JP6152535B2 - 細胞培養組成物及びインフルエンザウイルスの生産方法 - Google Patents
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Description
本発明は、インフルエンザウイルスの増殖効率を高めた細胞培養組成物、この細胞培養組成物を使用するインフルエンザウイルスの生産方法、及び、この方法により生産されるインフルエンザウイルスに関する。
インフルエンザは、インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染症であり、飛沫感染や接触感染等により感染し、高熱、頭痛、筋肉痛、関節痛等の強い全身症状を伴う呼吸器感染症である。インフルエンザウイルスは、直径約1万分の1ミリの多形性のオルソミクソウイルス科のRNAウイルスでA、B及びC型の３種の型に分類される。インフルエンザウイルスは、ウイルス粒子表面に存在する赤血球凝集素(HA)がHA1+HA2へ開裂することにより感染力を獲得し、感染が多段階に進行する。
インフルエンザワクチンの接種はインフルエンザの重症化の防御に最良の手段となっている。インフルエンザワクチンは、ワクチン製造用のインフルエンザウイルスを発育鶏卵の尿膜腔内に接種して培養増殖させ、漿尿液から遠心にて濃縮精製し、ウイルス粒子を界面活性剤等で処理し、ホルマリンで不活化した全粒子ワクチン又はウイルス粒子をエーテルや界面活性剤で破砕後更に精製を行ったスプリットワクチン又はサブユニットワクチンである。しかしながらインフルエンザワクチンを有精卵から作る場合は、卵１つから１回接種分のワクチンしかできないため、インフルエンザウイルスの増殖効率は十分であるとはいえない。
これに対して、インフルエンザウイルスを細胞培養において複製する手法が開示されており、非特許文献１には、MDCK細胞がインフルエンザウイルスのin vitroでの複製のための適切な細胞として記載されている。また、特許文献１には、MDCK細胞の培養液中に分泌されるトリプシンインヒビターを、培地又は緩衝液で洗浄することにより除去又は低減した後に、細胞にインフルエンザウイルスを接種し、インフルエンザウイルス接種細胞を培養する方法が記載されている。
Kilbourne,E.D.,著、1987年 Influenza、PlenumMedical BookCompany-NewYorkand London,89〜110頁
しかし、上記の技術についてもインフルエンザウイルスの増殖効率は十分であるとはいえず、インフルエンザワクチンをできるだけ早く多数の人に供給するために、更に増殖効率を高めたインフルエンザウイルスの増殖方法が望まれる。本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、インフルエンザウイルスの増殖効率に優れた細胞培養組成物、インフルエンザウイルスの生産方法、及び、この方法により生産されるインフルエンザウイルスを提供することを目的とする。
本発明にかかる細胞培養組成物は、IRF7又はMAVSの発現及び／又は機能を抑制させることによりインフルエンザウイルスの増殖効率を高めたMDCK細胞を含む。
本発明にかかるインフルエンザウイルスの生産方法は、本発明にかかる細胞培養組成物中のMDCK細胞にインフルエンザウイルスを感染させる工程と、前記細胞培養組成物をインキュベートする工程と、前記細胞培養組成物からインフルエンザウイルスを単離する工程と、を含む。
本発明にかかるインフルエンザウイルスは、本発明にかかるインフルエンザウイルスの生産方法によって生産される。
本発明によれば、効率よくインフルエンザウイルスを増殖することができる。そのためインフルエンザワクチンの製造効率も上昇させることができ、これによりインフルエンザの発症を抑制することができる。インフルエンザは肺炎を合併すると重症化しやすく、痰を伴う咳や呼吸困難等の症状が発生し、高齢者は死亡するケースも多く、また乳幼児においても深刻な合併症として、インフルエンザ脳炎・脳症が発生する虞があるが、本発明によればインフルエンザワクチンの製造効率も上昇させることができるので、ワクチン接種により発症予防、重症化や致命的な合併症を防ぐことが可能となり、本発明により得られる利益は計り知れない。
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
本発明者は、MDCK(Madin-Darby canine kidney cell)細胞においてIRF7又はMAVSの発現及び／又は機能を抑制させ、この細胞を用いてインフルエンザウイルスを増殖させるとインフルエンザウイルスの増殖効率が極めて優れていることを見出し、この新知見に基づいて本発明を完成させた。本発明にかかる細胞培養組成物は、IRF7又はMAVSの発現及び／又は機能を抑制させてインフルエンザウイルスの増殖効率を高めたMDCK細胞を含む細胞培養組成物である。MDCK細胞は、イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来の増殖力の強い細胞株である。
IRF7は、多くのインターフェロン誘導遺伝子のプロモーター領域に存在するIRF-E及びISREと呼ばれる領域を標的とするIRFファミリーに属し、I型インターフェロン(IFN)遺伝子発現誘導に関与する転写因子である。
MAVS(mitochondrial antiviral signaling)は、ミトコンドリア外膜のアダプタータンパク質であるミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達であり、I型インターフェロン(IFN)遺伝子発現誘導に関与しており、別名はIPS-1、Cardif、又はVISAである。
IRF7又はMAVSの「発現」とは、IRF7又はMAVSをコードするDNAの遺伝子情報がmRNAに転写されること、又は、mRNAに転写されアミノ酸配列として翻訳されることを意味する。
IRF7又はMAVSの「機能」とは、IRF7又はMAVSが備えている働きを意味する。IRF7及びMAVSの生物学的機能として、I型インターフェロン遺伝子発現誘導に関与する機能を例示できる。
