CN101103111A - 用于治疗呼吸道病毒感染的组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了干扰呼吸道病毒感染，包括呼吸道合胞体病毒和甲型禽流感病毒(包括H5N1株)中的病毒复制的siRNA组合物。本发明进一步提供了siRNA组合物的用途，所述的组合物用于抑制呼吸道病毒感染的细胞中的病毒基因表达，并用于治疗患者的呼吸道病毒感染。总的来说，本发明提供了多核苷酸、双链多核苷酸或发夹结构多核苷酸，所述的多核苷酸包含15-30个碱基的第一核苷酸序列及其互补序列，所述的第一核苷酸序列靶向呼吸道合胞体病毒或甲型流感病毒的基因组。另外，本发明提供了含有siRNA序列的载体、细胞和药物组合物。

Description

用于治疗呼吸道病毒感染的组合物及其用途
技术领域
本发明涉及干扰呼吸道病毒感染，特别是呼吸道合胞体病毒和甲型禽流感病毒(包括H5N1株)中的病毒复制的siRNA组合物。本发明进一步涉及siRNA组合物的用途，所述的组合物用于抑制病毒基因在呼吸道病毒感染的细胞中的表达，并用于治疗患者的呼吸道病毒感染。
背景技术
几个世纪以来，呼吸道病毒感染已经成为人类健康和生命的重大威胁。众所周知的事件包括由流感病毒株、呼吸道合胞体病毒引起的感染以及严重急性呼吸器官综合症(SARS)。这些包括1981年的全球性流感大流行，其导致全世界范围内约20-40百万人口死亡。在最近的十年里也存在其它的流感大流行。2002年SARS的爆发夺去了大约800条生命(2)。
呼吸道合胞体病毒
呼吸道合胞体病毒(RSV)感染是严重的儿童呼吸道疾病的主要原因。大约三分之二的婴儿在生命的第一年里感染RSV并且几乎100％的婴儿在两岁时已经感染了RSV。目前不存在特异性和有效的治疗剂来用于治疗RSV感染。
呼吸道合胞体病毒(RSV)是有包膜的，不分节的单链负链RNA病毒(NNR)，其属于单链负链病毒目中的副粘病毒科(14，29)。副粘病毒共同具有下列性质。1)它们具有病毒核衣壳蛋白(N)紧紧包被的单链RNA基因组29，30。2)亚基因组mRNA通过RdRP从负基因组转录。3)病毒复制在宿主细胞的细胞质中进行。RSV从感染到子代病毒颗粒释放的生命周期的细节得以充分地研究(15)。
RSV基因组是15.5kb长的负链，包含基因3′-NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2、L-5′(见图1)。这些基因中有7个基因产物是和其它的副粘病毒3共有的，即N、P、M、SH、G、F和L。一些病毒或宿主因子涉及调节RNA转录和复制(20)。另外，存在病毒顺式作用信号，这些信号在mRNA转录和RNA复制中起调节作用(3)。
RSV感染的潜伏期大约为4-5天；它首先感染鼻咽，然后在几天内，它到达支气管和细支气管，感染局限于呼吸上皮的浅层。
甲型流感
从1997年开始，出现了新的甲型禽流感株，即H5N1。虽然主要局限于禽类(野生群体和家禽两者)，但是该病毒显然仅感染与受感染的禽类直接接触的人。在人中，该感染引起严重疾病，导致人的严重呼吸器官疾病和死亡(3-12)。许多案例和爆发已经在东南亚的许多国家发生。鉴于禽病毒感染人的能力，存在增加的突变成传染性人变种的风险，具有出现新的流感大流行的风险，该流感大流行具有有效且持续的人与人之间的传播和高的死亡率。
由于禽流感H5N1是一种新出现的与肺炎相关的传染性病原体并且它的病理学和机制不是很清楚，因而在人的疾病案例中仍没有用于H5N1禽流感的特异性和有效的治疗。目前，流感感染用抗病毒剂，例如这两种药物(属于神经氨酸酶抑制剂类)：奥塞米韦(商业上称为Tamiflu)和扎那米韦(商业上称为Relenza)或老的M2抑制剂金刚烷胺和金刚乙胺治疗。
H5N1是甲型流感病毒的一个亚型。因而它是有包膜的，有分节的负单链RNA病毒，属于正粘病毒科。在甲型流感病毒(包括H5N1)的生命周期中，病毒基因组RNA(vRNA)用作互补RNA(cRNA)产生的模板，所述的病毒基因组RNA还用作信使RNA(mRNA)产生的模板。在病毒复制过程中产生的这三种类型的RNA分子的每种都能用有义或反义siRNA来靶向，用于siRNA介导的降解。甲型流感基因组，其由包含至少10个开放阅读框(ORF)的8个单独的RNA片段构成，可用作病毒基因组复制和亚基因组或基因引导的mRNA合成的模板。图2显示了描述甲型流感病毒颗粒结构的图示。聚合酶PB2、PB1(聚合酶碱性蛋白1和2)和PA(聚合酶酸性蛋白)分别由RNA1、RNA2和RNA3编码。四种病毒结构蛋白H(血凝素)、N(神经氨酸酶)、M1和M2(基质蛋白1和2)分别由RNA片段4、6和7编码，而RNA5编码NP(核壳体蛋白)以及RNA8编码NS1和NS2(非结构蛋白1和2)。
RNA干扰
RNA干扰(RNAi)是序列特异性RNA降解过程，所述的过程提供了相对容易和直接的方式来分解或沉默理论上的任何基因(17、18、19)。在自然发生的RNA干扰中，双链RNA通过RNA酶III/螺旋酶蛋白Dicer切割成小干扰RNA(siRNA)分子中，即在3′末端具有2-nt突出端的19-23个核苷酸(nt)的dsRNA。这些siRNA整合进称为RNA-诱导-沉默复合体(RISC)的多组分-核糖核酸酶中。siRNA的一条链保持与RISC结合，并引导该复合体接近与RISC中的该ss-siRNA引导序列互补的同源RNA。这种siRNA引导的核酸内切酶消化该RNA，从而使其失活。目前的研究已经表明，化学合成的21-25nt siRNA的使用在哺乳动物细胞中显示出RNAi效果(20)，并且siRNA杂交(在末端或中间)的热力学稳定性在决定该分子的作用中起重要作用(21，22)。RISC、siRNA分子和RNAi的这些及其它特性已经得以描述(23-28)。
在实验室或潜在地在治疗应用中，RNAi在哺乳动物细胞中的应用使用了化学合成的siRNA或内源性表达的分子(2，21)。内源性siRNA首先通过表达载体(质粒或病毒载体)表达成小型发夹结构RNA(shRNA)，并然后通过Dicer加工成siRNA。据认为siRNA很有希望成为用于人类疾病，特别是由病毒感染引起的疾病的治疗剂(19、20、27-30)。
重要的是，目前不可能以任何可信度去预测可能靶向病毒基因组序列的多种可能的候选siRNA(例如约16-30个碱基对的寡核苷酸)中哪个将实际上会显示出有效的siRNA活性。因而，必须产生并检验单独的特定候选siRNA多核苷酸或寡核苷酸序列以确定是否已经发生了对靶基因的期望干扰。因此，本领域可以设计确信能够特异性改变给定mRNA的表达的siRNA多核苷酸。
仍然相当需要抑制病毒病原体基因和它们的同源蛋白质产物的表达的组合物和方法。特别是迫切需要组合物和方法来抑制致病性呼吸道病毒基因在病毒感染的细胞中表达，并用于在受试者中治疗呼吸道病毒感染。此外，需要治疗RSV和甲型禽流感，特别是H5N1株感染的组合物和方法。另外还需要用于治疗的组合物和方法，所述的治疗是非常有效的，并且不依赖于使用或修饰已知的抗病毒剂。本发明解决了这些问题并满足了相关的需要。
发明内容
本发明提供了涉及使用RNA干扰来抑制病毒感染和复制的组合物和方法，所述的抑制是通过分裂病毒病原体，例如那些引起呼吸道病毒感染的病毒病原体(包括甲型流感H5N1和RSV)的病毒RNA分子来获得的。这些病毒是在人和其它哺乳动物中引起严重呼吸道疾病的病原体。抑制病毒复制将对抗感染了病毒的培养细胞和受试者中的病毒感染，包括减轻它的症状。
在第一个方面，本发明提供了分离的多核苷酸，所述多核苷酸的长度可以是15-200之间任何数目的核苷酸。多核苷酸包括靶向呼吸道合胞体病毒或甲型流感病毒的基因组的第一核苷酸序列。在该多核苷酸中，任意T(胸腺嘧啶)或任意U(尿嘧啶)可以任选地由其它碱基取代。另外，在多核苷酸中第一核苷酸序列由以下构成：a)长度为15-30之间任何数目的核苷酸的序列，或b)在a)中给出的序列的互补序列。这种多核苷酸在此可以称为线性多核苷酸。
在本发明一个相关方面，上面描述的多核苷酸进一步包括通过环序列与第一核苷酸序列分开的第二核苷酸序列，从而第二核苷酸序列
a)具有与第一核苷酸序列基本相同的长度，并且
b)是与第一核苷酸序列基本互补的。
在该后面的结构中，称为发夹结构多核苷酸，第一核苷酸序列与第二核苷酸序列杂交而形成发夹结构，所述发夹结构的互补序列通过环(loop)序列连接。
在线性多核苷酸和发夹结构多核苷酸的许多实施方案中，第一核苷酸序列是：
a)选自SEQ ID NO：1-263的序列；
b)比a)项中给出的序列长的靶向序列，其中该靶向序列(targeting sequence)靶向呼吸道病毒的基因组并包括选自SEQ IDNO：1-263的序列；
c)选自SEQ ID NO：1-263的序列的片段，其中所述片段由长度为至少15个核苷酸且至多比所选择的序列短一个碱基的连续碱基序列构成；
d)其中最多有5个核苷酸不同于选自SEQ ID NO：1-263的序列的序列；或
e)在a)-d)中给出的任何序列的互补序列。
在线性多核苷酸或发夹结构多核苷酸的多种实施方案中，第一核苷酸序列的长度是21-25之间任何数目的核苷酸。在许多实施方案中，线性多核苷酸或发夹结构多核苷酸由选自SEQ ID NO：1-263的序列构成，并任选包含结合至所选择的序列3′的二核苷酸突出端。然而，在线性多核苷酸或发夹结构多核苷酸的另外的实施方案中，位于第一核苷酸序列的3′末端的二核苷酸序列是TT、TU、UT或UU并且包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或两者。在多个其它的实施方案中，线性或发夹结构多核苷酸可以是DNA，或者它可以是RNA，或者它可以由脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸两者构成。
在本发明的另外方面提供了双链多核苷酸，所述的双链多核苷酸包括在权利要求1中描述的第一条多核苷酸链和与第一条链的至少第一核苷酸序列互补并与其杂交而形成双链组合物的第二条多核苷酸链。这些多核苷酸结构也可以称为线性多核苷酸。
仍然在一另外方面中，本发明提供了包含两种或多种在权利要求1、权利要求2或两者中描述的靶向多核苷酸的组合物，这样该组合物的每个多核苷酸靶向靶标病毒的基因组中的不同序列。
由于与呼吸道病毒病原体靶标的高度相似性或同一性，并且在理论上不希望被结合的，相信一旦引入至病毒感染的细胞中，该多核苷酸会引起RNA干扰，导致病原体基因组RNA、互补RNA和信使RNA的消化。特别地，在本发明这些方面的重要实施方案中，相信在这些多核苷酸中的第一核苷酸序列或其互补序列形成RNA诱导沉默复合物(RISC)，所述的RNA诱导沉默复合物将多核苷酸siRNA序列引导至病原体基因组的RNA序列，从而促进病原体基因组的RNA的切割。
在另外的方面，本发明提供了包含由本发明的线性多核苷酸或发夹结构多核苷酸提供的序列的载体。在多个实施方案中，这些载体的任何一种可以是质粒、重组病毒、转座子或微小染色体。仍然在另外的方面，提供了通过本发明的一个或多个线性多核苷酸，或通过本发明的一个或多个发夹结构多核苷酸转染的细胞。
依然在另外的方面，本发明提供了药物组合物和可药用载体，所述的药物组合物包含一个或多个线性多核苷酸或发夹结构多核苷酸，或它们的混合物，其中每个多核苷酸靶向靶标病毒基因组中的不同序列。
然而在另外的方面，本发明提供了药物组合物和可药用载体，所述的药物组合物包含含有线性多核苷酸的一个或多个载体，或含有发夹结构多核苷酸的载体，或它们的混合物，其中每个载体含有靶向靶标病毒基因组中的不同序列的多核苷酸。
在药物组合物的多个实施方案中，载体包括合成的阳离子聚合物、脂质体、葡萄糖、表面活性剂或它们的任何两种或多种的组合。
依然在另一方面，本发明提供了合成线性多核苷酸或发夹结构多核苷酸的方法，所述的这两种多核苷酸具有靶向呼吸道合胞体病毒或甲型流感病毒的基因组的序列。该方法包括以下步骤：
a)提供包含活性反应末端并对应所述序列第一个末端的核苷酸的核苷酸反应物；
b)加入包含活性反应末端并对应该序列相继位置的另一核苷酸反应物，用来与来自前面步骤的活性末端反应并使该生长的多核苷酸序列增加一个核苷酸长度，并且除去不希望的产物和过剩的反应物，和
c)重复步骤b)直到加入了对应于该序列第二个末端的核苷酸的核苷酸反应物；
从而提供了完整的多核苷酸。
依然在另外的方面，本发明提供了用于用RNA抑制剂转染细胞的方法，其中该方法包括使细胞与包含一个或多个线性多核苷酸，或一个或多个发夹结构多核苷酸的组合物接触。在许多实施方案中，如此转染的细胞包含通过一个或多个多核苷酸靶向的呼吸道病毒。
然而在另一方面，本发明提供了抑制呼吸道病毒在经病毒感染的细胞中复制的方法，所述的方法包括使细胞与包含一个或多个线性多核苷酸，或一个或多个发夹结构多核苷酸的组合物接触，其中所述的一个或多个多核苷酸靶向病毒。
依然在另一方面，本发明提供了靶向呼吸道病毒的线性多核苷酸，或它们的两种或多种的混合物的用途，或者靶向呼吸道病毒的发夹结构多核苷酸，或它们的两种或多种的混合物的用途，所述的用途用于生产在受试者中有效治疗由呼吸道病毒引起的感染的药物组合物。在所述用途的多个实施方案中，受试者是人。
然而在另一方面，本发明提供了在受试者中治疗由呼吸道病毒引起的感染的方法。该方法包括施用有效剂量的靶向呼吸道病毒的线性多核苷酸，或它们的两种或多种的混合物给受试者，或者施用有效剂量的靶向呼吸道病毒的发夹结构多核苷酸，或它们的一种或多种的混合物给受试者。在这种方法的多个实施方案中，受试者是人。在另外的实施方案中，将线性多核苷酸和发夹结构多核苷酸两者都施用给受试者。
附图说明
图1.人呼吸道合胞体病毒(hRSV、RSV)(-)ssRNA基因组的示意图。基于GenBank登记号NC_001781。
图2.甲型流感病毒结构的示意图。该图显示了整合于病毒颗粒中的病毒基因组的8个片段。
图3.本发明多核苷酸的多种实施方案的示意图。图A，线性多核苷酸的实施方案。长度为200或低于200个核苷酸，并且为15个或大于15个核苷酸。在b)中，特异性靶向序列包含于更长的靶向序列中。在d)中较黑的直条图解表示取代的核苷酸。图B，全长为200个核苷酸或少于200个核苷酸的发夹结构多核苷酸的实施方案。
图4.显示H5N1基因组中siRNA序列的位置的示意图
图5.在MDCK细胞培养基中H5N1病毒生长的抑制
图6.在不同时间点测定的siRNA的抑制效果
具体实施方式
在这里确定的所有专利、专利申请公开内容和专利申请通过全文引用作为参考，就如同在这里是逐字显现的。在此确定的所有技术公开内容也通过引用作为参考。
在当前描述中，冠词“a”、“an”和“the”等价地指单数或复数含义。这些冠词的特殊意思在使用它们的上下文中是明显的。
如于此使用的，术语“靶标”序列以及类似的术语和短语涉及本发明多核苷酸所针对的存在于病原体基因组中的核苷酸序列。多核苷酸a)通过包括与病原体基因组内包含的特定子序列(称为靶标序列)同源或者相同的序列，或者b)通过包括其互补序列与所述靶标序列同源或相同的序列来靶向病原体序列。根据RNA干扰现象，相信靶向病原体序列的任何多核苷酸具有与靶标序列杂交的能力，因而起始了RNA干扰。
如此处使用的，术语“互补序列”、“互补性序列”及相似的术语和短语指其碱基形成互补碱基对(碱基对碱基)的两个序列，如领域如生物化学、分子生物学、基因组学及与本发明领域相关的类似领域中的技术人员常规理解的。
如此处使用的，当在序列或子序列的每个位点上第一个序列或子序列具有与第二个序列或子序列相同的碱基时，第一个序列或子序列是与第二个序列或子序列“相同的”，或具有“100％的同一性”，或通过表达100％同一性概念的术语或短语来描述。在测定同一性时，包含T(胸腺嘧啶)或任何它的衍生物，或U(尿嘧啶)或任何它的衍生物的任何特定碱基位置是彼此相同的，因而认为是同一的。
