BR9809456B1 - molécula isolada de polinucleotìdeo, composição de célula ou isenta de célula, partìcula de piv infeciosa, atenuada e imunogênica, e, composição imunogênica. - Google Patents

Description

"MOLÉCULA ISOLADA DE POLINUCLEOTÍDEO, COMPOSIÇÃODE CÉLULA OU ISENTA DE CÉLULA, PARTÍCULA DE PIVINFECIOSA, ATENUADA E IMUNOGÊNICA, E, COMPOSIÇÃOIMUNOGÊNICA".

APLICAÇÕES RELATADAS

O presente pedido é um pedido de continuação em parte do, ereivindica o benefício sob o título 35 do Pedido Provisório U.S. N060/047.575, depositado em 23 de maio de 1997 e o Pedido Provisório U.S. N060/059.385, depositado em 19 de setembro de 1997, cada um dos quais é incorporado neste por referência.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Os vírus da parainfluenza humana (HPIV), HPIV1, HPIV2 eHPIV3 são causas significantes da bronquiolite, crupe e pneumonia em bebêse crianças. Karron et al., J. Infect. Dis. 172: 1445 a 1450 (1995); Collins etal., "Parainfluenza Viruses", p. 1205 a 1243. Em Β. N. Fields et al., eds.,Fields Virology, 3a ed., vol. 1. Lippincott - Raven Publ., Filadélfia (1996);Murphy et al., Virus Res. 11:1 a 15 (1988). As infecções por estes vírusresultam em morbidez substancial em crianças de menos do que 3 anos deidade e são responsáveis por aproximadamente 20% das hospitalizações entre bebês e crianças imaturas por infecções do trato respiratórios.

A despeito dos consideráveis esforços para desenvolverterapias de vacina eficazes contra o HPIV, nenhum agente de vacinaaprovado foi até agora obtido para qualquer cepa do HPIV, nem paramelhorar as enfermidades relacionadas com o HPIV. Até agora, apenas doiscandidatos à vacina PIV atenuados, vivos receberam atenção particular. Umdestes candidatos é uma cepa do PIV bovino (BPIV) que é antigenicamenterelacionado ao HPIV3 e que tem mostrado proteger animais contra o HPIV3.O BPIV3 é atenuado, geneticamente estável e imunogênico em bebês ecrianças humanas (Karron et al., J. Inf. Dis. 171: 1107 a 1114 (1995a)Karron et al., J. Inf. Dis. 172: 1445 a 1450 (1995b). Um segundo candidato àvacina PIV3, o JS cpA5 é um mutante adaptado ao frio da cepa JS do tiposelvagem do HPIV3 (Karron et al., (1995b), acima; Belshe et al., J. Med.Virol. 10: 235 a 242 (1982)). Este candidato à vacina PIV3 inoculado a frio(cp), atenuado, vivo, demonstra sensibilidade à temperatura (ts), adaptação aofrio (ca) e fenótipos de atenuação (att) que são estáveis após a replicaçãoviral in vivo. O vírus cpA5 é protetivo contra a prova do PIV3 humano emanimais experimentais e é atenuado, geneticamente estável e imunogênico embebês e crianças humanas soronegativas (Hall et al., Virus Res. 22: 173 a 184(1992); Karron et al., (1995b), acima.

O HPIV3 é um membro do gênero Paramixovírus da famíliados Paramixovírus, da ordem dos Mononegavirais. O seu genoma é umfilamento único de RNA de sentido negativo, de 15462 nucleotídeos (nt) decomprimento (Galinski et al., Virology 165: 499 a 510, (1988); Stokes et al.,Virus Res. 25: 91 a 103 (1992)) e codifica pelo menos oito proteínas (Collinset al., acima, (1996); Galinski, acima, (1991); Springgs e Collins, J. Gen.Virol. 67: 2705 a 2719, (1986)). Três destas proteínas estão associadas com ogenoma do RNA para formar o nucleocapsídeo; isto é, a proteínanucleocapsídea N, a fosfoproteína Pea subunidade L de polimerase grande.

As três proteínas adicionais estão associadas com o envelope, isto é, aproteína matriz M, mostrando mediar a ligação e liberação viral, da proteínahemaglutinina-neuraminidase HN e da proteína de fusão F. Duas outrasproteínas, HN e F, representam os antígenos de neutralização e de proteçãodos PIVs (Collins et al., em Fields Virology, 3a ed., 1: 1205 a 1243 (1996)).

A significante divergência de seqüência nestes dois antígenos de proteção,entre PIVs diferentes é a base para a especificidade de tipo da imunidade deproteção contra estes patógenos (id.).

Uma outra proteína do PIV, a proteína C, é codificada poruma estrutura de leitura aberta sobreposta (ORF) da proteína P do mRNA(Springgs e Collins, 1986) e a proteína D é gerada pela correção de RNA docístron P (Galinski et al., Virology 186: 543 a 550 (1992)). O mRNA Ptambém contém um ORF interno que tem o potencial para codificar umdomínio rico em cisteína denominado V. O ORF V também é encontrado emoutros paramixovírus e tipicamente é acessado pela correção do RNA, maseste não é o caso com o PIV. No presente, não se sabe se o ORF V do PIV éexpresso.

O genoma viral do PIV também contém regiões extragênicaslíder e de trecho, que possuem promotores requeridos para a replicação e atranscrição viral. Assim, o mapa genético do PIV é representado como líder3'-N-P/C/D-M-F-HN-L-trecho. A transcrição inicia na terminação 3' econtinua por um mecanismo seqüencial de parada-início e é guiado pormotivos curtos conservados, encontrados nos limites do gene. O final defluxo ascendente de cada gene contém um sinal de início de gene (GS), quedireciona o início de seu respectivo mRNA. O terminal de fluxo descendentede cada gene contém um motivo de final de gene (GE) que direciona apoliadenilação e a terminação.

A identificação de mutações atenuadoras no cpA5 e nos outroscandidatos à vacina PIV3 é de interesse por uma variedade de razões. Emparticular, serão úteis para se entender as bases genéticas da atenuação e paracaracterizar a virologia e patogênese moleculares de cepas atenuadas doHPIV3 para fornecer vacinas clinicamente aceitáveis para o uso contra estes eoutros paramixovírus, especialmente o HPIVl e o HPIV2, que juntos sãoresponsáveis por um adicional de 7% das admissões pediátricas em hospital.Para se alcançar estas metas relacionadas, um processo para produzir víruscom um fenótipo wt a partir do cDNA é necessário determinar qual(is)mutação(ões) no vírus c/?45 especifica os fenótipos ts, ca e att e qual(is)gene(s) do BPIV3 especifica o fenótipo de atenuação.As seqüências completas de nucleotídeo do protótipo da cepaPIV3 e das cepas JS wt HPIV3 e cp4S foram determinadas (Stokes et al:,acima, (1992); Stokes et al., Virus Res. 30: 43 a 52 (1993)). A partir destesestudos, a cepa cp45 mostrou possuir pelo menos dezessete substituições denucleotídeo, comparado à cepa parente JS wt HPIV3, oito das quais estãocorrelacionadas com mudanças nas proteínas virais. Entretanto, não foipreviamente mostrado qual destas mutações identificadas especificam osfenótipos desejados, por exemplo, ts, ca e att. Recentemente, o crescimentode cpA5 em temperaturas não permissíveis foi relatado ser complementado pela coexpressão de um clone de cDNA do gene L da cepa 47885 do wt PIV3(Ray et al, J. Virol. 70: 580 a 584 (1996)), sugerindo que o gene L possaconter uma ou mais mutações que contribuam para o fenótipo ts do cp45.Entretanto, os resultados deste estudo são complicados pelo fato de que acepa 47885 não é isogênica com o parente JS do cp45 (por exemplo, os dois vírus são 4% diferentes ao nível do nucleotídeo e as proteínas L diferem em41 posições de aminoácidos (Stokes et al., acima, (1992); a errata publicada éapresentada no Virus Res. 27: 96 (1993); Virus Res. 25: 91 a 103. Alémdisso, este processo de complementação não fornece uma dimensão clara dacontribuição relativa da(s) mutação(ões) do gene L para o fenótipo ts total do cp45.

O resgate e a análise de mutações atenuadoras no PIV3 eoutros RNAs de vírus requerem processos eficazes para se manipular oscDNAs, quanto aos vírus particulares de interesse. A despeito dos avançoanteriores na identificação de cDNAs para PIV, a manipulação do RNA genômico deste e de outros RNAs de sentido negativo de vírus tem semostrado difícil. Um obstáculo maior neste particular é que o RNA genômiconu destes vírus não é infeccioso.

Apenas recentemente, iniciou-se o desenvolvimento deprocessos bem sucedidos para se direcionar a manipulação genética de vírusde RNA de filamento negativo não segmentado (para revisões, verConzelmann, J. Gem. Virol. 77: 381 a 389 (1996); Palese et al., Proc. Natl:Acad. Sei. U.S.A. 93: 11354 a 11358, (1996)). Nucleocapsídeos funcionaisforam gerados com sucesso a partir da coexpressão intracelular deplasmídeos separadamente transfectados, que levam o promotor T7 da RNApolimerase e que codifica o RNA genômico ou antigenômico e as proteínasΝ, P e L. A expressão intracelular de cDNA é direcionada pelo T7 da RNApolimerase que é produzido pela co-infecção com um vírus recombinante davacínia. Este processo foi primeiramente usado para se determinar osrequisitos de transcrição e de replicação de mini-réplicons codificados porcDNA. Algum sucesso foi alcançado na aplicação destes processos geraispara o resgate de vírus infeccioso da raiva, de vírus da estomatite vesicular(VSV), de vírus do sarampo e de vírus de Sendai, a partir do RNAantigenômico codificado pelo cDNA, na presença do nucleocapsídeo N, dafosfoproteína P e da subunidade L da polimerase grande (Garcin et al,EMBO J. 14: 6087 a 6094 (1995); Lawson et al., Proc. Natl Acad. Sei.U.S.A. 92: 4477 a 4481 (1995); Radecke et al., EMBO J. 14: 5773 a 5784(1995); Schnell et al., EMBO J. 13: 4195 a 4203 (1994); Whelan et al., Proc.Natl. Acad. Sei. U.S.A. 92: 8388 a 8392 (1995)). O vírus sincicial respiratório(RSV) também foi recuperado do antigenoma que codifica o cDNA mas istoexigiu a transfecção de um plasmídeo adicional que codifica o fator deprolongação de transcrição M2 ORF 1 (Collins et al, 1995).

O resgate do vírus infeccioso PIV e de outros membrosmonomegavirais é complicado devido a seu genoma de RNA de filamentonegativo não segmentado. Os complexos genômicos de ribonucleoproteína(RNPs) dos vírus de genoma segmentado, tais como influenza, são no geralpequenos no tamanho e frouxamente estruturados e podem ser ensaiados invitro a partir do RNA e das proteínas virais requeridas. Entretanto, o PIV eoutros membros mononegavirais caracterizam RNPs muito maiores e maisfirmemente estruturados, que tende a ser refratário à associação funcional Intvitro. Além disso, o potencial codificador do mRNA do HPIV3 P écomplicado pela "correção de RNA" cotranscricional (Galinski et al.,Virology 186: 543 a 550 (1992)). As substituições resultantes na estrutura deleitura podem aumentar as ORFs internas que são expressas como quimerasfundidas à parte n-terminal de P. Além disso, o HPIV3 parece diferir damaioria dos outros paramixovírus que expressam uma proteína quimérica V,como observado acima. O conjunto correspondente de proteínas da correçãodo HPIV3 ainda não foi identificado e o ORF V interno do HPIV3 é separadodo sítio de correção por numerosos códons translacionais de interrupção(Galinski et al., (1992, acima). Ainda um outro fator complicador é que acorreção por BPIV3 e HPIV3 produz uma nova proteína quimérica D, na quala metade ascendente de P é fundida a um domínio que é codificado por umasegunda ORF interna (Pelet et al, EMBO J. 10: 443 a 448 (1991); Gaslinskiet al., acima, (1992)). A proteína D não tem uma contraparte em outrosparamixovírus.

Em vista do acima mencionado, existe uma necessidadeurgente na técnica por ferramentas e processos para engendrar vacinasseguras e eficazes para aliviar os sérios problemas de saúde atribuíveis aoPIV, particularmente enfermidades entre bebês e crianças, atribuíveis aoHPIV3. Muito surpreendentemente, a presente invenção satisfaz estas eoutras necessidades relacionadas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece novas ferramentas e processospara introduzir mudanças fenotípicas e estruturais pré determinadas no PIVinfeccioso. Em uma modalidade da invenção, uma molécula depolinucleotídeo isolada é fornecida, a qual compreende um promotortranscricional operavelmente ligado, uma seqüência de polinucleotídeo quecodifica um genoma ou antigenoma de PIV e um terminador transcricional.O genoma ou o antigenoma de PIV pode ser uma seqüênciahumana ou não humana de PIV ou uma versão destas, modificada de formarecombinante. Em uma modalidade, a seqüência de polinucleotídeo codificaum genoma ou antigenoma quimérico que compreende uma seqüência dePIV humano, unida com uma seqüência PIV não humana de modorecombinante, tal como um gene ou um seguimento de gene de PIV bovino(BPIV). Em exemplos adicionais, o polinucleotídeo codifica uma quimera deseqüências de um PIV não humano e pelo menos um outro PIV de origemhumana ou não humana.

Em outras modalidades, a invenção fornece uma partículainfecciosa de PIV, isolada, que compreende um genoma ou antigenoma dePIV recombinante (rPIV). A partícula infecciosa de PIV, isolada, pode seruma partícula viral ou subviral. Como usado neste, partícula subviral refere-se a qualquer partícula infecciosa de PIV que carece de um elementoestrutural, por exemplo, um seguimento de gene, um gene, uma proteína ouum domínio funcional de proteína, que está presente em um vírus completo(por exemplo, um virion montado que inclua um genoma ou antigenoma, umnucleocapsídeo e um envelope, completos). Assim, um exemplo de umapartícula subviral da invenção é um nucleocapsídeo infeccioso que contenhaum genoma ou antigenoma e os produtos dos genes Ν, P e L. Outraspartículas subvirais são produzidas pelas supressões ou substituições parciaisou completas de genes não essenciais e/ou seus produtos (por exemplo, F,ΗΝ, M ou C), entre outros elementos estruturais não essenciais.

A partícula infeciosa de PIV, isolada é preferivelmente umPIV humano, mais preferivelmente um PIV3 humano (HPIV3). A invençãotambém fornece partículas infeciosas, isoladas de PIV de bovino ou demurino (BPIV ou MPIV), bem como partículas que compreendam seqüênciasquiméricas de dois ou mais genomas de PIV, diferentes, por exemplopartículas que incorporem seqüências de polinucleotídeo do HPIV3 e doHPIV1, seqüências do HPIV3 e do HPIV2 ou compreendidas de seqüênciasdo HPIV3 e do BPIV.

Em aspectos relacionados da invenção, são fornecidaspartículas infecciosas de PIV, isoladas, que incorporam seqüências denucleotídeo do HPIV3 unidas a pelo menos uma seqüência de um PIVheterólogo, tal como HPIV1, HPIV2, BPIV ou MPIV. Por exemplo, os genesinteiros do HPIV3 podem ser substituídos pelos genes da contraparte deoutras formas de PIV, tais como os genes glicoproteínicos HN e/ou F doPIVl ou do PIV2. Alternativamente, um seguimento de gene selecionado, porexemplo um final citoplásmico, um domínio de transmembrana ouectodomínio de HN ou F do HPIVl ou HPIV2, pode ser substituído por umseguimento de gene correspondente, em uma contraparte do gene do HPIV3para produzir construções que codifiquem proteínas quiméricas, por exemploproteínas de fusão que tenham um final citoplásmico e/ou um domínio detransmembrana do PIV3 fundido a um ectodomínio de PIVl ou de PIV2.

Alternativamente, os genes ou seguimentos de gene de um PIV pode seradicionado (isto é, sem substituição) dentro de um motivo de PIV heterólogo,para criar novas propriedades imunogênicas dentro de clone resultante.

Outras modificações podem ser produzidas introduzindo-seem um genoma ou antigenoma de PIV uma inserção de nucleotídeo, umrearranjo, uma supressão ou uma substituição, selecionada para codificar umaalteração fenotípica desejada, tal como uma que resulte na atenuação,sensibilidade à temperatura, adaptação ao frio, tamanho de placa pequena,restrição à faixa de hospedeiro, crescimento melhorado in vitro ou umamudança em um epítopo imunogênico do PIV. Em um aspecto da invenção,as mutações que ocorrem no PIV atenuado, biologicamente derivado sãoidentificadas e introduzidas individualmente ou em combinação em um clonede PIV de tamanho natural. Tipicamente, estas mutações são mudançasúnicas de aminoácido manifestadas por vírus mutantes, biologicamentederivados em um PIV do tipo selvagem, por exemplo mudanças apresentadaspor mutantes de PIV que tenham fenótipos ts, ca ou att. Estas mudanças doPIV mutante biologicamente derivado são incorporadas em um clone de PIVrecombinante para especificar características desejadas no vírus resultante.

As mutações de exemplo incluem mudanças de aminoácido que especificamum fenótipo atenuado no HPIV3 da cepa JS cpA5. Entre estas mutações deexemplo estão mutações que ocorrem dentro da PIV polimerase do gene L,que especificam os fenótipos ts, ca ou att, por exemplo, substituições deaminoácido que ocorrem no Tyr942, Leu992 e/ou Thr1558 da cepa do PIV JS dotipo selvagem. Em aspectos mais detalhados, os recombinantes atenuados doPIV estão descritos em que Tyr942 é substituído por His, Leu992 é substituídopor Phe e/ou Thr1558 é substituído por lie.

Também fornecido dentro da invenção estão os PIVrecombinantes que tenham mutações múltiplas especificadoras de fenótipointroduzidas em combinações selecionadas no genoma ou antigenoma de umclone infecioso, para produzir características desejadas que incluamatenuação, sensibilidade á temperatura, adaptação ao frio, tamanho pequenode placa, restrição de faixa hospedeira, etc. Por exemplo, são fornecidosclones de PIV que incorporam pelo menos duas mutações separadas,adotadas de um mutante de PIV biologicamente derivada, por exemplo, duasmutações ts do HPIV3 JS c/?45. Vírus atenuados multiplicados são assimobtidos, selecionando-se mutações de um "menu" de lesões identificadas eintroduzindo-se estas mutações em várias combinações para calibrar um vírusde vacina para selecionar níveis de atenuação, imunogenicidade eestabilidade.

Em modalidades adicionais, a invenção fornece asuplementação de uma ou mais mutações adotadas dos PIV biologicamentederivados, por exemplo, as mutações ts, ca ou att, com tipos adicionais demutações que envolvam os mesmos ou diferentes genes. Os genes alvo para amutação neste contexto incluem a proteína de nucleocapsídeo N, afosfoproteína P as subunidades L de polimerase grande, a proteína matriz M,a proteína de hemaglutinina-neuraminidase HN, a proteína de fusão F e osprodutos C, D e V de ORF. Em aspectos preferidos as mutações atenuadorasadotadas de PIV biologicamente derivadas são incorporadas dentro de umrecombinante quimérico de PIV, por exemplo, um recombinante de PIV quetenha seqüências de nucleotídeo tanto do HPIV3 quanto do HPIVl ou deambos os vírus HPIV e BPIV.

Em outras modalidades, a invenção fornece processos para aprodução de uma partícula infecciosa de PIV, por exemplo, uma partículaviral ou subviral, de uma ou mais moléculas de polinucleotídeo, isoladas, quecodifiquem um genoma ou antigenoma de PIV (ver também o pedido co-pendente, provisório de Patente U.S. 60/047575 depositado em 23 de maio de1997, incorporado neste por referência, em sua totalidade). Para produziruma partícula infecciosa de PIV, de acordo com estes processos, um vetor deexpressão que compreenda uma molécula isolada de polinucleotídeo quecodifica um genoma ou antigenoma de PIV é co-expressado em um sistemade célula ou isento de célula com um vetor de expressão que compreendauma ou mais moléculas isoladas de polinucleotídeo que codifiquem asproteínas Ν, P e L de um PIV, por meio do qual uma partícula infecciosa dePIV é produzida. O genoma ou antigenoma de PIV e as proteínas Ν, P e Lpodem ser co-expressadas por um vetor único de expressão ou por vetores deexpressão separados. Em modalidades alternadas, as proteínas Ν, P e L sãocada uma codificadas em vetores de expressão separados.

Dentro dos processos acima mencionados, a molécula depolinucleotídeo que codifica o genoma ou o antigenoma de PIV podecorresponder a uma seqüência genômica ou antigenômica de PIV humano,bovino ou de murino. Alternativamente, o PIV que codifica o polinucleotídeopode ser uma quimera de uma seqüência genômica ou antigenômica de PIVhumano e pelo menos uma seqüência genômica ou antigenômica de PIV nãohumano. Em processos adicionais para produzir PIV infecioso, opolinucleotídeo que codifica o genoma ou antigenoma de PIV é uma quimerade dois ou mais genomas de PIV humano, por exemplo, um polinucleotídeoque contenha seqüências de HPIV3 unidas a seqüências de uma ou mais dasformas relacionadas de PIV humano, tais como o PIVl humano ou o PIV2humano. Os genes individuais do PIV3 humano podem ser substituído pelosgenes de contraparte, a partir do PIV heterólogo, por exemplo os genes deglicoproteína HN e F do PIVl ou do PIV2, para produzir um genoma ou umantigenoma modificado que codifica um PIV quimérico. Alternativamente,um seguimento de gene heterólogo, selecionado, tal como um finalcitoplásmico, um domínio de transmembrana ou um ectodomínio de HN ou Fdo HPIVl ou do HPIV2 pode ser substituído por um seguimento de gene decontraparte em um tipo diferente de PIV ou de gene diferente, por exemplo, oHN ou F do HPIV3, para produzir construções que codifiquem proteínasquiméricas, por exemplo proteínas de fusão que tenham um finalcitoplásmico e/ou um domínio de transmembrana do PIV3 fundido a umectodomínio do PIVl ou do PIV2.

No entanto, em processos adicionais para produzir PIVinfeccioso, o genoma ou antigenoma de PIV é modificado para produzir umaquimera de uma seqüência genômica ou antigenômica de PIV humano e pelomenos uma seqüência de PIV não humano, por exemplo, um polinucleotídeoque contenha seqüências tanto de PIV humano quanto de bovino.

Em outros processos para produzir PIV infecioso, o genomaou antigenoma do PIV é modificado por uma inserção, rearranjo, supressãoou substituição de nucleotídeo selecionado para codificar uma alteraçãofenotípica desejável, tal como uma que resulte em atenuação, sensibilidade àtemperatura, adaptação ao frio, tamanho pequeno de placa, restrição à faixade hospedeiro ou um mudança em um epítopo imunogênico do PIV.Alternativamente a molécula de polinucleotídeo que codifica o genoma ou oantigenoma de PIV pode ser modificado para codificar moléculas não PIV,por exemplo, uma citocina, um epítopo auxiliar T5 um marcador de restriçãode sítio ou uma proteína de um patógeno microbiano diferente (por exemplo,vírus, bactéria ou fungo) capaz de evocar uma imuno resposta de proteção nohospedeiro pretendido. Em uma modalidade, o genoma ou antigenoma dePIV é modificado para codificar proteína e um RSV humano ou de um vírusdo sarampo.

Em outras modalidades da invenção, é fornecido um sistemade expressão de célula ou isento de célula (por exemplo, um lisato isento decélula) que incorpora um vetor de expressão que compreende uma moléculaisolada de polinucleotídeo que codifica um genoma ou antigenoma de PIV eum vetor de expressão que compreende uma ou mais moléculas isoladas depolinucleotídeo que codificam as proteínas Ν, P e L de um PIV. Naexpressão, o genoma ou o antigenoma e as proteínas Ν, P e L combinam-separa produzir uma partícula infecciosa de PIV, tal como uma partícula viralou subviral. As moléculas de polinucleotídeos isoladas, que codificam ogenoma ou antigenoma de PIV e as, uma ou mais, das moléculas depolinucleotídeo isoladas, que codificam as proteínas Ν, P e L de PIV podemser expressas por um único vetor ou o genoma e uma ou mais das proteínasΝ, P e L podem ser incorporadas em dois ou mais vetores separados.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

A Figura 1 ilustra a construção do plasmídeo p218 (131), quecodifica uma cópia completa do RNA genômico do HPIV3. O diagrama dop218 (A*A'CC'D*E) (no alto à esquerda) ilustra a localização do terminadorT7 e da ribozima delta adjacente ao nucleotídeo 1 do genoma do HPIV3. Odiagrama no alto à direita do p(E*FF'GHIJKL*)ilustra as localizações dosmarcadores de seqüência 7 (asterisco), ver Figura 2 abaixo e o promotor T7adjacente ao nucleotídeo 15462 do HPIV3. Os 15 clones de sobreposiçãousados para construir o cDNA genômico de comprimento completo sãoindicados por letras no lado de fora dos dois plasmídeos. Os sítios únicos derestrição NgoMl e Xhol foram usados para clonar o p218 (131) que codifica oRNA genômico de sentido negativo completo do HPIV3, ilustrado na partede baixo. A localização de cada marcador de sequenciamento no p218 (131)que diferencia o JS recombinante do JS wt é indicado por um asterisco.

A Figura 2 representa marcadores de seqüência no RNAgenômico codificado pelo cDNA dos genes HN (1) e L (2) do HPIV3. Asseqüência são de sentido negativo, as mutações são colocadas em caixas.

1) Uma substituição nt não codificadora no 7903 remove umsítio Hgal do JS wt. As substituições de nucleotídeo no cDNA do JS no 7913e 7915 cria um sítio Scal e muda o aminoácido 370 de prolina para treonina,removendo o epítopo de anticorpo reconhecido por mAb 170/7 e 423/6.Observou-se também, que o gene HN contém um ponto adicional de mutaçãono nt 7593, que não foi anteriormente reconhecido. Isto resulta em umamudança de treonina para isoleucina na posição de aminoácido 263, naproteína HN.

2) As três mutações não codifícadoras incidentais no gene Ldo cDNA do JS, que ocorreram durante a construção ou montagemplasmídica estão colocadas em caixas.

A Figura 3 inclui um diagrama (não em escala) do cDNA doPIV3-CAT (topo, desenhado como um plasmídeo circular) e o RNAminigenômico codificado (embaixo, desenhado como um filamento único doRNA de sentido negativo, de 3' a 5').

PLASMÍDEO:

O promotor T 7 é mostrado como uma seta preta apontando nadireção da transcrição. As posições são mostradas para a ribozima delta, oterminador transcricional T7, os terminadores transcricionais do vírus vacíniainserido (T7CT e T5AT), os sítios de restrição de enzima e a seqüênciacodificadora para os vários domínios do mini-genoma codificado.MINI-GENOMA DE RNA:

O final 5' (à direita) do mini-genoma é definido pelo promotorpara a T7 RNA polimerase, que contribui com uma extensão de dois resíduosnão virais G. Estes não estão incluídos nos cálculos do comprimento. O final3' é definido pela ribozima e é isento de quaisquer nucleotídeos heterólogos.As regiões específicas do PIV3 são mostradas como caixas abertas. O CATORF é sombreado e os complementos de sentido negativo dos códonstranslacionais de iniciação (UAC) e determinação (AUU) são apresentados.

As posições de nucleotídeo são indicadas de acordo com o mini-genoma maiscurto, de 898 nucleotídeos. Os comprimentos de nucleotídeo das regiõesespecíficas são dados entre parênteses. A seqüência das posições de 90 a 124(de 3' a 5', sentido negativo) é apresentada embaixo; a seqüência específicade PIV3 está sublinhada, o complemento de um terminador transcricional dovírus vacínia tem a linha sobreposta, o complemento do sítio Xbal está emitálico e o complemento do códon translacional de início para o CAT ORFestá em negrito. O sítio onde os resíduos G de 0 a 6 foram inseridos,resultando no PIV3-CAT de 0 a +6, está indicado. Abreviações: GS, motivotranscricional de início de gene; GE, motivo transcricional de final de genede terminação/poliadenilação; NT, seqüência de gene não traduzida.

A Figura 4 representa a expressão da enzima CAT por mini-genoma PIV3-CAT de 0 a +6. As células foram transfectadas complasmídeos que codificam o mini-genoma PIV3-CAT e as proteínas Ν, P e L,indicados e foram simultaneamente infectados com o recombinante do vírusvacínia vTF7-3 que expressa a T7 RNA polimerase. Os lisatos forampreparados 48 horas após a infecção e as amostras que representam 3000células foram analisadas quanto a atividade CAT. As atividades foramexpressas em relação ao mini-genoma +2, que é um múltiplo de seis, como100. As amostras, nas quais o plasmídeo L foi omitido não tiveram atividadeCAT detectável sob estas condições.

As Figuras 5A e 5B representam a síntese do RNA mini-antigenômico pelos mini-genoma PIV3-CAT de 0 a +6. As células foramtransfectadas e infectadas como descrito para a Figura 4, exceto para oscontroles nos quais o plasmídeo N (linha 1) ou o plasmídeo L (linha 2) foiomitido. O plasmídeo do mini-genoma PIV3-CAT que foi transfectado emcada caso está indicado. Os lisatos de célula foram preparados 48 horas apósa transfecção: a alíquota um foi tratada com nuclease microcócico (tratada) ea segunda foi tratada por mock (não tratada), seguido por processamento paraa purificação de RNA. Os RNAs foram analisados pela hibridização damancha do Norte com uma riboprova CAT de sentido negativo. Como ummarcador e controle para o tratamento de nuclease, o mini-genoma RSV-CAT C2 (Grosfeld et aL, J. Virol. 69: 5677 a 5686 (1995), incorporada nestepor referência em sua totalidade) foi complementado pelas proteínas RSV N,P e L e foi processado em paralelo (Linha 10). Os autorradiogramas dasmanchas hibridizadas são mostradas na Figura 5A. A Figura 5B mostra aanálise de phosphorimager em que a quantidade de hibridização em relaçãoao mini-genoma +2 foi calculada separadamente para as amostras tratadas enão tratadas.

As figuras 6A e 6B representam a síntese do mRNApoliadenilado pelos mini-genomas PIV3-CAT de 0 a +6. Usando-se alíquotasdas células do mesmo experimento como apresentado nas Figuras 5A e 5B, oRNA intracelular total foi colhido 48 horas após a transfecção e fracionadopela oligo (dT) cromatografia em frações ligadas e não ligadas, que foramanalisadas pela hibridização da mancha do Norte com uma riboprova CAT desentido negativo. A Figura 6A apresenta autorradiogramas das manchashibridizadas. A Figura 6B apresenta a análise de phosphorimager, em que aquantidade de hibridização foi normalizada em relação à fração de RNAligado do mini-genoma +2, isto foi calculado separadamente para as fraçõesligadas e não ligadas.

As Figuras 7 A e 7B representam o acúmulo de mini-genomaintracelular em resposta ao plasmídeo que codifica os mini-genomas PIV3-CAT de 0 a +6. Isto é uma continuação do experimento apresentado nasFiguras 5A e 5B. Assim, as células que foram transfectadas com osplasmídeos que codificam um mini-genoma e as proteínas Ν, P e L einfectados com vTF7-3 foram colhidas 48 horas após a transfecção e oslisatos de célula foram preparados. A alíquota um do lisato foi tratada comnuclease microcócica (tratada) e a outra foi tratada por mock (não tratada),seguido pelo processamento para a purificação do RNA. Os RNAs foramanalisados pela hibridização da mancha do Norte com uma riboprova CAT desentido positivo, ao passo que na Figura 5A a riboprova foi de sentidonegativo. A Figura 7A apresenta autorradiogramas das manchas hibridizadas.

A Figura 7B apresenta a análise de phosphorimager na qual a quantidade dehibridização em relação ao mini-genoma +2 foi calculada separadamentepara as amostras tratadas e não tratadas.

As figuras de 8 a 10 ilustram a construção do p3/7 (131) 2G.

O p3/7 (131) 2G codifica um anti-genoma HPIV3 de sentido positivocompleto e contém 2 resíduos G entre o promotor T7 e o nucleotídeo 1 doanti-genoma. A construção envolveu modificações em separado das metadesesquerda e direita do cDNA 218 (131) que codifica o genoma de sentidonegativo. Usando-se a mesma estratégia, um segundo cDNA, o p3/7 (131) foiconstruído, o qual é idêntico ao p3/7 (131) 2G exceto que os dois resíduos Gforam omitidos.

A Figura 8 representa a construção do p(Esquerdo+2G)realizada pela substituição da ribozima e do terminador de transcrição T7 dop218 (A*A'CC'D*E) com um promotor T7 que inclui dois resíduos G. Op218 (A*A'CC'D*E) foi usado como padrão em uma PCR que amplificou os1224 nucleotídeos à esquerda do genoma HPIV3 (retângulo preto rotulado"PIV3seq.") usando-se um iniciador de PCR à esquerda que introduziu opromotor T7. Este fragmento de PCR foi clonado na janela MluI-PmlI dop218 (A*A'CC'D*E), resultando no p(Esquerda+2G).

A Figura 9 representa construção do p(Direita+), realizada pela substituição do promotor T7 do p(E*FF'GHIHKL*) com uma ribozimae o terminador T7 colocado adjacente ao nucleotídeo do PIV3 15642 nofilamento de sentido positivo (antigenoma). O p(E*FF'GHIHKL*) foi usadocomo um padrão em um PCR que amplificou os 649 nucleotídeos à direita dogenoma HPIV3 (retângulo preto rotulado "PIV3 seq.") usando-se umoligonucleotídeo mutagênico que adiciona parte da ribozima delta (incluindoum sítio RsrII de ocorrência natural). Este produto de PCR foi clonado najanela RsrII-BssHII do p3/7para produzir o pPIV3-3/7, reconstruindo-seassim uma ribosima completa flanqueada pelo terminador T7. O fragmentoSwaI-NgoMI do pPIV3-3/7 foi clonado nas janelas SwaI-NgoMI dop(E*FF'GHIHKL*), resultando no p(Direita+). As localizações dos setemarcadores de seqüência são indicadas com asteriscos.

A Figura 10 representa a construção do p3/7(131)2G. Ofragmento NgoMI-XhoI do p(Direita+) foi clonado na janela NgoMI-XhoI dop(Esquerda+2G), resultando no p3/7 (131) 2G. as posições dos genes HPIV3 são indicadas (não em escala). As localizações dos marcadores de seqüênciasão indicadas com asteriscos.

A Figura 11 a confirmação de seqüência de um PIV3recombinante de sentido negativo. Um fragmento de 1379 bp (nucleotídeosde 7334 a 8713) estendendo-se as mutações a 7903, 7913 e 7915, foi geradopor RT-PCR do RNA de células infectadas e então analisado porsequenciamento de ciclo. As mutações que diferem do PIV recombinante doJS wt são indicadas por setas. A seqüência completa a partir do nt 7897 até7922 é apresentada na margem próxima a cada gel, com as três diferenças denucleotídeo indicadas em negrito.A Figura 12 fornece um mapa do plasmídeo pTM (L)942/992/1558, que contém o PIV3 L cDNA com substituições de aminoácidonas posições 942, 992 e 1558 na seqüência da proteína L. A posição relativade cada uma das mudanças codificadoras está indicada, junto com a diferençaaa e o sítio de restrição de ocorrência natural que foi deliberadamenteremovido como um marcador. Os sítios de restrição usados para a clonagem{Sphl, PinAl, BamHl e ATieI) são indicados. A seta mostra a direção daseqüência codificadora da proteína L e é numerada de acordo com a posiçãode aminoácido.

A Figura 13 é uma representação esquemática dos vírus PIV3recombinantes que levam mutações representativas dentro da invenção.

A Figura 14 ilustra a construção do cDNA que codifica o anti-genoma PIV3-PIVl em que os ORFs HN e F do PIV3 foram substituídos poraqueles do PIV1. Primeiro (iniciando-se embaixo à esquerda) os genes F eHN do PIV3 foram subclonados (como fragmentos BspE-Ii I-Xho I e iscoR I-SpeI) a partir do clone do cDNA do PIV3, p3/7 (131) 2G (painel A) paragerar o pLit.PIV3.F3a e pLit.PIV3.HN4 (painel B), respectivamente. Amutagênese de PCR (painel C) foi realizada para suprimir as regiõescodificadoras completas dos genes F e HN do PIV3 e para introduzir novossítios de restrição (encaixotados). Os cDNAs de F e HN do PIVl forampreparados a partir de RNA de célula infectada pela RT-PCR e clonados nopLITMUS28 (painel D). Estes clones, pLit.lFwt e pLit.lHNwt, foram usadoscomo padrões para a modificação dos genes F e HN do PIVl em seus códonsde início e de término para introduzir novos sítios de restrição compatíveiscom aqueles introduzidos nas deleções de PIV3 (painel E). Os genesquiméricos F e HN foram construídos importando-se as regiões codificadorasde PIVl para as supressões de PIV3 para gerar o pLit.PIV3-l.Fhc epLit.PIV3-l.HNhc (painel F). Os F e HN quiméricos foram montados juntospara gerar o pSE.PIV3-l.hc (painel G). Os seguimentos quiméricos F e HNforam introduzidos no clone p3/7 (131) 2G de comprimento completo, doPIV3 pela substituição do seu fragmento BspE I-Sphli para gerar opFLC.2G+.hc (painel H). As caixas pequenas entre os genes representam asregiões de final do gene, intergênicas e de início do gene e as linhas representam as regiões não codificadoras. As porções sombreadas são doPIV1, as caixas abertas são do PIV3. As setas pretas representam o promotorT7, enquanto as caixas pretas representam a ribozima do vírus delta dahepatite (HDV).

A Figura 15 A é um diagrama dos genes quiméricos HN e F do rPIV3-l quimérico (meio) em paralelo com aquele do rPIV3/JS (topo;alternativamente referido neste como rJS e rPIV3 do JS wt) e doPIVl/Wash64 (embaixo). As quatro regiões de junção que contêm astransições de seqüência do PIV3 para o PIVl estão em caixas e numeradas deI a IV. Cada caixa pequena entre os genes representam as regiões de final de gene, intergênica e de início de gene e as linhas representam regiões nãocodificadoras. Os iniciadores da RT-PCR, específicos para os genes M e L doPIV3 (par de iniciadores A no topo) ou específicos para os genes M e HN doPIVl (par de iniciadores B embaixo) usados na Figura 14B são representadoscomo setas.

Figura 15B mostra uma avaliação dos produtos de RT-PCRgerados usando-se o RNA virion (vRNA) como padrão e os pares deiniciadores específicos para o PIV3 ou para o PIVl descritos na Figura 14A.A etapa de transcrição reversa foi omitida em uma duplicata de cada padrão,como indicado, para confirmar que o produto de PCR foi derivado do RNA.Para o rPIV3-l, o par A de iniciadores específicos para o PIV3 deu umaumento para o produto de 4,6 kb suposto, ao passo que o par B deiniciadores, específicos para as seqüências PIV-I não presentes no rPIV3-l,não produziram produto. Os controles positivos que usam vRNA do rPIV3/JS(rotulados como rPIV3) ou do PIVl/Wash64 (rotulados como PIV1) sãoapresentados em paralelo.