IRF7又はMAVSの発現の「抑制」とは、IRF7又はMAVSをコードするDNAの遺伝子情報がmRNAに転写される過程、又は、mRNAに転写され且つアミノ酸配列として翻訳される過程で生じる様々な反応の少なくとも1つを妨げることにより、IRF7又はMAVSをコードする遺伝子の転写・翻訳によるIRF7又はMAVSの生成を低減させることを意味する。
IRF7又はMAVSの機能の「抑制」とは、IRF7又はMAVSが備えている働きを低減させる又は消失させることを意味する。
IRF7又はMAVSの発現の抑制は、IRF7又はMAVSの発現を抑制する作用を有する化合物を用いて実施できる。このような化合物として、例えば、IRF7又はMAVSの発現をRNA干渉の手法により低下又は消失させる作用を有するsiRNA（small interfering RNA）を例示できる。siRNAは標的遺伝子のmRNAを分解してその発現を抑制する短鎖二重鎖RNAである。
IRF7又はMAVSの発現を抑制する作用を有するsiRNAは、IRF7又はMAVSの遺伝子の部分配列からなるRNA（センス鎖）と該RNAの塩基配列に相補的な塩基配列からなるRNA（アンチセンス鎖）とを、該遺伝子のmRNAの配列に基づいて設計し、自体公知の化学合成法により合成し、得られた両RNAをアニーリングさせることにより製造できる。siRNAを構成するセンスRNA及びアンチセンスRNAは、それぞれ20個から30個程度のヌクレオチドからなることが好ましい。また、それぞれ、その3'末端に、オーバーハング配列と呼ばれる1個乃至数個の塩基配列からなるヌクレオチドを結合させることが好ましい。オーバーハング配列は、RNAをヌクレアーゼから保護する作用を有する。オーバーハング配列は、該RNAのRNA干渉効果を抑制しない限りにおいて特に制限されず、好ましくは1個ないし10個、より好ましくは1個ないし4個、更に好ましくは2個のヌクレオチドからなるものをいずれも用いることができる。具体的には、デオキシチミジル酸からなる配列（例えばTT）、ウリジル酸からなる配列（例えばUU）、デオキシチミジル酸に続いて任意のヌクレオチドが結合した配列（例えばTN）といった配列を例示できる。オーバーハング配列は、センスRNA及びアンチセンスRNAのそれぞれの3'末端のリボース3'水酸基部位にジエステル結合により結合させる。
IRF7の発現を抑制する作用を有するsiRNAとして、配列番号１に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドであるセンス鎖、及び、配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列である配列番号２に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドであるアンチセンス鎖、からなる二本鎖RNAであるsiRNAがあげられる。
また、IRF7の発現を抑制する作用を有するsiRNAとして、配列番号３に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドであるセンス鎖、及び、配列番号３の塩基配列に相補的な塩基配列である配列番号４に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドであるアンチセンス鎖、からなる二本鎖RNAであるsiRNAがあげられる。
MAVSの発現を抑制する作用を有するsiRNAとして、配列番号５に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドであるセンス鎖、及び、配列番号５の塩基配列に相補的な塩基配列である配列番号６に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドであるアンチセンス鎖、からなる二本鎖RNAであるsiRNAがあげられる。
また、MAVSの発現を抑制する作用を有するsiRNAとして、配列番号７に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドであるセンス鎖、及び、配列番号７の塩基配列に相補的な塩基配列である配列番号８に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドであるアンチセンス鎖、からなる二本鎖RNAであるsiRNAがあげられる。
なお、IRF7又はMAVSの発現を抑制する作用を有するsiRNAは上記例示したものに制限されず、IRF7又はMAVSの発現をRNA干渉の手法により低下又は消失させ得るものであればいずれも用いることができる。
siRNAを高効率で長期にMDCK細胞中で発現させるには、siRNAを含む発現ベクターを用いて細胞内に導入する方法が好ましい。一般的には、U6プロモータを使用したヘアピン型RNA発現ベクターがよく用いられている。ヘアピン型RNA発現ベクターの製造は、発現ベクターのプロモータの下流に、ライゲーション用制限酵素サイト、標的センス鎖、ループ配列、標的アンチセンス鎖、ターミネータ配列、及びライゲーション用制限酵素サイトをこの順序で含む合成DNAを挿入することにより実施できる。プロモータから転写された短鎖RNAはアニーリング反応によりヘアピン型RNAの構造をとる。このヘアピン型RNAはダイサー（dicer）により認識されて切断されsiRNAとなる。これら発現ベクターは、トランスフェクションや組換えウイルス感染法で細胞に導入可能である。発現ベクターは、プラスミドベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター等の公知ベクターから任意に選択して用いることができる。プロモータは、siRNAを発現させ得るプロモータであれば特に制限されず、U6プロモータ、H1プロモータ、tRNAプロモータ等を例示できる。プロモータの適正は使用する細胞によって異なるが、簡単な繰り返し実験により適当なものを選択できる。