如于此描述的，靶向多核苷酸的序列或其互补序列可以与靶序列完全相同，或者其在序列的特定位置可以包含错配的碱基。在这里充分描述了错配的整合。尽管不愿受理论束缚，据信整合入错配在生理学条件下提供了期望水平的杂交稳定性来优化对讨论的特定靶序列的RNA干扰现象。同一性程度决定了在两个序列中其碱基彼此相同的位置的百分比。“序列同一性百分比”是通过这样计算的：在比较区来比较经最佳比对的两个序列，测定两个序列中都出现相同核酸碱基(在核酸的情形中，例如A、T或U，C、G或I，)处的位置数以获得匹配位置数，用匹配位置数除以比较区内(即窗口大小)的位置总数，并将结果乘以100而得到序列同一性的百分比。彼此低于100％相同的序列是“相似的”或“同源的”；同源性程度或百分比相似性是指如在下面段落中确定的两个序列或子序列之间的同一性的百分比的同义术语。例如，彼此显示出至少60％的同一性，或优选至少65％的同一性，或优选至少70％的同一性，或优选至少75％的同一性，或优选至少80％的同一性，或更优选至少85％的同一性，或更优选至少90％的同一性，或更优选至少95％的同一性的两个序列是彼此“相似的”或“同源的”。备选地，关于siRNA分子的寡核苷酸序列，有5个或少于5个的碱基，或有4个或少于4个的碱基，或有3个或少于3个的碱基，或有2个或少于2个的碱基，或有一个碱基不同的两个序列称为彼此“相似的”或“同源的”。
如本领域已知的，“同一性”是两个或多个多肽序列或者两个或多个多核苷酸序列之间的关系，如通过比较序列来确定。在本领域中，“同一性”也指多肽或多核苷酸序列之间的序列亲缘关系水平，根据具体情况而定，如通过在这些序列的字符之间匹配来测定。“同一性”和“相似性”可以容易地通过已知方法计算，所述的方法包括但不限于在(Computational Molecular Biology，Lesk.A.M.，ed.，OxfordUniversity Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics andGenome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I.Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，eds.Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，eds.，MStockton Press.New York，1991；以及Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.(1988)48：1073中描述的那些方法。用于测定同一性的优选方法是设计来在检验的序列之间产生最大匹配。用于测定同一性和相似性的方法编码于公共可获得的计算机程序中。用于测定两个序列之间的同一性和相似性的优选计算机程序方法包括，但不限于GCG程序包(Devercux，J等(1984)，Nucleic Acids Research 12(1)：387)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Atschul，S.F.等(1990)J.Molec.Biol.215：403-410。BLASTX程序是从NCBI和其它来源(BLAST Manual，Altschul，S.，等，NCBINLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)可公共可获得的。众所周知的Smith Waterman算法也可以用于测定同一性。
序列比较的参数包括下面的算法：Needleman和Wunsch，J.MolBiol.48：443-453(1970)。
比较矩阵：来自Hentikoff and Hentikoff，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89：10915-10919的BLOSSUM62。
如在此使用的，术语“分离的”，和类似的词，在用于描述核酸、多核苷酸或寡核苷酸时，指从它的天然或初始状态移开。因而，如果它是天然存在的，则它已经从其初始环境中移开。如果它已经通过合成制备，则它已经从该合成产生的初始产物的混合物中分离。例如，天然存在于生物体(以其自然状态)中的天然出现的多核苷酸是未经“分离”的，但是从与其共存的物质中分离的相同的多核苷酸是“分离的”，如在此采用的术语。通常，除去至少一种显著共存的物质构成了“分离的”核酸、多核苷酸、寡核苷酸。在多数情况下，可以去除数种、许多或大多数共存的物质来分离核酸、多核苷酸、寡核苷酸、蛋白质、多肽或寡肽。作为非限制性的实例，对于多核苷酸，术语“分离的”可以表示它从其天然存在的染色体和细胞中分离。进一步的实例是，“分离的”蛋白质或多肽可以表示使其从细胞溶解产物或细胞均浆中的另一种成分分离。
作为体外合成方法或化学合成方法的产物的核酸、多核苷酸或寡核苷酸基本上通过合成方法分离。在重要的实施方案中，处理这种合成产品以去除使用的试剂和产物母体，以及通过该方法产生的副产品。
同样，多核苷酸和多肽可以存在于例如不是天然存在的组合物的组合物中，例如制剂、用于将多核苷酸引入至细胞中的组合物、用于化学或酶促反应的组合物或溶液，并且，其中保留有如在此采用的术语的意义范围内的分离的多核苷酸或多肽。
如在此和在权利要求中使用的，“核酸”或“多核苷酸”，以及基于这些的类似术语指由天然存在的核苷酸构成的聚合物以及由合成的或经修饰的核苷酸构成的聚合物。从而，如在此使用的，是RNA的多核苷酸，或者是DNA的多核苷酸可以包含天然存在的部分例如天然存在的碱基和核糖或脱氧核糖环，或者它们可以如下面描述的由合成的或经修饰的部分构成。核苷酸之间的键通常是3′-5′磷酸键，其可以是天然的磷酸二酯键、磷酸硫酯键和其它合成的键。经修饰的主链的实例包括，硫代磷酸酯(phosphorothioates)、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基和其它的烷基磷酸酯包括3′-亚烷基磷酸酯、5′-亚烷基磷酸酯和手性磷酸酯、亚磷酸酯、氨基磷酸酯包括3′-氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒基磷酸酯和硼烷基磷酸酯。另外的键包括磷酸三酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基酯、氨基乙酸酯，氨基甲酸酯、硫醚、桥联的氨基磷酸酯、桥联的亚甲基磷酸酯、桥联的硫代磷酸酯和磺基核苷酸间键合。其它聚合物键包括这些的2′-5′链连类似物。参见美国专利6,503,754和6,506,735和于此引用的参考文献，在这里通过引用作为参考。
核酸和多核苷酸长度可以是20个或更多的核苷酸，或者是30个或更多的核苷酸，或者是50个或更多的核苷酸，或者是100个或更多的，或者是1000个或更多的，或者是数万个或更多的，或者是数十万个或更多的核苷酸。siRNA可以是如在此定义的多核苷酸。如在此使用的，“寡核苷酸”和基于“寡核苷酸”的类似术语涉及由天然存在的核苷酸构成的短聚合物，也涉及由合成的或经修饰的核苷酸(如在前面的段落中刚描述的)构成的聚合物。寡核苷酸长度可以是10个或更多的核苷酸，或15个、或16个、或17个、或18个、或19个、或20个或更多的核苷酸，或者21个、或者22个、或者23个、或者24个或更多的核苷酸，或者25个、或者26个、或者27个、或者28个或29个、或者30个或更多的核苷酸，或者35个或更多的、40个或更多的、45个或更多的、达到约50个核苷酸。作为siRNA的寡核苷酸可以具有15-30个核苷酸之间的任何数量的核苷酸。在许多实施方案中，siRNA可能具有21-25个核苷酸之间的任何数量的核苷酸。
从刚提供的定义中可以理解，由于尺寸范围的重叠，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”在此可以等同使用来指本发明的siRNA。
如在此和在权利要求中使用的，“核苷酸序列”、“寡核苷酸序列”或“多核苷酸序列”，以及类似的术语可互换地指寡核苷酸或多核苷酸具有的碱基序列，也涉及具有该序列的寡核苷酸或多核苷酸结构。此外，核苷酸序列或多核苷酸序列涉及任何天然的或合成的多核苷酸或寡核苷酸，其中碱基序列是通过表示碱基的字母的特定序列的描述或列举所定义，所述的表示碱基的字母是如本领域中常规采用的。
在寡核苷酸和多核苷酸中的碱基可以是“未修饰的”或“天然的”碱基，所述的碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。另外，它们可以是具有修饰或取代基的碱基。如在此使用的，经修饰的碱基的非限制性实例包括其它合成的和天然的碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫脲嘧啶、2-巯基胸腺嘧啶和2-巯基胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其它炔基衍生物、6-氮杂尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫脲嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基以及其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-氟-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其它经修饰的碱基包括三环嘧啶例如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯丙噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G-clamps例如经取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3′、2′：4，5]吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-酮)。经修饰的碱基还包括其中嘌呤或嘧啶碱基经其它杂环取代的那些碱基，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤核苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。其它碱基包括在美国专利No.3,687,808中公开的那些碱基、在The Concise Encyclopedia OfPolymer Science And Engineering，pages 858-859，Kroschwitz，J.L，ed.John Wiley & Sons，1990中公开的那些碱基、由Englisch等，Angewandte Chemie，International Edition(1991)30，613公开的那些碱基，以及由Sanghvi，Y.S.，Chapter15，AntisenseResearch and Applications，pages 289-302，Crooke，S.T.和Lebleu，B.，ed.，CRC Press，1993公开的那些碱基。这些碱基的某些特别是可用于增加本发明寡聚化合物(oligomeric compounds)的亲合性。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已经显示能增加核酸双链体的稳定性0.6-1.2个水平(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.和Lebleu，B.，eds.，Antisense Research and Applications，CRC Press，Boca Raton，1993，pp.276-278)并且是目前优选的碱基取代，在与2′-O-甲氧乙基糖修饰组合时甚至更优选。参见美国专利6,503,754和6,506,735和在其中引用的参考文献，在这里将它们引入作为参考。任何经修饰的碱基的使用等同于具有相同碱基配对特性的天然存在的碱基的使用，如本领域技术人员所理解的。
如在此和在权利要求中使用的，术语“互补”和基于“互补”的类似词语，指在核酸、多核苷酸或寡核苷酸的一条链中的第一核酸碱基只与在核酸、多核苷酸或寡核苷酸的另一条链中的特定的第二核酸碱基特异性相互作用的能力。作为非限制性的实例，如果考虑天然存在的碱基，A和T或U可彼此相互作用，以及G和C可彼此相互作用。如在本发明中和权利要求中使用的，“互补”用旨在表示“完全互补”，即，当两条多核苷酸链互相比对时，将会至少存在一部分链，在该链中，一条链中的连续碱基序列中的每个碱基与在相对链上相同长度的连续碱基序列中的相互作用的碱基互补。
如在此使用的，“杂交”、“杂交化”以及类似的词语涉及通过使具有互补序列的链彼此相互作用来形成核酸、多核苷酸或寡核苷酸双链体的过程。由于每条链上的互补碱基特异性相互作用而形成碱基对而使相互作用发生。链相互杂交的能力取决于多种条件，如在下面列出的。核酸链在每条链中有足够数量的相对应位置由可以相互作用的核苷酸占据时相互杂交。本发明领域中的熟练技术人员包括分子生物学家和细胞生物学家(作为非限制性的实例)可理解，形成双链体的链的序列不需要彼此100％的互补而能特异性杂交。
如此处使用的，“片段”以及基于“片段”的类似词语指短于全长参照序列的核酸、多核苷酸或寡核苷酸的部分。片段中的碱基序列未经改变地来自产生该片段的分子的对应部分的序列；与其产生它的分子的相应部分比较在该片段中不存在插入或缺失。如在此考虑的，核酸或多核苷酸(例如寡核苷酸)的片段长度是15个或更多碱基、或者16个或更多、17个或更多、18个或更多、19个或更多、20个或更多、21个或更多、22个或更多、23个或更多、24个或更多、25个或更多、26个或更多、27个或更多、28个或更多、29个或更多、30个或更多、50个或更多、75个或更多、100个或更多，多达比全长序列短一个碱基的长度。寡核苷酸可以是化学合成的并且可以用作siRNA、PCR引物或探针。
检测和标记。靶向多核苷酸，例如包含siRNA序列的多核苷酸，以及病毒多核苷酸靶标可以以多种方式检测。检测可以包括导致能够观测靶向多核苷酸的存在和或数量的任何一种或多种方法。在一个实施方案中，含有靶向多核苷酸或病毒靶标的样品核酸可以在扩增之前检测。在一个备选的实施方案中，可以扩增样品中的靶向多核苷酸来提供增加的靶向多核苷酸，或者是扩增的病毒靶标，并检测或定量该扩增的多核苷酸。物理、化学或生物学方法可用于检测和定量靶向多核苷酸。物理方法包括，作为非限制性实例，表面等离子共振(SPR)检测法，例如使探针结合至表面并使用SPR来检测靶向多核苷酸结合至固定的探针上，或在层析介质中放入探针并检测层析介质中靶向多核苷酸的结合。物理方法进一步包括凝胶电泳或毛细管电泳形式，其中将靶向多核苷酸从其它的多核苷酸分解，并且检测该分解的靶向多核苷酸。化学方法通常包括聚合酶链式反应(PCR)方法，以及其中靶向多核苷酸与探针杂交的杂交方法。生物学方法包括使靶向多核苷酸或靶标多核苷酸对细胞产生生物效应，并检测该效应。本发明公开了可以用作生物学检测法的生物效应的实例。这些包括通过颗粒计数、噬菌斑测定、对感染细胞的细胞病变效应评估等来计算病毒颗粒。在许多实施方案中，可按下面描述地标记多核苷酸以助于检测和定量。例如，在不包括扩增的实施方案中，样品核酸可以通过化学或酶促添加标记部分(例如标记核苷酸或标记寡核苷酸连接序列)来标记。
扩增的多核苷酸可以直接检测和/或定量。例如，可以在凝胶中对扩增的多核苷酸进行电泳以便按大小解析，并用染料染色显示它的存在和数量。备选地，扩增的靶向多核苷酸可以在杂交条件下暴露于探针核酸(见下文)并检测和/或定量通过杂交的结合而得以检测。检测可以以允许测定靶向多核苷酸已经结合至探针的任何方式完成。这可通过检测由杂交片段引起的探针物理性质的变化来完成。这种物理检测方法的非限制性实例是SPR。