A Figura 16 representa seqüências das junções PIV3-PIV1 nosprodutos de RT-PCR do rPIV3-l mostrados na Figura 14B foramdeterminados. A seqüência para cada uma das quatro regiões de junção(Regiões de I a IV) está representada e alinhada com as regiõescorrespondentes ao rPIV3/JS (linha de topo) e ao PIVl/Wash64 (linhadebaixo) que foram sequenciadas em paralelo aos produtos aos produtos deRT-PCR. As barras verticais indicam a identidade da seqüência e regiões emcaixa indicam as mutações introduzidas e os sítios de restrição. A mudançado códon Gln para o Glu no gene quimérico F está indicada por caixasombreada. Os códons de início e de fim estão sublinhados.

A Figura 16 mostra géis sequenciadores para a região III(esquerda) e IV (direita) dos produtos de RT-PCR do rPIV3-l comparadocom o rPIV3 (esquerda) ou PIVl (direita). Os códons de início e de fim sãomarcados por uma caixa, os sítios de restrição são marcados por setas.

A Figura 18 representa o crescimento multicíclico de PIVsparental e quimérico em cultura de tecido. As monocamadas de célula LLC-MK2 foram inoculadas com o vírus em um MOI de 0,01, e as célulasinfectadas pelo vírus foram incubadas a 32°C na presença de tripsina. Ossobrenadantes da cultura de tecido foram colhidos em intervalos de 24 horas,congelados e analisados no mesmo teste de TCID50 usando-se hemadsorçãopara identificar as culturas infectadas por vírus. Cada ponto representa atitulação média de três culturas separadas com S.E. Indicated. A linhahorizontal pontilhada indica o limite inferior da detecção viral.

A Figura 19 ilustra a introdução das três mutações do gene Ldo cpAS no pFLC.2G+.hc, o clone antigenômico cDNA do vírus quiméricorPIV3-l. O pTM (L) 942/992/1558 (A) é um clone plasmídeo do gene L quecarrega as três mutações encontradas no çp45. As mutações na posição deaminoácido 942 na proteína L do PIV3 é uma substituição de tyr (wt) para his(cp45) e um sítio Eae I próximo foi removido para marcar este sítio. De modosimilar, a mutação 992 é uma mudanças de leu para phe com um sítio Bsr Iremovido e a mutação 1558 é uma mudança de thr para ile com um sítio AvaII removido. O fragmento SphI-NheI de 2,9 kb presente no pTM (L)942/992/1558 foi introduzido no pFLC.2G+hc (Β), o plasmídeo que carregao clone de tamanho completo do cDNA do rPIV3-l, para dar opFLC+hc.c/?45L (C). Para as construções em (B) e (C), as caixas pretasindicam a localização da ribozima do vírus da hepatite Deo terminador T7,as regiões sombreadas são os ORFs HN e F do PIVl e as caixas abertasrepresentam seqüências derivadas do PIV3. O pFLC.2G+hc.c/?45L foi usadona transfecção para produzir o vírus recombinante quimérico atenuado,designado rPIV3-l.cp45L.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES ESPECÍFICAS

A presente invenção fornece composições e processos paraproduzir e modificar PIV infeccioso a partir de moléculas isoladas depolinucleotídeo, preferivelmente cDNA. As partículas de PIV infeccioso sãoproduzidas por um sistema recombinante de co-expressão que permite aintrodução de mudanças definidas no PIV infeccioso. Estas modificações sãoutilizáveis em uma ampla variedade de aplicações, incluindo odesenvolvimento de cepas vivas de vacina atenuada que carregam mutaçõesatenuadoras definidas, predeterminadas.

Os PIVs infecciosos da invenção são produzidos pela co-expressão intracelular ou isenta de célula de uma ou mais moléculas isoladasde polinucleotídeo que codifica um RNA genoma ou anti-genoma do PIV,junto com um ou mais polinucleotídeos que codificam proteínas virais,necessárias para gerar um nucleocapsídeo replicador, de transcrição. Entre asproteínas virais utilizáveis para co-expressão, para produzir PIV infecciosoestão as proteínas principais, proteína nucleocapsídea (N), proteínanucleocapsídea de fosfoproteína (P) e polimerase grande (L), proteína defusão (F)5 glicoproteína hemaglutinina-neuraminidase (HN) e proteína matriz(M). Também utilizáveis neste contexto são os produtos dos ORJFs C1DeVdo PIV.

Os cDNAs que codificam um genoma ou anti-genoma de PIVsão construídos para a co-expressão intracelular ou in vitro com as proteínasvirais necessárias para formar o PIV infeccioso. "Anti-genoma de PIV"significa uma molécula de polinucleotídeo de sentido positivo isolada queserve como um padrão para a síntese de descendentes do genoma PIV.

Preferivelmente, um cDNA é construído, o qual é uma versão de sentidopositivo do genoma PIV que corresponde ao RNA replicativo intermediárioou anti-genoma, assim como para minimizar a possibilidade de hibridizaçãocom os transcritos de sentido positivo de seqüências complementares quecodificam proteínas necessárias para gerar o nucleocapsídeo replicador, detranscrição.

Em algumas modalidades da invenção o genoma ou anti-genoma de um PIV recombinante (rPIV) necessita apenas conter aquelesgenes ou porções destes necessários para converter as partículas virais ousubvirais infeciosas desse modo codificadas. Além disso, os genes ouporções destes podem ser fornecidos por mais do que uma molécula depolinucleotídeo, isto é, um gene pode ser fornecido por complementação oucoisa parecida a partir de uma molécula separada de nucleotídeo. Em outrasmodalidades, o genoma ou anti-genoma de PIV codifica todas as funçõesnecessárias para o crescimento, replicação e infecção virais sem aparticipação de um vírus auxiliar ou função viral fornecida por um plasmídeoou linhagem de célula auxiliar.

"PIV recombinante" significa uma partícula de PIV ousemelhante ao PIV, viral ou subviral, diretamente ou indiretamente derivadade um sistema de expressão recombinante ou propagada do vírus oupartículas subvirais produzida deste. O sistema de expressão recombinanteutilizará um vetor de expressão recombinante que compreende uma unidadetranscricional operavelmente ligada que compreende uma montagem de pelomenos um elemento ou elementos genéticos que tenham um papel reguladorna expressão do gene PIV, por exemplo um promotor, uma seqüênciaestrutural ou codificadora que é transcrita no RNA do PIV e seqüências deiniciação e terminação de transcrição apropriadas.

Para produzir o PIV infeccioso a partir de um genoma ou anti-genoma de PIV expressado por cDNA, o genoma ou anti-genoma é co-expressado com aquelas proteínas do PIV N, PEL5 necessárias para (i)produzir um nucleocapsídeo capaz da replicação do RNA e (ii) converter osnucleocapsídeos descendentes capazes tanto para replicação quanto para atranscrição do RNA. A transcrição pelo nucleocapsídeo genoma fornece asoutras proteínas do PIV e inicia uma infecção produtiva. Alternativamente,proteínas adicionais do PIV necessárias para uma infecção produtiva podemser supridas pela co-expressão.

A síntese do anti-genoma ou genoma do PIV junto com asproteínas virais mencionadas acima também podem ser obtidas in vitro(isento de célula), por exemplo, usando-se uma reação combinada detranscrição e translação, seguido pela transfecção nas células.Alternativamente, o RNA anti-genoma ou genoma pode ser sintetizado invitro e transfectado nas células que expressam as proteínas do PIV.

Em certas modalidades da invenção, as seqüênciascomplementares que codificam as proteínas necessárias para gerar umnucleocapsídeo do PIV, replicador, de transcrição são fornecidas por um oumais vírus auxiliares. Tais vírus auxiliares podem ser do tipo selvagem oumutante. Preferivelmente, o vírus auxiliar pode ser fenotipicamentedistinguido do vírus codificado pelo cDNA do PIV. Por exemplo, é desejávelfornecer anticorpos monoclonais que reajam imunologicamente com o vírusauxiliar mas não com o vírus codificado pelo cDNA do PIV. Tais anticorpospodem ser anticorpos de neutralização. Em algumas modalidades, osanticorpos podem ser usados em cromatografia de afinidade para separar ovírus auxiliar do vírus recombinante. Para ajudar na obtenção de taisanticorpos, mutações podem ser introduzidas no cDNA do PIV para fornecerdiversidade antigênica deste vírus auxiliar, tal como nos gênerosglicoproteínicos HN ou F.

Em modalidades alternadas da invenção as Ν, P, L e outrasproteínas de PIV desejadas são codificadas por um ou mais vetores não viraisde expressão, que podem ser os mesmos ou separados daquele que codifica ogenoma ou anti-genoma. Proteínas adicionais podem ser incluídas comodesejado, cada uma codificada pelo seu próprio vetor ou por um vetor quecodifica uma ou mais das Ν, P, L e outras proteínas de PIV desejadas ou ogenoma anti-genoma completos. A expressão do genoma ou do anti-genomae das proteínas dos plasmídeos transfectados pode ser obtida, por exemplo,para cada cDNA que esteja sob o controle de um promotor para a polimerasede RNA T7, que a seu turno é suprido pela infecção, transfecção outransdução com um sistema de expressão para a polimerase de RNA T7, porexemplo, uma cepa MVA do vírus vacínia recombinante que expresse apolimerase de RNA T7 (Wyatt et al, Virology, 210: 202 a 205 (1995),incorporado neste por referência em sua totalidade). As proteínas virais e/oua polimerase de RNA T7 também podem ser fornecidas por célulasmamíferas transformadas ou pela transfecção de mRNA pré-formado ou deproteína.

Um anti-genoma de PIV pode ser construído para o uso napresente invenção montando-se, por exemplo, seguimentos de cDNAclonados, que representam quando agregados o anti-genoma completo, porreação de polimerase de cadeia ou coisa parecida (PCR; descrito, porexemplo, nas Patentes U.S. 4.683.195 e 4.683.202 e PCR Protocols: A Guideto Methods and Applications, Innis et al., eds., Academic Press, San Diego(1990), cada uma incorporada neste por referência em sua totalidade) decópias do mRNA ou RNA genoma do PIV transcritas de modo reverso. Porexemplo, uma primeira construção é gerada, que compreende cDNAscontendo o final à esquerda do anti-genoma engendrado a partir de um promotor apropriado (por exemplo, o promotor de polimerase do TNA T7) emontado em um vetor de expressão apropriado, tal como um vetor deplasmídeo, de cosmídeo, de fago ou de DNA de vírus. O vetor pode sermodificado por mutagênese e/ou pela inserção de poliligador sintético quecontenha sítios únicos de restrição designados para facilitar a montagem. Por facilidade de preparação, a Ν, P, L e outras proteínas do PIV desejadaspodem ser montadas em um ou mais vetores separados. O final à direita doplasmídeo anti-genômico pode conter seqüências adicionais como desejado,tais como uma ribozima flanqueadora e terminadores transcricionais T7 emtandem. A ribozima pode ser do tipo cabeça de martelo (por exemplo,Grosfeld et al., (1995), acima). Que poderia produzir um final 3' contendoum nucleotídeo não viral único ou pode ser qualquer uma das outrasribozimas adequadas tal como aquela do vírus delta da hepatite (Perrotta etal., Nature 350: 434 a 436 (1991), incorporada neste por referência em suatotalidade) que poderia produzir um final 3' isento de nucleotídeos que nãodo PIV. Os finais à esquerda e à direita são então unidos por intermédio deum sítio de restrição comum.

Uma variedade de inserções, supressões e rearranjos denucleotídeo podem ser feitas no genoma ou no anti-genoma durante ou apósa construção do cDNA. Por exemplo, as seqüências de nucleotídeos específicas desejadas podem ser sintetizadas e inseridas em regiõesapropriadas no cDNA usando-se sítios de enzima de restrição convenientes.Alternativamente, tais técnicas como mutagênese específica de sítio, examede alanina, mutagênese de PCR ou outras técnicas tais, bem conhecidas natécnica podem ser usadas para introduzir mutações no cDNA.Modos alternativos para construir cDNA que codifique ogenoma ou o anti-genoma inclui PCR de transcrição reversa usando-secondições de PCR melhoradas (por exemplo, como descrito em Cheng et al.,Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 91: 5695 a 5699 (1994), incorporada neste porreferência) para reduzir o número de subunidades de componentes de cDNApara tão pouco quanto um ou dois pedaços. Em outras modalidades,promotores diferentes podem ser usados (por exemplo, T3, SP6) ouribozimas diferentes (por exemplo, aquela do vírus delta da hepatite). Vetoresde DNA diferentes (por exemplo, cosmídeos) podem ser usados para apropagação, para melhor acomodar o genoma ou anti-genoma de tamanho grande.

Os polinucleotídeos isolados (por exemplo, cDNA)quecodificam o genoma ou o anti-genoma pode ser inserido nas célulashospedeiras apropriadas por transfecção, eletroporação, inserção mecânica,transdução ou coisa parecida, nas células que sejam capazes de suportar umainfecção produtiva de PIV, por exemplo, células HEp-2, FRhL-DBS2, LLC-MK2, MRC-5 e Vero. A transfecção de seqüências isoladas depolinucleotídeos pode ser introduzidas em células cultivadas por, porexemplo transfecção mediada pelo fosfato de cálcio (Wigler et ai, Cell 14:725 (1978); Corsaro e Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603 (1981); Grahame Van der Eb, Virology 52: 456 (1973)), eletroporação (Neumann et al.,EMBO J. 1: 841 a 845 (1982)), transfecção mediada por DEAE-dextrana(Ausubel et ai, (ed.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wileyand Sons, Inc., NY (1987), transfecção mediada por lipídio catiônico(Hawley-Nelson et al., Focus 15: 73 a 79 (1993)) ou um reagente detransfecção comercialmente disponível, por exemplo, LipofectACE® (LifeTechnologies, Gaithersburg, MD) ou coisa parecida (cada uma dasreferências anteriores são incorporados neste por referência em suatotalidade).Como mencionado acima, em algumas modalidades dainvenção a N, P5 L e outras proteínas do PIV desejadas são codificadas porum ou mais vírus auxiliares que são fenotipicamente distinguíveis daquelesque codificam o genoma ou anti-genoma. A Ν, P, L e outras proteínasdesejadas do PIV também podem ser codificadas por um ou mais vetores deexpressão que podem ser os mesmos ou separados daqueles que codificam ogenoma ou o anti-genoma e várias combinações destes. Proteínas adicionaispodem ser incluídas como desejado, codificadas por seu próprio vetor ou porum vetor que codifica um ou mais das Ν, P, L ou outras proteínas desejadasdo PIV ou o genoma ou o anti-genoma completo.

As composições e processos da invenção permitem análise e amanipulação da biologia molecular do PIV e os mecanismos patogênicosusando-se, por exemplo, mutações definidas para alterar a função ouexpressão de proteínas selecionadas do PIV. Usando-se estes processos ecomposições, uma pessoa pode facilmente distinguir as mutaçõesresponsáveis pelas mudanças fenotípica desejadas a partir de mutaçõesincidentais silenciosas e mutações seletas específicas de fenótipo para aincorporação em um genoma ou em um anti-genoma recombinante do PIVpara a produção de vacina.

As modificações do PIV fornecidas dentro da invenção sãodirecionadas para a produção de vírus de vacina melhorados, por exemplo,para intensificar a atenuação viral e a imunogenicidade da vacina, pararemover epítopos associados com imunopatologia não desejável, paraacomodar a tendência antigênica, etc. Para alcançar estes e outros objetivos,as composições e processos da invenção permitem uma ampla variedade demodificações a serem introduzidas em um genoma ou anti-genoma do PIV,para a incorporação no PIV infeccioso, recombinante. Por exemplo, genesestranhos ou seguimentos de gene que codificam antígenos ou epítoposprotetores podem ser adicionados dentro de um clone do PIV para gerarcepas de vírus PIV capazes de induzir a imunidade tanto ao PIV quanto a umoutro vírus ou agente do qual o antígeno protetor foi derivado.Alternativamente, genes estranhos podem ser inseridos no todo ou em partecodificando moduladores do sistema imune tais como citocinas, paraintensificar a imunogenicidade de um vírus de vacina.

Outras mutações que podem ser incluídas dentro dos clonesdo PIV da invenção incluem, por exemplo, a substituição dos genes ousegmentos de gene heterólogos (por exemplo, um seguimento de gene quecodifica um final citoplásmico de um gene glicoproteínico) com um gene decontraparte ou um seguimento de gene em um clone do PIV.

Alternativamente, a ordem relativa dos genes dentro de um clone do PIVpodem ser mudados, o promotor do genoma do PIV pode ser substituído pelasua contraparte antiogenômica ou gene(s) selecionado(s), convertido em nãofuncional (por exemplo, pela remoção funcional que envolve a introdução deum códon de interrupção para impedir a expressão do gene). Outrasmodificações em um clone do PIV podem ser feitas para facilitar asmanipulações, tais como a inserção dos sítios de restrição única em váriasregiões não codificadoras ou codificadoras ou em outro lugar. Além disso asseqüências de gene não transladadas podem ser removidas para aumentar acapacidade de inserção de seqüências estranhas.

Assim, fornecendo-se clones infeciosos do PIV a invençãopermite uma ampla faixa de alterações para serem recombinantementeproduzidas dentro do genoma do PIV (o anti-genoma), produzindo mutaçõesdefinidas que especificam mudanças fenotípicas desejadas. "Cloneinfeccioso" significa o cDNA ou seu produto, o RNA, sintético ou docontrário, capaz de ser diretamente incorporado nos virions infecciosos quepodem ser transcritos no RNA genômico ou anti-genômico, capaz de servircomo um padrão para produzir o genoma de partículas infecciosas virais ousubvirais. Como observado acima, as mutações definidas podem serintroduzidas por uma variedade de técnicas convencionais (por exemplo,mutagênese direcionada por sítio) em uma cópia de cDNA do genoma ou doanti-genoma. O uso de subfragmentos de cDNA genômicos ou anti-genômicos para montar um cDNA genoma ou anti-genoma completo comodescrito nesta, tem a vantagem de que cada região pode ser separadamentemanipulada, onde os motivos pequenos de cDNA fornecem melhor facilidadede manipulação do que motivos grandes de cDNA e então facilmentemontados em um cDNA completo. Assim o anti-genoma ou genomacompleto de cDNA ou um subfragmento selecionado deste pode ser usadocomo um padrão para a mutagênese direcionada por oligonucleotídeos. Istopode ser por meio do intermediário de uma forma de fagomídeo de filamentoúnico, tal como usando-se o conjunto MUTA-gen® do Bio-Rad Laboratories(Richmond, CA) ou um processo usando-se o plasmídeo de filamento duplo,diretamente com um padrão tal como o conjunto de mutagênese Chameleon®da Stratagene (La Jolla, CA) ou pela reação de polimerase de cadeiautilizando-se um iniciador oligonucleotídeo como um padrão que contenhaa(s) mutação(ões) de interesse. Um subfragmento mutado pode então sermontado no anti-genoma ou genoma completo do cDNA. Uma variedade deoutras técnicas de mutagênese são conhecidas e podem ser rotineiramenteadaptadas para o uso na produção de mutações de interesse em um anti-genoma ou genoma de cDNA do PIV da invenção.

Assim, em uma modalidade ilustrativa, mutações sãointroduzidas usando-se o conjunto de mutagênese in vitro de fagomídeoMUTA-gene® disponível da Bio-Rad Laboratories. Em resumo, o cDNA quecodifica um genoma ou anti-genoma do PIV é clonado no plasmídeo pTZl 8Ue usado para transformar células CJ236 (Life Technologies). As preparaçõesde fagomídeo são preparadas como recomendado pelo fabricante. Osoligonucleotídeos são projetados para a mutagênese pela introdução de umnucleotídeo alterado na posição desejada do gnoma ou do anti-genoma. Oplasmídeo que contém o genoma ou anti-genoma geneticamente alterado éentão amplificado.

As mutações podem variar desde mudanças únicas denucleotídeo até a introdução, supressão ou substituição de seguimentosgrandes de cDNA contendo um ou mais seguimentos de genes ou de genoma.

Os seguimentos de genoma podem corresponder a domínios estruturais e/oufuncionais, por exemplo, citoplásmico, de transmembrana ou hectodomíniosde proteínas, sítios ativos tais como os sítios que servem de mediador emligações ou outras interações bioquímicas com diferentes proteína, sítiosepitópicos, por exemplo, sítios que estimulam a ligação de anticorpo e/ouhumoral ou imuno respostas mediadas por células, etc. Os seguimentos degenoma utilizáveis neste particular variam de cerca de 15 a 35 nucleotídeosno caso dos seguimentos de genoma que codificam domínios funcionaispequenos de proteínas, por exemplo, sítios epitópicos, a cerca de 50, 75, 100,de 200 a 500 e de 500 a 1500 ou mais nucleotídeos.

A capacidade para introduzir mutações definidas no PIVinfeccioso tem muitas aplicações, incluindo a manipulação de mecanismospatogênicos e imunogênicos do PIV. Por exemplo, as funções das proteínasdo PIV, incluindo as proteínas Ν, Ρ, M, F, HN e L e os produtos de ORF C, De V podem ser manipulados pela introdução de mutações que removam oureduzam o nível de expressão da proteína ou que produzam a proteínamutante. Em uma tal modificação de exemplo, uma seqüência no sítio declivagem da proteína F pode ser modificada e os efeitos desta modificação nocrescimento em cultura de tecido e a infecção e patogênese do PIV resultantepode ser rotineiramente determinada em animais experimentais.

Várias características do estruturais do RNA genoma, taiscomo promotores, regiões intergênicas e sinais de transcrição também podemser rotineiramente manipuladas dentro dos processos e composições dainvenção. Os efeitos das proteínas de ação trans e das seqüências de RNA deação eis podem ser facilmente determinados, por exemplo, usando-se umcDNA anti-genoma completo em testes paralelos usando-se mini-genomas doPIV (Dimock et ai., J. Virol. 67: 2772 a 2778 (1993), incorporado neste porreferência em sua totalidade), cuja condição dependente de resgate éutilizável na caracterização daqueles mutantes que possam ser muitoinibidores para serem recuperados no vírus infeccioso independente dereplicação.

A presente invenção ainda fornece ferramentas e processospara se distinguir facilmente entre mutações incidentais silenciosas e mutações responsáveis por diferenças fenotípicas, por exemplo, pelaintrodução de mutações suspeitas, separadamente e em várias combinações,no genoma ou no anti-genoma do PIV infeccioso do tipo natural (isto é, paraum ou mais caráter fenotípico tal como sensibilidade à temperatura,replicação em um hospedeiro selecionado, etc.). Este processo permite aidentificação de mutações responsáveis pelos fenótipos de vacina desejadostais como atenuação, sensibilidade à temperatura, adaptação ao frio, tamanhode placa pequeno, restrição à faixa de hospedeiro, etc. As mutaçõesidentificadas por estes processos podem então ser introduzidas em váriascombinações para modificar um vírus de vacina a um nível apropriado de atenuação, etc., como desejado. Além disso, a presente invenção fornece acapacidade para combinar mutações de cepas diferentes de vírus em umacepa única de vacina.

Como observado acima as mutações incorporadas dentro dosclones do PIV recombinantemente alterados podem ser selecionados com base em suas capacidades para alterar a expressão e/ou função de umaproteína selecionada do PIV, produzindo uma mudança fenotípica desejadaou para uma variedade de outros propósitos. As mudanças fenotípicasdesejadas incluem, por exemplo, mudanças no crescimento viral em cultura,sensibilidade à temperatura, tamanho de placa, atenuação e imunogenicidade.Por exemplo, uma seqüência de polinucleotídeo que codifica o genoma ou oanti-genoma que pode ser modificado por uma inserção, rearranjo, supressãoou substituição para especificar atenuação, sensibilidade à temperatura,adaptação ao frio, tamanho de placa pequeno, restrição à faixa de hospedeiro,alteração na expressão do gene ou uma mudança em um epítopoimunogênico.

Em um aspecto da invenção, as mutações que ocorrem no PIVatenuado, biologicamente derivado são identificadas e introduzidasindividualmente ou em combinação em um clone do PIV de comprimentocompleto e os fenótipos dos vírus recombinantes resgatados que contêm asmutações introduzidas são determinados. Em modalidades de exemplo, asmudanças de aminoácido apresentadas pelos vírus mutantes biologicamentederivados em relação a um PIV do tipo natural, por exemplo mudançasexibidas por mutantes do PIV que tenham os fenótipos ts, ca ou aít, sãoincorporadas dentro dos clones recombinantes do PIV. Essas mudanças doPIV mutante biologicamente derivado especificam características desejadasnos clones resultantes, por exemplo um fenótipo de atenuação especificadapor uma mutação adotada do HPIV3 mutante do JS cp45. Estas mudanças sãopreferivelmente introduzidas no vírus recombinante usando-se duas ou trêsmudanças de nucleotídeo comparadas a uma seqüência mutantecorrespondente do tipo natural ou biologicamente derivada, que tem o efeitode estabilizar a mutação contra a reversão genética.

A presente invenção também fornece PIV recombinante quetenha mutações múltiplas, especificadoras de fenótipo introduzidas emcombinações selecionadas no genoma ou no anti-genoma de um cloneinfeccioso. Este processo, junto com a avaliação do fenótipo fornece um PIVrecombinante mutante tendo tais características desejadas de atenuação,sensibilidade à temperatura, adaptação ao frio, tamanho pequeno de placa,restrição da faixa hospedeira, etc. Assim, os exemplares de clones do PIV quesão divulgados neste, incorporam uma ou mais e preferivelmente pelo menosduas mutações atenuadoras, por exemplo as mutações ís, ca ou att, adotadasde um mutante do PIV biologicamente derivado, tal como o JS cpA5. Osgenes alvo para adotar as mutações biologicamente derivadas em um PIVrecombinante, neste contexto inclui a proteína nucleocapsídea N, afosfoproteína P, a subunidade L da polimerase grande, a matriz proteínica M,a proteína hemaglutinina-neuraminidase HN, a proteína de fusão F e osprodutos de ORF C, D e V. Também alvejadas são as seqüênciasextragênicas, por exemplo, as seqüências nas regiões 3' líder ou trailer de umgenoma do PIV e nos elementos de ação eis tais como as seqüências dosgenes de início e dos genes de término, por exemplo, o sinal de início dogene N. Os exemplares de mutações incorporadas no PIV recombinante nesteincluem uma ou mais substituições de nucleotídeo que especifica mudança(s)de aminoácido no gene polimerase L, por exemplo, em Tyr942, Leu992 e/ouThr1558. Por exemplo, recombinantes do PIV são divulgados em que Tyr942 ésubstituído por His, Leu992 é substituído por Phe e/ou Thr1558 é substituído porlie. Estas mutações foram incorporadas com sucesso em vários exemplaresdos recombinantes do PIV neste, incluindo os recombinantes r942, r992,rl558, r942/992, r992/1558, r942/1558 ou r942/992/1558, descritos nosExemplos abaixo. Outros exemplares de mutações adotados de um mutantedo PIV biologicamente derivado incluem uma ou mais mutações na proteínaN, incluindo mutações específicas em uma posição que corresponde aosresíduos Val96 ou Ser389 do JS cp45. Em aspectos mais detalhados, estasmutações dão representadas como Val96 para Ala ou Ser389 para Ala. Tambémdivulgado nos exemplos abaixo estão os PIV recombinantes que codificamuma substituição de aminoácido na proteína C, por exemplo, uma mutaçãoem uma posição que corresponde a Ile96 do JS cp45, preferivelmenterepresentada por uma substituição de Ile96 para Thr. Outros exemplares demutações adotadas de mutantes de PIV biologicamente derivados incluemuma ou mais mutações na proteína F, que incluem mutações adotadas do JScpA5 em uma posição que corresponde aos resíduos Ile420 ou Ala450 do JScp45, preferivelmente representada pelas substituições ácidas Ile420 para Valou Ala450 para Thr. Outros recombinantes do PIV dentro da invenção adotam uma ou mais substituições de aminoácido na proteína HN, comoexemplificado abaixo por um PIV recombinante que adota uma mutação emuma posição que corresponde ao resíduo Val384 do JS cp45, preferivelmenterepresentado pela substituição de Val384 para Ala. Exemplos adicionais aindadentro deste aspecto da invenção incluem PIV recombinantes que incorporam uma ou mais mutações em uma seqüência extragênica, por exemplo, umaseqüência líder 3' do genoma ou anti-genoma recombinante de PIV.Exemplares de mutações neste contexto incluem mutações no líder 3' queocorrem em uma ou mais posições que correspondem ao nucleotídeo 23, 24e/ou 28 do JS cp45, por exemplo, uma mudança de T para C no nucleotídeo 23, uma mudança de C para T no nucleotídeo 24 ou uma mudança de G paraT no nucleotídeo 28. As mutações extragênicas adicionais ainda incluem umaou mais mutações na seqüência de início do gene N, como exemplificadoabaixo por uma mutação na seqüência de início do gene N em uma posiçãoque corresponde ao nucleotídeo 62 do JS cp45, preferivelmente representada por uma mudança de A para T. Os exemplares de mutações acima adotadasdo PIV mutante biologicamente são avaliados recombinados no PIVrecombinante nos Exemplos abaixo para resultar, individualmente e/ou emcombinação, em novas cepas atenuadas de candidatos a vacina, comoexemplificado pelos recombinantes designados neste como rcp45, rcp45 3' NCMFHN, rcp45 3'NL, rcp45 3'N e rcp45 F. Outros recombinantes do PIVdentro da invenção incorporarão uma pluralidade e até um complementocompleto das mutações presentes em um ou mais desses recombinantes deexemplo, bem como as mutações identificadas em outras cepas do PIVmutante, biologicamente derivadas, identificadas e adotadas em um PIVrecombinante de acordo com os ensinamentos neste.

As mutações identificadas de acordo com os processosdivulgados neste são compiladas em um "menu" e introduzidas em váriascombinações para calibrar um vírus de vacina a um nível selecionado deatenuação, imunogenicidade e estabilidade. Em modalidades preferidas, ainvenção fornece a suplementação de uma ou mais mutações adotadas doPIV, biologicamente derivadas, por exemplo, mutações ís, ca ou att, comtipos adicionais de mutações que envolvam os mesmos ou diferentes genes.

Os genes alvo para a mutação neste particular também incluem a proteínanucleocapsídea N, a fosfoproteína P, a subunidade L da polimerase grande, aproteína matriz M, a proteína hemaglutinina-neuraminidase HN, a proteínade fusão F e os produtos de ORF C3 D e V. Em um aspecto, os PIVsrecombinantes são fornecidos em que pelo menos uma mutação atenuadoraocorra no gene L da polimerase do PIV e envolva uma substituição denucleotídeo especificando um fenótipo ts ou att adotado de uma cepa do PIVmutante biologicamente derivada, por exemplo a JS cpA5. Os exemplares derecombinantes HPIV3 divulgados neste incluem os recombinantes r942,r992, rl558, r942/992, r992/1558, r942/1558 ou r942/992/1558, descritos nosExemplos abaixo. Estes exemplares de clones de PIV incorporam uma oumais substituições de nucleotídeo que resultam em uma mudança deaminoácido na gene polimerase, por exemplo, em Tyr942, Leu992 e/ou Thr1558.Por exemplo, os recombinantes de PIV são divulgados em que Tyr942 ésubstituído por His, Leu992 é substituído por Phe e/ou Thr1558 é substituído porlie. Preferivelmente duas ou três mutações são incorporadas em um códonque especifica uma mutação atenuadora que adiciona estabilidade aumentadacontra a reversão fenotípica.

Em aspectos adicionais, uma variedade de outras alteraçõesgenéticas podem ser produzidas em um genoma ou anti-genoma do PIVrecombinante para a incorporação no PIV infeccioso recombinante, sozinhaou junto com uma ou mais mutações atenuadoras adotadas de um PIVmutante biologicamente derivado. Os genes heterólogos (por exemplo, dediferentes cepas de PIV ou de fontes não PIV tais como outros vírus, porexemplo, o vírus RSV ou do sarampo) podem ser inseridos ou substituídos,no todo ou em parte, a ordem dos genes mudados, o gene sobrepostoremovido, o promotor do genoma do PIV substituído pelo seu anti-genomade contraparte e mesmo genes não essenciais, inteiros, suprimidos. Em umaspecto, um gene do PIV selecionado, por exemplo o ORF C, D ou V, éfuncionalmente suprimido para produzir um PIV recombinante que tenhanovas características fenotípicas, por exemplo crescimento melhorado invitro e/ou atenuação in vivo. Um clone de PIV infeccioso da invençãotambém pode ser engendrado para intensificar a sua imunogenicidade einduzir a níveis de proteção maiores do que aqueles fornecidos pela infecçãonatural ou para remover epítopos associados com reações imunopatológicasindesejáveis. A imunogenicidade intensificada das vacinas produzidas pelapresente invenção volta-se para um dos maiores obstáculos para controlar oPIV, isto é, a natureza incompleta da imunidade induzida pela infecçãonatural. Neste particular, o(s) gene(s) ou seguimento(s) de gene(s)adicional(is) pode(m) ser inserido(s) no ou próximo ao genoma ou anti-genoma do PIV que pode ser colocado sob o controle de um conjunto comumou independente de sinais de transcrição. Os genes de interesse incluemaqueles que codificam as citocinas (por exemplo, IL-2 até IL-15especialmente o IL-2, IL-6 e IL-12, etc.) e as proteínas ricas em epítopos decélulas auxiliares Τ. A proteína adicional pode ser expressa como umaproteína separada ou como uma quimera engendrada de uma segunda cópiade uma das proteínas do PIV, tais como HN. Isto fornece a capacidade paramodificar e melhorar a imuno resposta contra o PIV, tanto quantitativaquanto qualitativamente.

Outras mutações utilizáveis dentro da invenção envolve asubstituição do final 3' do genoma pela sua contraparte do anti-genoma, queestá associada com mudanças na replicação e transcrição do RNA. Alémdisso, as regiões intergênicas podem ser encurtadas ou alongadas ou mudadasno conteúdo da seqüência. Em aspectos também adicionas, o PIV utilizávelem uma formulação de vacina pode ser conveniente modificado paraacomodar tendência antigênica na circulação do vírus. Tipicamente amodificação será nas proteínas HN e/ou F. por exemplo, uma formaantigênica selecionada de um gene HN ou F completo ou o(s) seguimento(s)que codifica(m) regiões imunogênicas particulares destes é incorporada em um cDNA do genoma ou anti-genoma do PIV pela substituição de umaregião de contraparte no clone infeccioso ou pela adição de uma ou maiscópias do gene tal que diversas formas antigênicas sejam representadas noclone resultante. Os descendentes do vírus produzido a partir do cDNA doPIV modificado são então usados nos protocolos de vacinação contra as cepas emergentes.

Outras mutações para o uso no PIV infeccioso da invençãoincluem mutações nos sinais de ação eis identificados durante a análisemutacional dos mini-genomas do PIV. Por exemplo, a análise insercional edelecional das seqüências líder e trailer e de flanco, identifica promotores virais e sinais de transcrição e fornecem uma série de mutações associadascom graus variados de redução na replicação ou transcrição do RNA. Amutagênese de saturação (por meio da qual cada posição por sua vez émodificada para cada uma das alternativas de nucleotídeo) destes sinais deação eis também identifica mutações que reduzem ou aumentam a replicaçãoou transcrição do RNA. Qualquer uma destas mutações podem ser inseridasno anti-genoma ou genoma complexo como descrito neste.

Modificações adicionais nos clones do PIV podem ser feitaspara facilitar as manipulações, tal como a inserção dos sítios de restriçãoúnica em várias regiões intergênicas ou em outro lugar. As seqüências degene não transladadas também podem ser removidas para aumentar acapacidade de se inserir seqüências estranhas.

Certas substituições, inserções, supressões ou rearranjos degenes ou de segmentos de gene dentro do PIV recombinante da invenção (porexemplo, substituições de um segmento de gene que codifica uma proteínaselecionada ou uma região de proteína, por exemplo um final citoplásmico,um domínio de transmembrana ou um ectodomínio, um sítio ou regiãoepitópica, um sítio ou região de ligação, um sítio ou região ativa quecontenha um sítio ativo, etc.) são feitas em relação estrutural ou funcional auma "contraparte" de gene ou um segmento e gene existentes, do mesmo oude diferente PIV ou de outra fonte. Tais modificações produzem novosrecombinantes tendo mudanças fenotípicas desejadas comparadas ao PIV dotipo natural ou parental ou outras cepas virais. Por exemplo, osrecombinantes deste tipo podem expressar uma proteína quimérica que tenhaum final citoplásmico e/ou um domínio de transmembrana de um PIVfundido a um ectodomínio de outro PIV. Outros exemplares derecombinantes deste tipo expressam regiões duplicadas de proteína, taiscomo as regiões imunogênicas duplicadas.

Como usado neste, genes de "contraparte", seguimentos degene, proteínas ou regiões de proteína são tipicamente de fontes heterólogas(por exemplo, de genes de PIV diferentes ou que representem o mesmo (istoé, homólogas ou alélicas) gene ou seguimento de gene em diferentes tipos oucepas de PIV). As contrapartes típicas selecionadas neste particularcompartilha características estruturais totais, por exemplo, cada contra partepode codificar uma proteína comparável ou um domínio estrutural deproteína, tal como um domínio citoplásmico, um domínio de transmembrana,um ectodomínio, um sítio ou região de ligação, um sítio ou região epitópica,etc. Os domínios de contraparte e seus seguimentos que codificam geneabrangem uma montagem de espécies que tenham uma faixa de tamanho evariações de seqüência definidas por uma atividade biológica comum entre odomínio ou as variantes do seguimento de gene. Por exemplo, dois domíniosde proteína selecionados codificados pelos segmentos de gene de contrapartedentro da invenção compartilha substancialmente da mesma atividadequalitativa, tal como fornecer uma função de transposição de membrana, umaatividade específica de ligação, um sítio de reconhecimento imunológico, etc.Mais tipicamente uma atividade biológica específica compartilhada entre ascontrapartes, por exemplo, entre segmentos selecionados de proteína ouproteínas, serão de modo substancial quantitativamente similar, isto é, nãovariarão nos respectivos níveis de atividade quantitativa em mais do que30%, preferivelmente em não mais do que 20%, mais preferivelmente em nãomais do que 5 a 10%.

