KR20070086344A - 탠덤 전사 유닛을 갖는 재조합 인플루엔자 벡터 - Google Patents

탠덤 전사 유닛을 갖는 재조합 인플루엔자 벡터 Download PDF

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influenza virus
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요시히로 가와오까
가브리엘 노이만
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위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션
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Abstract

본 발명은 예를 들어 헬퍼 바이러스의 부재하에서 PolI 및/또는 PolII 프로모터를 함유하는 탠덤 전사 카세트를 포함하는 벡터를 사용하여 인플루엔자 바이러스를 제조하는데 유용한 조성물을 제공한다.
PolI 프로모터, PolII 프로모터, 전사 카세트, 인플루엔자 바이러스, 플라스미드, 벡터

Description

탠덤 전사 유닛을 갖는 재조합 인플루엔자 벡터 {RECOMBINANT INFLUENZA VECTORS WITH TANDEM TRANSCRIPTION UNITS}
관련 출원의 상호-참조
본 출원은 2004년 11월 19일자로 출원된 미국 출원 제60/629,665호의 출원일의 이익을 청구하며, 그의 개시사항은 본원에 참고로 도입된다.
정부 권리의 진술
본 발명은 미국 정부의 승인으로 이루어졌다 (미 공중 보건국 알러지 및 감염성 질환 기구로부터, 승인번호 AI047446). 정부는 본 발명에 있어서 특정 권리를 가질 수 있다.
인플루엔자 전염병 및 광역유행병은 계속적으로 인간의 목숨을 빼앗고 세계 경제에 영향을 주고 있다. 미국에서만도, 연간 인플루엔자로 인해 어림잡아 50,000명이 사망하며 (문헌 [Thompson et al., 2003]), 세계적인 광역유행병은 수백만의 인플루엔자-관련 사망을 초래할 수 있다. 전통적인 예는 소위 "스페인 인플루엔자"이며, 이로 인해 1918년 내지 1919년에 세계적으로 어림잡아 4000만 내지 5000만 명의 사람들이 사망했다. 인플루엔자 바이러스에 의해 가해지는 위협은 조류 인플루엔자 바이러스의 인간 집단으로의 최근의 도입으로 추가로 상승되었다. 조류 인플루엔자 바이러스는 오랫동안 인간에게 직접 전파되지 않으며 치명적인 결과를 유발하지 않는 것으로 생각되었다. 하지만, 이러한 인식은 18명의 홍콩 거주자가 H5N1 아형의 완전 조류 인플루엔자 바이러스에 의해 감염되고 그 중 6명이 사망했던 1997년에 바뀌었다 (문헌 [Subbarao et al., 1998]; [Claas et al., 1998]). 다음 수 년에 걸쳐, 2005년 1월 26일 현재 54명의 감염된 개체 중 41명의 목숨을 빼앗았던 몇몇 아시아 국가에서의 고도 병원체성 H5N1 인플루엔자 바이러스의 진행성 발생을 비롯한, 직접적인 조류-대-인간 전염의 몇몇 다른 경우가 보고되었다 (문헌 [Peiris et al., 2004]; [Fouchier et al., 2004]; [Koopsman et al., 2004]). 높은 사망률과 인간-대-인간 전염의 가능성과 함께, 증가하는 수의 인간 H5N1 바이러스 감염은 상기 바이러스에 대한 백신의 개발을 필수적이게 한다.
미국에서는, 2가지 인플루엔자 백신이 인간 용도로 인가된다: 불활성화 백신 및 살아있는 약독화된 백신 바이러스. 인플루엔자 바이러스 백신의 생성은 재배열에 의존하며 (문헌 [Gerdil, 2003]), 이는 헤마글루티닌 (HA) 및 뉴라미니다제 (NA) 절편을 제공하는 순환성 야생형 균주 및 A/PR/8/34 (PR8) 바이러스 (달걀에서 고-성장 특성을 제공하는 약독화된 인간 바이러스) 또는 약독화된 표현형을 제공하는 살아있는 약독화된 바이러스로 세포를 공동감염시킬 것을 필요로 한다. 목적하는 "6+2" 재배열체 (즉, PR8 또는 살아있는 약독화된 바이러스의 유전적 배경에서 순환성 야생형 균주의 HA 및 NA 유전자 절편을 함유하는 것들)의 선택은 시간-소모적이며 번거롭다. 더욱이, 재배열 및 선택에 대한 필요, 뿐만 아니라 일부 재배열 바이러스가 높은 역가로 성장할 수 없음은 백신 제조를 지연시켰다.
인플루엔자 A 및 B 바이러스에 대해, 클로닝된 cDNA로부터 상기 바이러스의 생성을 가능하게 하는 매우 효과적인 역 유전학 시스템이 현재 자리잡고 있다 (문헌 [Neumann et al., 1999]; [Hoffmann et al., 2002]; [Fodor et al., 1999]; [Hoffmann et al., 2000]). 한 가지 시스템 (문헌 [Neumann et al., 1999])에서는, RNA 중합효소 I (PolI) 프로모터 및 종결자 서열의 제어하에 8개의 인플루엔자 바이러스 RNA 절편을 코딩하는 8개의 플라스미드를 3개의 바이러스 중합효소 서브유닛 및 핵단백질 NP의 발현용의 4개의 RNA 중합효소 II (PolII)-유래 플라스미드와 함께 진핵 세포 내로 형질감염시킨다; 상기 4개의 단백질은 바이러스 복제 및 전사를 개시하는데 필요하다. 바이러스 cDNA가 하나의 부위 상의 RNA 중합효소 I 프로모터 및 다른 부위 상의 RNA 중합효소 II 프로모터에 플랭킹되어, vRNA 및 mRNA가 동일한 주형으로부터 유래되도록 하는 8개의 플라스미드에 의존하는 대안적인 시스템이 또한 개발되었다 (문헌 [Hoffmann et al., 2000]). 상기 시스템은 6+2 재배열체가 재배열 및 스크리닝 절차에 대한 필요없이 유전자조작되도록 하였다.
제한된 수의 포유동물 세포주는 인플루엔자 바이러스 백신 생성에 이용가능하다. 이에는 마딘-다비(Madin-Darby) 개 신장 (MDCK) 세포 (문헌 [Brands et al., 1999]; [Palache et al., 1999]; [Halperin et al., 2002]) 및 아프리카 녹색 원숭이 신장 (베로(Vero)) 세포 ([Kistner et al., 1998]; [Kistner et al., 1999a]; [Kistner et al., 1999b]; [Bruhl et al., 2000])를 들 수 있다. 상기 세포주는 고효율로 형질감염될 수 없으며, 때때로 그의 용도는 인플루엔자 바이러스 백신 제조용 역 유전학 시스템에서 제한된다; 하지만, 베로 세포에서의 인플루엔자 바이러스의 생성이 입증되었다 (문헌 [Fodor et al., 1999]; [Nicolson et al., 2005]).
따라서, 인플루엔자 바이러스를 제조하는 개선된 방법이 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 하나 이상의 벡터, 예를 들어 플라스미드 또는 다른 것, 예를 들어 선형 핵산 전달 비히클 상에 (i) RNA 중합효소 I (PolI) 기재 전사 카세트, 및/또는 (ii) RNA 중합효소 II (PolII) 기재 전사 카세트, 및/또는 (iii) RNA PolI/II 기재 전사 카세트를 포함하는 탠덤(tandem) 전사 유닛 (전사 카세트)을 포함하는 단리된 벡터 (폴리뉴클레오티드)를 제공한다. 특히, 본 발명은 감염성 음성 가닥 절편화된 RNA 바이러스를 제조하는 조성물에 유용한 플라스미드를 제공하며, 조성물은 바이러스 생성용 바이러스 유전자를 함유하는 8개 미만의 플라스미드를 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 인플루엔자 바이러스 유전자를 갖는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 플라스미드를 포함할 수 있으며, 조성물은 일단 세포에 도입되면 감염성 인플루엔자 바이러스를 생성한다. 따라서, 일 실시양태에서, 바이러스 생성용 플라스미드의 수를 감소시키는 역 유전학 시스템을 제공하기 위해, 8개 이하의 각각의 인플루엔자 바이러스 RNA 합성용 RNA 중합효소 I 전사 카세트가 하나의 플라스미드 상에 결합되고, 3개 이하의 인플루엔자 바이러스 중합효소 서브유닛용의 전사 카세트가 하나의 플라스미드 상에 결합되었다. 하기 기재된 바와 같이, 이러한 접근법은 베로 세포에서 인플루엔자 A 바이러스의 효과적이고 활발한 생성 을 가능하게 하였다.
예를 들어, 본 발명은 하기 카세트 중 하나 이상과 같은 탠덤 전사 카세트를 포함하는 플라스미드와 같은 벡터를 포함한다: (i) RNA PolI 프로모터, 인플루엔자 바이러스 RNA에 대한 cDNA (음성- 또는 양성-센스 배향), 및 RNA PolI 종결자; (ii) RNA PolII 프로모터, 인플루엔자 바이러스 PB2, PB1, PA, 및/또는 NP 단백질에 대한 DNA, 및 아데닐중합 신호 (RNA PolII 전사 종결 서열), 및/또는 (iii) RNA PolII 프로모터, RNA PolI 전사 종결 서열, 인플루엔자 바이러스 RNA에 대한 cDNA (양성-센스 배향), RNA 중합효소 PolI 프로모터, 및 RNA PolII 전사 종결 서열. 효과적으로 형질감염될 수 있는 세포주에서, 상기 접근법은 형질감염된 세포로부터 유래된 상청액 mL 당 108 바이러스 이하를 생성하였다.
본원에 기재된 벡터 및/또는 전사 카세트의 조합물은 예를 들어 현재 순환성 바이러스로부터 유래된 HA 및 NA 유전자와 결합된 소위 "내재 유전자" (즉, PB2, PB1, PA, NP, M 및 NS)를 사용한, 살아있는 약독화된 인플루엔자 백신 바이러스의 생성에 유용하다. 예를 들어, H5N1 바이러스는 달걀에서 성장할 수 없으며, 따라서 상기 유전자를 함유하는 전사 카세트는 H5N1 백신 바이러스의 생성에 특히 유용하다. 일 실시양태에서, 전사 카세트 내의 HA는 A형 HA이다. 또다른 실시양태에서, 전사 카세트 내의 HA는 B형 HA이다. 또다른 실시양태에서, 인플루엔자 바이러스 C형으로부터의 유전자가 사용된다. 일 실시양태에서, RNA PolI 프로모터는 인간 RNA PolI 프로모터이다. 일 실시양태에서, NA cDNA는 NB 서열을 추가로 포함한 다. 일 실시양태에서, 조성물은 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 BM2 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트를 추가로 포함한다.
일 실시양태에서, 모든 8개의 인플루엔자 바이러스 생성용 RNA PolI 전사 카세트를 하나의 플라스미드 상에 결합시킴으로써, 바이러스는 5개의 플라스미드, 즉 모든 8개의 vRNA 합성용의 1개, 및 중합효소 단백질 및 NP 단백질 합성용의 4개로부터 생성될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 4개의 중합효소 단백질 및 NP 단백질 합성용 RNA PolII 전사 카세트를 하나의 플라스미드 상에 결합시킴으로써, 바이러스는 2개의 플라스미드, 즉 모든 8개의 vRNA 합성용의 1개, 및 중합효소 단백질 및 NP 단백질 합성용의 1개로부터 생성될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 하나의 플라스미드 상의 3개의 중합효소 단백질 합성용 RNA PolII 전사 카세트, 하나의 플라스미드 상의 1개의 NP 단백질용 RNA PolII 전사 카세트, 및 모든 8개의 vRNA 합성용 플라스미드를 결합시킴으로써, 바이러스는 3개의 플라스미드로부터 생성될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 4개의 HA, NA, M 및 NS vRNA의 생성용 RNA PolI 전사 카세트 및 4개의 PB2, PB1, PA 및 NP vRNA 및 mRNA의 생성용 RNA PolI/II 전사 카세트를 하나의 플라스미드 상에 결합시킴으로써, 인플루엔자 바이러스는 하나의 플라스미드로부터 생성될 수 있다.
임의의 적합한 프로모터 또는 전사 종결 서열은 단백질, 예를 들어, 바이러스 단백질, 비-바이러스 병원체의 단백질, 또는 치료용 단백질, 또는 vRNA를 발현시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 일 실시양태에서, 본 발명은 인플루엔자 바이 러스 단백질을 발현하거나 코딩하는, 또는 천연 및 재조합 vRNA 둘다의 인플루엔자 vRNA를 발현하거나 코딩하는 단리되고 정제된 벡터, 예를 들어 플라스미드를 제공한다. 바람직하게는, 프로모터는 특정 숙주 세포, 예를 들어 조류 또는 포유동물 숙주 세포, 예를 들어 개, 고양이, 말, 소, 양 또는 인간 세포를 비롯한 영장류 세포에서의 발현에, 또는 바람직하게는 하나 이상의 숙주에서의 발현에 적합하다.
일 실시양태에서, 하나 이상의 vRNA 생성용 벡터는 RNA PolI 프로모터, 예를 들어, 인간 RNA PolI 프로모터, RNA PolII 프로모터, RNA PolIII 프로모터, T7 프로모터, 또는 T3 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는 프로모터를 포함한다. RNA PolII 프로모터를 포함하는 vRNA용 벡터에 대해, 벡터는 리보자임 서열을 임의로 포함할 수 있다 (PCT/US04/016649 참조, 그의 개시사항은 본원에 참고로 도입됨). vRNA 벡터에 대한 바람직한 전사 종결 서열은 RNA PolI 전사 종결 서열, RNA PolII 전사 종결 서열, 또는 리보자임을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 함께 사용되는 플라스미드 또는 플라스미드의 조합물 내의 각각의 RNA PolII 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다. 함께 사용되는 플라스미드 또는 플라스미드의 조합물 내의 각각의 RNA PolI 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, 함께 사용되는 플라스미드 또는 플라스미드의 조합물 내의 각각의 RNA PolII 전사 종결 서열은 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, 함께 사용되는 플라스미드 또는 플라스미드의 조합물 내의 각각의 RNA PolI 전사 종결 서열은 동일하거나 상이할 수 있다. 12개 미만, 예를 들어 10개 미만의 플라스미드의 사용은 102 TCID50/mL, 103 TCID50/mL, 104 TCID50/mL, 105 TCID50/mL, 106 TCID50/mL, 107 TCID50/mL, 108 TCID50/mL 이상의 역가를 수득할 수 있다.
일 실시양태에서, 하나 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 바이러스 절편에 대한 cDNA는 RNA PolI 종결 및 프로모터 서열에 각각 플랭킹되며, 그 후 상기 전사 카세트는 RNA PolII 프로모터 및 RNA PolII 아데닐중합 신호에 플랭킹된다 (도 4에서 NP 유전자에 대해 예시됨). 상기 접근법은 동일한 주형으로부터 vRNA (RNA PolI에 의해 합성됨) 및 mRNA (RNA PolII에 의해 합성됨) 둘다를 생성한다. 따라서, 바이러스 단백질 합성을 위한 추가의 플라스미드는 더이상 필요하지 않으며, 이는 인플루엔자 바이러스 생성에 필요한 전사 카세트의 수를 감소시킨다. 각각의 vRNA/단백질 코딩 카세트에서 RNA PolI 프로모터 및/또는 RNA PolI 전사 종결 서열 및/또는 RNA PolII 프로모터 및/또는 RNA PolII 종결 서열은 임의의 다른 카세트와 동일하거나 상이할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 2개의 플라스미드, 즉 HA vRNA 및 NA vRNA 생성용의 하나, 및 M vRNA 및 NS vRNA 생성용의 하나, 및 4개의 RNA PolI/II 전사 카세트 (PB2, PB1, PA, 및 NP vRNA 및 mRNA 합성용)를 함유하는 1개의 플라스미드의 조합물을 포함하여 3개의 플라스미드로부터의 바이러스 생성을 가능하게 하거나, 또는 PB2, PB1, PA, NP, M 및 NS vRNA 용의 1개의 플라스미드, HA vRNA 용의 1개의 플라스미드, NA vRNA 용의 1개의 플라스미드, 및 중합효소 및 NP 단백질의 합성용의 1개의 플라스미드의 조합물을 포함하여 4개의 플라스미드로부터의 바이러스 생성을 가능하게 한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 6개의 vRNA, 예를 들어 PB2, PB1, PA, NP, M 및 NS vRNA 생성용의 1개의 플라스미드, 2개의 vRNA, 예를 들어 HA 및 NA vRNA 생성용의 1개의 플라스미드, 및 각각 PB2, PB1, PA 및 NP에 대한 단백질 생성용의 4개의 플라스미드를 포함하여, 6개의 플라스미드로부터의 바이러스 생성을 가능하게 한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 6개의 vRNA, 예를 들어 PB2, PB1, PA, NP, M 및 NS vRNA 생성용의 1개의 플라스미드, 2개의 vRNA, 예를 들어 HA 및 NA vRNA 생성용의 1개의 플라스미드, PB2, PB1, PA에 대한 단백질 생성용의 1개의 플라스미드, 및 NP에 대한 단백질 생성용의 1개의 플라스미드를 포함하여, 4개의 플라스미드로부터의 바이러스 생성을 가능하게 한다.