また、IRF7又はMAVSの発現を抑制する作用を有する化合物として、shRNAを例示できる。shRNAは、ヘアピン構造を有する短鎖二重鎖RNAであり、siRNAと同様、RNA干渉により遺伝子の発現を抑制する。shRNAは、センスRNAとアンチセンスRNAとが例えばオリゴヌクレオチド等により連結され、センスRNA由来部分とアンチセンスRNA由来部分が二重鎖を形成するため、ヘアピン様構造を呈する。shRNAは、センスRNAとアンチセンスRNAに加え、これら2つのRNAを連結し且つループ構造を形成するようなオリゴヌクレオチドを含むRNAを、IRF7又はMAVSをコードする遺伝子のmRNAの塩基配列に基づいて設計して、自体公知の方法により製造することができる。好ましくは、センスRNAの3'末端とループ構造を形成するオリゴヌクレオチドの5'末端とが結合し、更にループ構造を形成するオリゴヌクレオチドの3'末端とアンチセンスRNAの5'末端とが結合したオリゴヌクレオチドであることが望ましい。ループ構造を形成するオリゴヌクレオチドとは、センスRNAとアンチセンスRNAの間に存在して両RNAを連結でき、それ自体がループ構造を形成するものを意味する。好ましくは4個ないし23個、より好ましくは4個ないし8個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが望ましい。
また、IRF7又はMAVSをノックアウトして発現させない作用を有する物質として、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Zinc Finger Nucleases, ZFNs)を例示できる。ZFNsはジンクフィンガードメインとDNA切断ドメインから成る人工制限酵素である。また、IRF7又はMAVSをノックアウトして発現させない作用を有する化合物として、Transcriptionactivator like effector(TALE)のDNA結合ドメインを利用したTALE nucleases (TALENs)も例示できる。
また、IRF7又はMAVSの機能の抑制は、IRF7又はMAVSの機能を抑制する作用を有する物質を用いて実施できる。このような物質として、例えば、ドミナントネガティブ変異体を例示できる。IRF7又はMAVS遺伝子の機能を抑制する物質としては、IRF7又はMAVS蛋白質の作用を妨げ得る物質である限り特に限定されないが、IRF7又はMAVS蛋白質のドミナントネガティブ変異体、該変異体をコードする核酸を含む発現ベクターが例示される。IRF7又はMAVS蛋白質のドミナントネガティブ変異体とは、IRF7又はMAVS蛋白質に対する変異の導入によりその活性が低減したものをいう。該ドミナントネガティブ変異体は、天然のIRF7又はMAVS蛋白質と競合することでその活性を阻害することができる。該ドミナントネガティブ変異体は、IRF7又はMAVS遺伝子をコードする核酸に変異を導入することによって作製することができる。変異としては、例えば、機能性部位における、当該部位が担う機能の低下をもたらすようなアミノ酸の変異（例えば、１以上のアミノ酸の欠失、置換、付加）が挙げられる。ドミナントネガティブ変異体は、PCRや公知のキットを用いる自体公知の方法により作製できる。
また、IRF7又はMAVSの発現及び／又は機能を抑制する作用を有する化合物として、IRF7又はMAVSの発現及び／又は機能を特異的に抑制する作用を有する低分子量化合物を挙げることができる。低分子量化合物とは、ペプチド、ペプチド様物質、ポリペプチド、核酸、有機化合物、及び無機化合物が含まれ、その分子量が好ましくは10000以下、より好ましくは5000以下、更に好ましくは1000以下、更により好ましくは500以下の化合物を意味する。
細胞培養組成物は、IRF7又はMAVSの発現及び／又は機能を抑制させたMDCK細胞以外に、この細胞を増殖するための培地、バッファ等が含有される。培地は、無血清培地、血清含有培地、又はAPF培地である。培地のpHは、適当な緩衝液（例えば、炭酸水素ナトリウム、HEPES）で細胞増殖に適した6.5〜8、好ましくは、6.8〜7.3に調整される。
増殖効率を高めることができるインフルエンザウイルスは、Ａ型及びＢ型の何れのものでも可能であり、またインフルエンザウイルスは、エンベロープ表面上の分子であるヘマグルチニン(HA)とノイラミニダーゼ(NA)の抗原性の違いから、各々複数の亜型に分類されているところ、Ａ型及びＢ型の各々の亜型であっても増殖効率を高めることが可能である。Ａ型インフルエンザウイルスとＢ型インフルエンザウイルスは、両者とも８分節からなるウイルスゲノムを持ち、その構成もHA, NA, PA, PB1, PB2, M, NP, NSで同一であるところ、両者はウイルス粒子を構成するM1とNPの抗原性は異なるが、非常に良く似た構造と性質を持ったウイルスと言えるため、Ａ型及びＢ型のどちらにも同様にウイルス増殖性の向上を見込むことができるからである。
次に、上記の細胞培養組成物を使用したインフルエンザウイルスの生産方法を説明する。
まず、例えばIRF7の発現を抑制する作用を有するsiRNAと、MAVSの発現を抑制する作用を有するsiRNAとを合成し、これらの何れかをMDCK細胞に導入し、IRF7又はMAVSの発現を抑制させたMDCK細胞を準備する。MDCK細胞の初期細胞密度は、特に限定されるものではないが、例えば1〜100×105cells/mL、好ましくは、3〜80×105cells/mLであり、より好ましくは、4〜70×105cells/mLである。
次に、このMDCK細胞にインフルエンザウイルスを感染させる。インフルエンザウイルスの濃度は、特に限定されるものではないが、例えば50〜10000TCID50/wellであり、好ましくは80〜8000TCID50/wellであり、より好ましくは90〜2000TCID50/wellである。または、m.o.i 0.00001〜0.1であり、好ましくはm.o.i 0.0001〜0.01である。