Os genes de contraparte e os segmentos de gene, bem comooutros polinucleotídeos divulgados neste para produzir o PIV recombinantedentro da invenção, preferivelmente compartilha da identidade substancial deseqüência com uma "seqüência de referência" de polinucleotídeoselecionado, por exemplo, com outra seqüência de contraparte selecionada.Como usado neste, uma "seqüência de referência" é uma seqüência definidausada como uma base para a comparação de seqüência, por exemplo, umseguimento de um cDNA ou de gene de comprimento completo ou umaseqüência completa de cDNA ou de gene. No geral, uma seqüência dereferência tem pelo menos 20 nucleotídeos no comprimento, freqüentementepelo menos 25 nucleotídeos no comprimento e freqüentemente pelo menos50 nucleotídeos no comprimento. Visto que, dois polinucleotídeos podem,cada um (1) compreender uma seqüência (isto é, uma porção da seqüênciacompleta de polinucleotídeo) que seja similar entre os dois polinucleotídeos e(2) podem ainda compreender uma seqüência que seja divergente entre osdois polinucleotídeos, as comparações de seqüência entre dois (ou mais)polinucleotídeos são tipicamente realizadas comparando-se as seqüências dedois polinucleotídeos em uma "janela de comparação" para identificar ecomparar as regiões locais de similaridade de seqüência. Uma "janela decomparação", como usado neste, refere-se a um seguimento conceituai depelo menos 20 posições contíguas de nucleotídeo em que uma seqüência de polinucleotídeo pode ser comparada a uma seqüência de referência de pelomenos 20 nucleotídeos contíguos e em que a porção da seqüência depolinucleotídeo na janela de comparação pode compreender adições ousupressões (isto é, lacunas, de 20 por cento ou menos como comparado àseqüência de referência (que não compreende adições ou supressões) para umalinhamento ótimo das duas seqüências. Alinhamento ótimo de seqüênciaspara alinhar uma janela de comparação pode ser conduzido pelo algoritmo dehomologia de local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981),pelo algoritmo de homologia de alinhamento de Needleman & Wunsch, J.Mol. Biol. 48: 443 (1970), pelo processo de procura de similaridade de Pearson & Lipman5 Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85: 2444 (1988) (cada umadas quais é incorporada por referência), por implementaçõescomputadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA E TFASTAno Wisconsin Genetics Softwares Package Release 7.0, Genetics ComputerGroup, 575 Science Dr., Madison, WI, incorporada neste por referência) ou pela inspeção e o melhor alinhamento (isto é, que resulta na maiorporcentagem de similaridade de seqüência na janela de comparação) geradopelos vários processos é selecionado. O termo "identidade de seqüência"significa que duas seqüências de polinucleotídeo são idênticas (isto é, emuma base de nucleotídeo para nucleotídeo) na janela de comparação. O termo "porcentagem de identidade de seqüência" é calculado comparando-se duasseqüências otimamente alinhadas na janela de comparação, determinando-seo número de posições nas quais a base de ácido nucleico idêntico (porexemplo A, T, C, G, U ou I) ocorre em ambas as seqüências para dar onúmero de posições emparelhadas, dividindo-se o número de posiçõesemparelhadas pelo número total de posições na janela de comparação (isto é,o tamanho da janela) e multiplicando-se o resultado por 100 para dar aporcentagem da identidade de seqüência. Os termos "identidade substancial"como usado neste denota uma característica de uma seqüência depolinucleotídeo em que o polinucleotídeo compreende uma seqüência quetem pelo menos 85 por cento de identidade de seqüência, preferivelmentepelo menos 90 a 95 por cento de identidade de seqüência, mais usualmentepelo menos 99 por cento de identidade de seqüência como comparado a umaseqüência de referência em uma janela de comparação de pelo menos 20posições de nucleotídeo, freqüentemente em uma janela de pelo menos de 25a 50 nucleotídeos, em que a porcentagem de identidade de seqüência écalculada comparando-se a seqüência de referência à seqüência depolinucleotídeo que pode incluir supressões ou adições que totalize 20 porcento ou menos da seqüência de referência na janela de comparação. Aseqüência de referência pode ser um subconjunto de uma seqüência maior.

Além destes relacionamentos de seqüência de polinucleotídeo,as proteínas e as regiões de proteína codificadas pelo PIV recombinante dainvenção também são tipicamente selecionadas para ter relacionamentosconservativos, isto é, para ter identidade substancial de seqüência ousimilaridade de seqüência, com os polipeptídeos de referência selecionados.

Como aplicado aos polipeptídeos, o termo "identidade de seqüência"significa peptídeos compartilhando aminoácidos idênticos em posiçõescorrespondentes. O termo "similaridade de seqüência" significa peptídeosque têm aminoácidos idênticos ou similares (isto é, substituiçõesconservativas) nas posições correspondentes. O termo "identidadesubstancial de seqüência" significa que duas seqüências de peptídeo quandootimamente alinhadas, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT usando-se pesos de falta de lacuna, compartilham de pelo menos 80 por cento deidentidade de seqüência, preferivelmente pelo menos 90 por cento deidentidade de seqüência, mais preferivelmente pelo menos 95 por cento deidentidade de seqüência ou mais (por exemplo, 99 por cento de identidade deseqüência). O termo "similaridade substancial" significas que duasseqüências de peptídeo compartilham porcentagens correspondentes dasimilaridade de seqüência. Preferivelmente, as posições de resíduo que nãosão idênticas, diferem por substituições conservativas de aminoácido.Substituições conservativas de aminoácido refere-se à permutabilidade dosresíduos que tenham cadeias laterais similares. Por exemplo, um grupo deaminoácidos que têm cadeias laterais alifáticas é glicina, alanina, valina,leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos que têm cadeias lateraishidroxílicas alifáticas é serina e treonina; um grupo de aminoácidos que temcadeias laterais contendo é asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidosque têm cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina e triptofano; umgrupo de aminoácidos que têm cadeias laterais básicas é lisina, arginina ehistidina e um grupo de aminoácidos que têm cadeias laterais contendoenxofre é cisteína e metionina. Os grupos preferidos de substituiçãoconservativa de aminoácidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina e asparagina-glutamina. Asabreviações para os vinte aminoácidos de ocorrência natural usadas nesteseguem o uso convencional (Immunology - A Synthesis (2a ed., E. S. Golub& D. R. Gren, eds., Sinauer Associates, Sunderland, MA, 1991), incorporadaneste por referência). Os estereoisômeros (por exemplo, D-aminoácidos) dosvinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não naturais tais como osaminoácidos α,α-dissubstiuídos, aminoácidos N-alquílicos, ácido lático eoutros aminoácidos não convencionais também podem ser componentesadequados para os polipeptídeos da presente invenção. Exemplos deaminoácidos não convencionais incluem: 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-Ν,Ν,Ν-trimetillisina, ε-Ν-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilistidina, 5-hidroxilisina, co-N-metilarginina e outros aminoácidos similares e iminoácidos (por exemplo, 4-hidroxiprolina). Além disso, os aminoácidos podem ser modificados porglicosilação, fosforilação e outros.

O PIV infeccioso produzido do genoma ou do anti-genomaexpresso pelo cDNA pode ser de qualquer das cepas do PIV ou semelhanteao PIV, por exemplo, humano, bovino ou murino, etc. Para engendrar umaimuno resposta protetora, a cepa de PIV pode ser uma que seja endógena aoindivíduo a ser imunizado, tal como o PIV humano sendo usado paraimunizar seres humanos. O genoma ou o anti-genoma pode ser modificado,entretanto, para expressar genes ou segmentos de gene heterólogos do PIV ougenes ou seguimentos de gene de outras fontes heterólogas, por exemplo, ovírus RSV ou o vírus do sarampo. Assim, o PIV infeccioso pretendido para aadministração em seres humanos pode ser o PIV humano que foi modificadopara conter genes ou seguimentos de gene de um tipo de PIV bovino oumurino tal como para os propósitos de atenuação. O BPIV3 possui mutaçõesde faixa de hospedeiro que restringe a sua replicação em macacos rhesus eem seres humanos (Karron et al., acima, 1995a; van Wyke Coelingh et al.,(1988), cada uma incorporada neste por referência em sua totalidade). 0(s)gene(s), as mutações e seqüências reguladoras de ação eis do BPIV3 queespecificam fenótipos desejados, por exemplo, restrição à faixa dehospedeiro, serão identificados por suas substituições quanto às seqüênciascorrespondentes no rPIV da invenção e incorporados dentro de outro rPIVmodificado para desenvolver ainda agentes de vacina úteis, adicionais. Demodo similar, as mutações do JS cpA5 que são conhecidas por comunicarmutações atenuadoras não ts na faixa de hospedeiro para o macaco rhesus(Hall et al., acima, (1992)) será do mesmo modo identificado e incorporadonos agentes de vacina rPIV modificados, da invenção. Alternativamente, umPIV bovino pode ser modificado para conter genes que codifiquem, porexemplo, proteínas ou epítopos imunogênicos que evoquem proteção contra ainfecção do PIV humano. Por exemplo, os genes glicoproteínicos do PIVhumano podem ser substituídos pela contraparte de genes glicoproteínicosbovinos, tal que o PIV bovino evoque uma imuno resposta protetora em sereshumanos contra as cepas do PIV humano.

Em modalidades de exemplo, genes individuais, seguimentosde gene ou nucleotídeos únicos ou múltiplos de um PIV são substituídospela(s) sequência(s) de contraparte de um PIV heterólogo ou de outra fonte.Por exemplo, seguimentos heterólogos de gene, tais como um que codifiqueum final citoplásmico, um domínio de transmembrana ou um ectodomínio,um sítio ou região epitópica, um sítio ou região de ligação, um sítio ou regiãoativa que contenha um sítio ativo, etc. de uma proteína selecionada de umPIV são substituídos por uma contraparte de segmento de gene em um outroPIV para produzir novos recombinantes, por exemplo, recombinantes queexpressem uma proteína quimérica que tenha um final citoplásmico e/ou umdomínio de transmembrana de um PIV fundido a um ectodomínio de umoutro PIV. Os seguimentos de genoma preferidos neste particular varia decerca de 15 a 35 nucleotídeos no caso de seguimentos que codifiquemdomínios funcionais pequenos de proteínas, por exemplo, sítios epitópicos acerca de 50, 75, 100, 200 a 500 ou 500 a 1500 ou mais nucleotídeos porseguimentos de gene que codifiquem domínios ou regiões de proteínamaiores.

Em um aspecto da invenção, domínios selecionados deproteínas HN e/ou F de uma cepa de PIV são substituídos em um clone dePIV heterólogo para produzir um vírus recombinante capaz de estimular umaimuno resposta de proteção cruzada contra ambas as cepas de PIV em umhospedeiro imunizado. Em outros aspectos, clones modificados de PIV sãofornecidos, que compreendem uma quimera de uma seqüência genômica ouanti-genômica de PIV humano e pelo menos uma seqüência de PIV nãohumano, por exemplo um polinucleotídeo que contenha seqüências tanto dePIV humano quanto de PIV bovino. A substituição de um PIV humano quecodifica seqüência ou que não codifica seqüência (por exemplo, umpromotor, um final de gene, um início de gene, um elemento intergênico ououtro de ação eis) por uma contraparte de seqüência de PIV bovina ou demurino produz recombinantes tendo uma variedade de efeitos atenuadorespossíveis. Por exemplo, um efeito de faixa de hospedeiro freqüentementeoriginar-se-á de um gene de PIV heterólogo que não funcione eficientementeem uma célula humana, da incompatibilidade da seqüência ou proteínaheterólogas com uma seqüência ou proteína de PIV humano biologicamenteinterativa (por exemplo, uma seqüência ou proteína que ordinariamentecoopere com a seqüência ou proteína substituída quanto a transcrição,translação, montagem, etc., virais), entre outros efeitos atenuadores úteis.

Ainda em um outro aspecto da invenção, a inserção de genes ou segmentosde gene estranhos e em alguns casos de seqüências de nucleotídeo nãocodificadoras, no genoma do PIV resulta em um aumento desejado nocomprimento do genoma causando no entanto efeitos fenotípicos adicionaisdesejados. Supõe-se que o comprimento aumentado do genoma resulte naatenuação do clone de PIV resultante, dependente em parte do comprimentodo inserto. Além disso, a expressão de certas proteínas a partir de um geneinserido no PIV recombinante resultará na atenuação do vírus devido a açãoda proteína. Isto foi descrito para o IL-2 expresso no vírus vacínia (ver, porexemplo, Flexner et ai, Nature 33: 259 a 262 (1987)) e também poderia sersuposto par ao interferon gama.

As supressões, inserções, substituições e outras mutações queenvolvam mudanças de genes ou seguimentos de gene virais completos noPIV recombinante da invenção produzem candidatos a vacina altamenteestáveis que são particularmente importantes no caso de indivíduosimunossuprimidos. Muitas destas mutações resultarão em atenuação dascepas de vacina resultantes, ao passo que outras especificarão tipos diferentesde mudanças fenotípicas desejadas. Por exemplo, certos genes virais sãoconhecidos que codificam proteínas que interferem especificamente com aimunidade do hospedeiro (ver, por exemplo, Kato et al., EMBO J. 16: 578 a587 (1997), incorporada neste por referência). Supõe-se que a ablação de taisgenes nos vírus de vacina reduzam a virulência e a patogênese e/ou melhore aimunogenicidade.

Em aspectos preferidos da invenção, os clones de PIVmodificados representam uma quimera de dois ou mais genomas de PIVhumano, por exemplo, um clone contendo seqüências de polinucleotídeo doHPIV3 unidos a seqüências de um ou mais PIVs heterólogos humanos taiscomo o HPIVl e o HPIV2. Assim, genes ou seguimento de gene individuaisdo PIV3 humano pode ser substituído ou suplementado com contrapartes degenes ou seguimentos de gene do HPIVl ou do HPIV2, ou vice versa. Em umexemplo descrito abaixo, a invenção fornece um clone de PIV, o rPIV3 -1, noqual tanto os genes glicoproteínicos HN quanto os F do HPIVl sãosubstituídos por seus genes de contraparte em um antecedente de HPIV3,produzindo um vírus quimérico que tenha características imunológicasrepresentativas de ambas as cepas parentes.

Em aspectos adicionais da invenção, o PIV quimérico ou osclones de PIV que tenham outras alterações de genes ou de seguimentos degene, como descrito acima são ainda modificados pela introdução de uma oumais mutações atenuadoras, adotadas de um PIV mutante, biologicamentederivado, por exemplo, o HPIV3 JS cpAS para se obter um atenuado ou outroderivado mutante quimérico atenuado. Por exemplo, um ou mais PIVhumano que codifica ou que não codifica polinucleotídeos podem sersubstituídos por uma contraparte de seqüência de um PIV humano, PIVbovino ou PIV de murino heterólogos, como descrito acima e sua alteraçãopode ser combinada com uma ou mais mutações que especifiquem, porexemplo, um fenótipo ts, ca ou att, adotados de um mutante de PIV atenuado,biologicamente derivado, para produzir um atenuado ou outro vírus de vacinaatenuado (isto é, comparado ao clone quimérico ou ao vírus parentebiologicamente derivado). Alternativamente, a supressão funcional de umgene ou seguimento de gene não essencial, tal como os ORF C, D ou V,podem ser combinados em um PIV recombinante com uma ou mais mutaçõesque especifiquem um fenótipo ts, ca ou att, de mutantes de PIV,biologicamente derivados, para produzir uma cepa de vacina atenuada. Estasmodificações combinatórias produzem PIV recombinante tendocaracterísticas fenotípicas desejadas, por exemplo, vírus de rendimento aumentado, atenuação intensificada e/ou resistência genética à reversão deum fenótipo atenuado, devido aos efeitos combinados das mutaçõesdiferentes selecionadas.

Em um projeto de mutação combinatória, é fornecido um PIVmodificado que compreende uma quimera de uma seqüência genômica ouanti-genômica de PIV humano e pelo menos um seqüência de PIV nãohumano, por exemplo um polinucleotídeo que contenha seqüências tanto dePIV humano quanto de PIV bovino e que também incorpore uma ou maismutações adotadas de PIV biologicamente derivado, por exemplo, uma oumais mutações ts, ca ou att, de ocorrência natural. Alternativamente, o PIV modificado pode ser uma quimera de dois ou mais genomas de PIV humano,por exemplo um polinucleotídeo que contenha seqüências do HPIV3 unido aseqüências de um ou mais PIVs heterólogos humanos, tais como o HPIVl e oHPIV2 que ainda incorpore um ou mais ts, ca ou att ou outras mutaçõesselecionadas de PIV biologicamente derivado (por exemplo, uma substituiçãode nucleotídeo que especifique um fenótipo ts, ca ou att adotado de uma cepamutante de PIV, biologicamente derivada, tal como a JS cpAS). Em aspectosmais detalhados, os genes ou seguimentos de genes individuais do PIV3humano são substituídos ou suplementados contrapartes de genes ou desegmentos de gene da HPIVl e do HPIV2 ou vice versa, em um clone queseja atenuado ou ainda atenuado por, por exemplo, uma mudança denucleotídeo que codifica uma substituição de aminoácido que confira umamutação ts no gene L de polimerase grande. Por exemplo, a invenção fornececlones de PIV que tenham os genes proteínicos HN e/ou F do HPIVlsubstituídos pelos seus genes de contraparte em um antecedente de HPIV3,em que o fenótipo do clone quimérico resultante é ainda modificado pela(s)mutação(ões) ts, ca ou att codificada(s) dentro de um ou mais dos genes Ν, P,L, M, HN, F, C, D e V. Várias combinações de um menu de mutaçõespossíveis divulgadas neste podem ser feitas para calibrar um vírus de vacinapara um nível selecionado de atenuação, imunogenicidade e estabilidade, porexemplo, para se obter um vírus quimérico satisfatoriamente atenuado eimunogênico que tenha características imunológicas representativas dascepas múltiplas do PIV. Em um aspecto, os PIVs recombinantes sãofornecidos em que pelo menos uma mutação atenuadora ocorra no gene L dapolimerase do PIV (como exemplificado pelos recombinantes r942, r992,rl558, r942/992, r942/1558, r992/1558 ou r942/992/1558 descritos nosExemplos abaixo) incorporado em um antecedente de PIV quimérico. Porexemplo, os recombinantes úteis de PIV quimérico dentro deste aspecto dainvenção terão um ou mais genes ou seguimentos de gene dos genesglicoproteínicos HN e/ou F do, por exemplo, HPIVl substituídos pelo(s)seu(s) gene(s) em um antecedente heterólogo, por exemplo em um clone deHPIV3, e incorporará ainda uma ou mais mutações atenuadoras, porexemplo, substituições de nucleotídeo que resultem em uma mudança deaminoácido no gene polimerase (tal como as mudanças de Tyr para His naposição 942, uma mudança de Leu para Phe na posição 992 e/ou umamudança de Thr para Ile na posição 1558) de um mutante de PIVbiologicamente derivado. Um tal recombinante atenuado, quimérico,exemplificado abaixo é o rPIV3-l.çp45L, um derivado do rPIV3-l queincorpora todas as três mutações do gene L especificadas acima do JS cp45.Mutações ainda adicionais que podem ser incorporadas em umantecedente de PIV quimérico para desenvolver cepas de vacinas serãoselecionadas de mutações biologicamente derivadas em outros genes ou serãocriadas de novo em um genoma recombinante por mutagênese padrãodirecionada por sítio ou outros processos mutagênicos puramenterecombinantes. Os genes alvo para adotar mutações biologicamentederivadas ou para criar novas mutações em um PIV recombinante nesteparticular incluem a proteína nucleocapsídea N, a fosfoproteína P, asubunidade L da polimerase grande, a proteína matriz M, a proteínahemaglutinina-neuraminidase HN, a proteína de fusão F e os produtos deORF C, D e V. São também alvejadas as seqüências extragênicas, porexemplo, as seqüências nas regiões 3' líder ou trailer de um genoma PIV. Asmutações de exemplo identificadas e incorporadas no PIV recombinante, nãoquimérico, descritas acima serão assim facilmente incorporadas dentro de umantecedente de PIV quimérico, por exemplo, como exemplificado pelorPIV3-l. Estes exemplos de mutação incluem uma ou mais mutações naproteína N, incluindo mutações específicas em uma posição que correspondeaos resíduos Val96 ou Ser389 do JS cp45. Em aspectos mais detalhados, estasmutações são representadas como de Val96 para Ala ou de Ser389 para Ala.

Também desejadas para a incorporação em recombinantes quiméricos de PIVsão as mutações na proteína C, por exemplo, uma mutação em uma posiçãoque corresponda a Ile96 do JS cp45, preferivelmente representada por umasubstituição de Ile96 para PHR, como descrito acima. Outros exemplos demutações para a incorporação em um antecedente quimérico de PIV incluemuma ou mais mutações na proteína F, adotada por exemplo do JS cp45 emuma posição que corresponda aos resíduos Ile420 ou Ala450, por exemplo,substituições de Ile420 para Val ou de Ala450 para Thr. Os recombinantesquiméricos de PIV ainda adicionais dentro da invenção adotarão uma ou maissubstituições de aminoácido na proteína HN, por exemplo uma mutação emuma posição correspondente ao resíduo Val384 do JS cp45, tal como de Val384para Ala. Os recombinantes quiméricos ainda adicionais incorporarão uma oumais mutações em uma seqüência extragênica, por exemplo, uma seqüência3' líder do genoma ou do anti-genoma recombinante. Exemplos de mutaçõesneste particular incluem mutações no 3' líder que ocorrem em uma ou maisposições que correspondem ao nucleotídeo 23, 24, 28 e/ou 45 do JS c/?45, porexemplo, uma mudança de T para C no nucleotídeo 23, uma mudança de Cpara T no nucleotídeo 24, uma mudança de G para T no nucleotídeo 28 ouuma mudança de T para A no nucleotídeo 45. As mutações extragênicasainda adicionais para a incorporação dentro de um antecedente quimérico dePIV incluem uma ou mais mutações em uma seqüência de início do gene N,com exemplificado neste por uma mutação na seqüência de início do gene Nem uma posição que corresponde ao nucleotídeo 62 do JS c/?45, tal comouma mudança de A para T. Estes exemplos de mutações avaliados ecombinados no PIV recombinante nos Exemplos abaixo serão facilmenteincorporados dentro de um recombinante quimérico de PIV usando-se osprocessos e as ferramentas fornecidos neste e especificarão, individualmentee/ou em combinação, mudanças fenotípicas desejadas para produzir aindacepas quiméricas de vacina atenuada adicional, dentro da invenção.

Em projetos adicionais de mutação combinatória, sãofornecidos PIVs modificados que incorporam uma ou mais das mutaçõesanteriores ís, ca ou att, adotadas de PIV biologicamente derivados ourecombinantemente geradas em um clone de PIV da invenção, emcombinação com uma outra mutação distinta divulgada neste (por exemplo,uma supressão, uma adição ou um rearranjo de um gene ou segmento de genede PIV Ν, P, L, M, HN5 F, C, D ou V, ou um gene ou segmento de gene deuma outra fonte tal como o vírus RSV ou do vírus do sarampo). Tambémneste caso, várias combinações de um menu de mutações divulgadas nestepodem ser feitas para calibrar o vírus de vacina a um nível selecionado deatenuação, imunogenicidade e estabilidade. Assim, são fornecidos PIVsrecombinantes que apresentam pelo menos uma mutação atenuadora de ummutante de PIV biologicamente derivado, por exemplo, uma mutação nogene L da polimerase do PIV como observado no JS cp45, ou uma mutaçãogerada de modo recombinante e ainda incorpore uma ou mais mudançasadicionais selecionadas dentre, por exemplo, uma substituição ou introduçãode um gene ou segmento de gene heterólogos de uma fonte não PIV (porexemplo, um gene ou epítopo imunogênicos do RSV ou do sarampo ou umgene que codifica uma citocina), uma mudança na ordem dos genes viraispara alterar os níveis de expressão, uma remoção do gene sobreposto, umasubstituição de um promotor do genoma de PIV pela sua contraparteantigenômica, um encurtamento, um alongamento ou uma remoção deregiões intergênicas, por exemplo, para aumentar a capacidade para inserirseqüências estranhas, mutações em sinais de ação eis para reduzir ouaumentar a replicação ou transcrição do RNA, uma inserção de sítios derestrição única ou uma supressão de genes não essenciais, mesmo total, entreoutras mudanças.

Para o uso em vacina, o vírus produzido de acordo com apresente invenção pode ser usado diretamente em formulações de vacina ouliofilizado, como desejado, usando-se os processos de liofilização bemconhecidos pelo técnico. O vírus liofilizado será tipicamente mantido a cercade 4°C. Quando pronto para o uso o vírus liofilizado é reconstituído em umasolução estabilizadora, por exemplo, salmoura ou que compreenda SPG,Mg+* e HEPES, com ou sem adjuvante, como ainda descrito abaixo.

As vacinas de PIV da invenção contêm como ingrediente ativouma quantidade imunogenicamente eficaz do PIV produzido como descritonesta. O vírus modificado pode ser introduzido em um hospedeiro comcarregador fisiologicamente aceitável e/ou adjuvante. Os carregadoresutilizáveis são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, água, águatamponada, salmoura a 0,4%, glicina a 0,3%, ácido hialurônico e outros. Assoluções aquosas resultantes podem ser acondicionadas para ao uso comoestão ou liofílizadas, as preparações liofilizadas sendo combinadas com umasolução estéril antes da administração como acima mencionado. Ascomposições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamenteaceitáveis como requerido para se aproximar das condições fisiológicas, taiscomo agentes ajustadores de pH e tamponizantes, agentes ajustadores datonicidade, agentes umectantes e outros, por exemplo, acetato de sódio,lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio,monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina e outros. Os adjuvantesaceitáveis incluem o adjuvante incompleto de Freund, MPL® (monofosforillipídio A 3-o-desacilado; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT)e IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA), entre muitos outros adjuvantesadequados, bem conhecidos na técnica.

Na imunização com uma composição de PIV como descritoneste, via aerossol, gotinha, oral, tópico ou outro caminho, o sistema imunedo hospedeiro responde à vacina pela produção de anticorpos específicospara as proteínas do vírus PIV, por exemplo, as glicoproteínas F e HN. Comoum resultado da vacinação com uma quantidade imunogenicamente eficaz doPIV produzido como descrito neste, o hospedeiro torna-se pelo menos parcialou completamente imune à infecção pelo PIV ou resistente para desenvolverinfecção moderada ou grave pelo PIV, particularmente do trato respiratórioinferior.

O hospedeiro ao qual as vacinas são administradas pode serqualquer mamífero que seja suscetível à infecção pelo PIV ou um vírusintimamente relacionado e cujo hospedeiro seja capaz de gerar uma imunoresposta protetora aos antígenos da cepa inoculada por vacinação.Consequentemente, a invenção fornece processos para criar vacinas para umavariedade de usos humanos e veterinários.As composições de vacina que contêm o PIV da invenção sãoadministrados a um hospedeiro suscetível a ou de outro modo em riscoquanto à infecção pelo PIV5 para intensificar as capacidades de imunoresposta próprias do hospedeiro. Uma tal quantidade é definida como sendouma "dose imunogenicamente eficaz". Neste uso, a quantidade precisa doPIV a ser administrado dentro de uma dose eficaz dependerá do estado desaúde e do peso do hospedeiro, do modo de administração, da natureza daformulação, etc., mas no geral, variará de cerca de IO3 a cerca de IO6unidades formadoras de placa (PFU) ou mais do vírus por hospedeiro, demodo mais comum de cerca de IO4 a IO5 PFU/ vírus por hospedeiro. Emqualquer evento, as formulações de vacina devem fornecer uma quantidadede PIV modificado da invenção, suficiente para proteger eficazmente opaciente hospedeiro contra infecção séria ou que ameace a vida.

O PIV produzido de acordo com a presente invenção pode sercombinado com vírus de outros sorotipos ou cepas do PIV para se obterproteção contra sorotipos ou cepas múltiplas do PIV. Alternativamente, aproteção contra sorotipos ou cepas múltiplas do PIV pode ser obtidacombinando-se epítopos protetores de sorotipos ou cepas engendradas em umvírus, como descrito neste. Tipicamente quando diferentes vírus sãoadministrados estarão em mistura e são administrados simultaneamente, mastambém podem ser administrados separadamente. A imunização com umacepa pode proteger contra cepas diferentes do mesmo ou de sorotipodiferente.

Em alguns casos pode ser desejável combinar as vacinas dePIV da invenção com vacinas que induzam a respostas protetoras a outrosagentes, particularmente outros vírus da infância. Em um outro aspecto dainvenção, o PIV pode ser utilizado como um vetor para antígenos protetoresde outros patógenos, tais como o vírus sincicial respiratório (RSV) ou o vírusdo sarampo, incorporando-se as seqüências que codificam aqueles antígenosprotetores no genoma ou antigenoma do PIV que é usado para produzir o PIVinfeccioso, como descrito neste. A clonagem do cDNA do RSV e outrasdivulgações relevantes à invenção estão descritas nos pedidos de patente co-pedentes dos Estados Unidos Série n25 08/534.768, 60/021.773, 08/720.132,60/046.141, 60/047.634 e 08/892.403 e pedido de patente PCTPCT/US97/12269, cada uma incorporada neste por referência.

Administrações únicas ou múltiplas das composições devacina da invenção podem ser realizadas. Em neonados e lactentes, aadministração múltipla pode ser requerida para evocar níveis suficientes deimunidade. A administração deve iniciar dentro do primeiro mês de vida eem intervalos por toda a infância, tal como em dois meses, seis meses, umano e dois anos, como necessário para se manter níveis suficientes deproteção contra o PIV natural (do tipo selvagem) e/ou outros motivos deinfecções virais. De modo similar, os adultos os quais são particularmentesuscetíveis à infecções por PIV repetidas ou sérias, por exemplotrabalhadores da saúde, diaristas, membros da família de crianças jovens,idosos e indivíduos com a função cardiopulmonar comprometida podemrequerer imunizações múltiplas para estabelecer e/ou manter imuno respostasprotetoras.

Os níveis de imunidade induzida fornecidos pelas vacinas dainvenção podem ser monitorados medindo-se as quantidades de anticorposneutralizadores das secreções e do soro. Com base nestas medições, asdosagens de vacina podem ser ajustadas ou vacinações repetidas comonecessário, para se manter os níveis desejados de proteção. Além disso, vírusde vacina diferentes podem ser vantajosos para de grupos receptoresdiferentes. Por exemplo, uma cepa de PIV engendrada que expresse umaproteína adicional rica em epítopos de célula T pode ser particularmentevantajoso para adultos ao invés para crianças.

Já em um outro aspecto da invenção, o PIV é utilizado comoum vetor para a terapia transitória de gene do trato respiratório. De acordocom esta modalidade o genoma ou o anti-genoma do PIV recombinanteincorpora uma seqüência que é capaz de codificar um produto de gene deinteresse. O produto de gene de interesse está sob o controle do mesmo ou deum promotor diferente daquele que controla a expressão do PIV. O PIVinfeccioso, produzido pela co-expressão do genoma ou do anti-genoma doPIV recombinante com as Ν, P, L e outras proteínas desejadas do PIV e quecontenha uma seqüência que codifique o produto de gene de interesse, éadministrado a um paciente. A administração é tipicamente por aerossol,nebulizador ou outra aplicação tópica ao trato respiratório do paciente sendotratado. O PIV recombinante é administrado em uma quantidade suficientepara resultar na expressão dos níveis terapêuticos ou profiláticos do produtode gene desejado. Os produtos de gene representativos que podem seradministrados dentro deste processo são preferivelmente adequados para aexpressão transitória, incluindo, por exemplo, interleucina-2, interleucina-4,gama-inteferon, GM-CSF, G-CSF, eritropoietina e outras citocinas,glicocerebrosidase, fenilalanina hidroxilase, regulador de condutânciatransmembrânica de fibrose cística (CFTR), transferase fosforibosílica dahipoxantina-guanina, citotoxinas, genes supressores de tumor, RNAs anti-sentido e antígenos de vacina.

Os exemplos seguintes são fornecidos por via de ilustração,não de limitação.

EXEMPLO I

CONSTRUÇÃO DO PLASMÍDEO p218 (131) QUE CODIFICA O RNAGENÔMICO DO PIV DE SENTIDO NEGATIVO

Um clone de cDNA completo, designado p218 (131) (Figura1; (SEQ ID NO: 1) (depositado sob os termos do Tratado de Budapest com aAmerican Type Culture Collection (ATCC) da 12301 Parklawn Drive,Rockville, Maryland 20852, U.S.A. e concedido a designação 97991) foiconstruído para codificar a seqüência genômica completa de 15462 nt dacepa HPIV3 JS. Uma ribozima da hepatite delta foi colocada adjacente aofinal 3' da seqüência genômica tal que a clivagem própria produziria o final31 do HPIV3 (Perrotta e Been, Nature 350: 434 a 436, (1991), incorporadaneste por referência em sua totalidade). Um terminador de transcrição T7 foicolocado a seguir da ribozima delta. O promotor T7 foi colocado adjacenteao final 5' da seqüência genômica tal que o nucleotídeo terminal 5' dogenoma do HPIV3 foi o primeiro nucleotídeo sintetizado. Nestaconfiguração, o cDNA codifica uma cópia completa de sentido negativo doRNA genômico do PIV3 que contém o término genômico correto semquaisquer nucleotídeos heterólogos adicionais.

O cDNA do HPIV3 foi montado a partir de 14 subclones desobreposição (denominados A*-L, cujas letras em parênteses designamplasmídeos individuais e não se referem a genes virais específicos)construídos por transcrição reversa (RT) e reação de polimerase de cadeia(PCR) do RNA isolado de virions purificados por centrifugação de gradientede sacarose (Stokes et al., acima, 1992; Stokes et al., acima, 1993, cada umaincorporada neste por referência em sua totalidade). Os subclonesabrangeram os seguintes nucleotídeos do RNA genômico (numerados com ofinal 3'designado como posição 1): 1 a 2058 (A*), 1874 a 3111 (A'), 3086 a5140 (C)5 4348 a 5276 (C)5 5072 a 6695 (D*), 5904 a 8532 (E), 7806 a 9898(F), 9332 a 10740 (F'), 9760 a 10955 (G), 10862 a 11925 (H), 11835 a 12868(I), 12426 a 13677 (J), 13630 a 14496 (K) e 14467 a 15462 (L). Cadafragmento foi clonado no pBluescript KSII (Strategene, La Jolla, CA)usando-se técnicas convencionais de clonagem e foi completamentesequenciado.

O plasmídeo p(L) foi então submetido à mutagênesedirecionada a sítio para introduzir o promotor T7 por intermédio de umintermediário de DNA de filamento único de acordo com o procedimentoMUTA-GENE (BioRad, Hercules, CA). O promotor T7 foi posicionado demodo que a transcrição iniciasse precisamente no final 5' do genoma doHPIV3 usando-se o iniciador mutagênico de sentido negativo: 5'-AATACGACTCACTATA*ACCAAACAAGAGAAG-3' (SEQ ID NO: 2; asseqüências T7 estão em itálico, as seqüências específicas do HPIV3 estãosublinhadas e o nucleotídeo do HPIV3 de final 5', a posição do genoma15462 está indicada por um asterisco). Este p(L) modificado foi designadop(L*). O plasmídeo p(E) foi modificado para produzir o p(E*) pelo mesmoprocesso usando-se o oligonucleotídeo mutagênico de sentido negativo 5'-CCAAGTACTATGAGATGCTTGATT-3' (SEQ ID NO: 3) para inserir trêssubstituições de nucleotídeo (sublinhado) no gene HN no HPIV3 na posição7903, 7913, 7915 (Figura 1). Estas substituições removeram um sítio Hgal,inseriu um sítio Seal, e o aminoácido 370 modificado da proteína codificadaHN tal que o epítopo reconhecido pelos anticorpos monoclonais (mAb) 423/6e 170/7 foi removido (van Wyke Coelingh et al., J. Virol. 61: 1473 a 1477,(1987), incorporada neste por referência). Os subclones p(E*) até p(K) forammontados de um modo por etapas no plasmídeo p(L*) para dar oP(E*FF'GHIJKL*) (Figura IA). Este plasmídeo inclui os nucleotídeos doHPIV3 de 5904 a 15462 com o promotor T7 adjacente ao nucleotídeo 15472no final 5' do genoma. Os subclones p(A*) até p(E) foram montados em umsegundo subclone de sobreposição, p(A*A'CC'D*E) que continha osnucleotídeos do HPIV3 de 1 a 8532.

Tanto o subclone p(E*FF'GHIJKL*) quanto o subclonep(A*A'CC'D*E) foram completamente sequenciados. Além das mutações deponto introduzidas, descritas acima, o cDNA diferiu da seqüência JS HPIV3autêntica (Stokes et al., acima, 1992) por uma substituição única denucleotídeo na posição 1615 que foi dentro do gene N e causou umasubstituição no aminoácido 506 na proteína codificada. Três outrassubstituições de nucleotídeo foram observadas nas posições 10355, 11333 e15248 no gene L que não mudou a proteína codificada (figura 2). Estas trêsmudanças não codificadoras foram retidas como marcadores adicionais deseqüência para identificar o vírus recombinante (designado rPIV) derivado docDNA e a mutação no gene N foi corrigida como descrito mais tarde.

O subclone p(A*A'CC'D*E) foi então modificado para inserira ribozima do vírus da hepatite delta e o terminador T7 adjacente à posição 1do HPIV3. Um mini-genoma do HPIV3 em que o final 3' do genoma HPIV3(GGTÍGGG) (sublinhado) foi gerado através de clivagem própria de umaribozima anti-genômica de flanco do vírus da hepatite delta (mostrado emparte em negrito) foi previamente construída (Dimock e Collins, J. Virol. 67:2772 a 2778, (1993); Perrotta e Been, acima, (1991) cada uma incorporadaneste por referência em sua totalidade). A ribozima ao seu turno foi seguidapor um terminador de transcrição T7. Este mini-genoma de cDNA foi usadocomo um padrão em uma reação de PCR que modificou a seqüênciaadjacente até o sítio de clivagem da ribozima para ser um sítio Smal(CCCvl-GGG) e colocado um sítio Apal (GGGCCÍC) no lado descendente doterminador T7. O produto de PCR foi clonado no pKSII que foi digerido comZfasHII abruptamente terminado por enchimento, produzindo o p218.

O p218 foi projetado tal que qualquer seqüência poderia serintroduzida no sítio aberto Smal pela ligação de final abrupto e o seutranscrito de RNA poderia ser clivado no sítio de corte da ribozima delta(NNNÍGGG). O subclone p(A*A'CC'D*E) foi digerido com Hgal e SalI(8533) que liberou o cDNA do HPIV3 e foi enchido com dNTPs e polimeraseT4 de DNA para dar o término abrupto. O sítio Hgal está 10 nucleotídeos emfluxo ascendente da posição 1 do HPIV3 e quando digerido e enchido deixaum término abrupto que inicia com a posição 1 do HPIV3. O fragmento Hgal-SalI foi purificado em gel e clonado no sítio Smal do p218. A mutação nogene N (T no nt 1615) foi corrigida para a seqüência JS wt (A no nt 1615)(ver GenBank acesso # Zl 1575, incorporada neste por referência) usando-semutagênese de Kunkel (Kunkel et al., Methods Enzymol. 154: 367 a 382,(1987), incorporada neste por referência em sua totalidade). O plasmídeo foidesignado p218 (A*A'CC'D*E) (Figura 1).