完成检测的备选方法是使用标记形式的扩增多核苷酸，并且检测结合的标记。标记可以是放射性同位素标记，例如125I、35S、32P、14C或3H，例如这些标记可通过它们的放射性检测。备选地，可以选择标记，这样使得其可以用光谱法，例如通过荧光、磷光或化学发光检测。因而可以采用发荧光的，或发出磷光的，或引起化学发光反应的标记。此外标记还可以是在特异性配体-受体对中的配体，该配体的存在则可通过第二次结合特异性受体来检测，所述的受体通常是自身经标记用于检测的。
干扰RNA
根据本发明，呼吸道病毒靶标的基因表达通过RNA干扰来削弱。病毒基因的表达产物通过特异性双链siRNA核苷酸序列靶向，所述的核苷酸序列至少与含有15-30之间任何数量的核苷酸，或在多数情况下，含有21和25个核苷酸之间任何数量的核苷酸的病毒靶标的片段互补。靶标序列可以出现在5′非翻译(UT)区中、编码序列中或3′UT区中。参见，例如，PCT申请WO00/44895、WO99/32619、WO01/75164、WO01/92513、WO01/29058、WO01/89304、WO02/16620和WO02/29858，每个在此通过全文引用作为参考。
根据本发明的方法，呼吸道病毒基因的表达，并由此呼吸道病毒的复制可用siRNA来抑制。根据本发明的靶向多核苷酸包括siRNA寡核苷酸。这种siRNA也可以通过化学合成与病毒序列相同或相似的核苷酸序列来制备。参见，例如，Tuschl，Zamore，Lehmann，Bartel andSharp(1999)，Genes & Dev.13：3191-3197，在此通过全文引用作为参考。备选地，靶向siRNA可以使用靶向多核苷酸序列，例如通过在无细胞系统(例如但不限制于果蝇提取物)中消化呼吸道病毒的核糖多核苷酸，或者通过转录重组双链病毒cRNA来获得。
使用由16-30nt的有义链和相同长度的16-30nt的反义链构成的siRNA双链体通常可观察到有效的沉默。在许多实施方案中，siRNA配对双链体的每条链在3′末端另外具有2-nt的突出端。2-nt 3′突出端的序列对siRNA靶标识别的特异性提供了额外的较小的贡献。在一个实施方案中，位于3′突出端的核苷酸是核糖核苷酸。在一个备选的实施方案中，位于3′突出端的核苷酸是脱氧核糖核苷酸，3′脱氧核苷酸的使用提供了增强的细胞内稳定性。
本发明的重组表达载体，当介导入细胞内时，经加工而提供包含靶向呼吸道病毒的siRNA序列的RNA。这种载体是以允许表达的方式克隆进表达载体的DNA分子，所述的表达载体包含有效连接的位于病毒靶向序列旁侧的调控序列。与病毒RNA反义的RNA分子通过第一个启动子(例如，克隆DNA 3′的启动子序列)转录并且病毒RNA靶标的有义链的RNA分子通过第二个启动子(例如克隆DNA 5′的启动子序列)从该载体转录。有义和反义链然后在体内杂交以产生用于沉默病毒基因的靶向呼吸道病毒的siRNA构建体。备选地，可以使用两个构建体来产生siRNA构建体的有义和反义链。此外，克隆DNA能够编码具有二级结构的转录产物，其中单个转录产物具有来自靶基因或基因的有义序列和互补的反义序列两者。在这个实施方案的一个实例中，发夹结构的RNAi产物与全部或部分靶基因相似。在另一个实例中，发夹结构的RNAi产物是siRNA。在病毒序列旁侧的调控序列可以是相同的或者可以是不同的，这样它们的表达可以独立地调控，或以时间或空间的方式调控。
在某些实施方案中，siRNA通过克隆病毒基因模板进含有，例如来自小核RNA(snRNA)U6或人RNase P RNA H1的RNA聚合酶III转录单位的载体而得以在细胞内转录。载体系统的一个实例是GeneSuppressorTM RNA干扰试剂盒(购自Imgenex)。U6和H1启动子是III型Pol III启动子的成员。类U6启动子的+1核苷酸总是鸟嘌呤核苷，然而H1启动子的+1核苷酸是腺嘌呤核苷。这些启动子的终止信号由5个连续的胸腺嘧啶脱氧核苷确定。转录产物通常在第二个尿苷后裂解。在该位置裂解在表达的siRNA中产生了3′UU突出端，其类似于合成的siRNA的3′突出端。长度少于400个核苷酸的任何序列可以通过这些启动子转录，从而它们理想地适合约21-核苷酸的siRNA在例如大约50-核苷酸RNA茎环(stem-loop)转录产物中的表达。已经研究了RNAi和影响siRNA效力的因子的特征(参见，例如Elbashir，Lendeckel和Tuschl(2001)Genes & Dev.15：188-200)。
对可利用的核苷酸序列文库进行初始BLAST同源性检索选择的siRNA序列以确保只靶向病毒基因，而不是宿主基因。参见，Elbashir等，2001 EMBO J.20(23)：6877-88。
多核苷酸的合成
对应靶向核苷酸序列的寡核苷酸，以及包含靶向序列的多核苷酸可以通过标准合成技术，例如使用自动化DNA合成仪来制备。用于合成寡核苷酸的方法包括熟知的化学方法，包括(但不限于)连续添加核苷酸亚磷酰胺至表面衍生化颗粒，如由T，Brown和Dorcas J.S.Brown在Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach，F.Eckstein，editor，Oxford University Press，Oxford，pp.1-24(1991)中描述的，并且在这里将其通过全文引用作为参考。
合成方法的一个实例使用Expedite RNA亚磷酰胺和胸苷亚磷酰胺(Proligo公司，德国)。将使合成的寡核苷酸去保护并进行凝胶-纯化(Elbashir等，(2001)Genes & Dev.15，188-200)，随后通过Sep-Pak C18柱(Waters，Milford，Mass.，USA)纯化(Tuschl等，(1993)Biochemistry，32：11658-11668)。将互补的ssRNA在90℃下于退火缓冲液(100mM醋酸钾、pH为7.4的30mM HEPES-KOH、2mM醋酸镁)中培养1分钟，随后在37℃下培养1小时以便与对应的ds-siRNA杂交。
寡核苷酸合成的其它方法包括(但不限于)根据磷酸三酯和磷酸二酯方法的固相寡核苷酸合成法(Narang等，(1979)Meth.Enzymol.68：90)和H-磷酸酯方法(尤其是Garegg，P.J等，(1985)″Formationof internucleotidic bonds via phosphonate intermediates″，Chem.Scripta 25，280-282；和Froehler，B.C等，(1986a)″Synthesisof DNA Via deoxynucleoside H-phosphonate intermediates″，Nucleic Acid Res.，14，5399-5407)和载体合成方法(Beaucage等，(1981)Tetrahedron Letters 22：1859-1862)以及氨基磷酸酯技术(caruthers，M.H等，″Methods in Enzymology，″Vol.154，pp.287-314(1988))、美国专利5,153,319、5,132,418、4,500,707、4,458,066、4,973,679、4,668,777和4,415,732，以及在“Synthesisand Applications of DNA and RNA，”S.A.Narang，editor，AcademicPress，New York，1987中描述的其它方法，以及其中包括的参考文献，以及非亚磷酰胺技术。固相合成法有助于寡核苷酸从杂质和过剩的试剂中分离。一旦从固体载体分离，寡核苷酸可以进一步通过已知的技术分离。
本发明的抑制性多核苷酸
本发明广泛提供了用于一旦进入呼吸道病毒病原体感染的细胞中就能引起RNA干扰现象的寡核苷酸。本发明，虽然不限于呼吸道病毒靶标的种类，但重点是靶向RSV和多种甲型流感株的寡核苷酸。RNA干扰通过合适的双链RNA在细胞中发生，所述的双链RNA的一条链与病毒靶基因中的序列一致或高度相似。通常，靶向呼吸道病毒的寡核苷酸可以是DNA或RNA，或者它可能包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的混合物。后者的实例是在3′末端以脱氧二核苷酸序列，例如d(TT)、d(UU)、d(TU)、d(UT)，以及其它可能的二核苷酸的终止的RNA序列。在另外的实施方案中，3′突出端可以由具有上面指定碱基或其它碱基的核糖核苷酸构成。此外，寡核苷酸药物制剂可以是单链的或双链的。本发明的治疗性寡核苷酸的数个实施方案可以认为是寡核糖核苷酸或具有3′d(TT)末端的寡核糖核苷酸。单链的靶向多核苷酸，一旦进入哺乳动物细胞中，容易通过细胞中存在的内源性酶活性转化成双链分子。
最一般的，本发明提供了长度可以是15个核苷酸至200个核苷酸的任何长度的寡核苷酸或多核苷酸。多核苷酸包括靶向呼吸道合胞体病毒或甲型流感病毒的基因组的第一核苷酸序列。所述的第一核苷酸序列由a)其长度是15-30之间任何数目的核苷酸的序列，或b)它的互补序列构成。这种多核苷酸在这里称为线性多核苷酸。
图3提供了本发明多核苷酸的某些实施方案的示意图。本发明公开了在RSV或多种甲型流感株中的靶序列，或在某些方案中公开了与靶序列稍微错配的siRNA序列，所有的这些在SEQ ID NO：1-263中提供。在此公开的序列长度为19个核苷酸至25个核苷酸。靶向序列在图3中通过浅的阴影区段表示。图3小图A，a)阐明了一个实施方案，其中显示为“SEQ”的公开序列可以任选地包含于全长可以达到200个核苷酸的更长的多核苷酸中。
本发明另外提供的是，在靶向多核苷酸中，选自SEQ ID NO：1-263的序列可以是更长的靶向序列的部分，这样该靶向多核苷酸就可以靶向比由SEQ表示的第一核苷酸序列长的病毒基因序列。这在图3，小图A，b)中得以阐明，其中完整的靶向序列用多核苷酸上方的水平线显示，并且用在SEQ区段周围的较暗的阴影显示。如在多核苷酸的所有实施方案中，这种较长的序列可以任选地包含于更长的多核苷酸(长度为200或少于200的碱基)中(图3，小图A，b)。
本发明进一步提供了是任意SEQ ID NO：1-263的片段的序列，所述的片段长度至少为15个核苷酸(并且至多比参照SEQ ID NO：短一个碱基；在图3，小图A，c)中说明)，以及其中多达5个核苷酸可以与SEQ ID NO：1-263提供的靶序列不同的序列(在图3，小图A，d)中阐明，在该实例中显示了由三条较暗的直条表示的三个不同的碱基)。
本发明更进一步提供了与任何的上述序列互补的序列(在图3，小图A，e)中显示，并称为“COMPL”)。任何这些序列包含于本发明的寡核苷酸或多核苷酸中。本发明的任何线性多核苷酸可以只由在上面a)-e)中描述的序列构成，或者任选可以包含另外的碱基达到200个核苷酸限制。由于RNA干扰需要双链RNA，靶向多核苷酸本身可以是双链的，该双链包括与SEQ ID NO：1-263提供的至少一个序列互补并与其杂交的第二条链，或者可依靠细胞内过程来产生互补链。
从而，多核苷酸可以是单链的，或者它可以是双链的。在更进一步的实施方案中，多核苷酸仅包含脱氧核糖核苷酸，或者它仅包含核糖核苷酸，或者它包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸两者。在于此描述的多核苷酸的重要实施方案中，靶序列由长度可以是15个核苷酸(nt)，或16nt、或17nt、或18nt、或19nt、或20nt、或21nt、或22nt、或23nt、或24nt、或25nt、或26nt、或27nt、或28nt、或29nt、或30nt的序列构成。依然在另外有利的实施方案中，靶向序列可以与病毒病原体基因组中的靶序列有多达5个碱基的差别。
在本发明的多个实施方案中，多核苷酸是由靶向序列构成的siRNA，其任选包含如在此描述的3′二核苷酸突出端。
备选地，鉴于在RNA干扰中需要双链RNA，寡核苷酸或多核苷酸可以制备形成分子内发夹环状的双链分子。这种分子由先前段落的任何实施方案中描述的第一个序列、后面的短的环序列、该环序列后面依次接着的与第一个序列互补的第二个序列构成。这种结构形成了期望的分子内发夹结构。而且，据公开这种多核苷酸同样具有200个核苷酸的最大长度，这样，列举的这三种需要的结构可以构成具有任何全长达到200个核苷酸的任何寡核苷酸或多核苷酸。发夹环状的多核苷酸在图3，小图B中说明。
作为靶标的RSV株
对于RSV，尽管可以靶向病毒基因组的任何部分，合理的是靶向编码病毒特异性酶促功能的基因应该提供有效的候选siRNA。这些基因包括L、F、G和P基因。L基因，位于病毒基因组的5′末端，只少量地表达，因此有效的RNAi沉默可能只需要少量的siRNA。也可以靶向结构基因。
RSV亚型A和B的以下代表性病毒株的序列可用于选择靶序列，所述的靶序列是亚型A和B之间共有的(表1)或者是亚型A特异性(表2)或亚型B特异性(表3)。
亚型A：A2株(GenBank M74568)和Long株(仅P-mRNA，GenBankM22644和F-mRNA，GenBank M22643)。
亚型B：B1株(GenBank NC_001781)和株9320(GenBank AY353550)。
比对病毒基因序列以寻找共有的或特有的区域。对于每种靶基因或区，选择至少两个靶标，除非不适用(NA)。寻找两种亚型共有的靶序列比寻找它们之一特有的靶标更困难，因为只存在非常少的同源或相同的序列可利用。
表1.RSV亚型A和B(A2、B1和9230株)共有的靶基因
靶标基因*   序列(5’to 3’)**   在A2上的位置(M734568)   在B1上的位置(NC_001781)   在9230上的位置(AY353550)     SEQ ID NO：
前导序列/NS1(-)链   AATGGGGCAAATAAGAATTTG   42-62   42-62   42-62     1
前导序列/NS1   AATGGGGCAAATAAGAATTTg   42-62   42-62   42-62     2
N   AAGATGGCTCTTAGCAAAGTc   1137-1157   1137-1157   1135-1155     3
P   AATTCCTAGAATCAATAAAGg   2401-2421   2403-2423   2401-2421     4
M   AAGCTTCACGAAGGCTCCACA   3279-3299   3281-3301   3279-3299     5
SH   NA
G   NA
F   AATGATATGCCTATAACAAAt   6444-6464   6449-6469   6447-6467     6
M2   AAGATAAGAGTGTACAATACT   7975-7995   7987-8007   7986-8006     7
M2/L   NA
L   AACATCCTCCATCATGGTTAA   9090-9110   9101-9121   9100-9120     8
L   AAGTACTAATTTAGCTGGACA   12973-12993   12984-13004   12983-13003     9
L   AAGATTGCAATGATCATAGTT   14133-14153   14144-14164   14143-14163     10
L   AACATTCATTGGTCTTATTTA   14243-14263   14254-14274   14253-14273     11
尾   NA
NA＝不适用
*靶标大部分是(+)链RNA，例如mRNA；除非另外说明，例如第一靶标。