본 발명의 조성물 및/또는 방법에 유용한 다른 벡터는 바이러스 서열 및 임의로 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및/또는 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열에 플랭킹된 당해 DNA, 예를 들어 예방용 또는 치료용 단백질에 대한 당해 유전자 또는 오픈 리딩 프레임 (코딩 영역)을 포함한다. 당해 DNA는 프로모터에 대해 양성 센스 또는 음성 센스 배향일 수 있다. vRNA 또는 단백질 생성용 백터에서든, 당해 DNA는 암 치료요법 또는 백신, 또는 유전자 요법에 유용한 에피토프와 같은 면역원성 에피토프를 코딩할 수 있다. 일 실시양태에서, 당해 DNA는 전장 인플루엔자 바이러스 cDNA 또는 인플루엔자 바이러스 DNA 코딩 영역, 예를 들어, 인플루엔자 A (예를 들어, 임의의 15 HA 또는 9 NA 아형을 비롯한 임의의 인플루엔자 A 유전자), B 또는 C DNA (문헌 [Fields Virology (Fields et al. (eds.), Lippincott-Raven Publ., Philadelphia, PA (1996)] (본원에 구체적으로 참고로 도 입됨)의 45장 및 46장 참조)이지만, 임의의 공급원으로부터, 예를 들어 임의의 바이러스로부터의 유전자(들)가 본 발명의 벡터 또는 방법에 사용될 수 있음이 고려된다. 따라서, 본 발명의 조성물은 또한 전사 종결 서열에 연결된 3' 인플루엔자 바이러스 비코딩 서열을 포함하는 3' 인플루엔자 바이러스 서열에 연결된, 당해 이종 DNA에 연결된 5' 인플루엔자 바이러스 비코딩 서열, 즉 천연 또는 천연에서 발견되는 것과 상이한 연결로 인플루엔자 서열에 연결되지 않은 것을 포함하는 5' 인플루엔자 바이러스 서열에 연결된 프로모터를 포함하는 전사 카세트를 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 당해 DNA는 RNA 중합효소 프로모터 및 RNA 중합효소 전사 종결 서열에 작동적으로 연결된다.
일 실시양태에서, 당해 DNA는 병원체의 면역원성 폴리펩티드 또는 펩티드 또는 치료용 폴리펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 일 실시양태에서, 당해 DNA는 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열에 작동적으로 연결되는 반면, 또다른 실시양태에서, 당해 DNA는 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열에 작동적으로 연결된다. 또다른 실시양태에서, 당해 DNA는 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열, 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열에 작동적으로 연결된다. 당해 DNA를 포함하는 전사 카세트는 하나 이상의 다른 전사 카세트와 동일한 플라스미드 상에 있을 수 있거나, 다른 전사 카세트와 상이한 플라스미드 상에 있을 수 있다. 바이러스의 제조시, 당해 DNA로 인플루엔자 바이러스 오픈 리딩 프레임 또는 그의 일부분을 치환할 수 있거나, 모든 인플루엔자 바이러스 오픈 리딩 프레임을 대신할 수 있다.
본 발명은 또한 바이러스, 예를 들어 인플루엔자 바이러스의 제조 방법, 또는 당해 이종 DNA를 인플루엔자 바이러스 벡터에 도입함으로써 유전자를 전달하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 상기 방법은 본 발명의 조성물을 감염성 인플루엔자 바이러스를 수득하는데 유효한 양으로 사용하여 세포를 다수의 본 발명의 전사 카세트와 예를 들어 연속적으로 또는 동시에 접촉시키는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 조성물과 접촉된 세포로부터 바이러스를 단리하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한 단리된 바이러스, 및 본 발명의 조성물 또는 바이러스와 접촉된 숙주 세포를 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 세포를 vRNA 또는 단백질 생성 벡터라는 하나 이상의 벡터를, vRNA 또는 단백질 생성 벡터라는 다른 벡터 이전에 접촉시키는 것을 포함한다.
본 발명의 방법은 예를 들어 약독화 돌연변이를 바이러스 게놈에 도입시킴으로써, 인플루엔자 바이러스와 같은 음성 가닥 바이러스의 용이한 제조를 가능하게 한다. 또한, 인플루엔자 바이러스가 강한 체액성 및 세포성 면역을 유도하기 때문에, 본 발명은 특히 바이러스의 천연 변이체의 이용가능성의 관점에서, 백신 벡터와 같이 상기 바이러스를 크게 향상시키며, 이는 연속적으로 사용되어 유전자 요법에 반복 사용을 가능하게 할 수 있다.
헬퍼 바이러스 감염을 필요로 하지 않는 본원에 기재된 바이러스의 제조 방법은 바이러스 돌연변이유발 연구, 및 백신 (예를 들어, AIDS, 인플루엔자, B형 간염, C형 간염, 리노바이러스, 필로바이러스, 말라리아, 헤르페스, 및 발 및 구강 질환용)의 생성, 및 유전자 요법 벡터 (예를 들어, 암, AIDS, 아데노신 데아미나 제, 근육 퇴행위축, 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍증 및 중추신경계 종양용)에 유용하다. 따라서, 의료 요법에 사용하기 위한 바이러스 (예를 들어 백신 또는 유전자 요법용)가 제공된다.
본 발명은 또한 병원체, 예를 들어 박테리아, 바이러스, 또는 기생충, 또는 악성 종양에 대해 개체를 면역화하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 개체를 면역화하는데 유효한 보조제와 임의로 조합된 소정량의 하나 이상의 본 발명의 단리된 바이러스를 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 바이러스는 병원체에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 종양-특이적 폴리펩티드에 대한 서열을 포함하는 vRNA를 포함한다.
또한, 내인성 단백질이 감소된 양이거나 없는 것을 특징으로 하는 증상 또는 질환을 갖는 포유동물에서의 내인성 단백질의 발현을 증대시키거나 증가시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 포유동물에서 내인성 단백질의 양을 증대시키거나 증가시키는데 유효한 소정량의 본 발명의 단리된 바이러스를 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다. 바이러스는 내인성 단백질의 양을 증대시키거나 증가시키는 폴리펩티드에 대한 vRNA를 포함한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
도 1. 수립된 역 유전학 시스템의 개략도. RNP 형질감염 방법 (A)에서, 정제된 NP 및 중합효소 단백질을 시험관내-합성된 vRNA를 사용하여 RNP 내로 집합시킨다. 세포를 RNP로 형질감염시킨 후, 헬퍼 바이러스 감염시킨다. RNA 중합효소 I 방법 (B)에서, RNA 중합효소 I 프로모터, 구조될 vRNA를 코딩하는 cDNA, 및 RNA 중합효소 I 종결자를 함유하는 플라스미드를 세포 내로 형질감염시킨다. RNA 중합효소 I에 의한 세포내 전사로 합성 vRNA를 수득하며, 이를 헬퍼 바이러스를 사용한 감염시 자손 바이러스 입자 내로 패키징한다. A) 및 B)에서, 형질감염체 바이러스 (즉 클로닝된 cDNA로부터 유래된 RNA를 함유하는 것들)를 헬퍼 바이러스 집단으로부터 선별한다. (C)에 나타낸 방법에서, RNA 중합효소 I 프로모터, 8개의 바이러스 RNA 단편에 대한 cDNA, 및 RNA 중합효소 I 종결자를 함유하는 플라스미드를 단백질 발현 플라스미드와 함께 세포 내로 형질감염시킨다. 감염성 바이러스는 PA, PB1, PB2 및 NP를 발현하는 플라스미드로 생성될 수 있지만, 모든 남아있는 구조 단백질 (꺽음 괄호)의 발현은 생성된 바이러스에 따라 바이러스의 생성 효율을 증가시킨다.
도 2. RNA 중합효소 I 구조물 생성의 개략도. 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 cDNA를 PCR에 의해 증폭시키고, BsmBI으로 소화시키고, 인간 RNA 중합효소 I 프로모터 (P) 및 마우스 RNA 중합효소 I 종결자 (T)를 함유하는 pHH21 벡터의 BsmBI 부위 내로 클로닝한다 (문헌 [E. Hoffmann, Ph.D. thesis, Justus, Liebig-University, Giessen, Germany]). 종결자 서열의 티미딘 뉴클레오티드 상류 (*T)는 인플루엔자 바이러스 RNA의 3' 말단을 나타낸다. 인플루엔자 A 바이러스 서열은 굵은 문자로 나타낸다.
도 3. 다중 인플루엔자 바이러스 유전자를 갖는 플라스미드의 개략도. A) 1개의 주형으로부터 모든 8개의 인플루엔자 바이러스 RNA 전사용 pTM-PolI-WSN- All. 인간 RNA 중합효소 I 프로모터 (푸른색, PolI 프로모터), 음성-센스 배향의 인플루엔자 바이러스 절편을 코딩하는 cDNA (상이한 색깔로 나타냄), 및 마우스 RNA 중합효소 I 종결자 (검은색, PolI 종결자)를 포함하는 전사 유닛을 제한 엔도뉴클레아제에 대한 고유한 인식 부위를 사용함으로써 하나의 플라스미드 상에 결합시킨다. B) 1개의 플라스미드로부터의 6개 및 2개의 인플루엔자 바이러스의 전사용 pTM-PolI-WSN-PB2-PB1-PA-NP-M-NS 및 pTM-PolI-WSN-HA-NA. 상기 플라스미드 및 용어는 pTM-PolI-WSN-All에서 개요된 바와 같이 생성되었다. C) 1개의 플라스미드로부터의 PB2, PB1 및 PA mRNA 전사용 pC-PolII-WSN-PB2-PB1-PA. RNA 중합효소 II 프로모터 (짙은 푸른색, Pol II 프로모터), 즉, 닭 β-액틴 프로모터, 각각의 바이러스 단백질에 대한 코딩 영역 (상이한 색깔로 나타냄), 및 아데닐중합 서열 (금색, PolyA)을 포함하는 전사 단위를 제한 엔도뉴클레아제에 대한 고유한 인식 부위를 사용함으로써 하나의 플라스미드 상에 결합시켰다.
도 4. RNA 중합효소 I/II 전사 유닛. NP 유전자를 RNA 중합효소 I 종결자 (PolI-Term) 및 RNA 중합효소 I 프로모터 (PolI-Prom) 서열에 플랭킹시켰다. 그 후, 상기 단위를 CMV 프로모터 (CMV Pr)와 같은 RNA 중합효소 II 프로모터, 및 소 성장 호르몬 아데닐중합 신호 (BGH polyA)와 같은 아데닐중합 신호 사이에 삽입한다.
도 5. PB2, PB1, PA 및 NP vRNA 및 mRNA의 합성용의 4개의 RNA 중합효소 I/II 전사 유닛, 및 HA, NA, M 및 NS vRNA의 합성용의 4개의 RNA 중합효소 I 전사 유닛을 함유하는 플라스미드. PII: RNA 중합효소 II 프로모터 (그늘진 박스), pA: 아데닐중합 신호 (열린 박스); P: RNA 중합효소 I 프로모터 (큰 검은색 박스), T: RNA 중합효소 I 종결자 (작은 검은색 박스).
정의
본원에 사용된 "단리된 및/또는 정제된"이라는 용어는 생체내에서 물질과 결합되지 않도록, 또는 시험관내에서 물질로부터 실질적으로 정제되도록 하는, 본 발명의 플라스미드 또는 본 발명의 바이러스와 같은 핵산 분자의 시험관내 제조, 단리 및/또는 정제를 지칭한다. 단리된 바이러스 제조물은 일반적으로 시험관내 배양 및 전파에 의해 수득되며, 다른 감염성 작용물질이 실질적으로 없다. 본원에 사용된 "실질적으로 없는"은 상기 작용물질에 대한 표준 검출 방법을 사용한 특정 감염성 작용물질에 대한 검출 수준 미만을 의미한다. "재조합" 바이러스는 예를 들어 재조합 DNA 기술을 이용하여 바이러스 게놈에 대한 변화를 도입하여 시험관내에서 제작되거나, 다르게는 인공적으로 생성된 것이다. 본원에 사용된 "재조합 핵산" 또는 "재조합 DNA 서열 또는 절편"이라는 용어는 공급원으로부터 유래되거나 단리되고 후속적으로 시험관내에서 화학적으로 변경될 수 있어서, 그의 서열이 천연 발생이지 않거나 천연 게놈 내에 위치되는 것처럼 위치되지 않는 천연 발생 서열에 상응하는 핵산, 예를 들어 DNA를 지칭한다. 공급원으로부터 "유래된" DNA의 예는, 유용한 단편으로 확인되고 그 후 본질적으로 순수한 형태로 화학적으로 합성된 DNA 서열일 것이다. 공급원으로부터 "단리된" 이러한 DNA의 예는 화학적 수단에 의해, 예를 들어 제한 엔도뉴클레아제의 사용에 의해 상기 공급원으로부터 삭제되거나 제거되어, 추가로 배가될 수 있는, 예를 들어 유전학적 유전자조작의 방법론에 의해 본 발명에 사용하기 위해 증폭될 수 있는 유용한 DNA 서열일 것이다.
본원에 사용된 "고도로 형질감염가능한 세포"는 예를 들어 형질감염된 세포에서의 단백질 발현에 의해 측정된 바로, 단일 플라스미드를 사용한 형질감염 효율이 약 95％일 경우, 및/또는 비약독화된 인플루엔자 바이러스의 바이러스 생성용 인플루엔자 바이러스 유전자를 갖는 5개 초과의 플라스미드를 사용한 형질감염이 형질감염 2일 후까지 약 106 TCID50/mL 이상의 바이러스 역가를 생성하거나, 또는 약독화된 바이러스가 약 102 TCID50/mL의 바이러스 역가를 생성할 경우의 세포이다. 예시적인 고도로 형질감염가능한 세포로는 293T 세포를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 대조적으로, 본원에 사용된 "형질감염 효율이 감소된 세포"는 단일 플라스미드를 사용한 형질감염 효율이 약 50％ 미만이고/거나 약독화된 인플루엔자 바이러스의 바이러스 생성용 인플루엔자 바이러스 유전자를 갖는 5개 초과의 플라스미드를 사용한 형질감염이 형질감염 2일 후까지 약 3 x 105 TCID50/mL 미만의 바이러스 역가를 생성할 경우의 세포이다. 형질감염 효율이 감소된 예시적인 세포로는 베로 세포 및 MDCK 세포를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
음성-센스 RNA 바이러스
음성-센스 RNA 바이러스는 7가지 과 (랍도비리대(Rhabdoviridae), 파라믹소비리대(Paramyxoviridae), 필로비리대(Filoviridae), 보르나비리내(Bornaviridae), 오르토믹소비리대(Orthomyxoviridae), 부니아비리대(Bunyaviridae) 및 아레나비리대(Arenaviridae))로 분류되며, 이는 통상적인 인간 병원체, 예를 들어 호흡기 융합체 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스 및 에볼라 바이러스, 뿐만 아니라 가금 및 가축 산업에 주요한 경제적인 영향을 갖는 동물 바이러스 (예를 들어, 뉴캐슬병 바이러스 및 린더페스트 바이러스)를 포함한다. 첫번째 4개의 과는 비절편화된 게놈을 특징으로 하는 반면, 후자의 3개의 과는 각각 6-내지-8, 3, 또는 2개의 음성-센스 RNA 절편으로 이루어진 게놈을 갖는다. 음성-센스 RNA 바이러스의 공통적인 특징은 그의 RNA 게놈의 음성 복수성이다; 즉, 바이러스 RNA (vRNA)는 mRNA에 상보적이며, 따라서 단독으로는 감염성이 아니다. 바이러스 전사 및 복제를 개시하기 위해, vRNA는 바이러스 중합효소 복합체 및 핵단백질에 의해, 각각 플러스-센스 mRNA 또는 cRNA로 전사되어야 한다: 인플루엔자 A 바이러스에 대해, 바이러스 중합효소 복합체는 3가지 중합효소 단백질 PB2, PB1 및 PA로 이루어진다. 바이러스 복제 동안, cRNA는 새로운 vRNA 분자의 합성을 위한 주형으로서 기능한다. 모든 음성-가닥 RNA 바이러스에 대해, vRNA 및 cRNA의 5' 및 3' 말단 둘다에서의 비-코딩 영역은 바이러스 게놈의 전사 및 복제에 중요하다. 세포 또는 바이러스 mRNA 전사와는 달리, cRNA 및 vRNA는 둘다 5' 말단에서 캡핑되지도 않으며, 바로 3' 말단에서 아데닐중합되지도 않는다.