次に、インフルエンザウイルスを感染させたMDCK細胞をインキュベートする。インキュベートの条件は、特に限定されるものではないが、例えば、培養温度は、32℃〜38℃、好ましくは33〜34℃であり、培養期間は、12時間〜４日間、好ましくは18時間〜２日間、より好ましくは24時間であり、炭酸ガス濃度は4〜6％、好ましくは5％であり、酸素濃度は、2〜10ppm、好ましくは3ppmである。
その培養上清を用いて、通常の限界希釈法に従い例えば２回継代してインフルエンザウイルスが単離される。
（実施例１）
IRF7を標的とするsiRNAとして、配列番号１に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号２に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-1と、配列番号３に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号４に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-2と、配列番号９に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号１０に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-3と、を合成した。
IRF7を標的とするsiRNAとして、配列番号１に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号２に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-1と、配列番号３に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号４に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-2と、配列番号９に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号１０に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-3と、を合成した。
また、MAVSを標的とするsiRNAとして、配列番号５に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号６に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-4と、配列番号７に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号８に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-5と、配列番号１１に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号１２に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-6と、を合成した。
また、TBK1を標的とするsiRNAとして、配列番号１３に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号１４に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-7と、配列番号１５に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号１６に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-8と、配列番号１７に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号１８に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-9と、を合成した。
また、TRIM21を標的とするsiRNAとして、配列番号１９に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号２０に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-10と、配列番号２１に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号２２に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-11と、配列番号２３に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号２４に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-12と、を合成した。
また、MYD88を標的とするsiRNAとして、配列番号２５に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号２６に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-13と、配列番号２７に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号２８に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-14と、配列番号２９に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号３０に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-15と、を合成した。
