合线、假肢、血管导管、透析导管、人造血管、人工心脏瓣膜、心脏起搏器、植入型心律转复除颤器、IV针、诸如大头针、螺丝、平板的用于正骨和骨形成的器械，其他的器械以及用于伤口愈合的人造组织基质。
除了本文所提供的方法以外，本发明所使用的寡聚物可配制用于以任一便捷的方式给药以用于人类或兽医，通过与其他的药物类比。反义寡聚物与它们相应的制剂在流感病毒感染的治疗中可单独给药或与其他的治疗策略联合给药(例如奥司他韦，其市场商品名为)。
根据本发明，反义寡聚物的递送途径包括但不限于各种系统的途径，包括口服和胃肠外途径，例如静脉内的、皮下的、腹膜内的和肌肉内的、以及吸入、经皮肤的、肺部的和局部递送。本领域中技术人员可确定适当的途径，视治疗中个体的状态而定。例如，皮肤的病毒感染治疗中，适当的用于反义寡聚物递送的途径为局部递送，而用于病毒的呼吸系统感染的治疗得反义寡聚物的递送为通过吸入、鼻内的或肺部递送。寡聚物也可直接递送至病毒感染的部位或血液循环。
反义寡聚物可以任一便捷的生理学可接受的媒介物给药。此类组合物可包括任一各种各样的标准的药学上可接受的本领域中普通技术人员所应用的载体。实例包括但不限于盐水、磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)、水、乙醇水溶液、诸如油/水乳剂或甘油三酯乳剂的乳剂、片剂以及胶囊。合适的生理学上可接受的载体的选择因所选择的给药模式而不同。
在一些情况下，如上文所述，可应用脂质体以促进细胞对反义寡核苷酸的摄取(例如见Williams,S.A.,Leukemia.10(12):1980-1989,1996;Lappalainen et al.,AntiviralRes.23:119,1994;Uhlmann et al,Antisense Oligonucleotides:A New TherapeuticPrinciple,Chemical Reviews,Volume 90,No.4,pages 544-584,1990;Gregoriadis,G.,Chapter 14,Liposomes,Drug Carriers in Biology and Medicine,pp.287-341,Academic Press,1979)。水凝胶也可用作媒介物用于反义寡聚物给药，例如，如WO 93/01286或PCT专利申请US 1992/005305号所述。可选择地，寡核苷酸以微球或微粒给药(例如见Wu,G.Y.and Wu,C.H.,/.Biol.Chem.262:4429-4432,1987)。可选择地，与反义寡聚物复合的充气的微泡的使用可增强递送至靶组织，如美国专利申请第6,245,747号所述。
也可使用缓释组合物。这些可包括特型制品形式的半渗透的聚合物基质，诸如膜剂或微囊剂。
在方法的一方面，个体为人类个体，例如被诊断患有局部的或全身的病毒感染的患者。患者的状态也可指示。例如，本发明的反义寡聚物的预防性给药，例如在患者为(1)免疫功能低下的；(2)烧伤；(3)有留置导管；或(4)将接受或最近接受了手术的情况下。在一优选的实施方案中，寡聚物为磷二酰胺吗啉寡聚物，包含在药学上可接受的载体中，口服给药。在另一优选的实施方案中，寡聚物为磷二酰胺啉寡聚物，包含在药学上可接受的载体中，静脉内给药(i.v)。
反义化合物可以有效导致最高的血液浓度至少200-400nM反义寡聚物的量和方式给药。通常，给予一种或多种剂量的反义寡聚物，通常以规律的间隔，约1-2周的时间段。用于口服给药的优选的剂量为约1-100mg寡聚物/70kg。在一些情况下，可需要大约100mg寡聚物/患者的剂量。对i.v.给药而言，反义寡聚物可以规律的间隔短时间给药，例如两周或更少的。每日。然而，在一些情况下，寡聚物间隔地给药较长的时间段。抗生素给药或其他治疗处理可在跟随在给药后或与给药同时。可如所示的调整治疗方案(剂量、频率、途径等)，基于免疫测定、其他的生物化学测试以及治疗中个体的生理学检查的结果。
治疗的监测
利用本发明反义寡核苷酸的有效的体内治疗方案可因持续时间、剂量、频率和给药途径，以及治疗中个体的状态而不同(即预防性给药与响应局部的或全身的感染的给药相对)。因此，此类体内疗法将经常要求监测，通过适合于治疗中病毒感染的特定类型的试验以及剂量或治疗方案中的相应调整以便实现最佳的治疗结果。可通过感染的一般指标，诸如全血细胞计数(CBC)、核酸检测方法、免疫诊断试验、病毒培养或异源双链体的检测监测治疗。
可从取自给予个体反义寡聚物之前、期间以及随后的生物学样品(组织、血液、尿液等)中检测本发明反义寡聚物体内给药以抑制或消除一种或多种类型的RNA病毒生长的功效。此类样品的测定包括(1)利用本领域中技术人员已知的程序，例如凝胶电泳流动分析，监测与靶序列和非靶序列所形成的异源双链体的存在或不存在；(2)如通过诸如ELISA或免疫印迹(Western blotting)的标准技术，监测病毒蛋白产生的量，或(3)测量对病毒滴度的影响，例如通过Spearman-Karber的方法(例如见Pari,G.S.et al.,Antimicrob.Agents and Chemotherapy.39(5):1157-1161,1995;Anderson,K.P.et al.,Antimicrob.Agents and Chemotherapy.40:2004-2011,1996;Cottral,G.E.(ed)in:Manual of Standard Methods for Veterinary Microbiology,pp.60-93,1978)。
参考文献
Abes,R.,H.M.Moulton,et al.(2008)."Delivery of steric block morpholinooligomers by(R-X-R)4 peptides:structure-activity studies."Nucleic Acids Res.
Cox,N.J.and K.Subbarao(1999)."Influenza."Lancet 354(9186):1277-82.
Cox,N.J.and K.Subbarao(2000)."Global epidemiology of influenza:pastand present."Annu Rev Med 51:407-21.