많은 바이러스 단백질의 기본적인 기능은 생화학적으로 및/또는 바이러스 감염의 내용에서 해명되었다. 그러나, 역 유전학 시스템은 바이러스 복제 및 병원성, 뿐만 아니라 살아있는 약독화된 바이러스 백신의 개발에 관한 음성-가닥 절편화된 및 비-절편화된 RNA 바이러스에 대한 우리의 지식을 극적으로 증가시켰다. 용어가 분자 바이러스학에 사용될 경우, 역 유전학은 클로닝된 cDNA로부터 유래된 게놈을 갖는 바이러스의 생성으로 정의된다 (검토를 위해, 문헌 [Neumann et al., 2002] 참조).
인플루엔자 바이러스
인플루엔자 A 바이러스는 총 10 내지 11개의 단백질을 코딩하는 8개의 단일-가닥 음성-센스 바이러스 RNA (vRNA)의 게놈을 갖는다. 인플루엔자 바이러스 생활 주기는 헤마글루티닌 (HA)이 숙주 세포의 표면 상에서 살리실산-함유 수용체에 결합한 후, 수용체-매개 세포내이입되면서 시작된다. 후기 엔도솜의 낮은 pH는 HA에서 구조적 이동을 촉발함으로써, HA2 서브유닛 (소위 융합 펩티드)의 N-말단을 노출시킨다. 융합 펩티드는 바이러스 및 엔도솜 막의 융합을 개시시키며, 매트릭스 단백질 (M1) 및 RNP 복합체는 세포질 내로 방출된다. RNP는 vRNA를 캡시드화하는 핵단백질 (NP) 및 PA, PB1 및 PB2 단백질에 의해 형성된 vRNA 및 바이러스 중합효소 복합체로 이루어진다. RNP는 전사 및 복제가 일어날 경우 핵 내로 수송된다. RNA 중합효소 복합체는 3개의 상이한 반응을 촉매한다: 5' 캡 및 3' 폴리A 구조를 갖는 mRNA의 합성, 전장 상보성 RNA (cRNA)의 합성, 및 주형으로서 cDNA를 사용한 게놈 vRNA의 합성. 그 후, 새롭게 합성된 vRNA, NP 및 중합효소 단백질은 RNP 내로 집합되고, 핵으로부터 이출되고, 자손 바이러스 입자의 버딩이 일어나는 형질막으로 수송된다. 뉴라미니다제 (NA) 단백질은 시알릴올리고당으로부터 살리실산을 제거하여, 새롭게 집합된 비리온을 세포 표면으로부터 방출시키고, 바이러스 입자의 자가 집합을 방지함으로써 후기 감염에 중요한 역할을 한다. 바이러스 집합체는 단백질-단백질 및 단백질-vRNA 상호작용과 관련되지만, 상기 상호작용의 성질은 거의 알려져 있지 않다.
인플루엔자 B 및 C 바이러스가 구조적으로 및 기능적으로 인플루엔자 A 바이러스와 유사하지만, 약간의 차이가 있다. 예를 들어, 인플루엔자 B 바이러스의 M 절편은 탠덤 시스트론의 종결-재개시 반응을 통해 2가지 단백질, 즉 M1 및 BM2를 코딩하며, NA 절편은 바이시스트론 mRNA로부터 NA 및 NB 단백질을 코딩한다. 7개의 vRNA 절편을 갖는 인플루엔자 C 바이러스는 M1 단백질을 생성하는데 스플라이싱된 전사체에 의존한다; 비스플라이싱된 mRNA의 생성물은 단백질분해적으로 절단되어 CM2 단백질을 생성한다. 또한, 인플루엔자 C 바이러스는 개별 HA 및 NA 단백질보다는 HA-에스테라제를 코딩한다.
토고토바이러스(Thogotovirus)
토고토바이러스 (THOV)는 오르토믹소비리대의 과 내의 새로운 속을 대표한다. 이는 진드기에 의해 전염되며, 낙타, 염소 및 소를 비롯한 가축에서 발견되었다. 결과적으로, THOV는 진드기 및 척추동물 세포에서 복제될 수 있다. THOV 게놈은 단일-가닥, 음성-센스 RNA의 6개의 절편을 포함한다. 3개의 가장 큰 절편에 의해 코딩되는 단백질은 인플루엔자 바이러스 중합효소 단백질 PB2, PB1 및 PA와 유의한 상동성을 나타낸다. 절편 5는 인플루엔자 바이러스 NP와 관련된 단백질을 코딩한다. 절편 4에 의해 코딩되는 THOV 당단백질은 인플루엔자 바이러스 HA 또는 NA와 상동성이지 않지만, 이는 바쿨로바이러스(Baculovirus) 당단백질에 대해 서열 유사성을 나타낸다. 가장 작은 절편은 매트릭스 단백질을 코딩하는 것으로 여겨지며, 임의의 인플루엔자 바이러스 단백질과 공통점이 없다. 인플루엔자 바이러스와 마찬가지로, vRNA의 3' 및 5' 말단 둘다는 프로모터 활성을 필요로 하며, 상기 활성은 각각 vRNA의 3' 및 5' 말단의 말단 14 및 15 뉴클레오티드에 위치된다.
THOV의 mRNA 합성은 숙주 세포-유래된 캡 구조에 의해 준비된다. 그러나, 인플루엔자 바이러스와 대조적으로, 단지 캡 구조 (추가의 뉴클레오티드가 없음)만이 세포 mRNA로부터 절단된다 (문헌 [Albo et al., 1996]; [Leahy et al., 1997]; [Weber et al., 1996]). 시험관내 절단 분석은 vRNA의 5' 및 3' 말단 둘다가 엔도뉴클레아제 활성을 필요로 함을 밝혔지만 (문헌 [Leahy et al., 1998]), 인플루엔자 바이러스에 대해 보여진 바와 같이 (문헌 [Hagen et al., 1994]) 모델 cRNA 프로모터의 첨가는 엔도뉴클레아제 활성을 자극하지 않는다 (문헌 [Leahy et al., 1998]). 인플루엔자 바이러스에 대해 제안된 코르크 스크루 구조와 유사한 '후크' 구조가 THOV에 대해 제안되었다 (문헌 [Leahy et al., 1997]; [Weber et al., 1997]). 하지만, 상기 '후크' 구조는 THOV vRNA 프로모터에서만 발견된다. cRNA 프로모터 서열은 cRNA의 5' 말단에서 위치 2 및 9 사이, 및 3 및 8 사이의 염기쌍의 형성을 허용하지 않는다. 상기 뉴클레오티드 사이의 염기쌍-형성을 허용하는 위치 3 또는 8에서의 변형은 엔도뉴클레아제 활성을 자극하며, 이는 제안된 '후크' 구조의 강력한 지지 증거이다 (문헌 [Leahy et al., 1998]). 더욱이, 상기 구조는 THOV 생활 주기의 조절에 중요할 수 있다; '후크' 구조를 형성하는 vRNA 프로모터는 PB2 엔도뉴클레아제 활성을 자극함으로써 전사를 가능하게 할 수 있다. 대조적으로, cRNA 프로모터는 '후크' 구조를 형성하지 않을 수 있으며, 따라서 엔도뉴클레아제 활성을 자극할 수 없으므로 복제를 초래하지 못할 수 있다.
부니아비리대(Bunyaviridae)
부니아비리대 과는 인간에서 출혈열 또는 뇌염열 (예를 들어, 리프트 계곡열, 한탄(Hantaan), 라 크로세(La Crosse) 및 크리미안-콩고(Crimean-Congo) 출혈열)을 유발하는 몇몇 바이러스를 포함한다. 구형 및 외피화된 비리온은 단일-가닥, 음성-센스 RNA의 3개의 절편을 함유한다 (문헌 [Elliott, 1997]에서 검토됨). 가장 큰 절편 (L)은 바이러스 RNA 중합효소 단백질 (L 단백질)을 코딩하는 반면, M 절편은 2가지 바이러스 당단백질 G1 및 G2 및 비구조 단백질 (NSm)을 코딩한다. 가장 작은 절편 (S)은 뉴클레오캡시드 단백질 (N) 및 제2 비구조 단백질 (NSs)을 코딩한다. 바이러스 복제 및 전사는 세포질에서 일어나며, 새롭게 집합된 비리온은 골지체의 막을 통해 버딩한다.
문헌 [Bridgen and Elliott (1996)]은 전적으로 클로닝된 cDNA로부터 감염성 부니암웨라(Bunyamwera) 바이러스를 생성하는 역 유전학 시스템을 수립하였다. 이들은 광견병 바이러스에 대해 문헌 [Schnell et al. (1994)]에 의해 최초로 개시된 전략을 따른다: 바이러스 중합효소 및 핵단백질을 발현하는 세포에서의 양성-센스 항게놈 RNA를 코딩하는 (그러나 음성-센스 게놈 RNA는 코딩하지 않는) cDNA의 세포내 전사. 문헌 [Bridgen and Elliott (1996)]은 HeLaT4+ 세포를 T7 중합효소를 발현하는 백시니아 바이러스로 감염시키고, 상기 세포를 S, M 및 L 절편에 의해 코딩되는 단백질을 발현하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 그 후, 상기 세포를 T7 중합효소 프로모터에 플랭킹된 전장 항-게놈 cDNA 및 간염 델타 바이러스 리보자임을 코딩하는 3개의 플라스미드로 형질감염시켰다. 백시니아 바이러스 입자의 수에 대한 부니아바이러스 입자의 수를 증가시키기 위해, 저자들은 백시니아 바이러스가 아니라 부니아웨라가 복제되는 모기 세포를 사용하였다. 상기 프로토콜은 유전학적으로 유전자조작 부니아비리대에 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 상이한 부니아비리대 균주로 공동감염된 세포에 의해 용이하게 수득될 수 없는 재배열 바이러스를 생성할 수 있다.
전사 및 복제에 필요한 부니아바이러스 프로모터 요소 및 바이러스 단백질을 연구하기 위해, 문헌 [Dunn et al. (1995)]은 부니아웨라 S RNA 절편의 5' 및 3' 비번역된 영역 사이에 음성-센스 배향의 CAT 유전자를 클로닝하였다. 세포를 L 및 S 절편에 의해 코딩되는 단백질을 발현하는 구조물로 형질감염시킨 후, 시험관내에서 전사된 RNA로 형질감염시켰고, 이는 CAT 활성을 초래하였다. 부니아바이러스 S 절편은 중복된 리딩 프레임에서 2가지 단백질, 즉 N 및 NSs를 코딩한다. 상기 단백질 둘다가 전사 및 복제에 필요한지 확인하기 위해, N 또는 NSs만을 발현하는 구조물을 CAT 활성에 대해 시험하였다. L 단백질과 함께 N 단백질 발현은 CAT 활성을 초래한 반면, NSs 발현 구조물에서는 CAT 활성이 검출되지 않았다. 따라서, L 및 N 단백질은 부니아바이러스-유사 RNA의 전사 및 복제에 충분하다.
인플루엔자 바이러스에 대해, 부니아바이러스 RNA의 말단 서열은 상보적이며 고도로 보존된다. 따라서, 상기 서열 요소는 부니아바이러스 프로모터를 한정하며, 프로모터 활성에 중요한 것으로 여겨진다. 바이러스 RNA의 3' 말단에서 5개의 뉴클레오티드의 결실은 CAT 발현을 극적으로 감소시킨다 (문헌 [Dunn et al., 1995]). 대조적으로, 5' 말단에서 2개의 뉴클레오티드, 또는 3' 말단에서 11 또는 35개의 뉴클레오티드의 첨가는 CAT 발현을 없애지 않는다 (문헌 [Dunn et al., 1995]). 따라서, 인플루엔자 바이러스 중합효소 복합체와 마찬가지로, 부니아바이러스 중합효소 단백질은 명백히 전사 및/또는 복제를 내부적으로 시작시킬 수 있다.
본 발명의 재조합 인플루엔자 바이러스 벡터
본원에 기재된 벡터의 사용은 인플루엔자 바이러스와 같은 절편화된 바이러스의 생성에 필요한 플라스미드의 수를 유의하게 감소시키며, 고효율로 형질감염될 수 있는 세포주에서의 인플루엔자 바이러스의 구조 효율을 증가시켜, 매우 약독화된 바이러스의 생성을 가능하게 하고/거나 인간 백신 생성용 세포주를 비롯한 고효율로 형질감염될 수 없는 세포주 (예를 들어, 베로 세포)에서의 인플루엔자 바이러스의 생성을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명의 벡터의 사용은 바이러스 생성을 위한 변이체의 수를 감소시켜 인플루엔자 바이러스의 보다 일정한 생성 ,및 플라스미드 내력, 정제 및 독성의 적절한 문서화를 제공해야 하는 부담을 감소시킨다. 상기 이점은 특히 광역유행병에 대한 백신 바이러스의 급속한 생성을 가능하게 한다. 더욱이, 본원에 개시된 본 발명은 인플루엔자 바이러스에 제한되지 않지만, 임의의 다른 안티센스 RNA 바이러스, 예를 들어 파라믹소비리대, 랍도비리대, 필로비리대, 레오비리대(Reoviridae), 아레나비리대 또는 부니아비리대에 적용될 수 있다.
본 발명은 하나 이상의 하기 단리된 및/또는 정제된 벡터, 또는 하나 이상의 벡터 및/또는 2개 이상의 전사 카세트를 포함하는 조성물을 제공한다: PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 인플루엔자 바이러스 PA에 대한 DNA 절편, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트, 인플루엔자 바이러스 PB1에 대한 DNA 절편, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트, 인플루엔자 바이러스 PB2에 대한 DNA 절편, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트, 및/또는 인플루엔자 바이러스 NP에 대한 DNA 절편, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트.
본 발명의 벡터는 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및/또는 PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트로부터 선택된 2개 이상의 전사 카세트를 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및 PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트로부터 선택된 2개 이상의 전사 카세트를 포함할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및/또는 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트로부터 선택된 적어도 2개의 전사 카세트를 포함한다.
본 발명은 또한 인플루엔자 바이러스 PA에 대한 DNA 절편, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트, 인플루엔자 바이러스 PB1에 대한 DNA 절편, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트, 인플루엔자 바이러스 PB2에 대한 DNA 절편, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트, 및/또는 인플루엔자 바이러스 NP에 대한 DNA 절편, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트로부터 선택된 적어도 2개의 전사 카세트를 갖는 벡터를 포함한다.
또한, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HEF cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 HEF cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및/또는 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트로부터 선택된 2개 이상의 전사 카세트를 포함하는 벡터가 제공된다.
또한, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터, 및 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HEF cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 HEF cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트로부터 선택된 2개 이상의 전사 카세트를 포함하는 벡터가 제공된다.
일 실시양태에서, 본 발명은 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HEF cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 HEF cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 인플루엔자 바이러스 PA에 대한 DNA 절편, 예를 들어 전장 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트, 인플루엔자 바이러스 PB1에 대한 DNA 절편, 예를 들어 전장 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트, 인플루엔자 바이러스 PA에 대한 DNA 절편, 예를 들어 전장 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트, 및/또는 인플루엔자 바이러스 PA에 대한 DNA 절편, 예를 들어 전장 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트를 포함하는 하나 이상의 전사 카세트를 포함하는 단리된 및/또는 정제된 벡터를 제공한다.
예시적인 본 발명의 조성물
본 발명은 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및/또는 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트로부터 선택된 2개 이상의 vRNA 생성용 전사 카세트를 포함하는 하나 이상의 플라스미드; 및 PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및/또는 PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트로부터 선택된 하나 이상의 mRNA 생성용 전사 카세트를 포함하는 하나 이상의 플라스미드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 실시양태에서, 각각의 PolI 프로모터는 동일하다. 일 실시양태에서, 각각의 PolII 프로모터는 동일하다. 일 실시양태에서, 각각의 PolI 전사 종결자 서열은 동일하다. 일 실시양태에서, 각각의 PolII 전사 종결자 서열은 동일하다.
