ES2523587T3 - Virus influenza B que tienen alteraciones en el polipéptido hemaglutinina - Google Patents

Abstract

Método de preparación de un virus influenza B glicosilado en HA que tiene replicación aumentada en huevos que comprende: (a) introducir una mutación que da como resultado una sustitución de aminoácido en la posición 141 de HA de glicina a arginina en un genoma de virus influenza B que codifica para un polipéptido HA con un residuo de glicina en la posición 141; y (b) replicar el genoma de virus influenza mutado en condiciones mediante las cuales se produce el virus influenza B.

Description

Virus influenza B que tienen alteraciones en el polipéptido hemaglutinina

5 Antecedentes de la invención

Los virus influenza están constituidos por un núcleo interno de ribonucleoproteína que contiene un genoma de ARN monocatenario segmentado y una envuelta de lipoproteína externa cubierta por una proteína de matriz. Un ejemplo de una cepa de influenza es B/Jiangsu/10/03. Pueden recuperarse detalles de la cepa de influenza de B/Jiangsu/19/30 a través de www.fludb.org/brc/fluStrainDeatils.do?strainName=B/Jiangsu/10/03&detector=influenza. B/Jiansang/19/30 comprende una arginina en la posición de aminoácido 141 de la proteína HA. Los virus influenza A y B contienen cada uno ocho segmentos de ARN monocatenario con polaridad negativa. Los ocho segmentos genómicos de influenza B codifican para 11 proteínas. Los tres genes más grandes codifican para componentes de la ARN polimerasa, PB1, PB2 y PA. El segmento 4 codifica para la proteína HA. El segmento 5 codifica para NP. El

15 segmento 6 codifica para la proteína NA y la proteína NB. Ambas proteínas, NB y NA, se traducen a partir de marcos de lectura solapantes de un ARNm bicistrónico. El segmento 7 de influenza B también codifica para dos proteínas: M1 y BM2. El segmento más pequeño codifica para dos productos: NS1 se traduce a partir del ARN de longitud completa, mientras que NS2 se traduce a partir de una variante de ARNm sometida a corte y empalme.

Se han producido vacunas que pueden producir una respuesta inmunitaria protectora específica para virus influenza durante más de 50 años. Las vacunas pueden caracterizarse como vacunas de virus completos, vacunas de virus divididos, vacunas de antígeno de superficie y vacunas de virus atenuados vivos. Aunque las formulaciones apropiadas de cualquiera de estos tipos de vacuna pueden producir una respuesta inmunitaria sistémica, las vacunas de virus atenuados vivos también pueden estimular inmunidad de la mucosa local en el tracto respiratorio.

25 FluMist™ es una vacuna atenuada viva que protege a niños y adultos de la enfermedad de la gripe (Belshe et al. (1998) The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children N Engl J Med 338:1403-12; Nichol et al. (1999) Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults: a randomized controlled trial JAMA 282:137-44). Las cepas de la vacuna FluMist™ contienen los segmentos génicos de HA y NA derivados de las cepas de tipo natural circulantes actualmente junto con seis segmentos génicos internos de un virus donador maestro (MDV) común. Chen et al. (2006), Virology.; 345(2):416-23 describen el mapeo genético del fenotipo adaptado al frío de B/Ann Arbor/1/66, el virus donador maestro para vacunas con influenza atenuado vivo (FluMist).

35 Hasta la fecha, las vacunas contra la gripe disponibles comercialmente en los Estados Unidos se propagan en huevos embrionados de gallina. Muchas cepas de virus influenza B no crecen bien en huevos y deben “adaptarse al huevo”. Desgraciadamente, la adaptación al huevo de los virus influenza B da como resultado la pérdida de un sitio de glicosilación unido a N en el residuo de aminoácido 196 ó 197 del polipéptido HA. La pérdida del sitio de glicosilación unido a N afecta a la antigenicidad del virus y de manera correspondiente a la eficacia de la vacuna. La estabilización del sitio de glicosilación unido a N en virus influenza B hechos crecer en huevos podría ser de importancia en, entre otros, la fabricación de una vacuna contra la gripe B. Por ejemplo, Lugovtsev et al. (2007), Virology; 365(2):315-23 describen que se ha encontrado en estudios previos que la adaptación de la cepa B/Victoria/504/2000 a alto crecimiento en huevos estaba asociada con cambios sólo en hemaglutinina (HA). El fenotipo de alto crecimiento se asoció con la adquisición de o bien dos (R162M y D196Y) o bien tres (G141E,

45 R162M y D196Y) sustituciones de aminoácido (AA), que se pronosticó que estarían cerca del dominio de unión al receptor de HA. Logovtsev et al. (2007) describen la contribución al crecimiento del virus de cada una de estas sustituciones de AA y determinaron su efecto sobre las propiedades antigénicas. Se encontró que G141E y R162M eran las más favorables para el crecimiento del virus; sin embargo, sólo R162M pudo mejorar el crecimiento del virus sin alteración antigénica. En Nakagawa et al. (2003), J Gen Virol; 84(4):769-73, se usaron dos anticuerpos monoclonales para seleccionar mutantes de escape (definidos por su falta de reactividad frente a los anticuerpos monoclonales) de las cepas del grupo Yamagata del virus influenza B. El análisis de las secuencias de aminoácidos deducidas identificó una sustitución de aminoácido individual en el residuo 141 (Gly->Arg) o 149 (Arg->Gly) en los mutantes de escape 5H4 y 141 (Gly->Arg), 147 (Thr->Ile) o 148 (Ser->Gly) en los mutantes de escape 3A12.

55 Sumario de la invención

La presente invención se define mediante las reivindicaciones. La invención engloba un método de preparación de un virus influenza B tal como se define mediante la reivindicación 1. Se introduce una mutación que da como resultado una sustitución de aminoácido en la posición 141 de HA por arginina en un genoma de virus influenza B. Se replica el genoma de virus influenza B mutado en condiciones mediante las cuales se produce el virus influenza

B.

La invención también engloba un método de preparación de un virus influenza B tal como se define mediante la reivindicación 3. Se introduce una pluralidad de vectores en una población de células huésped. Los vectores 65 comprenden secuencias de nucleótidos que corresponden a: (a) al menos 6 segmentos genómicos internos de una primera cepa de influenza B, y (b) uno o más segmentos genómicos que codifican para los polipéptidos HA y NA de

al menos una segunda cepa de influenza B. El polipéptido HA comprende una arginina en el residuo de aminoácido

141. La población de células huésped se cultiva a una temperatura que no supera los 35 grados. Se recupera el virus influenza.

5 Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Ilustración del plásmido pAD3000.

Figura 2: Ilustración de un sistema de ocho plásmidos para la producción de virus influenza B.

Figura 3A-D: A y B, caracterización de virus MDV-B recombinante mediante RT-PCR; C y D, caracterización de B/Yamanashi/166/98 recombinante mediante RT-PCR.

Figura 4A y B: Secuencia de pAD3000 en formato de GeneBank (SEQ ID NO: 3).

15 Figura 5A -AE: Alineación de secuencias con MDV-B y ocho plásmidos, A-E, segmento PB1 (SEQ ID NO: 4); F-J, segmento PB2 (SEQ ID NO: 5); K-O, segmento PA (SEQ ID NO: 6); P-S, segmento HA (SEQ ID NO: 7); T-W, segmento NP (SEQ ID NO: 8); X-Z, segmento NA (SEQ ID NO: 9); AA-AC, segmento M (SEQ ID NO: 10); AD-AE, segmento NS (SEQ ID NO: 11).

Figura 6: Productos de RT-PCR derivados de la amplificación simultánea de los segmentos HA y NA de cepas de influenza B.

Figura 7: Gráfico de barras que ilustra títulos relativos de virus recombinantes y reordenantes.

25 Figura 8: Ilustración esquemática de recombinantes de genes triples con residuos de tipo natural en proteínas PA, NP y M1.

Figura 9: Tabulación de crecimiento de virus recombinantes de genes individuales y genes dobles.

Figura 10: Tabulación de los residuos de aminoácido de la nucleoproteína que corresponden al fenotipo no ts.

Figura 11: Gráficos de barras que ilustran la replicación diferencial de virus reordenantes. Los recuadros grises representan residuos de aminoácido de tipo natural. La línea discontinua representa la temperatura de desactivación

35 (ts) de 2,0 log10.

Figura 12: Alineación de las secuencias de HA cerca del sitio de glicosilación en 196/197 de varias cepas de influenza B amplificadas en huevos. Se alinean los virus del linaje Victoria con la cepa de referencia B/Victoria/2/87 (SEQ ID NO: 12). Se alinean los virus del linaje Yamagata con B/Yamagata/16/88 (SEQ ID NO: 13). En la alineación sólo se muestran los residuos que difieren de la cepa de referencia. El posible sitio de N-glicosilación (N-X-T/S) en la posición de 196/197 se indica subrayado y en forma de flecha. “.” indica deleción de aminoácido en los linajes B/Yamagata. “x” indica aminoácido mixto.

Figura 13: Confirmación de la glicosilación de HA mediante inmunotransferencia de tipo Western. Se sometieron a

45 electroforesis B/Shanghai/361/02 6:2 (B/SH), B/Jilin/20/03 6:2 (B/JL) y B/Jiangsu/10/03 6:2 (B/JS) con la secuencia 196-199 indicada en SDS-PAGE al 10%. Se detectaron las proteínas HA1 y HA2 mediante inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpo policlonal anti-HA. El subrayado indica la secuencia original presente en el aislado de virus en huevo.

Figura 14: Virus hechos crecer en huevos con arginina en el residuo 141 de HA conservan la glicosilación en el residuo 196-197. Se hicieron crecer en huevos B/Shanghai/361/02 6:2 (B/SH), B/Ohio/1/05 6:2 (B/Ohio) y B/Jiangsu/10/03 6:2 (B/JS) con los residuos indicados en 141 y 196/197 y se sometieron a electroforesis los virus en SDS-PAGE al 10%. Se detectaron las proteínas HA1 y HA2 mediante inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpo policlonal anti-HA. La migración más lenta de HA1 indica que el sitio 196/197 estaba glicosilado tal como

55 se indica mediante*. El subrayado indica la secuencia original presente en el aislado de virus en huevo.

Descripción detallada

La presente invención engloba un método para producir virus influenza B mediante la introducción de vectores en células en cultivo tal como se define mediante las reivindicaciones. Los virus influenza B producidos mediante el método pueden tener residuos de aminoácido en posiciones particulares que influyen en la capacidad de los virus para replicarse en huevos, o pueden influir en las características de los virus una vez replicados en huevos.

A menos que se defina otra cosa, se entiende que todos los términos científicos y técnicos tienen el mismo

65 significado que el usado comúnmente en la técnica a la que pertenecen. Para el fin de la presente invención, se definen a continuación los siguientes términos:

Un “ácido nucleico”, “polinucleótido”, “secuencia de polinucleótido” y “secuencia de ácido nucleico” pueden ser un polímero de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos monocatenario o bicatenario, o una quimera o análogo de los mismos. Estos términos también pueden incluir polímeros de análogos de nucleótidos que se producen de manera

5 natural que tienen la naturaleza esencial de los nucleótidos naturales porque se hibridan con ácidos nucleicos monocatenarios de manera similar a los nucleótidos que se producen de manera natural (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos).

Un “gen” puede referirse a cualquier ácido nucleico asociado con una función biológica. Los genes incluyen secuencias codificantes y/o las secuencias reguladoras requeridas para su expresión. Un “gen” puede referirse a una secuencia genómica específica, así como a un ADNc o a un ARNm codificado por esa secuencia genómica.

Los genes pueden incluir además segmentos de ácido nucleico no expresados que, por ejemplo, forman secuencias de reconocimiento para otras proteínas. Las secuencias reguladoras no expresadas incluyen “promotores” y

15 “potenciadores”, a los que se unen proteínas reguladoras tales como factores de transcripción, dando como resultado la transcripción de secuencias adyacentes o cercanas. Un promotor o potenciador “específico de tejido” es uno que regula la transcripción en un tipo o tipos de tejido o tipo o tipos de células específico(s).

Un “vector” puede ser un medio mediante el cual puede propagarse y/o transferirse un ácido nucleico entre organismos, células o componentes celulares. Los vectores incluyen plásmidos, virus, bacteriófagos, provirus, fagémidos, transposones y cromosomas artificiales, y similares, que se replican de manera autónoma o pueden integrarse en un cromosoma de una célula huésped. Un vector también puede ser un polinucleótido de ARN desnudo, un polinucleótido de ADN desnudo, un polinucleótido compuesto tanto por ADN como por ARN dentro de la misma hebra, un ADN o ARN conjugado con poli-lisina, un ADN o ARN conjugado con péptidos, un ADN

25 conjugado con liposomas, o similares, que no son de replicación autónoma.

Un “vector de expresión” puede ser un vector, tal como un plásmido, que puede promover la expresión, así como la replicación de un ácido nucleico incorporado en el mismo. Un ácido nucleico que va a expresarse puede estar “operativamente unido” a un promotor y/o potenciador, y someterse al control de regulación de la transcripción por el promotor y/o potenciador.

Un “vector de expresión bidireccional” normalmente se caracteriza por dos promotores alternativos orientados en sentidos opuestos en relación con un ácido nucleico situado entre los dos promotores, de manera que puede iniciarse la expresión en ambas orientaciones dando como resultado, por ejemplo, la transcripción de ARN tanto de

35 hebra positiva (+) o sentido, como de hebra negativa (-) o antisentido. Alternativamente, el vector de expresión bidireccional puede ser un vector ambisentido, en el que el ARNm viral y el ARN genómico viral (tal como un ARNc) se expresan a partir de la misma hebra.

“Aislado”, cuando se refiere a un material biológico, tal como un ácido nucleico o una proteína, puede ser un material biológico que está sustancialmente libre de los componentes que normalmente le acompañan o interaccionan con el mismo en su entorno que se produce de manera natural. El material aislado puede comprender opcionalmente materiales no encontrados con el material en su entorno natural, por ejemplo, una célula.

“Recombinante” puede indicar un material (por ejemplo, un ácido nucleico o una proteína) que se ha alterado

45 artificial o sintéticamente (de manera no natural) por la intervención humana. La alteración puede realizarse en el material dentro de, o retirado de, su estado o entorno natural.

Los virus reordenantes incluyen virus que incluyen componentes genéticos y/o de polipéptido derivados de más de una fuente o cepa viral original. Por ejemplo, un reordenante 7:1 incluye 7 segmentos genómicos virales (o segmentos génicos) derivados de un primer virus original y 1 segmento genómico viral, por ejemplo, que codifica para hemaglutinina o neuraminidasa, de un segundo virus original. Un reordenante 6:2 incluye 6 segmentos genómicos, lo más comúnmente los 6 genes internos de un primer virus original, y dos segmentos genómicos, por ejemplo, hemaglutinina y neuraminidasa, de un segundo virus original. Un reordenante 6:1:1 puede incluir 6 segmentos genómicos, lo más comúnmente los 6 genes internos de un primer virus original, 1 segmento genómico

55 de un segundo virus original que codifica para hemaglutinina y 1 segmento genómico de un tercer virus original que codifica para neuraminidasa. Los 6 genes internos también pueden ser los de más de un virus original.

La introducción de vectores o ácidos nucleicos puede referirse a la incorporación de los ácidos nucleicos en una célula eucariota o procariota. Los vectores o ácidos nucleicos pueden incorporarse en la célula mediante la incorporación en su genoma (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plastidio o ADN mitocrondrial), pueden convertirse en un replicón autónomo, o pueden expresarse de manera transitoria (por ejemplo, ARNm transfectado). La introducción incluye métodos tales como “infección”, “transfección”, “transformación” y “transducción”. La introducción puede realizarse mediante electroporación, precipitación con fosfato de calcio o transfección mediada por lípidos (lipofección).

65 Una célula huésped puede ser una célula que contiene un ácido nucleico heterólogo, tal como un vector, y que

soporta la replicación y/o expresión del ácido nucleico. Las células huésped pueden ser células procariotas tales como E. coli, o células eucariotas tales como células de levadura, insecto, anfibio, ave o mamífero, incluyendo células humanas. Las células huésped incluyen células Vero (de riñón de mono verde africano), células Per.C6 (células retinianas embrionarias humanas), células BHK (de riñón de cría de hámster), células primarias de riñón de

5 pollo (PCK), células de riñón canino Madin-Darby (MDCK), células de riñón bovino Madin-Darby (MDBK), células 293 (por ejemplo, células 293T) y células COS (por ejemplo, células COS1, COS7). La célula huésped también engloba combinaciones o mezclas de células incluyendo, por ejemplo, cultivos mixtos de diferentes tipos celulares o líneas celulares (por ejemplo, células Vero y CEK). El cocultivo de células Vero sometidas a electroporación se describe, por ejemplo, en el documento PCT/US04/42669 presentado el 22 de diciembre de 2004.

Un virus sensible a la temperatura (ts) presenta normalmente una reducción de 100 veces o mayor en el título a 37ºC en relación con 33ºC para cepas de influenza B. Un virus adaptado al frío (ca) presenta normalmente crecimiento a 25ºC dentro de 100 veces su crecimiento a 33ºC. Un virus atenuado (att) se replica normalmente en las vías respiratorias superiores de hurones, pero no es detectable en tejidos pulmonares, y no produce enfermedad

15 de tipo gripe en los animales. El crecimiento indica la cantidad viral tal como se indica mediante el título, el tamaño de placa o la morfología, densidad de partícula u otras medidas conocidas por los expertos en la técnica.