O fragmento Xhol -NgoMI do p(E*FF'GHIJKL*), quecontinha o promotor T7 e o cDNA dos nucleotídeos 7438 a 15462 foiclonado na janela ^TzoI -NgoMI do p218 (A*A'CC'D*E) (Figura 1). Isto uniuos dois fragmentos do cDNA do HPIV3 no nucleotídeo 7438 do HPIV3,produzindo um plasmídeo que contém um cDNA do HPIV3 de comprimentocompleto que codifica um RNA genômico de sentido negativo com as trêsmutações desejadas, mencionadas acima no gene HN e três mutaçõesincidentais no gene L. A construção final, designada p218 (131) (Figura 1;SEQ ID NO: 1), foi então sequenciada em sua totalidade por sequenciadorautomatizado no NCI Frederick Câncer Research and Development Center(Frederick, MD) usando-se o conjunto sequenciador de ciclo Taq DYEDeoxy Terminator (ABI, Foster City, CA). Isto identificou uma mudançaadicional no gene HN isto é, uma mudança de C para T no gene HN naposição 7593 que mudou o aminoácido 263 do HN de treonina paraisoleucina, isto também está indicado na Figura 2.

EXEMPLO II

TRANSCRIÇÃO E SISTEMA DE REPLICAÇÃO DE RNA PARA OHPIV3

O presente exemplo descreve composições e processos paraproduzir uma transição reconstituída e um sistema de replicação de RNA parao vírus da parainfluenza humana do tipo 3 (HPIV3). Este sistema exemplarfoi desenvolvido usando-se componentes expressados intracelularmente apartir de plasmídeos transfectados direcionados por uma polimerase T7 deRNA suprido por um vírus vacínia recombinante. O sistema é fundamentadoem um análogo de sentido negativo do RNA genômico do HPIV3 no qual osgenes virais foram suprimidos e substituídos por um polinucleotídeo quecodifica a cloranfenicol acetil transferase bacteriana (CAT). As proteínas N,PeL são expressas de plasmídeos co-transfectados de modo a direcionareficazmente a transcrição e a replicação do RNA. A transcrição de acordocom este exemplo produz um mRNA subgenômico poliadenilado, que podeser facilmente isolado, por exemplo, por oligo (dT) cromatografia. Areplicação de RNA de acordo com este exemplo produz mini-antigenoma edescendente de mini-genoma, que mostram ser encapsidados com base naresistência à digestão com nuclease microcócica.

A) VÍRUS E CÉLULAS

Um vírus vacínia recombinante, vTF7-3, que expressa obacteriofago T7 de polimerase de RNA, foi fornecido como descrito porFuerst et al., (.Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 83: 8122 a 8126, 1986,incorporada neste por referência em sua totalidade). As culturas demonocamada HEp-2 foram mantidas a 37°C em 5% de CO2 com OptiMEM 1(Life Technologies, Gaithersburg, MD) suplementado com 2% de soro fetalbovino (FBS), 50 μg/ml de sulfato de gentamicina e 2 mM de glutamina.

B) cDNAs

Os cDNAs que correspondem aos ORFs dos genes Ν, P e L dacepa JS do HPIV3 (GenBank #Z11575; Stokes et al., 1992) foramindividualmente clonados na janela Ncol-Sall do plasmídeo pTM-1, no qual atranscrição é mediada pela polimerase e translação T7 do RNA por um sítiointerno de entrada de ribossoma que precede o ORF estranho (Elroy-Stein etal., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 86: 6126 a 6130 (1989) incorporada nestepor referência em sua totalidade). Cada gene foi primeiro modificado pelareação de polimerase de cadeia (PCR) para colocar um sítio Neol oucompatível com Ncol no sítio de início translacional e um sítio Sall no finalde fluxo descendente.

O plasmídeo p(131), que é similar ao p218 (131) exceto quecarece da ribozima do vírus da hepatite delta, foi usado como um padrão paracada PCR. Os iniciadores usados par amplificar a ORF de N foramCCCTAT AATTTC ΑΛCA JG7TGAGCCTATTTG (SEQ ID NO: 4; iniciadoravançado relativo ao sentido positivo) e

GATTAAAATGTTGGrCG^CTTAGTTGCTTCC (SEQ ID NO: 5; os itálicos representam os sítios de enzima de restrição e o sítio de iníciotranslacional está em negrito). O produto de PCR, um fragmento de 1578 bpflanqueado por um sítio Afl III e Sal I, foi clonado na janela ./VcoI -Sali dopTM-1 para produzir o pTM(N).

Os iniciadores usados para amplificar o ORF de fosfoproteína (P) do PIV3 foram 5'-

CCATAGAGAGTCC4 rGGAAAGCGATGCTAAAAACTATC-3' (SEQ IDNO: 6; iniciador avançado) e 5'-

CGGTGTCGTTTCTTTGrCG^CTCATTGGCAATTGTTG-3' (SEQ ID NO:7; iniciador reverso). Um cDNA de comprimento completo da cepa JS do RNA genômico (pl31) foi usado como padrão para a PCR. O produto dePCR resultante foi um fragmento de 1851 bp, flanqueado por um sítio derestrição Neol e Sall (em itálicos). O produto de PCR foi então clonado najanela Ncol-Sall do pTM-1 para produzir o pTM (P).

Um segundo PCR foi realizado para amplificar o ORF de fosfoproteína P do PIV3 sem o ORF C. O pl31 foi novamente usado comocDNA padrão. Um iniciador avançado diferente e o mesmo iniciador reversoforam usados para amplificar o ORF P PIV3 sem o C; 5'-CCATAGAGAGTCC^JGGAAAGCGAÇGCTAAAAACTATC-3' (SEQ IDNO: 74; iniciador avançado) e 5'-

CGGTGTCGTTTCTTTGrCG^CTCATTGGCAATTGTTG-3' (SEQ ID NO:7; iniciador reverso). O produto de PCR resultante foi um fragmento de 1851bp flanqueado por um sítio de restrição Ncol e SalI (designado por itálicos).O nucleotídeo sublinhado no iniciador avançado representa uma substituiçãoque é silenciosa no ORF P mas muda o códon do início do ORF C paratreonina. O próximo códon de início para o ORF C está a mais do que 400nucleotídeos em fluxo descendente. Assim, apenas a proteína P poderia serproduzida. O produto de PCR foi clonado na janela Ncol-Sall do pTM-1 paraproduzir um segundo plasmídeo, o pTM (P nenhum C).

O ORF L do HPIV3 foi clonado no pTM -1 em três partes: osfinais foram derivados de produtos de PCR e o corpo principal foi umfragmento de restrição do p218 (131). O final de fluxo ascendente do ORF Lfoi amplificado usando-se os iniciadoresGCAAAGCGTGCCCGGGCCA TGGACACTGAATCTAACAATGGC (SEQID NO: 8) e GAAATTCCTTA^TCGA7TCTCTAGATTC (SEQ ID NO: 9).Isto produziu o produto de PCR de 1.020 bp, LI, no qual as posições 8625-9645 do genoma de comprimento total foram flanqueadas pelos sítios Smal eNcol no final de fluxo ascendente e por um sítio Clal no final de fluxodescendente (todos os três sítios estão em itálico). O final de fluxodescendente do ORF L foi amplificado usando-se os iniciadoresCCCATCAACTGTAACΑΓΛCGZ^AGAAAGAC (SEQ ID NO: 10) eGGTTAGGATATGrCG^CATTGTATTTATG (SEQ ID NO: 11). Istoproduziu o produto de PCR de 1.733 bp, L2, no qual as posições 13: 645-15.378 do genoma de cadeia completa foram flanqueadas por um sítio SnaBle Sall (italicizado). O plasmídeo p(131) foi digerido com Clal e Pstl paraproduzir o fragmento L central de 4.487 bp, que contém as posições 9.630-14.120 do genoma de cadeia completa. O Ll e o L central foram unidos nosítio comum Clal e clonados na janela Smal-Pstl do pBluescript paraproduzir o p(Ll + L central). O fragmento L2 foi então clonado na janelaPstl-Sall do p(Ll + L central) para produzir o ORF L completo flanqueadopelo Neol e SaU.. Este foi então clonado na janela Neol e SalI do pTM-1 paraproduzir o pTM (L). as seqüências das regiões geradas por PCR do pTM (N)(SEQ ID NO: 20), pTM (P) (SEQ ID NO: 21) e pTM (L) (SEQ ID NO: 22)foram confirmadas pelo processo de sequenciamento de didesoxinucleotídeo.Para aumentar a eficiência da transcrição T7 certasmodificações foram feitas para uma construção de cDNA que codifica ummini-genoma PIV de sentido negativo, chamado PIV3 -CAT(-) (Dimock eCollins, J. Virol. 67: 2772 a 2778 (1993), incorporada neste por referência emsua totalidade). O PIV3 - CAT(-) inclui o terminal 3' de 111 nucleotídeos e oterminal 5' de 115 nucleotídeos do genoma HPIV3 fundido a uma cópia desentido negativo do ORP CAT. Este cDNA foi designado para produzir, nalinearização com Hgal e na transcrição com polimerase de RNA T7, ummini-genoma que contenha os finais corretos exatos do genoma HPIV3. Duasrodadas sucessivas de PCR, usando-se oligonucleotídeos mutagênicos queadicionam extensões sucessivas ao final do cDNA, onde usado para substituiro sítio Hgal com a ribozima delta da hepatite (Perrotta e Been, Nature 350:434 a 436 (1991), incorporada neste por referência em sua totalidade), tal queclivagem própria gere o final 3' do HPIV3 genômico correto. Um sinal determinação transcricional T7 foi inserido imediatamente após a ribozima(Figura 3) para produzir o PIV3 - CAT - delta. O cDNA do PIV3 - CAT -delta foi modificado pela mutagênese de PCR para inserir um, dois ou trêsresíduos G entre o promotor T7 e o final 5' do mini-genoma, usando-se sítiosde restrição flanqueando o trailer e o promotor T7. Esta modificaçãoproduziu eficiência aumentada de transcrição T7. Em experimentospreliminares, o mini-genoma contendo dois resíduos G, chamados PIV3 -CAT - GG foi o mais ativo na expressão do CAT no sistema de transcrição ereplicação reconstituídos, descrito abaixo e foi usado para todos os derivadossubsequentes.

O cDNA do PIV3 - CAT - GG foi ainda modificado pormutagênese de PCR de sobreposição para introduzir modificaçõessimultaneamente a dois sítios como segue. Primeiro, a seqüência T7CT, quecontém os motivos transcricionais de terminação em tandem para apolimerase de RNA de estágio precoce do vírus vacínia (T5NT) (Yuen eMoss, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.Α. 84: 6417 a 6421 (1987), incorporadaneste por referência em sua totalidade), foi inserido no filamento do cDNA defilamento de sentido positivo entre a ribozima delta e o terminadortranscricional T7 (Figura 1). Este motivo e um segundo motivo descrito nesteabaixo foram adicionados para prevenir a transcrição promíscua do geneCAT pela polimerase de RNA precoce do vírus vacínia. Segundo, o mini-genoma de cDNA inserido foi modificado na junção entre a região nãotransladada Neo gene CAT para conter (i) a inserção de um segundo motivode terminação do vírus vacínia (T5AT) nos filamentos de sentido positivo docDNA nas posições de 103 a 109 relativo ao mini-genoma codificado e (ii) ainserção dos resíduos G de 0 a 6 (sentido negativo) na posição 112 do mini-genoma (Figura 3). A mutagênese de PCR de sobreposição envolveu trêsconjuntos de reações (PCR 1, 2 e 3) realizados como segue. A PCR 1 foi umconjunto de 7 reações em paralelo [PCR 1 (0) a (+6)] que usou o cDNA doPIV3 - CAT - GG como um padrão e os dois oligonucleotídeos mutagênicosseguintes como iniciadores: o iniciador avançado foi o:111GGGGTTATGCTACTGCAGGCTTTTTTTCT-CCCTTAGCC ATCCG"62(SEQ ID NO: 12) e o iniciador reverso foi o:114CTCCA TTCTAG^ÍN)TTATAAAAATTATAGAGTTCCC90 (SEQ ID NO:13). A seqüência em negrito no primeiro oligonucleotídeo é o terminador davacínia de fluxo ascendente em tandem e a seqüência em negrito no segundooligonucleotídeo é o segundo terminador. Esta reação amplificou a ribozimae a região líder adjacente e inseriu as mutações descritas acima. A PCR 2 foiuma reação única que usou o cDNA do PIV3 - CAT - GG como um padrão eum iniciador avançado que hibridizou na seqüência plasmídica de fluxoascendente de um sítio único NgoMl (Figura 3) e um iniciador reversocomplementar para o primeiro iniciador da reação 1. Assim os produtos daPCR 1 e 2 sobrepuseram esta última seqüência. Os produtos da PCRl (0) a(+6) e da PCR 2 foram purificados em gel. Os produtos da PCR 1 (0) a (+6)foram cada um misturados separadamente com uma alíquota do produto daPCR 2 e amplificado em uma terceira reação (PCR 3 (0) a (+6)) que tambémcontinha o iniciador avançado da PCR 2 e o iniciador reverso da PCR 1. Osprodutos da PCR 3 (0) a (+6) foram digeridos com NgoMli que corta naseqüência específica do plasmídeo e Xbal que corta no final de fluxoascendente do gene CAT (Figura 3) e clonados na janela NgoMl - Xbal doPIV 3 -CAT - GG. Isto resultou em um painel de cDNAs que codificam mini-genomas que foram denominados de acordo com o número de resíduos Ginseridos: PIV3 - CAT 0 a PIV3 - CAT +6. As estruturas de todas as regiõesde DNA derivadas do PCR foram confirmadas pelo sequenciamento dedidesoxinucleotídeo.

C) TRANSFECÇÃO

As células HEp-2 foram cultivadas para 90% de confluênciaem placas de 6 reservatórios. Cada reservatório de uma placa de 6reservatórios (1,5 χ IO6 células) foi transfectado com 0,4 μg de pTM (P), 0,4μg de pTM (N), 0,05 μg de pTM (L) e 0,4 μg de plasmídeo mini-genômico.

Os plasmídeos foram adicionados a 0,1 ml de OptiMEM (Life Technologies)e misturados com 0,1 ml do OptiMEM contendo 12 μΐ de LipofectACE (LifeTechnologies). Após um período de incubação de aproximadamente 15minutos na temperatura ambiente, 0,8 ml de OptiMEM 1 contendo 2% desoro de bezerro e 1,5 χ IO7 pfu de vTF7-3 foram adicionados a cadareservatório. As placas foram incubadas a 37°C por 12 horas após o que omeio foi substituído por OptiMEM 1 fresco contendo 2% de soro fetalbovino. As células foram então incubadas a 37°C por um total de 48 horas ecolhidas para a análise de RNA e o teste CAT. Cada mini-genoma foirepresentado em triplicata (3 reservatórios) que foram raspados do meio ereunidos.

D) TESTE DE CAT

Uma alíquota representando 3,33% (1,5 χ IO5 células) de cadaamostra reunida das células colhidas, descrito acima, foi removida para oteste CAT. A alíquota foi centrifugada a 1.000 rpm por 5 minutos e osobrenadante descartado. A suspensão de célula foi lavada com 1 ml de 40mM de Tris, pH 7,5, 1 mM de EDTA, 150 mM de NaCl e recolocada emsuspensão em 50 μΐ de Tris a 0,25 M, pH 7,5. O lisato foi preparado por trêsciclos de congelamento e descongelamento e clarificado por centrifugação a8.000 rpm por 5 minutos. 1 μΐ do lisato foi ensaiado quanto a capacidade paraacetilar o D-treo-[dicloroacetil I-14C] cloranfenicol (Amersham) usando-seum teste convencional (Gorman et al., Mol. Cell. Biol. 2: 1044 a 1051(1982), incorporada neste por referência em sua totalidade). A acetilação foivisualizada por cromatografia de camada fina e quantificada por análise dephosphoimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

E) ANÁLISE DE RNA

As células remanescentes colhidas de cada amostra reunida foidividida em três partes iguais para a isolação do RNA encapsidado, do RNAtotal e do mRNA. As três alíquotas foram centrifugadas a 1000 rpm por cincominutos e os sobrenadantes descartados. Duas alíquotas da suspensão decélula foram recolocadas em suspensão em 50 μΐ de RSB (10 mM de NaCl,10 mM de Tris, pH 7,5, 1,5 mM de MgCl2) contendo 1% de Triton X-100,0,5% de DOC. 50 μΐ e 10 mM de Tris 7,5, 1 mM de CaCl2 e 20 μg (1 mg/mlestoque) de nuclease microcócica foram então adicionados a uma alíquota e aoutra recebeu a mesma mistura sem a nuclease microcócica (Baker & Moyer,J. Virol. 62: 834 a 838 (1988), incorporada neste por referência em suatotalidade). O propósito da nuclease microcócica foi para destruir o RNA nãoencapsidado e as condições usadas foram otimizadas nos experimentospreliminares. As misturas foram incubadas a 30°C por 30 minutos e o RNAfoi isolado com Trizol (Life Technologies) de acordo com o procedimento dofornecedor. A terceira alíquota de suspensão de célula foi processada quantoa purificação do RNA com Trizol e o RNA purificado foi separado pelacromatografia de oligo(dT) celulose nas frações poliadeniladas e nãopoliadeniladas (Grosfeld et ai, J. Virol. 69: 5677 a 5686 (1995), incorporadaneste por referência em sua totalidade). As amostras de RNA foram rodadasem géis de agarose a 1,5% contendo 0,44 M de formaldeído, transferidas para nitrocelulose (Chomczynski, Anal. Biochem. 201: 134 a 139 (1992),incorporada neste por referência em sua totalidade), hibridizada comriboprovas específicas para filamento e quantificadas pela análise dephosphoimager.

EXEMPLO 3

CONSTRUÇÃO E EXPRESSÃO DE MINI-GENOMAS DE PIV3MODIFICADOS

No presente exemplo, um painel de cDNAs foi construídopara codificar mini-genomas de PIV 3 que diferiram no comprimento porincrementos únicos de nucleotídeos. A transcrição e a replicação de RNAneste sistema reconstituído foram mais eficientes para o mini-genoma cujocomprimento foi um múltiplo de seis. Neste particular, os membros dogênero Paramixovirus e do Morbillivirus tipicamente mantêm uma "regra deseis", isto é, os genomas (ou mini-genomas) replicam eficientemente apenasquando seus comprimentos de nucleotídeo é um múltiplo de seis (supõe-seseja um requerimento para o espaçamento preciso dos resíduos denucleotídeo em relação à proteína de encapsidação NP). Entretanto, apresente descoberta ilustra que os mini-genomas cujos comprimentos foramum nucleotídeo maior do que ou menor do que um múltiplo de 6 foramsurpreendentemente ativos, especialmente na replicação do RNA.

Um painel de sete cDNAs foi construído para codificar setemini-genomas de PIV3 - CAT, chamado PIV3 - CAT 0 a +6, que diferem nocomprimento por incrementos de nucleotídeo único (Figura 3). Cada mini-genoma é um análogo curto de sentido negativo do RNA genômico doHPIV3 no qual os genes virais foram suprimidos e substituídos por umacópia de sentido negativo do ORF CAT. O ORF CAT é flanqueado porseguimentos não transladados dos genes N e L, pelos motivos de transcriçãoN GS e L GE, e pelos términos extragênicos líder 3' e trailer 5' do RNAgenômico. O final 5' de cada mini-genoma de PIV3 - CAT é definido pelopromotor adjacente quanto à polimerase T7 de RNA. Este promotor foiconstruído para contribuir com uma extensão de dois resíduos G não viraispar ao final 5' do mini-genoma codificado, como descrito acima. A presençados resíduos G adicionais adjacentes ao núcleo não transcrito do promotor T7melhora a sua eficiência transcricional e o trabalho preliminar mostrou que apresença de dois resíduos G forneceu os níveis mais altos de atividade nosistema reconstituído descrito abaixo. Estes dois resíduos G não estãoincluídos nos cálculos do comprimento do mini-genoma. O final 3' do mini-genoma é criado por clivagem própria por uma ribozima abrupta do vírus dahepatite delta, que poderia gerar o nucleotídeo de terminal 3' correto. Os setemini-genomas diferem por aumento de nucleotídeo único no comprimentodevido à inserção dos resíduos G de O a 6 na junção entre a região nãotransladada Neo gene CAT (Figura 3) e varia no comprimento de 898 a 904nucleotídeos. O mini-genoma PIV3 - CAT +2 é o único que é um múltiplo deseis (deve ser observado que cada mini-genoma conteve dois resíduos G nãovirais adicionais no final 5' contribuído pelo promotor T7, mas é assumidoque estes poderiam ser perdidos durante a replicação intracelular do RNAmediada pelo HPIV3).

Cada cDNA do PIV3 - CAT foi transfectado nas células HEp-2 que foram infectadas com vTF7-3, um vírus da vacínia recombinante queexpressa a polimerase de RNA T7. Os plasmídeos que codificam as proteínasΝ, P e L sob o controle do promotor T7 foram transfectadas em paralelo. OcDNA de P foi modificado por mutagênese direcionada a sítio para eliminaro sítio translacional de início do ORF c, como descrito acima. As célulasforam colhidas 48 horas após a infecção. Uma alíquota da suspensão decélula foi processada quanto ao teste de enzima CAT (Figura 4). As célulasremanescentes foram divididas em três alíquotas iguais e processadas quantoa análise de RNA como descrito abaixo.

O cDNA do mini-genoma foi ainda modificado para conter 2motivos de terminação de transcrição precoce de gene do vírus vacínia emtandem (T7NT) no filamento do plasmídeo de sentido positivo de fluxoascendente do inserto PIV3 - CAT, e um terceiro (T5AT) no mesmo filamentoimediatamente em fluxo ascendente do ORF CAT (Figura 3). Estes foramdesignados para minimizar a transcrição promíscua do ORF CAT pelapolimerase do vírus vacínia (Grosfeld et o/., (1995), acima). A expressãoCAT foi reprodutivamente detectada quando cada um dos mini-genomasPIV3 - CAT foi complementado pelos plasmídeos Ν, P e L (Figura 4) e adetecção de CAT foi dependente de todas as três proteínas do PIV3.

Entretanto, a expressão foi muito maior para o PIV3 - CAT +2, que tem um15 comprimento de nucleotídeo que múltiplo de seis. As relações e quantidadespreferidas do mini-genoma e dos plasmídeos de suporte foram determinadoscom base na expressão da enzima CAT.

EXEMPLO IV

SÍNTESE DOS RNAs DE SENTIDO POSITIVO PELOS MINI-GENOMASDE PIV

A transcrição e replicação dos mini-genomas de PIV foiconfirmada pela detecção dos produtos de RNA de ambos os processos.Como descrito nos Exemplos anteriores, três alíquotas iguais da suspensão decélula foram tomadas para a análise de RNA. Uma alíquota foi usada para aanálise de oligo(dT), como descrito abaixo. As outras duas alíquotas foramlisadas com detergente e incubadas com nuclease microcócica ou tratadas pormock. O RNA foi então isolado, separado por eletroforese em géis de agaroseem formaldeído, transferido para nitrocelulose e analisado por hibridizaçãocom riboprova CAT de sentido negativo. O RNA dos lisatos tratados commicrocócico e tratado com mock são mostrados na Figura 5A, painéissuperior e inferior, respectivamente.

A análise de RNA dos lisatos tratados com mock mostraramque a complementação de cada mini-genoma com os plasmídeos Ν, P e Lresultou na síntese de uma banda do RNA que foi muito similar, no tamanho,ao marcador que consiste do RNA expressado pelo mini-genoma RSV - CATC2 de 931 nucleotídeos (Grosfeld et ai, (1995), acima. A análise dephosphoimagery é apresentada na Figura 5B. Pouco ou nenhum RNA foidetectado quando os plasmídeos N ou L foram omitidos, confirmando queestes RNAs são produtos da polimerase reconstituída do PIV3.

Supõe-se que cada mini-genoma de PIV3 - CAT codifiquedois RNAs de sentido positivo, isto é, o mini-antigenoma e o CAT mRNAsubgenômico. Supõe-se que cada mini-antigenoma seja o complemento exatodo seu mini-genoma que teve de 898 a 904 nucleotídeos no comprimento. OmRNA subgenômico prognosticado é definido pelos sinais GS e GE e supõe-se seja de 804 nucleotídeos no comprimento e contenha um final poliA de100 a 200 nucleotídeos.

A detecção de uma banda única de gel do RNA de sentidopositivo na Figura 5A (painel inferior) sugere que o anti-genoma e o mRNAnão foram resolvidos por eletroforese de gel. Consequentemente, otratamento com nuclease monocócica foi usado para identificar o RNA anti-genoma, visto que o anti-genoma (e o genoma) mas não o mRNA poderiamser encapsidados e resistentes à digestão. O uso de nuclease microcócica paraeste propósito é bem estabelecido (Baker & Moyer (1988), acima) e ascondições selecionadas foram verificadas com mini-réplicons e mostraramdegradar completamente o mRNA contido nos lisatos de célula HEp-2. ORNA residual foi purificado e analisado pela mancha do Norte com riboprovade sentido negativo (Figura 5A, painel superior) e quantificado porphosphoimagery (Figura 5B; observe que nesta análise as quantidades deRNA tratadas por microcócicos e não tratadas foram separadamentenormalizadas). Estas investigações revelaram a presença de uma populaçãode RNA protegido correspondendo ao mini-antigenoma encapsidado desentido positivo. Entre diversos experimentos, este RNA protegido foicalculado em aproximadamente 3 a 15% do RNA de sentido positivo.

Tanto para o RNA total quanto para o resistente aomicrocócico, o acúmulo foi maior no caso do mini-genoma +2, que tem 900nucleotídeos no comprimento e assim um múltiplo de seis. Entretanto,quantidades substanciais de RNA também acumuladas no caso dos mini-genomas que não apresentam um comprimento que corresponda a ummúltiplo de seis nucleotídeos, em particular mini-genomas +1 e +3 que foramum de nucleotídeo mais longo ou mais curto do que o mini-genoma +2. Defato, a quantidade de anti-genoma encapsidado produzido pelos mini-genomas + 1 e +3 foi de 85% e 72% daqueles do mini-genoma +2 (Figura5B). Mesmo o mini-genoma menos eficiente, o mini-genoma +5, foi 20% tãoativo quanto o mini-genoma +2 como determinado pela medição do RNAencapsidado acumulado. No caso de medições para detectar o RNA total desentido positivo, os mini-genomas +1 e +3 produziram 52% e 45% do mesmototal de RNA como o mini-genoma +2.

Para confirmar a presença do mRNA subgenômico, a alíquotafinal da suspensão de célula colhida foi processada quanto a purificação deRNA. O RNA foi então submetido à oligo(dT) cromatografia. Os RNAs quenão tiveram êxito na ligação e aqueles que ligaram e foram eluídos emtampão de baixo sal foram analisados pela hibridização da mancha do Norte(Figura 6A) e por phosphorimagery (Figura 6B; observe que neste caso oligado e o não ligado são normalizados juntos em relação ao RNA ligado domini-genoma +2). Estes testes mostram que aproximadamente 64% do RNAde sentido positivo foi poliadenilado, com suposto para o mRNAsubgenômico. O acúmulo de mRNA foi maior para o mini-genoma +2.Entretanto, quantidades substanciais de mRNA também foram observadospara os outros mini-genoma. A quantidade de mRNA sintetizado pelos mini-genomas +1 e +3 foi 30% e 20% respectivamente, comparado àquelesintetizado pelo mini-genoma +2 e foi de aproximadamente 13% para osmini-genomas menos ativos.

EXEMPLO V

SÍNTESE DO RNA DE SENTIDO NEGATIVO PELOS MINI-GENOMASDE PIV

Os vários mini-genomas PIV3-CAT descritos nos exemplos anteriores controlaram a síntese de mRNA e de mini-antigenomaencapsidado de sentido positivo, o último representando a primeira etapa nareplicação de RNA. A segunda etapa na replicação de RNA envolve a síntesedo mini-genoma encapsidado descendente do produto mini-antigenômico.Para se avaliar este último processo, as amostras de RNA dos lisatos tratadospor mock e tratados por nuclease, descritos no Exemplo precedente foramanalisados pela hibridização da mancha do Norte com riboprova CAT desentido positivo (Figura 7A) e quantificado por phosphorimagery (Figura7B).

A análise do RNA dos lisatos tratados por mock (Figura 7A,painel inferior) mostrou que quantidades consideráveis mini-genomaacumuladas intracelularmente em todas as amostras, incluindo os controlesnegativos nos quais o plasmídeo de suporte N ou L foi omitido. As análisesdescritas nas Figuras 5A-B e 6A-B mostraram que a síntese do RNA desentido positivo foi insignificante sob estas condições, portanto, o mini-genoma observado na ausência de N ou L não poderia ser o produto dareplicação de RNA mediada pela polimerase reconstituída do HPIV3 e aoinvés disso deve ser o produto da transcrição T7 do plasmídeo transfectado.

Supõe-se que o mini-genoma produzido pela polimerasereconstituída do HPIV3 seja encapsidado, enquanto muito do mini-genomaproduzido pela polimerase T7 de RNA é suposto ser não encapsidado.Portanto, o RNA da mesma amostra tratada por nuclease microcócica descritanas Figuras 5A-B foram usadas para preparar uma segunda mancha, que foihibridizada com riboprova CAT de sentido positivo (Figura 7A, painelsuperior). Isto mostrou que todos os mini-genomas de RNA acumulados naausência da proteína N foram degradados (Figura 7A, painel superior, linha1), como suposto. Essencialmente todos dos mini-genomas que acumularamna ausência de L também foram sensíveis à degradação (Figura 7A, painelsuperior, linha 2). O mini-genoma derivado de plasmídeo sintetizado naausência de L e na presença de N e P sozinhos não pareceram ocorrereficientemente.

Quando o conjunto completo dos três plasmídeos de suporteestiveram presentes, quantidades significantes de RNA mini-genômicoresistentes à nuclease microcócica acumularam para cada um dos mini-genomas (Figura 7A, painel superior). Como foi o caso com os RNAs desentido positivo, as quantidades maiores de mini-genoma descendente foiobservada com o mini-genoma +2. Os mini-genomas +1 e +3 foram osseguintes em abundância, com níveis de RNA genômico que foram 67% e42% daqueles do mini-genoma +2.

Os exemplos anteriores demonstraram que as proteínas NP e Ldo HPIV3 foram necessárias e suficientes para a transcrição eficiente e para areplicação do RNA. Natureza muito forte da transcrição e da replicação doRNA mediadas pela polimerase reconstituída do PIV3 confirmou afuncionalidade das proteínas codificadas. Supõe-se ainda que a inclusão deproteínas virais adicionais dentro do sistema de expressão aumentará oumodificará estes processos. A co-expressão do PIV C, D e potencialmente Vdentro das composições e processos da invenção serão úteis, por exemplo,para aumentar e/ou modificar a replicação do RNA. Para este propósito, osplasmídeos serão construídos e ensaiados de acordo com os processosanteriores para se alcançar a co-expressão de um ou mais destes elementospara se determinar seus efeitos na transcrição do PIV e na replicação doRNA, bem como no fenótipo PIV em modelos adequados de infecção.

EXEMPLO VI

CONSTRUÇÃO DE PIV INFECCIOSO, RECOMBINANTE A PARTIR DEcDNA

Os exemplos seguintes descrevem a produção de PIVinfeccioso, recombinante de PIV (rPIV) pela co-expressão intracelular dequatro cDNAs originados de plasmídeo. Estes cDNAs separadamentecodificam um genoma completo de HPIV3 e a proteína nucleocapsídea N, afosfoproteína Pea proteína polimerase L do HPIV3.

A) VÍRUS E CÉLULAS

A cepa da vacínia modificada Ankara (MVA), o vírus vacíniarecombinante eu expressa a polimerase do bacteriofago T7 do RNA foifornecido de acordo com Wyatt et ai., Virol. 210: 202 a 205, 1995,incorporada neste por referência em sua totalidade. As culturas demonocamada HEp-2 foram mantidas a 37°C em 5% de CO2 com OptiMEM 1(Life Technologies) suplementado com 2% de FBS, 50 μg/ml de sulfato degentamicina e 2 mM de glutamina. A cepa JS wt do HPIV3 e o seu derivadoatenuado ts, JS cp45 foram propagados em células LLC-MK2 como descritopor Hall et ai, Virus Res. 22: 173 a 184 (1992), incorporada neste porreferência em sua totalidade.

B) cDNAs

O clone completo cDNA designado p218 (131) (Figura 1,SEQ ID NO: 1) que codifica uma seqüência genômica completa do HPIV3foi construído como descrito acima. Um segundo clone cDNA designadop3/7 (131) (SEQ ID NO: 14) (depositado sob os termos do Tratado deBudapest com o ATCC e concedido a designação 97990) foi construído paracodificar uma seqüência anti-genômica do HPIV3. O p3/7 (131) difere doρ218 (131) em que as posições do promotor T7 e do terminador deribozima/T7 relativo ao cDNA do HPIV3, os insertos foram intercambiados.Assim, o primeiro nucleotídeo sintetizado no p3/7 (131) é o final 5' do anti-genoma, isto é o complemento de sentido positivo da posição de genoma 1 eo final anti-genoma 3' definido pela clivagem da ribozima é o complementoda posição de genoma 15462. Um terceiro clone designado p3/7 (131) 2G(SEQ ID NO: 15) (depositado sob os termos do Tratado de Budapest com oATCC e concedido a designação 97989) também foi construído idêntico aop3/7 (131), exceto que os dois resíduos G foram inseridos entre o final 5' doanti-genoma e o promotor T7.

Para a construção do p3/7 (131) 2G e p3/7 (131), os doisplasmídeos p(A*A'CC'D*E) e p(E*FF'GHIJKL*) foram modificados eunidos para codificar o antigenoma completo de sentido positivo do HPIV3.Primeiro, o terminador T7 e a ribozima delta que limita o final 3' do HPIV3no p(A*A'CC'D*E) foram substituídos por um promotor T7 usando-se PCR(ver Figura 8). O iniciador de sentido positivo 5'GGCCCGTCG.4 CGCGT AATACGACTCACTATAGGACCAAACAAGAG-3' (SEQ ID NO: 18) colocou o promotor T7 (negrito) adjacente ao líder 3'do HPIV3 (seqüência do HPIV3 sublinhada) com os resíduos 2G inseridosentre estes dois elementos para melhorar a transcrição. Um sítio único Mlul(italicizado) foi colocado em fluxo ascendente do promotor T7 parapropósitos de clonagem (Figura 8). O iniciador de sentido negativo 5'-l224CGGCATCACGTGCTAC1209-3' (SEQ ID NO: 19) que se estende de nt1209-1224 do gene N do HPIV3 e incluso um sítio único PmlI (italicizado)presente na seqüência natural do HPIV3. Tanto o produto de PCR quanto opadrão parente p218 (A*A'CC'D*E) foram digeridos com Mlul e Pmll e oproduto de PCR foi então clonado na janela Mlul- Pmll. Uma segunda reaçãode PCR foi feita usando-se o mesmo iniciador de sentido negativo e uminiciador de sentido positivo sem os resíduos 2G inseridos entre o promotorΤ7 e o final 3' do HPIV3. Estes plasmídeos foram designados p(Esquerda +2G) e p(Esquerda +). A construção do p(Esquerda +2G) está ilustrada naFigura 8, a construção do p(Esquerda +) seguiu a mesma estratégia.

O plasmídeo p(E*FF'GHIJKL*) foi modificado por PCR paracolocar a ribozima delta e o terminador T7 adjacentes ao final 5' do HPIV3(Figura 9). O iniciador de sentido positivo: 5'-GGKlTlGCGCGCmuAATTTAAATCATCTGGuzi*-V (SEQ ID NO: 16)introduziu um sítio BssHlI (em itálico) exatamente em fluxo ascendente deum sítio único Swal (em itálico, sublinhado) no gene L do HPIV3 (aseqüência específica do HPIV3 está sublinhada). O iniciador de sentidonegativo: 5'-CCCAGGTCGG4CCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCAGCCC15462ACCAAAACAAGAGAAGAACTCTGTTTGG15435-3' (SEQ ID NO: 17)colocou uma porção da ribozima delta (negrito) que incluiu um sítio únicoRsrll de ocorrência natural (em itálico) adjacente ao final 5' do genomaHPIV3 (sentido negativo, sublinhado. Este produto de PCR foi digerido comBssHlI e Rsrll e clonado na janela BssHlI- Rsrll do plasmídeo p3/7 (Figura9). O plasmídeo p3/7 é idêntico ao p218 exceto que a ribozima delta e oterminador 17 estão na orientação reversa. O plasmídeo p3/7 contendo ainserção acima mencionada foi designado pPIV3 -3/7 e conteve a ribozimadelta completa e o terminador 17 adjacentes ao terminal 5'de 651nucleotídeos do HPIV3. O fragmento SwaI e NgoMl do plasmídeo pPIV3 -3/7 foi então isolado e clonado na janela SvvaI -NgoMl dop(E*FF'GHIJKL*). O plasmídeo resultante, designado p(Direita +) colocou aribozima delta completa e o terminador 17 adjacente ao final 5' do HPIV3(ver Figura 9). O fragmento Xhol - NgoMl do p(Direita +) foi clonado najanela Xhol - NgoMl do p(Esquerda +) e do p(Esquerda +2G) resultando nosplasmídeos p3/7 (131) (SEQ ID NO: 14) e p3/7(131 2G) (SEQ ID NO: 15),respectivamente (Figura 10). Cada um destes codificou o análogo de sentidopositivo completo do RNA anti-genômico do HPIV3, com o último cDNAcontendo dois resíduos G adjacentes ao promotor T7 para melhorar aeficiência transcricional.

C) TRANSFECÇÃO

As células HEp-2 foram cultivadas a 90% de confluência emplacas de seis reservatórios. Cada reservatório de uma placa de 6reservatórios (1,5 χ IO6 células) foi transfectado com os três plasmídeos desuporte previamente descritos, 0,4 μg de pTM (P)5 0,4 μg de pTM (N), 0,05μg de pTM (L) junto com 5 μg de cDNA genômico ou anti-genômico decomprimento total do HPIV3. Os plasmídeos foram adicionados a 0,2 ml deOptiMEM 1 (Life Technologies) contendo 12 μl de LipofectACE (LifeTechnologies). Após um período de incubação de aproximadamente 15minutos na temperatura ambiente, 0,8 ml de OptiMEM 1 contendo 2% desoro fetal bovino e 1,5 χ IO7 pfu de MVA-T7 foram adicionados a cadareservatório. As culturas foram incubadas a 32°C por 12 horas após o que omeio foi substituído por OptiMEM 1 fresco contendo 2% de soro fetalbovino. As culturas foram incubadas a 32°C por três dias adicionais entãocolhidas e passadas (referindo-se como passagem 1) em monocamadas deHEp-2 fresco. Estas culturas de passagem 1 foram incubadas a 32°C porcinco dias e o vírus presente na cultura foi colhido, passado uma vez emculturas de LLC-MK2 e caracterizadas por hemaglutinação-inibição (HAI)como descrito (van Wyke Coelingh et ai., Virol. 143: 569 a 582, (1985)(incorporada neste por referência em sua totalidade) para determinar se omesmo possuía a mutação monoclonal resistente ao corpo (MARM) quemarcou o vírus recuperado do cDNA.

