JP5303603B2 - インフルエンザウイルスの生産用多重プラスミドシステム - Google Patents
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Description
本願は米国仮特許出願第60/375,675号(出願日2002年4月26日);第60/394,983号(出願日2002年7月9日);第60/410,576号(出願日2002年9月12日);第60/419,802号(出願日2002年10月18日);第60/420,708号(出願日2002年10月23日);第60/457,699号(代理人整理番号26−000250US;出願日2003年3月24日)、及び代理人整理番号26−000260US(発明の名称「インフルエンザウイルスの生産用多重プラスミドシステム(Multi−Plasmid System for the Production of Influenza Virus)」,出願日2003年4月10日)の優先権を主張し、前記各出願の開示内容全体を全目的で本明細書に組込む。
図1はpAD3000プラスミドの模式図。
(詳細な説明)
定義
インフルエンザウイルス
発現ベクター
付加的発現エレメント
インフルエンザウイルスワクチン
弱毒、温度感受性及び低温適応インフルエンザウイルスワクチン
細胞培養
宿主細胞へのベクターの導入
ウイルスの回収
ワクチンの予防投与方法及び組成物
キット
ウイルス核酸及び蛋白質の操作
ウシ成長ホルモン(BGH)ポリアデニル化シグナルをサルウイルス40(SV40)に由来するポリアデニル化シグナルで置換するようにプラスミドpHW2000(Hoffmannら(2000)A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids Proc Natl Acad Sci USA 97:6108−6113)を改変した。
polyA.1 :AACAATTGAGATCTCGGTCACCTCAGACATGATAAGATACATTGATGAGT(配列番号1)
polyA.2:TATAACTGCAGACTAGTGATATCCTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTA(配列番号2)
を使用してSV40に由来する配列を増幅した。
低温適応A型インフルエンザウイルス株A/AA/6/60変異体は鼻腔投与インフルエンザAワクチンの生産用マスタードナーウイルスとして一般に使用されている。この株は本発明に関して典型的なマスタードナーウイルス(MDV)である。簡単にするために、この株A/AA/6/60変異体を本明細書ではMDV−Aと言う。RNeasyミニキット(Qiagen)を使用してMDV−AウイルスRNAを抽出し、表1に示すプライマーを使用してRT−PCRにより8個の対応するcDNAフラグメントを増幅した。
10%胎仔ウシ血清(FBS)を添加した変法イーグル培地(MEM)にMadin−Darbyイヌ腎(MDCK)細胞とヒトCOS7細胞を維持した。5%FBSを添加したOpti−MEM I(Life Technologies)にヒト胚性腎細胞(293T)を維持した。MDCK細胞とCOS7細胞又は293T細胞を6ウェルプレートで1:1の比で共培養し、これらの細胞を約80%のコンフルエンシーでトランスフェクションに使用した。293T細胞とCOS7細胞はトランスフェクション効率が高いが、インフルエンザウイルス複製には許容されない。MDCK細胞と共培養すると、組換えウイルスの効率的な複製を確保することができる。トランスフェクションに先立ち、血清添加培地を無血清培地(Opti−MEM I)に交換し、4〜6時間インキュベートした。TransIT−LT1(Mirus)を使用し、20μlのTransIT−LT1を160μlのOpti−MEMIで希釈して8種のプラスミドDNA(PB2,PB1,PA,NP,M,NS,HA及びNA)各1μgと混合して総容量200μlとすることによりプラスミドDNAトランスフェクションを実施した。DNA:トランスフェクション試薬混合物を室温で45分間インキュベートした後に800μlのOpti−MEMIを加えた。次にトランスフェクション混合物を共培養MDCK/293T又はMDCK/COS7細胞に加えた。トランスフェクト細胞を35℃又は33℃で6時間〜24時間、例えば一晩インキュベートし、トランスフェクション混合物を各ウェルで1mlのOpti−MEMに交換した。