일 실시양태에서, 하나 이상의 vRNA 생성용 플라스미드는 인플루엔자 바이러스 PA, 인플루엔자 바이러스 PB1, 인플루엔자 바이러스 PB2, 인플루엔자 바이러스 HA, 인플루엔자 바이러스 NP, 인플루엔자 바이러스 NA, 인플루엔자 바이러스 M 및 인플루엔자 바이러스 NS 절편용의 전사 카세트를 포함한다. 일 실시양태에서, 하나 이상의 mRNA 생성용 플라스미드는 인플루엔자 바이러스 PA, 인플루엔자 바이러스 PB1, 인플루엔자 바이러스 PB2 또는 인플루엔자 바이러스 NP용의 2개 이상의 전사 카세트를 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 mRNA 생성용 플라스미드는 인플루엔자 바이러스 PA, 인플루엔자 바이러스 PB1, 인플루엔자 바이러스 PB2 및 인플루엔자 바이러스 NP용의 카세트를 포함한다. 일 실시양태에서, 하나 이상의 mRNA 생성용 플라스미드는 3개의 카세트를 포함하며, 조성물은 PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 유전자에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 갖는 제3 mRNA 생성용 플라스미드를 추가로 포함하며, 제3 플라스미드의 DNA 코딩 영역은 3개의 카세트를 포함하는 플라스미드 상에 있지 않은 인플루엔자 바이러스 유전자에 대한 것이다. 예를 들어, 하나 이상의 mRNA 생성용 플라스미드는 인플루엔자 바이러스 PA, 인플루엔자 바이러스 PB1, 인플루엔자 바이러스 PB2용의 카세트를 포함하며, 제3 플라스미드는 인플루엔자 바이러스 NP용의 카세트를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 하나 이상의 vRNA 생성용 플라스미드는 인플루엔자 바이러스 PA, 인플루엔자 바이러스 PB1, 인플루엔자 바이러스 PB2, 인플루엔자 바이러스 NP, 인플루엔자 바이러스 M 및 인플루엔자 바이러스 NS용의 전사 카세트를 포함한다. 또한, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트를 포함하는 vRNA 생성용 플라스미드가 포함된다. 예를 들어, 하나 이상의 mRNA 생성용 플라스미드는 인플루엔자 바이러스 PA, 인플루엔자 바이러스 PB1, 인플루엔자 바이러스 PB2 및 인플루엔자 바이러스 NP용의 카세트를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 하나 이상의 mRNA 생성용 플라스미드는 3개의 카세트를 포함하며, 조성물은 PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 유전자에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 갖는 제3 mRNA 생성용 플라스미드를 추가로 포함하며, 제3 플라스미드의 DNA 코딩 영역은 3개의 카세트를 포함하는 플라스미드 상에 있지 않은 인플루엔자 바이러스 유전자에 대한 것이다. 예를 들어, 하나 이상의 mRNA 생성용 플라스미드는 인플루엔자 바이러스 PA, 인플루엔자 바이러스 PB1, 인플루엔자 바이러스 PB2용의 카세트를 포함하며, 제3 플라스미드는 인플루엔자 바이러스 NP용의 카세트를 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트를 포함하는 플라스미드를 포함한다. 일 실시양태에서, 전사 카세트 내의 HA는 A형 HA이다. 또다른 실시양태에서, 전사 카세트 내의 HA는 B형 HA이다. 일 실시양태에서, RNA 중합효소 I 프로모터는 인간 RNA 중합효소 I 프로모터이다. 일 실시양태에서, 전사 카세트 내의 NA 절편은 B형 NA 절편, 즉 인플루엔자 B 바이러스 NA 및 NB 단백질 둘다에 대한 것이다. 일 실시양태에서, 조성물은 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA, 예를 들어 M1 및 M2 둘다에 대한 것에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트를 추가로 포함한다.
또한, PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및/또는 PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트로부터 선택된 2개 이상의 전사 카세트를 포함하는 플라스미드를 포함하는 조성물이 제공된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트로부터 선택된 하나 이상의 전사 카세트를 포함하는 플라스미드; 및 인플루엔자 바이러스 PA에 대한 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트, 인플루엔자 바이러스 PB1에 대한 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트, 인플루엔자 바이러스 PB2에 대한 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트, 및 인플루엔자 바이러스 NP에 대한 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트로부터 선택된 하나 이상의 전사 카세트를 포함하는 플라스미드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 실시양태에서, 전사 카세트 내의 HA는 A형 HA이다. 또다른 실시양태에서, 전사 카세트 내의 HA는 B형 HA이다. 일 실시양태에서, RNA PolI 프로모터는 인간 RNA PolI 프로모터이다. 일 실시양태에서, 전사 카세트 내의 NA cDNA는 B형 NA cDNA, 즉 NA 및 NB를 갖는 것이다. 일 실시양태에서, 조성물은 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA, 예를 들어 M1 및 BM2를 갖는 것에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트를 추가로 포함한다.
또한, 인플루엔자 바이러스 PA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PA에 대한 cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트, 인플루엔자 바이러스 PB1, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB1에 대한 cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트, 인플루엔자 바이러스 PB2, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB2에 대한 cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트, 및 인플루엔자 바이러스 NP, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NP에 대한 cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트를 포함하는 플라스미드를 포함하는 조성물이 제공된다.
또한, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HEF cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 HEF cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및/또는 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트로부터 선택된 2개 이상의 전사 카세트를 포함하는 하나 이상의 vRNA 생성용 플라스미드; 및 PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및/또는 PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트로부터 선택된 하나 이상의 전사 카세트를 포함하는 하나 이상의 mRNA 생성용 플라스미드를 포함하는 조성물이 포함된다.
일 실시양태에서, 하나 이상의 vRNA 생성용 플라스미드는 인플루엔자 바이러스 PA, 인플루엔자 바이러스 PB1, 인플루엔자 바이러스 PB2, 인플루엔자 바이러스 HEF, 인플루엔자 바이러스 NP, 인플루엔자 바이러스 M 및 인플루엔자 바이러스 NS 절편용의 전사 카세트를 포함한다. 일 실시양태에서, 하나 이상의 mRNA 생성용 플라스미드는 인플루엔자 바이러스 PA, 인플루엔자 바이러스 PB1, 인플루엔자 바이러스 PB2 또는 인플루엔자 바이러스 NP용의 2개 이상의 전사 카세트를 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 mRNA 생성용 플라스미드는 인플루엔자 바이러스 PA, 인플루엔자 바이러스 PB1, 인플루엔자 바이러스 PB2 및 인플루엔자 바이러스 NP용의 카세트를 포함한다. 일 실시양태에서, 하나 이상의 mRNA 생성용 플라스미드는 3개의 카세트를 포함하며, 조성물은 PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 유전자에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 갖는 제3 mRNA 생성용 플라스미드를 추가로 포함하며, 제3 플라스미드의 DNA 코딩 영역은 3개의 카세트를 포함하는 플라스미드 상에 있지 않은 인플루엔자 바이러스 유전자에 대한 것이다. 예를 들어, 하나 이상의 mRNA 생성용 플라스미드는 인플루엔자 바이러스 PA, 인플루엔자 바이러스 PB1, 인플루엔자 바이러스 PB2용의 카세트를 포함하며, 제3 플라스미드는 인플루엔자 바이러스 NP용의 카세트를 포함한다. 일 실시양태에서, 하나 이상의 vRNA 생성용 플라스미드는 인플루엔자 바이러스 PA, 인플루엔자 바이러스 PB1, 인플루엔자 바이러스 PB2, 인플루엔자 바이러스 NP, 인플루엔자 바이러스 M 및 인플루엔자 바이러스 NS 절편용의 전사 카세트를 포함한다. 예를 들어, 조성물은 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HEF cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 HEF cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트를 포함하는 vRNA 생성용 플라스미드를 포함한다.
또한, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HEF cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 HEF cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및/또는 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트로부터 선택된 2개 이상의 전사 카세트를 포함하는 플라스미드를 포함하는 조성물이 제공된다. 일 실시양태에서, 각각의 vRNA 생성용 전사 카세트는 하나의 플라스미드 상에 있다. 일 실시양태에서, 각각의 mRNA 생성용 전사 카세트는 하나의 플라스미드 상에 있다. 일 실시양태에서, 각각의 전사 카세트는 하나의 플라스미드 상에 있다. 일 실시양태에서, RNA PolI 프로모터는 인간 RNA PolI 프로모터이다.
본 발명은 또한 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HEF cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 HEF cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트로부터 선택된 하나 이상의 전사 카세트; 및 인플루엔자 바이러스 PA에 대한 cDNA, 예를 들어 전장 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트, 인플루엔자 바이러스 PB1에 대한 cDNA, 예를 들어 전장 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트, 인플루엔자 바이러스 PB2에 대한 cDNA, 예를 들어 전장 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트, 및/또는 인플루엔자 바이러스 NP에 대한 cDNA, 예를 들어 전장 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트로부터 선택된 하나 이상의 전사 카세트를 포함하는 플라스미드를 포함하는 조성물을 포함한다. 일 실시양태에서, 각각의 vRNA 생성용 전사 카세트는 하나의 플라스미드 상에 있다. 일 실시양태에서, 각각의 mRNA 생성용 전사 카세트는 하나의 플라스미드 상에 있다. 일 실시양태에서, 각각의 전사 카세트는 하나의 플라스미드 상에 있다. 일 실시양태에서, RNA PolI 프로모터는 인간 RNA PolI 프로모터이다.
일 실시양태에서, 임의로 293T 세포 또는 베로 세포인 세포와 접촉될 경우, 조성물은 검출가능한 양의 인플루엔자 바이러스, 예를 들어 102 이상 내지 103 이상 TCID50/mL의 역가를 생성한다.
예시적인 방법
본 발명은 또한 인플루엔자 바이러스의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포를, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및/또는 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및/또는 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트로부터 선택된 2개 이상의 전사 카세트를 포함하는 플라스미드; 및 인플루엔자 바이러스 PA에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 인플루엔자 바이러스 PB1에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 인플루엔자 바이러스 PB2에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및/또는 인플루엔자 바이러스 NP에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트로부터 선택된 하나 이상의 전사 카세트를 포함하는 플라스미드와 접촉시키는 것을 포함한다.
일 실시양태에서, 인플루엔자 바이러스의 제조 방법은 세포를, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트를 포함하며, 임의로 인플루엔자 바이러스 PA에 대한 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트, 인플루엔자 바이러스 PB1에 대한 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트, 인플루엔자 바이러스 PB2에 대한 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트, 및/또는 인플루엔자 바이러스 NP에 대한 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트로부터 선택된 하나 이상의 전사 카세트를 포함하는 플라스미드와 접촉시키는 것을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 세포를, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HEF cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 HEF cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및/또는 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트로부터 선택된 2개 이상의 전사 카세트를 포함하는 플라스미드; 및 인플루엔자 바이러스 PA에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 인플루엔자 바이러스 PB1에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 인플루엔자 바이러스 PB2에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및/또는 인플루엔자 바이러스 NP에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트로부터 선택된 하나 이상의 전사 카세트를 포함하는 플라스미드와 접촉시키는 것을 포함하는 인플루엔자 바이러스의 제조 방법을 제공한다.
또한, 인플루엔자 바이러스의 제조 방법이 제공된다. 상기 방법은 세포를, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HEF cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 HEF cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트를 포함하며, 임의로 인플루엔자 바이러스 PA에 대한 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트, 인플루엔자 바이러스 PB1에 대한 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트, 인플루엔자 바이러스 PB2에 대한 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트, 및/또는 인플루엔자 바이러스 NP에 대한 cDNA, 예를 들어, 전장 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트로부터 선택된 하나 이상의 전사 카세트를 포함하는 플라스미드와 접촉시키는 것을 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 방법은 세포를 전사 종결 서열에 연결된 3' 인플루엔자 바이러스 비코딩 서열 및 임의로 코딩 서열의 인접한 부분을 포함하는 3' 인플루엔자 바이러스 서열에 연결된 당해 DNA (PCT/US03/04233 참조)에 연결된, 5' 인플루엔자 바이러스 비코딩 서열 및 임의로 코딩 서열의 인접한 부분을 포함하는 5' 인플루엔자 바이러스 서열에 연결된 프로모터 (본원에 참고로 도입된 PCT/US03/04233 참조)를 포함하는 전사 카세트를 포함하는 벡터와 접촉시키는 것을 포함한다. 일 실시양태에서, 당해 DNA는 센스 배향이다. 또다른 실시양태에서, 당해 DNA는 음성 센스 배향이다. 당해 DNA는 병원체의 면역원성 폴리펩티드 또는 펩티드 또는 치료용 폴리펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함할 수 있다. 당해 DNA는 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열에 작동적으로 연결될 수 있고/거나, 당해 DNA는 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열에 작동적으로 연결된다.
본 발명에 사용될 수 있는 세포주 및 인플루엔자 바이러스
본 발명에 따르면, 인플루엔자 바이러스에 대한 수용체인 1종 이상의 살리실산의 줄어들거나 감소된 수준을 발현하는 돌연변이체 세포를 비롯한 인플루엔자 바이러스의 효과적인 복제를 뒷받침하는 임의의 세포가 본 발명에 사용될 수 있다. 상기 방법에 의해 수득된 바이러스로 재배열 바이러스를 제조할 수 있다.
바람직하게는, 세포는 WHO 인증된 또는 인증가능한 연속성 세포주이다. 이러한 세포주를 인증하는 요건은 계통, 성장 특징, 면역학적 마커, 바이러스 감수성, 종양발생 및 저장 조건에 관한 특징, 뿐만 아니라 동물, 달걀 및 세포 배양물에서의 시험에 의한 것을 포함한다. 이러한 특징은 세포에 검출가능한 우발성 작용물질이 없는지를 확인하는데 이용된다. 일부 국가에서는, 핵학이 또한 필요할 수 있다. 또한, 종양발생은 바람직하게는 백신 생성에 사용되는 것과 동일한 통과 수준인 세포에서 시험된다. 백신 바이러스는 바람직하게는 일정한 결과를 생성하는 것으로 나타난 방법에 의해 정제된다 (예를 들어, 문헌 [World Health Organization, 1982] 참조).
최종 생성물의 정제를 위한 적절한 시험이 포함될 수 있도록, 사용되는 세포주의 완전한 특성화를 수립하는 것이 바람직하다. 본 발명에 사용되는 세포의 특성화에 사용될 수 있는 데이타로는 (a) 그의 기원, 유래 및 통과 내력에 대한 정보; (b) 그의 성장 및 형태학적 특징에 대한 정보; (c) 우발성 작용물질의 시험의 결과; (d) 세포를 다른 세포주 사이에서 명백히 인식되게 하는 생화학적, 면역학적 및 세포학적 패턴과 같은 구별가능한 특징; 및 (e) 종양발생에 대한 시험의 결과를 들 수 있다. 바람직하게는, 사용되는 숙주 세포의 통과 수준, 또는 집단 배가는 가능한 한 낮다.
세포에서 생성되는 바이러스는 백신 또는 유전자 요법 제제화 이전에 고도로 정제되는 것이 바람직하다. 일반적으로, 정제 절차는 세포 DNA, 다른 세포 성분 및 우발성 작용물질의 광범위한 제거를 초래할 것이다. DNA를 광범위하게 열화시키거나 변성시키는 절차가 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Mizrahi, 1990]을 참조한다.
백신
본 발명의 백신은 임의의 병원체의 당단백질을 포함하는 면역원성 단백질, 예를 들어 1종 이상의 박테리아, 바이러스, 효모 또는 진균으로부터의 면역원성 단백질을 포함할 수 있다. 따라서, 일 실시양태에서, 본 발명의 인플루엔자 바이러스는 HIV와 같은 렌티바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, CMV 또는 HSV와 같은 헤르페스 바이러스, 또는 발 및 구강 질환 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는 인플루엔자 바이러스 또는 다른 바이러스 병원체에 대한 백신 벡터일 수 있다.
완전 비리온 백신은 한외여과에 의해 농축된 후, 띠 원심분리에 의해 또는 크로마토그래피에 의해 정제된다. 이는 예를 들어 포르말린 또는 베타-프로피오락톤을 사용한 정제 전후에 불활성화된다.
서브유닛 백신은 정제된 당단백질을 포함한다. 이러한 백신은 하기와 같이 제조될 수 있다: 세정제로 처리함으로써 단편화된 바이러스 현탁액을 사용하여, 표면 항원을 예를 들어 초원심분리에 의해 정제한다. 따라서, 서브유닛 백신은 주로 HA 단백질 및 또한 NA를 함유한다. 사용되는 세정제는 양이온성 세정제, 예를 들어 헥사데실 트리메틸 암모늄 브로마이드 (문헌 [Bachmeyer, 1975]), 음이온성 세정제, 예를 들어 암모늄 데옥시콜레이트 (문헌 [Laver & Webster, 1976]; [Webster et al., 1977]); 또는 비이온성 세정제, 예를 들어 명칭 트리톤(TRITON) X1OO으로 시판되는 것일 수 있다. 헤마글루티닌은 또한 브로멜린과 같은 프로테아제로 비리온을 처리한 후 단리된 후, 문헌 [Grand and Skehel (1972)]에 의해 기재된 것과 같은 방법에 의해 정제될 수 있다.