**在设计siRNA时，对于每个这些小写字母的核苷酸(g、c或t)“错配”是需要的，以便减少siRNA双链体该末端的热力学能量值。用粗体小写字母的斜体字标出的碱基表示错配。
在这种情况(表1)下，有时需要将错配引入至RNA双链体一个末端的5′碱基中。
表2.亚型A特异性靶标基因(株A2 & Long株的F/P)
靶标基因   序列(5’to 3’)*     在A2基因组上的位置(M734568)     SEQ IDNO：
前导序列(-)链   AAATGCGTACAACAAACTTGC     9-29     12
前导序列   AACAAACTTGCATAAACCAAA     19-39     13
NS1   AAGAATTTGATAAGTACCACT     54-74     14
NS1   AACTAACGCTTTGGCTAAGGC     209-229     15
NS2   AATAAATCAATTCAGCCAACC     602-622     16
NS2   AACTATTACACAAAGTAGGAA     830-850     17
N   AACAAAGATCAACTTCTGTCA     1176-1196     18
N   AAGAAATGGGAGAGGTAGCTC     1558-1578     19
P   AATTCAACTATTATCAACCCA     2520-2530     20
P   AACAATGAAGAAGAATCCAGC     2676-2696     21
M   AAATAAAGATCTGAACACACT     3770-3790     22
M   AAATATCCACACCCAAGGGAC     3442-3462     23
M   AAATAAAGATCTGAACACACT     3770-3790     24
SH   AACATAGACAAGTCCACACAC     4266-4286     25
SH   AACAATAGAATTCTCAAGCAA     4320-4340     26
G   AAACAAGGACCAACGCACCGC     4696-4716     27
G   AACTTCACTTATAATTGCAGC     4840-4860     28
F   AAATAAGTGTAATGGAACAGA     5858-5878     29
F   AAACAATCGAGCCAGAAGAGA     5969-5989     30
M2   AAATAAGTGGAGCTGCAGAGT     7781-7801     31
M2   AACAATCAGCATGTGTTGCCA     7880-7900     32
M2/L   NA
L   AAGTTACATATTCAATGGTCC     8593-8613     33
L   AACTAAATATAACACAGTCCT     8685-8905     34
尾   NA
NA＝不适用
表3.亚型B特异性基因靶标(B1株和9320株)
靶标基因   序列(5’to 3’)*   在B1基因组上的位置(NC-001781)   在9320基因组上的位置(AY353550)   SEQIDNO：
前导序列(-)链   AATGCGTACTACAAACTTGCA   10-30   10-30   35
前导序列   AAATGCGTACTACAAACTTGC   9-29   9-29   36
NS1   AATTAATTCTTCTGACCAATG   196-216   196-216   37
NS1   AACAAGCAGTGAAGTGTGCCC   278-298   278-298   38
NS2   AATAATAACATCTCTCACCAA   700-720   700-720   39
NS2   AATGTATTGGCATTAAGCCTA   936-956   936-956   40
N   AAATAAGGATCAGCTGCTGTC   1175-1195   1173-1193   41
N   AACAAACTATGTGGTATGCTA   1272-1292   1270-1290   42
P   AATAAAGGGCAAGTTCGCATC   2416-2436   2414-2434   43
P   AACAAATGACAACATTACAGC   2725-2745   2723-2743   44
M   AATATGGGTGCCTATGTTCCA   3361-3381   3359-3379   45
M   AACATACTAGTGAAGCAGATC   3428-3448   3426-3446   46
SH   AAATACATCCATCACAATAGA   4308-4328   4306-4326   47
SH   AAACATTCTGTAACAATACTC   4445-4465   4443-4463   48
G   AATCTATAGCACAAATAGCAC   4796-4816   4794-4814   49
G   AATATTCATCATCTCTGCCAA   4866-4886   4864-4884   50
F   AAAGAAACCAAATGCAATGGA   5858-5878   5856-5876   51
F   AAACAAAGCTGTAGTCAGTCT   6187-6207   6185-6205   52
M2   AAATAAGTGGAGCTGCTGAAC   7793-7813   7792-7812   53
M2   AACAATCAGCATGTGTTGCTA   7892-7912   7892-7911   54
M2/L   NA
L   AAATAACATCACAGATGCAGC   9591-9611   9590-9610   55
L   AATACCTACAACAGATGGCCC   9931-9951   9930-9950   56
尾   NA
NA＝不适用
为了提供靶向病毒基因组的5′末端的siRNA试剂，株B1或株9320单独特有的末尾-靶标在下面显示(表4)。该(+)链(抗-基因组RNA)的5′末端是靶标，即病毒基因组开始复制时使用该正RNA链(抗基因组RNA)作为模板产生的新生引导序列。
表4.RSV亚型B的两种株的尾部靶标
    靶标基因   序列(5’to 3’)*   在B1基因组上的位置(NC_001781)  在9320基因组上的位置(AY353550) SEQIDNO：
  尾   AATTTAGCTTACTGATTCCAA   15098-15108  NA 57
  尾   AACTAACAATGATACATGTGC   15159-15179  NA 58
  尾   AATTTAGCATATTGATTCCAA   NA  15097-15107 59
  尾   AACTAACAATTATACATGTGC   NA  15158-15178 60
用粗体斜体字标出的碱基表示错配。
基于在上述表1-表4中列出的靶标，siRNA可以如下产生：a)提供3′-dTdT突出端给双链siRNA的每条链，b)在需要“错配”的情况下，将G:C改为G:T或G:A；A:T将会改成A:C或A:G；并且C:G将会改成C:T或C:A。
作为靶标的甲型流感株
在(+)链mRNA序列中的，25和19个核苷酸长度的siRNA靶序列已经在所有的8个片段中得以确定。该序列在表5-表12中显示。siRNA序列来自8个片段的每一个。每个序列的片段也显示了从5′末端的mRNA中的起始核苷酸位点。
表5.靶向甲型流感株的血凝素基因(A/chicken/Thailand/CH-2/2004(H5N1)；GenBank AY649382)的siRNA序列。
起始核苷酸NO.  序列     SEQ ID NO：
177  TCTAGATGGAGTGAAGCCTCTAATT     61
295  GCCAATCCAGTCAATGACCTCTGTT     62
453  TCCATACCAGGGAAAGTCCTCCTTT     63
601  GCAGAGCAGACAAAGCTCTATCAAA     64
678  ACCAAGAATAGCTACTAGATCCAAA     65
710  GGCAAAGTGGAAGGATGGAGTTCTT     66
718  GGAAGGATGGAGTTCTTCTGGACAA     67
869  GCAACACCAAGTGTCAAACTCCAAT     68
1501  GGAACGTATGACTACCCGCAGTATT     69
1673  CCAATGGGTCGTTACAATGCAGAAT     70
25  GCAATAGTCAGTCTTGTTA     71
267  GCCGGAATGGTCTTACATA     72
416  CCAGTCATGAAGCCTCATT     73
533  GGAGCTACAATAATACCAA     74
688  GCTACTAGATCCAAAGTAA     75
875  CCAAGTGTCAAACTCCAAT     76
988  GCGACTGGGCTCAGAAATA     77
1302  CCTAGATGTCTGGACTTAT     78
1625  CCCTAGCACTGGCAATCAT     79
1678  GGGTCGTTACAATGCAGAA     80
表6.靶向甲型流感病毒的基质蛋白2和基质蛋白1(M)基因(A/Thailand/1(KAN-1)/2004(H5N1)；GenBank AY626144)的siRNA序列。
起始核苷酸NO. 序列     SEQ ID NO：
171 GACCAATCCTGTCACCTCTGACTAA 81
172 ACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAA     82
178 CCTGTCACCTCTGACTAAAGGGATT     83
265 CCAGAATGCCCTAAATGGAAATGGA     84
272 GCCCTAAATGGAAATGGAGATCCAA     85
373 ACTCAGCTACTCAACCGGTGCACTT     86
521 GCAACTACCACCAACCCACTAATCA     87
772 GCGATTCAAGTGATCCTATTGTTGT     88
786 CCTATTGTTGTTGCCGCAAATATCA     89
826 TGATATtGTGGATTCTTGATCGTCT     90
31 TCTTCTAACCGAGGTCGAA     91
177 TCCTGTCACCTCTGACTAA     92
178 CCTGTCACCTCTGACTAAA     93
399 CCAGTTGCATGGGTCTCAT     94
573 GCACTACAGCTAAGGCTAT     95
772 GCGATTCAAGTGATCCTAT     96
813 GGGATCTTGCACTTGATAT     97
814 GGATCTTGCACTTGATATT     98
821 GCACTTGATATTGTGGATT     99
862 GCATTTATCGTCGCCTTAA     100
表7.靶向甲型流感病毒的神经氨酸酶基因(A/chicken/Thailand/CH-2/2004(H5N1)；GenBank AY649383)的siRNA序列。
起始核苷酸NO. 序列     SEQ ID NO：
53 ACCATCGGATCAATCTGTATGGTAA     101
164 GCTGAACCAATCAGCAATACTAATT     102
401 TCCAATGGGACTGTCAAAGACAGAA     103
577 GGCTGTATTGAAATACAATGGCATA     104
662 GCATGTGTAAATGGCTCTTGCTTTA     105
749 GGGAAAGTGGTTAAATCAGTCGAAT     106
750 GGAAAGTGGTTAAATCAGTCGAATT     107
779 GCTCCTAATTATCACTATGAGGAAT     108
843 GCAGGGATAATTGGCATGGCTCAAA     109
1189 CCAGCATCCAGAACTGACAGGACTA     110
54 CCATCGGATCAATCTGTAT     111
59 GGATCAATCTGTATGGTAA     112
164 GCTGAACCAATCAGCAATA     113
407 GGGACTGTCAAAGACAGAA     114
500 GCTTGGTCAGCAAGTGCTT     115
528 GCACCAGTTGGTTGACAAT     116
572 GCTGTGGCTGTATTGAAAT     117
662 GCATGTGTAAATGGCTCTT     118
675 GCTCTTGCTTTACTGTAAT     119
1068 CCAGGAGCGGCTTTGAAAT     120
表8.靶向甲型流感病毒的核壳体蛋白(NP)基因(A/Thailand/1(KAN-1)/2004(H5N1)；GenBank AY626145)的siRNA序列。
起始核苷酸NO. 序列     SEQ ID NO：
64 GCGTCTCAAGGCACCAAACGATCTT     121
191 GCACAGAACTCAAACTCAGTGACTA     122
451 GCTGGTCTTACCCACCTGATGATAT     123
627 GGTGATGGAGCTGATTCGGATGATA     124
854 TCCTGAGAGGATCAGTGGCCCATAA     125
910 GCAGTGGCCAGTGGATATGACTTTG     126
916 GCCAGTGGATATGACTTTGAGAGAG     127
993 GGTCTTTAGTCTCATTAGACCAAAT     128
1173 GGAGGCAATGGACTCCAACACTCTT     129
1331 CCATTATGGCAGCATTTACAGGAAA     130
116 GCCAGAATGCTACTGAGAT     131
381 GCTAATTCTGTACGACAAA 132
413 GGATTTGGCGTCAAGCGAA     133
989 GCCAGGTCTTTAGTCTCAT     134
1024 CCAGCACATAAGAGTCAAT     135
1066 GCAGCATTTGAGGACCTTA     136
1182 GGACTCCAACACTCTTGAA     137
1327 GCGACCATTATGGCAGCAT     138
1339 GCAGCATTTACAGGAAATA     139
1351 GGAAATACTGAGGGCAGAA     140
表9.靶向甲型流感病毒的非结构蛋白1和非结构蛋白2(NS)基因(A/Thailand/1(KAN-1)/2004(H5N1)；GenBank AY626146)的siRNA序列。
起始核苷酸NO. 序列     SEQ ID NO：
82 TCTTTGGCATGTCCGCAAACGATTT     141
299 GACATGACTCTCGAAGAAATGTCAA     142
509 CCATTACCTTCTCTTCCAGGACATA     143