Egholm,M.,O.Buchardt,et al.(1993)."PNA hybridizes to complementaryoligonucleotides obeying the Watson-Crick hydrogen-bonding rules."Nature 365(6446):566-8.Jearawiriyapaisarn,N.,H.M.Moulton,et al.(2008)."SustainedDystrophin Expression
Induced by Peptide-conjugated Morpholino Oligomers in the Muscles ofmdx Mice."Mol Ther.
Marshall,N.B.,S.K.Oda,et al.(2007)."Arginine-rich cell-penetratingpeptides facilitate delivery of antisense oligomers into murine leukocytesand alter pre-mRNA splicing."Journal of Immunological Methods 325(1-2):114-126.
Moulton,H.M.,M.H.Nelson,et al.(2004)."Cellular uptake of antisensemorpholino oligomers conjugated to arginine-rich peptides."Bioconjug Chem 15(2):290-9.
Munster,V.J.,E.de Wit,et al.(2009)."Pathogenesis and Transmission ofSwine-Origin 2009A(H1N1)Influenza Virus in Ferrets."Science.
Stein,C.A.,J.B.Hansen,et al.(2010)."Efficient gene silencing bydelivery of locked nucleic acid antisense oligonucleotides,unassisted bytransfection reagents."Nucleic Acids Res 38(1):e3.
Strauss,J.H.and E.G.Strauss(2002).Viruses and Human Disease.SanDiego,Academic Press.
Summerton,J.and D.Weller(1997)."Morpholino antisense oligomers:design,preparation,and properties."Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7(3):187-95.
Wu,B.,H.M.Moulton,et al.(2008)."Effective rescue of dystrophinimproves cardiac function in dystrophin-deficient mice by a modifiedmorpholino oligomer."Proc Natl Acad Sci U S A 105(39):14814-9.
本说明书中所提到的所有出版物和专利申请都通过引用的方式并入本文，如同每篇独立的出版物和专利被特别且单独指出通过引用的方式并入一样。
尽管为了理解清晰，已借助例证和实例相当详细地描述了上述发明，但显然，根据本发明的教导，对本领域普通技术人员而言，在没有背离所附加的权利要求的精神和范围的情况下，可对本发明做某些改变和修饰。仅以说明而非限制的方式，提供下述实施例。本领域技术人员应当很容易地认识到，可以改变或修饰以产生基本类似结果的各种非关键性参数。
实施例
A.材料和方法
所有的肽由Global Peptide Services(Ft.Collins,CO)或AVI BioPharma(Corvallis,OR)定制合成并且纯化至>90%纯度(见下列的实施例2)。根据已知的方法由AVIBioPharma合成PMO，例如(Summerton and Weller 1997)和美国专利申请第5,185,444号所述的，并且进一步描述于PCT专利申请US08/012804号的方法。PMO的示例性结构如图1A-C中所示。由Integrated DNA Technologies Inc.,Skokie,IL合成2’-OMe寡聚物。由Biosynthesis,Inc.,Lewisville,TX产生LNA寡聚物。
如(美国专利申请第7,468,418号，PCT专利申请US08/008168号以及(Marshall,Oda et al.2007;Abes,Moulton et al.2008))所述，一些PMO寡聚物在3’末端由富精氨酸肽((RAhxRRBR)2AhxB或(RAhxR)4AhxB;各自为SEQ ID NO:124与118)连接以形成肽连接的PMO(PPMO)，从而增强细胞摄取。
可用于制造含(1-哌嗪)氧亚膦羟基键的吗啉亚基的合成路径描述于PCT专利申请US07/011435号并且下文提供了用于代表性合成的进一步的实验细节。哌嗪与三苯基氯甲烷的反应产生三苯甲基哌嗪，其作为琥珀酸盐被分离出来。弱碱(诸如二异丙基乙胺或DIEA)存在的情况下与三氟乙酸乙酯反应提供1-三氟乙酰基-4-三苯甲基哌嗪，其即刻与HCl反应以提供良好产率的盐。用甲苯中的三氯氧磷将二氯磷酰基部分引入。
氯化酰基与吗啉亚基(moN)反应以提供激活的亚基，其可如美国专利申请第5,185,444号或Summerton and Weller,1997(上文引用的)所述并且进一步地描述于PCT专利申请US08/012804号。必要时，合适的保护基被用于核苷碱基；例如，苯甲酰用于腺嘌呤和胸腺嘧啶，苯乙酰用于鸟嘌呤以及三甲基乙酰甲基用于肌苷。含(1-哌嗪)氧亚膦羟基键的亚基可以并入到现存的PMO合成协议，例如如Summerton and Weller(1997)所述，未加修饰。
实施例1小鼠模型系统中甲型流感病毒的抑制
甲型流感病毒感染的小鼠模型被用于检测感染的代表性反义寡聚物的体内功效。经由50微升内大约4×104个空斑形成单位的鼻内给药，甲型流感病毒亚型H2N3(PortChalmers/1/73)被用于感染Balb/c雌性小鼠。研究使用每组12只小鼠，第2天移除6只以检测病毒滴度并且第6天移除6只以检测病毒滴度。二级终点包括防止体重减轻和存活。
三种测试的反义寡聚物化合物，如表1和下列的表6中所列举的PB1-AUG+15、M1/M2-AUG和NP-v3’(SEQ ID NO:12,13与30-33)，被评估为肽连接的(PPMO)和正电荷键化学(PMOplusTM)。利用连接至PMO 3’末端的CP06062肽(SEQ ID NO:124)合成PPMO。每一测试制剂以三种剂量水平评估(10,30和100微克)以建立剂量依赖的关系。经由鼻内途径加量，开始于第0天感染前4小时，然后4天内每天总共5剂量。研究的主要终点为肺中病毒滴度降低，以空斑形成单位/g肺组织衡量。