Un virus, ácido nucleico viral o producto codificado viralmente, modificado artificialmente por ingeniería genética, por ejemplo, un polipéptido, una vacuna, es un virus, ácido nucleico o producto, que incluye al menos una mutación introducida mediante métodos recombinantes, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis por PCR, etc. Un virus (o componente o producto viral) modificado artificialmente por ingeniería genética que comprende una o más mutaciones de nucleótido y/o sustituciones de aminoácido indica que el genoma o segmento genómico viral que codifica para el virus (o componente o producto viral) no se deriva de fuentes que se producen de manera natural, tales como una cepa de virus de laboratorio existente previamente o que se produce de manera natural de virus

25 producido mediante métodos no recombinantes (tales como pases progresivos a 25ºC), por ejemplo, una cepa A/Ann Arbor/6/60 o B/Ann Arbor/1/66 de tipo natural o adaptada al frío.

Vectores

En algunos métodos englobados por la invención, pueden insertarse segmentos genómicos virales que corresponden a cada uno de los ochos segmentos del virus influenza B en una pluralidad de vectores para la manipulación y producción de virus influenza. Pueden incluirse ocho vectores en la pluralidad de vectores; ocho vectores que comprenden secuencias de ácido nucleico que corresponden a los ocho segmentos genómicos de uno

o más virus influenza B. La pluralidad de vectores pueden incluir más o menos vectores. Por ejemplo, pueden

35 incluirse 11 vectores en la pluralidad de vectores; 11 vectores que comprenden secuencias de ácido nucleico que corresponden a las secuencias codificantes de las 11 proteínas del virus influenza B. Alternativamente, puede incluirse un vector en la pluralidad de vectores; un vector que comprende cada uno de los ochos segmentos genómicos del uno o más virus influenza B. También pueden incluirse dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, nueve o diez vectores en la pluralidad de vectores.

Los vectores pueden ser vectores virales, plásmidos, cósmidos, fagos o cromosomas artificiales. Si los vectores son plásmidos, los plásmidos pueden proporcionar uno o más orígenes de replicación funcional en células bacterianas y eucariotas y, opcionalmente, un marcador conveniente para examinar o seleccionar células que incorporan la secuencia de plásmido. Un vector de ejemplo, el plásmido pAD3000, se ilustra en la figura 1.

45 Si los vectores son plásmidos, los plásmidos pueden ser vectores de expresión bidireccionales que pueden iniciar la transcripción de los segmentos genómicos virales en cualquier sentido, es decir, dando lugar a moléculas de ARN viral tanto de hebra (+) como de hebra (-). Para efectuar la transcripción bidireccional, se inserta cada uno de los segmentos genómicos virales en un vector que tiene al menos dos promotores independientes, de manera que se transcriben copias de ARN genómico viral mediante un primer promotor de ARN polimerasa (por ejemplo, Pol I), a partir de una hebra y se sintetizan ARNm virales a partir de un segundo promotor de ARN polimerasa (por ejemplo, Pol II). Por consiguiente, los dos promotores se disponen en orientaciones opuestas flanqueando al menos un sitio de clonación (es decir, una secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción), preferiblemente un único sitio de clonación, adecuado para la inserción de segmentos de ARN genómico viral. Alternativamente, puede emplearse

55 un vector “ambisentido” en el que se transcriben el ARNm de hebra (+) y el ARN viral de hebra (-) (como ARNc) a partir de la misma hebra del vector.

Vectores de expresión

El segmento genómico del virus influenza que va a expresarse está operativamente unido a una secuencia de control de la transcripción apropiada (promotor) para dirigir la síntesis de ARNm. Una variedad de promotores son adecuados para su uso en vectores de expresión para regular la transcripción de segmentos genómicos del virus influenza. En determinadas realizaciones, por ejemplo, en las que el vector es el plásmido pAD3000, se utiliza el promotor de ARN polimerasa II (Pol II) dependiente de ADN de citomegalovirus (CMV). Si se desea, por ejemplo, 65 para regular la expresión condicionada, pueden sustituirse otros promotores que inducen transcripción de ARN en las condiciones especificadas, o en las células o los tejidos especificados. Están disponibles numerosos promotores

virales y de mamífero, por ejemplo, humanos, o pueden aislarse según la aplicación específica contemplada. Por ejemplo, los promotores alternativos obtenidos de los genomas de virus animales y humanos incluyen promotores tales como los promotores de adenovirus (tal como adenovirus 2), papilomavirus, virus de la hepatitis B, poliomavirus y virus de simio 40 (SV40), y diversos promotores retrovirales. Los promotores de mamífero incluyen,

5 entre muchos otros, el promotor de actina, promotores de inmunoglobulina, promotores de choque térmico, y similares. Además, pueden emplearse promotores de bacteriófagos conjuntamente con la ARN polimerasa relacionada, por ejemplo, el promotor de T7.

La transcripción se aumenta opcionalmente incluyendo una secuencia potenciadora. Los potenciadores normalmente son elementos de ADN de actuación en cis cortos, por ejemplo de 10-500 pb, que actúan en colaboración con un promotor para aumentar la transcripción. Se han aislado muchas secuencias potenciadoras de genes de mamífero (hemoglobina, elastasa, albúmina, alfa-fetoproteína e insulina) y virus de células eucariotas. El potenciador puede someterse a corte y empalme en el vector en una posición en 5’ o 3’ con respecto a la secuencia codificante heteróloga, pero normalmente se inserta en un sitio en 5’ con respecto al promotor. Normalmente, el

15 promotor, y si se desea, secuencias de potenciación de la transcripción adicionales se eligen para optimizar la expresión en el tipo de célula huésped en el que va a introducirse el ADN heterólogo (Scharf et al. (1994) Heat stress promotors and transcription factors Results Probl Cell Differ 20:125-62; Kriegler et al. (1990) Assembly of enhancers, promoters, and splice signals to control expression of transferred genes, Methods in Enzymol 185: 51227). Opcionalmente, el amplicón también puede contener un sitio de unión a ribosomas o un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) para la iniciación de la traslocación.

Los vectores tal como se describen también pueden incluir secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm, tal como un sitio de poliadenilación o una secuencia de terminación. Tales secuencias están disponibles comúnmente a partir de las regiones no traducidas en 5’ y, ocasionalmente en 3’, de

25 ADN o ADNC eucariotas o virales. En una realización, por ejemplo, que implica el plásmido pAD3000, las secuencias de poliadenilación de SV40 proporcionan una señal de poliadenilación.

Además, tal como se describió anteriormente, los vectores de expresión incluyen opcionalmente uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células huésped transformadas. Además de los genes enumerados anteriormente, marcadores tales como dihidrofolato reductasa o de resistencia a neomicina son adecuados para la selección en cultivo de células eucariotas.

Puede emplearse el vector que contiene la secuencia de ADN apropiada tal como se describió anteriormente, así como una secuencia de control o promotora apropiada, para transformar una célula huésped permitiendo la

35 expresión de la proteína.

Elementos de expresión adicionales

Un segmento genómico que codifica para una proteína de virus influenza puede incluir cualquier secuencia adicional necesaria para la expresión del segmento. Por ejemplo, pueden incluirse señales de iniciación específicas que ayudan en la traducción eficaz de la secuencia codificante heteróloga. Estas señales pueden incluir, por ejemplo, el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. Para garantizar la traducción de toda la proteína codificada por el segmento genómico, se inserta el codón de iniciación en el marco de lectura correcto en relación con la proteína viral. Los codones de iniciación y elementos de transcripción exógenos pueden ser de diversos orígenes, tanto

45 naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión puede potenciarse mediante la inclusión de potenciadores apropiados para el sistema celular en uso.

Pueden incorporarse en el vector secuencias de polinucleótido adicionales tales como secuencias señal, secuencias de secreción o localización, y similares, habitualmente, en marco con la secuencia de polinucleótido de interés, por ejemplo, para dirigir la expresión del polipéptido a un compartimento celular, membrana u orgánulo deseado, o a los medios de cultivo celular. Tales secuencias las conocen los expertos e incluyen péptidos líder de secreción, secuencias de direccionamiento a orgánulos (por ejemplo, secuencias de localización nuclear, señales de retención en el ER, secuencias de tránsito mitocondrial), secuencias de ubicación/anclaje en la membrana (por ejemplo, secuencias de detención de la transferencia, secuencias de anclaje a GPI), y similares.

55 Segmentos genómicos internos

Los segmentos genómicos internos de una cepa de virus influenza B pueden ser los segmentos genómicos internos de uno o más virus influenza B maestros. El uno o más virus influenza B maestros pueden seleccionarse basándose en propiedades deseables relevantes para la administración de la vacuna. Por ejemplo, puede seleccionarse una cepa de virus de influenza B donador maestro para un fenotipo atenuado, adaptación al frío y/o sensibilidad a la temperatura. En este contexto, B/Ann Arbor/1/66 ca, o una cepa de influenza B modificada artificialmente por ingeniería genética que incorpora una o más de las sustituciones de aminoácido especificadas en la tabla 17 puede ser la cepa de influenza B donadora maestra. Estas sustituciones de aminoácido pueden incluir sustituciones en uno 65 o más de PB2630; PA431; PA497; NP55; NP114; NP410; NP509; M1159 y M1183. Las sustituciones de aminoácido pueden incluir una o más de las siguientes: PB2631, (S630R); PA431 (V431M); PA497 (Y497H); NP55 (T55A); NP114 (V114A);

NP410 (P410H); NP509 (A509T); M1159 (H159Q) y M1183 (M 183V). Las sustituciones de aminoácido pueden incluir sustituciones en la totalidad de PB2630; PA431; PA497; NP55; NP114; NP410; NP509; M1159 y M1183. Las sustituciones pueden ser la totalidad de PB2630 (S630R); PA431 (V431M); PA497 (Y497H); NP55 (T55A); NP114 (V114A); NP410 (P410H); NP509 (A509T); M1159 (H159Q) y M1183 (M183V).

5 Los seis segmentos genómicos internos de la una o más cepas de virus influenza B maestro (es decir, PB1, PB2, PA, NP, NB, M1, BM2, NS1 y NS2) pueden transfectarse en células huésped adecuadas en combinación con segmentos de hemaglutinina y neuraminidasa de una cepa deseable antigénicamente, por ejemplo, una cepa que se pronostica que produce infección por influenza local o global significativa. Tras la replicación del virus reordenante en cultivo celular a temperaturas apropiadas para lograr una recuperación eficaz, por ejemplo, igual o inferior a 35ºC, tal como entre aproximadamente 30ºC y 35ºC, tal como entre aproximadamente 32ºC y 35ºC, tal como entre aproximadamente 32ºC y 34ºC, o a aproximadamente 30ºC, o a aproximadamente 31ºC, o a aproximadamente 32ºC, o a aproximadamente 33ºC, o a aproximadamente 34ºC o a aproximadamente 35ºC, se recuperan virus reordenantes. El virus recuperado puede replicarse en huevos embrionados. El virus recuperado puede recuperarse

15 en células en cultivo. El virus recuperado, que puede haberse replicado en huevos embrionados o células en cultivo, puede inactivarse usando un agente de desnaturalización tal como formaldehído o β-propiolactona.

Virus influenza B con atributos alterados

Los métodos de la presente invención engloban la introducción de una mutación que da como resultado una sustitución de aminoácido en la posición 141 de HA. La mutación puede aumentar la capacidad del virus influenza B para replicarse en huevos de pollo embrionados en comparación con el virus influenza sin sustitución en HA. La sustitución en la posición 141 de HA puede permitir además que el virus influenza conserve la glicosilación en el residuo de aminoácido 196/197 de HA. La sustitución en la posición 141 de HA puede no alterar adicionalmente de

25 manera significativa la antigenicidad de HA. La sustitución en la posición 141 de la HA es por una arginina.

La introducción de la sustitución de aminoácido en HA puede potenciar la capacidad del virus influenza B para replicarse en huevos en al menos el 10%, o en al menos el 20%, o en al menos el 30%, o en al menos el 40%, o en al menos el 50%, o en al menos el 60%, o en al menos el 70%, o en al menos el 80%, o en al menos el 90%, o en al menos el 100%, o en al menos el 200%, o en al menos el 300%, o en al menos el 400%, o en al menos el 500% en comparación con el virus influenza no modificado. El título del virus con capacidad potenciada para replicarse en huevos puede ser de al menos 5,0 log10 UFP/ml, al menos 6,0 log10 UFP/ml, al menos 6,5 log10 UFP/ml, al menos 7,0 log10 UFP/ml, al menos 7,25 log10 UFP/ml, al menos 7,5 log10 UFP/ml, al menos 7,75 log10 UFP/ml, al menos 8,0 log10 UFP/ml, al menos 8,25 log10 UFP/ml, al menos 8,5 log10 UFP/ml, al menos 8,75 log10 UFP/ml, al menos

35 9,0 log10 UFP/ml o al menos 9,5 log10 UFP/ml. El virus influenza B con capacidad potenciada para replicarse en huevos en comparación con el virus influenza no modificado también conservará la glicosilación de HA en la posición de residuo de aminoácido 196/197.

La introducción de la sustitución de aminoácido puede no alterar adicionalmente de manera significativa la antigenicidad del virus influenza con sustitución en comparación con el virus sin sustitución. La antigenicidad del virus influenza con sustitución en comparación con el virus sin sustitución difiere en menos del 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40% o 50%. Los métodos para determinar la antigenicidad viral se conocen bien en la técnica.

La introducción de una mutación que da como resultado la sustitución de aminoácido en la HA en la posición de

45 residuo 141 puede modular la actividad de unión al receptor de la HA. La actividad de unión al receptor de la HA incluye, pero no se limita a, la unión de HA a residuos de ácido siálico (por ejemplo, restos sialil-galactosilo unidos en 2-6 [Siaα(2,6)Gal] y restos sialil-galactosilo unidos en 2-3 [Siaα(2,3)Gal]) presentes en glicoproteínas o glicolípidos de la superficie celular. Se conocen bien en la técnica métodos para someter a ensayo la unión de HA. La introducción de la mutación que da como resultado una sustitución de aminoácido en el residuo 141 de HA puede potenciar la unión de HA a restos [Siaα (2,3)Gal]. La potenciación de la unión a restos [Siaα(2,3)Gal] puede ser en al menos el 10%, o en al menos el 20%, o en al menos el 30%, o en al menos el 40%, o en al menos el 50%, o en al menos el 60%, o en al menos el 70%, o en al menos el 80%, o en al menos el 90%, o en al menos el 100%, o en al menos el 200% en, por ejemplo, un ensayo de hemaglutinación conocido por los expertos en la técnica.

55 El virus variante influenza B puede tener adicionalmente uno o más atributos incluyendo atenuación, una adaptación al frío, sensibilidad a la temperatura, o cualquier combinación de los mismos. El virus variante influenza B puede tener uno o más de estos atributos debido a la incorporación de segmentos genómicos internos de un virus donador influenza B maestro, tal como influenza B/Ann Arbor/1/66.

El virus variante influenza B para su uso en el método puede ser cualquier virus influenza B que comprenda un polipéptido HA con un residuo de glicina en la posición 141. El polipéptido HA del virus influenza B puede ser el de la cepa de influenza B/Victoria/2/87, B/Hong Kong/330/01, B/Brisbane/32/02, B/Malaysia/2506/04, B/Hawaii/13/04, B/Ohio/1/05, B/Yamagata/16/88, B/Yamanashi/166/98, B/Johannesburg/5/99, B/Victoria/504/00, B/Shanghai/361/02, B/Jilin/20/03 o B/Florida/7/04.

65 Cultivo celular

En un método englobado por la invención, se introduce una pluralidad de vectores en células huésped. Estas células huésped incluyen, por ejemplo, células Vero, células Per.C6, células BHK, células MDCK, células 293 y células COS, incluyendo células 293T, células COS7. Alternativamente, pueden emplearse cocultivos que incluyen dos de

5 las líneas celulares anteriores, por ejemplo, células MDCK y o bien células 293T o bien COS, en una razón, por ejemplo, de 1:1. Las células pueden mantenerse en un medio de cultivo comercial adecuado, tal como medio de Eagle modificado por Dulbecco complementado con suero (por ejemplo, suero bovino fetal al 10%), o en medio libre de suero, a concentración de CO2 y humedad controladas, adecuado para mantener el pH tamponado neutro (por ejemplo, a pH de entre 7,0 y 7,2). Opcionalmente, el medio contiene antibióticos para evitar el crecimiento bacteriano, por ejemplo, penicilina, estreptomicina etc., y/o nutrientes adicionales, tales como L-glutamina, piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales, complementos adicionales para promover características de crecimiento favorables, por ejemplo, tripsina, β-mercaptoetanol, y similares.

Se han notificado extensamente procedimientos para mantener células de mamífero en cultivo y los conocen los

15 expertos en la técnica. Se proporcionan protocolos generales, por ejemplo, en Freshney (1983) Culture of Animal Cells: Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, Nueva York; Paul (1975) Cell and Tissue Culture, 5ª ed., Livingston, Edinburgh; Adams (1980) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Cell Culture for Biochemists, Work and Burdon (eds.) Elsevier, Ámsterdam. Los detalles adicionales en cuanto a procedimientos de cultivo tisular de particular interés en la producción de virus influenza in vitro incluyen, por ejemplo, Merten et al. (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation. En Cohen and Shafferman (eds) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines. Adicionalmente, se determinan fácilmente variaciones en tales procedimientos a través de experimentación de rutina.

Pueden cultivarse células para la producción de virus influenza B en medio que contiene suero o libre de suero. En

25 algún caso, por ejemplo, para la preparación de virus purificados, puede ser deseable hacer crecer las células huésped en condiciones libres de suero.