564 TCCTCATCGGAGGACTTGAATGGAA     144
565 CCTCATCGGAGGACTTGAATGGAAT     145
570 TCGGAGGACTTGAATGGAATGATAA     146
603 GAGTCACTGAAACTATACAGAGATT     147
827 GCAAGAGATAAGAGCCTTCTCGTTT     148
838 GAGCCTTCTCGTTTCAGCTTATTTA     149
840 GCCTTCTCGTTTCAGCTTATTTAAT     150
48 CCAACACTGTGTCAAGCTT     151
63 GCTTTCAGGTAGACTGCTT     152
88 GCATGTCCGCAAACGATTT 153
165 CCCTAAGAGGAAGAGGCAA     154
253 GGAGTCTGATAAGGCACTT     155
324 GGGACTGGTTCATGCTCAT     156
330 GGTTCATGCTCATGCCCAA     157
337 GCTCATGCCCAAGCAGAAA     158
840 GCCTTCTCGTTTCAGCTTA     159
841 CCTTCTCGTTTCAGCTTAT     160
表10.靶向甲型流感病毒的聚合酶酸性蛋白(PA)基因(A/Thailand/1(KAN-1)/2004(H5N1)；GenBank AY626147)的siRNA序列。
起始核苷酸NO. 序列     SEQ ID NO：
64 CCAATGATCGTCGAGCTTGCGGAAA     161
159 GGAGGTCTGTTTCATGTATTCGGAT     162
296 GGACTGTGGTGAATAGTATCTGCAA     163
588 GGGTCTATGGGATTCCTTTCGTCAA     164
691 CCACCGAACTTCTCCAGCCTTGAAA     165
888 GGATGCCCTTAAATTAAGCATCGAA     166
935 GGATACCACTATACGATGCAATCAA     167
991 CCCAACATCGTGAAACCACATGAAA     168
1568 GGAATGATACCGATGTGGTAAATTT     169
2189 GGCAATGCTACTATTTGCTATCCAT     170
36 GGAAGACTTTGTGCGACAA     171
340 CCTAAATTTCTCCCAGATT     172
510 GGACTACACCCTTGATGAA     173
882 GCTGATGGATGCCCTTAAA     174
1602 GGAATTCTCTCTTACTGAT     175
1690 GCAGTAGGCCAAGTTTCAA     176
1710 GCCCATGTTCCTGTATATA     177
1770 GGAAATGAGGCGATGCCTT     178
2163 CCTCGCACATGCACTGAAA     179
2190 GCAATGCTACTATTTGCTA     180
表11.靶向甲型流感病毒的聚合酶碱性蛋白1(PB1)基因(A/Thailand/1(KAN-1)/2004(H5N1)；GenBank AY626148)的siRNA序列。
起始核苷酸NO. 序列     SEQ ID NO：
28 GGCAAACCATTTGAATGGATGTCAA     181
90 GCTATAAGTACCACATTCCCTTATA     182
424 CCTATGACTGGACATTGNATAGAAA     183
1028 GCCAGAATGGTTTCGGAATGTCTTA     184
1042 GGAATGTCTTAAGCATTGCACCTAT     185
1355 GGACGGACTCCAATCCTCTGATGAT     186
1444 GGACTTGTAAACTAGTTGGAATCAA     187
1824 GGACCAAATCTATACAATATCCGAA     188
2022 GCAACTACACATTCATGGATTCCTA     189
2206 CCCGAATTGACGCACGAATTGATTT     190
25 GCAGGCAAACCATTTGAAT     191
34 CCATTTGAATGGATGTCAA     192
288 GCACAAACAGATTGTGTAT     193
702 GCACTGACACTGAACACAA     194
765 GCAACACCCGGAATGCAAA     195
988 GGATGTTTCTGGCAATGAT     196
1021 GGGAACCAGCCAGAATGTT     197
1059 GCACCTATAATGTTCTCAA     198
1157 GCTTGCAAACATTGATCTT     199
1753 GAGATCATTCGAGCTTGAA     200
表12.靶向甲型流感病毒的聚合酶碱性蛋白2(PB2)基因(A/Thailand/1(KAN-1)/2004(H5N1)；GenBank AY626149)的siRNA序列。
起始核苷酸NO. 序列     SEQ ID NO：
68 CCCGCACTCGCGAGATACTAACAAA     201
193 CCAATCACAGCGGACAAGAGAATAA     202
870 GGAGATGTGTCACAGCACACAAATT     203
939 GGAACAAGCTGTGGATATATGCAAA     204
1315 CCCATGCATCAACTCCTGAGACATT     205
1403 GGATGATCGGAATATTACCTGACAT     206
1420 CCTGACATGACTCCCAGCACAGAAA     207
1849 GGGACATTTGATACTGTCCAGATAA     208
1866 CCAGATAATAAAGCTGCTACCATTT     209
2135 GGTATGGACCAGCATTGAGCATCAA     210
310 GCTGTAACTTGGTGGAATA     211
413 CCTTTGGTCCCGTTCATTT     212
603 GCTCCAAGATTGTAAGATT     213
717 GGTATTGCATTTGACTCAA     214
811 GCTGCCAGAAACATTGTTA     215
899 GGATAAGGATGGTGGACAT     216
1189 GGAAGAGACGAACAATCAA     217
1320 GCATCAACTCCTGAGACAT     218
2153 GCATCAATGAACTGAGCAA     219
2296 GCCATCAATTAGTGTCGAA     220
用于选择靶向甲型流感的有效siRNA候选序列的另一种方法是，集中于两种重要的病毒表面糖蛋白，即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的亚型特异性。已报道能引起人感染的亚型是H5N1、H7N7和H9N2。下面是亚型特异性HA和NA靶标的实例。
表13.H5N1血凝素(HA)的siRNA靶序列(基于GenBank DQ023145，GI：66775624)：
No. 序列(5’to 3’)   位置 SEQIDNO：
  1 AATGGTAGATGGTTGGTATGG   1091-1111 221
  2 AAGGCAATAGATGGAGTCACC   1170-1190 222
  3 AACACTCAGTTTGAGGCCGTT   1221-1241 223
  4 AAGATGGAAGACGGATTCCTA   1290-1310 224
  5 AATGCTGAACTTCTGGTTCTC   1326-1346 225
  6 AACTCTAGACTTTCATGACTC   1361-1381 226
  7 AAGGTCCGACTACAGCTTAGG   1404-1424 227
  8 AATGTGATAATGAATGTATGG   1471-1491 228
  9 AACAGTGGCGAGTTCCCTAGC   1516-1636 229
在表13中的序列是六种H5N1株共有的，所述的H5N1株从2000年和2003年之间中国的HPAI病毒感染的鸡分离。这些H5N1株在表14中列出。
表14
    No. 定义 登记号
    1 A/chicken/Huadong/1/2000(H5N1) DQ201829，GI：76786306
    2 A/chicken/Zhengabou/1/2002(H5N1) DQ211923，GI：76800651
    3 A/chicken/China/1/2002(H5N1) DQ023145，GI：66775624
    4 A/chicken/Zhoukou/2/2002(H5N1) DQ211924，GI：76800617
    5 A/chicken/Jiyuan/1/2003(H5N1) DQ211922，GI：76800613
    6 A/chicken/Luohuo/3/2003(H5N1) DQ211925，GI：76800619
表15.H5N1神经氨酸酶(NA)的siRNA靶序列(基于GenBankDQ023147，GI：66775628)。
  No. 序列(5’to 3’)     位置   SEQ IDNO：
  1 AATCTGTATGGTAATTGGAAT     48-68   230
  2 AACATTAGCGGGCAATTGATC     201-221   231
  3 AAAGACAGAAGCCCTCACAGA     400-420   232
  4 AATTGGAATTTCTGGCCCAGA     528-548   233
  5 AATGGGGCTGTGGCTGTATTG     550-570   234
  6 AACAGACACTATCAAGAGTTG     588-608   235
  7 AACATACTGAGAACTCAAGAG     616-636   236
  8 AATGTGCATGTGTAAATGGCT     641-661   237
  9 AATTATCACTATGAGGAGTGC     769-789   238
  10 AATCACATGTGTGTGCAGGGA     813-833   239
  11 AAGGGTTTTCATTTAAATACG     992-1012   240
  12 AATGGGTGGACTGGAACGGAC     1084-1104   241
  13 AACTGATTGGTCAGGATATAG     1140-1160   242
  14 AACTGACAGGATTAGATTGCA     1184-1204   243
  15 AAGACCTTGTTTCTGGGTTGA     1206-1226   244
  16 AATCAGAGGGCGGCCCAAAGA     1230-1250   245
上述序列是六种H5N1株共有的，所述的H5N1株从2001年和2003年之间中国的经HPAI病毒感染的鸡或猪分离。这些H5N1株在下面的表16中列出。
表16
    No. 定义 登记号
    1 A/chicken/Kaifeng/1/2001(H5N1) DQ211930，GI：76800629
    2 A/Swine/Fujian/F1/2001(H5N1) AY747618，GI：54126532
    3 A/chicken/Zhengzhou/1/2002(H5N1) DQ211927，GI：76800623
    4 A/chichen/China/1/2002(H5N1) DQ023147，GI：66775628
    5 A/chicken/Zhoukou/2/2002(H5N1) DQ211928，GI：76800625
    6 A/chicken/Luohuo/3/2003(H5N1) DQ211929，GI：76800627
表17.H7N7血凝素(HA)的siRNA靶序列(基于GenBank AY999986，GI：66394837)：
  No. 序列(5’to 3’)     位置     SEQ ID NO：
  1 AAGGTCTGATTGATGGGTGGT     1061-1081     246
  2 AATGCACAAGGGGAGGGAACT     1099-1119     247
  3 AAGCACCCAATCAGCAATTGA     1134-1164     248
  4 AATAGACAATGAATTCACTGA     1212-1232     249
  5 AAGCAAATTGGCAATGTGATA     1240-1260     250
  6 AATTGGACCAGAGATTCCATG     1261-1281     251
  7 AAGAGACAACTGAGAGAGAAT     1384-1404     252
  8 AAGATGGCACTGGTTGCTTCG     1412-1432     253
  9 AACACCTATGATCACAGCAAG     1480-1500     254
  10 AATAGAATACAGATTGACCCA     1522-1542     255
所有这些上述的序列是六种H7N7株共有的，所述的H7N7株从2002年瑞典的野鸭分离。这些H7N7株在下面的表18中列出。
通过比较这这六种HA序列，发现HA1相关的结构域具有更高频率的点突变，因而，从HA2结构域选择10个靶标。
表18
  No. 定义 登记号
  1 A/Mallard/Swedcn/102/02(H7N7) AY999986，GI：66394837
  2 A/Mallard/Sweden/103/02(H7N7) AY999987，GI：66394839
  3 A/Mallard/Sweden/104/02(H7N7) AY999988，GI：66394941
  4 A/Mallard/Sweden/105/02(H7N7) AY999989，GI：66394843
  5 A/Mallard/Sweden/106/02(HTN7) AY999990，GI：66394845
  6 A/Mallard/Sweden/107/02(H7N7) AY999991，GI：66394847
确定了对抗多种甲型流感H5N1 mRNA序列的另外的siRNA双链体。这些在表19中显示。它们的位置在图4中说明。
表19.靶向H5N1禽流感的RNAi序列
基因 链 序列   SEQ IDNO：
NP-1 有义 5’-GGAUCUUAUUUCUUCGGAG(dTdT)-3’   256
反义 5’-CUCCGAAGAAAUAAGAUCC-(dTdT)-3’   257
NP-2 有义 5’-UAUGAGAGAAUGUGCAACA(dTdT)-3’   258
反义 5’-UGUUGCACAUUCUCUCAUA(dTdT)-3’   259
M2-1 有义 5’-ACAGCAGAUGCUGUGGAU(dTdT)-3’   260
反义 5’-AUCCACAGCAUUCUGCUGU-(dTdT)-3’   261
M2-2 有义 5’-CUGAGUCUAUGAGGGAAGA(dTdT)-3’   262