また、TRADDを標的とするsiRNAとして、配列番号３１に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号３２に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-16と、配列番号３３に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号３４に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-17と、配列番号３５に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号３６に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-18と、を合成した。
また、TRAF5を標的とするsiRNAとして、配列番号３７に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号３８に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-19と、配列番号３９に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号４０に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-20と、配列番号４１に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号４２に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-21と、を合成した。
また、DDX58を標的とするsiRNAとして、配列番号４３に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号４４に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-22と、配列番号４５に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号４６に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-23と、配列番号４７に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号４８に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-24と、を合成した。
また、IRF3を標的とするsiRNAとして、配列番号４９に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号５０に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-25と、配列番号５１に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号５２に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-26と、配列番号５３に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号５４に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるsiRNA-27と、を合成した。
これらのsiRNAをMDCK細胞（ATCCCCL-34）にLullaby（OZ Biosciences）を用いて導入した。即ち、トランスフェクションの18時間前にMDCK細胞（0.2cm2あたり10,000細胞）を96wellプレート(カタログ番号353072, BD Falcon社)に播種して血清入り培地でインキュベートしておき、無血清培地にLullabyを添加してMixtureを作成し、１μＭに希釈したsiRNAをそのMixtureに添加してよく混和し、siRNAを含むMixtureをMDCK細胞に添加して４８時間後に感染用の細胞とした。次にMDCK細胞にインフルエンザウイルス（A/Puerto Rico/8/34,A(H1N1)）を100 TCID50/wellで感染させ、このインフルエンザウイルスを感染させたMDCK細胞を34℃、炭酸ガス濃度5％、酸素濃度3ppmで24時間培養した。
その後培養上清を回収し、培養液中のインフルエンザウイルスの量をリアルタイムPCR法にて測定した。リアルタイムPCR反応システムにはBIO-RAD社製「CFX96 Real-Time PCR System」を使用した。PCR反応液は最終容量25μLで実施した。その反応液の組成は以下の通りである：25μL中、Applied Biosystems社製 TaqMan One-step RT-PCRMaster Mix Reagents Kitの2x Master Mixを12.5μL、40x RT Mixを0.625μL、試料が5μL、PCRプライマーがforward,reverseそれぞれ300[nM]、TaqManプローブが200[nM]含まれ、nuclease free waterで目的の最終容量に調製された。Forwardのprimer配列はCTACGGAAGGAGTACCAGAGTC（配列番号５５）であった。Reverseのprimer配列はCTAGCTCTATGCTGACAAAATGATC（配列番号５６）であった。TaqManプローブの配列はTCTGCTGTTCCTCTCGATATTCTTCCCTCA（配列番号５７）であった。
PCRプログラム(thermalprofile)は次の通りであった。
48.0℃ 30分
95.0℃ 10分の初期加温に引き続き、
95.0℃ 15秒
60.0℃ 1分(本ステップ終了毎に蛍光を測定)
を40サイクル反復
その結果、下記表１に示されるように、IRF7又はMAVSのノックダウンにより、インフルエンザウイルスの増殖効率は２倍以上増加したことが判明した。
48.0℃ 30分
95.0℃ 10分の初期加温に引き続き、
95.0℃ 15秒
60.0℃ 1分(本ステップ終了毎に蛍光を測定)
を40サイクル反復
その結果、下記表１に示されるように、IRF7又はMAVSのノックダウンにより、インフルエンザウイルスの増殖効率は２倍以上増加したことが判明した。