분할 백신은 지질을 용해시키는 작용물질로 처리된 비리온을 포함한다. 분할 백신은 하기와 같이 제조될 수 있다: 불활성화된 또는 그렇지 않은 상기와 같이 수득된 정제된 바이러스의 수성 현탁액을, 교반하면서 세정제와 결합된 에틸 에테르 또는 클로로포름과 같은 지질 용매로 처리한다. 바이러스 외피 지질의 용해는 바이러스 입자의 단편화를 초래한다. 주로 그의 원래 지질 환경이 제거된 헤마글루티민 및 뉴라미니다제 및 코어 또는 그의 분해 생성물로 이루어진 분할 백신을 함유하는 수성상을 회수한다. 그 후, 잔류의 감염성 입자를, 이것이 이미 수행되지 않았다면 불활성화시킨다.
불활성화된 백신. 본 발명의 불활성화된 인플루엔자 바이러스 백신은 포르말린 또는 β-프로피오락톤 처리와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 공지된 방법을 이용하여 본 발명의 복제된 바이러스를 불활성화시킴으로써 제공된다. 본 발명에 사용될 수 있는 불활성화 백신 유형으로는 전체-바이러스 (WV) 백신 또는 서브비리온 (SV) (분할) 백신을 들 수 있다. WV 백신은 비손상, 불활성화 바이러스를 함유하는 반면, SV 백신은 지질-함유 바이러스 외피를 가용화시키는 세정제로 분쇄된 후 잔류의 바이러스를 화학적으로 불활성화된 정제된 바이러스를 함유한다.
또한, 사용될 수 있는 백신으로는 표면 항원으로 지칭되는 단리된 HA 및 NA 표면 단백질을 함유하는 것들, 또는 서브유닛 백신을 들 수 있다. 일반적으로, SV 및 표면 항원 (즉, 정제된 HA 또는 NA) 백신에 대한 반응은 유사하다. 외피 바이러스에 면역학적으로 관련된 NA 항원 및 비관련된 HA를 함유하는 실험적인 불활성화 WV 백신은 통상적인 백신보다 덜 효과적인 것으로 나타난다 (문헌 [Ogra et al., 1977]. 관련 표면 항원 둘다를 함유하는 불활성화 백신이 바람직하다.
살아있는 약독화된 바이러스 백신. 살아있는 약독화된 인플루엔자 바이러스 백시은 또한 공지된 방법 단계에 따라 인플루엔자 바이러스 감염을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 약독화는 바람직하게는 공지된 방법에 따라 약독화된 공여자 바이러스로부터 복제된 단리체 또는 재배열 바이러스로 약독화된 유전자의 전달에 의한 단일 단계에서 달성된다 (예를 들어, 문헌 [Murphy, 1993] 참조). 인플루엔자 A 바이러스에 대한 내성이 HA 및 NA 당단백질에 대한 면역 반응의 발달에 의해 매개되기 때문에, 상기 표면 항원을 코딩하는 유전자는 순환성 야생형 균주로부터 와야 한다. 약독화된 유전자는 약독화된 모체로부터 유래된다. 상기 접근법에서, 약독화를 부여하는 유전자는 바람직하게는 HA 및 NA 당단백질을 코딩하지 않는다. 다르게는, 상기 유전자는 임상적인 바이러스 단리체의 표면 항원을 갖는 재배열체로 전달될 수 없다.
많은 공여자 바이러스가 인플루엔자 바이러스를 재생적으로 약독화시키는 그의 능력에 대해 평가되었다. 비-제한적 예로서, A/Ann Arbor(AA)/6/60 (H2N2) 한랭 적응 (ca) 공여자 바이러스는 약독화된 백신 생성에 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Edwards, 1994]; [Murphy, 1993] 참조). 그 후, 재배열체 자손을 약독화된 A/AA/6/60 (H2N2) ca 공여자 바이러스의 표면 항원을 갖는 바이러스의 복제를 억제하는 H2N2 항혈청의 존재하에서 25℃에서 (유독성 바이러스의 복제에 제한적임) 선별한다.
많은 계열의 H1N1 및 H3N2 재배열체가 인간에서 평가되었으며, 만족할만하게 (a) 감염성이고, (b) 혈청반응음성적 어린이 및 면역학적으로 준비된 성인에 대해 약독화되고, (c) 면역원성이며 (d) 유전학적으로 안정한 것으로 밝혀졌다. ca 재분류체의 면역원성은 그의 복제 수준과 필적한다. 따라서, 새로운 야생형 바이러스에 의한 ca 공여자 바이러스의 6개의 전달가능한 유전자의 획득은 감수성 성인 및 어린이를 백신화하는데 사용하기 위한 상기 바이러스를 재현적으로 약독화시켰다.
다른 약독화 돌연변이는 상기 돌연변이체 유전자를 갖는 감염성 바이러스를 구조하는 부위-지정 돌연변이유발에 의해 인플루엔자 바이러스 유전자 내로 도입될 수 있다. 약독화 돌연변이는 게놈의 코딩 영역 내로 뿐만 아니라 비-코딩 영역 내로도 도입될 수 있다. 이러한 약독화 돌연변이는 또한 예를 들어 PB2 중합효소 유전자 (문헌 [Subbarao et al., 1993]) 또는 NS 유전자 내로 도입될 수 있다. 따라서, 새로운 공여자 바이러스는 또한 부위-지정 돌연변이유발에 의해 도입된 약독화 돌연변이를 갖도록 생성될 수 있으며, 이러한 새로운 공여자 바이러스는 A/AA/6/60 ca 공여자 바이러스에 대해 상기 기재된 것과 유사한 방식으로 살아있는 약독화된 H1N1 및 H3N2 재배열체의 생성에 사용될 수 있다.
이러한 약독화된 바이러스는 원래의 임상적 단리체의 것과 실질적으로 유사한 항원 결정자를 코딩하는 바이러스로부터의 유전자를 유지하는 것이 바람직하다. 이는 약독화된 백신의 목적이 바이러스의 원래의 임상적 단리체와 실질적으로 동일한 항원성을 제공하는 반면, 동시에 백신이 백신화된 포유동물에서 심각한 병원성 상태를 유도하는 최소의 변화를 유발하는 정도로 감염성을 없애는 것이기 때문이다.
따라서, 바이러스는 동물, 예를 들어 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 백신과 같이 본 발명에 따라 약독화되거나 불활성화되고, 제제화되거나 투여될 수 있다. 이러한 약독화되거나 불활성화된 백신이 임상적인 단리체 또는 그로부터 유래된 고성장 균주의 것과 유사한 항원성을 유지했는지를 측정하는 방법이 당업계에 널리 공지되어 있다. 이러한 공지된 방법으로는 공여자 바이러스의 항원 결정자를 발현하는 바이러스를 제거하는 항혈청 또는 항체의 사용; 화학적 선택 (예를 들어, 아만타딘 또는 리만티딘); HA 및 NA 활성 및 억제; 및 항원성 결정자를 코딩하는 공여자 유전자 (예를 들어, HA 또는 NA 유전자)가 약독화된 바이러스에 존재하지 않는지를 확인하는 DNA 스크리닝을 들 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Robertson et al., 1988]; [Kilbourne, 1969]; [Aymard-Henry et al., 1985]; [Robertson et al., 1992]을 참조한다.
제약 조성물
접종 또는 비경구 또는 경구 투여에 적합한 본 발명의 제약 조성물은 약독화되거나 불활성화된 인플루엔자 바이러스를 포함하며, 임의로 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 추가로 포함한다. 조성물은 당업계에 공지된 바와 같은 보조제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Berkow et al., 1987]; [Averv's Drug Treatment, 1987]; [Osol, 1980]을 참조한다. 본 발명의 조성물은 일반적으로 개별 투여량 (단위 투여량)의 형태로 제공된다.
통상적인 백신은 일반적으로 그의 조성물 내로 삽입된 각각의 균주로부터의 헤마글루티닌 약 0.1 내지 200 ㎍, 바람직하게는 10 내지 15 ㎍을 함유한다. 본 발명의 백신 조성물의 주요 구성요소를 형성하는 백신은 A, B 또는 C형의 바이러스, 또는 그의 임의의 조합, 예를 들어 3가지 유형 중 2가지 이상, 상이한 아형의 2가지 이상, 동일한 유형의 2가지 이상, 동일한 아형의 2가지 이상, 또는 상이한 단리체(들) 또는 재배열체(들)를 포함할 수 있다. 인간 인플루엔자 바이러스 A형은 H1N1, H2N2 및 H3N2 아형을 포함한다.
비경구 투여용의 제제는 당업계에 공지된 보조제 또는 부형제를 함유할 수 있는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및/또는 에멀젼을 포함한다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성유, 및 에틸 올레에이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르이다. 담체 또는 차단 드레싱은 피부 침투성을 증가시키고 항원 흡수를 증진시키기 위해 사용될 수 있다. 경구 투여용의 액체 투여 형태는 일반적으로 액체 투여 형태를 함유하는 리포좀 용액을 포함한다. 현탁화 리포좀에 적합한 형태로는 정제수와 같은 당업계에 통상적으로 사용되는 불활성 희석제를 함유하는 에멀젼, 현탁액, 용액, 시럽 및 엘릭시르를 들 수 있다. 불활성 희석제 이외에, 이러한 조성물은 또한 아주반트, 습윤화제, 유화제 및 현탁화제, 또는 감미제, 향미제 또는 방향제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Berkow et al., 1992]; [Avery's, 1987]; 및 [Osol, 1980]을 참조한다.
본 발명의 조성물이 개체에게 투여용으로 사용될 경우, 이는 염, 완충제, 아주반트, 또는 조성물의 효능을 개선하는데 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다. 백신에 대해, 아주반트, 특이적 면역 반응을 증강시킬 수 있는 물질이 사용될 수 있다. 통상적으로, 아주반트 및 조성물은 면역계에 제시되기 전에 혼합되거나, 유기체가 면역화되는 동일한 부위 내로 개별적으로 제시된다. 백신 조성물에 사용하기에 적합한 물질의 예는 문헌 [Osol (1980)]에 제공된다.
백신에서 이질성은 2 내지 50 균주 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값과 같은 2개 이상의 인플루엔자 바이러스 균주에 대해 복제된 인플루엔자 바이러스를 혼합함으로써 제공될 수 있다. 현대식 항원성 조성물을 갖는 인플루엔자 A 또는 B 바이러스 균주가 바람직하다. 본 발명에 따르면, 백신은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 인플루엔자 바이러스의 단일 균주에서의 변이체에 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 제약 조성물은 예를 들어 유전자 요법용의 1종 이상의 화학치료 화합물, 면역억제제, 항염증제 또는 면역 증강제, 및 감마 글로불린, 아만타딘, 구아니딘, 히드록시벤지미다졸, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 종양 괴사 인자-알파, 티오세미카르바존, 메티사존, 리팜핀, 리바비린, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 포스카르네트, 포스포노아세트산, 아시클로비르, 디데옥시뉴클레오시드, 프로테아제 억제제 또는 간시클로비르를 포함하나 이에 제한되지 않는 백신용 화학요법제를 추가로 또는 부가적으로 포함할 수 있다.
조성물은 또한 다양하지만 소량의 엔도톡신-무함유 포름알데히드 및 조성물이 투여되는 유기체에 안전하고 바람직하지 않은 효과에 기여하지 않는 보존제를 함유할 수 있다.
제약 목적
조성물 (또는 이것이 유도하는 항혈청)의 투여는 "예방적" 또는 "치료적" 목적용일 수 있다. 예방적으로 제공될 경우, 백신인 본 발명의 조성물은 임의의 병원체 감염의 증상이 나타나기 전에 제공된다. 조성물의 예방적 투여는 임의의 후속 감염을 예방하거나 약독화하는 기능을 한다. 예방적으로 투여될 경우, 본 발명의 유전자 요법 조성물은 임의의 질환 증상이 나타니기 전에 제공된다. 조성물의 예방적 투여는 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 예방하거나 약독화하는 기능을 한다.
치료적으로 제공될 경우, 약독화되거나 불활성화된 바이러스 백신은 실제 감염의 증상의 검출시 제공된다. 화합물(들)의 치료적 투여는 임의의 실제 감염을 약독화하는 기능을 한다. 예를 들어, 문헌 [Berkow et al., 1992] 및 [Avery, 1987]을 참조한다. 치료적으로 투여될 경우, 유전자 요법 조성물은 질환의 증상 또는는 지시의 검출시 제공된다. 화합물(들)의 치료적 투여는 상기 질환의 증상 또는 지시를 약독화하는 기능을 한다.
따라서, 본 발명의 약독화되거나 불활성화된 백신 조성물은 따라서 감염의 개시 전에 (예상되는 감염을 예방하거나 약독화하기 위해) 또는 실제 감염의 개시 후에 제공될 수 있다. 유사하게, 유전자 요법을 위해, 조성물은 장애 또는 질환의 임의의 증상이 나타나기 전, 또는 하나 이상의 증상이 검출된 후에 제공될 수 있다.
조성물은 그의 투여가 수여자 환자에 의해 내성일 수 있을 경우, "약물학적으로 허용되는"으로 지칭된다. 이러한 제제는 투여되는 양이 생리학적으로 유의할 경우 "치료 유효량"으로 투여된다고 지칭된다. 본 발명의 조성물은 그의 존재가 수여자 환자의 생리에 검출가능한 변화를 초래할 경우, 예를 들어 하나 이상의 감염성 인플루엔자 바이러스 균주에 대해 하나 이상의 일차 또는 이차 체액성 또는 세포성 면역 반응을 증진시킬 경우, 생리학적으로 유의하다.
제공된 "예방"은 절대적일 필요가 없으며, 즉 인플루엔자 감염은 환자의 대조군 집단 또는 집합과 비교시 통계학적으로 유의한 개선이 있을 경우, 전체적으로 예방적이거나 근절될 필요가 없다. 예방은 인플루엔자 바이러스 감염의 증상의 개시의 중증도 또는 급속도를 완화하는 것에 제한될 수 있다.
제약 투여
본 발명의 조성물은 수동 면역 또는 능동 면역에 의해 1종 이상의 병원체, 예를 들어 1종 이상의 인플루엔자 바이러스 균주에 내성을 부여할 수 있다. 능동 면역에서, 불활성화되거나 약독화된 살아있는 백신 조성물은 숙주 (예를 들어, 포유동물)에게 예방적으로 투여되며, 투여에 대한 숙주의 면역 반응은 감염 및/또는 질환에 대해 보호된다. 수동 면역에 대해, 유도된 항혈청은 회수되고 1종 이상의 인플루엔자 바이러스 균주에 의해 유발된 감염을 갖는 것으로 의심되는 수여자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 유전자 요법 조성물은 능동 면역에 의해 목적하는 유전자 생성물의 예방적 또는 치료적 수준을 생성할 수 있다.
일 실시양태에서, 백신은 암컷 및 태아 또는 신생아 둘다를 (태반을 통해 또는 모유에서의 항체의 수동 도입을 통해) 예방하는 기능을 하는 면역 반응의 생성을 유도하는데 충분한 시간 및 양의 조건하에서 포유동물 암컷에게 (임신 또는 분만시 또는 전에) 제공된다.
따라서, 본 발명은 장애 또는 질환, 예를 들어 1종 이상의 병원체의 균주에 의한 감염을 에방하거나 약독화하는 방법을 포함한다. 본원에 사용된 백신은 그의 투여가 질환의 증상 또는 상태의 전체적인 또는 부분적인 약독화 (즉, 억제), 또는 질환에 대한 개체의 전체적인 또는 부분적인 면역성을 초래할 경우, 질환을 예방하거나 약독화한다고 지칭된다. 본원에 사용된 유전자 요법 조성물은 그의 투여가 질환의 증상 또는 상태의 전체적인 또는 부분적인 약독화 (즉, 억제), 또는 질환에 대한 개체의 전체적인 또는 부분적인 면역성을 초래할 경우, 질환을 예방하거나 약독화한다고 지칭된다.
본 발명의 1종 이상의 불활성화되거나 약독화된 인플루엔자 바이러스, 또는 그의 조성물은 이전에 기재된 바와 같은 제약 조성물을 사용하여 의도되는 목적을 달성하는 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다.
예를 들어, 이러한 조성물의 투여는 피하, 정맥내, 진피내, 근육내, 복막내, 비내, 경구 또는 경피 경로와 같은 다양한 비경구 경로에 의해서일 수 있다. 비경구 투여는 볼루스 주사 또는 시간 경과에 따른 점진적 관류에 의해서일 수 있다. 본 발명의 제약 조성물을 사용한 바람직한 방식은 근육내 또는 피하 적용에 의해서이다.