D) SEQUENCIAMENTO DO VÍRUS RECOMBINANTE

A presença de marcadores de seqüência de nucleotídeo nosgenes HN e L do PIV recombinante foi determinada por RT-PCR do RNAisolado de virions recuperados. 1 ml de rPIV (1 χ 10^5 pfu/ml, passagem nível2) foi precipitado com 200 μΐ de polietileno glicol a 25% poi incubação emgelo por uma hora e centrifugação a 12000g por 15 minutos. O RNA foipurificado com o reagente TRIzol (Life Technologies) seguindo-se oprocedimento recomendado pelo fabricante. A RT-PCR foi realizada com oconjunto Superscript (Life Technologies) seguindo-se o protocolorecomendado pelo fabricante. As reações de controle foram idênticas excetoque a transcriptase reversa foi omitida da reação para confirmar que osprodutos de PCR foram derivados somente do RNA do vírus e não depossíveis contaminações dos plasmídeos do cDNA. Quatro pares deiniciadores foram usados para gerar os produtos de PCR dos nt 7334-8715,9364-10854, 10939-15392 e 13623-15392. Os produtos de PCR resultantesforam então sequenciados usando-se a análise de seqüência dedidesoxinucleotídeo de ciclo (New England Biolabs, Beverly, MA).EXEMPLO VII

RECUPERAÇÃO DO VÍRUS RECOMBINANTE DO cDNA QUECODIFICA O RNA GENÔMICO DE SENTIDO NEGATIVO

O plasmídeo p218 (131) e os três plasmídeos de suporte pTM(N), pTM (P) e pTM (L) foram transfectados em células HEp-2 com MVAexpressando polimerase T7 RNA. Um grupo de controle consistindo de pTM(N), pTM (P), pTM (L) e MVA foi co-transfectado nas células HEp-2 sem op218 (131). No quarto dia, a transfecção foi colhida, passada em célulasHEp-2 frescas dispostas em monocamada por cinco dias e passadasnovamente durante cinco dias em culturas de LLC-MK2 (passagem 2). Ovírus presente na colheita da passagem dois foi ainda caracterizado por HAI.As culturas do grupo de transfecção que receberam os três plasmídeos desuporte sem o clone genômico de comprimento total p218 (131) nãoproduziram o HPIV3. O vírus rPIV recuperado foi confirmado ser o HPIV3visto que reagiu no teste HAI com os mAbs 77/5, 101/1 e 454/11 que sãoespecíficos para o HPIV3 (Tabela 1). Foi presuntivamente identificado comosendo derivado do cDNA porque falhou em reagir com o mAbs 170/7 e423/6, compatível com a mutação MARM que foi introduzida no cDNA.<table>table see original document page 81</column></row><table>Para confirmar que o rPIV foi realmente recuperado docDNA, o mesmo foi analisado em paralelo com o HPIV3 da cepa JS do tiposelvagem por RT-PCR usando-se os quatro primeiros pares flanqueando assete mutações marcadoras inseridas. Cada produto de PCR obtido foidependente da inclusão do RT, indicando que cada um foi derivado do RNAe não de contaminação do cDNA. O sequenciamento de ciclo dos quatroprodutos de PCR confirmaram que a seqüência do rPIV continha cada umdos sete marcadores, os dados de sequenciamento mostrando três dosmarcadores estão ilustrados na Figura 11. As diferenças de seqüência entre orPIV e o JS wt no gene HN, incluindo nt 7903, 7913 e 7915 estão facilmentevisíveis. As análises de seqüência similar foram realizadas para os outrosquatro marcadores nas posições de nt 7593, 10355, 11333 e 15248 e o rPIVocupou cada mutação.

Estes resultados demonstram com sucesso a recuperação dorPIV infeccioso do cDNA que codifica um RNA genômico de sentidonegativo. Isto difere da maioria dos relatos publicados para a recuperação devírus de RNA de filamento negativo, não segmentado, em que o cDNA usadopara a recuperação do vírus foi designado para codificar o RNA anti-genômico de sentido positivo (Baron e Barrett, acima, 1997, Collins et al.,acima, 1995; Conzelmann, acima, 1996, Garcin et ai., acima, 1995; Lawsonet al., acima, 1995; Radecke et ai, acima, 1995; Whelan et al., acima, 1995).

A recuperação do vírus infeccioso de um cDNA que codifica o RNAgenômico foi previamente relatado apenas para o caso do vírus Sendai e aeficiência da recuperação foi muito menor do que para o cDNA que codificao RNA anti-genômico (Kato et al., 1996). Na maior parte dos outros estudos,a recuperação do vírus foi obtida com cDNA anti-genômico mas não com ocDNA genômico (Lawson et al., 1995; Whelan et al., 1995). Váriosproblemas potenciais foram observados que podem explicar estes resultadosrefratários incluindo possível fortalecimento do RNA genômico codificadopelo cDNA com o mRNA produzido pelos plasmídeos de suporte, resultandoem híbridos inativos (Conzelmann, acima, 1996; Lawson et al., acima, 1995).Foi também observado que a polimerase do T7 RNA demonstra terminarpreferencialmente nas junções de gene do RNA genômico, talvez devido ao trato oligo U do sinal GE parecer com o sinal natural para a terminação detranscrição pela polimerase T7 RNA(Whelan et al., acima, 1995).

EXEMPLO VII

RECUPERAÇÃO DO VÍRUS RECOMBINANTE DO cDNA QUECODIFICA RNA ANTI-GENÔMICO DE SENTIDO POSITIVO

Como descrito em mais detalhes acima, o p3/7(131) e op3/7(131) 2G foram construídos para codificar um antigenoma de sentidopositivo, que deu origem ao PIV recombinante. O plasmídeo p3/7(131) 2Gseria idêntico ao p3/7(131) se não fosse pela adição de dois resíduos G entreo promotor T7 e o primeiro nucleotídeo do antigenoma. A adição de dois resíduos G entre o promotor T7 e o primeiro nucleotídeo do HPIV3 o p3/7(131) 2G está fundamentada nos exemplos precedentes demonstrando que apresença dos dois resíduos G adicionados (como oposto a O, 1 ou 3 resíduosG adicionados) produziu níveis substancialmente aumentados de replicaçõesde mini-réplicon.

Os dois cDNAs anti-genômicos [p3/7 (131) e p3/7 (131) 2G]foram separadamente transfectados nas células junto com os plasmídeos desuporte Ν, P e L e foram simultaneamente infectados com o vírusrecombinante MVA-T7 usando-se o mesmo procedimento descrito acimapara o p218 (131). O vírus infeccioso de cada cDNA anti-genômico foirecuperado e foi presuntivamente identificado como sendo derivado docDNA pela sua incapacidade de reagir com o mAbs 423/6 e 170/7. Aeficiência da recuperação do vírus foi avaliada para cada um dos cDNAs anti-genômicos versus o cDNA genômico p218 (131). Doze reações detransfecção usando o genoma de sentido negativo do cDNA p218 (131) (SEQID NO: 1) foram conduzidas em paralelo com doze transfecçces usando-se oanti-genoma de sentido positivo do cDNA p3/7 (131) 2G (SEQ ID NO: 15)para comparar a eficiência da recuperação do vírus a partir dos dois cDNAs.Um ml da colheita de transfecção de cada reservatório foi titulado em célulasLLC-MK2 e os dois mis remanescentes foram passados (passagem 1) emcélulas LLC-MK2 frescas. No quinto dia, a passagem 1 foi colhida e tituladacomo descrito acima. O vírus recombinante foi recuperado de 12 dos 12reservatórios transfectados com p3/7 (131) 2G, mas apenas de 4 dos 12reservatórios transfectados com p218 (131). O título médio do vírus presentena cultura do vírus passado do anti-genoma de sentido positivo foi IO5'0,quase 10 vezes maior do que aquele do genoma de sentido negativo que foiIO4'1. Entretanto, com uma amplificação adicional os títulos tornaram-seequivalentes.<table>table see original document page 21</column></row><table>A eficiência de recuperação do vírus recombinante a partir dostrês plasmídeos de comprimento completo que codificam os RNAs do HPIV3genômico ou anti-genômico foi o estudado a seguir, (i) para determinar se ocDNA genômico ou anti-genômico é mais eficiente na geração de vírusrecombinante e (ii) para determinar o efeito de dois resíduos G extras noterminal 5' na produção de vírus recombinantes (Tabela 2).

Desafortunadamente, não foi possível titular-se diretamente a colheita detransfecção por titulação de placa porque o MVA-T7 residual interferiu coma formação de placa do rJS nas culturas de monocamada de LLC-MK2.

Portanto, primeiro comparamos a eficiência da recuperação do rJS detransfecções múltiplas independentes e, como visto em outros experimentos,observamos que o rJS foi mais freqüentemente recuperado de culturastransfectadas com p3/7 (131) 2G, do que de culturas transfectadas com p218(131). Visto que cada colheita de transfecção, incluindo aquelas com o p218(131) produziram rJS em outros experimentos, não foi possível usar esteprocesso de análise para comparar a eficiência relativa da geração do vírusrecombinante. Estimamos portanto a quantidade relativa do vírus presente nacolheita de transfecção pela quantificação do total de vírus seguindo umapassagem da colheita de transfecção (Tabela 2). Visto que cada plasmídeo foiprojetado para produzir um vírus idêntico (rJS), diferenças nos títulos dovírus passado foram considerados com reflexo das diferenças no título dovírus presente na colheita de transfecção. Nos experimentos acima, aconstrução com dois resíduos G de terminal 5' foi o mais eficiente na geraçãodo rJS. Isto indicou que os dois resíduos adicionados realmente aumentarama eficiência da recuperação, mas o mecanismo para este pequeno aumento naeficiência não foi definido. Estas descobertas indicam uma pequena, masmensurável, vantagem de usar o p3/7 (131) 2G como substrato paraexperimentos futuros projetados para introduzir mutações no cDNA doHPIV3. A pequena vantagem na recuperação do vírus recombinante do p3/7(131) 2 G poderia ser especialmente necessária para recuperar vírus quetivessem mutações atenuadoras que restringissem a replicação in vitro.Embora o VSV tenha sido recuperado de cDNA anti-genômico que incluiutrês resíduos G no final do terminal 5', a eficiência da recuperação do vírus desta construção não foi comparado com a recuperação da mesma construçãodeficiente dos resíduos extras (Whelan et al., Proc. Natl. Acãd. Sei. U.S.A.92: 8388 a 8392 (1995), incorporada neste por referência em sua totalidade).Ao contrário das experiências com o vírus Sendai e com o vírus do sarampo,está claro que resíduos G virais extras no fim do terminal 5' do anti-genoma não são nocivos à recuperação do vírus recombinante e, de fato, demonstramser vantajosos [Garcin et al., acima, 1995; Radecke et al., acima, 1995; Katoet al., 1996]. Os plasmídeos genômicos e anti-genômicos sem os doisresíduos de guanina do terminal 5'demonstraram eficiência igual na geraçãodo vírus recombinante. Isto está ao contrário do parecer anterior que observou o cDNA genômico como sendo menos eficiente do que cDNA anti-genômico na geração do vírus recombinante (Whelan, 1995; Kato et al.,1996).

A eficiência da recuperação do vírus do p3/7 (131) (SEQ IDNO: 14) foi comparada àquela do p3/7 (131) 2G (SEQ ID NO: 15) e do p218 (131) (SEQ ID NO: 1) em uma experimento similar como acima. Arecuperação do p3/7 (131) foi comparável àquela do p217 (131). Arecuperação foi mais consistente e eficiente com ambos os cDNAs anti-genômicos contendo os Gs extras (Tabela 2).

EXEMPLO VII

EFICIÊNCIA DA FORMAÇÃO DE PLACA DO rPIV EMTEMPERATURAS PERMISSÍVEIS E RESTRITIVAS

O nível de sensibilidade à temperatura da replicação in vitrodos vírus de controle e do rPIV derivado de ambos p218 (131) e p3/7 (131)2G foi determinado a 32°C, 37°C, 39°C e 40°C em culturas de monocamadasde LLC-MK2 como previamente descrito (Hall et ai, Virus Res. 22: 173 a184, (1992), incorporada neste por referência em sua totalidade), com asseguintes modificações. Os vírus foram inoculados em monocamadas deLLC-MK2 em placas de 24 reservatórios em diluições em série de 10 vezesdeixadas para adsorver por 1 hora na temperatura ambiente. As culturasforam então sobrepostas com 1 ml de L-15 suplementado com 2 mM deglutamina e 0,8% de metilcelulose e as placas foram então incubadas por 5dias na temperatura indicada. A sobrecamada de metilcelulose foi removida ea monocamada fixada com 80% de metanol a 4% por uma hora. As placasvirais presentes na monocamada foram classificadas usando-se uma misturade dois mAbs de murino anti-HN específico para o HPIV3 101/1 e 66/4,como fluído de ascite usado em uma diluição de 1: 500, usando-se umprocesso de imunoperoxidase de coloração específica par anticorpos demurino como previamente descrito (Murphy et al., Vaccine 8: 497 a 502(1990), incorporada neste por referência em sua totalidade).

Os vírus recombinantes derivados do cDNA de sentidopositivo ou negativo foram caracterizados pelo ensaio de placa a 32°C, 37°C,39°C e 40°C para determinar se eram fenotipicamente similares ao vírus JSwt. Tanto rPIV de sentido positivo quanto o de sentido negativo foramcomparáveis ao vírus JS wt em seus níveis de replicação nas temperaturaselevadas de 39°C e 40°C (Tabela 3). Isto está ao contrário do mutante ts doJS cp45 que mostrou uma redução de 30 vezes no título a 37°C e falha emproduzir placas a 39°C ou 40°C.TABELA 3

O rJS PARECE-SE COM SEU PARENTE BIOLOGICAMENTEDERIVADO, O VÍRUS JS DO TIPO SELVAGEM NO NÍVEL DEREPLICAÇÃO EM TEMPERATURAS RESTRITIVAS (39°C - 40°C)

<table>table see original document page 89</column></row><table>

Vírus recombinante derivado do clone de sentido anti-genômicop3/7 (131) 2G.

2 Vírus recombinante derivado do clone de sentido genômico p218(131)

3 O JS cp45 é um mutante sensível à temperatura derivado do JS wt.

A seqüência do JS cp45 foi completamente determinada(Stokes et al., acima, 1993) e as mutações foram identificadas nos genes líderΝ, Ρ, M, F, HN e L. Entretanto não se conhece qual(is) mutação(ões) é(são)responsável(is) pelos fenótipos ca, att ou ts. Devido ao exemplar rPIV dainvenção demonstrar o fenótipo ts+ igual ao parente JS wt, as mutações cp45entre outras mutações conhecidas ou ainda a serem descobertas para o PIVpodem ser introduzidas sozinhas ou em combinação no cDNA decomprimento completo para apontar com precisão os efeitos de mutaçõesindividuais ou de combinações destas, por exemplo, avaliando-se areplicação do vírus recombinante que incorpora a(s) mutação(ões) deinteresse em temperaturas elevadas. A(s) mutação(ões) assim identificada(s)pode(m) ser incorporada(s) em agentes eficazes de vacina atenuada comodescrito nos exemplos abaixo. Estas e outras mutações incorporadas no PIVrecombinante podem ser ainda otimizadas por, por exemplo, mutagênese paracriar duas ou mais substituições de nucleotídeo por códon para converter-seem um vírus recombinante que seja mais geneticamente estável do que umacepa mutante biologicamente derivada.

EXEMPLO VIII

REPLICAÇÃO DO rPIV EM HAMSTERS

Trinta e seis hamsters Syrian dourados de 16 semanas deidade foram divididos em quatro grupos de nove e inoculadosintranasalmente com 0,1 ml contendo IO5'5 pfu do vírus rPIV recuperado docDNA de sentido negativo, rPIV recuperado do cDNA de sentido positivo, JScp45 ou JS wt. No 4- dia, os hamsters foram sacrificados e os pulmões eturbinados nasais colhidos. Os pulmões foram homogeneizados em umasuspensão a 20% p/v de L-15 contendo 2,5 μg /ml de anfotericina B (QualityBiologicals, Gaithersburg, MD), 200 μg/ml de pipericilina (LederleLaboratories, Pearl River, NY) e 50 μg/ml de gentamicina (QualityBiologicals). Os turbinados nasais foram similarmente homogeneizados emuma suspensão a 10% p/v de L-15. Após a homogeneização, as amostrasforam aliquotadas e rapidamente congeladas em um banho de gelo seco eetanol. Os vírus presentes nas amostras foram titulados em uma data posteriorem placas de 96 reservatórios de células LLC-MK2 a 32°C classificando oCPE no quinto e no sétimo dia após a inoculação. O Iog10 TCID50/gm médiofoi calculado para cada grupo de nove hamsters.

A Tabela 4 ilustra que o rPIV recuperado do cDNA de sentidonegativo e o rPIV recuperado do cDNA de sentido positivo replicaramsubstancialmente no mesmo nível como o JS wt no trato respiratório superiore inferior dos hamsters. Isto está em contraste com o vírus JS cpA5 que estáatenuado em cada sítio.TABELA 4

O rJS PARECE-SE COM O SEU PARENTE BIOLOGICAMENTEDERIVADO, O VÍRUS JS wt NO NÍVEL DE REPLICAÇÃO NO TRATORESPIRATÓRIO SUPERIOR E INFERIOR DOS HAMSTERS.

<table>table see original document page 91</column></row><table>

1 Vírus recombinante recuperado usando-se o p3/7 (131) 2G que

codifica o anti-genoma do HPIV3 de sentido positivo.

2 Vírus recombinante recuperado usando-se o p218 (131) quecodifica o genoma do HPIV3 de sentido negativo.

3 Mutante ts biologicamente derivado.

4 Vírus parente biologicamente derivado.

5 Títulos médios (erros padrão para nove hamsters por grupo.

Assim, os exemplares do rPIVs da invenção podem reter acapacidade replicativa nos hamsters expostos à cepa parente JS wtbiologicamente derivada, por meio da qual as mutações tais como aquelaspresentes na vacina candidata de JS cp45 que restringe a replicação noshamsters e outros hospedeiro, incluindo primatas não humanos e sereshumanos, podem ser identificadas e incorporadas dentro das cepasmodificadas do rPIV da invenção, como descrito nos Exemplos abaixo.EXEMPLO IX

IDENTIFICAÇÃO DE SUBSTITUIÇÕES DE AMINOÁCIDO NO HPIV3ESPECIFICANDO FENÓTIPOS ATENUADOS E INCORPORAÇÃO DEMUTAÇÕES ATENUADORAS NOS CLONES DE PIV INFECCIOSOS,ATENUADOS

A capacidade para gerar PIV infeccioso de cDNA facilita odesenvolvimento de vacinas do vírus da parainfluenza atenuados vivos. Maisespecificamente, usando-se os processos e ferramentas divulgadas neste, asbases genéticas da atenuação das vacinas candidatas de PIV podem serfacilmente determinadas e as vacinas de PIV infeccioso produzidas do cDNApodem ser projetadas para alcançar um nível calibrado excelente deatenuação e imunogenicidade.

Além disso, as ferramentas e os processos da invençãofornecem desenvolvimento de vacina para todos os três vírus daparainfluenza humana, HPIV1, HPIV2 e HPIV3 que são os mais importantesna enfermidade do ser humano. Por exemplo, para produzir e selecionaragentes de vacina de HPIV3 eficazes dentro da invenção, mutaçõesassociadas com fenótipos desejados de vacinas candidatas do HPIV3biologicamente derivadas ou o vírus BPIV3 atenuado, por exemplo mutaçõesatenuadoras podem ser identificadas e incorporadas no rPIV. Aplicando-seestes processos, mutações atenuadoras de um amplo menu de mutaçõescandidatas são selecionadas e combinadas para gerar o rPIV tendo umequilíbrio desejado de atenuação e imunogenicidade e que retenha o fenótipoda atenuação a seguir da replicação em seres humanos.

No presente exemplo, as bases genéticas do fenótipo sensívelà temperatura (ts) e da atenuação in vivo (att) do vírus PIV3 JS c/?45atenuado vivo são descritos. Sete exemplares dos vírus PIV3 recombinantes(três vírus única, três vírus dupla e um vírus triplamente danificados) foramrecuperados do cDNA anti-genômico de tamanho completo e analisadosquanto seus fenótipos ts e att. Estes recombinantes possuem uma ou maismutações de substituição de aminoácido presentes no gene L do JS cpA5(alternativamente referido neste como cp45), adotado dentro de um clonecDNA do JS wt). Estas três mutações exemplares, biologicamente derivadasestão todas presentes em um cepa representativa do JS cp45 cultivada emcélulas Vero, designadas JS cp45 Vero, depositada em 21 de agosto de 1997sob os termos do Tratado de Budapest com a American Type CultureCollection (ATCC) da 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852,U.S.A e concedido o número de acesso ATCC VR 25S8.

As análises dos exemplares recombinantes do PIV5apresentadas abaixo, demonstram que cada uma das três mutaçõesexemplares no L(Tyr942 para His, Leu992 para Phe e Thr1558 para lie)contribuem para os fenótipos ís e att do cpA5 e são utilizáveis para gerar ovírus de vacina recombinante.

VÍRUS E CÉLULAS

Os vírus PIV3 JS wt e cp45 foram cultivados em células LLC-MK2 como previamente descrito (Hall et al., Virus Res. 22: 173 a 184(1992), incorporada neste por referência). O vírus vacínia recombinantevTF7-3 é descrito em Fuerst et al., Virology 225: 419 a 422 (1996) e o vírusda vacínia modificada, Ankara (MVA) que expressa a polimerase T7 édescrito em Wyatt et al., Virology 210: 201 a 205 (1995) (cada umaincorporada neste por referência). As células HEp-2 (ATCC CCL 23) e LLC-MK2 (ATCC CCL 7.1) foram mantidas em OptiMEM (Life Technologies)suplementado com 2% de FBS e sulfato de gentamicina (50 μg/ml).

CONSTRUÇÃO DE MUTAÇÕES DE PONTO NO GENE L DO PIV3.

O pUC 19 foi modificado para aceitar um fragmento do geneL do PIV3 JS wt de modo a introduzir mutações de ponto no gene L pormutagênese direcionada a sítio. Primeiro um sítio único de restrição MzeI foiintroduzido no pUC 19 ligando-se um par de oligonucletídeoscomplementares (5'-GATCGATGCTAGCCC-3' (SEQ ID NO: 23) e 5'-GATCGGGCTAGCATC-3' (SEQ ID NO: 24)) contendo o sítio de restriçãoNhel no sítio Hindlll do pUC19 para criar o pUC19 (Ν). O fragmento Sphl(PIV3 nt 11317) até o NheI (PIV3 nt 14087) do pTM (L), que inclui asposições onde as três mudanças codificadoras no cp45 ocorrem e que podemser diretamente introduzidas no cDNA do PIV3 de tamanho completo (verabaixo) foi clonado no sítio Sphl e NheI do pUC19 (N) para criar o pUCL (N-S). As mutações de ponto foram introduzidas no pUCL (N-S) usando-seoligonucleotídeos mutagênicos com o conjunto de mutagênese Transformer(Clontech, Palo Alto, CA) com o propósito de (i) criar substituiçõesexemplares de aminoácido nas posições 942, 992 e 1558 da proteína L,individualmente e em combinação e (ii) remover um sítio específico deenzima de restrição de ocorrência natural próximo a cada substituição decódon como um marcador [ver Tabela 5].<table>table see original document page 95</column></row><table>As mutações introduzidas nos derivados pUCL (N-S) foramverificados pelo sequenciamento de didesoxinucleotídeo do DNA plasmídeo.O fragmento Sphl até BanRl (nt 13733) do pUCL (N-S) contendo asmutações do gene L individual do cp45 foi subclonado nos sítios de Sphl atéBamHl do pTM (L) para dar o pTM (L)-942, -992, -942/992 e -1558; asoutras mutações duplas e triplas foram montadas usando-se os sítios Pin AI eNhe I (Figura 12). Os plasmídeos mutantes pTM (L) foram cada um testadosna temperatura permissível (32°C) quanto à capacidade para conduzir aexpressão do gene marcador de transferase acetil cloranfenicol em umsistema de mini-réplicon que compreende um RNA mini-genoma codificadopor plasmídeo e as proteínas Ν, P e L (Durbin et al., Virology 234: 74 a 78(1997), incorporada neste por referência). Os vários plasmídeos mutantes Lsofreram a expressão do gene marcador a 75-106% o nível do wt L,indicando que cada cDNA engendrado estava isento de mutações espúriassignificantes (não mostradas). Os fragmentos Sphl até Nhel de cada um dosplasmídeos mutantes pTM (L) foram então subclonados na janela Sphl atéNheI do cDNA anti-genômico do PIV3 JS de tamanho completo, p3/7 (131)2G para criar sete clones de cDNA do PIV3 de tamanho completo,representando cada combinação possível das três substituições.

RECUPERAÇÃO DO PIV3 RECOMBINANTE írPIV3) OUE LEVA UMADUAS OU TRÊS SUBSTITUIÇÕES DA PROTEÍNA cp45.

Cada cDNA anti-genômico de comprimento completo queleva uma ou mais mutações do gene cp45 L, juntos com os três plasmídeosde suporte pTM (N), pTM (P) e pTM (L), foram transfectados nas célulasHEp-2 em placas de seis reservatórios (Costar, Cambridge, MA) usando-seLipofectACE (Life Technologies) e MVA - T7 como descrito acima. Apósincubação a 32°C durante quatro dias, a colheita de transfecção foi passadaem células HEp-2 em placas de 6 reservatórios que foram incubadas a 32°Cpor quatro dias. Cada sobrenadante da passagem 1 foi colhido e passado emum frasco T-25 de células LLC-MK2, que foi incubado a 32°C por ,5 a 6 dias.O sobrenadante da passagem 2 foi colhido e a presença do vírusrecombinante foi inicialmente confirmada por coloração de imunoperoxidasedas placas de vírus (Murphy et ai, Vaccine 8: 497 a 502 (1990), incorporadaneste por referência) com anticorpo monoclonal anti-HN (Mab) 77/5, que seliga tanto ao JS PIV3 recombinante, quanto ao biologicamente derivado e oMab 423/6, que não se liga ao vírus derivado do cDNA devido ao seu epítopoter sido removido para servir como um marcador. O vírus presente napassagem 1 foi submetido a duas ou três rodadas de purificação de placa emcélulas LLC-MK2 como previamente descrito. Cada vírus recombinantebiologicamente clonado foi amplificado duas vezes em células LLC-MK2 a32°C para produzir vírus para outra caracterização. O vírus foi concentradodo meio clarificado por precipitação em polietileno glicol e o RNA viral(vRNA) foi extraído com Reagente Trizol (Life Technologies). A transcriçãoreversa (RT) foi realizada no vRNA usando-se o conjunto Superscript II cominiciadores de hexâmero randômico (Life Technologies). O conjuntoAdvantage cDNA TCR (Clontech, Palo Alto, CA) e os iniciadores de sentido(5' nt 11190 -GCATTATCTAGATGTGTCTTCTGGTCAGAG-3' nt 11219)(SEQ ID NO: 31) e anti-sentido (5' nt 14140 -CCTGAATTATAATAATTAACTGCAGGTCCT-3' nt -14111) (SEQ IDNO: 32) específicos para ao gene PIV3 L foram usados para amplificar aregião que abrange o fragmento de Sphl até NheI. Os fragmentos de PCRforam analisados por digestão com cada uma das enzimas de restrição cujossítios de reconhecimento foram removidos durante a inserção das trêsmutações do cpA5 no L (ver Tabela 5).

EFICIÊNCIA DA FORMAÇÃO DE PLACA (ΈΟΡ) EM TEMPERATURASPERMISSIVAS E RESTRITIVAS DO rPIV3 OUE LEVA UMA. DUAS OUTRES SUBSTITUICOE DE AMINOACIDO NA PROTEÍNA cp45 L.

O nível de sensibilidade à temperatura da formação de placain vitro dos vírus de controle e recombinantes foi determinado a 32°C, 37CC,38°C, 39°C, 40°C e 410C em culturas de monocamadas de LLC-MK2 e asplacas foram enumeradas por hemadsorção com células vermelhas do sanguedo porquinho-da-índia seguindo a remoção da sobrecamada de metilcelulose.

Alternativamente, as placas virais presentes na monocamada foramidentificadas por coloração de imunoperoxidase com uma mistura de doismAbs de murino anti-HN específico para PIV3, 101/1 e 454/11 diluídos a1:500, (Murphy et al., acima, (1990)).

ESTUDOS COM HAMSTERS

Os hamsters Syrian dourados de 4 a 6 semanas de idade, emgrupos 6 foram inoculados intranasalmente com 0,1 ml de OptiMEM 1 poranimal contendo 105,5 pfu do rPIV3 JS wt, vírus PIV3 cp45 ou um dos rPIV3contendo uma ou mais substituição(ões) da proteína cp45 L. No 42 dia após ainfecção, os hamsters foram sacrificados e os pulmões e turbinados nasaiscolhidos e o vírus foi quantificado como descrito acima. O Iog10 TCID50/gmédio foi calculado para cada grupo de seis hamsters.

RESULTADOS

INTRODUÇÃO DAS SUBSTITUIÇÕES DE AMINOÁCIDOS DEPROTEÍNA L DO PIV3 cp45 NO wt JS rPIV3.

Como observado acima, as três substituições de aminoácidopresentes na proteína L do cpAS (Tabela 5)foram introduzidasindividualmente ou em combinações selecionadas no cDNA anti-genômicoque codifica o seu parente wt, da cepa PIV3 JS. Cada mutação introduzida foiengendrada para ser marcada com uma mutação silenciosa que removeu umsítio de enzima de restrição de ocorrência natural próxima, para facilitar amonitoração da mutação no rPIV3 recuperado (Tabela 5, Figura 12). Amudança codificadora no aminoácido 1558 foi projetada para conter duasmudanças de nucleotídeo no rl558, comparado a uma substituição de nt nocpA5, para reduzir a chance de reversão neste sítio durante a replicação invitro ou in vivo.

Sete rPIV3s que levam uma, duas ou todas as três dassubstituições de aminoácido do cp45 foram recuperados em cultura de tecidopela transfecção de cada um dos cDNA anti-genômico junto com os plasmídeos de suporte pTM (N), pTM (P) e pTM (L) e co-infecção com ovírus vacínia MVA/T7 pol recombinante (Wyatt et ai, acima, (1995)). CadarPIV3 possuiu o marcador de resistência Mab que foi deliberadamenteintroduzido no gene HN engendrando-se o cDNA anti-genômico. Os rPIV3foram biologicamente clonados em dois ou três ciclos de passagem de placa aplaca para assegurar que cada preparação de vírus foi geneticamentehomogênea. Esta precaução foi tomada porque o vírus da vacínia podeplanejar recombinações entre o cDNA anti-genômico e os plasmídeos desuporte.

Para confirmar que cada um dos sete rPIV3 continha a(s) mutação(ões) engendrada(s) no gene L, o RNA foi purificado a partir devirions precipitados e foi copiado no cDNA e amplificado por RT-PCR. Asreações de controle mostraram que a etapa de RT foi requerida para a geraçãode produtos de RT-PCR, indicando que um padrão de RNA, ao invés decDNA contaminante, foi requerido para a geração dos produtos de RT-PCR.Os produtos de RT-PCR foram submetidos à digestão com as três enzimas derestrição, cujas seqüências de reconhecimento foram removidas comomarcadores para as mudanças codificadoras inseridas. Como suposto, oproduto de RT-PCR do JS wt rPIV3 foi clivado o número apropriado devezes para cada uma das três enzimas, visto que as r942/992/1558 careceramcada uma dos três sítios removidos durante a criação das mudançascodificadoras individuais do cp45. Cada um dos outros rPIV3s careceramdo(s) sítio(s) de restrição apropriado(s), indicando a presença das mutaçõesintroduzidas.

EFICIÊNCIA DA FORMAÇÃO DE PLACA A 32°C. 37°C. 38°C. 39°C.40°C E 41°C DE rPIV3 OUE LEVAM MUTAÇÕES çp45. L.

Os sete rPIV3s que levam as várias combinações dassubstituições de aminoácido da proteína cp45 L foram ensaiadas quanto assuas capacidades para formar placas em monocamadas LLC-MK2 a 32°C,37°C, 38°C, 39°C, 40°C e 41°C. Como apresentado na Tabela 6, cada rPIV3que leva uma substituição cp45 aa foi ts, ao passo que o JS wt rPIV3 parentenão foi restringido na formação de placa em qualquer uma das temperaturastestadas. A temperatura de interrupção da formação de placa do r942, r992 erl558 foi 40°C. O r942 manifestou uma redução de 700 vezes na formaçãode placa a 40°C, indicando que a sua replicação foi marginalmente reduzidanesta temperatura restritiva. Entretanto, o tamanho da placa do r942 tambémfoi enormemente reduzida a 40°C, o que também indicou que a suareplicação foi restringida nesta temperatura, comparado ao JS wt. O r942 foicompletamente restringido na replicação à 41°C (dado não apresentado). Or992 e o rl558 foram enormemente reduzidos (uma redução acima de1.000.000 de vezes) na formação de placa a 40°C. Estes resultados indicamque cada uma das três mutações do gene cpAS L especificam individualmenteo fenótipo ts, embora aquele da mutação r942 seja de algum modo menosrestritivo. O vírus mutante duplo r942/1558 e o mutante triplo r942/992/1558tiveram uma temperatura de interrupção de 39°C, enquanto aqueles dor942/992 e do cp45 foi 38°C. O mutante duplo, r992/1558 foi menos ts doque o mutante único r992. O r992/1558, igual o r942, foi completamenterestringido na formação de placa a 41°C. O nível de sensibilidade àtemperatura apresentado pelo duplo ou pelo triplo resulta de uma açãorecíproca delicada entre os rPIVs das três mutações que não pode ser preditados níveis de sensibilidade à temperatura apresentados pelos mutantessimples. Também, visto que o r942/992/1558 foi levemente menos ts do queo cp45, outras mutações fora do gene L5 provavelmente também contribuírampara o fenótipo ts do cp45, representando portanto mutações de interessedentro da invenção.

TABELA 6

A EFICIÊNCIA DA FORMAÇÃO DE PLACA (EOP) A 32°C, 37°C, 38°C,39°C E 40°C DO rPIV3 QUE LEVA UMA, DUAS OU TRÊSSUBSTITUIÇÕES DE AMINOÁCIDO NA PROTEÍNA cp45 L.

<table>table see original document page 101</column></row><table>

a. O vírus c/?45 é um vírus biologicamente derivado e cada um dos outrosvírus testados é um recombinante.

b. As placas foram do tamanho exato.

c. Os números sublinhados representam a temperatura de interrupção daformação de placa, que é definido como a temperatura restritiva mais baixana qual uma redução de 100 vezes no título é observada, em comparação como título a 32°C.

CULTIVO EM HAMSTERS

Grupos de seis hamsters Golden Syrian foram intranasalmenteinoculados com JS wt rPIV3, cpAS biologicamente derivado ou com rPIV3contendo uma ou mais substituições de aminoácido na proteína cpA5 Leareplicação do vírus nos pulmões e nos turbinados nasais foi determinada.

Neste experimento [Tabela 7], cada um dos rPIV3s que levam umasubstituição de aminoácido única foi restringido na replicação no tratorespiratório superior e inferior [Tabela 7], Entretanto, o r942, o vírus menosts foi apenas marginalmente suprimido na replicação no trato respiratóriosuperior e inferior em um segundo experimento. Estes dados demonstram queduas das três substituições de aminoácido contribuem para o fenótipo attquando presentes como vírus recombinantes de lesão simples. Entretanto, amutação 942, de fato contribui para a atenuação (por exemplo, o r942/992 émais atenuado do que o r992 sozinho). Assim, cada uma das substituições deaminoácido no L contribui para o fenótipo att agindo sozinho ou emcombinação com outra mutação de aminoácido em L. Cada um dos mutantesduplos foi atenuado indicando que a perda de qualquer uma das trêssubstituições do gene L que segue a replicação in vivo ainda deixa um vírusatenuado. Isto é uma apresentação parcial para os níveis altos previamenteobservados de estabilidade do fenótipo ts do cpA5 que segue a replicação invivo. O mutante triplo r942/992/1558 foi tão restringido quanto o cp45 para areplicação no trato respiratório superior e inferior indicando que as três substituições de aminoácido na proteína L são os contribuidores principaispara o fenótipo att do cp45.

TABELA 7

O NÍVEL DE REPLICAÇÃO NO TRATO RESPIRATÓRIO SUPERIOR EINFERIOR DE HAMSTERS DO rPIV3 QUE LEVA UMA, DUAS OU TRÊS SUBSTITUIÇÕES DE AMINOÁCIDO NA PROTEÍNA cp45 L,COMPARADO AO JS wt rPIV3 E cp45

<table>table see original document page 102</column></row><table>

a. Grupos de seis hamsters cada um foram intranasalmente administradoscom IO5'5 pfu do vírus por animal em um inóculo de 0,1 ml e os pulmões e osturbinados nasais foram colhidos 4 dias depois.

b. Erro padrão.

c. O cp45 é um vírus biologicamente derivado e outros são recombinantes.

Para resumir os resultados acima, substituições em cada umadas posições de aminoácido da proteína L, 992 e 1558 especificaram umaredução de 1.000.000 de vezes na formação de placa na cultura de célula a40°C, enquanto a substituição na posição 942 especificou uma redução de700 vezes. Assim cada uma das três mutações contribuem individualmentepara o fenótipo ts. O recombinante triplo que possui todas as três mutaçõesde L é levemente menos ts do que o cp45, sugerindo que existem mutaçõesfora do gene L, no cp45, que também poderiam contribuir para o seu fenótipots. Duas das três mutações individuais em L, cada uma contribuiu pararestringir a replicação no trato respiratório superior ou inferior dos hamsters,que são responsáveis pela estabilidade observada dos fenótipos ts e att docp45 durante a replicação in vivo. De modo importante, o nível dasensibilidade à temperatura das cepas de vacina recombinante in vitro foiestritamente prognosticada da atenuação in vivo. O vírus recombinante quepossui todas as três mutações foi tão restritivo na replicação quanto omutante cp45 tanto no trato respiratório superior quanto no inferior doshamsters, indicando que o gene L do vírus cp45 é um componente atenuadorprincipal desta cepa candidata à vacina. Embora cada mutação especifique,por si própria, o fenótipo ts, quando colocadas juntas não são simplesmenteaditivos mas, ao invés, de algum modo, influenciam-se umas às outras. Oefeito das três mutações juntas no mutante triplo pareceram melhorar aoinvés de intensificar o nível de sensibilidade à temperatura observada nosdois mutantes duplos que foram avaliados. De modo interessante, isto deveriafornecer uma pressão seletiva não prognosticada, para manter pelo menosalgumas das mutações do cp45 L, visto que a perda por reversão dasubstituição 992 ou da 1558, poderia aumentar ao invés de diminuir o nívelde sensibilidade à temperatura. Consideradas juntas, estas descobertasindicam que o alto nível de estabilidade dos fenótipos ts e att do vírus cpA5resulta da contribuição de múltiplas mutações ts no L para o fenótipo att. Aidentificação destas três mutações como as mutações atenuadoras principaisdo cp45 fornece a base para monitorar o vírus durante todos os estágios defabricação e que segue à replicação em seres humanos.