IRF7ではsiRNA-1及びsiRNA-2によるノックダウンによりインフルエンザウイルスの増殖効率が２倍以上増加した。MAVSではsiRNA-4及びsiRNA-5によるノックダウンによりインフルエンザウイルスの増殖効率が２倍以上増加した。DDX58ではsiRNA-22によるノックダウンによりインフルエンザウイルスの増殖効率が２倍以上増加した。IRF3ではsiRNA-27によるノックダウンによりインフルエンザウイルスの増殖効率が２倍以上増加した。TBK1、TRIM21、MYD88、TRADD、TRAF5ではインフルエンザウイルスの増殖効率が２倍以上増加したsiRNAは無かった。本実施例ではIRF7、MAVS、TBK1、TRIM21、MYD88、TRADD、TRAF5、DDX58、IRF3につき、各々siRNAは３種類作成して試験を行ったが、少なくとも２種類のsiRNAによりインフルエンザウイルスの増殖効率が２倍以上増加したものでなければ、ノックダウンにより増殖効率の増加が期待できる遺伝子とは判断しなかった。このように、IRF7及びMAVSはノックダウンによりインフルエンザウイルスの増殖効率が増加することが示唆された。
（実施例２）
イヌIRF7に対するshRNAを発現するレンチウイルスベクターをMDCK細胞に導入し、安定的にIRF7をノックダウンしたMDCK細胞を作製した。shRNAは、配列番号５８に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号５９に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるものであった（shRNA-1）。また、配列番号６０に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号６１に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるshRNA（shRNA-LacZ）を発現するレンチウイルスベクターをMDCK細胞に導入してコントロールMDCK細胞を作製した。次にMDCK細胞にインフルエンザウイルス（A/Narita/1/2009,A(H1N1)pdm09）をm.o.i=0.001で感染させ、このインフルエンザウイルスを感染させたMDCK細胞を34℃、炭酸ガス濃度5％、酸素濃度3ppmで72時間培養した。
イヌIRF7に対するshRNAを発現するレンチウイルスベクターをMDCK細胞に導入し、安定的にIRF7をノックダウンしたMDCK細胞を作製した。shRNAは、配列番号５８に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号５９に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるものであった（shRNA-1）。また、配列番号６０に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号６１に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるshRNA（shRNA-LacZ）を発現するレンチウイルスベクターをMDCK細胞に導入してコントロールMDCK細胞を作製した。次にMDCK細胞にインフルエンザウイルス（A/Narita/1/2009,A(H1N1)pdm09）をm.o.i=0.001で感染させ、このインフルエンザウイルスを感染させたMDCK細胞を34℃、炭酸ガス濃度5％、酸素濃度3ppmで72時間培養した。
その後培養上清を回収し、培養液中のインフルエンザウイルスの量を実施例１と同様にしてリアルタイムPCR法にて測定した。結果を図１に示す。IRF7 shRNAは、shRNA-1をベクター導入してIRF7をノックダウンしたMDCK細胞である。コントロールshRNAは、shRNA-LacZをベクター導入したMDCK細胞である。No shRNAは、shRNAを導入していないMDCK細胞である。ウイルスRNAの相対的増加量は、No shRNAに対するウイルスRNAの増加量を相対的に示す数値である。図１に示されるように、IRF7のノックダウンにより、shRNAを導入していないMDCK細胞と比較して、インフルエンザウイルスの増殖効率は５倍増加したことが判明した。
（実施例３）
イヌIRF7に対するshRNAを発現しているMDCK細胞とコントロールのshRNAを発現しているMDCK細胞を2×105cells/well となるように6ウェルプレートにまき、細胞密度が上限に達するまで培養した。実施例２と同様に、shRNAは、配列番号５８に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号５９に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるものであった。これらの細胞に表２に示されているA(H1N1)ウイルス、A(H1N1)pdm09ウイルス、A(H3N2)ウイルス、B型ウイルスを、表２に示されている量（100〜1000 pfuまたは100〜1000 TCID50）で感染させ、表２に示されている時間（48時間〜96時間）後にHA価を測定した。
イヌIRF7に対するshRNAを発現しているMDCK細胞とコントロールのshRNAを発現しているMDCK細胞を2×105cells/well となるように6ウェルプレートにまき、細胞密度が上限に達するまで培養した。実施例２と同様に、shRNAは、配列番号５８に示される塩基配列のセンス鎖及び配列番号５９に示される塩基配列のアンチセンス鎖からなるものであった。これらの細胞に表２に示されているA(H1N1)ウイルス、A(H1N1)pdm09ウイルス、A(H3N2)ウイルス、B型ウイルスを、表２に示されている量（100〜1000 pfuまたは100〜1000 TCID50）で感染させ、表２に示されている時間（48時間〜96時間）後にHA価を測定した。