인플루엔자 바이러스 관련된 병리증상을 예방, 억제 또는 치료하는 전형적인 처방은 단일 치료로서 투여되거나, 1주 내지 약 24개월 이하의 기간 또는 임의의 범위 또는 그 안의 값에 걸쳐 증진용 또는 추가접종 투여량으로서 반복되는, 본원에 기재된 바와 같은 유효량의 백신 조성물의 투여를 포함한다.
본 발명에 따르면, 조성물의 "유효량"은 목적하는 생물학적 효과를 달성하는데 충분한 것이다. 유효 투여량은 수여자의 연령, 성별, 건강 및 체중, 있을 경우 동시 치료의 종류, 치료의 빈도 및 원하는 효과의 성질에 따라 다를 것이다. 하기 제공된 유효 투여량의 범위는 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 바람직한 투여량 범위를 나타낸다. 그러나, 가장 바람직한 투여량은 당업자에 의해 이해되고 측정가능한 바와 같이 개별 대상체에 맞추어진다. 예를 들어, 문헌 [Berkow et al., 1992]; [Avery's, 1987]; 및 [Ebadi, 1985]을 참조한다.
포유동물 (예를 들어, 인간) 또는 조류 성인 유기체에 대한 약독화된 바이러스 백신의 투여량은 약 103 내지 107 플라크 형성 단위 (PFU)/kg, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값일 수 있다. 불활성화된 백신의 투여량은 헤마글루티닌 단백질 약 0.1 내지 200, 예를 들어 50 ㎍ 범위일 수 있다. 그러나, 투여량은 출발점에서와 같이 기존의 백신을 이용하여 통상적인 방법에 의해 측정된 바와 같은 안전하고 유효한 양이어야 한다.
복제된 바이러스 백신의 각각의 투여량에서 면역반응성 HA의 투여량은 적합한 양, 예를 들어 1 내지 50 ㎍ 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값, 또는 3살 이상의 어린이에 대해 성분당 통상적으로 15 ㎍ 및 3살 미만의 어린이에 대해 성분당 7.5 ㎍인, 미국 보건국 (PHS)에 의해 권고되는 양을 함유하도록 표준화될 수 있다. NA의 양은 또한 표준화될 수 있으나, 상기 당단백질은 프로세서 정제 및 저장 동안 불안정할 수 있다. 백신의 각각의 0.5-mL 투여량은 바람직하게는 대략 10억 내지 500억 바이러스 입자, 바람직하게는 100억 입자를 함유한다.
본 발명은 하기 비-제한적 실시예의 의해 추가로 기재될 것이다.
실시예 1
인플루엔자 A 또는 B 바이러스의 게놈은 8-절편화된 단일 음성 가닥 (C는 7개의 절편만을 가짐)이다. 바이러스 감염, 뿐만 아니라 인플루엔자에 대한 백신을 개발하는 전략에 중요한 유전자 중 2가지는 헤마글루티닌 (HA) 및 뉴라미니다제 (NA) 유전자이다. 숙주 세포로의 유입은 말단 N-아세틸 뉴라민산 (살리실산) 기를 함유하는 점막단백질에의 HA 스파이크의 결합에 의해 용이해진다. 전통적인 인플루엔자 백신은 통상적으로 "무해한" 주 균주로부터의 6개의 다른 유전자와 함께 HA 및 NA 유전자를 결합시킴으로써 제조된다. 상기 공정은 매우 시간 소모적이며, 종종 백신 개발 동안 역가가 낮아지는 경향이 있다. 역 유전학에 의해 합성 인플루엔자 바이러스를 생성하는 방법론은 바이러스를 제조하는데 사용되었으며, 예를 들어, 재조합 바이러스는 병원체성 균주로부터의 HA 및 NA 유전자를 함유하며, 주 균주로부터의 6개의 유전자가 집합된다. 특히, 상기 클로닝된 유전자는 추가의 플라스미드에서 코딩된 복제 및 전사에 필요한 단백질 (중합효소 PB2, PB1, PA 및 NP)과 함께 세포주 내로 형질감염된다. 그 후, 살아있는 약독화된 바이러스를 백신 생성을 위해 수거한다.
재료 및 방법
세포. 293T 인간 배아 신장 세포 및 아프리카 녹색 원숭이 신장 (베로) 세 포를 10％ FCS가 보충된 DMEM에서 유지하였다. 모든 실험에 대해, 이전에 사용된 베로 CCL-81 세포를 사용하여 불활성화된 일본 뇌염 백신을 생성하고, 종양형성 및 우발성 감염성 작용물질의 부재에 대해 스크리닝하였다 (문헌 [Sugawara et al., 2002]). 마딘-다비 개 신장 (MDCK) 세포를 5％ NCS를 함유하는 MEM에서 유지하였다. 모든 세포를 37℃에서 5％ CO2에서 유지하였다.
플라스미드의 제작. 인플루엔자 바이러스 RNA 절편 합성용 RNA 중합효소 I 전사 카세트를 결합시키기 위해, 인간 RNA 중합효소 I 프로모터, 음성-센스 배향의 인플루엔자 바이러스 cDNA, 및 마우스 RNA 중합효소 I 종결자를 포함하는 전사 카세트 (문헌 [Neumann et al., 2002])를, 바이러스 게놈에 존재하지 않는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드로 PCR에 의해 증폭하였다. 주형으로서, RNA 중합효소 I 프로모터 및 종결자 서열 사이에 위치된 A/WSN/33 (H1N1) 바이러스의 각각의 바이러스 cDNA를 함유하는 pPolI-WSN-PB2, -PB1, -PA, -HA, -NP, -NA, -M, -NS (모두 문헌 [Neumann et al., 2002]에 기재됨)를 사용하였다. PCR 생성물을 각각의 제한 부위를 함유하는 표준 벡터 내로 클로닝하고, 시퀀싱하여 이들이 원하지 않는 돌연변이가 없는지를 확인하였다. 생성된 플라스미드의 기능성을 역 유전학에 의해 확인하였다.
플랭킹된 고유한 제한 부위를 갖는 변형된 pTM1 벡터 (문헌 [Moss et al., 1990])를 사용하여 개별 RNA 중합효소 I 전사 카세트를 단계식으로 결합시켰다 (상기 벡터는 하기에 보다 상세히 기재됨). 각각의 클로닝 단계에서, 2 내지 7개의 RNA 중합효소 I 전사 유닛을 함유하는 생성된 플라스미드의 기능성을 역 유전학에 의해 확인하였다. 최종 플라스미드인 pPolI-WSN-All (도 3A)은 모든 8개의 인플루엔자 A/WSN/33 바이러스 RNA의 합성용의 8개의 RNA 중합효소 I 전사 카세트를 함유하였다. 상기 플라스미드를 실온에서 이. 콜라이(E. coli) JM 109 세포에서 안정하게 유지하였으며, 박테리아 배양물을 테리픽 브로쓰(Terrific Broth) 배지에서 대략 30시간 동안 성장시켰다.
동일한 전략을 이용하여, HA 및 NA 절편, 및 남아있는 6개의 바이러스 절편 (즉, PB2, PB1, PA, NP, M 및 NS)에 대한 RNA 중합효소 I 전사 카세트를 함유하는 2가지 플라스미드 (각각 pTM-PolI-WSN-HA-NA 및 pTM-PolI-WSN-PB2-PB1-PA-NP-M-NS)를 각각 생성하였다 (도 3B).
플라스미드 pCAWSPB2, pCAWSPB1 및 pCAWSPA는 닭 β-액틴 프로모터, A/WSN/33 PB2, PB1 또는 PA 단백질의 코딩 서열 및 아데닐중합 신호를 유도하엿다. 상기 RNA 중합효소 II 전사 유닛은 PCR에 의해 또는 짧은 DNA 링커를 삽입함으로써 고유한 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열에 플랭킹되었다. PCR-증폭된 전사 카세트를 그의 전체로 시퀀싱한 후, 3가지 RNA 중합효소 II 전사 카세트를 고유한 제한 부위를 사용하여 결합시켰다. 생성된 플라스미드 (pC-PolII-WSN-PB2-PB1-PA, 도 3C)의 기능성을 역 유전학에 의해 입증하였다.
플라스미드로부터의 바이러스의 생성. 293T 세포 (1 x 106) 또는 베로 CCL-81 세포 (5 x 105)를 트랜스(Trans) IT-LT1 (위스콘신주 매디슨에 소재하는 미니 스(Minis))을 사용하여 제조업자의 지시에 따라 형질감염시켰다. 간략히, 형질감염 시약 (293T 세포의 형질감염에 대해 DNA ㎍ 당 트랜스 IT-LT1 2 ㎕; 베로 세포의 형질감염에 대해 DNA ㎍ 당 트랜스 IT-LT1 4 ㎕)를 옵티(Opti)-MEM (지브코 비알엘(GIBCO BRL)) 100 ㎕에 희석하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하고, 예비-혼합된 DNA에 첨가하였다. 모든 형질감염 실험에 대해, 바이러스 RNA 합성용의 각각의 '단위 유닛' 플라스미드 (즉, pPolI-WSN-PB2, -PB1, -PA, -HA, -NP, -NA, -M, -NS; 문헌 [Neumann et al. (1999)]에 기재됨) 0.1 ㎍, 1종 이상의 RNA 중합효소 I 전사 유닛을 함유하는 플라스미드 (즉, pTM-PolI-WSN-All, pTM-PolI-WSN-HA-NA, 또는 pTM-PolI-WSN-PB2-PB1-PA-NP-M-NS) 1 ㎍, 및 각각의 단백질 발현 플라스미드 1 ㎍을 사용하였다. 형질감염 후 지시된 시간에, MDCK 세포에서 50％ 조직 배양물 감염성 투여량 (TCID50)을 측정하였다.
결과
다중 RNA 중합효소 I 또는 II 전사 카세트를 함유하는 플라스미드. 8 내지 12개 미만의 플라스미드로부터 인플루엔자 바이러스를 생성하기 위해 (문헌 [Neumann et al., 1999]; [Hoffmann et al., 2000]; [Fodor et al., 1999]), 바이러스 RNA (vRNA) 합성용의 RNA 중합효소 I 전사 카세트, 또는 mRNA 합성용의 RNA 중합효소 II 전사 카세트를 하나의 플라스미드 상에 결합시켰다. 모델로서, 바이러스 생성의 파라미터 및 효율이 널리 수립된 A/WSN/33 (WSN) 바이러스를 사용하였다. 간략히, 인간 RNA 중합효소 I 프로모터, 음성- 센스 배향의 인플루엔자 바이 러스 cDNA, 및 마우스 RNA 중합효소 I 종결자를 포함하는 RNA 중합효소 I 전사 카세트를 PCR에 의해 증폭하고, 클로닝하고, 시퀀싱한 후, 고유한 제한 부위를 사용하여 단계식으로 결합시켰다. 벡터 골격으로서, 20 kb의 에볼라(Ebola) 바이러스 cDNA를 안정하게 지지하며 따라서 큰 DNA 단편의 삽입에 안정한, 변형된 pTM1 벡터 (문헌 [Moss et al., 1990])를 사용하였다. 8개의 개별 RNA 중합효소 I 전사 유닛을 함유하는 pTM-PolI-WSN-All (도 3A; 길이 약 22.5 kb)의 생성은 주요한 장애를 나타내지 않았지만, 이. 콜라이 JM 109 박테리아의 실온에서의 성장은 상기 플라시미드의 재조합의 방지를 필요로 하였다.
인플루엔자 바이러스 백신의 연간 생성을 위해, 단지 2가지의 바이러스 RNA 절편, 즉, 헤마글루티닌 (HA) 및 뉴라미니다제 (NA) 표면 당단백질을 코딩하는 것들은 대체될 필요가 없다. 상기 이유 때문에, HA 및 NA 절편에 대한 전사 유닛이 결합된 플라스미드를 생성한 반면 (pTM-PolI-WSN-HA-NA) (도 3B), 제2 플라스미드에는 내부 단백질을 코딩하는 전사 유닛이 결합되었다 (pTM-PolI-WSN- PB2-PB1 -PA-NP-M-NS) (도 3B). 상기 플라스미드 둘다는 37℃에서 이. 콜라이 JM109 박테리아에서의 증폭 동안 안정하였다.
바이러스 생성에 필요한 플라스미드의 수를 추가로 감소시키기 위해, WSN PB2, PB1 및 PA 단백질에 대한 3가지 RNA 중합효소 II 전사 유닛을 vRNA 합성용의 RNA 중합효소 I 전사 유닛의 결합을 가능하게 한 것과 동일한 전략을 이용하여 하나의 벡터 골격 상에 결합시켰다. 생성된 플라스미드는 37℃에서 이. 콜라이 JM109 박테리아에서 안정하였다; 이는 pC-PolII-WSN-PB2-PB1-PA로 소화되었다 (도 3C). 주목할 것은, 중합효소 단백질 및 NP에 대한 RNA 중합효소 II 전사 유닛을 결합시키는 플라스미드는 회수할 수 없었다.
다중 전사 카세트를 함유하는 플라스미드로부터의 293T 세포의 바이러스 생성. 다중 전사 카세트를 함유하는 플라스미드의 기능성을 시험하기 위해, 293T 세포를 pTM-PolI-WSN-All (모든 8개의 vRNA의 전사용) (표 1, 컬럼 2 및 3), 또는 pTM-PolI-WSN-HA-NA 및 pTM-PolI-WSN-PB2-PB1-PA-NP-M-NS (2개 및 6개의 vRNA 용) (표 1, 컬럼 7 및 8)로 형질감염시켰다. 세포를 4개의 NP 발현용 플라스미드 및 개별 플라스미드로부터의 중합효소 서브유닛 (표 1, 컬럼 2 및 7)으로, 또는 각각 NP, 또는 PB2, PB1 및 PA를 발현하는 2개의 플라스미드 (표 1, 컬럼 3 및 8)로 형질감염시켰다. 바이러스는 상기 플라스미드로부터 성공적으로 생성되었으며, 이는 RNA 중합효소 I 또는 RNA 중합효소 II 전사 유닛이 결합될 수 있으며, 따라서 인플루엔자 바이러스의 인공적인 생성에 필요한 플라스미드의 수를 감소시킬 수 있음을 입증한다. 형질감염 후 48시간에, 바이러스의 생성 효율은 2 x 107 내지 2.7 x 108 TCID50/mL (표 1, 컬럼 2, 3, 7, 8: 평균 = 1.1 x 108 TCID50/mL) 범위였다. 상기 효율은 세포가 8개의 인플루엔자 vRNA의 전사용 개별 플라스미드, 및 4개 또는 2개의 NP의 합성용 플라스미드, 및 3개의 중합효소 서브유닛으로 형질감염된 대조 실험에 대해 수득된 것 (표 1, 컬럼 9 및 10, 6.3 x 106 내지 1.3 x 108 TCID50/mL; 평 균 = 5.5 x 107 TCID50/mL)보다 약간 높았다 (p = 0.17).
가장-형질감염 (표 1, 컬럼 14), 단백질 발현 플라스미드만으로 형질감염된 세포 (표 1, 컬럼 11 and 12), vRNA 합성용의 8개의 플라스미드만으로 형질감염된 세포 (표 1, 컬럼 13), 또는 각각 2개 또는 6개의 vRNA의 합성용의 플라스미드로 형질감염된 세포 (각각 표 1, 컬럼 4 또는 5)를 비롯한 많은 대조 실험을 또한 수행하였다. 상기 대조군 중 어느 것도 바이러스를 생성하지 않았다. 그러나, 뚜렷한 바이러스 역가가 pTM-PolI-WSN-All (표 1, 컬럼 1), 또는 pTM-PolI-WSN-HA-NA 및 pTM-PolI-PB2-PB1-PA-NP-M-NS의 조합물 (표 1, 컬럼 6)로 형질감염된 세포에서 검출되었다. 상기 플라스미드는 음성-센스 바이러스 RNA의 전사를 위해 소화되었으며, 3가지 중합효소 단백질은 예상되지 않았다. 따라서, 상기 플라스미드만을 사용한 바이러스 생성은 예상되지 않았다 (가능한 설명에 대해서는 하기 참조).
Figure 112007043816564-PCT00001
293T 세포를 지시된 플라스미드로 형질감염시켰다. 48시간 후, 상청액의 바이러스 역가를 MDCK 세포에서의 플라크 분석에 의해 측정하였다. 3가지 독립적인 실험의 결과가 나타나 있다. '8 유닛' 플라스미드: pTM-PolI-WSN-All; '6 유닛' 플라스미드: pTM-PolI-WSN-PB2-PB1-PA-NP-M-NS; '2 유닛' 플라스미드: pTM-PolI-WSN HA-NA; 8 x 1 유닛 플라스미드: pPolI-WSN-PB2, -PB1, -PA, -HA, -NP, -NA, -M, -NS의 조합물; p.t.: 형질감염 후.