E ainda de interesse que a mutação de tirosina para histidinana posição 942, sustentavelmente a mais conservativa das substituiçõesdentre as três mutações, foi a menos sensível à temperatura. A polimerase Ldo PIV3 é um polipeptídeo grande, 2233 aa no comprimento e supõe-se seruma proteína multifuncional que codifica domínios múltiplos, incluindoaqueles requeridos para a formação de complexos com a proteína P, ligaçãode RNA, poliadenilação de RNA, transcrição de RNA e replicação de RNA(Collins et al., acima, (1996)). As substituições de aminoácido em L nasposições 942 e 992 são localizadas próximo a regiões que são bemconservadas entre outros membros da família dos Paramyxovirus (Blumberget al., Virology 164: 487 a 497 (1992); Galinski et al., Virology 165: 499 a510 (1988)). A mutação na posição 1558 está em uma região da polimeraseque demonstra compartilhar menos da identidade de seqüência com outraspolimerases L. Embora o mecanismo pelo qual o fenótipo ts é conferido pelasubstituição tripla de aminoácido em L não seja conhecido, é provável que osdomínios e atividades múltiplas da proteína L sejam afetados, ou que ummecanismo comum envolvendo várias atividades de L seja afetado.EXEMPLO X

IDENTIFICAÇÃO DIRETA E RECONSTITUIÇÃO EM VÍRUSRECOMBINANTE DE VACINA, DE MUTAÇÕES EM UM VÍRUS HPIVDO TIPO 3 ATENUADO VIVO, BIOLOGICAMENTE DERIVADO (cjAS)QUE ESPECIFIQUE A SENSIBILIDADE À TEMPERATURA,ADAPTAÇÃO AO FRIO E FENÓTIPOS DE ATENUAÇÃOOs exemplos acima demonstram que cada uma das trêssubstituições de aminoácido na proteína polimerase L do cpAS confere osfenótipos de sensibilidade à temperatura (<ts) e atenuação (att), mas não ofenótipo de adaptação ao frio (ca) (ver também, Skiadopoulos et al., J. virol.72(3): 1762 a 1768, 1998). O cp45 contém doze mutações adicionais emoutras proteínas (N, C, M, F e HN) ou seqüências potenciais de ação eis (aregião líder e o sinal de início da transcrição de gene{GS} do gene N), e suascontribuições para estes fenótipos têm sido até agora indefinidas. O presenteExemplo ainda caracteriza a base genética para os fenótipos ts, ca e att docp45 para fornecer ainda informação adicional com respeito às bases quantoao alto nível observado de estabilidade destes fenótipos que seguem areplicação do cp45 em seres humanos ou primatas não humanos. Em umaspecto deste estudo, um vírus cp45 recombinante (rc/?45) que contenhatodas as quinze mutações específicas do cp45 foi construído usando-se umsistema genético reverso e observou-se ser essencialmente indistinguível dovírus biologicamente derivado, com base no tamanho da placa, nível desensibilidade à temperatura, adaptação ao frio e nível de replicação no tratorespiratório superior e inferior de hamsters. Além disso, os vírusrecombinantes que contenham: (1) as mudanças específicas do cp45 nasproteínas C, M, F ou HN, (2) as mutações de gene líder e N combinadas ou(3)diversas combinações das mutações de cp45 foram construídas. A análisedestes vírus recombinante mostrou que mutações múltiplas do cp45distribuídas por todo o genoma contribui para os fenótipos ts, ca e att. Asmutações em C e F não foram ts a 40°C mas não obstante conferiu o fenótipoatt, e, entretanto, são mutações att não ts. A mutação HN não confere osfenótipos ca, ts ou att. Os vírus que possuem as mutações 31 líder e N foramts mas exibiram apenas atenuação marginal no trato respiratório superior doshamsters. Recombinantes que possuam diversas combinações de mutaçõesapresentaram um nível maior de sensibilidade à temperatura do que o cp45,mas o nível aumentado de sensibilidade à temperatura não refletiu em umaumento na atenuação in vivo. Estas últimas descobertas indicam que asmutações múltiplas identificadas no cp45 interagem para afetar a replicaçãoin vitro. A presença das mutações atenuadoras múltiplas ts e não ts no cpA5provavelmente contribuem para o seu alto nível de atenuação e estabilidadefenotípica. O conhecimento dos fenótipos associados com as várias mutaçõesdo cpA5 fornecidas neste permite o monitoramento preciso dos vírus PIVbiologicamente derivados e a manipulação fácil do vírus recombinante paraalcançar uma montagem ampla de recombinantes de vacina úteis dentro dainvenção.

VÍRUS E CÉLULAS

Os vírus rPIV3s, PIV3 JS wt e cp45 descritos no presenteExemplo foram cultivados em células LLC-MK2 de símio (ATCC CCL 7.1)como descrito acima (ver também, Durbin et al., Virology 235: 323 a 332,1997a; Hall et al., Virus Res. 22 (3): 173 a 184, 1992; Skiadopoulos et al., J.Virol. 72 (3): 1762 a 1768, 1998). O vírus vacínia modificado, Ankara foifornecido como descrito acima. As célula HEp-2 (ATCC CCL 23) e LLC-MK2 foram mantidas em OptiMEM I (Life Technologies, Gaithersburg, MD)suplementado com 2% de FBS e sulfato de gentamicina (50 μg/ml), ou emEMEM suplementado com 10% de FBS, sulfato de gentamicina (50 μg/ml) e2 mM de glutamina. As células L-132 (ATCC CCL 5) foram cultivadas emMEM de Earl (Life Technologies) suplementado com 10% de FBS, 2 mM deglutamina, 20 mM de Hepes, mM de aminoácidos não essenciais e 100unidades de estreptomicina-neomicina/ml.

CONSTRUÇÃO DE MUTAÇÕES DE PONTO EM PIV3.

Fragmentos subgenômicos do p3/7 (131) 2G, o clone cDNAanti-genômico do PIV3 JS wt usado acima para recuperar vírus infecciosos(ver também, Durbin et al., Virology 235: 323 a 332, 1997a; Skiadopoulos etal, J. Virol. 72(3): 1762 a 1768, 1998), foram clonados em vetores pUC19modificados para aceitar estes fragmentos, usando-se técnicas padrão declonagem molecular. As mutações de ponto correspondentes a mutaçõesidentificadas no c/?45, bem como as mutações que criam ou que removemseqüências de reconhecimento de enzima de restrição silenciosas (Tabela 8)foram introduzidas usando-se o conjunto de mutagênese transformadora(Clontech, Palo Alto, CA) como previamente descrito.

TABELA 8. MUTAÇÕES DO PIV3 cp45 INTRODUZIDAS EM rPIV3

<table>table see original document page 107</column></row><table>

a. A posição do primeiro nucleotídeo na seqüência PIV3 apresentada.

b. A seqüência do tipo selvagem é apresentada acima da seqüência mutante.

As mudanças de nucleotídeo estão sublinhadas. As substituições de códonestão em negrito.

c. Cada seqüência de reconhecimento de endonuclease de restrição relevanteestá em itálicos; (+) indica a adição de nova seqüência de reconhecimento deendonuclease de restrição; (-) indica a remoção de uma seqüência dereconhecimento de endonuclease de restrição de ocorrência natural.

d. As mutações estão indicadas como as três letras de designação deaminoácido do wt, seguido pela posição do aminoácido seguido peladesignação do cpA5.

e. Estas mutações foram identificadas por Joanne Tatem (observações nãopublicadas), as outras foram de Stokes et al., Virus Res. 30 (1): 43 a 52, 1993.

f. Dois nucleotídeos foram mudados no códon indicado de modo a reduzir achance de reversão de reversão para a seqüência de tipo selvagem.

Após a mutagênese, os fragmentos de endonuclease derestrição foram completamente sequenciados e novamente clonados no clonede comprimento total, p3/7 (131) 2G. As mutações 3' líder e N foramamplificadas por transcrição reversa (RT) -PCR diretamente do RNA viriondo PIV3 cp45 e foram clonados no pEsquerda+2G (ver acima) ou em umvetor pUC19 modificado para outras manipulações. As combinações demutações foram construídas usando-se técnica padrão de clonagemmolecular. O clone plasmídeo de comprimento total contendo as mutaçõescpA5, denominado pFLCc/?45, foi completamente sequenciado paradeterminar se mutações estranhas foram introduzidas durante o processo declonagem, mas nenhuma foi encontrada.

RECUPERAÇÃO DO PIV3 RECOMBINANTE (rPIV3)

Cada cDNA anti-genômico de tamanho completo que leva asmutações cp45, junto com os três plasmídeos de suporte pTM (Ν), pTM (Pnão C) e pTM (L) foi transfectado em células HEp-2 em placas de seisreservatórios (Costar, Cambridge, MA) usando-se LipofectACE (LifeTechnologies, Gaithersburg, MD) e MVA -T7 como descrito acima. Apósincubação a 32°C por quatro dias, a colheita de transfecção foi passada emcélulas LLC-MK2 em frascos de T-25 que foram incubados a 32°C durantequatro a oito dias. Este vírus colhido foi chamado passagem 1 e foisubmetido a três rodadas da purificação de placa sobre células LLC-MK2como descrito acima. Cada vírus recombinante biologicamente clonado foiamplificado duas vezes em células LLC-MK2 a 32°C para produzir viraspara outra caracterização. O vírus foi concentrado em meio clarificado porprecipitação com polietileno glicol (ver Mbiguino e Menezes, J. Virol.Methods 31: 2 a 3, 1991, incorporada neste por referência em sua totalidade)e o RNA viral (vRNA) foi extraído com Reagente Trizol (Life Technologies).A transcrição reversa foi realizada no vRNA usando-se o Sistema de Pré-amplificação Superscript II (Life Technologies) com iniciadores de hexâmerorandômico. O conjunto Advantage cDNA PCR (Clontech) e iniciadores desentido e de anti-sentido, específicos para várias porções do PIV3 genomaforam usados para amplificar fragmentos para a análise de endonuclease derestrição. Os fragmentos de PCR foram analisados pela digestão com cadauma das enzimas de restrição cujos sítios de reconhecimento foram criadosou removidos durante a construção das mutações (Tabela 8).EFICIÊNCIA DA FORMAÇÃO DE PLACA (EOP) DO rPIV3 OUE LEVAMUTAÇÕES cpAS EM TEMPERATURAS PERMISSÍVEIS ERESTRITIVAS.

O nível de sensibilidade à temperatura da formação de placain vitro dos vírus de controle e recombinantes foi determinado a 32°C, 35°C,36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C e 41°C em culturas de monocamadas de LLC-MK2 como descrito acima (Ver também, Hall et al., Virus Res. 22 (3): 173 a184, 1992, incorporada neste por referência em sua totalidade). As placasforam numeradas por hemadsorção com células vermelhas do sangue doporquinho-da-índia seguindo-se da remoção da sobrecamada demetilcelulose, ou alternativamente as placas virais presentes na monocamadaforam identificadas por coloração de imunoperoxidase com uma mistura dedois mAbs de murino anti-HN específico do PIV3, 101/1 e 454/11 diluídos1:250 (ver, Murphy et al., Vaccine 8 (5): 497 a 502 (1990); van WykeCoelingh et al., Virology 143 (2): 569 a 582, 1985).

AVALIAÇÃO DOS VÍRUS MUTANTES rPIV3 QUANTO AO FENÓTIPODE ADAPTAÇÃO AO FRIO.

O cultivo dos vírus rPIV3 mutantes e wt foi determinada a32°C e 20°C em monocamadas de célula L-132 confluentes preparadas emplacas de cultura de tecido de 24 reservatórios. Reservatórios em duplicata decada uma das duas placas foram inoculados com 0,2 ml de cada vírus rPIV3mutante ou wt, em uma multiplicidade de infecção de 0,01. Após uma horade adsorsão na temperatura ambiente, o inóculo foi aspirado e asmonocamadas foram lavadas com 1 ml de PBS por reservatório. As culturasinoculadas foram sobrepostas com 0,5 ml de MEM de Earl, suplementadocom 10% de FBS, 2 mM de glutamina, 20 mM de Hepes, 1 mM deaminoácidos não essenciais e 100 unidades de estreptomicina-neomicina/ml.uma placa foi selada em uma bolsa a prova d'água (Kapak) e entãosubmergida em um banho a 20°C durante 13 dias. A placa em duplicata foicolocada a 32°C em uma incubadora de CO2 por 3 dias. No final do período,o vírus foi colhido por congelamento e descongelamento. O título do vírusrecuperado de cada reservatório foi determinado pelo teste de placa emcélulas LLC-MK2 a 32°C usando a hemadsorção com células vermelhas dosangue do porquinho-da-índia, para se visualizar as placas. Dois estoques dereferência do wt e dois do cpAS foram usados como controles.

ESTUDOS COM HAMSTERS.

Hamsters Golden Syrian de cinco semanas de idade em gruposde cinco foram inoculados intranasalmente com 0,1 ml de OptiMEM I poranimal, contendo IO6,0 pfu do vírus JS wt rPIV3, PIV3 cpA5 ou um dosrPIV3s mutante. No quarto dia após a infecção, os hamsters foramsacrificados, os pulmões e os turbinados nasais foram colhidos e o vírusforam quantificados como descrito acima. O Iog10 TCID50/grama médio, a32°C, foi calculado para cada grupo de Hamsters.

RESULTADOS

INTRODUÇÃO DAS MUTAÇÕES cp45 DO PIV3 NO JS wt rPIV3.As quinze mutações no 3' líder, o sinal. N GS s as proteínas N,C, M, F, HN e L do cp45 (Tabela 8) foram introduzidas no cDNA completodo PIV3 anti-genômico por mutagênese direcionada por sítio ou poramplificação direta de PCR de um seguimento de cDNA do cpA5 que leva asmutações desejadas. Os seguintes cDNAs anti-genômicos foram feitos (verFigura 13): (i) rcp45 3' N, contendo as quatro mutações de ponto da regiãolíder, a mutação de ponto no sinal N GS e as duas mudanças de aminoácidona proteína N; (ii) rcp45 C, contendo a mudança de aminoácido simples naproteína C; (iii) xcpA5 M, contendo a mudança de aminoácido simples no M;(iv) xcp45 F, contendo as duas mudanças de aminoácido no F; (v) rçp45 HN,contendo a mudança de aminoácido simples no HN; (vi) rc/?45 L, contendoas três mudanças de aminoácido no L, como descrito acima; (vii) rcpAS 3'NL, contendo as mutações de i. e vi., acima; (viii) vcp45 3' NCMFHN,contendo todas as mutações exceto quanto às três em L; e (ix) rc/?45contendo todas as quinze mutações de cp45 listadas na Tabela 8. Na maioriados casos, cada mudança do cp45 foi engendrada para ser acompanhada poruma ou mais mudanças silenciosas na proximidade, que introduziu ouremoveu um sítio de reconhecimento de enzima de restrição (Tabela 8). Estesserviram como marcadores para confirmar a presença da mutação no cDNA eno vírus recuperado. Também, duas das mudanças codifícadoras deaminoácido (mutações números IOe 15 na Tabela 8) foram feitas usando-seduas mudanças de nucleotídeo ao invés da mudança simples observada nocp45, reduzindo a possibilidade a reversão do dito sítio para wt. O cDNA docp45, que contém todas as quinze mudanças do cp45 na Tabela 8 foi montadoa partir dos mesmos subclones de cDNA mutagenizados do mesmo modocomo foram usados para introduzir mudanças do cp45 em outros cDNAsanti-genômicos; foi sequenciado em sua totalidade e foi confirmado conterapenas as mutações pretendidas. Isto indicou que todas as regiões que foramsubmetidas à mutagênese ou PCR e foram manipuladas por clonagem,possuíram as seqüências desejadas e careceram de outras mutações nãodesejadas. Cada plasmídeo de comprimento completo que leva uma ou maisdas mutações do cpA5 foram transfectados em células HEp-2 junto complasmídeos de suporte e MVA - T7 para produzir PIV3 recombinante comodescrito acima. A análise dos fragmentos de RT-PCR que abrangem asmutações indicadas na Tabela 8 foram amplificadas a partir de RNA viriondos diversos vírus recombinantes indicados na Figura 13, confirmou apresença das mutações introduzidas e outras mutações não pretendidas nãoforam observadas.

MORFOLOGIA DA PLACA

Alguns dos vírus recombinantes demonstraram morfologia deplaca distintas quando testados em células LLC-MK2. As placas de JS wtrPIV3 tiveram um tamanho médio de 1 mm e foram indistinguíveis notamanho do JS wt PIV3 biologicamente derivado. As placas dos vírus cp45 ercpAS foram maiores do que a do wt, medindo na média de duas a três vezesmaiores no diâmetro do que a do wt e foram indistinguíveis uma da outra.Isto demonstrou, para este fenótipo, a comparabilidade do vírus cp45biologicamente derivado e recombinante.

EFICIÊNCIA DA FORMAÇÃO DE PLACA DOS rPIV3s QUE LEVAAS MUTAÇÕES c/745, EM CÉLULAS LLC-MK2, EMTEMPERATURAS PERMISSÍVEIS E RESTRITIVAS.

Os rPIV3s foram ensaiados quanto suas capacidades paraformar placas em temperaturas permissíveis e restritivas, variando de 32°C a41°C (Tabela 9). A análise dos fenótipos ts dos vírus que levam componentesindividuais do cpA5 revelaram que os vírus rcp45 3' N e rcp45 M teve umatemperatura de interrupção de 40°C e o rçp45 mutante teve uma temperaturade interrupção de 41°C. A temperatura de interrupção do rcp45 F e do rcp45HN mutantes foi maior do que 41°C. Compatível com os resultados acima ovírus rcp45 L teve uma temperatura de interrupção de 39°C. Um vírus éconsiderado ter um fenótipo is, por exemplo, se sua redução de replicação a40°C (isto é, o título a 32°C menos o título a 40°C) é de aproximadamente>100 vezes aquela do vírus wt a 40°C. Aplicando-se esta definição, ospresentes resultados indicaram que pelo menos duas regiões do cpA5 (3' N eL) contribuem para o fenótipo ts.<table>table see original document page 114</column></row><table>Como apresentado na Tabela 9, o rc/?45, que contém todas asmutações do cp45, teve uma temperatura de interrupção de 38°C que foiidêntica àquela do cp45 biologicamente derivado. Estes resultados mostramque o fenótipo ts do cp45 foi reproduzido de modo bem sucedido no rcp45.

Além disso estes resultados validam a análise de seqüência do cpA5 e asubsequente reconstrução de mutações no vírus recombinante.

O vírus rc/?45 3' NCMFHN, que é idêntico ao rc/?45 excetopelo fato de que carece das três mutações L, apresentou uma temperatura deinterrupção de 36°C. Visto que as mutações L são conhecidas por conferirsensibilidade à temperatura, individualmente e em combinação, é um tantoparadoxal que o xcpA5 3' NCMFHN fosse mais, ao invés de menos, ts do queo cpA5. Isto indica que existe uma interação de mutações dentro do cp45 pormeio da qual as mutações compensam-se mutuamente para dar um nível desensibilidade à temperatura que é menor do que a soma dos componentesindividuais.

O vírus xcp45 3' NL foi construído para investigar se asmutações L interagem com as mutações líder e/ou N, visto que acredita-seque todos estes elementos interajam durante a síntese de RNA. Este vírusteve uma temperatura de interrupção de 36°C, comparado aos 40°c e 39°Cpara o xcp45 3' N e o rçp45 L, respectivamente. Estes resultados sugerem queexista uma interação entre as mutações 3' N e L que resulta no aumento dasensibilidade à temperatura. Estes resultados também fornecem um outroexemplo de que um subconjunto de mutações do cpA5 especificam um nívelde sensibilidade à temperatura maior do que aquela observada para o rçp45que contêm o conjunto total de mutações.

FENÓTIPO ca DOS rPIV3s OUE LEVA MUTAÇÕES DO cp45.

Os rPIV3s foram analisados para se determinar quaiselementos genéticos do cpA5 especificavam o fenótipo ca (Tabela 10). Foidemonstrado acima que o rc/?45 L é ts e att, mas não ca. Isto indica que oselementos genéticos especificam a maioria dos fenótipos ca, estão loos.lizadosfora de L e isto foi confirmado no presente estudo. Cada um dos rPIVs quepossuem as mutações 3' líder e N foram ca exceto o rc/?45 3' NCMFHN, queexibiram um fenótipo intermediário. Isto mostra que o fenótipo ca estáespecificado principalmente dentro da região 3' Ν. A descoberta de que onível do ca dos vírus que contêm o segmento 3' N é menor do que aquele docp45 ou do xcpAS indica que outras regiões do cp45 contribuam para ofenótipo ca, mesmo que isto não esteja aparente das análises de outrasregiões individualmente. O vírus rc/?45 3' NL é mais ca do que o vírus rcp453' N, sugerindo que as mutações L podem dar uma modesta contribuição. Osvírus cpA5 e rcp45 biologicamente derivados exibem níveis comparáveis deca indicando que este fenótipo, igual aos fenótipos de tamanho de placa e tsfoi reproduzido com sucesso no vírus cp45 recombinante fornecido neste.Entretanto, o fenótipo ca, do mesmo modo que o fenótipo ís é um fenótipocompósito que reflete contribuições individuais para o fenótipo global bemcomo contribuições dos elementos de interação genética.

TABELA 10

<table>table see original document page 116</column></row><table>a. O título do vírus é expresso em Iog10 PFU/ml.

b. O cp4S é biologicamente derivado e os outros vírus são recombmantes. Ofenótipo ca é definido como um aumento maior do que 10 vezes naproliferação a 20°C em relação ao wt.

PROLIFERAÇÃO DOS VÍRUS MUTANTES rcpAS EM HAMSTERS

Grupos de cinco hamsters Golden Syrian foram inoculadosintranasalmente com IO6 TCID50 do vírus recombinante ou biologicamentederivado e o nível da replicação do vírus nos pulmões e turbinados nasaisforam determinados quatro dias depois (Tabela 11). O quarto dia após ainoculação foi anteriormente mostrado ser o pico da replicação do vírus noshamsters tanto para o vírus wt quanto para o vírus cp45 (ver, Crookshanks eBelshe, J. Med. Virol. 13 (3): 243 a 249, 1984, incorporada neste porreferência em sua totalidade). O vírus rcp45 foi reduzido aproximadamente40 vezes na replicação nos turbinados nasais e 1000 vezes nos pulmões eassim foi tão atenuado quanto o vírus cp45 biologicamente derivado. Estesresultados indicam que o fenótipo de atenuação do cp45 foi reproduzido comsucesso na sua versão recombinante. Visto que cada fenótipo do cp45 foicompletamente reproduzido no rcp45, as cinco mutações adicionais no cp45que não foram incluídas neste Exemplo provavelmente deram poucacontribuição ás propriedades do cp45.TABELA 11

NÍVEL DE REPLICAÇÃO NO TRATO RESPIRATÓRIO SUPERIOR EINFERIOR DE HAMSTERSa DOS PIV3s wt E MUTANTEb.

<table>table see original document page 118</column></row><table>

a. Grupos de cinco hamsters cada um foram intranasalmente administradoscom 10^6-0 TClD50 do vírus por animal em um inóculo de 0,1 ml e os pulmõese os turbinados nasais foram colhidos 4 dias depois.

b. O cp45 é um vírus biologicamente derivado, os outros vírus sãorecombinantes.

c. TCID50, 50% de tecido infeccioso/dose (erro padrão

d. O conjunto de vírus usado neste estudo foi observado conter um fenótipode placa misturado. O fenótipo de atenuação deste mutante será reavaliadousando-se preparações adicionais de vírus.

Como demonstrado acima, as mutações no gene L do cp45especifica a maioria dos fenótipos de atenuação deste vírus. No Exemplopresente, a contribuição das mutações do cp45 fora de L, como um grupo, foiexaminado. O mutante rc/?45 3' NCMFHN foi apenas levemente reduzido nareplicação nos turbinados nasais mas foi mais do que 100 vezes reduzido nareplicação nos pulmões, que mostram que mutações atenuadoras adicionaisestiveram presentes fora da proteína L. De modo importar-te, se cada uma dastrês mutações no gene L do rc/?45 reverteram para a seqüência do tiposelvagem, o vírus resultante, o xcpAS 3' NCMFHN poderia ainda reter ofenótipo de atenuação. Os vírus mutantes rcpAS M e rcpAS HN não foramdefeituosos quanto a replicação no trato respiratório dos hamsters e o vírusrc/?45 3' N apresentou apenas uma diminuição marginal na replicação notrato respiratório inferior. Isto sugere que as mutações presentes no 3' líder,no sítio de início de gene N e nas proteínas Ν, M e HN não são atenuadoraspor e de si mesmas. Entretanto, estas mutações poderiam contribuir com aatenuação global do cpA5 no contexto de outras mutações do cpA5. Tambémmutações individuais dentro da região 3' N pode ter efeitos que não estejamaparentes quando o conjunto das mutações é analisado junto, o qual pode serfacilmente determinado de acordo com a presente divulgação.

A replicação dos vírus mutantes rcp45 C e rc/?45 F foireduzida em aproximadamente 100 vezes tanto nos turbinados nasais quantonos pulmões, demonstrando que as mutações presentes nas proteínas C e F docp45 conferem o fenótipo de atenuação em hamsters, embora o nível deatenuação não seja tão grande quanto aquele conferido pelas mutações cp45L. Como descrito acima, os vírus mutantes xcpA5 F e rcpA5 C não possuem ofenótipo ts e portanto as mutações que ocorrem nas proteínas CeF sãoconsideradas ser mutações atenuadoras não ts.EXEMPLO XI

RECUPERAÇÃO DO PIV3 RECOMBINANTE, QUIMÉRICO EM QUE ASGLICOPROTEÍNAS HEMAGLUTININA E DE FUSÃO FORAMSUBSTITUÍDAS PELAS GLICOPROTEÍNAS CORREPONDENTES DOPIVl

Dentro do presente exemplo, um vírus rPIV quimérico égerado e selecionado de modo que incorpore um ou mais dos genesheterólogos ou seqüências grandes de polinucleotídeo de um PIV emantecedente rPIV diferente. Dentro deste aspecto da invenção, genesindividuais ou seguimentos de gene de um PIV são substituídos pela(s)sequência(s) de contraparte de um PIV heterólogo ou de outra fonte. Em umamodalidade descrita no presente Exemplo, ferramentas e processos são fornecidos para substituir, por exemplo, os antígenos protetores HN e/ou F doHPIVl ou HPIV2 em um HPIV3 recombinante para produzir umrecombinante quimérico adequado para desenvolver vacinas vivas atenuadas.

VÍRUS E CÉLULAS

A cepa PIVl usada neste estudo,PIVl/Washington/20993/1964 (PIVl/Wash 64) foi isolada em WashingtonDC em 1964 e foi confirmada ser um vírus virulento do tipo selvagem emestudos clínicos em voluntários humanos adultos (Murphy et al., Infect.Immun. 12: 62 a 68 (1975), incorporada neste por referência). Foi propagadoem células LLC-MK2 (ATCC CCL 7.1) em Opti-MEM 1 (Life Technologies) com 50 μ^τνλ de sulfato de gentamicina, 2 mM de glutamina e0,75 μg/mi de tripsina (Catalog No. 3741, Worthington Biochemical Corp.,Freehold, NJ). A cepa Greer do PIV2 humano (Catalog No. V-322-001-020,NIAID Repository Rockville, MD) usado no teste hemaglutinação-inibição(HAI) foi propagado do mesmo modo. A cepa JS do vírus PIV3 humano e oseu derivado recombinante do cDNA (rPIV3/JS) com fenótipo do tiposelvagem foram propagados com descrito acima. O Ankara Vacíniamodificado (MVA, recombinante que expressa o bacteriofago polimerase T7RNA é descrito em Wyatt et ai, Virology 210: 202 a 205 (1995)(incorporada neste por referência).

As células HEp-2 foram obtidas da ATCC (ATCC CCL 23) emantidas em Opti-MEM I (Life Technologies) com 2% de soro fetal bovino(FBS), 50 μg/ml de sulfato de gentamicina e 2 mM de glutamina.CONSTRUÇÃO DE UM cDNA OUE CODIFICA UM ANTI-GENOMAPIV3 - PIVl QUIMÉRICO COMPLETOUm cDNA que codifica um RNA anti-genômico PIV3 decomprimento completo em que as ORFs do PIV3 HN e F foram substituídaspor suas contrapartes PIVl foi construído como mostrado na Figura 14. Osclones do cDNA dos genes HN e F do PIVlAVash 64 foram preparados doRNA extraído de células LLC-MK2 que foram infectadas com o vírusPIVl/Wash 64 do tipo selvagem. O cDNA foi gerado usando-se o Sistema dePré-amplificação Superscript usando-se iniciadores hexâmeros randômicos(Life Technologies). Os cDNAs do PIVl F e HN foram amplificados compolimerase Vent DNA (New England Biolabs3 Beverly5 MA) usando-se paresde iniciadores específicos de gene com base em seqüências de consensopresentes no GenBank. Todos os iniciadores descritos abaixo são anotados demodo que as seqüências específicas de PIV estão sublinhadas, os sítios derestrição estão em itálicos, o nt alterado das seqüências do tipo selvagemestão em minúsculo e os códons de início e de fim estão em negrito. Oiniciador PIVl F de sentido positivo que hibridiza o nt de 60 a 97 de fluxoascendente do códon de mício foi 55-GGGAAAGAtCCAGAGACAAGAACGG-3' (SEQ ID NO: 33). O iniciadorPIVl F de sentido negativo, que hibridiza o nt de 36 a 61 de fluxodescendente do códon de início foi 5'-GGTGAAGTTGTGGATccATTTGATTG-3' (SEQ ID NO: 34). Conduz aum sítio BamHl. O iniciador de sentido positivo para o PIVl HN foi 5'-CAACCTGTAAGGUcCAGCATCCG-3' (SEQ ID NO: 35). Hibridiza o ntde 13 a 16 em fluxo ascendente do códon de início HN e leva um sítio Kpnl.O iniciador PIVl HN de sentido negativo foi o 5'-GATATGGTGTTaGGcC7TGATCTGTTC-3' (SEQ ID NO: 36). Hibridizaos últimos dois nt do códon de final e 25 nt adicionais em fluxo descendentee leva um sítio Stul. O PIVl F cDNA foi clonado como um fragmento BamYile de final abrupto no pLITMUS28 digerido por ^amHI-EcoR V (NewEngland Biolabs), enquanto o PIVl HN cDNA foi clonado como umfragmento Kpnl-Stul no mesmo vetor. As seqüências de nt dos plasmídeosresultantes, designados como pLit. IHNwt e pLit.lFwt (GenBank número deAcesso: AFO16280 e AFO16279), foram determinados usando-se o conjuntode Sequenciamento Circumvent (New England Biolabs). Estes dois clonesforam modificados (Figura 14) usando-se iniciadores de PCR mutagênicospara suprimir suas regiões não codificadoras e para introduzir novos sítios derestrição flanqueando seus códons de início e de fim para os propósitos deconstruir os genes quiméricos HN e F do PIV3-1. As seqüências deiniciadores mutagênicos PIVl F de sentido positivo e de sentido negativoforam 5'-CzccATGsAAAAATCAGAGATCCTCTTCT-3' (SEQ ID NO: 37)e 5'-CtggafccfAATTGGAGTTGTTACCCATGTA-3' (SEQ ID NO: 38),respectivamente, os sítios de restrição introduzidos são Ncol e BamYU.. Asseqüências de iniciadores mutagênicos HN do PIVl de sentido negativo e desentido positivo foram 5 '-AACc/* 7Y7GCTGAAAAAGGGAAAA-3' (SEQ IDNO: 39) e 5,-GGTG/íflGCr;AAGATGTGATTTTACATATTTTA-3' (SEQID NO: 40), respectivamente, os sítios de restrição introduzidos são Ncoi eHindlll.

A segunda etapa envolveu a modificação dos genes HN e F doPIV3 para servir como aceptores do PIVl que codifica as regiões geradasacima. Os genes F e HN do PIV3 foram subclonados em diversas etapas doclone de comprimento completo do PIV3/JS, p3/7(131) 2G para gerar opLit.PIV3.HN.4 e pLit.PIV3.F.3a (Figura 14). As regiões que codificam o Fou HN do PIV3 foram suprimidas por mutagênese de TCR e substituídas porsítios de restrição apropriados para aceitar o cDNA HN e F do PIVl descritosacima. As seqüências dos iniciadores mutagênicos de PIV3 F de sentidopositivo e de sentido negativo foram 5'-AAATAggatccCTACAGATCATTAGATATTAAAAT-3' (SEQ ID NO: 41)e 5 '-Cgc CA 7gGTGTTCAGTGCTTGTTG-3' (SEQ ID NO: 42),respectivamente, os sítios de restrição introduzidos foram BamRl e Neol. Asseqüências de iniciadores mutagênicos do PIV3 HN de sentido positivo e desentido negativo foram S^CCAC/^gC/rAATTAACCATAATATGCATCA-3' (SEQ ID NO: 43) e Si-TTCC^ggATTTGGATTTGTCTATTGGGT-S'(SEQ ID NO: 44), respectivamente, os sítios de restrição introduzidos foramHindlll e Ncol. O códon de início para o HN pode ser regenerado da ligaçãocom o cassete mutagenizado PIVl HN. Os cDNAs do PIVl Hn ou Fdescritos acima foram importados como um fragmento AfcoI - Hindlll para oHN ou como um fragmento Ncol - BamHI para o F, que gerou o pLit.PIV3-l.HNhc e pLit.PIV3-l.Fhc. Estes dois cDNAs foram então unidos nopSE.PIV3-l.hc, que foi subseqüentemente sequenciado em sua totalidade.Depois o fragmento BspEl - Sphl foi inserido no p3/7 (131) 2G para gerar opFLC.2G+.hc (Figura 14). A seqüência de nucleotídeo deste fragmentoBspEl - Sphl, que contém os genes quiméricos F e HN está no GenBank (No.de acesso AFO16281). De modo importante, o cDNA engendrado foidesignado de modo que o anti-genoma final conformou a regra dos seis(Durbin et ai, Virology 234: 74 a 78 (1997), incorporada neste porreferência). O plasmídeo pFLC.2G+.hc que codifica a quimera do rPIV3-lfoi depositado em 17/9/97 sob os termos do Tratado de Budapest com aAmerican Type Culture Collection (ATCC) da 12301 Parklawn Drive,Rockville, Maryland 20852, U.S.A.

TRANSFECÇÃO

As monocamadas de célula HEp-2 foram cultivadas paraconfluência em placas de seis reservatórios (Costar Corp, Cambridge, MA) eas transfecções foram realizadas como descrito acima. As monocamadas decélula foram infectadas com MVA-T7 a uma multiplicidade de infecção(MOI) de 3 em 0,8 ml de Opti-MEM I contendo 50 μg/ml de gentamicina e 2mM de glutamina e então transfectados com os três plasmídeos de suporte,0,4 μg de pTM (N), 0,4 μg pTM (P), 0,05 μg pTM (L) e 5 μg do cDNA anti-genoma de PIV3-1. Os plasmídeos foram misturados em 0,2 ml de Opti-MEM I contendo 12 μl de LipofectACE (Life Techílolôgiès) e adicionados acada reservatório. O plasmídeo PIV3/JS cDNA, p3/7 (131) 2G que codifica oRNA anti-genômico do tipo selvagem PIV3/JS, foi transfectado em paralelocomo um controle positivo. Após a incubação a 32°CC por 12 horas, o meiode transfecção foi substituído por 1,5 ml de Opti-MEM fresco, suplementadopor 50 μg/ml de gentamicina e as culturas foram incubadas a 32°C por doisdias adicionais. Tripsina foi adicionada a uma concentração final de 0,75μg/ml no terceiro dia após a transfecção. Os sobrenadantes de cultura decélula foram colhidos no quarto dia e passado (referido como passagem 1)em monocamadas de célula LLC - MK2 fresco. Após adsorção durante anoite, o meio foi substituído com Opti-MEM I fresco com 0,75 μg/ml detripsina. As culturas da passagem 1 foram incubadas a 32°C por quatro dias eo vírus amplificado foi colhido e outra vez passado em células LLC - MK2(referido como passagem 2) durante outros 4 dias a 32°C na presença de 0,75μg/ml de tripsina. O vírus recuperado foi caracterizado pela reação com anti-soro PIVl de coelho, anti-soro PIV2 de porquinho-da-índia e 2 anticorposmonoclonais PIV3 HN em um teste de Hemaglutinação-inibição (HAI) comoanteriormente descrito (van Wyke Coelingh et ai, acima, (1985)) com aexceção de que células sangüíneas vermelhas de galinha (RBCS) foramusadas para os vírus que possuem as glicoproteínas PIVl HN, ao passo queas RBCs do porquinho-da-índia foram usados para o PIV3. O HAI foirealizado para determinar se o rPIV3 possuía a mutação monoclonalresistente ao anticorpo (MARM) que marcou o vírus recuperado do cDNA ouse o RPIV3-1 possuía o PIVl HN.

ANÁLISE DE SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO.

A construção quimérica de cDNA, pSE. PIV3 -l.hc foisequenciada com o conjunto de sequenciamento Circunvent (New EnglandBiolabs) antes da montagem final no clone de comprimento completopFLC.2G+.hc. Para a análise de RNA, os PIVs apropriados foramamplificados nos frascos T75 de células LLC-MK2.· O vírus foi colhido noquinto dia após a infecção e concentrado por precipitação com polietilenoglicol (Mbiguino et ai, J. Virol. Methods 31: 161 a 170 (1991)). O RNAviral foi extraído dos grãos virais e usado na transcrição reversa (RT) com oSistema de Pré amplificação Superscript (Life Technologies). A RT-PCR foirealizada usando-se o conjunto de Síntese de cDNA Advantage (Clontech) eos pares de iniciadores específicos do PIVl ou do PIV3. Os produtos de RT-PCR foram purificados em gel por eletroforese em, e elusão de, tiras demembrana de nitrocelulose NA45 DEAE (Schleicher & Schnuell, Keene,NH) e foram sequenciados.