表6.H3N2小鼠模型中所使用的反义寡聚物
图6显示感染后第6天对病毒滴度的影响。每一病毒滴度为被治疗的动物6个PPMO与6个PMOplusTM的平均值。M1/M2-AUG靶向的化合物(SEQ ID NO:12与13)表现出，与其他测试的化合物比较，基本上更大的活性。利用靶向于登革热(Dengue)病毒的不相关的PPMO与PMOplusTM序列获得图6中所示的来自于阴性对照的登革热(Dengue)处理的病毒滴度。
实施例2雪貂模型系统中甲型流感病毒的抑制
支持本发明的一个观察为本发明的化合物在驯养的雪貂(Mustela puto usfuro)动物模型系统中展现的抗病毒功效，利用新的H1N12009(S-OIV)病毒。雪貂模型的优势包括使用天然的流感病毒的人类分离株的能力，与鼠适应株相反，并且人体内所观察到的大多数临床体征诸如发热和流鼻涕的发展(Munster,de Wit et al.2009)。
用抵抗达菲(Tamiflu)的H1N1株感染6只雪貂，该H1N1株来自于2009年获取于疾病控制中心(大流行的猪流感)。病毒感染的途径为鼻内的(4×104个空斑形成单位)第1天，通过腹膜内(ip)注射PMOplusTM化合物或鼻内(in)给予PPMO化合物加量。靶向于登革热的阴性对照PMOplusTM(30mg/kg ip剂量)和PPMO(1.5mg/kg in剂量)化合物如上文实施例1中所述的给药。剂量对于PMOplusTM化合物而言为10，对于Ml/M2-AUGplus(SEQ ID NO:13;AVI-7100)而言为30mg/kg，对于连接在3’末端-SEQ ID NO:124的M1/M2-AUG PPMO(SEQ ID NO:12)而言为0.5与1.5mg/kg。感染前4小时、第1天、3天、5天进行加量。达菲(奥司他韦Oseltamivir)作为阳性抗病毒的对照给药，平行于反义化合物。盐水也包括在内作为阴性对照。
生命中的观察结果包括体重增加(图7A)、打喷嚏(图7B)、流鼻涕(图7C)以及呼吸窘迫(图7D)。M1/M2-AUG靶向的化合物防止体重减轻，减少打喷嚏、流鼻涕以及呼吸窘迫。从感染后第1天-第5天来自于洗鼻液的病毒滴度显示于图7E中，表示为曲线下面积(AUC)组织培养感染的剂量(TCID)。M1/M2-AUG PPMO制剂显示了2.3对数降低，相对于盐水(99.6%降低)以及1.1对数降低大于达菲(94.4%)。
为进一步评估AVI-7100(SEQ ID NO:13)，在被非适应性-抵抗奥司他韦HIN1(SOIV)大流行的流感病毒感染的雪貂中，测试靶向于流感病毒M1/M2节段翻译起始位点的PMOplus。在该研究中利用总共36只雄性雪貂。研究起始时匹配的约700g体重的雄性雪貂被随机分成5个处理组的其中之一(下文表7所示)，圈养于高效能空气粒子过滤的笼子中(每笼4只)以使病毒传播在笼-笼最小化。笼子保持在杜兰大学医学中心BSL-2实验室(TulaneUniversity Medical Center BSL-2laboratory)。
表7.雪貂研究设计
用AVI-7100在病毒冲击前1-4小时处理雪貂。给药途径为腹膜内，针对组2、3和5；口服针对组1。剂量间隔为病毒冲击后-4小时、24小时、48小时、72小时、96小时以及120小时。处理5组如下：组1接受奥司他韦5mg/kg每12小时口服给药，组2接受AVI-7100(PMOplus化合物；5’-CGG T+TA GAA GAC+TCA TC+T TT-3’)10mg/kg剂量，通过i.p.给药，组3接受AVI-7100(PMOplus化合物)30mg/kg剂量，通过i.p.给药，组4接受无菌的盐水对照通过i.p.给药，组5接受AVI-710010mg/kg每天一次通过i.p.给药以及奥司他韦5mg/kg每天两次。组大小在组1-2(每组8只雪貂)与组4-5(每组6只雪貂)间差异的原因可归于在研究启动时血清反应阴性的甲型流感病毒的有限利用度。
所有参与该研究的雪貂都存活到研究结束，感染后第8天，提示这些动物非常健康或该特定的病毒在该模型中不是非常致病的。尽管如此，如下文所示，这些结果不但表明AVI-7100处理，相对于未处理的或奥司他韦处理的对照，显著地减少了流感病毒感染的症状，而且说明AVI-7100与奥司他韦的联合可获得协同效应。临床的观察结果的总结显示于下列的表8中。
表8.临床的观察结果
作为进一步的提示，对渗入到上呼吸道的细胞的观察结果为感染的严重程度的测量。洗鼻液中巨噬细胞结构的总结被包括于下列的表9。另外，未处理的与奥司他韦处理的雪貂显示肺内显著的充血，伴有明显的肺泡炎(肺部炎症)，大量侵润性细胞包括淋巴细胞和中性粒细胞，以及肺中度增厚的肺泡壁。与此相反，AVI-7100处理的雪貂(有或无奥司他韦)显示肺部没有充血，只有轻微的肺泡炎和少许的浸润性细胞。
表9.上呼吸道中巨噬细胞结构
组 平均值±标准差 第3天峰
达菲 2.98±2.71 7.91±7.28
M1-30 2.78±2.97 1.59±1.28
M1-10 4.34±3.82 3.88±4.73
盐水 5.02±3.77 2.41±3.24
M1+达菲 4.27±3.10 0.91±1.25
如下列的表10所示，在第1天观察到洗鼻液中病毒血症峰值。在第2、4、6和7天没有收集洗鼻液以便将收集洗鼻液对病毒感染的进展的不利影响最小化。相对于盐水或奥司他韦，可在AVI-7100处理组中观察到显著的好处。相对于单独的AVI-7100(10mg/kg)和单独的奥司他韦处理，也观察到AVI-7100(10mg/kg)与奥司他韦联合的协同效应。此处，针对洗鼻液中病毒滴度用于联合用药(AVI-7100与奥司他韦)的AUC显示了相对于只有达菲组减少大于4对数，相对于盐水组减少大于3对数。联合用药也显示相对于等量的单独的AVI-7100(5.515AUG-2.999AUG)，病毒滴度减少得更多，这提示AVI-7100可增强奥司他韦的抗病毒效应。该结果是令人吃惊的，因为该研究中所用的病毒否则是耐受奥司他韦的。
表10.病毒滴度
实施例3利用剪接位点靶向的反义寡聚物对甲型流感病毒在组织培养中的抑制
本发明的一方面为通过M1/M2节段内反义靶向的多个位点，抑制甲型流感病毒复制。除了抑制通过靶向于通常的M1/M2AUG起始位点的翻译以外，也可利用本发明化合物，靶向于剪接供体与剪接受体位点。靶向于740位置上的剪接受体位点的两个PMO可被合成为连接肽的PPMO、SA740和SA746(各自为SEQ ID NO:26与29)并且被放置于用于H1N1株PR8的体外组织培养复制系统中。P007细胞穿透肽(SEQ ID NO:118)被连接至PMO的3M末端。