다중 전사 카세트를 함유하는 플라스미드로부터의 베로 세포의 바이러스 생성. 다음으로, 고효율로 형질감염되기 어려운 베로 세포에서 바이러스 생성의 효율을 시험하였다. 형질감염 후 48시간에, 12개의 플라스미드로부터의 바이러스 생성은 2가지 실험에서 무시할 만하였고, 1가지 실험에서는 낮은 반면 (표 2, 컬럼 9), 형질감염 후 72시간에, 바이러스는 모든 3가지 실험에서 검출되었다. 1개 또는 2개의 바이러스 RNA 합성용 플라스미드만을 사용한 것은 특히 pC-PolII-WSN-PB2-PB1-PA와의 조합물에서 형질감염 후 72시간에 바이러스 생성의 효율을 증가시켰으며, 값은 2.5 x 106 TCID50/mL 이하였다 (표 2, 컬럼 9 대 3: p = 0.0017; 컬럼 9 대 8: p = 0.0063). 결과적으로, 플라스미드 pC-PolII-WSN-PB2-PB1-PA로부터의 3가지 중합효소 단백질의 발현은 개별 플라스미드로부터의 상기 단백질을 제공하는 것에 비해 보다 효과적인 바이러스 생성을 초래하였다 (표 2, 컬럼 2 및 3 (p = 0.0054), 컬럼 7 및 8 (p = 0.028) 및 컬럼 9 및 10 (p = 0.2) 비교). 바이러스는 플라스미드 pTM-PolI-WSN-All에서 (표 2, 컬럼 1), 또는 플라스미드 pTM-PolI-WSN-PB2-PB1-PA-NP-M-NS 및 pTM-PolI-WSN-HA-NA (표 2, 컬럼 6)에서만 검출되었지만, 바이러스 생성은 결과적으로 관찰되지 않았으며, 생성된 바이러스 역가는 낮았다. 이는 베로 세포의 낮은 형질감염 효율 때문일 것이다. 함께 고려하면, 상기 결과는 다중 RNA 중합효소 I 또는 II 전사 유닛을 함유하는 플라스미드가 베로 세포에서 바이러스를 생성하는데 매우 효과적일 수 있음을 나타낸다.
Figure 112007043816564-PCT00002
베로 세포를 지시된 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 후 48시간 또는 72시간에, 상청액의 바이러스 역가를 MDCK 세포에서의 플라크 분석에 의해 측정하였다. 3가지 독립적인 실험의 결과가 나타나 있다. '8 유닛' 플라스미드: pTM-PolI-WSN-All; '6 유닛' 플라스미드: pTM-PolI-WSN-PB2-PB1-PA-NP-M-NS; '2 유닛' 플라스미드: pTM-PolI-WSN HA-NA; 8 x 1 유닛 플라스미드: pPolI-WSN-PB2, -PB1, -PA, -HA, -NP, -NA, -M, -NS의 조합물; p.t.: 형질감염 후.
토의
백신 바이러스의 생성은 현재 역 유전학에 의해 달성될 수 있다. 사실, 이는 고도로-병원체성 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 백신 균주의 생성에 대해서만 효과적인 접근법이다. 상기 바이러스는 인간 및 배아 달걀에 치명적이며 (문헌 [Shortridge et al., 1998]); 따라서, 예를 들어 그의 HA 절단 부위 서열의 변화에 의한 약독화 (문헌 [Horimoto et al., 1994]; [Subbarao et al., 2003])는 에어로졸화된 바이러스에 대한 노출에 대해 백신 생성 스태프를 보호하면서 배아 달걀에서 높은 역가로 성장을 보장하는데 중요하다. 인간 용도를 위해, 백신 균주의 생성은 종양형성 및 우발성 감염성 작용물질이 없는 것이 중요한 세포주를 필요로 할 것이다. 이러한 세포주 중 하나는 현재 광견병 및 폴리오 백신의 생성에 사용되는 베로 세포주이다 (문헌 [Montagnon et al., 1999]). '12 플라스미드' 접근법을 사용하여, 문헌 [Fodor et al. (1999)]은 형질감염 4일 후에 107 베로 세포로부터의 10 내지 20 플라크 형성 유닛의 생성을 보고하였다. 문헌 [Wood and Robertson (2004)]은 역 유전학에 의해 베로 세포에서 H5N1 참조 백신 균주를 생성하였지만, 구조 효율은 보고하지 않았던 반면, A/PR/8/34 (H1N1) 또는 A/PR/8/34-기재 바이러스는 103 pfu/mL의 효율로 베로 세포에서 생성되었다 (문헌 [Ozaki et al., 2004]). RNA 중합효소 I 및/또는 II 전사 유닛을 결합시켜 소수의 플라스미드로부터 바이러스 구조를 달성함으로써, 본 발명자들은 형질감염 3일 후에 5 x 105 베로 세포에서 약 105 내지 106 TCID50/mL을 생성할 수 있었다. 그에 의해, '12 플라스미드' 접근법에 비해 보다 효과적인 바이러스 생성이 상기 시스템으로 베로 세포에서 달성되었다 (표 2, 컬럼 3 또는 8과 컬럼 9 비교). 따라서, 이러한 강력하고 높은 효율의 역 유전학 시스템은 광역유행병 상황에서 백신 균주의 급속한 제조에 유리할 수 있었다.
인플루엔자 바이러스 생성은 중합효소 및 NP 단백질의 발현에 의존한다. 하나의 플라스미드 상에 중합효소 서브유닛을 결합시키는 것은 바이러스 생성의 효율을 증진시켰다. 이러한 발견은 바이러스 구조에 사용되는 플라스미드 수의 감소에 의해 설명될 수 있거나, 3개의 전사 유닛의 결합은 감염된 세포에서 발견되는 중합효소 서브유닛의 등몰 비율을 보다 가깝게 반영할 수 있다.
하나의 플라스미드 상에 동일한 프로모터 및 종결자 유닛을 결합시키는 것은 재조합을 유발하는 것으로 여겨진다. 그러나, 본원에서, 8개의 RNA 중합효소 I, 또는 3개의 RNA 중합효소 II 프로모터 및 종결자 서열은 하나의 벡터 골격에서 결합될 수 있음이 입증되었다. 문헌 [Hoffmann et al. (2000)]은 RNA 중합효소 I 및 II 프로모터의 조합물이 하나의 주형으로부터 vRNA 및 mRNA 합성을 가능하게 함을 입증하였다. 따라서, PB2, PB1, PA 및 NP vRNA 및 mRNA의 합성용의 4개의 RNA 중합효소 I/II 전사 유닛 및 NA, HA, M 및 NS vRNA의 합성용의 4개의 RNA 중합효소 I 전사 유닛을 함유하는 플라스미드를 설계할 수 있다. 이러한 구조물은 하나의 플라스미드로부터 인플루엔자 바이러스의 효과적인 생성을 가능하게 해야 한다. 더욱이, 하나의 플라스미드 상에 전사 유닛을 결합시키는데 있어서 본원에 기재된 성공은 다른 이들이 몇몇 플라스미드를 사용한 세포의 공동형질감염에 의존하는 다른 역 유전학 시스템에 상기 전략을 적용하거나, 하나의 플라스미드로부터 몇몇 단백질의 동시 발현용의 벡터를 설계하는 것에 대한 동기를 제공할 수 있다.
놀랍게도, 바이러스 생성은 단일 플라스미드, 즉 pTM-PolI-WSN-All로부터 관찰되었다. 상기 플라스미드로부터의 인플루엔자 바이러스 단백질의 발현은 벡터, 또는 RNA 중합효소 I 프로모터 또는 종결자 영역에 존재하는 (암호성) RNA 중합효소 II 프로모터로부터 단백질 합성을 암시한다. RNA 중합효소 I 프로모터 서열이 상류 전사 카세트로부터 잠재적으로 단백질 발현을 유도할 수 있는 반대 방향의 프로모터를 갖는지를 측정하기 위해, 본 발명자들은 리포터 유전자의 앞에서 전도된 RNA 중합효소 I 프로모터를 클로닝하였지만, 상당한 수준의 리포터 유전자 발현은 상기 플라스미드로부터 검출되지 않았다 (데이타는 도시하지 않음). 인플루엔자 바이러스의 생성은 4가지 상이한 단백질 (PB2, PB1, PA 및 NP)의 발현에 의존하며, 따라서, 몇몇 통독 이벤트를 필요로 할 것이다. 별법으로, 단백질 발현은 번역의 내부 개시와 같은 또다른 메카니즘으로부터 초래될 수 있다. f1 단일-가닥 DNA 복제 원점, 암피실린 저항성 유전자, 다중 클로닝 부위 및 T7 RNA 중합효소 전사 종결자를 함유하는 변형된 pTM1 (문헌 [Moss et al., 1990]) 벡터가 사용되었다. 원래의 pTM1 클로닝 벡터에 존재하는 EMCV 비번역된 영역 및 티미딘 키나제 서열의 강한 T7 RNA 중합효소 프로모터 및 일부는 상기 변형된 형태로부터 제거되었다. 따라서, 상기 벡터로부터의 중합효소 및 NP 단백질의 단백질 합성은 예상되지 않았다. 그럼에도 불구하고, 음성-가닥 RNA만을 생성하도록 설계된 플라스미드로부터의 인플루엔자 바이러스의 생성은 흥미로우며 추가로 연구할 가치가 있다.
요약하자면, 여기서, 베로 세포에서 백신 바이러스의 용이하고 재현가능한 생성을 가능하게 하는 인플루엔자 바이러스의 생성을 위한 개선된 시스템이 본원에 기재된다. 상기 시스템의 적용은 고도로 병원체성인 조류 인플루엔자 바이러스의 발생 상황에서 특히 유리하다.
실시예 2
재조합 바이러스 생성을 개선하기 위해, 한 가지 접근법은 모든 8개의 바이러스 유전자를 플라스미드 내로 코딩하는 cDNA를 클로닝하는 것이다. 따라서, 8개의 플라스미드로부터 8개의 바이러스 RNA를 생성하는 대신, 바이러스 RNA의 합성용의 전사 유닛을 하나의 플라스미드 상에 결합시킬 수 있으며, 따라서, 모든 8개의 바이러스 RNA는 하나의 플라스미드로부터만 제조되고, 이는 보다 적은 플라스미드로부터의 바이러스 구조를 가능하게 한다. 또한, 바이러스 단백질의 합성용의 전사 유닛은 보다 적은 플라스미드 상에서 결합될 수 있다. 모든 8개의 바이러스 유전자가 하나의 플라스미드에 유사하게 위치될 경우, 인플루엔자 바이러스 합성에 필요한 플라스미드의 수는 5개이다 (모든 바이러스 유전자에 대해 1개의 플라스미드, 및 PB2, PB1, PA 및 NP를 코딩하는 유전자에 대해 4개의 플라스미드). 별법으로, 각각의 유전자가 RNA 중합효소 II 프로모터 및 아데닐중합 신호에 플랭킹된 PB2, PB1, PA 및 NP 유전자를 하나의 플라스미드 내로 결합시킬 수 있다. 다른 조합물은 각각 PolI 프로모터를 갖는 6개의 바이러스 유전자를 갖는 1개의 플라스미드, 각각 PolII 프로모터를 갖는 3개의 바이러스 유전자를 갖는 1개의 플라스미드, 및 각각 PolI 프로모터를 갖는 2개의 바이러스 유전자 (HA 및 NA)를 갖는 1개의 플라스미드를 포함할 수 있다.
바이러스 유전자는 일부 실시양태에서 RNA 중합효소 I 프로모터 및 종결자 서열에 플랭킹되어 전사 유닛 (또는 카세트)를 형성하며, 그 후, 전사 카세트는 RNA 중합효소 II 프로모터 및 종결 신호 (아데닐중합 신호)에 플랭킹된다 (도 4). 상기 접근법은 동일한 유전자로부터 RNA 중합효소 I에 의해 합성된 게놈 음성 가닥 RNA, 및 RNA 중합효소 II에 의해 합성된 mRNA 둘다를 생성한다.
따라서, 본 발명은 형질감염을 위한 플라스미드의 수를 12개로부터 5개 또는 그 이하, 예를 들어 4, 3, 2 또는 1개로 감소시키며, 매우 약독화된 바이러스의 생성을 가능하게 하는 세포주로부터의 바이러스의 구조 효율을 증가시키고, 백신 생성을 위한 인플루엔자 바이러스의 일정한 생성을 가능하게 하고/거나 플라스미드 내력, 순도 및 독성에 관한 FDA 규제 문제를 감소시킨다.
참고문헌
Figure 112007043816564-PCT00003
Figure 112007043816564-PCT00004
Figure 112007043816564-PCT00005
모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 본원에 참고로 도입된다. 상기 명세서에서 본 발명은 그의 특정 바람직한 실시양태에 대해 기재되고, 많은 세부사항은 예시의 목적으로 설명되었지만, 본 발명은 추가의 실시양태에 대한 여지가 있으며, 본원에 기재된 특정 세부사항은 본 발명의 기본적인 원리로부터 벗어나지 않고 상당히 변형될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.

Claims (49)

  1. a) PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및/또는 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트로부터 선택된 2개 이상의 vRNA 생성용 전사 카세트를 포함하는 하나 이상의 플라스미드; 및
    b) PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolII 전사 종결 서열에 연결된 인 플루엔자 바이러스 PB2에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및/또는 PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트로부터 선택된 하나 이상의 mRNA 생성용 전사 카세트를 포함하는 하나 이상의 플라스미드를 포함하며, 조성물이 8개의 vRNA 생성용 전사 카세트를 포함하고, 조성물을 사용한 세포의 형질감염의 역가가 1 x 102 TCID50/mL 이상인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 8개 미만의 플라스미드로부터 인플루엔자 바이러스를 생성하기 위한 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나의 플라스미드가 8개의 vRNA 생성용 전사 카세트를 갖는 것인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 하나의 플라스미드가 1개의 mRNA 생성용 전사 카세트를 갖고, 또다른 플라스미드가 3개의 mRNA 생성용 전사 카세트를 갖는 것인 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 4개의 mRNA 생성용 플라스미드를 갖는 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나의 플라스미드가 6개의 vRNA 생성용 전사 카세트를 갖고, 또다른 플라스미드가 2개의 vRNA 생성용 전사 카세트를 갖는 것인 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 하나의 플라스미드가 1개의 mRNA 생성용 전사 카세트를 갖고, 또다른 플라스미드가 3개의 mRNA 생성용 전사 카세트를 갖는 것인 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 4개의 mRNA 생성용 플라스미드를 갖는 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나의 플라스미드가 1개의 mRNA 생성용 전사 카세트를 갖고, 또다른 플라스미드가 3개의 mRNA 생성용 전사 카세트를 갖는 것인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 4개의 mRNA 생성용 플라스미드를 갖는 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 종결 서열에 연결된 3' 인플루엔자 바이러스 비코딩 서열을 포함하는 3' 인플루엔자 바이러스 서열에 연결된 당해 DNA에 연결된 5' 인플루엔자 바이러스 비코딩 서열을 포함하는 5' 인플루엔자 바이러스 서열에 연결된 프로모터를 포함하는 전사 카세트를 추가로 포함하는 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 당해 DNA를 포함하는 전사 카세트가 vRNA 생성용 전사 카세트와 상이한 플라스미드 상에 있는 것인 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 당해 DNA를 포함하는 전사 카세트가 mRNA 생성용 전사 카세트와 상이한 플라스미드 상에 있는 것인 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 당해 DNA를 포함하는 전사 카세트가 vRNA 생성용 전사 카세트 중 하나를 갖는 플라스미드 상에 있는 것인 조성물.
  15. 제11항에 있어서, 당해 DNA를 포함하는 전사 카세트가 mRNA 생성용 전사 카세트 중 하나를 갖는 플라스미드 상에 있는 것인 조성물.
  16. PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인 플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및/또는 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트로부터 선택된 2개 이상의 vRNA 생성용 전사 카세트를 포함하는 하나 이상의 플라스미드를 포함하며, 조성물이 6개 이상의 vRNA용 전사 카세트를 포함하고, 조성물이 8개의 vRNA용 전사 카세트를 포함하며, 조성물을 사용한 세포의 형질감염의 역가가 1 x 102 TCID50/mL 이상인 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 8개 미만의 플라스미드로부터 인플루엔자 바이러스를 생성하기 위한 조성물.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 하나의 플라스미드가 8개의 vRNA 생성용 전사 카세트를 갖는 것인 조성물.