Las células pueden cultivarse a cualquier escala. Las células pueden cultivarse a pequeña escala, por ejemplo, menos de 25 ml de medio, en tubos o frascos de cultivo o en grandes frascos con agitación, en botellas giratorias o en perlas microportadoras (por ejemplo, perlas microportadoras de DEAE-Dextrano, tales como Dormacell, Pfeifer & Langen; Superbead, Flow Laboratories; perlas de copolímero de estireno-trimetilamina, tales como Hillex, SoloHill, Ann Arbor) en frascos, botellas o cultivos en reactor. Las perlas microportadoras son pequeñas esferas (en el intervalo de 100-200 micrómetros de diámetro) que proporcionan una gran área superficial para el crecimiento celular adherente por volumen de cultivo celular. Por ejemplo, un solo litro de medio puede incluir más de 20

35 millones de perlas microportadoras que proporcionan más de 8000 centímetros cuadrados de superficie de crecimiento. Para la producción comercial de virus, por ejemplo, para la producción de vacunas, puede ser deseable cultivar las células en un biorreactor o fermentador. Los biorreactores están disponibles en volúmenes de desde menos de 1 litro hasta más de 100 litros, por ejemplo, biorreactor Cyto3 (Osmonics, Minnetonka, MN); biorreactores NBS (New Brunswick Scientific, Edison, N.J.); biorreactores a escala de laboratorio y comercial de B. Braun Biotech International (B. Braun Biotech, Melsungen, Alemania).

Independientemente del volumen de cultivo, los cultivos pueden mantenerse a una temperatura inferior o igual a 35ºC, inferior o igual a 34ºC, inferior o igual a 33ºC, inferior o igual a 32ºC, inferior o igual a 31ºC o inferior o igual a 30ºC. Las células pueden cultivarse a una temperatura de entre aproximadamente 30ºC y 35ºC, entre

45 aproximadamente 32ºC y 35ºC, entre aproximadamente 32ºC y aproximadamente 34ºC o entre aproximadamente 32ºC y 33ºC.

Introducción de vectores en células huésped

Pueden introducirse vectores que comprenden secuencias de nucleótidos que corresponden a segmentos genómicos de influenza (por ejemplo, transfectarse) en células huésped según métodos bien conocidos en la técnica incluyendo, por ejemplo, coprecipitación con fosfato de calcio, electroporación, microinyección, lipofección y transfección empleando reactivos de transfección de poliamina. A modo de ejemplo, pueden transfectarse vectores, por ejemplo, plásmidos, en células huésped, tales como células COS, células 293T o combinaciones de células COS

55 o 293T y células MDCK, usando el reactivo de transfección de poliamina TransIT-LT1 (Mirus) según las instrucciones del fabricante. Puede introducirse aproximadamente 1 µg de cada vector en la población de células huésped con aproximadamente 2 µl de TransIT-LT1 diluidos en 160 µl de medio en un volumen total de 200 µl. Se incuban las mezclas de ADN:reactivo de transfección a temperatura ambiente durante 45 min seguido por la adición de 800 µl de medio. Se añade la mezcla de transfección a las células huésped, y se cultivan las células tal como se describió anteriormente.

Alternativamente, puede emplearse electroporación para introducir vectores que comprenden secuencias de nucleótidos que corresponden a segmentos genómicos de influenza en células huésped. A modo de ejemplo, pueden introducirse vectores de plásmido que comprenden secuencias de nucleótidos que corresponden a 65 segmentos genómicos de influenza B en células Vero usando electroporación según el siguiente procedimiento. Se resuspenden 5 x 106 células Vero, por ejemplo, hechas crecer en medio de Eagle modificado (MEM) complementado

con suero bovino fetal al 10% (FBS) en 0,4 ml de OptiMEM y se colocan en una cubeta de electroporación. Se añaden veinte microgramos de ADN en un volumen de hasta 25 µl a las células en la cubeta, que entonces se mezclan suavemente mediante ligeros golpes. Se realiza la electroporación según las instrucciones del fabricante (por ejemplo, BioRad Gene Pulser II con Capacitance Extender Plus conectado) a 300 voltios, 950 microfaradios con

5 una constante de tiempo de entre 28-33 ms. Se vuelven a mezclar las células mediante ligeros golpes y aproximadamente 1-2 minutos tras la electroporación se añaden 0,7 ml de MEM con FBS al 10% directamente a la cubeta. Entonces se transfieren las células a dos pocillos de una placa de cultivo tisular de 6 pocillos convencional que contiene 2 ml de MEM, FBS al 10% u OPTI-MEM sin suero. Se lava la cubeta para recuperar cualquier célula restante y se divide la suspensión de lavado entre los dos pocillos. El volumen final es de aproximadamente 3,5 ml. Entonces se incuban las células en condiciones permisivas para el crecimiento viral.

Recuperación de virus

Pueden recuperarse virus del medio de cultivo de células en las que se han introducido una pluralidad de vectores.

15 Puede obtenerse y clarificarse medio en bruto, y entonces puede concentrarse virus influenza en el medio clarificado. Los métodos de concentración comunes incluyen filtración, ultrafiltración, adsorción en sulfato de bario y elución, y centrifugación. A modo de ejemplo, en primer lugar puede clarificarse el medio en bruto procedente de cultivos infectados mediante centrifugación a, por ejemplo, 1000-2000 x g durante un tiempo suficiente para retirar residuos celulares y otra materia particulada grande, por ejemplo, entre 10 y 30 minutos. Alternativamente, el medio puede filtrarse a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,8 µm para retirar las células intactas y otra materia particulada grande. Opcionalmente, el sobrenadante del medio clarificado puede centrifugarse entonces para sedimentar los virus influenza, por ejemplo, a 15.000 x g, durante aproximadamente 3-5 horas. Tras la resuspensión del sedimento de virus en un tampón apropiado, tal como STE (Tris-HCl 0,01 M; NaCl 0,15 M; EDTA 0,0001 M) o solución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,4, el virus puede concentrarse mediante centrifugación en

25 gradiente de densidad en sacarosa (60%-12%) o tartrato de potasio (50%-10%). Son adecuados gradientes o bien continuos o bien por etapas, por ejemplo, un gradiente de sacarosa de entre el 12% y el 60% en cuatro etapas del 12%. Los gradientes pueden centrifugarse a una velocidad y durante un tiempo suficientes para que los virus se concentren en una banda visible para su recuperación. Alternativamente, y para aplicaciones comerciales a gran escala, el virus puede someterse a elutriación en gradientes de densidad usando un rotor de centrífuga zonal que funciona en modo continuo. Se proporcionan detalles suficientes para guiar a un experto a través de la preparación de virus influenza a partir de cultivo tisular, por ejemplo, en Furminger. Vaccine Production, en Nicholson et al. (eds) Textbook of Influenza, págs. 324-332; Merten et al. (1996) Production of virus influenza in cell cultures for vaccine preparation, en Cohen & Shafferman (eds) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines, págs. 141-151, y la patente estadounidense n.º 5.690.937. Si se desea, los virus recuperados pueden almacenarse a -80ºC en

35 presencia de sacarosa-fosfato-glutamato (SPG) como estabilizador.

Métodos y composiciones para la administración profiláctica de vacunas

Los virus recombinantes y reordenantes descritos en el presente documento pueden administrarse de manera profiláctica en un portador o excipiente apropiado para estimular una respuesta inmunitaria específica para una o más cepas de virus influenza. El portador o excipiente puede ser un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como agua estéril, solución salina acuosa, soluciones salinas tamponadas acuosas, disoluciones de dextrosa acuosas, disoluciones de glicerol acuosas, etanol, líquido alantoideo procedente de huevos de gallina no infectados (es decir, líquido alantoideo normal “NAF”) o combinaciones de los mismos. La preparación de tales

45 disoluciones garantizando esterilidad, pH, isotonicidad y estabilidad se efectúa según protocolos establecidos en la técnica. Generalmente, se selecciona un portador o excipiente para minimizar los efectos alérgicos u otros no deseados, y para adecuarse a la vía de administración particular, por ejemplo, subcutánea, intramuscular, intranasal, etc.

Generalmente, los virus influenza descritos en el presente documento se administran en una cantidad suficiente para estimular una respuesta inmunitaria específica para una o más cepas de virus influenza. Los expertos en la técnica conocen dosificaciones y métodos para provocar una respuesta inmunitaria protectora contra una o más cepas de influenza. A modo de ejemplo, pueden proporcionarse virus influenza inactivados en el intervalo de aproximadamente 1-1000 HID50 (dosis infecciosa humana), es decir, aproximadamente 105 -108 ufp (unidades 55 formadoras de placas) por dosis administrada. Alternativamente, se administran aproximadamente 10-50 µg, por ejemplo, aproximadamente 15 µg de HA sin un adyuvante, administrándose dosis más pequeñas con un adyuvante. Normalmente, la dosis se ajustará dentro de este intervalo basándose en por ejemplo, la edad, el estado físico, el peso corporal, el sexo, la dieta, el tiempo de administración y otros factores clínicos. La formulación de vacuna profiláctica puede administrarse de manera sistémica, por ejemplo, mediante inyección subcutánea o intramuscular usando una aguja y una jeringa, o un dispositivo de inyección sin aguja. Alternativamente, la formulación de vacuna puede administrarse por vía intranasal, o bien mediante gotas, aerosol de partículas grandes (mayores de aproximadamente 10 micrómetros) o bien pulverización en el tracto respiratorio superior. Para la administración intranasal, pueden usarse vacunas de virus vivo atenuado, por ejemplo, un virus influenza recombinante o reordenante adaptado al frío y/o sensible a la temperatura. Aunque se prefiere la estimulación de una respuesta 65 inmunitaria protectora con una única dosis, pueden administrarse dosificaciones adicionales, mediante la misma vía

o una diferente, para lograr el efecto profiláctico deseado.

Alternativamente, puede estimularse una respuesta inmunitaria mediante la selección como diana ex vivo o in vivo de células dendríticas con virus influenza. Por ejemplo, pueden exponerse células dendríticas en proliferación a virus en una cantidad suficiente y durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la captura de los antígenos de

5 influenza por las células dendríticas. Entonces se transfieren las células al sujeto que va a vacunarse mediante métodos de trasplante intravenoso convencionales.

Pueden estar presentes uno o más virus influenza B en una formulación para el tratamiento profiláctico o terapéutico de influenza. Una formulación puede comprender un virus influenza B. Una formulación puede comprender un virus influenza B y un virus influenza A. Una formulación puede comprender un virus influenza B y dos virus influenza A. Una formulación puede comprender dos virus influenza B y dos virus influenza A. Una formulación puede comprender dos virus influenza B. Al menos un virus influenza B en la formulación puede comprender una arginina en el residuo de aminoácido 141.

15 Una formulación para la administración profiláctica del virus influenza, o subunidades del mismo, también puede contener uno o más adyuvantes para potenciar la respuesta inmunitaria a los antígenos de influenza. Los adyuvantes adecuados incluyen: saponina, geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite o hidrocarburo, bacilo de Calmette-Guerin (BCG), Corynebacterium parvum y los adyuvantes sintéticos QS-21 y MF59.

La formulación para la administración profiláctica de virus influenza puede realizarse conjuntamente con la administración de una o más moléculas inmunoestimuladoras. Las moléculas inmunoestimuladoras incluyen diversas citocinas, linfocinas y quimiocinas con actividades inmunoestimuladoras, inmunopotenciadoras y proinflamatorias, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13); factores de crecimiento

25 (por ejemplo, factor estimulante de colonias (CSF) de granulocitos-macrófagos (GM)); y otras moléculas inmunoestimuladoras, tales como factor inflamatorio de macrófagos, ligando de Flt3, B7.1; B7.2, etc. Las moléculas inmunoestimuladoras pueden administrarse en la misma formulación que el virus influenza, o pueden administrarse por separado. Puede administrarse o bien la proteína o bien un vector de expresión que codifica para la proteína para producir un efecto inmunoestimulador.

Los vectores descritos en el presente documento que comprenden secuencias de nucleótidos que corresponden a segmentos genómicos de influenza pueden emplearse para introducir ácidos nucleicos heterólogos en un organismo huésped o célula huésped, tal como una célula de mamífero, por ejemplo, células derivados de un sujeto humano, en combinación con un portador o excipiente farmacéutico adecuado tal como se describió anteriormente. Puede 35 insertarse un ácido nucleico heterólogo en una región no esencial de un gen o segmento genómico. La secuencia de polinucleótido heteróloga puede codificar para un polipéptido o péptido, o para un ARN tal como un ARN antisentido

o ribozima. Entonces se introduce el ácido nucleico heterólogo en un huésped o en células huésped produciendo virus recombinantes que incorporan el ácido nucleico heterólogo, y se introducen los virus tal como se describió anteriormente.

Alternativamente, puede introducirse un vector descrito en el presente documento que incluye un ácido nucleico heterólogo y expresarse en células huésped cotransfectando el vector en una célula infectada con un virus influenza. Opcionalmente, se devuelven o se administran entonces las células al sujeto, normalmente al sitio del que se obtuvieron. En algunas aplicaciones, las células se injertan en un sitio de tejido, órgano o sistema (tal como se

45 describió anteriormente) de interés, usando procedimientos establecidos de transferencia o injerto de células. Por ejemplo, pueden administrarse células madre del linaje hematopoyético, tales como células madre hematopoyéticas derivadas de médula ósea, sangre de cordón umbilical o sangre periférica a un sujeto usando técnicas convencionales de administración o transfusión.

Alternativamente, pueden administrarse los virus que comprenden un ácido nucleico heterólogo a las células de un sujeto in vivo. Tales métodos pueden implicar la administración de partículas de vector a una población de células diana (por ejemplo, células sanguíneas, células cutáneas, células hepáticas, células neuronales (incluyendo, cerebro), células renales, células uterinas, células musculares, células intestinales, células de cuello uterino, células vaginales, células de próstata, etc., así como células tumorales derivadas de una variedad de células, tejidos y/u

55 órganos. La administración puede ser o bien sistémica, por ejemplo, mediante administración intravenosa de partículas virales, o bien mediante administración de las partículas virales directamente al sitio o sitios de interés mediante una variedad de métodos, incluyendo inyección (por ejemplo, usando una ajuga o jeringa), administración de vacuna sin aguja, administración tópica, o presionando contra un sitio de tejido, órgano o piel. Por ejemplo, las partículas de vector viral pueden administrarse mediante inhalación, por vía oral, por vía intravenosa, por vía subcutánea, por vía subdérmica, por vía intradérmica, por vía intramuscular, por vía intraperitoneal, por vía intratecal, mediante administración vaginal o rectal, o colocando las partículas virales dentro de una cavidad u otro sitio del organismo, por ejemplo, durante cirugía.

Los métodos englobados por la presente invención y los virus descritos en el presente documento pueden usarse

65 para tratar terapéutica o profilácticamente una amplia variedad de trastornos, incluyendo trastornos genéticos y adquiridos, por ejemplo, como vacunas para enfermedades infecciosas, debidas a virus, bacterias y similares.

Kits

Para facilitar el uso de los vectores y virus influenza descritos en el presente documento, puede envasarse

5 cualquiera de éstos, y componentes adicionales tales como tampón, células, medio de cultivo, útiles para el envasado y la infección del virus influenza para fines experimentales o terapéuticos, en forma de un kit. El kit puede contener, además de los componentes anteriores, materiales adicionales, por ejemplo, instrucciones para realizar los métodos de la invención, material de envasado, y un contenido.

Manipulación de ácidos nucleicos y proteínas virales

En el contexto de la invención, se manipulan ácidos nucleicos y/o proteínas de virus influenza según técnicas de biología molecular bien conocidas. Protocolos detallados para numerosos de tales procedimientos, incluyendo amplificación, clonación, mutagénesis, transformación, y similares, se describen, por ejemplo, en Ausubel et al.

15 Current Protocols in Molecular Biology (con suplementos hasta 2000) John Wiley & Sons, Nueva York (“Ausubel”); Sambrook et al. Molecular Cloning -A Laboratory Manual (2ª ed.), vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989 (“Sambrook”), y Berger y Kimmel Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, volumen 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (“Berger”).

Además de las referencias anteriores, se encuentran protocolos para técnicas de amplificación in vitro, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación mediante Qβreplicasa y otras técnicas mediadas por ARN polimerasa (por ejemplo, NASBA), útiles por ejemplo, para amplificar sondas de ADNc, en Mullis et al. (1987) patente estadounidense n.º 4.683.202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (“Innis”); Arnheim y Levinson (1990)

25 C&EN 36; The Journal Of NIH Research (1991) 3:81; Kwoh et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86, 1173; Guatelli et al. (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87:1874; Lomell et al. (1989) J Clin Chem 35:1826; Landegren et al. (1988) Science 241:1077; Van Brunt (1990). Biotechnology 8:291; Wu y Wallace (1989) Gene 4: 560; Barringer et al. (1990) Gene 89:117, y Sooknanan y Malek (1995) Biotechnology 13:563. Los métodos adicionales, útiles para clonar ácidos nucleicos en el contexto de la presente invención, incluyen Wallace et al., patente estadounidense n.º 5.426.039. Métodos mejorados de amplificación de ácidos nucleicos grandes mediante PCR se resumen en Cheng et al. (1994) Nature 369:684 y las referencias en el mismo.

Pueden sintetizarse determinados polinucleótidos descritos en el presente documento, por ejemplo, oligonucleótidos, utilizando diversas estrategias en fase sólida incluyendo química de acoplamiento con fosforamidita basada en

35 mononucleótidos y/o trinucleótidos. Por ejemplo, pueden sintetizarse secuencias de ácido nucleico mediante la adición secuencial de monómeros y/o trímeros activados a una cadena de polinucleótido en elongación. Véase, por ejemplo, Caruthers, M.H. et al. (1992) Met Enzymol 211:3.

En lugar de sintetizar las secuencias deseadas, puede encargarse a medida esencialmente cualquier ácido nucleico de cualquiera de una variedad de fuentes comerciales, tales como The Midland Certified Reagent Company (mcrc@oligos.com), The Great American Gene Company (www.genco.com), ExpressGen, Inc. (www.expressgen.com), Operon Technologies, Inc. (www.operon.com), y muchas otras.