肺泡的小鼠巨噬细胞系(ATCC;AMJ2-C11)用0.1MOI H1N1(PR8病毒株)感染并且在感染后1小时添加PPMO。35摄氏度下孵育细胞过夜。然后取走病毒的上清液并用VNAR蛋白酶孵育以释放病毒的RNA。通过定量实时PCR(qRT-PCR)定量HA RNA。洗涤、固定以及使细胞通透。然后37摄氏度下用单克隆的抗体作探针探测M1与M2蛋白30分钟。洗涤细胞并且在室温下添加与Alexa 646连接的抗鼠的IgG15分钟。然后通过流式细胞术测定M1与M2。为检测M1与M2蛋白水平，M1或M2阳性细胞的百分比与M1或M2的平均荧光强度相乘。然后每一样品被未处理的对照除以产生M1或M2与未处理的混杂对照相比较的百分比。
图8A显示病毒的HA RNA水平的降低(利用qRT-PCR所测量的)。SA740与SA746抑制HA RNA产生，表明与混杂的对照相比较病毒复制的抑制。在利用SA746的10微摩尔带有大约2对数降低和SA740的1对数降低处观察到最深意义的影响。图8B和8C各自显示了SA740与SA746对M1或M2蛋白水平的影响。上文所述的流式细胞术方法用于检测相对的蛋白水平。这两种寡聚物抑制M2蛋白产生而通过SA740降低M1蛋白水平。
实施例4利用锁核酸寡聚物抑制组织培养中甲型流感病毒
本发明的化合物包括包含不同化学实体的寡核苷酸对应物。合成一系列靶向于M1/M2节段AUG起始位点区域的锁核酸(分别为LNA-AUGl,LNA-AUG12,LNA-AUGl 3与LNA-AUG10;SEQ ID NO:63,74,75和72)，并且如上文实施例3中所述的用于病毒的RNA与M2蛋白表达的同一测定中测试这一系列锁核酸。用PR8感染AMJ2-C11细胞1小时，然后洗涤。然后在35摄氏度下将细胞覆于带有LNA或2’OMe化合物的96孔平板并允许孵育过夜。在那时(大约18小时总孵育时间)评估病毒的RNA水平与M2蛋白表达。图9A显示了4种不同的LNA对病毒RNA水平(HA节段)的影响。7.5微摩尔处，就LNA-AUG1寡聚物而言存在病毒的HA RNA水平中大约3对数的降低，与就LNA-AUG12化合物(分别为SEQ ID NO:63和74)而言大约1.5对数的降低比较。LNA-AUG1为20单体而LNA-AUG12为16单体。根据针对所有4个LNA寡聚物的长度，存在有效性的次序等级，表明较长的LNA为本发明优选的实施方案。图9B中所示的M2蛋白表达的测量中也可观察到这一关系，LNA-AUG1寡核苷酸相比较于LNA-AUG10化合物在7.5微摩尔处(SEQ ID NO:63与72)最有效。由10个碱基靶向序列组成的相对短的LNA-AUG10化合物在病毒的HA RNA和M2蛋白表达测定中是最少有效的。
实施例5利用2’OMe寡聚物抑制组织培养中的甲型流感病毒
本发明的化合物也包括由硫代磷酸键连接的2’OMe残基组成的反义对应寡聚物。通过各自IDT、2’OMe-AUGl,2’OMe-AUG2和2’OMe-SAl;SEQ ID NO:12,20和26产生3个2’OMe寡核苷酸。这些寡聚物被设计用于靶向M1/M2节段的AUG起始密码子或位于核苷酸740的剪接受体位点。2’OMe-SA1序列(SEQ ID NO:26)匹配实施例3中所述的如上文SA740的PPMO化合物的2’OMe-SA1序列。同一测定中测试2’OMe化合物它们如上文所述的实施例3和4中抑制病毒的HA RNA水平和M2蛋白表达的能力。通过如上文所述的LNA在实施例4中的剥裸获得细胞内递送。
所有3种2’OMe化合物都可有效降低病毒的HA RNA水平2.5-4.5对数在7.5微摩尔处，如图10A所示。也可在如图10B中所示的M2蛋白测量测定中观察到3种化合物的相对有效性。最有效的化合物为靶向于AUG起始位点区域的2’OMe-AUG224单体(SEQ ID NO:20)。相似有效的为靶向于下游的M1/M2剪接受体位点的2’OMe-SA1寡聚物(SEQ ID NO:26)。
实施例6体外对M1和M2蛋白表达的抑制
利用处理的和感染的AMJ2-C11细胞的免疫印迹分析评估本发明示例性化合物对M1和M2蛋白表达的影响。本发明的示例性PPMO化合物((M1/M2PPMO;P007-M1/M2-AUG;连接在3接末端-SEQ IDNO:118的SEQ ID NO:12)以3种微摩尔用于处理MDCK细胞过夜。然后用0.01MOI处H1N1-PR8继发地感染细胞1小时并且洗涤。感染18小时后，溶解细胞并且提取蛋白。将等量的蛋白装载于凝胶剂上用于利用与M1、M2以及肌动蛋白反应的单克隆抗体，通过标准的免疫印迹(蛋白质)测定进行随后的分析。如图11所示，M1与M2蛋白的表达降低，与未处理的对照和不相关的对照PPMO(登革热)比较。信号强度的分析指示M2蛋白表达被M1/M2PPMO抑制至大于如图11所示的M1蛋白表达的程度(即对M2而言9%，相对于对M1而言27%)。用于M1与M2的信号比较被肌动蛋白对照标准化。
序列表

Claims (18)

1.分离的抗病毒反义寡核苷酸，所述寡核苷酸包含：
耐核酸酶的主链和通过基本上不带电荷的、含磷的亚基间键连接的吗啉亚基，所述亚基间键将一个亚基的吗啉氮连接到邻近亚基的5’环外碳原子；
其中所述寡核苷酸由SEQ ID NO:12或13的碱基序列组成。
2.如权利要求1所述的抗病毒反义寡核苷酸，其中所述抗病毒反义寡核苷酸通过与病毒的靶区域形成异源双链体结构的能力表征，其中所述异源双链体结构为：
a)由所述病毒的正义链与所述寡核苷酸组成，以及
b)通过至少45℃的离解Tm表征。
3.如权利要求1所述的抗病毒反义寡核苷酸，其中所述吗啉亚基通过符合以下结构的含磷的键连接：
其中，Y1＝O，Z＝O，Pj为通过碱基特异的氢键有效结合到多核苷酸中碱基上的嘌呤或嘧啶碱基配对部分，以及X为烷基、烷氧基、硫代烷氧基或烷基氨基。
4.如权利要求3所述的抗病毒反义寡核苷酸，其中对于至少2个且不超过总数一半的亚基间键而言，X为1-哌嗪，并且其中不带电荷的键为X＝NR2，其中每一R独立地为氢或甲基。
5.如权利要求4所述的抗病毒反义寡核苷酸，其中所述抗病毒反义寡核苷酸包含SEQID NO:13的碱基序列，并且具有三个如SEQ ID NO:13中通过(+)所指示的含哌嗪的亚基间键。
6.如权利要求1所述的抗病毒反义寡核苷酸，其中所述抗病毒反义寡核苷酸与病毒的靶区域杂交，所述病毒的靶区域包含SEQ ID NO:l和5-7中的任意一个或多个的AUG起始密码子周围的45个碱基。
7.如权利要求1所述的抗病毒反义寡核苷酸，其中所述抗病毒反义寡核苷酸与病毒的靶区域杂交，所述病毒的靶区域包含SEQ ID NO:2。
8.如权利要求1所述的抗病毒反义寡核苷酸，其中所述抗病毒反义寡核苷酸连接至增强宿主细胞对所述抗病毒反义寡核苷酸的摄取的富精氨酸多肽。
9.如权利要求8所述的抗病毒反义寡核苷酸，其中所述富精氨酸多肽是SEQ ID NO:115-128中的任一个。
10.权利要求1-9中任一项所述的抗病毒反义寡核苷酸在制备用于治疗流感病毒感染的药物中的用途。
11.如权利要求10所述的用途，其还包括细菌抗生素在制备用于治疗继发性细菌感染的药物中的用途，其中所述细菌抗生素药物与所述抗病毒反义寡核苷酸药物单独地或同时地使用。
12.如权利要求11所述的用途，其中所述继发性细菌感染为链球菌肺炎感染。