REPLICACÃO DOS PIVs EM CÉLULAS LLC-MK2.

A enumeração de placa em monocamadas de LLC-MK2 foirealizada como previamente descrito exceto que tripsina foi adicionada nocaso dos vírus PIVl e rPIV3 -1 (Hall et al, Virus Res. 22: 173 a 184 (1992)).Resumidamente, o vírus diluído em série foi inoculado em monocamadas deLLC-MK2 em placas de seis reservatórios; o vírus foi adsorvido durante umahora a 32°C; as culturas foram sobrepostas com meio L-15 (LifeTechnologies) contendo 0,8% de agarose com ou sem tripsina adicionada eincubadas a 32°C por 6 dias; e as placas foram identificadas por hemadsorção(HAD) com células vermelhas do sangue de porquinho-da-índia seguindo aremoção da sobrecamada de agarose.

O cultivo de vírus do PIV em culturas de tecido foi avalidadopela infecção confluente de monocamadas LLC-MK2 em placas de dozereservatórios com vírus a uma MOI de 0,01. Após a adsorção a 32°C por umahora, o inóculo foi substituído por 1,5 ml/reservatório de Opti-MEM Isuplementado com gentamicina (50 μg/ml) e tripsina (0,75 μg/ml) e aindaincubado a 32°C por seis dias. Em intervalos de 24 horas, 0,3 ml do meio foiremovido de cada reservatório e 0,3 ml de meio fresco com tripsina foiadicionado. O título do vírus foi determinado a 32°C pelo teste dehemadsorção em monocamadas de célula LLC-MK2 usando-se fluído desobrecamada como previamente descrito (Hall et al., Virus Res. 22: 173 a184 (1992)) e os títulos foram expressos como Iog10 TCID50/ml.

REPLICACÂO DOS PIVs NO TRATO RESPIRATÓRIO DE HAMSTERS

Hamsters Golden Syrian em grupos de 12 foram cada uminoculados intranasalmente com 0,1 ml de meio L-15, contendo IO5 pfu dovírus rPIV3/JS, rPIV3-l ou PIVlAVash64. Nos dias quarto e cinco após ainoculação, seis hamsters de cada grupo foram sacrificados e seus pulmões eturbinados nasais colhidos, e homogeneizados e o vírus presente nas amostrasfoi titulado em monocamadas de célula LLC-MK2 a 32°C. Os títulos foramexpressos como Iog10 TCID50/grama médio, para cada grupo de seisHamsters.

RESULTADOS

CONSTRUÇÃO DE UM CLONE DE cDNA QUE CODIFICA UM RNAANTI-GENÔMICO DO PIV3-1 QUIMÉRICO DE COMPRIMENTOCOMPLETO PRODUZIDO PELA RECUPERAÇÃO DO VÍRUSQUIMÉRICO rPIV3-l.

Como observado acima, a construção final do cDNAquimérico do PIV3 e do PIV1, no qual as ORFs dos genes glicoproteínicosHN e F do JS PIV3 do tipo selvagem foram substituídos por aqueles doPIVlAVash64 que codificam seqüências (Figura 14) que codifica um RNAanti-genômico quimérico do PIV3-1 de 15.516 nt que conforma-se à regrados seis (Durbin et al., Virology 234: 74 a 78 (1997)). O pFLC.2G+.hccDNA que codifica o anti-genoma quimérico PIV3-1 foi transfectado emcélulas HEp-2 junto com os plasmídeos de suporte Ν, P e L. O p3/7 (131) 2GcDNA que codifica o JS wt PIV3 anti-genoma foi transfectado em paralelopara gerar um vírus parente de controle rPIV3. O vírus foi recuperado decada transfecção seguindo a segunda amplificação em células LLC-MK2 e osestudos foram iniciados para confirmar que cada vírus recombinante foiderivado do cDNA.

Os vírus recombinantes rPIV3-l e rPIV3 foram primeirocaracterizados quanto a presença das glicoproteínas PIVl ou PIV3 HN peloteste HAI com anticorpos monoclonais ou policlonais anti-HN específicos desorotipo. Como mostrado na Tabela 12 o rPIV3 reagiu com apenas um dosdois mAds do PIV3 como suposto, ao passo que o seu parentebiologicamente derivado, o PIV3/JS reagiu com ambos. Isto confirmou que orPIV3 continha a mutação introduzida MARM que marca este vírus comosendo derivado do cDNA. O vírus rPIV3-l reagiu com anticorpos específicospara a glicoproteína HN do PIV1, mas não às mesmas específicas para o HNdo PIV3 ou do PIV2, mostrando que o vírus continha o gene PIVl comosuposto.

TABELA 12

O rPIV3-l POSSUI A GLICOPROTEÍNA HN DO PIVl

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aCélulas sangüíneas vermelhas de pinto (RBC) foram usados no teste HAIpara o PIVl, PIV2 e rPIV3-l e RBCs de porquinho-da-índia foram usadospara o PIV3/JS e rPIV3/JS.

bO anti-soro de coelho foi adquirido da Denka Seiken Co. Ltd., Japan(Catálogo n° 410-701) e o anti-soro de porquinho-da-índia PIV2 foi obtido dorepositor NIAID, Rockville, MD (Catálogo n° V-322-50-558).

cΌ PIV3/JS biologicamente derivado contém epítopos reconhecidos porambos os mAb 423/6 e 77/5, ao passo que o rPIV3/JS foi engendrado paracarecer de reatividade com o mAb 423/6.

dO anti-soro PIV2 teve somente reatividade com o vírus PIVl e portanto nãoé completamente específico de tipo.Foi confirmado em seguida que o vírus rPIV3 -1 continha osgenes PIV3-1 HN e F quiméricos, engendrados. Como projetado, a estruturagenética do rPIV3-l foi único em quatro regiões de junção quandocomparado com cada um de seus parentes, PIVl/Wash64 ou rPIV3/JS (emcaixas na Figura 15A). Estas regiões são os pontos de transição nos quais aseqüência muda da região não codificadora PIV3 até a região codificadoraPIVl e então da região codificadora PIVl de volta para região nãocodificadora PIV3. Usando-se o par de iniciadores A específico para os genesPIV3 ML ou o par de iniciadores B específico para o PIVl M e cada final 3'do gene HN, os produtos de RT-PCR foram gerados por RNAs derivados devirions do rPIV3-l, rPIV3/JS e PIVl/Wash64. As reações de controlemostraram que a etapa RT foi requerida para a geração de produtos de RT-PCR, indicando que um padrão de RNA, ao invés de contaminar o DNA, foirequerido para produzir o produto de RT-PCR. Uma indicação recente de queo rPIV3 -1 foi de fato um vírus quimérico veio da descoberta de que apenas opar A de iniciadores específicos do PIV3 geraram o produto de cDNA de 4,6kb pretendido que alcança os genes F e HN (Figura 15B). Assim embora ovírus rPIV3-l contenha apenas a glicoproteína HN específica do HPIVl (vertabela 12) as regiões não codificadoras são específicas do PIV3.Inversamente, o par B de iniciadores específicos do PIVl amplificou umproduto apropriadamente dimensionado do controle PIVl mas não do rPIV3-1. A análise de digestão de restrição também demonstrou que o produtorPIV3-l de RT-PCR teve padrões únicos de restrição diferentes daqueles dorPIV3/JS e do PIVl/Wash64 e apropriado para esta seqüência prognosticada.

A seqüência nt do produto RT-PCR de 4,6 kb do rPIV3 -1 foideterminada em suas quatro regiões (Figura 15A) e comparada com aquelado rPIV3/JS e do PIVl/Wash64 (Figura 16). A seqüência rPIV3 -1 foicompletamente de acordo com o cDNA para o qual foi derivada. O exame doalinhamento de seqüência da Região I-IV para os três produtos de RT-PCRilustram que o rPIV3-l contém os ORFs das glicoproteínas F e HN do PIVlcom os códons de início e de fim alterados e flanqueados pelas regiões nãocodificadoras 5' e 3' do PIV3. Os exemplos de escadas sequenciadoras queligam a região III e IV do rPIV3-l (Figura 17), comparado em paralelo com orPIV3/JS ou PIVl/Wash64, foram avaliadas e esta análise confirmou que orPIV3 -1 é um vírus quimérico recombinante cuja estrutura estácompletamente de acordo com o cDNA do qual ele foi gerado.

DEPENDÊNCIA DA TRIPSINA E CITOPATICIDADE DO rPIV3 -1 INVITRO

O PIV1, semelhante ao vírus Sendai mas contrário ao PIV3,requer tripsina para a clivagem de sua glicoproteína F de modo a sofrer areplicação multicíclica em linhagens contínuas de células de cultura de tecido(Frank et ai, J. Clin. Microbiol. 10: 32 a 36 (1979)). Além disso, o PIVl éum vírus não citopático ao passo que o PIV3 facilmente produz CPEextensivo (Collins et ai., In Fields Virology, 3a ed., 1: 1205 a 1243 (1996)). OrPIV3 -1, o rPIV3 e o PIVl/Wash64 foram comparados com base nestaspropriedades. O rPIV3-l, semelhante ao PIVlAVash64 teve um título de HAmais alto usando-se RBCs de frango ao invés de porquinho-da-índia (Tabela13). O rPIV3 -1, igual a seu parente o PIVl/Wash64 requereu a tripsina paraa replicação eficiente em culturas com sobrecamada fluídica bem como paraa formação eficiente de placa. O rPIV3-l produziu placas a 32°C, 37°C ou40°C com eficiência similar. Está portanto evidente que o rPIV3 -1 possui aglicoproteína F do vírus parente PIVl e não é sensível à temperatura. Poroutro lado o rPIV3-l produziu CPE, como indicado pelas célulasarredondadas e desprendendo-se das monocamadas infectadas por vírus,quase na mesma extensão como o seu PIV3 parente sugerindo que estapropriedade biológica é uma função dos seus genes PIV3 que situam-se fora das regiões codificadoras HN e F assim, o rPIV3 -1 possui propriedadesbiológicas de ambos os parentes que são compatíveis com as descobertasacima demonstrando que é um vírus quimérico Este vírus quiméríco,recombinante, exemplar dentro da invenção foi depositado em 21 de maio de1998 sob os termos do Tratado de Budapest com o American Type CultureCollection (ATCC) da 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852,U.S.A.

TABELA 13

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Os estoques de vírus foram cultivados em células LLC-MK2 que foraminfectadas em um MOI de o,ol e incubadas por 6 dias na presença de(PIVl/Wash64, rPIV3-l) ou ausência (rPIV3/JS) de 0,75 μ^πιΐ de tripsina.Os estoques de vírus resultantes foram ensaiados pelos testes abaixo napresença ou ausência de tripsina como indicado.

bO teste de TCID50 foi realizado em 6 dias por visualização direta do CPE oupor hemadsorção (HAD).

0As placas foram visualizadas por HAD após seis dias de incubação.dO HAD das monocamadas infectadas por PIV3 foi aproximadamenteaparente aio passo que o do PIVl e do rPIV31 foi observável apenas pelomicroscópio em que as células únicas com RBC. adsorvido foram observadas.eO nível mais baixo de vírus detectável foi 10°'7/ml.

COMPARAÇÃO DO NÍVEL DE REPLICAÇÃO DO rPIV3 -1 E SEUSVÍRUS PARENTES EM CÉLULAS LLC-MK2 E HAMSTERS.

A replicação de multiciclo dos vírus rPIV3, rPIV3-l e doPIVl/Wash64 foi avaliada seguindo a inoculação de células de cultura detecido LLC-MK2 em um MOI de 0,01 (Figura 18). Pode ser visto que ascinéticas e magnitude da replicação dos três vírus são muito semelhantes. Istoindica que a substituição dos genes HN e F do PIVl por aqueles do PIV3 nãoatenua o vírus para a replicação in vitro. foi determinado em seguida se orPIV3 -1 foi atenuado in vivo, especificamente quanto a replicação nos tratosrespiratórios superiores e inferiores de hamsters (Tabela 14). O nívelobservado de replicação do rPIV3-l foi similar, se não levemente maior doque o de cada parente no trato respiratório superior e inferior dos hamsters.

TABELA 14

NÍVEL DE REPLICAÇÃO DOS PIVs PARENTES E QUIMÉRICOS NOTRATO RESPIRATÓRIO SUPERIOR E INFERIOR DE HAMSTERSa

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a Os hamsters foram infectados intranasalmente com IO5'0 TCID50 por animal,do vírus indicado e os pulmões e turbinados nasais foram removidos noquarto ou quinto dia após a infecção. Os títulos são a média de seis animaispor dia e são expressos como média do Iog10 TCID50/gramas (erro padrão.

Em resumo, o presente Exemplo demonstra a recuperaçãobem sucedida de um vírus rPIV3-l quimérico em que os ORFs dasglicoproteínas PIVl HN e F foram substituídas por aquelas do rPIV3. Estevírus quimérico replicou igual a seus vírus parentes PIVl e PIV3 do tiposelvagem in vitro e in vivo, demonstrando que a substituição dos ORFsglicoproteínicos não resulta na atenuação do rPIV3-l. Esta recuperação bemsucedida de um PIV3 recombinante que leva as glicoproteínas HN e F doPIVl é surpreendente porque os dois vírus, que representam soro tiposdistintos, não são intimamente relacionados. Em particular é notável que orecombinante quimérico desenvolve-se tão bem quanto os seus dois parentes.Notavelmente, os vírus recombinantes quimériccs que possuem umasubstituição no gene glicoproteínico também foram recuperados a partir dovírus da estomatite vesicular (VSV) (Lawson et al., Proc. Natl Acad. Sei.U.S.A. 92: 4477 a 4481 (1995)). Especificamente, o gene glicoproteínico Gdo VSV do sorotipo Indiana foi substituído pelo de sorotipo New Jersey queparticipa apenas 50% da identidade de seqüência de aminoácido. Aocontrário do rPIV3-l o VSV17nj replica em apenas 10% do nível dorecombinante VSV1 ou VSV, biologicamente derivado.

No presente Exemplo, as glicoproteínas HN e F tem 43 e 47%de identidade de seqüência, respectivamente, entre o PIVl e o PIV3. Atransferência das duas glicoproteínas juntas poderia, é claro, prevenir aincompatibilidade entre as glicoproteínas (Tanabayashi, K. e Compans, R.W.J. Virol. 70: 6112 a 6118 (1996)). Por outro lado, pensa-se no geral, que asglicoproteínas interajam com a proteína M (que é 63% idêntica entre PIVl ePIV3) através de seus domínios citoplásmicos (CT) ou de transmembrana(TM) e que esta interação seja importante na morfogênese e estrutura dovirion. Neste particular, o grau de identidade de seqüência entre as proteínasHN e F dos dois sorotipos dos domínios TM e CT é realmente baixo: 30% e22%, respectivamente para o domínio TM e 9 e 11%, respectivamente, para odomínio CT. Levando-se em consideração estes níveis baixos derelacionamento de seqüência, temos também perseguido uma estratégiaparalela de construir glicoproteínas quiméricas em que o ectodomínio dePIVl de cada glicoproteína foi fundido nos domínios TM e CT do PIV3.Com respeito às interações possíveis com a proteína M ou outras proteínainternas, poderia ser que uma estrutura conservada, tal como uma constelaçãode aminoácidos carregados fosse importante ao invés de uma seqüênciaconservada. Alternativamente, poderia ser que interações dos domíniosTMCT das glicoproteínas com proteínas internas não fosse tão crítico quantofoi anteriormente pensado. Será possível examinar estes fatores maisintimamente usando-se os processos e as ferramentas fornecidas neste. Porexemplo, estes fatores serão ainda elucidados pelo trabalho em progressoutilizando se os processos descritos acima para construir um vírus PIV3 queleve HN e F do PIV2.

Supôs-se que o rPIV3 -1 poderia requerer a tripsina para areplicação eficiente em cultura de tecido visto que esta é uma propriedadeconferida pela glicoproteína F do PIVl e observou-se ser este o caso.Entretanto, foi interessante observar que o rPIV3 -1 causou CPE que maispróximo pareceu com aquele do vírus parente PIV3, indicando que umgene(s) do PIV3, outro que não HN ou F5 especifica este fenótipo. Estespapéis também serão ainda elucidados usando-se os processos e ferramentasfornecidos neste para trocar gene(s) adicional(is) entre o PIVl não citopáticoe o PIV3 citopático.

EXEMPLO XIIRECUPERAÇÃO DO PIV RECOMBINANTE QUIMÉRICO ATENUADOVIVO QUE CODIFICA AS PROTEÍNAS INTERNAS DO PIV TIPO 3 E ASGLICOPROTEÍNAS DE SUPERFÍCIE DO PIV DO TIPO 1

No presente Exemplo, um derivado do rPIV3-l que leva ostrês aminoácido sensíveis à temperatura e atenuadores que codificam asmudanças observadas no gene L de vírus de vacina candidato PIV3 cp45atenuado vivo, denominado rPIV3 -l.c/?45L demonstra exibir um fenótiposensível a temperatura com um temperatura de interrupção de 3 8 °C, similaràquela do recombinante rPIV3 c/?45L que possui as mesmas três mutações. OrPIV3-l.c/?45L é atenuado no trato respiratório dos hamsters na mesmaextensão como o rPIV3 cp45L. A infecção de hamsters com o rPIV3 -1 .cp45L gera um nível moderado de anticorpos que inibem a hemaglutinaçãocontra o PIVl wt e induz a resistência completa para opor-se ao PIVl do tiposelvagem. Isto demonstra que os PIVs atenuados quiméricos de acordo com ainvenção são capazes de induzir uma imuno resposta altamente eficaz contraο PIV1. Esta divulgação também confirma os dados descritos acimademonstrando que as glicoproteínas de superfície dos vírus da parainfluenzasão suficientes para induzir um alto nível de resistência na oposição ao vírushomólogo. Inesperadamente, a infecção com o vírus quimérico recombinanterPIV3-l.c/?45L ou rPIV3, cada um levando os genes glicoproteínicos desuperfície do PIVl e os genes internos do PIV3, também induzem um nívelmoderado de resistência à replicação do vírus oponente PIV3. Isto indica queos genes internos do PIV3 podem independentemente induzir imunidadeprotetora contra o PIV3 em roedores. Assim, um sistema genético reversopara PIV3 como divulgado neste produz com sucesso candidatos a vacina dePIVl atenuados vivos que são atenuados e protetores em indivíduos modeloaceitos.

VÍRUS E CÉLULAS

A cepa wt PIVl usada neste estudo é a PIVl/Washington/20993/1964 (PIVl/Wash64) (ver, por exemplo Murphy et al., Infect. Immun.12: 62, 1975 (incorporada neste por referência em sua totalidade). O rPIV3-lquimérico, recuperado do cDNA do PIV3 quimérico em que os ORF do PIV3F e HN foram substituídos por aqueles do PIVl/Wash64, como descritoacima e em Tao et al., J. Virol. 72: 2955, 1998 (incorporada neste porreferência em sua totalidade). Estes vírus foram propagados em células LLC-MK2 (ATCC CCL 7.1) em Opti-MEM I (Life Technologies, Gaithersburg,MD) com 50 μg/ml de sulfato de gentamicina e 0,75 μg/ml de tripsina(Catálogo No. 3711, Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ). Atripsina é incluída porque a glicoproteína F do PIV1, mas não aquela doPIV3, é dependente de tripsina exógena para clivagem quando cultivado emcultura de célula sob estas condições. A cepa JS wt do vírus PIV3 humano eseu derivado recombinante do cDNA (rPIV3/JS) foram propagados comodescritos acima e em Durbin et al., Virology 235: 323, 1997 (incorporadaneste por referência em sua totalidade). A propagação do cp45, um derivadoatenuado do PIV3/JS wt (ver acima; e Karron et al., J Infect. Dis. 171. 1107,1995 (incorporada neste por referência em sua totalidade)), e rPIV3 cp45L,um PIV3 recombinante que leva as três mutações ts encontradas no gene L doc/?45, foram propagados como descrito acima e em Skiadopoulos et al.,J.Virol. 72: 1762, 1998 (incorporada neste por referência em sua totalidade).O Ankara Vaccinia modificado (MVA) recombinante que expressa obacteriofago T7 da polimerase do RNA é descrito em Virology 210: 202,1995 (incorporada neste por referência em sua totalidade).

As células HEp-2, que são usadas na transfecção foramobtidas da ATCC (ATCC CCL 23) e mantida em Opti-MEM I com 2% desoro fetal bovino (FBS), 50 μg/ml de sulfato de gentamicina.INTRODUÇÃO DAS MUTAÇÕES L NO cDNA DO rPIV3-l ANTI-GENÔMICO

As três mutações L do cp45 presente no plasmídeo pTM (L)942/992/1558 descrito acima (ver também, Skiadopoulos et al., J. Virol,. 72:1762, 1998, foram introduzidos no cDNA quimérico pFLC.2G+.hc (descritoacima, ver também, Tao et al., J. Virol. 72: 2955, 1998), como um fragmentoSphI-NheI de 2,8 kb (nt 11313 a 14092 no cDNA do PIV3 anti-genômico)para gerar o pFLC.2G+.hc.c/?45L que leva os ORFs F e HN do PIVl e as trêsmutações do gene cp45 L (Figura 19). As mutações específicas presentes nopTM (L) 942/992/1558 são indicadas na legenda da Figura 19.

TRANSFECÇÃO

As monocamadas de célula HEp-2 em placas de seisreservatório foram cultivadas para confluência e transfecções foramrealizadas como descrito acima (ver também, Tao et al., J. Virol. 72: 2955,1998). A tripsina foi adicionada em uma concentração final de 0,75 μg/ml noterceiro dia após a transfecção antes da colheita no quarto dia. Osobrenadantes da cultura de célula foram clarificados e passados (referidocomo passagem 1) em monocamadas de célula LLC - MK2 fresco. Apósadsorção durante a noite, o meio foi substituído ccm Ορΐί-ΜΕΜ 1 fresco com0,75 μ{*/πι1 de tripsina. As culturas da passagem 1 foram incubadas a 32°Cpor quatro dias e o vírus presente no sobrenadante foi colhido e outra vezpassado sob as mesmas condições (referido como passagem 2). O víruspresente na colheita da passagem dois foi testado quanto a presença daproteína HN do PIVl pelo teste de hemaglutinação-inibição (HAI) comodescrito acima (ver também Tao et ai, J. Virol. 72: 2955, 1998).REPLICAÇÃO DOS PIVs EM LLC-MK2 EM VÁRIAS TEMPERATURAS.

A enumeração de placa em monocamadas LLC-MK2 foirealizada como descrito acima, com 0,75 μg/ml de tripsina adicionada àsobrecamada de agarose no caso do PIV1, rPIV3-l e rPIV3-l.cp45L (vertambém, Tao et al., J. Virol. 72: 2955, 1998). Após incubação em váriastemperaturas por seis dias a sobrecamada de agarose foi removida e as placasforam identificadas por hemadsorção (HAD) com eritrócitos de porquinho-da-índia (RBCs).

REPLICAÇÃO DOS PIVs NO TRATO RESPIRATÓRIO DE HAMSTERS

Grupos de cinco hamsters foram inoculados intranasalmentecom 0,1 ml do meio Ll5 contendo IO6 unidades formadoras de placa (PFU)do rPIV3/JS, rPIV3 cp45L, cpA5, PIVl/Wash64, rPIV3-l ou rPIV3-l.cp45L.Os hamsters foram sacrificados no quarto dia após a infecção e seus pulmõese turbinados nasais foram colhidos e homogeneizados. O vírus presente nasamostras de tecido foi titulado em monocamadas de célula LLC-MK2 a 32/Ccomo descrito acima e em Tao et ai, J. Virol. 72: 2955, 1998. Os títulosforam expressos como a média recíproca do log10TCID50/grama de tecidopara cada grupo.

ESTUDOS DE IMUNIZAÇÃO E DEINOCULAÇÂO EM HAMSTERS.

Grupos de dez hamsters foram imunizados intranasalmentecom 106 PFU do vírus por animal, como descrito acima. O soro foi coletadopara o teste HAI antes da infecção e no 33° dia. O nível de anticorpospresentes no soro de cada grupo de 10 hamsters foi determinado usando-sePIVl/Wash64 e PIV3 /JS como antígenos e os títulos HAI determinados sãoapresentados como Iog2 médio (ver também, Tao et al., J. Virol. 72: 2955,1998).

Trinta e cinco dias após a imunização, cinco hamsters de cadagrupo foram inoculados intranasalmente com IO6 PFU do PIVl/Wash64 ourPIV3/JS. Os turbinados nasais e os pulmões destes hamsters inoculadosforam colhidos 4 dias após a inoculação. Os títulos do vírus nas amostras detecido foram determinados em monocamadas de LLC-MK2 como descritoacima e em Tao et ai, J. Virol. 72: 2955, 1998 e os títulos são apresentadoscomo média do Iog10 TCID50/grama de tecido.

RESULTADOSRECUPERAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO VÍRUS QUIMÉRICORECOMBINANTErPIV3 -l.c/?45L.

Como observado acima, o clone de cDNA pFLC.2G+.hc, umcDNA anti-genômico de tamanho completo do PIV3 em que as ORFs quecodificam as glicoproteínas F e HN foram substituídas por aquelas do PIV1,foi modificado pela introdução de três mudanças codificadoras deaminoácido (designados 942, 992 e 1558, de acordo com a posição deaminoácido na proteína L) identificado no gene L do cp45 e apresentadocomo sendo independente nas mutações ts e de atenuação (Figura 19; vertambém, Skiadopoulos et al., J. Virol. 72: 1762, 1998). Cada mudançacodificadora foi marcada pela co-introdução de substituições de nt contíguastranslacionalmente silenciosas para remover um sítio de restrição deocorrência natural (Figura 19; Tabela 8). A construção de plasmídeo final decomprimento completo pFLC.2G+.hc.cp45L (Figura 19), codifica um RNAanti-genômico quimérico do PIV3-1 de 15516 nt no comprimento e conformea regra dos seis (ver, Durbin et al., Virology 234: 74, 1997, incorporada nestepor referência em sua totalidade). A autenticidade do pFLC.2GH-.hc.cp45L foiconfirmado pela digestão com enzimas de restrição apropriadas.

O pFLS.2G+.hc.c/?45L cDNA foi transfectado em célulasHEp-2 junto com os plasmídeos de suporte Ν, P e L do PIV3 e infectadoscom MVA-T7 como descrito acima e em Tao et al., J. Virol. 72: 2955, 1998).

O vírus recuperado após duas passagens em células LLC-MK2, denominadorPIV3-l.cp45L foi biologicamente clonado por passagem de placa para placapara placa e o vírus amplificado foi analisado para confirmar que possuía asglicoproteínas e as três mutações introduzidas em L. Primeiro5 a presença daproteína HN do PIVl no rPIV3-l.çp45L foi confirmada pela reatividade comanticorpos específicos do PIVl em teste de HAI como descrito acima e emTao et al., J. Virol. 72: 2955, 1998). A presença dos genes quiméricos doPIV3-1 HN e F, bem como as mutações do gene L introduzidas no RNAgenômico do rPIV3-l.cp45L foi confirmado pela digestão de enzima derestrição ou análise de seqüência de nucleotídeo de produtos de RT-PCRgerados do RNA virion como descrito acima e em Tao et al, J. Virol. 72:2955, 1998. Estes dados confirmaram que o rPIV3-l.cp45L é um vírusquimérico recombinante que leva as três substituições de códon do gene L docp45.

O rPIV3-l.cp45L É SENSÍVEL À TEMPERATURA

As três mutações do gene L do cp45 foram mostradas acimapara conferir o fenótipo ts quando introduzidas no PIV3 wt (ver também,Skiadopoulos et al., J. Virol. 72: 1762, 1998) para avaliar se sua presença novírus quimérico poderia ter o mesmo efeito, a eficiência de formação de placado rPIV3-l.c/?45L foi determinada em várias temperaturas. Como mostradona Tabela 15, as três mutações L de fato conferiram o fenótipo ts ao vírusquimérico. O nível de sensibilidade à temperatura especificado pelasmutações c/?45L nos vírus recombinantes rPIV3.c/?45L e rPIV3-l.çp45L foiequivalente (Tabela 15, indicando que o efeito das mutações é independentedas glicoproteínas HN e F do PIV3 ou do PIV1. O nível de sensibilidade àtemperatura do rPIV3.c/?45L e do rPIV3-l.c/?45L foi comparável àquele dovírus cp45 biologicamente derivado, a despeito do fato de que o último víruspossui mutações fora de 1 (ver, Stokes et ai., Virus Res. 30: 43, 1993,incorporada neste por referência em sua totalidade.

TABELA 15

O VÍRUS CANDIDATO À VACINA RECOMBINANTE, QUIMÉRICO_rPIV3-l.çp45L É SENSÍVEL À TEMPERATURA

<table>table see original document page 139</column></row><table>

a Nomenclatura do vírus: rPIV3/JS, recombinante wt PIV3 cepa JS;PIVl/Wash64, PIVl wt biologicamente derivado; rPIV3-l, PIV3 quiméricorecombinante em que os ORFs F e HN foram substituídos por aqueles doPIVlAVash64. Vírus candidato a vacina biologicamente derivado do c/?45;rPIV3.c/?45L, PIV3 recombinante contendo a s três mutações do gene L docp45; rPIV3-l.c/?45L, rPIV3 -1 quimérico recombinante contendo as trêsmutações do gene L do cpA5.b Os títulos do vírus foram determinados usando-se monocamadas LLC-MK2em placas de 12 reservatórios. Os títulos são a média de dois ensaios.c Vírus biologicamente derivados. Todos os outros são vírus recombinantes.d A temperatura de interrupção, isto é a temperatura restritiva mais baixa naqual uma redução de dois Iog10 no título do vírus é observado, a de cada vírusts é indicada em negrito.

NÍVEL DE REPLICAÇÂO DO rPIV3-l.cp45L EM HAMSTERS

As três mutações do gene L do cpA5 foram mostradas acimapara conferir atenuação da replicação do vírus no trato respiratório superior einferior de hamsters, quando introduzidos no PIV3 wt (ver também,Skiadopoulos et ai, J.Virol. 72: 1762, 1998). Seus efeitos no vírus quiméricoforam avaliados por infecção intranasal de hamsters, como mostrado naTabela 16. Esta descoberta indica que o rPIV3-l.c/?45L provavelmente foiatenuado em ambos os sítios e, além disso que seu nível de atenuação foicomparável àquele do rPIV3.c/?45L. Assim, a capacidade das mutações c/?45L conferirem atenuação, igual a sensibilidade à temperatura é independenteda especificidade antigênica das glicoproteínas de superfície.

TABELA 16

O VÍRUS CANDIDATO A VACINA, RECOMBINANTE QUIMÉRICO,rPIV3-l.c/?45L É ATENUADO NO TRATO RESPIRATÓRIO DOS

HAMSTERS

Título do vírus (média do Iog10 TCID50/gramas (erro padrão) no tecido

<table>table see original document page 140</column></row><table>

a Grupos de cinco hamsters foram infectados intranasalmente com os vírusindicados em uma dosagem de IO6 PFU por hamster. No quarto dia após ainfecção, as amostras se tecido foram colhidos e ensaiados quanto ao vírus.b Os títulos do vírus são dados como Log10 TCID50 por grama de tecido.

INFECÇÃO COM rPIV3-l OU rPIV3-l.cp45L. CONTENDO ASPROTEÍNAS INTERNAS DO PIV3 E AS GLICOPROTEÍNAS DO PIVLCONFERE RESISTÊNCIA À INOCULAÇÃO DE PIVl EM HAMSTERS.

O vírus quimérico rPIV3-l e seu derivado atenuado rPIV3- l.çp45L foram avaliados quanto a imunogenicidade e eficácia protetora emhamsters. Como mostrado na Tabela 17, a infecção com cada vírus induziu osanticorpos HAI contra o PIV1, mas não contra o PIV3 confirmando que estesvírus quiméricos possuem a glicoproteína HN do PIVl e são altamenteimunogênicos. O nível de anticorpos HAI induzido pelo rPIV3-l.c/?45L foiduas vezes menor do que pelo rPIV3-l, o que indica que sua atenuaçãoresultou em uma modesta diminuição na imunogenicidade. Igualmente, orPIV3 e o rPIV3.c/?45L induziram anticorpos HAI contra o PIV3, mas nãocontra o PIVl e o nível induzido pelo vírus atenuado foi de aproximadamentevezes mais baixo. A despeito da replicação restrita em hamsters dos vírusrecombinantes que levam as mutações cpA5 L, a infecção com rPIV3.c/?45Lou rPIV3-l.c/?45L induziu a resistência completa à replicação do vírusinoculado que leva glicoproteínas homólogas.<table>table see original document page 142</column></row><table>A INFECCÂO COM rPIV3-l.cp45L TAMBÉM CONFERE RESISTÊNCIAAO PIV3

Informação sobre o papel das glicoproteínas dos PIVs outrasque não HN ou F (isto é, as proteínas internas) na resistência é limitada. Adivulgação e o uso de rPIV3 -1 e rPIV3-l.çp45L neste, fornece umaoportunidade para se examinar o papel que as proteínas internasdesempenham na resistência à inoculação com PIV3, visto que apenas osgenes compartilhados pelos vírus na imunização e na inoculação são os genesde proteína interna. A replicação do vírus PIV3 inoculado foisignificantemente restringida tanto no trato respiratório superior quanto noinferior, por infecção anterior de hamsters com rPIV3-l ou rPIV3-l.c/?45L(Tabela 17). Assim, estes dados indicam que as proteínas internas do PIV3,semelhantes às proteínas HN e F são capazes de induzir resistência parcial àreplicação do PIV3 inoculado.

Entre as descobertas demonstradas pelos estudos deimunogenicidade e eficácia, acima, uma descoberta particularmenteinesperada foi que a infecção com rPIV3 wt ou atenuado induziu umaredução de 100 vezes na replicação do vírus PIVl inoculado nos pulmões.Assim, a infecção com um soro tipo do PIV forneceu proteção significantecontra um sorotipo heterólogo. Isto em parte não foi suposto porque estudosprévios indicaram que a infecção de animais com um tipo de PIV humanonão induz a proteção heteróloga significante contra um PIV pertencente a umsorotipo humano diferente, conforme uma crença geral de que a imunidade ásinfecções por PIV humano fosse amplamente específica por tipo (ver, porexemplo, Cook et al., Amer. Jour. Hyg. 77: 150, 1963; Ray et al., J. Infect.Dis. 162: 746, 1990, cada uma incorporada neste por referência em suatotalidade).

O presente Exemplo demonstra a exploração bem sucedida denovos processos e reagentes desenvolvidos para gerar vacinas de PIV3 paraainda fornecer o desenvolvimento rápido e racional de vacinas candidatasatenuadas vivas para PIV1. Um cDNA que codifica o PIV3 infeccioso foimodificado pela substituição dos ORFs que codificam os antígenos protetorsHN e F do PIVl para suas contrapartes do PIV3. Subseqüentemente, asmutações atenuadoras, exemplificadas pelas três mutações atenuadoraspresentes no gene L do cp45 do PIV3, foram incorporadas dentro destecDNA modificado, quimérico de PIV3-PIV1. A partir deste cDNA, um vírusrecombinante foi recuperado levando os genes HN e F no PIV1, as proteínasinternas do PIV3 e as mutações do gene cp45 L do PIV3. Este recombinante,o rPIV3-l.cp45L foi sensível à temperatura, altamente atenuado em hamsterse altamente eficaz contra o PIVl inoculado em hamsters. O nível desensibilidade à temperatura, atenuação e imunogenicidade exibido pelorPIV3-l.c/?45L foi comparável àquele do cp45 do PIV3, indicando que osfenótipos especificados pelo conjunto das mutações do gene cp45 L sãoindependentes das glicoproteínas de superfície HN e F. Estas descobertas,que representam o primeiro candidato a vacina de PIVl atenuada viva,gerada por genéticas reversas, fornece um esquema no geral bem sucedidopara desenvolver vacinas contra o PIV1.

Pouca informação é conhecida no que concerne ao papel queas proteínas internas dos vírus da parainfluenza desempenham na resistênciaà reinfecção com o vírus homólogo. A infecção com os recombinantes davacínia que expressam N, epítopos dentro de N ou M, pelo modo relatado,induz a resistência à replicação do vírus inoculado mas a magnitude daresistência relatada é menor do que aquela induzida pelos recombinantes davacínia que levam glicoproteína HN ou F (ver, por exemplo, Kast et al,Proc. Natl Acad. Sei. U.S.A. 88: 2283, 1991; Sakaguchi et al, J. Gen. Virol.74: 479, 1993; Thomson et al, J. Immunol. 157: 822, 1996, cada umaincorporada neste por referência em sua totalidade). Estes estudos sugeremque as proteínas internas realizaram apenas contribuições menores para aresistência à reinfecção. Portanto, a presente divulgação apresenta resultadosinesperados mostrando que antes da infecção dos hamsters com rPIV3-l.c/?45L ou rPIV3-l induziu a cerca de 250 a 4000 vezes a redução dareplicação do PIV3 tanto nos turbinados nasais quanto nos pulmões. Estesdois vírus recombinantes quiméricos diferem do vírus PIV3 inoculado emque possuem as glicoproteínas HN e F do PIVl ao invés das do PIV3 mascompartilham todos os outros genes com o vírus inoculado. As glicoproteínasHN e F do PIVl compartilham 47% e 43% de identidade de seqüência comaquelas do PIV3, respectivamente. Embora seja provável que as proteínasinternas compartilhadas sejam mediadoras da resistência observada, tambémé possível que as seqüências de proteína compartilhadas entre asglicoproteínas F e HN de PIVl e PIV3 sejam contribuidoras da imunidadeobservada. Por exemplo, existem cinco trechos no HN e dois trechos no Fque abrangem pelo menos 9 resíduos de aminoácido no comprimento que sãocompartilhados ente PIVl e PIV3 e têm o potencial para atuar como epítoposprotetors CTL. E razoável considerar que as proteínas internascompartilhadas sejam contribuidoras para a restrição da replicação do vírusPIV3 wt inoculado, visto que este nível de imunidade cruzada não foi vistoestudos prévios (ver, por exemplo, Cook et ai, Amer. Jour. Hyg. 77: 150,1963; Ray et al., J. Infect. Dis. 162: 746, 1990, incorporadas neste porreferência em suas totalidades).