35℃又は33℃で24時間インキュベーション後に1μg/ml TPCK−トリプシンを添加した1mlのOpti−MEMIを各ウェルに加え、更に12時間インキュベートした。回収したウイルスを次にコンフルエントMDCK細胞で増幅するか又は発育鶏卵で直接増幅した。12ウェルプレート内のMDCK細胞にトランスフェクション混合物0.2mlを1時間室温で感染させた後、混合物を除去し、1μg/ml TPCK−トリプシンを添加した2mlのOpti−MEMIに交換した。細胞を35℃又は33℃で3〜4日間インキュベートした。増幅したウイルスをSPG安定剤の存在下に−80℃で保存するか又はプラーク精製し、MDCK細胞もしくは発育鶏卵で増幅した。
MDV−Aポリメラーゼ蛋白質の機能的発現
単一遺伝子リアソータント実験によるMDV−Aプラスミドの分析
MDV−A及び6:2リアソータントウイルスの回収
MDV−Aインフルエンザウイルスワクチン株は低温適応(ca),温度感受性(ts)及び弱毒(att)等のワクチン(例えば生弱毒ワクチン)の生産に関連する数種の表現型をもつ。MDV−A株と非tsビルレントwtA/AA/6/60株の配列比較の結果、これらの2種の株の間には最低17ntの差異があることが判明した(表6)。MDV−A配列における置換のいくつかはGeneBankデータベースで入手可能な全A型インフルエンザウイルスに比較してこの株にユニークであり、これらのアミノ酸置換の1個以上がatt,ca及びts表現型に機能的に関係することを示唆している。PB2821における単一アミノ酸置換はMDV−Aのts表現型の決定基として従来報告されていた唯一のヌクレオチド位置であった(Subbaraoら(1995)Addition of Temperature−Sensitive Missense Mutations into the PB2 Gene of Influenza A Transfectant Viruses Can Effect an Increase in Temperature Sensitivity and Attenuation and Permits the Rational Design of a Genetically Engineered Live Influenza A Virus Vaccine J.Virol.69:5969−5977)。
ウイルスts表現型への6個の内部遺伝子セグメントの関与
MDV−A ts表現型を決定した遺伝子座のマッピング
MDV−A及びリアソータントウイルスの宿主細胞制限
温度感受性、弱毒ウイルス株の構築
RNeasyキット(Qiagen,Valencia,CA)を使用して典型的インフルエンザBマスタードナー株(MDV−B)であるインフルエンザB/Ann Arbor/1/66の低温適応変異体(ca/Master Ann Arbor/1/66 P1 Aviron 10/2/97)に由来するウイルスRNAを感染発育鶏卵由来尿膜腔液100μlから抽出し、RNAをH2O 40μlに溶出させた。1ステップRT−PCRキット(Qiagen,Valencia,CA)を添付プロトコールに従って使用し、各反応に抽出RNA1μlを使用してゲノムセグメントのRT−PCRを実施した。RT反応は50分間50℃の後に15分間94℃で実施した。PCRは94℃1分、54℃1分、及び72℃3分を25サイクル実施した。BsmBI部位をもつセグメント特異的プライマーを使用してP遺伝子を増幅し、2個のフラグメントを作製した(表12)。
プラスミドのクローニング
ヘルパーフリーウイルス細胞培養システムでインフルエンザBを増殖させようとする際に遭遇する問題を解決するために、本発明は組換え及びリアソータントB株インフルエンザウイルスの生産用新規ベクターとプロトコールを提供する。インフルエンザBウイルスのレスキューに使用されるベクターシステムはインフルエンザAウイルスの作製に開発されたシステムに基づく(Hoffmannら(2000)A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids Proc Natl Acad Sci USA 97:6108−6113;Hoffmann & Webster(2000)Unidirectional RNA polymerase I−polymerase II transcription system for the generation of influenza A virus from eight plasmids J Gen Virol 81:2843−7)。