13.如权利要求11所述的用途，其中所述抗生素为β-内酰胺。
14.如权利要求11所述的用途，其中所述抗生素选自盘尼西林、阿莫西林、头孢菌素、氯霉素和克林霉素。
15.如权利要求10-11中任一项所述的用途，还包括靶向于编码CD200或CD200受体的RNA分子的反义寡核苷酸在制备药物中的用途，其中靶向CD200或CD200受体的药物与抗病毒反义寡核苷酸药物单独地或同时地使用。
16.包含权利要求1-9中任一项所述的抗病毒反义寡核苷酸和药学上可接受的载体的药物组合物。
17.如权利要求16所述的药物组合物，还包含细菌抗生素。
18.如权利要求16所述的药物组合物，还包含靶向于编码CD200或CD200受体的RNA分子的反义寡核苷酸。
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Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7468418B2 (en) 2003-04-29 2008-12-23 Avi Biopharma., Inc. Compositions for enhancing transport of molecules into cells
US7807816B2 (en) 2004-06-28 2010-10-05 University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
US8067571B2 (en) 2005-07-13 2011-11-29 Avi Biopharma, Inc. Antibacterial antisense oligonucleotide and method
US20100016215A1 (en) 2007-06-29 2010-01-21 Avi Biopharma, Inc. Compound and method for treating myotonic dystrophy
KR20230025924A (ko) 2008-10-24 2023-02-23 사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 Dmd를 위한 다중 엑손 스키핑 조성물
US20110269665A1 (en) 2009-06-26 2011-11-03 Avi Biopharma, Inc. Compound and method for treating myotonic dystrophy
EP2499249B1 (en) 2009-11-12 2018-08-08 The University Of Western Australia Antisense molecules and methods for treating pathologies
US8697858B2 (en) 2009-11-13 2014-04-15 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating influenza viral infection
CA3090304A1 (en) * 2010-05-13 2011-11-17 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense modulation of interleukins 17 and 23 signaling
KR101981705B1 (ko) 2010-05-28 2019-05-24 사렙타 쎄러퓨틱스, 인코퍼레이티드 변형된 서브유니트간 결합 및/또는 말단 그룹을 갖는 올리고뉴클레오타이드 유사체
US8198429B2 (en) 2010-08-09 2012-06-12 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compounds and methods for treating a filovirus infection
WO2012031243A2 (en) 2010-09-03 2012-03-08 Avi Biopharma, Inc. dsRNA MOLECULES COMPRISING OLIGONUCLEOTIDE ANALOGS HAVING MODIFIED INTERSUBUNIT LINKAGES AND/OR TERMINAL GROUPS
US9161948B2 (en) 2011-05-05 2015-10-20 Sarepta Therapeutics, Inc. Peptide oligonucleotide conjugates
CN104039739A (zh) 2011-11-18 2014-09-10 萨勒普塔医疗公司 功能改性的寡核苷酸及其亚单元
EP2788487B1 (en) 2011-12-08 2018-04-04 Sarepta Therapeutics, Inc. Oligonucleotide analogues targeting human lmna
US9150688B2 (en) 2012-04-30 2015-10-06 Institute Of Physics, Academia Sinica Copolymer, complex and method for releasing viruses using pH-dependence of the copolymer
WO2014164802A1 (en) 2013-03-11 2014-10-09 The Johns Hopkins University Influenza-activated constructs and methods of use thereof
JP6449231B2 (ja) 2013-03-14 2019-01-09 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド 筋ジストロフィを処置するためのエキソンスキッピング組成物
EA201591792A1 (ru) 2013-03-15 2016-02-29 Сарепта Терапьютикс, Инк. Улучшенные композиции для лечения мышечной дистрофии
DK3198017T3 (da) 2014-09-26 2021-04-12 Us Health Virusbaserede ekspressionsvektorer og anvendelser deraf
EP3302489A4 (en) 2015-06-04 2019-02-06 Sarepta Therapeutics, Inc. METHOD AND COMPOUNDS FOR THE TREATMENT OF DISEASES AND SUFFERING IN CONNECTION WITH LYMPHOCYTES