反义 5’-UCUUCCCUCAUAGACUCAG(dTdT)-3’   263
siRNA的组合物
本发明的多个实施方案提供了包含两种或多种寡核苷酸或多核苷酸的药物组合物，所述的每种寡核苷酸或多核苷酸包含靶向呼吸道病毒的基因组中的基因的序列。相关的实施方案提供了使用该组合物治疗细胞的方法和治疗呼吸道病毒感染的方法，以及这些组合物在生产用于治疗呼吸道病毒感染的药物组合物中的用途。该组合物的独立多核苷酸成分可靶向病毒病原体基因组中的相同基因或不同基因的不同部分，或一个基因以及多个基因的数个部分。使用寡核苷酸或多核苷酸的组合的一个优势是，抑制所考虑基因的表达的效果在组合时增加。在通过使用多个靶向序列来使基因分解或使基因组沉默获得了更好的效果。通过靶向病毒基因组中的多个基因在抑制病毒复制方面获得了增加的效果。
药物组合物
本发明的靶向多核苷酸在此称为“活性化合物”或“治疗剂”。这些治疗剂可以整合至适合施用给受试者的药物组合物中。
如此处使用的，“可药用载体”旨在包括任何和所有与药物施用兼容的溶剂、分散介质、包被物、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。合适的载体由Delgado和Remers、Lippincott-Raven在教科书例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Gennaro AR(Ed.)20th edition(2000)Williams & Wilkins PA，USA，和Wilson andGisvold′s Textbook of Organic Medicinal and PharmaceuticalChemistry中描述，将其在这里通过引用作为参考。可用于这些载体或稀释剂中的成分的优选实例包括(但不限于)水、盐水、磷酸盐、羧酸盐、氨基酸溶液、林格氏溶液、右旋糖(葡萄糖的同义词)溶液和5％的人血清白蛋白。作为非限制性的实例，右旋糖可以作为5％或10％的含水溶液使用。也可以使用脂质体和不含水载体如不挥发性油。这些介质和试剂作为药物活性物质的使用是本领域熟知的。辅助性的活性化合物也可以整合至组合物中。
本发明的药物组合物配制成与其期望的施用途径相协调。施用途径的实例包括肠胃外的，例如静脉内、皮内、皮下、经口、经鼻、通过吸入、经皮肤(局部)、经粘膜和直肠施用。用于肠胃外、静脉内、皮内或皮下施用的溶剂或混悬剂包括下列成分：无菌稀释液如用于注射的水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成的溶剂；抗茵剂如苯甲醇或尼泊金甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于调节张力的试剂如氯化钠或葡萄糖。
对于通过吸入施用，化合物是以喷雾剂的形式从含有合适的推进物例如气体(如二氧化碳)的压力容器或分配器递送，或者从喷雾器递送。
在一个实施方案中，将活性化合物和防止化合物从体内快速清除的载体一起制备，如控释制剂，包括埋植剂和微囊递送系统。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述的基质是成形的商品形式，如薄膜或微胶囊剂。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-甲基丙烯酸羟乙酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919，在此通过全文引用作为参考)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如LUPRON DEPOTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射的微球体)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然聚合物例如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能够使分子释放超过100天，但某些水凝胶在较短时间周期内释放药物活性剂。有利的聚合物是生物可降解的或生物相容的。脂质体混悬剂(包含针对受感染细胞的脂质体，脂质体含有针对病毒抗原的单克隆抗体)也可以用作可药用载体。这些可以根据本领域那些技术人员已知的方法，例如，如在美国专利No.4,522,811中描述的方法制备。具有有利形式(例如微球体形式)的持续释放的制剂可以从材料如上面描述的那些制备。
本发明的siRNA多核苷酸可以插入至载体中并且用作基因治疗载体。基因治疗载体可以通过任何多种途径，例如，如在美国专利No.5,703,055中描述的途径的任任途径递送给受试者。因而递送也包括，例如静脉内注射、局部施用(见美国专利No.5,328,470)或立体注射(见，例如Chen等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：3054-3057)。基因治疗载体的药物制剂可以包括可接受稀释剂中的基因治疗载体，或者可以包括基因递送载体嵌入其中的缓释基质。备选地，其中全部的基因递送载体可以从重组细胞完整地产生，例如逆转录病毒载体，药物制剂可以包括产生基因递送系统的一种或多种细胞。
药物组合物可以与施用说明书一起包含于试剂盒，例如容器、包装或分配器中。
也包含于本发明的是，治疗剂在生产用于在受试者中治疗呼吸道病毒感染的药物组合物或药剂中的用途。
递送
在多个实施方案中，本发明的siRNA多核苷酸通过脂质体介导的转染，例如通过使用可商业获得的制剂或技术，如OligofectamineTM、LipofectAmineTM试剂、LipofectAmine 2000TM(Invitrogen公司)以及通过电穿孔法和类似技术递送至培养基中的细胞中。另外，siRNA多核苷酸通过吸入和滴注入呼吸道中来递送给动物模型，例如啮齿类或非人的灵长类。用于动物模型的另外的途径包括静脉内(IV)、皮下(SC)和相关的施用途径。含有siRNA的药物组合物包含保护siRNA稳定性、延长siRNA寿命、加强siRNA功能，或者使siRNA靶向特定的组织/细胞的的另外的成分。这些包括多种生物可降解的聚合物、阳离子聚合物(例如聚乙烯亚胺)、阳离子共聚多肽例如组氨酸-赖氨酸(HK)多肽(见，例如Mixson等的PCT出版物WO 01/47496、Biomerieux的WO 02/096941，和Massachusetts Institute of Technology的WO 99/42091)、PEG化阳离子多肽，以及配体整合的聚合物等、正电荷的多肽、PolyTran聚合物(天然的多糖，也称为硬葡聚糖)、由靶向配体缀合的聚合物组成的毫微粒(TargeTran变体)、表面活性剂(Infasurf；Forest Laboratories，公司；ONY公司)，以及阳离子聚合物(例如聚乙烯亚胺)。Infasurf(calfactant)是用于气管内滴注的从牛肺分离的天然肺表面活性剂；它包含磷脂类、中性脂类和与疏水性表面活性剂-结合的蛋白质B和C。聚合物可以是一维或多维的，并且还可以是直径小于20微米、在20-100微米之间或大于100微米的微粒或毫微粒。所述的聚合物可以携带对受体或特殊组织或细胞的分子的特异性的配体分子，从而可用于siRNA的靶向递送。siRNA多核苷酸也可以通过基于阳离子脂质体的载体，例如DOTAP、DOTAP/胆固醇(Qbiogene公司)和其它类型的脂质含水溶液递送。而且，低百分比(5％-10％)的葡萄糖含水溶液，以及Infasurf是用于导气管递送siRNA的有效载体30。
使用悬浮于5％葡萄糖和Infasurf的经口-气管递送溶液中的荧光标记的siRNA，通过荧光显微术检验，已经显示在siRNA通过鼻孔或通过经口-气管途径递送至小鼠中并洗涤肺组织后siRNA广泛分布于肺中(参见共同拥有的WO 2005/01940，在此通过全文引用作为参考)。据显示，将siRNA递送至小鼠的鼻道和肺(上呼吸道和呼吸道深处)中成功地沉默了与质粒中的siRNA同时递送的指示基因(GFP或荧光素酶)，所述的质粒含有该指示基因和siRNA靶标的融合物(见共同拥有的WO 2005/01940)。另外，由发明人(与其它人一起工作)报道的实验已经证明，在SARS感染的恒河猴中siRNA物质抑制SARS冠状病毒的复制，从而减轻肺部病状30。
siRNA重组载体
本发明的另一方面关于含有本发明siRNA多核苷酸的载体，优选为表达载体。如在此使用的，术语“载体”意指能够转运其已经连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指另外的DNA片段可连接至其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA片段可以连接进该病毒基因组。某些载体能够引导它们有效连接的基因的表达。这种载体在此指“表达载体”。一般而言，用于重组DNA技术中的表达载体常常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可替换使用，由于质粒是最普遍使用的载体形式。然而，本发明旨在包括提供等价功能的这种其它形式的表达载体，例如病毒载体(如复制缺陷性逆转录病毒、腺病毒和腺病毒伴随病毒)。
本发明的重组表达载体包含适合核酸在宿主细胞中表达的形式的本发明核酸，这表示重组表达载体包含有效连接至要表达的核酸序列的一个或多个调控序列，所述的调控序列的选择是基于用于表达的宿主细胞。在重组表达载体中，“有效连接”旨在表示目标核苷酸序列以允许该核苷酸序列表达(例如，在体外转录/翻译系统中或当载体引入进宿主细胞时在细胞中)的方式连接至调控序列。术语“调控序列”旨在包括启动子、增强子和其它的表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这种调控序列例如在Goeddel(1990)GENE EXPRESSIONTECHNOLOGY：METHODS IN ENZYMOLOGY 185，Academic Press，SanDiego，Calif中描述。调控序列包括在许多类型的宿主细胞中引导核苷酸序列组成型表达的那些调控序列和只在某些宿主细胞中引导核苷酸序列表达的那些调控序列(例如，组织特异性调控序列)。然而在另一个实施方案中，本发明的核酸使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed(1987)Nature 329：840)和pMT2PC(Kaufman等，(1987)EMBO J 6：187-195)。当在哺乳动物细胞中使用时，表达载体的控制功能通常由病毒调控元件提供。例如，普遍使用的启动子源于多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。另外的载体包括微小染色体例如细菌人工染色体、酵母人工染色体或哺乳类人工染色体。对于其它对原核细胞和真核细胞两者适合的表达系统，参见，例如sambrook等的笫16和17章，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL.2nd ed.，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，1989。
在另一个实施方案中，重组哺乳动物表达载体能够优选在特殊细胞类型例如呼吸道的细胞中引导核酸的表达。组织特异性调控元件是本领域已知的。本发明进一步提供了包含克隆进表达载体的本发明DNA分子的重组表达载体。DNA分子以允许RNA分子表达(通过DNA分子转录)的方式有效地连接至调控序列，所述的RNA分子包含靶向病毒RNA的siRNA。可以选择有效连接至核酸的调控序列来引导RNA分子在多种细胞类型中的连续表达，例如病毒启动子和/或增强子，或者可以选择调控序列来引导反义RNA的组成型的、组织特异性或细胞类型特异性表达。
载体DNA可以通过常规的转化或转染技术来介导进原核或真核细胞中。如在此使用的，术语“转化”和“转染”旨在指用于将外来核酸(如DNA)介导进宿主细胞中的多种领域公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可以在Sambrook等，(2001)、Ausubel等，(2002)，以及其它实验室手册中找到。
病毒滴度或数量的检测方法
在实践中，本发明检测病毒可以通过多种方法完成。作为非限制性的实例，这些方法之一是免疫印迹法(蛋白质印迹)、免疫沉淀法(I.P)，以及组合的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测法等。这样的方法测量可能存在于感染的组织培养基的溶解产物或上清液中的靶标mRNA或它们的蛋白质产物的合成的减少。同样，这些检测法可以用作诊断方法，用于测量靶标mRNA或它们的产物的合成的减少，所述的靶标mRNA或它们的产物可能存在于从感染的动物或人受试者获得的匀化的组织样品、鼻咽洗出液、分泌物中。
在RT-PCR检测法中，病毒基因组RNA的合成用引物来测定，所述的引物与跨越NS1和NS2 ORF之间的结合处的序列互补。使用NS1/NS2引物的这种RT-PCR的结果将反映全部基因组RNA的合成。
方法进一步包括其中siRNA诱导的组织培养基中病毒复制的干扰通过实时定量PCR(RTQ-PCR)、TCID50、病毒噬茵斑检测法、荧光免疫检测法，以及免疫组织化学等测量的检测法，如本发明领域中熟练的技术人员已知的。另外，方法进一步包括检测病毒存在，采用上述TCID50方法来监控组织培养基中病毒复制的抑制，其中病毒的滴定度通过任何类型的细胞致病滴定终点测量，作为非限制性的实例，包括细胞融合、细胞病变效应(CPE)、细胞吸附等。
方法进一步包括其中在实验动物中所述siRNA介导的病毒复制通过RTQ-PCR、病理学、免疫组织化学和病毒的再分离法(re-isolationof virus)等测量的检测法。
设计了用于RT-PCR测定法的引物，所述的RT-PCR测定法用于测量通过RNAi引起的mRNA合成的减少。RT反应用六聚物或聚-dT引物起始；并且PCR通过使用对siRNA靶向的每种基因特异的上游和下游引物来完成。
对于基因组RNA合成的检测，设计一对引物(下游和上游)与NS1和NS2 ORF中的序列一致。使用“跨越结合点(joint-crossing)的”引物而不是与病毒基因组的任一末端互补的引物的目的是避免难以控制的大的整个RNA转录产物(大约15K-nt长)。通过设计，这种RT-PCR的产物将反映全部基因组RNA的合成。
已经确定的引物和RT-PCR产物的大小在下表20、21和22中列出。
表20.用于RSV株A2(亚型A)的引物。
基因 链 位置 序列   SEQ IDNO：
基因组-NS1 上游 399-419 CCTAATGGTCTACTAGATGAC   264
基因组-NS2 下游 738-718 TGTGTGTTATGATGTCTCTGG   265
L 上游 8773-8793 GACATACAAGAGTATGACCTC   266
L 下游 9410-9390 ATCCGCATCTTAAGCCTAAGC   267
F 上游 5786-5806 AGGCTATCTTAGTGCTCTGAG   268
F 下游 6205-6185 GATAAGCTGACTAGAGCCTTG   269
G 上游 4727-4747 GAAAGGACCTGGGACACTCTC   270
G 下游 5394-5374 ATGGTTGGCTCTTCTGTGGGC   271
P 上游 2356-2376 TTGCTCCTGAATTCCATGGAG   272
P 下游 2809-2789 GCCACTACTAATGTGTGAAGC   273