Además, pueden realizarse sustituciones de residuos de aminoácido seleccionados en polipéptidos virales mediante,

45 por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio. Por ejemplo, pueden producirse polipéptidos virales con sustituciones de aminoácido correlacionadas funcionalmente con una característica fenotípica deseable, por ejemplo, un fenotipo atenuado, adaptación al frío, sensibilidad a la temperatura, introduciendo mutaciones específicas en un segmento de ácido nucleico viral que codifica para el polipéptido. Los métodos para la mutagénesis dirigida al sitio se conocen bien en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Ausubel, Sambrook y Berger, citados anteriormente. Están disponibles comercialmente numerosos kits para realizar mutagénesis dirigida al sitio, por ejemplo, el kit de mutagénesis dirigida al sitio Chameleon (Stratagene, La Jolla), y pueden usarse según las instrucciones de los fabricantes para introducir, por ejemplo, una o más sustituciones de aminoácido descritas en la tabla 6 o la tabla 17, en un segmento genómico que codifica para un polipéptido de influenza A o B, respectivamente.

55 Ejemplos

EJEMPLO 1: CONSTRUCCIÓN DE pAD3000

Se modificó el plásmido pHW2000 (Hoffmann et al. (2000) A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids, Proc Natl Acad Sci USA 97:6108-6113) para sustituir las señales de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH) por secuencias señal de poliadenilación derivadas de virus de simio 40 (SV40).

Se amplificaron secuencias derivados de SV40 con Taq MasterMix (Qiagen) usando los siguientes oligonucleótidos,

65 designados en el sentido de 5’ a 3’: poliA.1: AACAATTGAGATCTCGGTCACCTCAGACATGATAAGATACATTGATGAGT (SEQ ID NO: 1) poliA.2:

TATAACTGCAGACTAGTGATATCCTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTA (SEQ ID NO: 2).

Se usó el plásmido pSV2His como molde. Se obtuvo un fragmento compatible con el producto de 175 pb pronosticado y se clonó en pcDNA3.1, usando un vector de clonación Topo TA (Invitrogen) según las indicaciones 5 del fabricante. Se escindió el fragmento de 138 pb deseado que contenía las señales de poliadenilación de SV40 del plásmido resultante con EcoRV y BstEII, se aisló en un gel de agarosa y se ligó entre los sitios Pvull y BstEII únicos en pHW2000 usando técnicas convencionales (véase, por ejemplo, Ausubel, Berger, Sambrook). Se secuenció el plásmido resultante, pAD3000 (figura 1) y se encontró que contenía el sitio de poliadenilación de SV40 en la orientación correcta. Los nucleótidos 295-423 en pAD3000 corresponden a los nucleótidos 2466-2594,

10 respectivamente, en la cepa 777 de SV40 (AF332562).

EJEMPLO 2: SISTEMA DE OCHO PLÁSMIDOS PARA LA PRODUCCIÓN DE MDV-B

Se extrajo ARN viral de una variante adaptada al frío de influenza B/Ann Arbor/1/66 (ca/Master Ann Arbor/1/66 P1

15 Aviron 10/2/97), una cepa donadora maestra de influenza B a modo de ejemplo (MDV-B) a partir de 100 µl de líquido alantoideo de huevos embrionados infectados usando el kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA), y se eluyó el ARN en 40 µl de H2O. Se realizó RT-PCR de segmentos genómicos usando el kit de RT-PCR One Step (Qiagen, Valencia, CA) según el protocolo proporcionado, usando 1 µl del ARN extraído para cada reacción. La reacción de RT se realizó durante 50 min a 50ºC, seguido por 15 min a 94ºC. La PCR se realizó durante 25 ciclos a 94ºC durante

20 1 min, 54ºC durante 1 min y 72ºC durante 3 min. Se amplificaron los genes de P usando cebadores específicos de segmento con sitios BsmBI que dieron como resultado la generación de dos fragmentos (tabla 1).

Tabla 1. Cebadores de RT-PCR para la amplificación de los ocho ARNv de influenza ca B/Ann Arbor/1/66.

Cebador directo Cebador inverso

PB1 Bm-PB1b-1: (SEQ ID NO: 14) Bm-PBlb-1200R: (SEQ ID NO: 15) [1A] TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCGGAGCCTTTAAGATG TATTCGTCTCGATGCCGTTCCTTCTTCATTGAAGAATGG PB1 Bm-PB1b-1220: (SEQ ID NO: 16) Bm-PB1b-2369R: (SEQ ID NO: 17) [1B] TATTCGTCTCGGCATCTTTGTCGCCTGGGATGATGATG ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACACGAGCCTT PB2 Bm-PB2b-1: (SEQ ID NO: 18) Bm-PB2b-1145R: (SEQ ID NO: 19) [2A] TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCGGAGCGTTTTCAAGATG TATTCGTCTCTCTCATTTTGCTCTTTTTTAATATTCCCC PB2 Bm-PB2b-1142: (SEQ ID NO: 20) Bm-PB2b-2396R: (SEQ ID NO: 21) [2B] TATTCGTCTCATGAGAATCGAAAAACTACTAATAAATTCAGC ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACACGAGCATT PA Bm-Pab-1: (SEQ ID NO: 22) Bm-PAb-1261R: (SEQ ID NO: 23) [3A] TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCGGTGCGTTTGA TATTCGTCTCCCAGGGCCCTTTTACTTGTCAGAGTGC PA Bm-Pab-1283: (SEQ ID NO: 24) Bm-PAb-2308R: (SEQ ID NO: 25) [3B] TATTCGTCTCTCCTGGATCTACCAGAAATAGGGCCAGAC ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACACGTGCATT HA MDV-B 5’BsmBI-HA: (SEQ ID NO: 26) MDV-B 3’BsmBI-HA: (SEQ ID NO: 27)

TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCAGAGCATTTTCTAATATC ATATCGTCTCGTATTAGTAGTAACAAGAGCATTTTTC NP Ba-NPb-1: (SEQ ID NO: 28) Ba-NPb-1842R: (SEQ ID NO: 29) TATTGGTCTCAGGGAGCAGAAGCACAGCATTTTCTTGT ATATGGTCTCGTATTAGTAAACAACAGCATTTTT NA MDV-B 5’BsmBI-NA: (SEQ ID NO: 30) MDV-B 3’BsmBI-NA: (SEQ ID NO: 31) TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCAGAGCATCTTCTCAAAAC ATATCGTCTCGTATTAGTAGTAACAAGAGCATTTTTCAG M MDV-B 5’BsmBI-M: (SEQ ID NO: 32) MDV-B 3’BsmBI-M: (SEQ ID NO: 33) TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCACGCACTTTCTTAAAATG ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAACGCACTTTTTCCAG NS MDV-B 5’BsmBI-NS: (SEQ ID NO: 34) MDV-B 3’BsmBI-NS: (SEQ ID NO: 35) TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCAGAGGATTTGTTTAGTC ATATCGTCTCGTATTAGTAGTAACAAGAGGATTTTTAT

25 Las secuencias complementarias a las secuencias de influenza se muestran en negrita. Los extremos 5’ tienen secuencias de reconocimiento para las endonucleasas de restricción BsmBI (Bm) o BsaI (Ba). Clonación de plásmidos 30 Se aislaron fragmentos de PCR, se digirieron con BsmBI (o BsaI para NP) y se insertaron en pAD3000 (un derivado

de pHW2000 que permite la transcripción de ARNv de sentido negativo y ARNm positivo) en el sitio BsmBI tal como se describió anteriormente. Se secuenciaron de dos a cuatro de cada uno de los plásmidos resultantes y se compararon con la secuencia consenso de MDV-B basándose en la secuenciación de los fragmentos de RT-PCR directamente. Los plásmidos que tenían sustituciones de nucleótido que dieron como resultado cambios de

5 aminoácidos diferentes de la secuencia consenso se “repararon” o bien clonando los plásmidos o bien utilizando el kit Quikchange (Stratagene, La Jolla, CA). Los plásmidos de B/Ann Arbor/1/66 resultantes se designaron pAB121-PB1, pAB122-PB2, pAB123-PA, pAB124-HA, pAB125-NP, pAB126-NA, pAB127-M y pAB128-NS. Usando este sistema de transcripción bidireccional, se produjeron intracelularmente todos los ARN y las proteínas virales, dando como resultado la generación de virus influenza B infecciosos (figura 2).

10 Resulta significativo que pAB121-PB1 y pAB124-HA tenían 2 y pAB128-NS tenía 1 sustitución de nucleótido silenciosa en comparación con la secuencia consenso (tabla 2). Estos cambios de nucleótido no dieron como resultado alteraciones de aminoácidos y no se prevé que afecten al rescate y al crecimiento virales. Estas sustituciones silenciosas se han conservado para facilitar el genotipado de los virus recombinantes.

15 Tabla 2. Conjunto de plásmidos que representan los ocho segmentos de B/Ann Arbor/1/66 (MDV-B).

Seg. plásmidos nucleótidos proteína

PB1 PAB121-PB1 A924>G924; C1701>T1701 silenciosa PB2 PAB122-PB2 consenso ---PA PAB123-PA consenso ---HA PAB124-HA T150>C150;T153>C153 silenciosa NP PAB125-NP consenso ---NA PAB126-NA consenso ---M PAB127-M consenso ---NS PAB128-NS A416>G416 NS1: silenciosa

Para la construcción de los plásmidos con sustitución de nucleótidos en los genes de PA, NP y M1, se usaron los

20 plásmidos pAB123-PA, pAB125-NP, pAB127-M como moldes. Se cambiaron los nucleótidos mediante el kit Quikchange (Stratagene, La Jolla, CA). Alternativamente, se amplificaron dos fragmentos mediante PCR usando cebadores que contenían las mutaciones deseadas, se digirieron con BsmBI y se insertaron en pAD3000-BsmBI en a una reacción de ligamiento de tres fragmentos. Se secuenciaron los plásmidos generados para garantizar que el ADNc no contenía mutaciones no deseadas.

25 Se determinó la secuencia del ADN de molde mediante el uso de rodamina o kits de reacción listos para secuenciación de ciclo de terminador de colorante rodamina con ADN polimerasa FS AmpliTaq® (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Inc, Foster City, CA). Se separaron las muestras mediante electroforesis y se analizaron en secuenciadores de ADN PE/ABI modelo 373, modelo 373 Stretch o modelo 377.

30 En un experimento separado, se amplificó ARN viral de influenza B/Yamanshi/166/98 y se clonó en pAD3000 tal como se describió anteriormente con respecto a la cepa MDV-B, con la excepción de que la amplificación se realizó durante 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 54ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 3 minutos. Se usaron cebadores idénticos para la amplificación de los segmentos de la cepa B/Yamanashi/166/98, con la sustitución de

35 los siguientes cebadores para la amplificación de los segmentos NP y NA: MDV-B 5’BsmBI-NP: TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCACAGCATTTTCTTGTG (SEQ ID NO: 36) y MDV-B 3’BsmBI-NP: ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAACAGCATTTTTTAC (SEQ ID NO: 37) y Bm-NAb-1: TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCAGAGCA (SEQ ID NO: 38) y Bm-NAb-1557R: ATATCGTCTCGTATTAGTAGTAACAAGAGCA TTTT (SEQ ID NO: 39), respectivamente. Los plásmidos de

40 B/Yamanashi/166/98 se designaron pAB251-PB1, pAB252-PB2, pAB253-PA, pAB254-HA, pAB255-NP, pAB256-NA, pAB257-M y pAB258-NS. Se identificaron tres diferencias de nucleótidos silenciosas en PA lo que facilitó el genotipado del virus B/Yamanashi/166/98 recombinante y reordenante.

EJEMPLO 3: GENERACIÓN DE VIRUS INFLUENZA B RECOMBINANTE INFECCIOSO E INFLUENZA

45 REORDENADO

Se produjeron virus influenza B recombinantes infecciosos mediante el cocultivo de células 293T o COS-7 (células de primate con alta eficacia de transfección y actividad múltiple) con células MDCK (permisivas para virus influenza). Las células 293T se mantuvieron en medio OptiMEM I-AB que contenía FBS al 5%. Las células COS-7 se 50 mantuvieron en medio DMEM I-AB que contenía FBS al 10%. Las células MDCK se mantuvieron en 1x MEM, FBS al 10% con la adición de agentes antibióticos y antimicóticos. Antes de la transfección con los vectores genómicos virales, se lavaron las células una vez con 5 ml de PBS o medio sin FBS. Se añadieron diez ml de tripsina-EDTA a

células confluentes en un frasco de 75 cm2 (las células MDCK se incubaron durante 20-45 min, las células 293T se incubaron durante 1 min). Se centrifugaron las células y se resuspendieron en 10 ml de OptiMEM I-AB. Entonces se diluyó un ml de cada línea celular suspendida en 18 ml de OptiMEM I-AB, y se mezclaron. Entonces se añadieron alícuotas de las células a una placa de 6 pocillos a 3 ml/pocillo. Tras 6-24 horas, se mezcló 1 µg de cada plásmido 5 en un tubo Eppendorf de 1,5 ml con OptiMEM I-AB para los plásmidos (x µl de plásmidos + x µl de OptiMEM I-AB + x µl DE TransIT-LT1 = 200 µl); 2 µ de TransIT-LT1 por µg de ADN de plásmido. Se incubó la mezcla a temperatura ambiente durante 45 min. Entonces se añadieron 800 µl de OptiMEM I-AB. Se retiró el medio de las células y se añadió la mezcla de transfección a las células (t = 0) a 33ºC durante 6-15 horas. Se retiró lentamente la mezcla de transfección de las células y se añadió 1 ml de OptiMEM I-AB, y se incubaron las células a 33ºC durante 24 horas.

10 Cuarenta y ocho horas tras la transfección, se añadió 1 ml de OptiMEM I-AB que contenía TPCK-tripsina 1 µg/ml a las células. A las 96 horas tras la transfección, se añadió 1 ml de OptiMEM I-AB que contenía TPCK-tripsina 1 µg/ml a las células.

Entre 4 días y 7 días tras la transfección, se retiró 1 ml del sobrenadante de cultivo celular y se monitorizó mediante

15 ensayo de placas o HA. Brevemente, se añadió una alícuota de 1 ml de sobrenadante en un tubo Eppendorf y se centrifugó a 5000 rpm durante 5 min. Se transfirieron novecientos µl de sobrenadante a un tubo nuevo y se realizaron diluciones en serie a 500 µl/pocillo a células MDCK (por ejemplo, en placas de 12 pocillos). Se incubó el sobrenadante con las células durante 1 hora, luego se retiró y se sustituyó por medio de infección (1xMEM) que contenía 1 µg/ml de TPCK-tripsina. Entonces se realizó ensayo de HA o ensayo de placas. Por ejemplo, para el

20 ensayo de placas, se titularon los sobrenadantes en células MDCK que se incubaron con recubrimiento de agarosa al 0,8% durante tres días a 33ºC. Para la infección de huevos, se recogió el sobrenadante de células transfectadas seis o siete días tras la transfección, se inyectaron 100 µl de las diluciones de virus en Opti-MEM I en huevos de pollo embrionados de 11 días a 33ºC. Se determinó el título tres días tras la inoculación mediante el ensayo de TCID50 en células MDCK.

25 Para generar MDV-B, se transfectaron o bien células 293T-MDCK o bien COS-7-MDCK cocultivadas con 1 µg de cada plásmido. Cuando se examinaron a de 5 a 7 días tras la transfección, las células MDCK cocultivadas mostraron efectos citopáticos (CPE), indicando la generación de virus MDV-B infeccioso a partir de ADNc clonado. No se observó CPE en células transfectadas con siete plásmidos (tabla 3). Para determinar la eficacia del sistema de

30 transfección de ADN para la generación de virus, se titularon sobrenadantes de células siete días tras la transfección en células MDCK y se determinó el título de virus mediante ensayo de placas. El título de virus del sobrenadante de 293T-MDCK cocultivadas fue de 5,0 x 106 ufp/ml y 7,6 x 106 ufp/ml en células COS7-MDCK.

Tabla 3. Generación de virus influenza-B infeccioso a partir de ocho plásmidos. 35

segmento 1 2 3 4

PB1 pAB121-PB1 ---PAB121-PB1 ---PB2 pAB122-PB2 pAB122-PB2 PAB122-PB2 pAB122-PB2 PA pAB123-PA pAB123-PA pAB123-PA pAB123-PA HA pAB124-HA pAB124-HA pAB124-HA pAB124-HA NP pAB125-NP pAB125-NP pAB125-NP pAB125-NP NA pAB126-NA pAB126-NA pAB126-NA pAB126-NA M pAB127-M pAB127-M pAB127-M pAB127-M NS pAB128-NS pAB128-NS pAB128-NS pAB128-NS

Células 293T-MDCK cocultivadas, células COS-7-MDCK cocultivadas

CPE +-+

ufp/ml 5,0 x 106 0 7,6 x 106

Se transfectaron células 293T-MDCK cocultivadas (1, 2) o células COS7-MDCK cocultivadas (3, 4) de manera transitoria con siete u ocho plásmidos. Se monitorizó el efecto citopático (CPE) siete días tras la transfección en las células MDCK cocultivadas. Siete días tras la transfección, se titularon los sobrenadantes de las células

40 transfectadas en células MDCK. Los datos de ufp/ml representan el promedio de múltiples experimentos de transfección (por ejemplo, tres o cuatro).

Se obtuvieron resultados comparables en experimentos de transfección utilizando los vectores de plásmido de B/Yamanashi/166/98. Estos resultados muestran que el sistema de transfección permite la generación reproducible 45 de novo de virus influenza B a partir de ocho plásmidos.

Genotipado de influenza B recombinante

Tras un pase posterior en células MDCK, se usó RT-PCR del sobrenadante de células infectadas para confirmar la autenticidad del virus generado. Se realizó RT-PCR con cebadores específicos de segmento para los ocho

5 segmentos (tabla 1). Tal como se muestra en la figura 3A, se generaron productos de PCR para todos los segmentos. La secuenciación directa de los productos de PCR de los segmentos PB1, HA y NS reveló que los cuatro nucleótidos analizados eran los mismos que los encontrados en el plásmido pAB121-PB1, pAB124-HA y pAB128-NS. Estos resultados confirmaron que el virus generado se generó a partir de los plásmidos designados y excluyen (además de los controles negativos) cualquier posible contaminación de laboratorio con el virus original (figura 3B).