  19. 제16항 또는 제17항에 있어서, 하나의 플라스미드가 6개의 vRNA 생성용 전사 카세트를 갖고, 또다른 플라스미드가 2개의 vRNA 생성용 전사 카세트를 갖는 것인 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 1개의 mRNA 생성용 전사 카세트를 갖는 하나의 플라스미드, 및 3개의 mRNA 생성용 전사 카세트를 갖는 또다른 플라스미드를 추가로 포함하는 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 4개의 mRNA 생성용 플라스미드를 추가로 포함하는 조성물.
  22. 제16항에 있어서, 1개의 mRNA 생성용 전사 카세트를 갖는 하나의 플라스미드, 및 3개의 mRNA 생성용 전사 카세트를 갖는 또다른 플라스미드를 추가로 포함하는 조성물.
  23. 제16항에 있어서, 4개의 mRNA 생성용 플라스미드를 추가로 포함하는 조성물.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 종결 서열에 연결된 3' 인플루엔자 바이러스 비코딩 서열을 포함하는 3' 인플루엔자 바이러스 서열에 연결된 당해 DNA에 연결된 5' 인플루엔자 바이러스 비코딩 서열을 포함하는 5' 인플루엔자 바이러스 서열에 연결된 프로모터를 포함하는 전사 카세트를 추가로 포함하는 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 당해 DNA를 포함하는 전사 카세트가 vRNA 생성용 전사 카세트와 상이한 플라스미드 상에 있는 것인 조성물.
  26. 제24항에 있어서, 당해 DNA를 포함하는 전사 카세트가 vRNA 생성용 전사 카세트 중 하나를 갖는 플라스미드 상에 있는 것인 조성물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, HA가 A형 HA인 조성물.
  28. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, HA가 B형 HA인 조성물.
  29. 세포를 유효량의 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 조성물과 접촉시켜 감염성 인플루엔자 바이러스를 수득하는 것을 포함하는, 인플루엔자 바이러스의 제조 방법.
  30. 세포를, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및/또는 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트로부터 선택된 2개 이상의 vRNA 생성용 전사 카세트를 포함하는 플라스미드; 및 PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및/또는 PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트로부터 선택된 하나 이상의 mRNA 생성용 전사 카세트를 포함하는 플라스미드와 접촉시키는 것을 포함하며, 세포가 8개의 vRNA용 전사 카세트와 접촉되고, 세포가 1 x 102 TCID50/mL 이상의 역가를 생성하는 것인, 인플루엔자 바이러스의 제조 방법.
  31. 세포를, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연 결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트를 포함하는 vRNA 생성용 전사 카세트를 포함하는 플라스미드와 접촉시키는 것을 포함하며, 세포가 8개의 VRNA용 전사 카세트와 접촉되고, 세포가 1 x 102 TCID50/mL 이상의 역가를 생성하는 것인, 인플루엔자 바이러스의 제조 방법.
  32. 세포를 2개의 플라스미드와 접촉시키는 것을 포함하며, 2개의 플라스미드가 함께, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트를 포함하며, 세포가 8개의 vRNA용 전사 카세트와 접촉되고, 세포가 1 x 102 TCID50/mL 이상의 역가를 생성하는 것인, 인플루엔자 바이러스의 제조 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 고도로 형질감염가능한 세포인 방법.
  34. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 베로(Vero) 세포인 방법.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, HA가 A형 HA인 방법.
  36. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, HA가 B형 HA인 방법.
  37. 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스를 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  38. 제30항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 종결 서열에 연결된 3' 인플루엔자 바이러스 비코딩 서열을 포함하는 3' 인플루엔자 바이러스 서열에 연결된 당해 DNA에 연결된 5' 인플루엔자 바이러스 비코딩 서열을 포함하는 5' 인플루엔자 바이러스 서열에 연결된 프로모터를 포함하는 전사 카세트를 추가로 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 당해 DNA가 양성 센스 배향인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 당해 DNA가 음성 센스 배향인 방법.
  41. 제38항에 있어서, 당해 DNA가 병원체의 면역원성 폴리펩티드 또는 펩티드 또는 치료용 폴리펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 것인 방법.
  42. 제30항 내지 제36항 및 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스를 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  43. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 조성물과 접촉된 세포.
  44. PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트를 포함하며, 플라스미드를 사용한 세포의 형질감염의 역가가 1 x 102 TCID50/mL 이상인, 인플루엔자 바이러스 생성용 플라스미드.
  45. PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및/또는 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트를 포함하며, HA 및 NA의 vRNA 생성용 플라스미드 및 전사 카세트를 사용한 세포의 형질감염의 역가가 1 x 102 TCID50/mL 이상인, vRNA 생성용 플라스미드.
  46. PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 및 PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트를 포함하며, PA, PB1, PB2, NP, M 및 NS의 vRNA 생성용 플라스미드 및 전사 카세트를 사용한 세포의 형질감염의 역가가 1 x 102 TCID50/mL 이상인 vRNA 생성용 플라스미드.
  47. PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolII 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2에 대한 DNA 코딩 영역에 작동적으로 연결된 PolII 프로모터를 포함하는 전사 카세트를 포함하며, 플라스미드가 NP를 코딩하지 않는 것인, mRNA 생성용 플라스미드.
  48. PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, PolI 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동적으로 연결된 PolI 프로모터를 포함하는 전사 카세트, 인플루엔자 바이러스 PA에 대한 DNA 절편에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트, 인플루엔자 바이러스 PB1에 대한 DNA 절편에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트, 인플루엔자 바이러스 PB2에 대한 DNA 절편에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트, 및 인플루엔자 바이러스 NP에 대한 DNA 절편에 각각 작동적으로 연결된 PolI 프로모터 및 PolI 전사 종결 서열 및 PolII 프로모터 및 PolII 전사 종결 서열을 포함하는 전사 카세트를 포함하는, 인플루엔자 바이러스 생성용 플라스미드.
  49. 세포를 유효량의 제44항 또는 제48항의 플라스미드와 접촉시켜 감염성 인플루엔자 바이러스를 수득하는 것을 포함하는, 인플루엔자 바이러스의 제조 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101323582B1 (ko) * 2011-03-17 2013-10-30 충북대학교 산학협력단 Ｖｅｒｏ 세포 유래의 ｐｏｌⅠ 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ543446A (en) * 2003-05-28 2008-06-30 Wisconsin Alumni Res Found High titer recombinant influenza viruses for vaccines and gene therapy
CA2587510A1 (en) 2004-11-19 2007-04-19 Wisconsin Alumni Research Foundation Recombinant influenza vectors with tandem transcription units
EP2010557B1 (en) 2006-03-31 2014-02-26 Wisconsin Alumni Research Foundation High titer recombinant influenza viruses for vaccines
WO2008141226A2 (en) * 2007-05-10 2008-11-20 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacteria comprising vectors for expression of nucleic acid sequences encoding antigens
WO2009025888A2 (en) 2007-05-10 2009-02-26 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Regulated synthesis of antigen and/or regulated attentuation to enhance vaccine immunogenics and/or safety
US9474798B2 (en) 2007-06-18 2016-10-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Influenza M2 protein mutant viruses as live influenza attenuated vaccines
EP2045323A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-08 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Linear expression constructs for production of influenza virus particles
WO2009046449A1 (en) 2007-10-05 2009-04-09 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacterium capable of eliciting an immune response against enteric pathogens
WO2009099678A1 (en) * 2008-02-09 2009-08-13 Sanofi Pasteur Biologics Co. Influenza b vaccines
WO2010045620A1 (en) 2008-10-17 2010-04-22 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacterium capable of eliciting an immune response against streptococcus pneumoniae
US9163219B2 (en) * 2009-04-14 2015-10-20 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Single expression vector for generation of a virus with a segmented genome
CA2762044A1 (en) * 2009-05-18 2010-11-25 Panacea Biotec Ltd Universal influenza vaccine based on recombinant modified vaccinia ankara virus (mva)
WO2010135563A1 (en) 2009-05-22 2010-11-25 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacterium and methods of antigen and nucleic acid delivery
US9045742B2 (en) * 2009-05-29 2015-06-02 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant Edwardsiella bacterium
US8828406B2 (en) * 2009-07-30 2014-09-09 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza viruses and uses thereof
CN102666860B (zh) * 2009-07-31 2015-06-17 诺华股份有限公司 反向遗传系统
ES2813347T3 (es) 2009-10-26 2021-03-23 Wisconsin Alumni Res Found Virus recombinantes de la influenza de alto título con replicación mejorada en células Vero
GB0919117D0 (en) * 2009-10-30 2009-12-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Process
US9062297B2 (en) 2010-01-13 2015-06-23 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Yersinia pestis vaccine
WO2011091291A1 (en) 2010-01-22 2011-07-28 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University BACTERIUM COMPRISING A REGULATED rfaH NUCLEIC ACID
US10130697B2 (en) 2010-03-23 2018-11-20 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Vaccines comprising mutant attenuated influenza viruses
US9598697B2 (en) 2010-05-28 2017-03-21 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacterium to decrease tumor growth
ES2655051T3 (es) 2011-08-26 2018-02-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Virus de la gripe con segmento génico PB2 mutante como vacunas vivas atenuadas
US9303264B2 (en) 2012-05-18 2016-04-05 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Photosynthetic microorganisms expressing thermostable lipase
US9580718B2 (en) 2013-06-17 2017-02-28 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Attenuated live bacteria with increased acid resistance and methods of use thereof
JP2016524915A (ja) 2013-07-15 2016-08-22 ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション Ｍｄｃｋ、ベロ細胞又は卵内で増強された複製を有する高力価の組換えインフルエンザウイルス
US10053671B2 (en) 2014-06-20 2018-08-21 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses
US10633422B2 (en) 2015-06-01 2020-04-28 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza virus replication by inhibiting microRNA lec7C binding to influenza viral cRNA and mRNA
US9890363B2 (en) 2015-07-06 2018-02-13 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza virus replication for vaccine development
JP2018530314A (ja) 2015-08-28 2018-10-18 ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション ウイルス様粒子からの感染性インフルエンザウイルスの生成
CN109477074B (zh) 2016-02-19 2023-01-24 威斯康星旧生研究基金会 用于疫苗开发的改进的乙型流感病毒复制
CN109641041A (zh) 2016-06-15 2019-04-16 西奈山伊坎医学院 流感病毒血细胞凝集素蛋白及其用途
EP3914295A2 (en) 2019-01-23 2021-12-01 Yoshihiro Kawaoka Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses
EP3921413A1 (en) 2019-02-08 2021-12-15 Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) Humanized cell line
CN109957550B (zh) * 2019-03-13 2020-10-20 浙江森卫生物医药发展有限公司 流感病毒的拯救方法及其组合物
US11390649B2 (en) 2019-05-01 2022-07-19 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza virus replication for vaccine development
WO2021041624A2 (en) 2019-08-27 2021-03-04 Yoshihiro Kawaoka Recombinant influenza viruses with stabilized ha for replication in eggs
US20210221854A1 (en) * 2020-01-17 2021-07-22 Regents Of The University Of Minnesota Systems, methods, and cell lines for generating influenza virus or influenza virus proteins

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4071618A (en) 1974-09-03 1978-01-31 Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University Process for preparing virus disease live vaccines
JPS57136528A (en) 1981-02-09 1982-08-23 Hayashibara Biochem Lab Inc Preparation of viral vaccine
NZ219515A (en) 1987-02-10 1989-09-27 Wellcome Found Fusion proteins comprising influenza virus ha and a nonnatural antigenic epitope
US6001634A (en) 1989-08-28 1999-12-14 Palese; Peter Recombinant negative strand RNA viruses
US5786199A (en) 1989-08-28 1998-07-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
US5840520A (en) 1989-08-28 1998-11-24 Aviron Recombinant negative strand RNA virus expression systems
US5854037A (en) 1989-08-28 1998-12-29 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
US5166057A (en) 1989-08-28 1992-11-24 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand rna virus expression-systems
US5919676A (en) 1993-06-24 1999-07-06 Advec, Inc. Adenoviral vector system comprising Cre-loxP recombination
ATE257175T1 (de) 1994-07-18 2004-01-15 Conzelmann Karl Klaus Prof Dr Rekombinantes infektiöses nicht-in-segmente- geteiltes, negativ-strange-rns-virus
US5789229A (en) 1994-09-30 1998-08-04 Uab Research Foundation Stranded RNA virus particles
US5716821A (en) 1994-09-30 1998-02-10 Uab Research Foundation Prevention and treatment of respiratory tract disease
EP0704533A1 (en) 1994-09-30 1996-04-03 Bayer Ag An attenuated vaccination virus, a method to make the virus and a pharmaceutical compositions comprising the virus
US5994526A (en) 1996-06-21 1999-11-30 Plant Genetic Systems Gene expression in plants
DE69739689D1 (de) 1996-07-15 2010-01-21 Us Gov Health & Human Serv Herstellung von attenuierten respiratorischen syncytialvirus-impfstoffen aus klonierten nukleotidsequenzen
US6271011B1 (en) 1996-10-15 2001-08-07 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Pasteurella neuraminidase coding sequences and diagnostic methods
WO1998048834A1 (en) 1997-04-30 1998-11-05 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant influenza viruses expressing tumor-associated antigens as antitumor agents
BR9809456B1 (pt) 1997-05-23 2011-06-28 molécula isolada de polinucleotìdeo, composição de célula ou isenta de célula, partìcula de piv infeciosa, atenuada e imunogênica, e, composição imunogênica.
CA2297786C (en) 1997-08-05 2011-06-14 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie New immunoprotective influenza antigen and its use in vaccination
US6146642A (en) 1998-09-14 2000-11-14 Mount Sinai School Of Medicine, Of The City University Of New York Recombinant new castle disease virus RNA expression systems and vaccines
WO2000020609A2 (en) * 1998-10-07 2000-04-13 Connaught Laboratories Limited Protective recombinant haemophilus influenzae high molecular weight proteins
EP1035209A1 (en) 1999-03-06 2000-09-13 ARTEMIS Pharmaceuticals GmbH Stable recombinant influenza viruses free of helper viruses
US8715940B2 (en) 1999-04-06 2014-05-06 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of making recombinant influenza virus
WO2000060050A2 (en) 1999-04-06 2000-10-12 Wisconsin Alumni Research Foundation Recombinant influenza viruses for vaccines and gene therapy
US6686168B1 (en) 1999-11-04 2004-02-03 Zymogenetics, Inc. Cell surface display of proteins by recombinant host cells
EP1276852B1 (en) 2000-04-14 2010-11-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Viruses comprising mutated ion channel protein
HU229101B1 (en) 2000-04-28 2013-07-29 St Jude Childrens Res Hospital Dna transfection system for the generation of infectious influenza virus
US6358733B1 (en) * 2000-05-19 2002-03-19 Apolife, Inc. Expression of heterologous multi-domain proteins in yeast
US20040241139A1 (en) 2000-07-20 2004-12-02 Gerd Hobom Recombinant influenza viruses with bicistronic vRNAs coding for two genes in tandem arrangement
EP1201760A1 (en) 2000-10-30 2002-05-02 ARTEMIS Pharmaceuticals GmbH Influenza virus vector for human dendritic cells
US7226774B2 (en) 2002-02-13 2007-06-05 Wisconsin Alumni Research Foundation Signal for packaging of influenza virus vectors
CN103540568A (zh) 2002-04-26 2014-01-29 米迪缪尼有限公司 制备流感病毒的多质粒系统
AU2004232992A1 (en) 2003-04-23 2004-11-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Recombinant influenza viruses holding a mutation in a transmembrane protein gene
NZ543446A (en) 2003-05-28 2008-06-30 Wisconsin Alumni Res Found High titer recombinant influenza viruses for vaccines and gene therapy
CN1829799A (zh) * 2003-05-28 2006-09-06 威斯康星旧生研究基金会 含polii启动子和核酶的重组流感载体
CA2587510A1 (en) 2004-11-19 2007-04-19 Wisconsin Alumni Research Foundation Recombinant influenza vectors with tandem transcription units

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101323582B1 (ko) * 2011-03-17 2013-10-30 충북대학교 산학협력단 Ｖｅｒｏ 세포 유래의 ｐｏｌⅠ 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터

Also Published As

Publication number Publication date
JP2008520248A (ja) 2008-06-19
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US20060166321A1 (en) 2006-07-27
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US8877209B2 (en) 2014-11-04
IL183026A0 (en) 2007-09-20
WO2007044024A3 (en) 2007-08-02
WO2007044024A2 (en) 2007-04-19
ZA200704088B (en) 2008-04-30
CN101103103A (zh) 2008-01-09

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