表21.用于RSV B1株(亚型B)的引物。
基因 链 位置 序列   SEQ IDNO：
基因组-NS1 上游 280-300 CAAGCAGTGAAGTGTGCCCTG   274
基因组-NS1 下游 849-829 CTCCCTACTTTGTGCAGTAGC   275
L 上游 8866-8886 AGTGATGTAAAGGTGTACGCC   276
L 下游 9343-9323 TGCTAAGGCTGATGTTCTTCC   277
F 上游 5773-5793 ATGTAGTGCAGTTAGCAGAGG   278
F 下游 6298-6278 GCTCTGTTGATTTACTATGGG   279
G 上游 4843-4863 ACCTCTCTCATAATTGCAGCC   280
G 下游 5301-5281 GTTTGTGGGTTTGATGGTTGG   281
P 上游 2420-2440 AAGGGCAAGTTCGCATCATCC   282
P 下游 2946-2926 TTCCTAAGTCTTGCCATAGCC   283
表22.PCR产物的大小
基因 引物SEQ IDNOS：     产物(bp)   基因 引物SEQID NOS：     产物(bp)
A2-基因组 264 & 265     340   B1-基因组 274 & 275     550
A2-L 266 & 267     638   B1-L 276 & 277     478
A2-F 268 & 269     420   B1-F 278 & 279     526
A2-G 270 & 271     668   B1-G 280 & 281     459
A2-P 272 & 273     454   B1-P 282 & 283     527
实施例
实施例1.在细胞培养基中抗-H5N1甲型流感的siRNA分子的效 力。
本实施例报道了培养基中siRNA对H5N1-感染细胞的抑制效果的评估。
siRNA的设计与合成
产生了分别靶向H5N1的NP(NP-1 & NP-2；表19，SEQ ID NOS：)和M2(M2-1 & M2-2；表19，SEQ ID NOS：)基因的两种siRNA。这些siRNA的靶序列可在许多H5N1病毒株中观察到(例如gi|47834945-10-1506、gi|8452827_1-1497、gi|13925158_46-1542、gi|61927237_46-1542、gi|59940391_44-＞1535、gi|9802277_46-1542)。在5′-有义链处用荧光素标记的ds-siRNA通过Proligo BioTech Ltd(巴黎，法国)化学合成。它们的抗-H5N1效力在用H5N1病毒感染的siRNA-转染的MDCK细胞(Madin-Darby犬肾；ATCCNumber：CCL-34，Manassas，VA)中测定。如下面描述的，对H5N1的抑制通过细胞病变效应(CPE)测定，通过标准TCID50(50％组织培养物感染剂量)方法反滴定在培养基中释放的病毒并且使用实时RT-PCR来定量细胞内的病毒RNA。
细胞培养siRNA转染和H5N1病毒感染
将MDCK细胞培养和维持于具有10％胎牛血清(FBS，Invitrogen公司)的MEM培养基中。将大约5000个细胞装入96-孔平板的每个孔中用于病毒感染和复制检测。用与0.5μl Lipofectamine 2000(Invitrogen，CA)混合的100、50、25和12.5nM的siRNA转染细胞。无关的siRNA靶向的荧光素酶(GL2i)或siRNA靶向的SARS冠状病毒(C-1)和转染子Lipofectamine 2000单独(C-2)包含于实验中作为阴性对照。转染后6小时，在H5N1病毒感染之前移除培养基并用PBS洗涤细胞两次。将稀释于具有1％FBS的MEM中100微升的100 TCID50H5N1病毒(株：A/香港/486/97)7加入至转染的细胞中。分别在感染后的12、16和24小时收集培养上清液和细胞用于检测释放的病毒滴度和细胞内的病毒RNA拷贝。感染后的24小时，在相差显微镜检查下观察和记录CPE。将该实验以一式三份进行并至少重复3次。
定量RT-PCR
Q-RT-PCR如下完成。全部的细胞内RNA根据生产商的说明书，使用RNeasy Mini kit(Qiagen公司，德国)分离。逆转录实验使用ThermoScript RT-PCR系统(Invitrogen公司，加拿大)，通过寡-dT引发进行。随后使用在表23中显示的引物完成实时PCR。
表23.用于Q-RT-PCR的H5N1引物
基因 引物 序列     SEQ ID NO：
NP 正向 5′-GACCAGGAGTGGAGGAAACA-3     284
NP 反向 5′-CGGCCATAATGGTCACTCTT-3′     285
M2 正向 5′-CGTCGCTTTAAATACGGTTTG-3′     286
M2 反向 5′-CGTCAACATCCACAGCATTC-3     287
将5μl RT产物(模板)、1μl的每种正向引物和反向引物(终浓度为500nM)、2μl 25mM MgCl2和9μl的水与2μl的SYBR GreenI Master Mix(Roche，美国)Master Mix混合并且使用ABI7900序列检测系统完成实时定量。PCR条件是：在50℃下5分钟，95℃下10分钟，然后循环40个循环的95℃下10秒钟、61℃下5秒钟以及在72℃下5秒钟。β-肌动蛋白的拷贝作为内部对照也进行测量。计算每1000个β-肌动蛋白拷贝的细胞内病毒RNA的拷贝数，并表示为与未处理对照比较的相对病毒RNA拷贝(处理的拷贝/未处理的拷贝×100％)。
病毒滴定度的测量
用或未用siRNA处理的培养基中的病毒滴定度如下测定。简而言之，将来自感染细胞的条件培养基在具有1％FBS的MEM中10倍系列梯度稀释。根据标准TCID50方法将每种稀释物用于感染细胞。简而言之，在感染之前16小时将细胞装入96-孔器皿中。感染后72小时，在相差显微镜检查下观察CPE并测定CPE-阳性(CPE+)细胞。随后如下评估TCID50：
Figure A20058004502300521
其中，h＝内插稀释梯度的log10值，其加至高于50％的值的log10梯度。计算感染病毒滴定度并同未处理对照相比而表示成产生的相对病毒(处理的滴定度/未处理的滴定度×100％)。
结果
siRNA NP-1处理(表19)在浓度为12.5-100nM时大于99％地减少了培养基中H5N1病毒的产生(图5，小图A)和细胞中病毒RNA拷贝的复制(图5，小图B)，而用靶向NP-2的siRNA处理(表19)在浓度为100nM时只抑制了细胞培养基中约60％的病毒生长。相反，不相关的siRNA处理对照(C-1)和用载体处理的对照(C-2)同未处理对照相比没有显著地抑制病毒生长。
用针对M2-1的siRNA处理(表19)在不同浓度时也显示出对病毒生长(图5，小图C)和病毒RNA复制(图5，小图D)有约80-94％的抑制效果，然而针对M2-2的siRNA在浓度为100nM时显示出大约60％的抑制效果，但更低试验浓度没有抑制效果。
在另一个实验中，培养基中的细胞用50nM的多种siRNA处理。在三个时间点收集培养基上清液中产生的病毒。通过测定感染培养基中50％的细胞所需的组织培养感染剂量(TCID50)滴定样品(图6，小图A；注意这在对数纵轴刻度上显示)。病毒RNA拷贝数/1000个β-肌动蛋白拷贝数通过实时RT-PCR测定(图6，小图B)。不相关的siRNA(C-1)和转染子(C-2)在实验中用作对照。发现NP-1和NP-2siRNA高度有效地抑制了病毒颗粒的生长和病毒RNA的增加。M1-1和M2-2siRNA的使用部分有效地防止了病毒复制。
该实施例中的结果显示，针对H5N1基因组中不同基因的多种siRNA高度有效地抑制了培养基中生长的感染细胞中的病毒复制。
实施例2.针对H5N1甲型流感的siRNA的组合。
确定了针对H5N1基因组中不同基因的siRNA组合以便提供有效的抗-H5N1活性。该实施例显示了两种这样的组合。
组合A：
NP-1：5′-GGAUCUUAUUUCUUCGGAG(dTdT)-3′(SEQ ID NO：256)、
M2-1：5′-ACAGCAGAAUGCUGUGGAU(dTdT)-3′(SEQ ID NO：260)和
HA-1：5′-TGGTAGATGGTTGGTATGG(dtdt)-3′(SEQ ID NO：221、
碱基3-21，加上3′末端(dtdt))。
组合B：
NP-1：5′-GGAUCUUAUUUCUUCGGAG(dTdT)-3′(SEQ ID NO：256)、
M2-1：5′-ACAGCAGAAUGCUGUGGAU(dTdT)-3′(SEQ ID NO：260)和
NA-1：5′-TCTGTATGGTAATTGGAAT(dtdt)-3′(SEQ ID NO：230、碱基3-21，加上3′末端(dtdt))。
实施例3.siRNA对细胞中的靶基因和病毒复制的体外抑制
在该实施例中，靶向不同的呼吸道病毒基因，能最有效地沉默同源靶基因或抑制病毒复制的siRNA和siRNA的组合，在细胞培养基中通过实验得以确定。在体外有效的siRNA是需进一步在体内实验和使用的候选物。
将允许培养的细胞系，例如A549(作为非限制性实例)(ATCCNumber：CCL-185TM，II型肺泡上皮肺癌细胞系)用RSV病毒株或甲型流感病毒株如H5N1感染，并且然后用多种siRNA独立地转染或组合转染。在组合的情况下，采用靶向一个单基因的两种siRNA或靶向两个或多个基因的siRNA的组合。单一的或组合的siRNA的总siRNA剂量保持相同。在不同的实验方法中，siRNA转染在RSV或甲型流感感染之前的数小时进行，或与病毒感染同时进行，或在感染后的数小时进行。这些不同的方法提供了试验siRNA是否在细胞水平上显示出预防和/或治疗效果的信息。
以多种方法检测了对靶基因的抑制或病毒复制抑制的程度。检测法的非限制性实例包括下列方法：
1)用细胞溶解产物和对抗给定病毒抗原的RSV或甲型流感特异性抗体进行免疫印迹(蛋白免疫印迹)。
2)同上，用细胞溶解产物和如上对抗单个基因产物的RSV或甲型流感特异性抗体进行免疫沉淀法(IP)。
3)实施rvtr-PCR来证明mRNA转录的抑制或病毒RNA复制的抑制。设计了特定的引物来测定靶标基因的转录或测定试验siRNA寡聚物是否也能够靶向基因组RNA。
4)基于细胞融合的TCID50的测量可用于比较经特异性siRNA处理和不相关的对照siRNA处理的细胞培养物，用于监控病毒复制的抑制。
5)免疫荧光或免疫组织化学也可以用于滴定病毒滴度，从而监控对病毒复制的siRNA-介导的抑制。
实施例4.在小型动物模型中通过siRNA对靶基因的抑制
在该实施例中，检验多种siRNA(单独地或它们的组合)来测定它们在动物模型中治疗RSV或禽流感H5N1的效力。通过吸入或滴注通过气道用RSV或流感H5N1株感染受试动物。siRNA通过相同的途径递送，并且在RSV或流感H5N1感染之前，与其同时或在其之后施用。通过改变siRNA递送时间，能够获得有关siRNA在试验动物中抑制RSV或流感H5N1复制、减轻RSV或流感H5N1引起的病状，和减轻类似RSV或流感H5N1症状的效力的信息，以及有关RSV或流感H5N1特异性siRNA是否在动物中显示出对实验性RSV或流感H5N1感染有预防或治疗效果的信息。
虽然RSV和流感H5N1能够感染广的范围的动物种类，但小鼠和棉鼠普遍用于RSV或流感H5N1动物模型研究中。啮齿动物的感染通常导致低水平至中等水平的病毒复制，复制在第四天达到峰值并迅速消失。这些动物未显示出明显的呼吸道疾病，但显示出肺部病变。在高剂量的病毒感染时它们显示出指示疾病的重量减轻、肺功能变化和毛发折皱。
将与上面实施例3中描述的相同的诊断检测法用于在从动物获得的样品(例如鼻、口腔或咽喉拭子)上监控siRNA介导的基因沉默和对RSV或流感H5N1感染抑制。另外，进行肺病理学、肺免疫组织化学和症状观察来测定体内siRNA对RSV或流感H5N1感染的效力。
实施例5.在非人灵长类动物模型中通过siRNA对靶基因的抑制
该实施例描述了在非人灵长类中对RSV或流感H5N1病毒复制的siRNA介导的抑制的试验。剂量施用的效力和安全性是该研究的主要目的。
基于我们在用于另一种呼吸道疾病(SARS)的恒河猴模型上使用的方法，达到30mg/kg体重的siRNA的剂量是可容许的，对动物未显示出毒性症状。(22)呼吸道递送(通过吸入和滴注)在非灵长类哺乳动物中经预筛选的siRNA显示出对病毒复制，以及减少病毒引起的病理学和疾病样症状(disease-like symptoms)的重大的作用。对于该RSV或流感H5N1试验，使用了相同的递送途径，并递送相似剂量的siRNA。
除了描述小型动物研究的试验(实施例4)外，下列检测法容易在灵长类动物中实施并有助于更直接地评估治疗效果。
1)病毒脱落：用受感染的猴子的鼻咽因洗脱样品测量病毒脱落。病毒产量通过TCID50(基于细胞融合)和/或荧光免疫检测法滴定。
2)鼻咽洗脱样品的RTQ-PCR：以监控病毒基因组拷贝数量的变化。
3)症状监控：当在人婴儿患者中观察时，可能发现细支气管炎症状。
虽然已经就它的多个实例性实施方案来描述和阐明了本发明，但可以在其中和对它们作出等价的实施方案和多种其它的改变、添加和省略而不背离本发明的精神和范围。
参考文献
1.Holmes，E.C.2004，Science，303：1787-1788.
2.Abbott，A.2003，Nature，424：121-123.
1.Yuen KY等，Lancet.351：467-71.1998.
2.Claas EC等，Lancet.351：472-7.1998.
3.Peiris JS，...Yuen KY等，Lancet.363：617-9.2004.
4.世界卫生组织 http://www.who.int/csr/disease/avian- influenza/country/cases-table-2005-06-28/en/i ndex.html
5.世界卫生组织 ：http://www.who.mt/csr/disease/avianinfluenza/
6.Li KS，...，Yuen KY等，Nature.430：209-13.2004.
7.Chen H等，Nature.436：191-2.2005.
8.Liu J等，Science，www.sciencexpress.org/6 July 2005/Page 1/10.1126/science.1115273.2005.
9.Bridges CB等，J Infect Dis 181：344～8.2000.
10.Ungchusak K等，N Engl J Med 352：333-40.2005
11.世界卫生组织 http://www.who.int/csr/resources/publications
12.Collins，R.M等，2001，Virology(4thed)，p.1443-1485.
13. www.medimmun.com
14.Smith，D.W等，1991，N Engl J.Med，P 325：24-29
15.Sharp，P.A.2001，Genes & Development，15：485-490.
16.Tuschl，T.2001，Chembiochem，2：239-245.
17.Dykxhoorn，D.M.等，2003，Nat Rev Mol Cell Biol，4(6)：457-67.
18.Elbashir，S.M.等，2001，Nature，411：494-498.
19.Schiwarz，D.S.等，2003，Cell，115：199-208.