De manera similar, tras la transfección con los vectores de plásmido B/Yamanashi/166/98, se recuperó el virus y se amplificó la región que engloba los nucleótidos 1280-1290 del segmento PA. La secuenciación confirmó que el virus recuperado correspondía al recombinante derivado de plásmido B/Yamanashi/166/98 (figuras 3C y D).

15 Fenotipado de rMDV-B

El virus MDV-B muestra dos fenotipos característicos: sensibilidad a la temperatura (ts) y adaptación al frío (ca). Por definición, una diferencia de 2 log (o superior) en el título de virus a 37ºC en comparación con 33ºC define ts, ca se define por una diferencia inferior a 2 log en el crecimiento del virus a 25ºC en comparación con 33ºC. Se infectaron células primarias de riñón de pollo (PCK) con el virus MDV-B original y con el virus transfectado derivado de plásmidos para determinar el crecimiento viral a tres temperaturas.

Para el ensayo de placas, se usaron células MDCK confluentes (ECACC) en placas de seis pocillos. Se incubaron

25 diluciones de virus durante 30-60 min. a 33ºC. Se recubrieron las células con recubrimiento de agarosa al 0,8%. Se incubaron las células infectadas a 33ºC o 37ºC. Tres días tras la infección, se tiñeron las células con disolución de cristal violeta al 0,1% y se determinó el número de plaques.

Se realizó el ensayo de fenotipo ca-ts mediante titulación de TCID50 de las muestras de virus a 25, 33 y 37ºC. Este formato de ensayo mide el título de TCID50 examinando el efecto citopático (CPE) del virus influenza sobre monocapas de células primarias de riñón de pollo en placas de cultivo celular de 96 pocillos a diferentes temperaturas (25ºC, 33ºC, 37ºC). Este ensayo no depende de la morfología de la placa, que varía con la temperatura y las cepas de virus; en cambio, depende únicamente de la capacidad del virus influenza para replicarse y producir CPE. Se suspendió una suspensión de células primarias de riñón de pollo (PCK), preparada 35 mediante tripsinización del tejido primario, en medio MEM (de Earl) que contenía FCS al 5%. Se sembraron células PCK en placas de cultivo celular de 96 pocillos durante 48 horas con el fin de preparar una monocapa con una confluencia >90%. Tras 48 h, se lavó la monocapa de células PCK durante una hora con medio MEM libre de suero que contenía L-glutamina 5 mM, antibióticos, aminoácidos no esenciales, denominado medio de ensayo de fenotipo (PAM). Se prepararon diluciones en serie de diez veces de las muestras de virus en bloques de 96 pocillos que contenían PAM. Entonces se sembraron en placa las muestras de virus diluidas sobre la monocapa de PCK lavadas en las placas de 96 pocillos. En cada dilución de la muestra de virus, se usaron repeticiones de seis pocillos para la infección con el virus diluido. Se incluyeron células no infectadas como control de células como repeticiones de 6 pocillos para cada muestra. Se tituló cada muestra de virus muestra de virus en 2-4 repeticiones. Se incluyó en cada ensayo el virus control de fenotipo con títulos determinados previamente a 25ºC, 33ºC y 37ºC. Con el fin de

45 determinar el fenotipo ts de las muestras de virus, se incubaron las placas durante 6 días a 33ºC y 37ºC en incubadores de cultivo celular con un 5% de CO2. Para la caracterización del fenotipo ca, se incubaron las placas a 2ºC durante 10 días. Se calculó el título de virus mediante el método de Karber y se notificó como log10 título de TCID50 medio (n=4)/ml ± desviación estándar. Las deviaciones estándar de los títulos de virus presentadas en la figura 1-3 oscilaron entre 0,1 y 0,3. Se usó la diferencia en el título de virus a 33ºC y 37ºC para determinar el fenotipo ts y se usó la diferencia en el título a 25ºC y 33ºC del virus para determinar el fenotipo ca.

El virus MDV-B recombinante derivado de plásmido (rccMDV-B) expresó los dos fenotipos característicos en cultivo celular, ca y ts, tal como se esperaba. El fenotipo ca, replicación eficaz a 25ºC, se mide funcionalmente como un diferencial en el título entre 25ºC y 33ºC inferior o igual a 2 log10 cuando se sometió a ensayo en células PCK. Tanto

55 MDV-B original como rccMDV-B expresaron ca; la diferencia entre 25ºC y 33ºC fue de 0,3 y 0,4 log10, respectivamente (tabla 4). El fenotipo ts también se mide observando los títulos a dos temperaturas diferentes en células PCK; sin embargo, para este fenotipo el título a 37ºC debe ser inferior al título a 33ºC en 2 log10 o más. La diferencia entre 33ºC y 37ºC para MDV-B original y rccMDV-B fue de 3,4 y 3,7 log10, respectivamente (tabla 4). Por tanto, el virus MDB-B derivado de plásmido recombinante expresaba los fenotipos tanto ca como ts.

El virus recombinante tenía un título de 7,0 log10 TCID50/ml a 33ºC y 3,3 TCID50/ml a 37ºC y 8,8 log10 TCID50/ml a 25ºC (tabla 4). Por tanto, el virus recombinante derivado de la transfección con los ocho plásmidos de segmento genómico de influenza MDV-B tiene el fenotipo tanto ca como ts.

65 Tabla 4. Ensayo de fenotipo para MDV-B y rMDV-B generados a partir de plásmidos.

Temperatura (ºC) Fenotipo

Virus

25 33 37

Log10 TCID50/ml (media + DE)

B/Ann Arbor/01/66 ca (MDV-B) 8,8 + 0,3 8,5 + 0,05 5,1 + 0,1 ca, ts RecMDV-B 7,4 + 0,3 7,0 + 0,13 3,3 + 0,12 ca, ts Rec53-MDV-B 5,9+0,1 5,7 + 0,0 5,3 + 0,1 ca, no ts

Se infectaron células primarias de riñón de pollo con el virus MDV-B original y el virus recombinante derivado de plásmido (recMDV-B). Se determinó el título de virus a tres temperaturas diferentes.

EJEMPLO 7: PRODUCCIÓN DE VIRUS B/YAMANASHI/166/98 REORDENANTE

5 Se amplificaron los segmentos HA y NA de varias cepas diferentes que representan los principales linajes de influenza B y se clonaron en pAD3000, esencialmente tal como se describió anteriormente. Se optimizaron los cebadores para la amplificación simultánea por RT-PCR de los segmentos HA y NA. La comparación de las regiones terminales del ARNv que representa la región no codificante del segmento 4 (HA) y el segmento 6 (NB/NA) reveló

10 que los 20 nucleótidos terminales en el extremo 5’ y los 15 nucleótidos en el extremo 3’ eran idénticos entre los genes de HA y NA del virus influenza B. Se sintetizó un primer par de cebadores para RT-PCR (las secuencias en cursiva son específicas del virus influenza B) Bm-NAb-1: TAT TCG TCT CAG GGA GCA GAA GCA GAG CA (SEQ ID NO: 38); Bm-NAb-1557R: ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGT AAC AAG AGC ATT TT (SEQ ID NO: 39) y se usó para amplificar simultáneamente los genes de HA y NA de diversas cepas de influenza B (figura 6). Se aislaron los

15 fragmentos de PCR de HA y NA de B/Victoria/504/2000, B/Hawaii/10/2001 y B/Hong Kong/330/2001, se digirieron con BsmBI y se insertaron en pAD3000. Estos resultados demostraron la aplicabilidad de estos cebadores para la generación eficaz de plásmidos que contienen los genes de HA y NA de influenza B a partir de varios virus de tipo natural diferentes que representan los principales linajes de influenza B. Pueden usarse los productos de RT-PCR para secuenciar y/o clonar en los plásmidos de expresión.

20 Con el fin de demostrar la utilidad de B/Yamanashi/166/98 (un virus similar a B/Yamagata/16/88) para expresar eficazmente antígenos de diversos linajes de influenza B, se generaron reordenantes que contenían PB1, PB2, PA, NP, M, NS de B/Yamanashi/166/98 y HA y NA de cepas que representan los linajes tanto Victoria como Yamagata (reordenantes 6 +2). Se cotransfectaron células COS7-MDCK cocultivadas de manera transitoria con seis plásmidos

25 que representan B/Yamanashi/166/98 y dos plásmidos que contienen el ADNc de los segmentos HA y NA de dos cepas del linaje B/Victoria/2/87, B/Hong Kong/330/2001 y B/Hawaii/10/2001, y una cepa del linaje B/Yamagata/16/88, B/Victoria/504/2000, según los métodos descritos anteriormente. De seis a siete días tras la transfección, se titularon los sobrenadantes en células MDCK nuevas. Los tres virus reordenantes 6 + 2 tenían títulos de entre 4 -9 x 106 ufp/ml (tabla 5). Estos datos demostraron que los seis genes internos de

30 B/Yamanashi/166/98 podían formar eficazmente virus infeccioso con los segmentos génicos HA y NA de ambos linajes de influenza B.

Se titularon los sobrenadantes de células COS7-MDCK cocultivadas seis o siete días tras la transfección y se determinó el título viral mediante ensayos de placas en células MDCK.

35 Tabla 5: Conjunto de plásmidos usados para la generación de B/Yamanashi/166/98 y reordenantes 6 + 2.

segmento

1 ---pAB251-PB1 pAB251-PB1 pAB251-PB1 pAB251-PB1 2 pAB252-PB2 pAB252-PB2 pAB252-PB2 pAB252-PB2 pAB252-PB2 3 pAB253-PA pAB253-PA pAB253-PA pAB253-PA pAB253-PA 4 pAB254-HA pAB254-HA pAB281-HA pAB285-HA pAB287-HA 5 pAB255-NP pAB255-NP pAB255-NP pAB255-NP pAB255-NP 6 pAB256-NA pAB256-NA pAB291-NA pAB295-NA pAB297-NA 7 pAB257-M pAB257-M pAB257-M pAB257-M pAB257-M 8 pAB258-NA pAB258-NA pAB258-NA pAB258-NA pAB258-NA

Virusrecombinante 8 6+2 6+2 6+2

B/Yamanashi/ 166/98 B/Victoria/504/ 2000 B/Hawaii/10/2001 B/Hong Kong/330/2001

ufp/mla 0 4x106 9x106 6x106 7x106

Se obtuvieron títulos relativamente altos mediante la replicación de B/Yamanashi/166/98 de tipo natural en huevos. Se realizaron experimentos para determinar si esta propiedad era un fenotipo inherente de los seis genes “internos” de este virus. Para evaluar esta propiedad, se comparó el rendimiento de B/Victoria/504/2000 de tipo natural, que se 5 replicaba sólo moderadamente en huevos, con el rendimiento del reordenante 6 + 2 que expresaba HA y NA de B/Victoria/504/2000. Se inocularon cada uno de estos virus, además de B/Yamanashi/166/9R tipo natural y recombinante, en 3 ó 4 huevos de pollo embrionados, a o bien 100 o bien 1000 ufp. Tres días tras la infección, se recogieron los líquidos alantoideos de los huevos y se determinaron los títulos de TCID50 en células MDCK. Los reordenantes 6 + 2 produjeron cantidades similares de virus en el líquido alantoideo con respecto a la cepa

10 B/Yamanashi/166/98 de tipo natural y recombinante (figura 7). La diferencia en el título entre B/Victoria/504/2000 y el recombinante 6 + 2 fue de aproximadamente 1,6 log10 TCID50 (0,7-2,5 log10 TCID50/ml, IC del 95%). Se confirmó la diferencia entre B/Victoria/504/2000 y el recombinante 6 + 2 en tres experimentos separados (P <0,001). Estos resultados demostraron que podían conferirse las propiedades de crecimiento en huevos de B/Yamanashi/166/98 a antígenos de HA y NA que normalmente se expresan a partir de cepas que se replican escasamente en huevos.

15 EJEMPLO 8: BASE MOLECULAR PARA LA ATENUACIÓN DE B/ANN ARBOR/1/66 CA

El virus MDV-B (B/Ann Arbor/1/66 ca) se atenúa en seres humanos, muestra un fenotipo atenuado en hurones y muestra un fenotipo adaptado al frío y sensible a la temperatura en cultivo celular. Se compararon las secuencias de 20 aminoácidos deducidas de los genes internos de MDV-B con secuencias en la base datos de influenza Los Alamos (de la web en: flu.lanl.gov) usando el algoritmo de búsqueda BLAST. Se identificaron ocho aminoácidos únicos para MDV-B y no presentes en ninguna otra cepa (tabla 6). Los segmentos genómicos que codifican para PB1, BM2, NS1 y NS2 no muestran residuos sustituidos únicos. Las proteínas PA y M1 tienen cada una dos, y la proteína NP tiene cuatro aminoácidos sustituidos únicos (tabla 6). Se encuentra un aminoácido sustituido en PB2 en la posición 630

25 (una cepa adicional B/Harbin/7/94 (AF170572) también tiene un residuo de arginina en la posición 630).

Estos resultados sugirieron que los segmentos génicos PB2, PA, NP y M1 pueden estar implicados en el fenotipo atenuado de MDV-B. De una manera análoga a la descrita anteriormente para MDV-A, puede utilizarse el sistema de ocho plásmidos para generar recombinantes y reordenantes (individuales y/o dobles, es decir, reordenantes 7:1;

30 6:2) de manera independiente auxiliar simplemente mediante la cotransfección de los plásmidos relevantes en células en cultivo tal como se describió anteriormente con respecto a MDV-A. Por ejemplo, los 6 genes internos de B/Lcc/40 pueden usarse conjuntamente con los segmentos HA y NA derivados de MDV-B para genera reordenantes 6 + 2.

35 Tabla 6. Aminoácidos sustituidos únicos de B/Ann Arbor/1/66

N.º B/Ann Arbor/1/66 ca Secuencias alineadas (virus de tipo natural) Número de secuencias alineadas

pos. aminoácido codón aminoácido codón PB10--23 PB2 1 630 Arg630 AGA Scr630 AGC 23 PA 2 431 Mct431 ATG Val431 GTG 23

497 His497 CAT Tyr497 TAT

NP 4 55 Ala55 GCC Thr55 ACC 26 114 Ala114 GCG Val114 GTG 410 His410 CAT Pro410 CCT, CCC 509 Thr509 GAC Ala509 GGC

M1 2 159 Gln159 CAA His159 CAT 24

183 Val183 GTG M183 ATG BM2 0--24 NS1 0--80 NS2 0--80

Se usó la secuencia de aminoácidos deducida de ocho proteínas de B/Ann Arbor ca en una búsqueda en BLAST. Se muestra la posición del aminoácido que era diferente entre MDV-B y las secuencias alineadas. Los nucleótidos en los codones que están subrayados representan las posiciones sustituidas.

Con el fin de determinar si las 8 diferencias de aminoácidos únicos tenían algún efecto sobre los fenotipos

característicos de MDV-B, se construyó un virus recombinante en el que las ocho posiciones de nucleótido codifican para el aminoácido que refleja el complemento genético de influenza de tipo natural. Se construyeron un conjunto de plásmidos en los que se cambiaron los ocho residuos de los genes de PA, NP y M1 mediante mutagénesis dirigida al sitio para reflejar los aminoácidos de tipo natural (tal como se indica en la tabla 6). Se generó un recombinante

5 con los ocho cambios, designado rcc53-MDV-B, mediante cotransfección de los plásmidos construidos en células COS7-MDCK cocultivadas. El cocultivo de células MDCK y el crecimiento a 33ºC garantizó que el sobrenadante contenía altos títulos de virus de seis a siete días tras la transfección. Se titularon los sobrenadantes de las células transfectadas y se determinó el título en células MDCK mediante ensayo de placas y células PCK a 33ºC y 37ºC.

Tal como se muestra en la figura 8, en dos experimentos independientes diferentes, rccMDV-B expresó el fenotipo ts tanto en células MDCK como en células PCK. El virus reordenante triple rcc53-MDV-B designado que alberga los ocho cambios de aminoácidos expresó el fenotipo no ts, la diferencia en el título entre 33ºC y 37ºC fue sólo de 0,7 log10 en células PCK. Este título era inferior a la diferencia de 2 log10 requerida característica de la definición de ts y

era significativamente inferior a la diferencia de ∼3 log10 observada con rccMDV-B. Estos resultados muestran que la

15 alteración de los ocho aminoácidos dentro de las proteínas PA, NP y M1 era suficiente para generar un virus de tipo natural, no ts, con glicoproteínas tanto homólogas como heterólogas.

Entonces se determinó la contribución de cada segmento génico al fenotipo ts. Se generaron recombinantes derivados de plásmido que albergaban el segmento génico o bien PA, NP o bien M con el complemento de aminoácido de tipo natural mediante la técnica de cotransfección de ADN. Todos los recombinantes de genes individuales mostraron restricción del crecimiento a 37ºC en células MDCK y en células PCK (figura 9), lo que indica que cambios en segmentos génicos no individuales podían revertir el fenotipo ts. Además, los virus recombinantes que portaban los segmentos génicos tanto NP como M o tanto PA como M juntos también conservaban el fenotipo ts. En contraposición, los virus recombinantes que albergaban los segmentos génicos tanto PA como NP tenían una

25 diferencia en el título entre 37ºC y 33ºC de 2,0 log10 o menos, similar a rcc53-MDV-B. Estos resultados muestran que los genes de NP y PA tienen una contribución principal al fenotipo ts.