CA3014776A1 (en) * 2016-03-02 2017-09-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Pan-genotypic agents against influenza virus and methods of using the same
US11339392B2 (en) 2016-03-02 2022-05-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Pan-genotypic agents against influenza virus and methods of using the same
CN109943519A (zh) * 2016-09-14 2019-06-28 四川蓝光英诺生物科技股份有限公司 人工组织前体及制备其的方法
BR112019012057A2 (pt) * 2016-12-15 2019-11-12 Meharry Medical College agente antiviral, composição farmacêutica para a administração do mesmo e métodos de redução na replicação do vírus zika (zikv) e tratamento de doença mediada pelo vírus zika (zikv)
US11046958B2 (en) 2017-01-24 2021-06-29 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Antisense oligonucleotides that inhibit influenza virus replication and uses thereof
WO2019060862A1 (en) * 2017-09-25 2019-03-28 Sarepta Therapeutics, Inc. METHODS FOR PREPARING MORPHOLINO PHOSPHORODIAMIDATE OLIGOMERS VIA FAST FLOW SYNTHESIS
AU2022282451A1 (en) * 2021-05-28 2023-12-21 Howard University Small complementary nucleic acids, compositions containing the same, and methods for use as antivirals
WO2023244536A2 (en) * 2022-06-13 2023-12-21 Neubase Therapeutics, Inc. Oligonucleotide analogue formulations

Family Cites Families (168)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH445129A (fr) 1964-04-29 1967-10-15 Nestle Sa Procédé pour la préparation de composés d'inclusion à poids moléculaire élevé
US3459731A (en) 1966-12-16 1969-08-05 Corn Products Co Cyclodextrin polyethers and their production
US3453257A (en) 1967-02-13 1969-07-01 Corn Products Co Cyclodextrin with cationic properties
US3426011A (en) 1967-02-13 1969-02-04 Corn Products Co Cyclodextrins with anionic properties
US3453259A (en) 1967-03-22 1969-07-01 Corn Products Co Cyclodextrin polyol ethers and their oxidation products
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
DE3650349T2 (de) 1985-03-15 1995-12-14 Antivirals Inc Immunotestmittel für polynukleotid und verfahren.
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5521063A (en) 1985-03-15 1996-05-28 Antivirals Inc. Polynucleotide reagent containing chiral subunits and methods of use
US5217866A (en) 1985-03-15 1993-06-08 Anti-Gene Development Group Polynucleotide assay reagent and method
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US4737323A (en) 1986-02-13 1988-04-12 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
US5637573A (en) 1986-05-23 1997-06-10 Agrawal; Sudhir Influenza virus replication inhibiting oligonucleotide analogues and their pharmaceutical compositions
US5194428A (en) 1986-05-23 1993-03-16 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of influenza virus replication by oligonucleotide phosphorothioates
DE3788914T2 (de) 1986-09-08 1994-08-25 Ajinomoto Kk Verbindungen zur Spaltung von RNS an eine spezifische Position, Oligomere, verwendet bei der Herstellung dieser Verbindungen und Ausgangsprodukte für die Synthese dieser Oligomere.