20.Khvorova，A.等，2003，Cell，115：209-216.
21.Reynolds，A.等，2004，Nat.Biotechnology，22：326-330.
22.Pellino，J.L.，& Sontheimer，E.J.，203，Cell，115：132-133.
23.Ma，J.B.等，2004，Nature，429：318-322.
24.Ahlquist，P，2002，Science，296：1270-1273.
25.Calain，P.& Roux，L.1993，J.Vol.，67：4822-4830.
26.Barik，S.2004，Virus Research，102：27-35.
27.Bitko，V.& Barik，S.2004，Nature Medicine，11，50-55.
28.Gitlin，L.等，Nature，418：430-434.
29.Zheng，B.J.等，2004，Antiviral Therapy，9：365-374.
30.Li B.J.等，2005，Nature Medicine，11，944-951.

Claims (30)

1.长度为200或更少核苷酸的分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列靶向呼吸道合胞体病毒或甲型流感病毒的基因组，其中任何T(胸苷)或任何U(尿苷)可以由其它核苷任选地取代，并且其中所述第一核苷酸序列由下列序列构成：
a)长度是15-30之间任何数目的核苷酸的序列，或
b)在a)中给出的序列的互补序列。
2.在权利要求1中描述的多核苷酸，所述的多核苷酸进一步包含通过环序列而与所述第一核苷酸序列分开的第二核苷酸序列，其中所述的第二核苷酸序列
a)具有与第一核苷酸序列基本相同的长度，并且
b)是与第一核苷酸序列基本上互补的。
3.在权利要求1或2中描述的多核苷酸，其中第一核苷酸序列由下列序列构成：
a)选自SEQ ID NO：1-263的序列；
b)比a)项中给出的序列长的靶向序列，其中该靶向序列靶向呼吸道病毒的基因组并包括选自SEQ ID NO：1-263的序列；
c)选自SEQ ID NO：1-263的序列的片段，其中所述片段由长度为至少15个核苷酸且至多比该选择序列短一个碱基的连续的碱基序列构成；
d)其中与选自SEQ ID NO：1-263的序列最多有5个核苷酸差别的序列；或
e)在a)至d)中给出的序列的互补序列。
4.在权利要求1或权利要求2中描述的多核苷酸，其中第一核苷酸序列的长度是21-25之间任何数目的核苷酸。
5.在权利要求1或权利要求2中描述的多核苷酸，所述的多核苷酸由选自SEQ ID NO：1-263的序列构成，任选地包括结合至该选择序列的3′的二核苷酸突出端。
6.在权利要求1或权利要求2中描述的多核苷酸，其中位于第一核苷酸序列的3′末端的二核苷酸序列是TT、TU、UT或UU，并且其中二核苷酸包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或两者。
7.在权利要求1或权利要求2中描述的多核苷酸，其中多核苷酸是DNA。
8.在权利要求1或权利要求2中描述的多核苷酸，其中多核苷酸是RNA。
9.在权利要求1或权利要求2中描述的多核苷酸，其中多核苷酸包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸两者。
10.双链的多核苷酸，所述的多核苷酸包含在权利要求1中描述的第一条多核苷酸链和与该第一条多核苷酸链的至少第一核苷酸序列互补并与其杂交的第二条多核苷酸链。
11.一种组合物，所述的组合物包含在权利要求1、权利要求2或两者中描述的多种靶向多核苷酸，其中每种多核苷酸靶向靶标病毒的基因组中的不同序列。
12.一种载体，所述的载体包含权利要求1的多核苷酸。
13.一种载体，所述的载体包含权利要求2的多核苷酸。
14.在权利要求12或权利要求13中描述的载体，其中该载体是质粒、重组病毒、转座子或微小染色体。
15.一种细胞，所述的细胞用权利要求1中描述的一种或多种多核苷酸转染。
16.一种细胞，所述的细胞用权利要求2中描述的一种或多种多核苷酸转染。
17.药物组合物，所述的药物组合物包含权利要求1或权利要求2中描述的一种或多种多核苷酸或其混合物以及可药用的载体，其中所述的每种多核苷酸靶向靶标病毒的基因组中的不同序列。
18.药物组合物，所述的药物组合物包含权利要求12或权利要求13中描述的一种或多种载体或其混合物以及可药用载体，其中每种载体包含靶向靶标病毒基因组中的不同序列的多核苷酸。
19.在权利要求17或权利要求18中描述的药物组合物，其中载体包括合成聚合物、脂质体、葡萄糖、表面活性剂或它们任意两种或更多种的组合。
20.合成在权利要求1或权利要求2中描述的多核苷酸的方法，所述的多核苷酸具有靶向呼吸道合胞体病毒或甲型流感病毒的基因组的序列，所述的方法包括以下步骤：
a)提供包含活性反应末端并对应位于该序列第一个末端的核苷酸的核苷酸反应物；
b)加入包含活性反应末端并对应该序列相继位置的另一核苷酸反应物，用来与来自前面步骤的活性反应末端反应并使该生长的多核苷酸序列增加一个核苷酸长度，并且除去不希望的产物和过剩的反应物，和
c)重复步骤b)直到加入了对应于该序列第二个末端的核苷酸的核苷酸反应物；
从而提供了完整的多核苷酸。
21.用RNA抑制剂转染细胞的方法，所述的方法包括使细胞与含有在权利要求1中描述的一种或多种多核苷酸的组合物接触。
22.在权利要求21中描述的方法，其中细胞包含所述的一种或多种多核苷酸所靶向的呼吸道病毒。
23.用RNA抑制剂转染细胞的方法，所述的方法包括使细胞与含有在权利要求2中描述的一种或多种多核苷酸的组合物接触。
24.在权利要求23中描述的方法，其中细胞包含所述的一种或多种多核苷酸所靶向的呼吸道病毒。
25.在病毒感染的细胞中抑制呼吸道病毒复制的方法，所述的方法包括使细胞与含有在权利要求1中描述的一种或多种多核苷酸的组合物接触，其中所述的一种或多种多核苷酸靶向病毒。
26.在病毒感染的细胞中抑制呼吸道病毒复制的方法，所述的方法包括使细胞与含有在权利要求2中描述的一种或多种多核苷酸的组合物接触，其中所述的一种或多种多核苷酸靶向病毒。
27.在权利要求1中描述的并且靶向呼吸道病毒的多核苷酸的用途，或它们的两种或更多种的混合物的用途，所述的用途用于生产在受试者中有效治疗由呼吸道病毒引起的感染的药物组合物。
28.在权利要求27中描述的用途，其中受试者是人。
29.在权利要求2中描述的并且靶向呼吸道病毒的多核苷酸的用途，或它们的两种或更多种的混合物的用途，所述的用途用于生产在受试者中有效治疗由呼吸道病毒引起的感染的药物组合物。
30.在权利要求29中描述的用途，其中受试者是人。
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010066112A1 (en) * 2008-12-11 2010-06-17 The University Of Hong Kong siRNA COMPOSITIONS AND METHODS FOR POTENTLY INHIBITING VIRAL INFECTION
CN101275132B (zh) * 2008-03-06 2010-10-13 中山大学 对A型流感病毒复制有抑制作用的siRNA及其编码序列
CN101920022A (zh) * 2010-04-29 2010-12-22 韩健宝 禽流行性感冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物
CN101880677B (zh) * 2009-11-06 2012-02-29 中国医学科学院病原生物学研究所 针对2009新甲型流感病毒多聚酶基因和核蛋白基因的siRNA序列及其应用
CN102108354B (zh) * 2008-03-06 2012-11-28 中山大学 一种对A型流感病毒复制有抑制作用的siRNA及其编码序列
CN101760457B (zh) * 2008-03-06 2013-05-01 中山大学 对A型流感病毒复制有抑制作用的siRNA及其编码序列
CN103966213A (zh) * 2013-02-06 2014-08-06 霍晋 A型流感病毒M基因有干扰作用的siRNA序列的设计和干扰作用的鉴定
CN103966212A (zh) * 2013-02-06 2014-08-06 霍晋 A型流感病毒NP基因有干扰作用的siRNA序列的设计及应用
CN107312777A (zh) * 2009-11-13 2017-11-03 萨雷普塔治疗公司 反义抗病毒化合物及治疗流感病毒感染的方法

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101169668B1 (ko) 2005-01-07 2012-08-07 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 ＲＳＶ의 ＲＮＡｉ 조절 및 이를 위한 약제학적 조성물
US20070213293A1 (en) * 2005-04-08 2007-09-13 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Rnai therapeutic for respiratory virus infection
US20100129460A1 (en) * 2005-10-14 2010-05-27 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Compounds and methods for peptide ribonucleic acid condensate particles for rna therapeutics
GB2432419A (en) * 2005-11-16 2007-05-23 Agency Science Tech & Res Influenza A virus detection method
CN101583715A (zh) * 2006-12-21 2009-11-18 因特拉迪格姆公司 用于治疗癌症的抑制性多核苷酸组合物和方法
WO2008118013A2 (en) 2007-03-23 2008-10-02 To-Bbb Holding B.V. Targeted intracellular delivery of antiviral agents
US8735567B2 (en) * 2007-11-06 2014-05-27 Patrick Y. Lu Multi-targeted RNAi therapeutics for scarless wound healing of skin
WO2009151539A1 (en) * 2008-05-24 2009-12-17 Sirnaomics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS USING siRNA MOLECULES FOR TREATMENT OF GLIOMAS
US20100168205A1 (en) * 2008-10-23 2010-07-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and Compositions for Prevention or Treatment of RSV Infection Using Modified Duplex RNA Molecules
WO2010078517A2 (en) 2008-12-31 2010-07-08 Sirnaomics, Inc. Compositions and methods using sirna molecules and sirna cocktails for the treatment of breast cancer
JP6110140B2 (ja) * 2009-06-16 2017-04-05 ザ リージェンツ オブ ザ ユニヴァシティ オブ ミシガン ナノエマルションワクチン
WO2012016139A2 (en) 2010-07-29 2012-02-02 Sirnaomics, Inc. Sirna compositions and methods for treatment of hpv and other infections
KR101135486B1 (ko) * 2011-05-25 2012-04-13 함종욱 보툴리눔 에이형 독소의 액상제품
US9868952B2 (en) 2012-07-08 2018-01-16 Sirnaomics, Inc. Compositions and methods for “resistance-proof” SiRNA therapeutics for influenza
AU2021322710A1 (en) * 2020-08-06 2023-02-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Compositions and methods for the detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-2), influenza A, and influenza B

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6830748B1 (en) 1997-09-26 2004-12-14 Medimmune Vaccines, Inc. Recombinant RSV virus expression systems and vaccines
GB9815040D0 (en) * 1998-07-10 1998-09-09 Medical Res Council Conditional mutant
WO2001047496A1 (en) 1999-12-29 2001-07-05 Mixson A James Histidine copolymer and methods for using same
US7070807B2 (en) 1999-12-29 2006-07-04 Mixson A James Branched histidine copolymers and methods for using same
WO2003070918A2 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Rna interference by modified short interfering nucleic acid
US20050176024A1 (en) 2001-05-18 2005-08-11 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of epidermal growth factor receptor (EGFR) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
EP1448586A4 (en) 2001-11-02 2006-03-01 Intradigm Corp THERAPEUTIC METHODS FOR NUCLEIC ACID DELIVERY VEHICLES
AU2003279010A1 (en) 2002-09-28 2004-04-19 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for delivery of short interfering rna and short hairpin rna
US20060134787A1 (en) 2004-12-22 2006-06-22 University Of Massachusetts Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of single and double blunt-ended siRNA
WO2005076999A2 (en) * 2004-02-05 2005-08-25 Intradigm Corporation Methods and compositions for combination rnai therapeutics
CA2572439A1 (en) * 2004-07-02 2006-01-12 Protiva Biotherapeutics, Inc. Immunostimulatory sirna molecules and uses therefor
WO2006085987A2 (en) * 2004-07-09 2006-08-17 University Of Iowa Research Foundation Rna interference in respiratory epitheial cells
US7199109B2 (en) 2005-06-03 2007-04-03 Cal Poly Pomona Foundation Potent inhibition of influenza virus by specifically designed short interfering RNA
EP2202239A1 (en) 2005-11-01 2010-06-30 Alnylam Pharmaceuticals Inc. RNAI inhibition of influenza virus replication

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101275132B (zh) * 2008-03-06 2010-10-13 中山大学 对A型流感病毒复制有抑制作用的siRNA及其编码序列
CN102108354B (zh) * 2008-03-06 2012-11-28 中山大学 一种对A型流感病毒复制有抑制作用的siRNA及其编码序列
CN101760457B (zh) * 2008-03-06 2013-05-01 中山大学 对A型流感病毒复制有抑制作用的siRNA及其编码序列
WO2010066112A1 (en) * 2008-12-11 2010-06-17 The University Of Hong Kong siRNA COMPOSITIONS AND METHODS FOR POTENTLY INHIBITING VIRAL INFECTION
CN102203254B (zh) * 2008-12-11 2013-07-10 香雪集团(香港)有限公司 有效抑制病毒感染的siRNA组合物及方法
CN101880677B (zh) * 2009-11-06 2012-02-29 中国医学科学院病原生物学研究所 针对2009新甲型流感病毒多聚酶基因和核蛋白基因的siRNA序列及其应用
CN107312777A (zh) * 2009-11-13 2017-11-03 萨雷普塔治疗公司 反义抗病毒化合物及治疗流感病毒感染的方法
CN107312777B (zh) * 2009-11-13 2020-11-13 萨雷普塔治疗公司 反义抗病毒化合物及治疗流感病毒感染的方法
CN101920022A (zh) * 2010-04-29 2010-12-22 韩健宝 禽流行性感冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物
WO2011134439A1 (zh) * 2010-04-29 2011-11-03 南京森楠生物技术研究有限公司 禽流行性感冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物
CN103966213A (zh) * 2013-02-06 2014-08-06 霍晋 A型流感病毒M基因有干扰作用的siRNA序列的设计和干扰作用的鉴定
CN103966212A (zh) * 2013-02-06 2014-08-06 霍晋 A型流感病毒NP基因有干扰作用的siRNA序列的设计及应用

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