Para determinar si los cuatro aminoácidos en la proteína NP y dos en la proteína PA contribuyen a no ts, se generaron recombinantes de genes dobles y genes triples con genes de NP y PA alterados (figura 10). La sustitución de dos aminoácidos en la proteína NP, A114 → V114 y H410 → P410 dio como resultado un fenotipo no ts. Los virus con sustitución individual H410 → P410 en la nucleoproteína mostraron fenotipo no ts en MDCK y PCK. Por otra parte, la sustitución individual A55 → T55 mostró un fenotipo ts, como lo hizo la sustitución individual en la posición 509. Estos resultados indican que los residuos de aminoácido V114 y P410 en NP están implicados en el crecimiento eficaz a 37ºC (figura 11A). Se empleó una estrategia similar para diseccionar la contribución de los dos

35 aminoácidos en el gen de PA. Se construyeron un conjunto de recombinantes, que albergaban cada uno un segmento génico de NP con cuatro aminoácidos consenso de tipo natural y un gen de PA con sólo uno de los dos aminoácidos consenso de tipo natural. La sustitución de H497 → Y497 siguió siendo ts (figura 11B), lo que demuestra que este locus tenía poco efecto sobre la expresión del fenotipo. En contraposición, la sustitución de M431 por V431 dio como resultado la reversión del fenotipo ts. Estos resultados muestran que los aminoácidos A114 y H410 en NP y M431 en PA son los determinantes principales para la sensibilidad a la temperatura de MDV-B.

Basándose en la evidencia anterior, un fenotipo ts y un fenotipo atenuado están altamente correlacionados. Está bien establecido que el virus B/Ann Arbor/1/66 ca no es detectable en tejido pulmonar de hurones infectados, mientras que los virus influenza B atenuados son detectables en pulmones tras la infección intranasal. Para

45 determinar si una mutación idéntica subyace a los fenotipos ts y att, se realizaron los siguientes estudios.

Se realizaron pases de virus recombinantes obtenidos tras la transfección en huevos de pollo embrionados para producir una reserva de virus. Se inocularon hurones de nueve semanas de edad por vía intranasal con 0,5 ml por orificio nasal de virus con títulos de 5,5, 6,0 ó 7,0 log10 ufp/ml. Tres días tras la infección, se sacrificaron los hurones y se examinaron sus pulmones y cornetes tal como se describió anteriormente.

Se infectaron hurones (cuatro animales en cada grupo) por vía intranasal con recMDV-B o rec53-MDV-B. Tres días tras la infección con el virus se recogieron los cornetes nasales y tejido pulmonar y se sometió a prueba la existencia del virus. No se detectó virus en los tejidos pulmonares de hurones infectados con 7,0 log10 ufp de recMDV-B. De los

55 cuatro animales infectados con virus rec53-MDV-B con 7,0 log10 ufp, en tres animales se detectó virus en el tejido pulmonar (un animal en este grupo por motivos desconocidos). En dos de cuatro tejidos pulmonares de hurones infectados con rec53-MDV-B a una dosis inferior (5,5 log ufp/ml) pudo aislare virus del tejido pulmonar. Por tanto, el cambio de los ocho aminoácidos únicos en la proteína PA, NP y M1 a residuos de tipo natural fue suficiente para convertir un fenotipo att en un fenotipo no att.

Puesto que los datos en cultivo celular mostraron que PA y NP son los principales elementos de contribución al fenotipo ts, en un segundo experimento, se infectaron hurones con rec53-MDV-B (PA, NP, M), rec62-MDV-B (PA),

NP rec71-MDV-B (NP) con 6 log ufp. Dos de cuatro animales infectados con rec53-MDV-B tenían virus en el pulmón. Ninguno de los tejidos pulmonares de hurones infectados con virus reordenantes individuales y dobles tenía niveles detectables de virus. Por tanto, además de los aminoácidos en las proteínas PA y NP, la proteína M1 es importante para el fenotipo att. Los virus con PA y NP de tipo natural no se replicaron en el pulmón de hurón lo que indica que

5 un subconjunto de las mutaciones implicadas en la atenuación están implicadas en el fenotipo ts.

Por tanto, los fenotipos ts y att de B/Ann Arbor/1/66 están determinados por tres genes como máximo. La conversión de ocho aminoácidos en la proteína PA, NP y M1 en residuos de tipo natural dio como resultado un virus recombinante que se replicaba eficazmente a 37ºC. De manera similar, un virus recombinante 6 + 2 que

10 representaba los seis genes internos de MDV-B con los segmentos HA y NA de B/HongKong/330/01 mostró un fenotipo ts y el recombinante triple era no ts.

Los resultados usando la estructura principal de MDV-B indicaron que eran suficientes seis aminoácidos para convertir una fenotipo ts/att en un fenotipo no ts/no att. Por tanto, hubo interés en determinar si la introducción de

15 estos seis residuos de “atenuación” transferiría estas propiedades biológicas a un virus influenza B no atenuado, de tipo natural, heterólogo, tal como B/Yamanashi/166/98.

Se produjeron B/Yamanashi/166/98 (rccYam) (7) de tipo natural recombinante y un virus recombinante (rec6-Yam): con seis cambios de aminoácidos en PA (V431→M431, H497→Y497), NP (V114→A114, P410→H410) y M1 20 (H159→Q159, M183→V183). RecYam mostró una reducción de título de 0,17 log10 en el título a 37ºC en comparación con 33ºC, mientras que rec6Yam era claramente ts, la diferencia en el título viral entre 37ºC y 33ºC era 4,6 log10. Se recuperó eficazmente el virus de hurones infectados con recYam, tal como se esperaba para un virus influenza B de tipo natural típico. Cuando se inoculó rec6Yam en hurones, no se detectó virus en los tejidos pulmonares (tabla 7). Por tanto, la transferencia de los loci de ts/att de MDV-B es suficiente para transferir los

25 fenotipos ts y at a un virus divergente.

Tabla 7. Estudios de atenuación en hurones

Virus recombinante

Componentes de tipo naturala Fenotipo ts Hurones Dosis [log10 ufp] Cornetes nasalesb [log10 ufp/g] Tejido pulmonar [log10 EID50/g]c

rMDV-B

ninguno ts 4 6,0 4,01 <1,5

rec53-B

NP, PA, M No ts 4 6,0 4,65 3,81

rec62-B

NP, PA No ts 4 6,0 4,69 <1,5

rec71NP-B

NP ts 4 6,0 4,13 <1,5

rec71M-B

M ts 4 6,0 4,17 <1,5

RecYam

No ts 4 6,0 4,92 3,31

rec6Yam

ts 4 6,0 4,02 <1,5

a Se usaron virus recombinantes con estructura principal de MDV-B que diferían en los aminoácidos de tipo natural

30 para infectar hurones por vía intranasal. RecYam es B/Yamanashi/166/98 recombinante y Rec6Yam representa un virus que tiene seis cambios de aminoácidos de “atenuación de MDV-B” en NP, PA y M1 con una estructura principal de B/Yamanashi.b Tres días tras la infección se determinó el título de virus de los cornetes nasales y el tejido pulmonar, se muestra el título promedio de cuatro hurones infectados.

35 c <1,5 indica que no se detectó virus.

Por consiguiente, las variantes modificadas artificialmente por ingeniería genética de virus de la cepa influenza B que tienen una o más de estas sustituciones de aminoácido presentan los fenotipos ts y att y son adecuadas para su uso, por ejemplo, como virus de cepa donadora maestra, en la producción de vacunas con virus influenza vivo

40 atenuado.

EJEMPLO 9: DETERMINACIÓN DE LOS LOCI QUE CONTROLAN EL FENOTIPO ADAPTADO AL FRÍO DEL VIRUS INFLUENZA B/ANN ARBOR/1/66

45 B/Ann Arbor/1/66 adaptado al frío (ca) es el virus donador maestro (MDV-B) para las vacunas Flumist® con virus influenza B atenuado vivo. Las vacunas con influenza B 6:2 que portan los seis genes internos derivados de B/Ann Arbor/1/66 ca y las glicoproteínas de superficie HA y NA de las cepas de tipo natural circulantes se caracterizan por los fenotipos adaptado al frío (ca), sensible a la temperatura (ts) y atenuado (att). El análisis de la secuencia reveló que MDV-B contiene nueve aminoácidos en las proteínas PB2, PA, NP y M1 que no se encuentran en cepas de tipo

50 natural de influenza B. Se determinó que tres aminoácidos en PA (M431V) y NP (A114V, H410P) determinaban el fenotipo ts y, además de estos tres loci de ts, dos aminoácidos en M1 (Q159H, V183M) conferían el fenotipo att.

Para entender la base molecular del fenotipo ca, se usó el sistema de genética inversa basado en plásmidos para evaluar la contribución de estos nueve aminoácidos específicos de MDV-B al fenotipo ca. MDV-B recombinante se replicó eficazmente a 25ºC y 33ºC en células de riñón embrionario de pollo (CEK). En contraposición, B/Ann Arbor/1/66 de tipo natural recombinante, que contenía los nueve aminoácidos de tipo natural, se replicó ineficazmente a 25ºC. Se determinó que se requería un total de cinco aminoácidos de tipo natural, uno en PB2 (R630S), uno en PA (M431V) y tres en NP (A114V, H410P, T509A), para revertir completamente el fenotipo ca de MDV-B. Además, la sustitución de dos aminoácidos en la proteína M1 (Q159H, V183M) de MDV-B o en las cepas de vacuna 6:2 por los aminoácidos de tipo natural aumentó significativamente la replicación del virus a 33ºC pero no a 25ºC en células CEK; el cambio V 183M tuvo un efecto mayor sobre el cambio.

EJEMPLO 10: RESCATE DE INFLUENZA DE OCHO PLÁSMIDOS MEDIANTE ELECTROPORACIÓN DE

CÉLULAS VERO

El virus influenza recombinante también puede rescatarse de células Vero usando electroporación. Estos métodos

15 son adecuados para la producción de los virus de la cepa tanto influenza A como influenza B, y permiten la recuperación de, por ejemplo, virus adaptados al frío, sensibles a la temperatura, atenuados a partir de células Vero hechas crecer en condiciones libres de suero que facilitan la preparación de una vacuna atenuada viva adecuada para su administración en, por ejemplo, formulaciones de vacuna intranasales. Además de su amplia aplicabilidad en todas las cepas de virus, la electroporación no requiere reactivos adicionales distintos al medio de crecimiento para el sustrato celular y por tanto tiene menos posibilidad de contaminantes no deseados. En particular, este método es eficaz para generar virus recombinantes y reordenantes usando células Vero adaptadas al crecimiento en condiciones libres de suero, tal como aislados de células Vero calificados como libres de patógenos y adecuados para la producción de vacunas. Esta característica apoya la elección de la electroporación como método apropiado para la introducción comercial de ADN en sustratos celulares.

25 Se comparó la electroporación con una variedad de métodos para la introducción de ADN en células Vero, incluyendo transfección usando numerosos reactivos basados en lípidos, precipitación con fosfato de calcio y microinyección de células. Aunque se obtuvo algún éxito usando reactivos basados en lípidos para el rescate de influenza A, sólo la electroporación demostró que rescataba influenza B así como influenza A de células Vero.

Un día antes de la electroporación, se dividieron células Vero confluentes al 90 -100% y se sembraron a una densidad de 9 x 106 células por frasco T225 en MEM complementado con pen./estrep., L-glutamina, aminoácidos no esenciales y FBS al 10% (MEM, FBS al 10%). Al día siguiente, se sometieron a tripsinización las células y se resuspendieron en 50 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) por frasco T225. Entonces se

35 sedimentaron las células y se resuspendieron en 0,5 ml de OptiMEM I por frasco T225. Opcionalmente, puede emplearse medio OptiMEM adaptado que no contiene componentes derivados de seres humanos ni de animales. Tras la determinación de la densidad celular, por ejemplo, mediante el recuento de una dilución 1:40 en un hemocitómetro, se añadieron 5 x 106 células a una cubeta de electroporación de 0,4 cm en un volumen final de 400 µl de OptiMEM I. Entonces se añadieron veinte µg de ADN que consistía en una mezcla equimolar de ocho plásmidos que incorporaban el genoma de o bien MDV-A o bien MDV-B en un volumen de no más de 25 µl a las células en la cubeta. Se mezclaron las células suavemente mediante ligeros golpes y se sometieron a electroporación a 300 voltios, 950 microfaradios en un BioRad Gene Pulser II con Capacitance Extender Plus conectado (BioRad, Hercules, CA). La constante de tiempo debe estar en el intervalo de 28 -33 ms.

45 Se mezcló el contenido de la cubeta suavemente mediante ligeros golpes y 1-2 min tras la electroporación se añadieron 0,7 ml de MEM, FBS al 10% con una pipeta de 1 ml. Entonces se mezclaron suavemente de nuevo las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo algunas veces y luego se dividieron entre dos pocillos de una placa de 6 pocillos que contenía 2 ml por pocillo de MEM, FBS al 10%. Entonces se lavó la cubeta con 1 ml de MEM, FBS al 10% y se dividió el contenido entre los dos pocillos para un volumen final de aproximadamente 3,5 ml por pocillo.

En experimentos alternativos, se sometieron a electroporación células Vero adaptadas a condiciones de crecimiento libres de suero, por ejemplo, en OptiPro (SFM) (Invitrogen, Carlsbad, CA) tal como se describió anteriormente excepto que tras la electroporación en OptiMEM I, se diluyeron las células en OptiPro (SFM) en el que se cultivaron posteriormente para el rescate de virus.

55 Entonces se hicieron crecer las células sometidas a electroporación en condiciones apropiadas para la replicación y la recuperación del virus introducido, es decir, a 33ºC para las cepas donadoras maestras adaptadas al frío. Al día siguiente (por ejemplo, aproximadamente 19 horas tras la electroporación), se retiró el medio y se lavaron las células con 3 ml por pocillo de OptiMEM I u OptiPro (SFM). Se añadió un ml por pocillo de OptiMEM I u OptiPro (SFM) que contenía pen./estrep. a cada pocillo y se recogieron los sobrenadantes diariamente sustituyendo los medios. Se almacenaron los sobrenadantes a -80ºC en SPG. Normalmente se observó la producción de virus pico entre 2 y 3 días tras la electroporación.

Tabla 8: Resultados de rescate de 8 plásmidos de cepas de MDV en diferentes tipos celulares y mediante diferentes 65 métodos de transfección

Sustrato

Método N.º de prueba Resultado (Virus infeccioso recuperado)

MDV-B

COS-7/MDCK

Lipo 3 positivo

COS-7/MDCK

CaPO4 2 positivo

MRC-5

Lipo 5 negativo

MRC-5

CaPO4 3 negativo

MRC-5

Electroporación 2 negativo

WI-38

Lipo 2 negativo

WI-38

Electroporación 4 negativo

WI-38

Microinyección 1 negativo

LF1043

Lipo 1 negativo

LF1043

CaPO4 2 negativo

Vero

Lipo 7 negativo

Vero

CaPO4 2 negativo

Vero/MDCK

Lipo 1 negativo

Vero (suero)

Electroporación 5 positivo (5/5)

Vero (libre de suero)

Electroporación 4 positivo (4/4)

Vero (suero) Vero (libre de suero)

Electroporación Electroporación MDV-A 3 3 positivo (3/3) positivo (3/3)

EJEMPLO 11: EL CRECIMIENTO DE VIRUS INFLUENZA B EN HUEVOS DA COMO RESULTADO LA PÉRDIDA DEL SITIO DE GLICOSILACIÓN EN 196/197 DE HA

5 La mayoría de los aislados clínicos de virus influenza B contienen un posible sitio de glicosilación unido a N de HA. Este sitio de glicosilación unido a N de HA está presente en torno a los residuos de aminoácido 196-199 para las cepas B/Yamagata y los residuos de aminoácido 197-199 para las cepas B/Victoria. Las cepas B/Victoria circulantes recientemente, tales como B/Malaysia/2506/04 y B/Ohio/1/05, y las cepas B/Yamagata circulantes recientemente, tales como B/Florida/7/04, contienen este posible sitio de glicosilación unido a N de HA.

10 Para determinar si el sitio de glicosilación de HA de estas cepas se conserva tras el pase en huevos, se hizo crecer cada cepa en huevos y se realizó la secuenciación de nucleótidos para determinar la secuencia de aminoácidos del polipéptido HA codificado. Las cepas de virus descritas usadas en este estudio se obtuvieron de los Centers for Disease Control and Prevention (CDC, Atlanta, GA). Se usó el virus para inocular huevos de pollo embrionados

15 obtenidos de Charles River SPAFAS (Franklin, CT, North) que se habían fertilizado 10-11 días antes de la inoculación del virus. Se incubaron los huevos inoculados a 33ºC. Se amplificaron los ARN virales de HA a partir de los virus en los huevos inoculados mediante RT-PCR, y luego se secuenciaron.

La secuencia de aminoácidos del polipéptido HA de las cepas de influenza B B/Ohio/1/05, B/Malaysia/2506/04 y

20 B/Florida/7/04 cambió en todos los casos en el sitio de glicosilación unido a N tras el pase en huevos. La secuencia en el sitio de glicosilación de B/Ohio/1/05 cambió de NET a SET. La secuencia en el sitio de glicosilación de B/Malaysia/2506/04 cambió de NET a NEA o SET. La secuencia en el sitio de glicosilación de B/Florida/7/04 cambió de NKT a NKP, DKT o IKT. Véase la tabla 9, a continuación.

25 Tabla 9: Secuencias del sitio de glicosilación en 196/197 de HA de influenza B antes y después del pase en huevos

Aminoácido 196-198 (197-199)

Virus

Aislado clínico* Aislado en huevos Clones de ADNc

B/Ohio/1/05 NET SET SET

B/Malaysia/2506/04 NET XaEX NEA

SET

NKP

B/Florida/7/04 NKT XKX DKT

IKT

* secuencias de HA de aislado clínico proporcionado por el Dr. M. Shaw de los CDC. a X indica secuencias mixtas

Se examinó la secuencia de aminoácidos en el sitio de glicosilación de HA de otras diversas cepas de virus influenza

5 B. Véase la figura 12, que proporciona una parte de la secuencia de aminoácidos de HA para seis B/Victoria y ocho B/Yamagata tras el pase en huevos. El posible sitio de glicosilación unido a N (N-X-T/S) está subrayado en la figura. Se observó que ninguna de las catorce cepas de virus influenza B examinadas conserva su posible sitio de glicosilación unido a N N-X-T/S tras el pase en huevos.