293T細胞は5%FBS細胞を添加したOptiMEMI−AB培地に維持し、COS−7細胞は10%FBSを添加したDMEMI−A培地に維持して293T又はCOS−7細胞(トランスフェクション効率とpolI活性の高い霊長類細胞)をMDCK細胞(インフルエンザウイルスに許容可能)と共培養した。MDCK細胞は抗生物質と抗カビ剤を添加した1×MEM,10%FBSに維持した。ウイルスゲノムベクターのトランスフェクションに先立ち、細胞をPBS又はFBS非添加培地5mlで1回洗浄した。75cm2フラスコでコンフルエント細胞にトリプシン−EDTA10mlを加えた(MDCK細胞は20〜45分間インキュベートし、293T細胞は1分間インキュベートした)。細胞を遠心し、OptiMEMI−AB10mlに再懸濁した。次に各懸濁細胞株1mlをOptiMEMI−AB18mlで希釈し、混合した。次に細胞3ml/ウェルを6ウェルプレートに分注した。6〜24時間後に各プラスミド1μgを1.5mlエッペンドルフチューブでOptiMEMI−ABと混合した(xμlプラスミド+xμl OptiMEM I−AB+xμl TransIT−LT1=200μl;プラスミドDNAμg当たり2μl TransIT−LT1)。混合物を室温で45分間インキュベートした。次にOptiMEMI−AB800μlを加えた。培地を細胞から除去し、トランスフェクション混合物を細胞(t=0)に33℃で6〜15時間加えた。トランスフェクション混合物を細胞からゆっくりと除去し、OptiMEMI−AB1mlを加え、細胞を33℃で24時間インキュベートした。トランスフェクションから48時間後に1μg/mlTPCK−トリプシンを添加したOptiMEMI−AB1mlを細胞に加えた。トランスフェクションから96時間後に1μg/mlTPCK−トリプシンを添加したOptiMEMI−AB1mlを細胞に加えた。
組換えインフルエンザBのゲノタイピング
rMDV−Bのフェノタイピング
インフルエンザBの主要系統に相当する数種の異なる株のHA及びNAセグメントをほぼ上述のように増幅し、pAD3000にクローニングした。プライマーはHA及びNAセグメントの同時RT−PCR増幅に最適化させた。セグメント4(HA)とセグメント6(NB/NA)の非コーディング領域に相当するvRNAの末端領域を比較した結果、5’末端の20個の末端ヌクレオチドと3’末端の15ヌクレオチドがインフルエンザBウイルスのHA及びNA遺伝子間で一致していることが判明した。RT−PCR用プライマー対(下線配列はインフルエンザBウイルス特異的である)Bm−NAb−1:TAT TCG TCT CAG GGA GCA GAA GCA GAG CA(配列番号79);Bm−NAb−1557R:ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGT AAC AAG AGC ATT TT(配列番号80)を合成及び使用してHA及びNA遺伝子を種々のインフルエンザB株から同時に増幅した(図8)。B/Victoria/504/2000,B/Hawaii/10/2001,及びB/Hong Kong/330/2001のHA及びNA PCRフラグメントを単離し、BsmBIで消化し、pAD3000に挿入した。これらの結果、これらのプライマーはインフルエンザBの主要系統に相当する数種の異なる野生型ウイルスに由来するインフルエンザB HA及びNA遺伝子を含むプラスミドの効率的な作製に適用できることが立証された。RT−PCR産物はシーケンシング及び/又は発現プラスミドへのクローニングに使用することができる。
MDV−Bウイルス(ca B/Ann Arbor/1/66)はヒトで弱毒されており、フェレットで弱毒表現型を示し、細胞培養で低温適応及び温度感受性表現型を示す。BLAST検索アルゴリズムを使用してMDV−Bの内部遺伝子の推定アミノ酸配列をLos Alamosインフルエンザデータベース(ワールドワイドウェブ:flu.lanl.gov)の配列と比較した。他の株には存在しないMDV−Bにユニークな8個のアミノ酸が同定された(表17)。PB1,BM2,NS1,及びNS2をコードするゲノムセグメントはユニーク置換残基を示さない。PA及びM1蛋白質は各々2個、NP蛋白質は4個のユニーク置換アミノ酸をもつ(表17)。PB2には630位に1個の置換アミノ酸が存在する(付加株B/Harbin/7/94(AF170572)も630位にアルギニン残基をもつ)。