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
EP0348458B1 (en) 1987-11-30 1997-04-09 University Of Iowa Research Foundation Dna molecules stabilized by modifications of the 3'-terminal phosphodiester linkage and their use as nucleic acid probes and as therapeutic agents to block the expression of specifically targeted genes
US5403711A (en) 1987-11-30 1995-04-04 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
US5543508A (en) 1987-12-15 1996-08-06 Gene Shears Pty. Limited Ribozymes
WO1989009221A1 (en) 1988-03-25 1989-10-05 University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5256775A (en) 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
GB8914233D0 (en) 1989-06-21 1989-08-09 Ici Plc Isocyanate-reactive compositions
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5955589A (en) 1991-12-24 1999-09-21 Isis Pharmaceuticals Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
US5623065A (en) 1990-08-13 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
US5852188A (en) 1990-01-11 1998-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
KR0166088B1 (ko) 1990-01-23 1999-01-15 . 수용해도가 증가된 시클로덱스트린 유도체 및 이의 용도
US5220007A (en) 1990-02-15 1993-06-15 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
EP0541722B1 (en) 1990-08-03 1995-12-20 Sterling Winthrop Inc. Compounds and methods for inhibiting gene expression
AU652577B2 (en) 1990-08-14 1994-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Inhibition of influenza virus type A, Ann Arbor strain H2N2 by antisense oligonucleotides
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
WO1992005186A1 (en) 1990-09-20 1992-04-02 Gilead Sciences Modified internucleoside linkages
US5122048A (en) 1990-09-24 1992-06-16 Exxon Chemical Patents Inc. Charging apparatus for meltblown webs
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
JPH07501204A (ja) 1991-06-28 1995-02-09 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 局所的オリゴヌクレオチド療法
DE69217994T2 (de) 1991-07-25 1997-09-04 Whitaker Corp Flüssigkeitsstandsmesser
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
US5495006A (en) 1991-09-27 1996-02-27 Allelix Biopharmaceuticals, Inc. Antiviral polynucleotide conjugates
US5576302A (en) 1991-10-15 1996-11-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides for modulating hepatitis C virus having phosphorothioate linkages of high chiral purity
AU3427993A (en) 1991-12-23 1993-07-28 Chiron Corporation HAV probes for use in solution phase sandwich hybridization assays
US5700922A (en) 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US20030171311A1 (en) 1998-04-27 2003-09-11 Lawrence Blatt Enzymatic nucleic acid treatment of diseases or conditions related to hepatitis C virus infection
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
EP1251170A3 (en) 1992-07-17 2002-10-30 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of NF-kappaB dependent animal diseases
US5652355A (en) 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US6174868B1 (en) 1992-09-10 2001-01-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of hepatitis C virus-associated diseases
US6391542B1 (en) 1992-09-10 2002-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of Hepatitis C virus-associated diseases
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
ATE160572T1 (de) 1993-03-31 1997-12-15 Sanofi Sa Oligonucleotide mit amidverkettungen die phosphoesterverkettungen einsetzen
AU6497694A (en) 1993-04-02 1994-10-24 Ribogene, Inc. Method for selective inactivation of viral replication
AU7513794A (en) 1993-09-10 1995-03-27 E.I. Du Pont De Nemours And Company Improved process for preparing 2-amino-4,6-dichloropyrimidine
US5801154A (en) 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US6060456A (en) 1993-11-16 2000-05-09 Genta Incorporated Chimeric oligonucleoside compounds
EP0733059B1 (en) 1993-12-09 2000-09-13 Thomas Jefferson University Compounds and methods for site-directed mutations in eukaryotic cells
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5734039A (en) 1994-09-15 1998-03-31 Thomas Jefferson University Antisense oligonucleotides targeting cooperating oncogenes
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
US5753613A (en) 1994-09-30 1998-05-19 Inex Pharmaceuticals Corporation Compositions for the introduction of polyanionic materials into cells
US5885613A (en) 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
EP0784630B1 (en) 1994-10-11 2004-09-15 University Of California Selective inhibition of internally initiated rna translation
IL115849A0 (en) 1994-11-03 1996-01-31 Merz & Co Gmbh & Co Tangential filtration preparation of liposomal drugs and liposome product thereof
US5545729A (en) 1994-12-22 1996-08-13 Hybridon, Inc. Stabilized ribozyme analogs
GB9510718D0 (en) 1995-05-26 1995-07-19 Sod Conseils Rech Applic Antisense oligonucleotides
US5955318A (en) 1995-08-14 1999-09-21 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for controlling the translation of hepatitis GBV proteins
US5652356A (en) 1995-08-17 1997-07-29 Hybridon, Inc. Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides
JPH09121867A (ja) 1995-10-31 1997-05-13 Soyaku Gijutsu Kenkyusho:Kk 抗インフルエンザウイルスアンチセンスオリゴヌクレオチド
US6245747B1 (en) 1996-03-12 2001-06-12 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Targeted site specific antisense oligodeoxynucleotide delivery method
US6214555B1 (en) 1996-05-01 2001-04-10 Visible Genetics Inc. Method compositions and kit for detection
AU4425397A (en) 1996-09-18 1998-04-14 Vanderbilt University Antisense gene therapy for rna viruses
ES2210761T3 (es) * 1997-05-21 2004-07-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Composicion y procedimiento para mejorar el transporte a traves de las membranas biologicas.
US6133246A (en) 1997-08-13 2000-10-17 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense oligonucleotide compositions and methods for the modulation of JNK proteins
US7572582B2 (en) 1997-09-12 2009-08-11 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
JPH11137260A (ja) 1997-11-06 1999-05-25 Soyaku Gijutsu Kenkyusho:Kk 抗インフルエンザウイルス環状ダンベル型ｒｎａ−ｄｎａキメラ化合物及び抗インフルエンザウイルス剤
US6228579B1 (en) 1997-11-14 2001-05-08 San Diego State University Foundation Method for identifying microbial proliferation genes
WO1999042091A2 (en) 1998-02-19 1999-08-26 Massachusetts Institute Of Technology Use of polycations as endosomolytic agents
US6258570B1 (en) 1998-04-17 2001-07-10 University Of Pittsburgh PCR assay for bacterial and viral meningitis
DE69932346T2 (de) 1998-10-26 2007-07-05 Avi Biopharma, Inc., Portland Auf Morpholin basierendes p53-Antisense- Oligonucleotid und dessen Verwendungen