2倍ずつ連続的に希釈したウイルス液に、A(H1N1)ウイルスとA(H3N2)ウイルスについてはモルモット赤血球、A(H1N1)pdm09ウイルスについては七面鳥赤血球、B型ウイルスについてはニワトリ赤血球を加え、赤血球の凝集が見られる最大希釈倍率をHA価とした。
その結果、IRF7に対するshRNAを発現しているMDCK細胞は、コントロール細胞に比べて、2倍〜8倍高いHA価を示した（表２）。
インフルエンザワクチンの製造に利用できる。
配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３，４５，４７，４９，５１，５３：siRNAセンス配列
配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８，５０，５２，５４：siRNAアンチセンス配列
配列番号５５〜５６：プライマー
配列番号５７：プローブ
配列番号５８，６０：shRNAセンス配列
配列番号５９，６１：shRNAアンチセンス配列
配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８，５０，５２，５４：siRNAアンチセンス配列
配列番号５５〜５６：プライマー
配列番号５７：プローブ
配列番号５８，６０：shRNAセンス配列
配列番号５９，６１：shRNAアンチセンス配列
Claims (7)
- IRF7又はMAVSの発現及び／又は機能を抑制させることによりインフルエンザウイルスの増殖効率を高めたMDCK細胞を含む細胞培養組成物。
- 前記IRF7の発現の抑制は、配列番号１に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドであるセンス鎖、及び、配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列である配列番号２に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドであるアンチセンス鎖、からなる二本鎖RNAであるsiRNAを導入することによりなされることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養組成物。
5’- GGCGC CUGGG CAAAU GCAAdT dT-3’ (配列番号１)
5’- UUGCA UUUGC CCAGG CGCCdT dT-3’ (配列番号２) - 前記IRF7の発現の抑制は、配列番号３に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドであるセンス鎖、及び、配列番号３の塩基配列に相補的な塩基配列である配列番号４に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドであるアンチセンス鎖、からなる二本鎖RNAであるsiRNAを導入することによりなされることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養組成物。
5’- CAGAG AAGCU GCUGC AGCAdT dT-3’ (配列番号３)
5’- UGCUG CAGCA GCUUC UCUGdT dT-3’ (配列番号４) - 前記MAVSの発現の抑制は、配列番号５に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドであるセンス鎖、及び、配列番号５の塩基配列に相補的な塩基配列である配列番号６に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドであるアンチセンス鎖、からなる二本鎖RNAであるsiRNAを導入することによりなされることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養組成物。
5’- GUUAG UUCCU GCUGA GGUUdT dT-3’ (配列番号５)
5’- AACCU CAGCA GGAAC UAACdT dT-3’ (配列番号６) - 前記MAVSの発現の抑制は、配列番号７に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドであるセンス鎖、及び、配列番号７の塩基配列に相補的な塩基配列である配列番号８に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドであるアンチセンス鎖、からなる二本鎖RNAであるsiRNAを導入することによりなされることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養組成物。
5’- CCUCC AAGGU GCCUA CCCAdT dT-3’ (配列番号７)
5’- UGGGU AGGCA CCUUG GAGGdT dT-3’ (配列番号８) - 前記IRF7の発現の抑制は、配列番号５８に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドであるセンス鎖、及び、配列番号５８の塩基配列に相補的な塩基配列である配列番号５９に示される塩基配列のオリゴヌクレオチドであるアンチセンス鎖、からなる二本鎖RNAであるshRNAを導入することによりなされることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養組成物。
5’- GGCGC CTGGG CAAAT GCAA-3’ (配列番号５８)
5’- TTGCA TTTGC CCAGG CGCC-3’ (配列番号５９) - インフルエンザウイルスの生産方法であって、
請求項１乃至６の何れか１項に記載の細胞培養組成物中のMDCK細胞にインフルエンザウイルスを感染させる工程と、
前記細胞培養組成物をインキュベートする工程と、
前記細胞培養組成物からインフルエンザウイルスを単離する工程と、
を含むインフルエンザウイルスの生産方法。
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