組換えインフルエンザAをVero細胞からレスキューできることは従来示唆されている(Fodorら(1999)Rescue of influenza A virus from recombinant DNA J.Virol.73:9679−82;Hoffmannら(2002)Eight−plasmid system for rapid generation of influenza virus vaccine Vaccine 20:3165−3170)。報告されている方法は脂質試薬を使用する必要があり、インフルエンザAの高度複製コンピテント実験室株の単一株(A/WSN/33及びA/PR/8/34)についてしか立証しておらず、ワクチン生産に適した生弱毒ウイルスの生産では適用が限られている。本発明はエレクトロポレーションを使用してVero細胞から組換えインフルエンザウイルスを回収するための新規方法を提供する。これらの方法はインフルエンザA及びインフルエンザB株両者のウイルスの生産に適しており、例えば鼻腔内ワクチン製剤で投与するのに適した生弱毒ワクチンの製造を容易にする無血清条件下で増殖させたVero細胞から例えば低温適応、温度感受性、弱毒ウイルスを回収することができる。エレクトロポレーションはウイルス株に広く適用できることに加え、細胞基質用増殖培地以外の付加的試薬を必要としないので望ましくない汚染の危険が少ない。特に、この方法は無血清条件下での増殖に適したVero細胞(例えば病原体フリーとみなされるワクチン生産に適切なVero細胞単離体)を使用して組換え及びリアソータントウイルスを作製するのに有効である。この特徴により、DNAを細胞基質に商業的に導入するのに適した方法としてエレクトロポレーションを選択することができる。
本発明のベクターは遺伝子送達システムとして遺伝子治療用にも使用することができる。このような用途には、組換えインフルエンザウイルス、例えば外来蛋白質を発現する組換えインフルエンザA又はBを作製することが望ましい。例えば、インフルエンザBウイルスのセグメント7はスプライスされないので、異種核酸配列の挿入に好都合な遺伝子エレメントとなる。mRNAはM1及びBM2蛋白質をコードする2個のオープンリーディングフレームをもつ2個のシストロンを含む。BM2又はM1のオープンリーディングフレームを目的異種核酸、例えば強化緑色蛍光蛋白質(EGFP)をコードする遺伝子で置換する。本発明のプラスミドベクターシステムを使用して、M1−EGFPのオープンリーディングフレームをコードするcDNAとBM2を2種の異なるプラスミドにクローニングする。オープンリーディングフレームは複製と転写に必要なシグナルを含むセグメント7の非コーディング領域の間に挿入する。あるいは、一方がM1 ORFを含み、他方がEGFP−BM2を含む2種のプラスミドを構築する。得られた9種のプラスミドのコトランスフェクションの結果、異種遺伝子配列を含む組換えインフルエンザBウイルスが作製される。同様に、インフルエンザAのNS1セグメントからEGFPを発現させることができる。
Claims (8)
- 感染性B型インフルエンザウイルスを細胞培養で生産するためのヘルパーウイルスフリー方法であって、
i)B型インフルエンザウイルスゲノムの核酸配列を含む複数のプラスミドベクターをVero細胞集団にエレクトロポレーションする段階と;
ii)Vero細胞集団をウイルス複製に許容可能な条件下で培養する段階と;
iii)複数の感染性B型インフルエンザウイルスを回収する段階
を含む前記方法。 - B型インフルエンザウイルスが弱毒、温度感受性及び低温適応から構成される群から選択される1種以上の表現型属性をもつ請求項1に記載の方法。
- (補正後)
B型インフルエンザウイルスが弱毒、温度感受性及び低温適応の表現型属性をもつ請求項2に記載の方法。 - B型インフルエンザウイルスが鼻腔内ワクチン製剤で投与するのに適している請求項1に記載の方法。
- Vero細胞を無血清培地で培養する段階を含む請求項1に記載の方法。
- ウイルス複製に許容可能な条件がVero細胞を35℃以下の温度で培養する段階を含む請求項1に記載の方法。
- ウイルス複製に許容可能な条件がVero細胞を33℃の温度で培養する段階を含む請求項1に記載の方法。
- 複数のプラスミドベクターが8個のプラスミドベクターである請求項1に記載の方法。
Applications Claiming Priority (14)
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