10 EJEMPLO 12: LA PÉRDIDA DEL SITIO DE GLICOSILACIÓN EN 196/197 DE HA REDUCE LA ANTIGENICIDAD DEL VIRUS INFLUENZA B

Se examinó a continuación el efecto del sitio de glicosilación en 196-197 de HA sobre la antigenicidad de las cepas de influenza B B/Ohio/1/05, B/Malaysia/2506/04 y B/Florida/7/04. Para comparar la antigenicidad de los virus 15 glicosilados frente a los no glicosilados, se produjo un par de virus que corresponden a cada una de las cepas de influenza B B/Ohio/1/05, B/Malaysia/2506/04 y B/Florida/7/04 usando genética inversa (véase el ejemplo 3). Los dos miembros de cada par eran idénticos excepto porque el primer miembro contenía un polipéptido HA con una secuencia de aminoácidos de tipo natural, es decir, una secuencia de aminoácidos de HA que contenía el sitio de glicosilación unido a N presente en la cepa obtenida del CDC, y el segundo miembro contenía un polipéptido HA que

20 carecía del sitio de glicosilación unido a N, es decir, una secuencia de aminoácidos de HA obtenida del virus tras pase en huevos.

Seis de los plásmidos usados en la técnica de genética inversa proporcionaron secuencias de nucleótidos que correspondían a los segmentos genómicos internos de B/Ann Arbor/1/66 ca (MDV-B). Un séptimo plásmido 25 proporcionó una secuencia de nucleótidos que correspondía al segmento genómico que codifica para el polipéptido de NA de tipo natural a partir de cada virus de tipo natural, por ejemplo, cada miembro del par de virus B/Ohio/1/05 se produjo usando la secuencia de polinucleótido de NA de tipo natural de la cepa B/Ohio/1/05. Un octavo plásmido proporcionó una secuencia de nucleótidos que correspondía a un segmento genómico que codifica para un polipéptido HA. El polipéptido HA era HA o bien de tipo natural o bien sometido a pase en huevo, dependiendo de si

30 el virus influenza era el primer o segundo miembro del par de virus.

Se obtuvieron las secuencias de polinucleótido de NA y HA de los virus de tipo natural mediante amplificación por RT-PCR del ARN de NA o HA de los virus de tipo natural, y clonación de los ADNc amplificados entre los dos sitios BsmBI de pAD3000. Se prepararon plásmidos que contenían secuencias de nucleótidos correspondientes a los

35 segmentos genómicos que codifican para los polipéptidos HA sometidos a pase en huevos sometiendo los plásmidos que contenían los segmentos de HA de tipo natural a mutagénesis dirigida al sitio usando un kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange® (Stratagene, La Jolla, CA).

Se transfectaron los plásmidos en células MDCK y 293 cocultivadas. Todos los virus rescatados se replicaron

40 eficazmente en células MDCK con títulos de 6-7 log10 UFP/ml. Siete días tras la transfección, se recogieron los sobrenadantes de las células transfectadas y se titularon mediante ensayo de placas. El análisis de la secuencia de los virus recuperados confirmaron que se conservaba la secuencia de aminoácidos de HA de tipo natural o sometida a pases en huevos, según el plásmido de HA usado para producir el virus durante la transfección.

45 Se examinó la antigenicidad de cada par de virus mediante ensayo de HAI usando sueros de hurón tras la infección. Se recogieron los sueros de los hurones 21 días tras la inoculación intranasal con 6-7 log10 UFP de virus. Se evaluaron los niveles de anticuerpos en suero de hurón frente a los diversos virus mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HAI). Se realizó el ensayo de HAI añadiendo 25 µl de muestras de suero diluidas en serie con 4 unidades de HA de virus influenza (en un volumen de 25 µl) en microplacas de 96 pocillos con fondo en V.

50 Tras 30 min de incubación, se añadieron 50 µl de eritrocitos de pavo al 0,5% para medir la hemaglutinación. Se expresó el título de HAI como la dilución de suero más alta que inhibe la hemaglutinación del virus. La tabla 10 proporciona la antigenicidad de los virus de tipo natural (glicosilación+ de HA)/sometidos a pases en huevos (glicosilación-de HA) apareados.

55 Tabla 10: Antigenicidad de variantes del sitio de glicosilación en 196/197 de HA en hurones

Media geométrica del título de HAI de suero de hurón

Virus Aminoácido 196-198 (197-199)

tras la infección frente a

Glicosilado (G-) No glicosilado (G+)

B/Ohio/1/05 SET (G-) 101,6 16,0 NET (G+) 64,0 64,0

B/Malaysia/2506/04 NEA (G-) 64,0 32,0 NET (G+) 25,4 50,8

B/Florida/7/04 DKT (G-) 161,3 28,5 NKT (G+) 35,9 80,6

Los sueros generados contra virus glicosilados en HA tenían títulos de HAI superiores contra virus glicosilados en HA que virus no glicosilados en HA apareados, y los sueros generados contra virus no glicosilados en HA tenían títulos de HAI superiores contra virus no glicosilados en HA apareados. Las diferencias antigénicas entre cada virus

5 glicosilado en HA/no glicosilado en HA apareado en el ensayo de HAI variaban desde 1,5-4,5 veces. Esta varianza indicó que el sitio de glicosilación en 196/197 afectaba a la antigenicidad del virus.

EJEMPLO 13: LOS VIRUS INFLUENZA B QUE TENÍAN EL SITIO DE GLICOSILACIÓN EN 196/197 DE HA NO PODÍAN REPLICARSE EN HUEVOS

10 Para determinar si cada miembro de las cepas de influenza apareadas del ejemplo 12 podía replicarse en huevos, se inocularos huevos embrionados con 102 UFP/huevo o 104-105 UFP/huevo de virus y se incubaron a 33ºC durante tres días. Entonces se determinaron los títulos pico de virus mediante ensayo de placas en células MDCK. En la tabla 11 se muestra la replicación de los virus apareados en huevos (título de virus) y la secuencia en los residuos

15 de aminoácido 196-199 de HA para cada uno de los virus.

Tabla 11. Replicación de variantes de glicosilación en 196/197 de HA apareadas en huevos

Título de virus Aminoácido 196-199 (197-200)

Virus Aminoácido 196-198 (197-199)

(log10 UFP/ml) tras crecimiento en huevos

B/Ohio/1/05 SET (G-) 8,7a SETQ NET (G+) 2,1a NDd 8,8b SETQ

B/Malaysia/2506/04 NEA (G-) 8,7a NEAQ N ET (G+) 1,7a ND 7,3b SETQ NENQ

B/Florida/7/04 DKT (G-) 8,2a DKTQ

NKT (G+) 3,0a NKTQ

6,7b NKIQ

NKTP

a,b Se inocularon los huevos con 102 UFP/huevo (a) o 104-105 UFP/huevo (b) de los virus reordenantes 6:2 indicados.

20 c Se determinó la secuencia de HA del virus recuperado de huevos y se indican los cambios en la secuencia de aminoácidos mediante subrayado. d ND: No determinado.

Para cada par de virus, el virus miembro que carece del sitio de glicosilación creció bien en huevos, hasta títulos

25 mayores de 8,0 log10 UFP/ml. Sin embargo, el virus miembro que contiene el sitio de glicosilación (NXT) no se replicó bien en huevos inoculados con 102 UFP de virus. Véase la tabla 11, que indica que los virus glicosilados en HA B/Ohio/1/05, B/Malaysia/2506/04 y B/Florida/7/04 crecieron hasta títulos de virus de sólo 2,1 log10 UFP/ml, 1,7 log10 UFP/ml y 3,0 log10 UFP/ml, respectivamente. La replicación de los virus miembros glicosilados en HA se hizo detectable cuando se inocularon los huevos con cantidades superiores de virus, 10a-105 UFP/huevo. El análisis de la

30 secuencia de estos virus en replicación reveló que se había introducido una sustitución de aminoácido en el sitio de glicosilación en 196/197. Véase la tabla 11, que indica que la secuencia de glicosilación de tipo natural de B/Ohio/1/05 cambió de NET a SET, la secuencia de glicosilación de tipo natural de B/Malaysia/2506/04 cambió de NET a SET o NEN y que la secuencia de glicosilación de tipo natural de B/Florida/7/04 cambió de NKT a NKI o se sustituyó una glutamina por prolina de manera inmediatamente C-terminal a la secuencia de glicosilación NXT.

35 Estudios previos (Bause, Biochem J. 209 (1983):331-336; Gavel y Von Heijne, Protein Eng. 3 (1990):433-442) han

mostrado que una prolina adyacente de manera C-terminal al sitio de glicosilación NXT de HA impide la glicosilación unida a N. Por tanto, parece que la falta de glicosilación en 196/197 de HA era necesaria para que los virus influenza B se replicasen bien en huevos.

5 EJEMPLO 14: IDENTIFICACIÓN DE UNA CEPA DE INFLUENZA B CON GLICOSILACIÓN+ EN HA QUE PUEDE REPLICARSE EN HUEVOS

Para determinar si cualquier cepa de influenza B que contiene el sitio de glicosilación en 196/197 podía replicarse en huevos, se inocularon huevos con diversas cepas de virus influenza B de tipo natural. Entonces se determinó la

10 secuencia de HA de los virus en replicación. La mayoría de los virus influenza B que podían replicarse en huevos no contenían el sitio de glicosilación NXT en los residuos 197-199 (o 196-198). Si los virus sometidos a pases en huevos contenían el sitio de glicosilación NXT estaban en el proceso de perderlo; la secuencia NXT era una de una población de secuencias en los residuos 197-199/196-198 de la proteína HA.

15 Se identificó que dos cepas de virus, B/Jilin/20/03 (B/JL) y B/Jiangsu/10/03 (B/JS), tenían la secuencia de glicosilación NXT, NKT, tras el pase en huevos. B/JL tenía una prolina en la posición 199, de manera inmediatamente C-terminal al sitio de glicosilación en 196-198. Tal como se comentó anteriormente, la prolina inmediatamente C-terminal a los residuos del sitio de glicosilación interfiere probablemente con e impide la glicosilación en 196/197. Para examinar más estrechamente la replicación de B/JL y B/JS en huevos, se prepararon

20 cepas de virus influenza B apareadas, que carecían de y contenían la secuencia de sitio de glicosilación NXT para cada uno de B/JL, B/JS y la cepa de influenza B relacionada B/Shanghai/361/02 (B/SH) mediante genética inversa tal como se describe en el ejemplo 12. Entonces se determinó la replicación de estos virus apareados en células MDCK y huevos. Véase la tabla 12.

25 Tabla 12: B/Jiangsu/10/03 mantenía el sitio de glicosilación en 196-197 en huevos

Títulos de virus (log10 UFP/ml) Aminoácido 196-199

Virus a Aminoácido 196-199

tras crecimiento en huevosc

MDCK Huevo B/JS/10/03 DKTQ (G-) 6,5 7,3 a DKTQ NKTQ (G+) 7,4 8,4 a NKTQ

B/SH/361/02 DKTQ (G-) 7,3 8,7 a DKTQ NKTQ (G+) 6,9 3,9 a NKTQ 6,2 b SKTQ DKTQ

B/JL/20/03 NKTP (G-) 6,4 7,6 a NKTP

NKTQ (G+) 7,5 3,0 a NKTQ

6,8 b NKSQ

a.b Se infectaron células MDCK con el virus indicado a una moi de 0,004 y se inocularon los huevos con 102 UFP/huevo (a) o 104-105 UFP/huevo (b) de los virus reordenantes 6:2 indicados amplificados en células MDCK que o bien tenían (G+) o bien no tenían (G-) el sitio de glicosilación de HA en 196/197 y se incubaron a 33ºC durante tres

30 días. Se determinaron los títulos pico de virus mediante ensayo de placas en células MDCK. c Se determinó la secuencia de HA del virus recuperado de huevos y se indican los cambios en la secuencia de aminoácidos mediante subrayado.

Los tres conjuntos de virus apareados se replicaban bien en células MDCK, con títulos que oscilaban entre 6,4 y 7,5

35 log10 UFP/ml. Sin embargo, no todos los virus se replicaban bien en huevos. Los huevos inoculados con 102 log10 UFP de cualquiera de los virus B/SH o B/JL glicosilados en 196/197 de HA (secuencia de glicosilación NKTQ) no se replicaban bien. La elevación de la dosis de inoculación de los virus glicosilados en HA B/SH o B/JL hasta 104 -105 log10 UFP dio como resultado replicación de virus detectable. La secuenciación de estos virus en replicación reveló la pérdida del sitio de glicosilación (de NKT a SKT o DKT en B/SH y e NKT a NKS en B/JL). A diferencia de los virus

40 B/SH y B/JL, el virus B/JS podía replicarse bien en huevos en presencia o ausencia del sitio de glicosilación, títulos de 7,3 y 8,4 log10 UFP, respectivamente.

La inmunotransferencia de tipo Western con un anticuerpo específico para HA confirmó el estado de glicosilación de cada uno de los virus hechos crecer en células MDCK y en huevos. Se realizó la inmunotransferencia de tipo 45 Western mezclando virus de sobrenadantes de cultivo celular de MDCK o líquido alantoideo con 2x tampón de lisis de proteínas (Invitrogen) y sometiendo a electroforesis en un gel de SDS-PAGE al 10%. Se transfirieron las proteínas sometidas a electroforesis en el gel a una membrana de nitrocelulosa y se sometieron a inmunotransferencia de tipo Western usando antisuero de pollo anti-influenza B. Se detectó el complejo proteína

anticuerpo mediante un kit de detección de quimioluminiscencia (GE Healthcare Bio-Sciences) tras la incubación con anticuerpos anti-pollo conjugados con HRP.

El análisis de inmunotransferencia de tipo Western mostró que cuando se replicaban en células MDCK, los virus con

5 glicosilación+ en HA conservaban su sitio de glicosilación y por tanto migraban más lentamente sobre el gel que sus virus de glicosilación-en HA homólogos apareados. Véanse, por ejemplo, los carriles 1 y 2 de la figura 13a, que muestran una banda que reacciona de manera cruzada con el antisuero de HA del virus con glicosilación+ en HA (carril 1) que migra más lentamente que la banda en el carril con el virus que tiene la glicosilación-en HA (carril 2). Se obtuvieron resultados similares para los virus tanto B/SH (figura 13a, carriles 3 y 4) como B/JL (figura 13a,

10 carriles 5 y 6).

Cuando se replicaron en huevos, sólo un virus, el virus B/JS, conservaba el patrón de migración en el que la banda para el virus con glicosilación+ en HA (figura 13b, carril 3) migraba más lentamente que la banda para el virus con glicosilación-en HA (figura 13b, carril 4). Este patrón sugería que el virus B/JS era el único virus sometido a prueba

15 que podía replicarse en huevos y conservar el sitio de glicosilación de HA.

EJEMPLO 15: ARGININA EN LA POSICIÓN DE RESIDUO DE AMINOÁCIDO 141 DE HA ESTABILIZA EL SITIO DE

GLICOSILACIÓN EN 196-197

20 La revisión de la tabla 12 reveló que aunque las cepas de influenza tanto B/JS como B/JL tenían la secuencia de aminoácidos NKTQ en los residuos de aminoácido de HA 196-199, sólo B/JS podía replicarse bien en huevos y conservar el sitio de glicosilación NKTQ. La comparación de la secuencia de aminoácidos de HA de los virus B/JS y B/JL identificó tres residuos de aminoácido diferentes. Entre estos tres residuos, 141R y 237E eran únicos para B/JS (en relación con otros virus influenza B). En las posiciones de residuo de aminoácido 141 y 237, la mayoría de las

25 cepas de influenza B contienen glicina. Para someter a prueba si uno o ambos de los residuos de aminoácido 141R y/o 237E contribuían a la estabilización del sitio de glicosilación en 196 de HA de B/JS, se mutagenizó HA de B/JS para cambiar 141R y/o 237E a glicina. Entonces se determinó la replicación de los diversos virus B/JS en huevos.

Tal como se muestra en la tabla 13, cuando el residuo 141 de HA de B/JS se cambió de R a G, el virus no podía

30 replicarse en huevos inoculados a una dosis de 102 UFP. El aumento de la dosis hasta 104-105 UFP permitió que el virus se replicase en huevos. Se secuenció el virus B/JS en replicación que tenía el residuo 141G de HA para determinar si se conservaba el sitio de glicosilación en 196/197. La secuenciación reveló que el sitio de glicosilación NKT se había perdido y sustituido con o bien DKT o bien NKTP. Este hallazgo indicó que el residuo de arginina 141 de HA de B/JS puede estar estabilizando el sitio de glicosilación de HA en 196/197. La sustitución de un glutamato

35 por glicina en el residuo de aminoácido 237 de HA de B/JS no afectó al crecimiento en huevos. Datos no mostrados.

Tabla 13: 141R de HA estabiliza el sitio de glicosilación en 196/197 durante el pase en huevos

Aminoácido en Títulos de virus

Aminoácido 196-199 (197-200)

Virus la posición indicada (log10 UFP/ml)

tras crecimiento en huevos c

141 196-198 (197-199) MDCK Huevo

B/JS/10/03 R NKT 7,4 8,4 a NKTQ G NKT 7,0 2,4 a NKTQ 8,5 b DKTQ NKTP

B/SH/361/02 R NKT 7,6 8,0 a NKTQ

B/Ohio/1/05 R NET 7,6 7,9 a NETQ

a.b Se infectaron células MDCK con el virus indicado a una moi de 0,004 y se inocularon los huevos con 102

40 UFP/huevo (a) o 104-105 UFP/huevo (b) de los virus reordenantes 6:2 indicados amplificados en células MDCK que o bien tenían (G+) o bien no tenían (G-) el sitio de glicosilación de HA en 196/197 y se incubaron a 33ºC durante tres días. Se determinaron los títulos pico de virus mediante ensayo de placas en células MDCK. c Se determinó la secuencia de HA del virus recuperado de huevos y se indican los cambios en la secuencia de aminoácidos mediante subrayado.