US20030087851A1 (en) 1999-01-20 2003-05-08 Biozak, Inc. Pharmaceutical composition for treating or preventing influenza, and novel oligonucleotide
US7094765B1 (en) 1999-01-29 2006-08-22 Avi Biopharma, Inc. Antisense restenosis composition and method
WO2000045167A2 (en) 1999-01-29 2000-08-03 Avi Biopharma, Inc. Non-invasive method for detecting target rna
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
DK1178999T3 (da) 1999-05-04 2007-08-06 Santaris Pharma As L-RIBO-LNA-analoger
US6669951B2 (en) 1999-08-24 2003-12-30 Cellgate, Inc. Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into epithelial tissues
WO2001015511A2 (en) 1999-09-01 2001-03-08 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Identification of peptides that facilitate uptake and cytoplasmic and/or nuclear transport of proteins, dna and viruses
EP1238071B1 (en) 1999-11-29 2008-04-23 Avi Biopharma, Inc. Uncharged antisense oligonucleotides targeted to bacterial 16s and 23s rrnas and their uses
US7070807B2 (en) 1999-12-29 2006-07-04 Mixson A James Branched histidine copolymers and methods for using same
US7163695B2 (en) 1999-12-29 2007-01-16 Mixson A James Histidine copolymer and methods for using same
WO2001049775A2 (en) 2000-01-04 2001-07-12 Avi Biopharma, Inc. Antisense antibacterial cell division composition and method
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
WO2001083740A2 (en) 2000-05-04 2001-11-08 Avi Biopharma, Inc. Splice-region antisense composition and method
NZ552462A (en) 2000-07-06 2008-09-26 Bio Merieux Method for controlling the microbiological quality of an aqueous medium and kit therefor
AU2001271873A1 (en) 2000-07-06 2002-01-21 Avi Biopharma, Inc. Transforming growth factor beta (TGF-beta) blocking agent-treated stem cell composition and method
US6673917B1 (en) 2000-09-28 2004-01-06 University Of Ottawa Antisense IAP nucleic acids and uses thereof
WO2002068637A2 (en) 2000-10-20 2002-09-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid-based treatment of diseases or conditions related to west nile virus infection
WO2003020739A2 (en) 2001-09-04 2003-03-13 Exiqon A/S Novel lna compositions and uses thereof
US20030224353A1 (en) 2001-10-16 2003-12-04 Stein David A. Antisense antiviral agent and method for treating ssRNA viral infection
JP2005507660A (ja) 2001-10-16 2005-03-24 アビ バイオファーマ， インコーポレイテッド ｓｓＲＮＡウイルス感染の処置のためのアンチセンス抗ウイルス剤および方法
KR100464261B1 (ko) 2002-01-24 2005-01-03 주식회사 파나진 Ｐｎａ 올리고머를 합성하기 위한 신규한 단량체 및 그의제조방법
KR20030084444A (ko) 2002-04-26 2003-11-01 주식회사 파나진 Ｐｎａ 올리고머를 합성하기 위한 신규한 단량체 및 그의제조방법
US7569575B2 (en) 2002-05-08 2009-08-04 Santaris Pharma A/S Synthesis of locked nucleic acid derivatives
CN1694959B (zh) 2002-09-13 2013-09-18 雷普利瑟公司 非序列互补的抗病毒寡核苷酸
CA2501946C (en) 2002-10-16 2014-12-23 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting west nile virus
JP4791043B2 (ja) 2002-12-31 2011-10-12 プロリゴ・エルエルシー 同一固体支持体上で、２以上のオリゴヌクレオチドをタンデムに合成するための方法および組成物
US7468418B2 (en) 2003-04-29 2008-12-23 Avi Biopharma., Inc. Compositions for enhancing transport of molecules into cells
EP3604537B1 (en) 2003-06-13 2021-12-08 Alnylam Europe AG Double-stranded ribonucleic acid with increased effectiveness in an organism
US7211668B2 (en) 2003-07-28 2007-05-01 Panagene, Inc. PNA monomer and precursor
AU2004276226B2 (en) 2003-08-05 2009-07-30 Avi Biopharma, Inc. Oligonucleotide analog and method for treating flavivirus infections
CA2532795A1 (en) 2003-08-07 2005-02-17 Avi Biopharma, Inc. Sense antiviral compound and method for treating ssrna viral infection
US20050171044A1 (en) 2003-12-24 2005-08-04 Stein David A. Oligonucleotide compound and method for treating nidovirus infections
US7626014B2 (en) 2004-04-27 2009-12-01 Alnylam Pharmaceuticals Single-stranded and double-stranded oligonucleotides comprising a 2-arylpropyl moiety
US7615618B2 (en) 2004-06-30 2009-11-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a non-phosphate backbone linkage
CA2574088C (en) 2004-07-21 2013-09-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a modified or non-natural nucleobase
EP1913011B1 (en) 2004-08-04 2016-11-02 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Oligonucleotides comprising a ligand tethered to a modified or non-natural nucleobase
US8129352B2 (en) 2004-09-16 2012-03-06 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating ssRNA viral infection
US8357664B2 (en) 2004-10-26 2013-01-22 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating influenza viral infection
US7524829B2 (en) 2004-11-01 2009-04-28 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compounds and methods for treating a filovirus infection
US8691781B2 (en) * 2004-11-05 2014-04-08 Sirnaomics, Inc. Compositions for treating respiratory viral infections and their use
US7957737B2 (en) 2005-06-02 2011-06-07 Samsung Electronics Co., Ltd. Mesh node association method in a mesh network, and mesh network supporting the same
CN1903870B (zh) * 2005-07-28 2012-03-14 长春华普生物技术有限公司 对病毒感染性疾病有治疗作用的单链脱氧核苷酸
WO2007030691A2 (en) 2005-09-08 2007-03-15 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating picornavirus infection
EP1937278B1 (en) 2005-09-08 2012-07-25 AVI BioPharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating picornavirus infection
KR20080086440A (ko) * 2005-11-01 2008-09-25 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 인플루엔자 바이러스 복제의 ＲＮＡｉ 억제
WO2007084359A2 (en) * 2006-01-17 2007-07-26 Oligos Etc., Inc. Compositions and methods for the treatment of influenza infection
KR20090034297A (ko) * 2006-02-16 2009-04-07 더 거번먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카 애즈 레프리젠티드 바이 더 세크러터리 오브 더 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 써비시즈 인플루엔자에 대한 항바이러스제 및 백신
WO2007103529A2 (en) 2006-03-07 2007-09-13 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating arenavirus infection
US8785407B2 (en) 2006-05-10 2014-07-22 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense antiviral agent and method for treating ssRNA viral infection
PT2735568T (pt) 2006-05-10 2017-11-14 Avi Biopharma Inc Análogos de oligonucleotidos que têm ligações intersubunidades catiónicas
KR101224458B1 (ko) 2006-06-30 2013-01-22 엘지디스플레이 주식회사 유기발광다이오드 표시장치 및 그의 구동방법
US20090099066A1 (en) 2007-06-29 2009-04-16 Avi Biopharma, Inc. Tissue specific peptide conjugates and methods
US20100016215A1 (en) 2007-06-29 2010-01-21 Avi Biopharma, Inc. Compound and method for treating myotonic dystrophy
CA2884340C (en) 2007-11-15 2017-07-25 Sarepta Therapeutics, Inc. Method of synthesis of morpholino oligomers
US8697858B2 (en) 2009-11-13 2014-04-15 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating influenza viral infection

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