45 Para confirmar adicionalmente que el residuo 141R de HA era suficiente para estabilizar el sitio de glicosilación en 196/197 de HA de influenza B durante la replicación en huevos, se introdujo una sustitución de aminoácido de glicina for arginina en 141 de HA de B/SH y B/Ohio/1/05. Tal como se muestra en la tabla 13, los virus tanto B/SH como B/Ohio/1/05 que tenían la sustitución de glicina a arginina en la posición 141 de HA podían replicarse eficazmente en

50 huevos, títulos de aproximadamente 8,0 log10 UFP/ml. Los virus B/SH y B/Ohio/1/05 con la sustitución de 141R de HA también conservaban la glicosilación de HA durante la replicación en huevos. Véase la figura 14, que proporciona una inmunotransferencia de tipo Western que confirma la glicosilación de HA de virus B/SH (carril 2),

B/Ohio (carril 4) y B/JS (carril 6) sometidos a pases en huevos que tenían el residuo 141R de HA. Estos datos indicaron que el residuo 141 de HA desempeña un papel en la influencia del uso del sitio de glicosilación en 196/197 de HA de virus influenza B hechos crecer en huevos.

5 EJEMPLO 16: ARGININA EN EL RESIDUO 141 DE HA DE INFLUENZA B NO AFECTA A LA ANTIGENICIDAD DEL VIRUS

Se sometió a prueba el efecto de sustituir un residuo de arginina en la posición de aminoácido 141 de HA sobre la antigenicidad de las cepas de influenza B. Para determinar si el residuo 141R afecta a la antigenicidad del virus, se

10 generaron sueros de hurón frente a diferentes virus glicosilados y no glicosilados. Se sometieron a prueba los sueros de hurón para determinar la reactividad frente a virus que contenían diferentes modificaciones en los residuos 141 y 196/197.

Se prepararon sueros de hurón inoculando por vía intranasal en hurones 7,0 log10 UFP de virus derivados de huevos

15 con firmas genéticas de GD (no glicosilado) o RN (glicosilado) en los sitios 141 y 196/197, respectivamente. Se recogió el suero tras la infección de los hurones veintiún días después para las pruebas de antigenicidad en el ensayo de HAI.

Se prepararon virus B/SH/361/02, B/Ohio/1/05 y B/JS/10/03 que tenían cada uno las firmas genéticas de GD, RN o

20 GN en las posiciones de aminoácido 141 y 196/197 de HA, respectivamente, para someter a prueba la antigenicidad frente a sueros de hurón. Se prepararon estos virus a partir de células MDCK infectadas; el virus influenza con los residuos G141 y 196/197N no pudieron crecer en huevos.

En el ensayo de HAI, el suero de hurón generado contra B/SH/361/02 no glicosilado (GD) reaccionó bien con el virus

25 B/SH/361/02 no glicosilado, pero no el virus B/SH/361/02 glicosilado; el título de HAI del suero de hurón tras la infección era cuatro veces mayor para el virus no glicosilado en relación con el glicosilado. De manera similar, el suero de hurón generado contra el virus B/SH/361/02 glicosilado (RN) reaccionó bien con el virus B/SH/361/02 glicosilado, pero no con el virus B/SH/361/02 no glicosilado. De nuevo, la diferencia en el título de HAI del suero de hurón tras la infección era de cuatro veces. Estas diferencias de cuatro veces son indicativas de una diferencia

30 antigénica entre virus no glicosilados y glicosilados, también comentado en el ejemplo 12, tabla 10.

El suero de hurón generado contra B/SH/361/02 glicosilado (RN) reaccionó de manera similar contra los virus glicosilados RN y GN en el ensayo de HAI; 2 veces mayor contra el virus glicosilado RN en relación con el virus glicosilado GN. Esta ligera diferencia en la reactividad indicó que el cambio de residuo de aminoácido en la posición

35 141 de glicina a arginina no tenía un impacto significativo sobre la antigenicidad de B/SH/361/02. Se obtuvieron resultados similares cuando se realizaron el mismo conjunto de ensayos de HAI usando las cepas de virus de influenza B B/Ohio/1/05 y B/JS/10/03. Véase la tabla 14.

Tabla 14: Falta de efecto del aminoácido 141 sobre la antigenicidad de cepas de influenza B. 40

Media geométrica del título de HAI

Aminoácido en

de suero de hurón tras la infección

Virus 141 196/197 GD RN

B/SH/361/02 G D (G-) 203,2 40,3 R N (G+) 40,3 161,3 G N (G+) 40,3 80,6

B/Ohio/1/05 G S (G-) 101,6 32,0 R N (G+) 32,0 161,3 G N (G+) 25,4 80,6

B/JS/10/03 G D (G-) 256,0 16,0 R N (G+) 32,0 90,5 G N (G+) 128,0 128,0

Se sometió a prueba el suero de hurón para determinar los títulos de HAI contra virus derivados de MDCK usando glóbulos rojos de pollo. Se calculó la media geométrica de títulos de HAI a partir de tres sueros de hurón tras la infección. Los títulos de HAI homólogos están subrayados.

EJEMPLO 17: LA GLICOSILACIÓN EN 196/197 DE HA AFECTA A LA UNIÓN A ÁCIDOS SIÁLICOS UNIDOS EN α-2,3

Debido a que los virus influenza B en los que el sitio 196/197 de HA esta glicosilado crecían bien en células MDCK pero no en huevos, la glicosilación en 196/197 de HA puede afectar a la especificidad de unión a receptor del virus. Sia (α-2,3) Gal y Sia (α-2,6) Gal son los dos restos receptores principales distribuidos de manera diferencial en 5 diferentes células huésped. Las células MDCK expresan restos tanto Sia (α-2,3) Gal como Sia (α-2,6) Gal. Las células de membrana corioalantoidea de embrión de pollo expresan sólo restos Sia (α-2,3) Gal. La especificidad de unión a receptor del virus puede examinarse mediante el ensayo de hemaglutinación usando eritrocitos (RBC) de diferentes especies animales que expresan de manera diferencial restos Sia (α-2,3) y Sia (α-2,6) Gal. RBC de caballo expresan principalmente receptores Sia (α-2,3) Gal mientras que RBC de cobaya expresan principalmente

10 receptores Sia (α-2,6) Gal. RBC de pollo y pavo están enriquecidos en la expresión de restos tanto Sia (α-2,3) como Sia (α-2,6) Gal (Ito et al., Virol. 156 (1997):493-499).

Se sometieron a prueba virus B/Ohio/1/05 y B/Jiangsu/10/03 derivados de huevos que eran glicosilación+ (RN) o glicosilación-(GS, RS, GD o RD) para determinar sus títulos de HA usando RBC de caballo (hRBC), RBC de cobaya

15 (gpRBC) y RBC de pavo (tRBC). Independientemente del estado de glicosilación del virus influenza B, se unieron todos bien de manera similar a gpRBC y tRBC, que expresan ambos restos Sia (α-2,6) Gal. En contraposición, los virus glicosilación+ (RN) se unieron escasamente a niveles indetectables a hRBC, que expresan sólo restos Sia (α2,3), lo que sugiere que la glicosilación en HA 196/197 inhibió la unión del virus a receptores Sia (a-2,3) Gal: Véase la tabla 15.

20 Tabla 15: La glicosilación en 196/197 de HA inhibe la unión de HA a receptores que tienen ácido siálico unido en α2,3.

Título de hemaglutinación (HA) Aminoácido en Título de virus con los glóbulos rojos indicados

(log10 UFP/ml) Virus 141 196/197 hRBC gpRBC tRBC

B/Ohio/1/05 G S (G-) 8,9 128 128 128 R S (G-) 9,3 512 64 128 R N (G+) 8,1 <2 64 64

B/JS/10/03 G D (G-) 8,9 1024 128 256 R D (G-) 7,6 64 32 32 R N (G+) 8,6 4 128 256

25 La incapacidad de los virus glicosilados para unirse a células que expresan restos Sia (α-2,3), tales como células alantoideas de huevos de pollo embrionados, hace difícil hacer crecer cepas de vacunas contra la gripe B en huevos. La pérdida del sitio de glicosilación, que permite el crecimiento de cepas de influenza B en huevos, altera la antigenicidad de las cepas. La capacidad para conservar el sitio de glicosilación en 196/197 de HA de virus influenza B, al mismo tiempo que se mantiene el crecimiento en huevos y la antigenicidad del virus, ayudaría en la fabricación

30 de la vacuna. La introducción de una arginina en la posición de aminoácido 141 de HA de cepas de influenza B es un medio de lograr esto.

Aunque la invención precedente se ha descrito en algún detalle con fines de claridad y comprensión, estará claro para un experto en la técnica a partir de una lectura de esta descripción que pueden realizarse diversos cambios en 35 la forma y los detalles sin apartarse del auténtico alcance de la invención.

Lista de secuencias

<110> MedImmune, LLC Jin, Hong Chen, Zhongying 40

<120> VIRUS INFLUENZA B QUE TIENEN ALTERACIONES EN EL POLIPÉPTIDO HEMAGLUTININA

<130> FL210PCT3

45 <150> Documento US 60/944.600

<151>

<160> 39

50 <170> PatentIn versión 3.3

5

<210> 1 <211> 50 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador de oligonucleótido

10

<400> 1 aacaattgag atctcggtca cctcagacat gataagatac attgatgagt 50

15

<210> 2 <211> 50 <212> ADN <213> artificial

20

<220> <223> cebador de oligonucleótido <400> 2

tataactgca gactagtgat atccttgttt attgcagctt ataatggtta

50

25

<210> 3 <211> 2836 <212> ADN <213> artificial

30

<220> <223> vector de clonación

<400> 3

<210> 4

<211> 2369

<212> ADN

<213> Virus influenza B

<400> 4

<210> 5

<211> 2396

<212> ADN

<213> Virus influenza B

<400> 5

<210> 6

<211> 2308

<212> ADN

<213> Virus influenza B

<400> 6

<210> 7

<211> 1884

<212> ADN

<213> Virus influenza B

<400> 7

<210> 8

<211> 1842

<212> ADN

<213> Virus influenza B

<400> 8

<210> 9

<211> 1557

<212> ADN

<213> Virus influenza B

<400> 9

<210> 10

<211> 1190

<212> ADN

<213> Virus influenza B

<400> 10

<210> 11 15 <211> 1098

<212> ADN

<213> Virus influenza B

<400> 11

<210> 12

<211> 71

<212> PRT 10 <213> Virus influenza B

<400> 12

<210> 13

<211> 69 20 <212> PRT

<213> Virus influenza B

<400> 13

10

<210> 14 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador de oligonucleótido

15

<400> 14

tattcgtctc agggagcaga agcggagcct ttaagatg

38

20

<210> 15 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial

25

<220> <223> cebador de oligonucleótido

<400> 15

30 35

tattcgtctc gatgccgttc cttcttcatt gaagaatgg <210> 16 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador de oligonucleótido 39

40

<400> 16 tattcgtctc ggcatctttg tcgcctggga tgatgatg 38

45

<210> 17 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial

50

<220> <223> cebador de oligonucleótido <400> 17

atatcgtctc gtattagtag aaacacgagc ctt

33

5

<210> 18 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador de oligonucleótido

<400> 18

15

tattcgtctc agggagcaga agcggagcgt tttcaagatg <210> 19 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial 40

<220> <223> cebador de oligonucleótido

25

<400> 19 tattcgtctc tctcattttg ctctttttta atattcccc 39

<210> 20 <211> 42 <212> ADN <213> Artificial

35

<220> <223> cebador de oligonucleótido <400> 20

tattcgtctc atgagaatgg aaaaactact aataaattca gc

42

<210> 21 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial

45

<220> <223> cebador de oligonucleótido

<400> 21

atatcgtctc gtattagtag aaacacgagc att

33

55

<210> 22 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador de oligonucleótido

<400> 22

tattcgtctc agggagcaga agcggtgcgt ttga

34

65

<210> 23 <211> 37 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador de oligonucleótido 5

<400> 23

tattcgtctc ccagggccct tttacttgtc agagtgc 37

<210> 24

<211> 39

<212> ADN

<213> Artificial

15 <220>

<223> cebador de oligonucleótido

<400> 24

tattcgtctc tcctggatct accagaaata gggccagac 39

<210> 25

<211> 33

<212> ADN 25 <213> Artificial

<220>

<223> cebador de oligonucleótido

<400> 25

atatcgtctc gtattagtag aaacacgtgc att 33

<210> 26 35 <211> 41

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador de oligonucleótido

<400> 26

tattcgtctc agggagcaga agcagagcat tttctaatat c 41 45

<210> 27

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador de oligonucleótido

<400> 27 55 atatcgtctc gtattagtag taacaagagc atttttc 37

<210> 28

<211> 38

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador de oligonucleótido 65

<400> 28

tattggtctc agggagcaga agcacagcat tttcttgt 38

<210> 29 5 <211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador de oligonucleótido

<400> 29

atatggtctc gtattagtag aaacaacagc attttt 36 15

<210> 30

<211> 41

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador de oligonucleótido

<400> 30

25 tattcgtctc agggagcaga agcagagcat cttctcaaaa c 41

<210> 31

<211> 39

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador de oligonucleótido 35

<400> 31

atatcgtctc gtattagtag taacaagagc atttttcag 39

<210> 32

<211> 41

<212> ADN

<213> Artificial

45 <220>

<223> cebador de oligonucleótido

<400> 32

tattcgtctc agggagcaga agcacgcact ttcttaaaat g 41

<210> 33

<211> 40

<212> ADN 55 <213> Artificial

<220>

<223> cebador de oligonucleótido

<400> 33

atatcgtctc gtattagtag aaacaacgca ctttttccag 40

<210> 34 65 <211> 40

<212> ADN

<213> Artificial

5

<220> <223> cebador de oligonucleótido <400> 34

tattcgtctc agggagcaga agcagaggat ttgtttagtc

40

<210> 35 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial

15

<220> <223> cebador de oligonucleótido

<400> 35

atatcgtctc gtattagtag taacaagagg atttttat

38

25

<210> 36 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador de oligonucleótido

<400> 36

tattcgtctc agggagcaga agcacagcat tttcttgtg

39

35

<210> 37 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> cebador de oligonucleótido

<400> 37

45

atatcgtctc gtattagtag aaacaacagc attttttac <210> 38 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial 39

<220> <223> cebador de oligonucleótido

55

<400> 38 tattcgtctc agggagcaga agcagagca 29

<210> 39 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial

65

<220> <223> cebador de oligonucleótido <400> 39

atatcgtctc gtattagtag taacaagagc atttt 35

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método de preparación de un virus influenza B glicosilado en HA que tiene replicación aumentada en huevos que

   comprende: 5

   (a) introducir una mutación que da como resultado una sustitución de aminoácido en la posición 141 de HA de glicina a arginina en un genoma de virus influenza B que codifica para un polipéptido HA con un residuo de glicina en la posición 141; y

   10 (b) replicar el genoma de virus influenza mutado en condiciones mediante las cuales se produce el virus influenza B.
2. 2. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa de introducción se realiza mediante mutagénesis dirigida al sitio.

   15 3. Método de preparación de un virus influenza B glicosilado en HA que tiene replicación aumentada en huevos que comprende:

   (a) introducir una mutación en un vector de una pluralidad de vectores, en el que el vector comprende secuencias de nucleótidos que corresponden al segmento genómico que codifica para HA, y

   20 en el que la mutación da como resultado arginina en el residuo de aminoácido 141;

   (b) introducir en una población de células huésped una pluralidad de vectores, comprendiendo dichos vectores

   secuencias de nucleótidos que corresponden a: 25

   (i)

   al menos 6 segmentos genómicos internos de una primera cepa de influenza B; y

   (ii)

   uno o más segmentos genómicos que codifican para los polipéptidos HA y NA de al menos una segunda cepa de

   influenza B, en el que el polipéptido HA comprende una arginina en el residuo de aminoácido 141; 30

   (c)

   cultivar la población de células huésped a una temperatura que no supera los 35 grados; y

   (d)

   recuperar el virus influenza.

   35 4. Método según la reivindicación 3, en el que el primer virus influenza B tiene uno de los siguientes atributos: sensibilidad a la temperatura, atenuación o adaptación al frío; o en el que el primer virus influenza B comprende los residuos de aminoácido: PB2630 (630R); PA431 (431M); PA497 (497H); NP55 (55A); NP114 (114A); NP410 (410H); NP510 (510T); M1159 (159Q) y M1183 (183V).

   40 5. Método según la reivindicación 3, en el que el primer virus influenza B es la cepa B/Ann Arbor/1/66.

3. 6. Método según la reivindicación 3, en el que las células son una de células Vero, células Per.C6, células BHK, células PCK, células MDCK, células MDBK, células 293 o células COS.

   45 7. Método según la reivindicación 3, en el que los vectores son plásmidos.

4. 8. Método según la reivindicación 3, en el que el método es independiente del uso de un virus auxiliar.
5. 9. Método según la reivindicación 3, en el que la temperatura es de entre 30 y 35 grados o es de entre 32 y 35 50 grados.
6. 10. Método según la reivindicación 3, que comprende además replicar el virus influenza recuperado en huevos; en el que el virus influenza replicado en huevos conserva el sitio de glicosilación en la posición de residuo de aminoácido 196/197 de HA; y en el que el virus influenza se replica hasta al menos un título pico de 7,0 log10 UFP/ml en los

   55 huevos.