A descoberta de que as proteínas internas do PIV3 dasquimeras rPIV3-l e rPIV3-l.cp45L conferiram resistência ao PIV3 inoculadodemonstra que os derivados atenuados do PIV3 podem ser usados comovetores para antígenos protetors contra o PIVl e PIV2. seguindo-se osensinamentos da invenção, a imunização com o vírus de vacina atenuadovivo com base no PIV3 pode restringir a replicação de outros vírus de vacinacom base no PIV3 subseqüentemente administrados, diminuindo assim aimunogenicidade do segundo vírus, visto que o PIV3, semelhante ao RSV,induz significantemente enfermidades na infância precoce; uma vacina deRSV-PIV3 para o uso em bebes muito jovens de 2 a 4 semanas de idade éportanto um importante aspecto da invenção (ver, por exemplo, Collins et al.,Fields Virology 3a ed. Filadélfia: Lippincott-Raven Publishers5 1205 (1),1996; Reed et al., J. Infect. Dis. 175: 807, 1997, cada uma incorporada nestepor referência em sua totalidade). De acordo com este aspecto da invenção, aimunização com uma vacina PIVl - PIV2 será iniciada preferivelmente acerca de 6 meses de idade, visto que a maioria das doenças PIVl e PIV2ocorrem após a idade de seis meses. Nas circunstâncias possíveis em que aimunização com rPIV3 cpAS signiflcantemente inibe a replicação de um vírusde vacina PIV3-1, quimérico recombinante, com o qual compartilha os genesde proteína interna, a imunização bem sucedida com uma vacina PIV3-1recombinante pode ser comprometida. Neste evento, uma vacina de PIVtrivalente será administrada simultaneamente ao invés de seqüencialmente, prevenindo assim a inibição observada acima.

O divulgado neste de que a infecção com uma vacina ou PIV3wt induz uma redução de 100 vezes a replicação do vírus pulmonar do PIVlheterólogo foi claramente inesperada, em parte porque os vírus do PIVhumano são sorologicamente distintos pelo teste de neutralização e emestudos prévios em hamsters constatou-se que a infecção prévia com um tipode PIV falhou em induzir a resistência ao se inocular com uma dose alta deum tipo diferente de PIV (ver, por exemplo, Cook et al., Amer. Jour. Hyg.69: 250, 1959). Além disso, existem poucos dados epidemiológicos quedocumentam que a infecção prévia com um PIV modifica significantemente ainfecção subsequente com um PIV heterotípico.

Em resumo, o presente Exemplo mostra que o rPIV3 foiconvertido com sucesso em uma vacina para o PIVl substituindo-se os ORFque codificam as glicoproteínas F e HN e introduzindo-se mutaçõesatenuadoras conhecidas nos genes internos do PIV3. Assim, os processos ereagentes extensivos fornecidos neste podem ser aplicados direta eprognosticavelmente para atenuar a estrutura principal de PIV3 do vírusquimérico rPIV3 -Ibem como para gerar vírus de vacina PIV2 atenuado vivo.

As divulgações anteriores tornam possível explorar osreagentes e os processos fornecidos neste para desenvolver uma amplamontagem de PIV e vacinas relacionadas. Neste contexto, a recuperação dequimeras imunogênicas, vivas entre PIV3 e PIV2 exemplifica novasferramentas para desenvolver uma faixa de vírus de PIV recombinante para ouso em vacina. Em conjunção com este trabalho, a identificação ecaracterização das bases genéticas para a atenuação de mutantes do PIV deocorrência natural, por exemplo, os candidatos a vacina, o çp45 e o BPIV3,seguindo os ensinamentos da presente divulgação também permite odesenvolvimento de um grande número de vírus recombinantes de vacina epartículas subvirais. Em particular, as mutações desejadas presentes nos vírusmutantes biologicamente derivados serão facilmente identificados eselecionados por suas introduções, isoladamente ou em combinação em umabase de PIV do tipo selvagem, parcialmente atenuado ou quimérico comomostrado nos exemplos acima. Estas descobertas expandirão o menu deexemplares, mutações atenuadoras dentro da invenção que podem serintroduzidas nos clones de PIV para calibrar o nível de atenuação e aimunogenicidade em vacinas recombinantes. as mutações biologicamentederivadas também podem ser introduzidas dentro dos clones de PIV quetenham tipos diferentes de mutações, por exemplo, mutações que envolvamalterações, supressões ou substituições de um gene ou um seguimento degene. Dentro deste aspecto da invenção, são fornecidos PIV recombinantesque tenham uma supressão, adição ou substituição selecionada de gene, talcomo o rPIV tendo uma supressão do(s) ORF(s) C, D ou V. Tais clonesalternativamente mutados podem ser ainda modificados de acordo com apresente divulgação pela introdução de uma ou mais mutações queespecifiquem um fenótipo ts, ca ou att adotados de um PIV mutantebiologicamente derivado. Como exemplificado pelos recombinantes do PIVr942, r992, rl558, r942/992, r992/1558 ou r942/1558 e r942/992/1558. Emaspectos adicionais da invenção, as mutações biologicamente derivadas serãocombinadas com mutações atenuadoras de novo, não encontradas nanatureza, como exemplificado pelas deleções de gene atenuadores, porexemplo dos ORFs C, D e/ou V. outros tipos de mutações divulgadas nesteque conferem características fenotípicas desejadas serão também combinadascom mutações atenuadoras, biologicamente derivadas, similares à faixa demutações combinatórias divulgadas para as cepas de vacina do RSVrecombinante no Pedido de Patente dos Estados Unidos Série No.08/892.403, depositado em 15 de julho de 1997 (incorporado neste porreferência). Mutações comparáveis podem ser facilmente introduzidas, porexemplo, em um vírus quimérico, para se obter um nível desejado deatenuação e imunogenicidade em uma cepa de vacina quimérica. Destamaneira, um amplo menu de mutações é fornecido dentro da invenção, osquais são úteis para se engendrar uma ampla montagem de vacinas de rPIVatenuados vivos que tenham um balanço desejado de atenuação eimunogenicidade, junto com outras características fenotípicas desejadas.

Embora a invenção precedente tenha sido descrita em algunsdetalhes por via de ilustração e exemplo para propósitos de clareza eentendimento, será obvio que certas mudanças e modificações possam serpraticadas dentro do escopo das reivindicações anexas.LISTAGEM DAS SEOUENCIAS

(1) INFORMAÇÃO GERAL:

(i) REQUERENTE:

(A) NOME: O Governo dos Estados Unidos

(B) RUA: Caixa OTT

(C) CIDADE: Bethesda

(D) ESTADO: Maryland

(E) PAÍS: Estados Unidos da América

(F) CÓDIGO POSTAL: 20892

(G) TELEFONE:

(H) TELEFAX:

(I) TELEX:

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: PRODUÇÃO DE VACINAS DE VÍRUSATENUADO DA PARAINFLUENZA A PARTIR DE SEQÜÊNCIA DE

NUCLEOTÍDEO CLONADO

(iii) NÚMERO DE SEQÜÊNCIAS: 74

(iv) FORMA LEGÍVEL DE COMPUTADOR:

(A) TIPO DE MEIO: disquete

(B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA DE OPERAÇÃO: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versão #1.25

(v) DADOS DO PEDIDO CORRENTE:

(A) NÚMERO DO PEDIDO: WO

(B) DATA DE DEPÓSITO: 22 de maio de 1998

(C) CLASSIFICAÇÃO:

(vi) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR:

(A) NÚMERO DO PEDIDO: US 60/059.385

(B) DATA DE DEPÓSITO: 19 de setembro de 1997

(vi) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR:(A) NÚMERO DO PEDIDO: US 60/047.575

(B) DATA DE DEPÓSITO: 23 de maio de 1997

(vii) INFORMAÇÃO DO REPRESENTANTE/AGENTE:

(A) NOME: King5 Jeffrey J.

(B) NÚMERO DE REGISTRO: 38.515

(C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/CERTIFICADO:17634-000320PC

(viii) INFORMAÇÕES DE TELECOMUNICAÇÕES:(A) TELEFONE: 206-467-9600

(B) TELEFAX: 415-576-0300

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 1:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 15669 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 1:GCTGGGTACC GGGCCCGTCG ACGCGTATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA 6 0GACCCGTTTA GAGGCCCCAA GGGGTTATGC TACTGCAGGC TCTCCCTTAG CCATCCGAGT 12 0GGACGTGCGT CCTCCTTCGG ATGCCCAGGT CGGACCGCGA GGAGGTGGAG ATGCCATGCC 130

GACCCACCAA ACAAGAGAAG AAACTTGTCT GGGAATATAA ATTTAACTTT AAATTAACTT 24 0

AGGATTAAAG ACATTGACTA GAAGGTCAAG AAAAGGGAAC TCTATAATTT CAAAAATGTT 300

GAGCCTATTT GATACATTTA ATGCACGTAG GCAAGAAAAC ATAACAAAAT CAGCCGGTGG 36 0

AGCTATCATT CCTGGACAGA AAAATACTGT CTCTATATTC GCCCTTGGAC CGACAATAAC 42 0

TGATGATAAT GAGAAAATGA CATTAGCTCT TCTATTTCTA TCTCATTCAC TAGATAATGA 4 80

GAAACAACAT GCACAAAGGG CAGGGTTCTT GGTGTCTTTA TTGTCAATGG CTTATGCCAA 54 0

TCCAGAGCTC TACCTAACAA CAAATGGAAG TAATGCAGAT GTCAAGTA7G TCATATACAT 6 00

GATTGAGAAA GATCTAAAAC GGCAAAAGTA TGGAGGATTT GTGGTTAAGA CGAGAGAGAT 6Ó0

GATATATGAA AAGACAACTG ATTGGATATT TGGAAGTGAC CTGGATTATG ATCAGGAAAC 72 0

TATGTTGCAG AACGGCAGGA ACAATTCAAC AATTGAAGAC CTTGTCCACA CATTTGGGTA 78 0

TCCATCATGT TTAGGAGCTC TTATAATACA GATCTGGATA GTTCTGGTCA AAGCTATCAC 84 0

TAGTATCTCA GGGTTAAGAA AAGGCTTTTT CACCCGATTG GAAGCTTTCA GACAAGATGG 900

AACAGTGCAG GCAGGGCTGG TATTGAGCGG TGACACAGTG GATCAGATTG GGTCAATCAT SSO

GCGGTCTCAA CAGAGCTTGG TAACTCTTAT GGTTGAAACA TTAATAACAA TGAATACCAG 102 0

CAGAAATGAC CTCACAACCA TAGAAAAGAA TATACAAATT GTTGGCAACT ACATAAGAGA 108 0

TGCAGGTCTC GCTTCATTCT TCAATACAAT CAGATATGGA ATTGAGACCA GAATGGCAGC 114 0

TTTGACTCTA TCCACTCTCA GACCAGATAT CAATAGATTA AAAGCTTTGA TGGAACTGTA 1200

TTTATCAAAG GGACCACGCG CTCCTTTCAT CTGTATCCTC AGAGATCCTA TACATGGTGA 12 6 0

GTTCGCACCA GGCAACTATC CTGCCATATG GAGCTATGCA ATGGGGGTGG CAGTTGTACA 132 0

AAATAGAGCC ATGCAACAGT ATGTGACGGG AAGATCATAT CTAGACATTG ATATGTTCCA 138 0

GCTAGGACAA GCAGTAGCAC GTGATGCCGA AGCTCAAATG AGCTCAACAC TGGAAGATGA 14 4 0

ACTTGGAGTG ACACACGAAT CTAAAGAAAG CTTGAAGAGA CATATAAGGA ACATAAACAG 1500

TTCAGAGACA TCTTTCCACA AACCGACAGG TGGATCAGCC ATAGAGATGG CAATAGATGA 15SO

AGAGCCAGAA CAATTCGAAC ATAGAGCAGA TCAAGAACAA AATGGAGAAC CTCAATCATC 162 0

CATAATTCAA TATGCCTGGG CAGAAGGAAA TAGAAGCGAT GATCAGACTG AGCAAGCTAC 168 0

AGAATCTGAC AATATCAAGA CCGAACAACA AAACATCAGA GACAGACTAA ACAAGAGACT 174 0

CAACGACAAG AAGAAACAAA GCAGTCAACC ACCCACTAAT CCCACAAACA GAACAAACCA 18 00

GGACGAAATA GATGATCTGT TTAACGCATT TGGAAGCAAC TAATCGAATC AACATTTTAA ISSO

TCTAAATCAA TAATAAATAA GAAAAACTTA GGATTAAAGA ATCCTATCAT ACCGGAATAT 1920

AGGGTGGTAA ATTTAGAGTC TGCTTGAAAC TCAATCAATA GAGAGTTGAT GGAAAGCGAT 198 0

GCTAAAAACT ATCAAATCAT GGATTCTTGG GAAGAGGAAT CAAGAGATAA ATCAACTAAT 204 0

ATCTCCTCGG CCCTCAACAT CATTGAATTC ATACTCAGCA CCGACCCCCA AGAAGACTTA 2100

TCGGAAAACG ACACAATCAA CACAAGAACC CAGCAACTCA GTGCCACCAT CTGTCAACCA 2160

GAAATCAAAC CAACAGAAAC AAGTGAGAAA GATAGTGGAT CAACTGACAA AAATAGACAG 2220TCTGGGTCAT CACACGAATG TACAACAGAA GCAAAAGATA GAAATATTGA TCAGGAAACT 2280

GTACAGAGAG GACCTGGGAG AAGAAGCAGC TCAGATAGTA GAGCTGAGAC TGTGGTCTCT 2340

GGAGGAATCC CCAGAAGCAT CACAGATTCT AAAAATGGAA CCCAAAACAC GGAGGATATT 2400

GATCTCAATG AAATTAGAAA GATGGATAAG GACTCTATTG AGGGGAAAAT GCGACAATCT 24SO

GCAAATGTTC CAAGCGAGAT ATCAGGAAGT GATGACATAT TTACAACAGA ACAAAC-TAGA 2520

AACAGTGATC ATGGAAGAAG CCTGGAATCT ATCAGTACAC CTGATACAAG ATCAATAAGT 2580

GTTGTTACTG CTGCAACACC AGATGATGAA GAAGAAATAC TAATGAAAAA TAGTAGGACA 2640

AAGAAAAGTT CTTCAACACA TCAAGAAGAT GACAAAAGAA TTAAAAAAGG GGGAAAAGGG 2700

AAAGACTGGT TTAAGAAATC AAAAGATACC GACAACCAGA TACCAACATC AGACTACAGA 2760

TCCACATCAA AAGGGCAGAA GAAAATCTCA AAGACAACAA CCACCAACAC CGACACAAAG 2820

GGGCAAACAG AAATACAGAC AGAATCATCA GAAACACAAT CCTCATCATG C-AATCTCATC 2880

ATCGACAACA ACACCGACCG GAACGAACAG ACAAGCACAA CTCCTCCAAC AACAACTTCC 2940

AGATCAACTT ATACAAAAGA ATCGATCCGA ACAAACTCTG AATCCAAACC CAAGACACAA 3000

AAGACAAATG GAAAGGAAAG GAAGGATACA GAAGAGAGCA ATCGATTTAC AGAGAGGGCA 3060

ATTACTCTAT TGCAGAATCT TGGTGTAATT CAATCCACAT CAAAACTAGA TTTATATCAA 3120

GACAAACGAG TTGTATGTGT AGCAAATGTA CTAAACAATG TAGATACTGC ATCAAAGATA 3180

GATTTCCTGG CAGGATTAGT CATAGGGGTT TCAATGGACA ACGACACAAA ATTAACACAG 3240

ATACAAAATG AAATGCTAAA CCTCAAAGCA GATCTAAAGA AAATGGACGA ATCACATAGA 3300

AGATTGATAG AAAATCAAAG AGAACAACTG TCATTGATCA CGTCACTAAT TTCAAATCTC 3360

AAAATTATGA CTGAGAGAGG AGGAAAGAAA GACCAAAATG AATCCAATGA GAGAGTATCC 3420

ATGATCAAAA CAAAATTGAA AGAAGAAAAG ATCAAGAAGA CCAGGTTTGA CCCACTTATG 3480

GAGGCACAAG GCATTGACAA GAATATACCC GATCTATATC GACATGCAGG AGATACACTA 3540

GAGAACGATG TACAAGTTAA ATCAGAGATA TTAAGTTCAT ACAATGAGTC AAATGCAACA 3600

AGACTAATAC CCAAAAAAGT GAGCAGTACA ATGAGATCAC TAGTTGCAGT CATCAACAAC 3660

AGCAATCTCT CACAAAGCAC AAAACAATCA TACATAAACG AACTCAAACG TTGCAAAAAT 3720

GATGAAGAAG TATCTGAATT AATGGACATG TTCAATGAAG ATGTCAACAA TTGCCAATGA 3780

TCCAACAAAG AAACGACACC GAACAAACAG ACAAGAAACA ACAGTAGATC AAAACCTGTC 3840

AACACACACA AAATCAAGCA GAATGAAACA ACAGATATCA ATCAATATAC AAATAAGAAA 3900

AACTTAGGAT TAAAGAATAA ATTAATCCTT GTCCAAAATG AGTATAACTA ACTCTGCAAT 3960

ATACACATTC CCAGAATCAT CATTCTCTGA AAATGGTCAT ATAGAACCAT TACCACTCAA 4020

AGTCAATGAA CAGAGGAAAG CAGTACCCCA CATTAGAGTT GCCAAGATCG GAAATCCACC 4080

AAAACACGGA TCCCGGTATT TAGATGTCTT CTTACTCGGC TTCTTCGAGA TGGAACGAAT 4140

CAAAGACAAA TACGGGAGTG TGAATGATCT CGACAGTGAC CCGAGTTACA AAGTTTGTGG 4200

CTCTGGATCA TTACCAATCG GATTGGCTAA GTACACTGGG AATGACCAGG AATTGTTACA 4260

AGCCGCAACC AAACTGGATA TAGAAGTGAG AAGAACAGTC AAAGCGAAAG AGATGGTTGT 4320TTACACGGTA CAAAATATAA AACCAGAACT C-TACCCATGG TCCAATAGAC TAAGAAAAGG 43 80

AATGCTGTTC GATGCCAACA AAGTTGCTCT TGCTCCTCAA TGTCTTCCAC TAGATAGGAG 4440

CATAAAATTT AGAGTAATCT TCGTGAATTG TACGGCAATT GGATCAATAA CCTTGTTCAA 4500

AATTCCTAAG TCAATGGCAT CACTATCTCT' ACCCAACACA ATATCAATCA ATCTGCAGGT 4550

ACACATAAAA ACAGGGGTTC AGACTGATTC TAAAGGGATA GTTCAAATTT TGGATGAGAA 4520

AGGCGAAAAA TCACTGAATT TCATGGTCCA TCTCGGATTG ATCAAAAGAA AAGTAGGCAG 4580

AATGTACTCT GTTGAATACT GTAAACAGAA AATCGAGAAA ATGAGATTGA TATTTTCTTT 4740

AGC-ACTAGTT GGAGGAATCA GTCTTCATGT CAATGCAACT GGGTCCATAT CAAAAACACT 4800

AGCAAGTCAG CTGGTATTCA AAAGAGAGAT TTGTTATCCT TTAATGGATC TAAATCCGCA 4SSO

TCTCAATCTA GTTATCTGGG CTTCATCAGT AGAGATTACA AGAGTGGATG CAATTTTCCA 4920

ACCTTCTTTA CCTGGCGAGT TCAGATACTA TCCTAATATT ATTGCAAAAG GAGTTGGGAA 4930

AATCAAACAA TGGAACTAGT AATCTCTATT TTAGTCCGGA CGTATCTATT AAGCCGAAGC 5040

PAATAAAGGA TAATCAAAAA CTTAGGACAA A^GAGGTCAA TACCAACAAC TATTAGCAGT 5100

CACACTCGCA AGAATAAGAG AGAAGGGACC AAAAAAGTCA AATAGGAGAA ATCAAAACAA 5150

AAGGTACAGA ACACCAGAAC AACAAAATCA AAACATCCAA CTCACTCAAA ACAAAAATTC 5220

CAAAAGAGAC CGGCAACACA ACAAGCACTG AACACAATGC CAACTTCAAT ACTGCTAATT 52S0

ATTACAACCA TGATCATGGC ATCTTTCTGC CAAATAGATA TCACAAAACT ACAGCACGTA 5340

GGTGTATTGG TCAACAGTCC CAAAGGGATG AAGATATCAC AAAACTTTGA AACAAC-ATAT 5400

CTAATTTTGA GCCTCATACC AAAAATAGAA GACTCTAACT CTTGTGGTGA CCAACAGATC 5450

AAGCAATACA AGAAGTTATT GGATAGACTG ATCATCCCTT TATATGATGG ATTAAGATTA 5520

CAGAAAGATG TGATAGTAAC CAATCAAGAA TCCAATGAAA ACACTGATCC CAGAACAAAA 5580

CGATTCTTTG GAGGGGTAAT TGGAACCATT GCTCTGGGAG TAGCAACCTC AGCACAAATT 5540

ACAGCGGCAG TTGCTCTGGT TGAAGCCAAG CAGGCAAGAT CAGACATCGA AAAACTCAAA 5700

GAAGCAATTA GGGACACAAA CAAAGCAGTG CAGTCAGTTC AGAGCTCCAT AGGAAATTTA 5700

ATAGTAGCAA TTAAATCAGT CCAGGATTAT GTTAACAAAG AAATCGTGCC ATCGATTGCG 5820

AGGCTAGGTT GTGAAGCAGC AGGACTTCAA TTAGGAATTG CATTAACACA GCATTACTCA 5880

GAATTAACAA ACATATTTGG TGATAACATA GGATCGTTAC AAGAAAAAGG AATAAAATTA 5940

CAAGGTATAG CATCATTATA CCGCACAAAT ATCACAGAAA TATTCACAAC ATCAACAGTT 6000

GATAAATATG ATATCTATGA TCTGTTATTT ACAGAATCAA TAAAGGTGAG AGTTATAGAT 6050

GTTGACTTGA ATGATTACTC AATCACCCTC CAAGTCAGAC TCCCTTTATT AACTAGGCTG 6120

CTGAACACTC AGATCTACAA AGTAGATTCC ATATCATATA ACATCCAAAA CAGAGAATGG 6180

TATATCCCTC TTCCCAGCCA TATCATGACG AAAGGGGCAT TTCTAGGTGG AGCAGACGTC 6240

AAAGAATGTA TAGAAGCATT CAGCAGCTAT ATATGCCCTT CTGATCCAGG ATTTGTATTA 6300

AACCATGAAA TAGAGAGCTG CTTATCAGGA AACATATCCC AATGTCCAAG AACAACGGTC 6360ACATCAGACA TTGTTCCAAG ATATGCATTT GTCAATGGAG GAGTGGTTGC AAACTGTATA 6420ACAACCACCT GTACATGCAA CGGAATTGGT AATAGAATCA ATCAACCACC TGATCAAGGA 64SO

GTAAAAATTA TAACACATAA AGAATGTAGT ACAATAGGTA TCAACGGAAT GCTGTTCAAT 6540

ACAAATAAAG AAGGAACTCT TGCATTCTAT ACACCAAATG ATATAACACT AAACAATTCT 6SOO

GTTGCACTTG ATCCAATTGA CATATCAATC GAGCTCAACA AGGCCAAATC AGATCTAGA--. 6650

GAATCAAAAG AATGGATAAG AAGGTCAAAT CAAAAACTAG ATTCTATTGG AAATTGGCAT 6720

CAATCTAGCA CTACAATCAT AATTATTTTG ATAATGATCA TTATATTGTT TATAATTAAT 6780

ATAACGATAA TTACAATTGC AATTAAGTAT TACAGAATTC AAAAGAGAAA TCGAGTGGAT 6S40

CAAAATGACA AGCCATATGT ACTAACAAAC AAATAACATA TCTACAGATC ATTAC-ATATT 6900

AAAATTATAA AAAACTTAGG AGTAAAGTTA CGCAATCCAA CTCTACTCAT ATAATTGAGG 6960

AAGGACCCAA TAGACAAATC CAAATTCGAG ATGGAATACT GGAAGCATAC CAATCACGGA 7020

AAGGATGCTG GTAATGAGCT GGAGACGTCT ATGGCTACTC ATGGCAACAA GCTCACTAAT 7030

AAGATAATAT ACATATTATG GACAATAATC CTGGTGTTAT TATCAATAGT CTTCATCATA 7140

GTGCTAATTA ATTCCATCAA AAGTGAAAAG GCCCACGAAT CATTGCTGCA AGACATAAAT 7200

AATGAGTTTA TGGAAATTAC AGAAAAGATC CAAATGGCAT CGGATAATAC CAATGATCTA 7260

ATACAGTCAG GAGTGAATAC AAGGCTTCTT ACAATTCAGA GTCATGTCCA GAATTACATA 7320

CCAATATCAT TGACACAACA GATGTCAGAT CTTAGGAAAT TCATTAGTGA AATTACAATT 7330

AGAAATGATA ATCAAGAAGT GCTGCCACAA AGAATAACAC ATGATGTAGG TATAAAACCT 7440

TTAAATCCAG ATGATTTTTG GAGATGCACG TCTGGTCTTC CATCTTTAAT GAAAACTCCA 75O0

AAAATAAGGT TAATGCCAGG GCCGGGATTA TTAGCTATGC CAACGACTGT TGATGGCTGT 7550

C-TTAGAACTC CGTCTTTAGT TATAAATGAT CTGATTTATG CTTATACCTC AAATCTAATT 7620

ACTCGAGGTT GTCAGGATAT AGGAAAATCA TATCAAGTCT TACAGATAGG GATAATAACT 7680

GTAAACTCAG ACTTGGTACC TGACTTAAAT CCTAGGATCT CTCATACCTT TAACATAAAT 7740

GACAATAGGA AGTCATGTTC TCTAGCACTC CTAAATATAG ATGTATATCA ACTGTGTTCA 7800

ACTCCCAAAG TTGATGAAAG ATCAGATTAT GCATCATCAG GCATAGAAGA TATTGTACTT 7860

GATATTGTCA ATTATGATGG TTCAATCTCA ACAACAAGAT TTAAGAATAA TAACATAAGC 7920

TTTGATCAAC CATATGCTGC ACTATACCCA TCTGTTGGAC CAGGGATATA CTACAAAGGC 7980

AAAATAATAT TTCTCGGGTA TGGAGGTCTT GAACATCCAA TAAATGAGAA TGTAATCTGC 8040

AACACAACTG GGTGCCCCGG GAAAACACAG AGAGACTGTA ATCAAGCATC TCATAGTACT 8100

TGGTTTTCAG ATAGGAGGAT GGTCAACTCC ATCATTGTTG TTGACAAAGG CTTAAACTCA 8160

ATTCCAAAAT TGAAAGTATG GACGATATCT ATGCGACAAA ATTACTGGGG GTCAGAAGGA 8220

AGGTTACTTC TACTAGGTAA CAAGATCTAT ATATATACAA GATCTACAAG TTGGCATAGC 82SO

AAGTTACAAT TAGGAATAAT TGATATTACT GATTACAGTG ATATAAGGAT AAAATGGACA 8340

TGGCATAATG TGCTATCAAG ACCAGGAAAC AATGAATGTC CATGGGGACA TTCATGTCCA 8400

GATGGATGTA TAACAGGAGT ATATACTGAT GCATATCCAC TCAATCCCAC AGGGAGCATT 8460

GTGTCATCTG TCATATTAGA CTCACAAAAA TCGAGAGTGA ACCCAGTCAT AACTTACTCA 8520ACAGCAACCG AAAGAGTAAA CGAGCTGGCC ATCCTAAACA GAACACTCTC AGCTGGATAT 3530

ACAACAACAA GCTGCATTAC ACACTATAAC AAAGGATATT GTTTTCATAT AGTAGAAATA 8640

AATCATAAAA GCTTAAACAC ATTTCAACCC ATGTTGTTCA AAACAGAGAT TCCAAAAAGC 3700

TGCAGTTAAT CATAATTAAC CATAATATGC ATCAATCTAT CTATAATACA AGTATATGAT 8750

AAGTAATCAG CAATCAGACA ATAGACAAAA GGGAAATATA AAAAACTTAG GAGCAAAGCG 8S20

TGCTCGGGAA ATGGACACTG AATCTAACAA TGGCACTGTA TCTGACATAC TCTATCCTGA 8S30

GTGTCACCTT AACTCTCCTA TCGTTAAAGG TAAAATAGCA CAATTACACA CTATTATGAG 8940

TCTACCTCAG CCTTATGATA TGGATGACGA CTCAATACTA GTTATCACTA GACAGAAAAT 9000

AAAACTTAAT AAATTGGATA AAAGACAACG ATCTATTAGA AGATTAAAAT TAATATTAAC 9050

TGAAAAAGTG AATGACTTAG GAAAATACAC ATT7ATCAGA TATCCAGAAA TGTCAAAAGA 9120

AATGTTCAAA TTATATATAC CTGGTATTAA CAGTAAAGTG ACTGAATTAT TACTTAAAGC 9130

AGATAGAACA TATAGTCAAA TGACTGATGG ATTAAGAGAT CTATGGATTA ATGTGCTATC 9240

AAAATTAGCC TCAAAAAATG ATGGAAGCAA TTA7GATCTT AATGAAGAAA ΤΤΑΑΤΑΑΤΑΤ 9300

ATCGAAAGTT CACACAACCT ATAAATCAGA TAAATGGTAT AATCCATTCA AAACATGGTT 9350

TACTATCAAG TATGATATGA GAAGATTACA AAAAGCTCGA AATGAGATCA CTTTTAATGT 9420

TGGGAAGGAT TATAACTTGT TAGAAGACCA GAAGAATTTC TTATTGATAC ATCCAGAATT 9430

GGTTTTGATA TTAGATAAAC AAAACTATAA TGGTTATCTA ATTACTCCTG AATTAGTATT 9540

GATGTATTGT GACGTAGTCG AAGGCCGATG GAA7ATAAGT GCATGTGCTA AGTTAGATCC 9500

AAAATTACAA TCTATGTATC AGAAAGGTAA TAACCTGTGG GAAGTGATAG ATAAATTGTT 9650

TCCAATTATG GGAGAAAAGA CATTTGATGT GATATCGTTA TTAGAACCAC TTGCATTATC 9720

CTTAATTCAA ACTCATGATC CTGTTAAACA ACTAAGAGGA GCTTTTTTAA ATCATGTGTT 9730

ATCCGAGATG GAATTAATAT TTGAATCTAG AGAATCGATT AAGGAATTTC TGAGTGTAGA 9840

TTACATTGAT AAAATTTTAG ATATATTTAA TAAGTCTACA ATAGATGAAA TAGCAGAGAT 9900

TTTCTCTTTT TTTAGAACAT TTGGGCATCC TCCATTAGAA GCTAGTATTG CAGCAGAAAA 9900

GGTTAGAAAA TATATGTATA TTGGAAAACA ATTAAAATTT GACACTATTA ATAAATGTCA 10020

TGCTATCTTC TGTACAATAA TAATTAACGG ATATAGAGAG AGGCATGGTG GACAGTGGCC 10030

TCCTGTGACA TTACCTGATC ATGCACACGA ATTCATCATA AATGCTTACG C-TTCAAACTC 10140

TGCGATATCA TATGAAAATG CTGTTGATTA TTACCAGAGC TTTATAGGAA TAAAATTCAA 10200

TAAATTCATA GAGCCTCAGT TAGATGAGGA TTTGACAATT TATATGAAAG ATAAAGCATT 10260

ATCTCCAAAA AAATCAAATT GGGACACAGT TTATCCTGCA TCTAATTTAC TGTACCGTAC 10320

TAACGCATCC AACGAATCAC GAAGATTAGT TGAAGTATTT ATAGCAGATA GTAAATTTGA 10380

TCCTCATCAG ATATTGGATT ATGTAGAATC TGGGGACTGG TTAGATGATC CAGAATTTAA 10440

TATTTCTTAT AGTCTTAAAG AAAAAGAGAT CAAACAGGAA GGTAGACTCT TTGCAAAAAT 10500

GACATACAAA ATGAGAGCTA CACAAGTTTT ATCAGAGACC CTACTTGCAA ATAACATAGG 10560

AAAATTCTTT CAAGAAAATG GGATGGTGAA GGGAGAGATT GAATTACTTA AGAGATTAAC 10620AACCATATCA ATATCAGGAG TTCCACGGTA TAATGAAGTG TACAATAATT CTAAAAGCCA 10680

TACAGATGAC CTTAAAACCT ACAATAAAAT AAGTAATCTT AATTTGTCTT CTAATCAGAA 10740

ATCAAAGAAA TTTGAATTCA AGTCAACGGA TATCTACAAT GATGGATACG AGACTGTGAG 10800

CTGTTTCCTA ACAACAGATC TCAAAAAATA CTGTCTTAAT TGGAGATATG AATCAACAGC 10860

TCTATTTGGA GAAACTTGCA ACCAAATATT TGGATTAAAT AAATTGTTTA ATTGGTTACA 10920

CCCTCGTCTT GAAGGAAGTA CAATCTATGT AGGTGATCCT TACTGTCCTC CATCAGATAA 10980

AGAACATATA TCATTAGAGG ATCACCCTGA TTCTGGTTTT TACGTTCATA ACCCAAGAGG 11040

GGGTATAGAA GGATTTTGTC AAAAATTATG GACACTCATA TCTATAAGTG CAATACATCT 11100

AGCAGCTGTT AGAATAGGCG TGAGGGTGAC TGCAATGGTT CAAGGAGACA ATCAAGCTAT 11160

AGCTGTAACC ACAAGAGTAC CCAACAATTA TGACTACAGA GTTAAGAAGG AGATAGTTTA 1122 0

TAAAGATGTA GTGAGATTTT TTGATTCATT AAGAGAAGTG ATGGATGATC TAGGTCATGA 1128 0

ACTTAAATTA AATGAAACGA TTATAAGTAG CAAGATGTTC ATATATAGCA AAAGAATCTA 1134 0

TTATGATGGG AGAATTCTTC CTCAAGCTCT AAAAGCATTA TCTAGATGTG TCTTCTGGTC 114 00

AGAGACAGTA ATAGACGAAA CAAGATCAGC ATCTTCAAAT TTGGCAACAT CATTTGCAAA 114 6 0

AGCAATTGAG AATGGTTATT CACCTGTTCT AGGATATGCA TGCTCAATTT TTAAGAATAT 1152 0

TCAACAACTA TATATTGCCC TTGGGATGAA TATCAATCCA ACTATAACAC AGAATATCAG 11580

AGATCAGTAT TTTAGGAATC CAAATTGGAT GCAATATGCC TCTTTAATAC CTGCTAGTGT 11640

TGGGGGATTC AATTACATGG CCATGTCAAG ATGTTTTGTA AGGAATATTG GTGATCCATC 11700

AGTTGCCGCA TTGGCTGATA TTAAAAGATT TATTAAGGCG AATCTATTAG ACCGAAGTGT 11760

TCTTTATAGG ATTATGAATC AAGAACCAGG TGAGTCATCT TTTTTGGACT GGGCTTCAGA 1182 0

TCCATATTCA TGCAATTTAC CACAATCTCA AAATATAACC ACCATGATAA AAAATATAAC 1188 0

AGCAAGGAAT GTATTACAAG ATTCACCAAA TCCATTATTA TCTGGATTAT TCACAAATAC 11940

AATGATAGAA GAAGATGAAG AATTAGCTGA GTTCCTGATG GACAGGAAGG TAATTCTCCC 12 000

TAGAGTTGCA CATGATATTC TAGATAATTC TCTCACAGGA ATTAGAAATG CCATAGCTGG 12 06 0

AATGTTAGAT ACGACAAAAT CACTAATTCG GGTTGGCATA AATAGAGGAG GACTGACATA 1212 0

TAGTTTGTTG AGGAAAATCA GTAATTACGA TCTAGTACAA TATGAAACAC TAAGTAGGAC 12180

TTTGCGACTA ATTGTAAGTG ATAAAATCAA GTATGAAGAT ATGTGTTCGG TAGACCTTGC 1224 0

CATAGCATTG CGACAAAAGA TGTGGATTCA TTTATCAGGA GGAAGGATGA TAAGTGGACT 12300

TGAAACGCCT GACCCATTAG AATTACTATC TGGGGTAGTA ATAACAGGAT CAGAACATTG 1236 0

TAAAATATGT TATTCTTCAG ATGGCACAAA CCCATATACT TGGATGTATT TACCCGGTAA 12420

TATCAAAATA GGATCAGCAG AAACAGGTAT ATCGTCATTA AGAGTTCCTT ATTTTGGATC 124 80

AGTCACTGAT GAAAGATCTG AAGCACAATT AGGATATATC AAGAATCTTA GTAAACCTGC 12 54 0

AAAAGCCGCA ATAAGAATAG CAATGATATA TACATGGGCA TTTGGTAATG ATGAGATATC 12600

TTGGATGGAA GCCTCACAGA TAGCACAAAC ACGTGCAAAT TTTACACTAG ATAGTCTCAA 12 66 0

AATTTTAACA CCGGTAGCTA CATCAACAAA TTTATCACAC AGATTAAAGG ATACTGCAAC 12720TCAGATGAAA TTCTCCAGTA CATCATTGAT CAGAGTCAGC λGATTCATAA CAATC-TCCAA 12730

TGATAACATG TCTATCAAAG AAGCTAATGA AACCAAAGAT AZTAATCTTA TTTATCAACA 12840

AATAATGTTA ACAGGATTAA C-TGTTTTCGA ATATTTATTT AC-ATTAAAAG AAACCACAGG 12900

ACACAACCCT ATAGTTATGC ATCTGCACAT AGAAGATGAG TC-TTGTATTA AAGAAAGTTT 12960

TAATGATGAA CATATTAATC CAGAGTCTAC ATTAGAATTA A7TCGATATC CTGAAAGTAA 13020

TGAATTTATT TATGATAAAG ACCCACTCAA AGATGTGGAC TrATCAAAAC TTATGGTTAT 13080

TAAAGACCAT TCTTACACAA TTGATATGAA TTATTGGGAT GATACTGACA TCATACATGC 13140

AATTTCAATA TGTACTGCAA TTACAATAGC AGATACTATC- TCACAATTAG ATCGAGATAA 13200

TTTAAAAGAG ATAATAGTTA TTGCAAATGA TGATGATATT AATAGCTTAA TCACTGAATT 13260

TTTGACTCTT GACATACTTG TATTTCTCAA GACATTTGC-T GGATTATTAG TAAATCAATT 13320

TGCATACACT CTTTATAGTC TAAAAATAGA AGGTAGGGAT CTCATTTGGG ATTATATAAT 13380

GAGAACACTG AGAGATACTT CCCATTCAAT ATTAAAAGTA T7ATCTAATG CATTATCTCA 13440

TCCTAAAGTA TTCAAGAGGT TCTGGGATTG TGGAGTTTTA AACCCTATTT ATGGTCCTAA 13500

TACTGCTAGT CAAGACCAGA TAAAACTTGC CCTATCTATA TC-TGAATATT CACTAGATCT 13560

ATTTATGAGA GAATGGTTGA ATGGTGTATC ACTTGAAATA TACATTTGTG ACAGCGATAT 13620

GGAAGTTGCA AATGATAGGA AACAAGCCTT TATTTCTAGA CACCTTTCAT TTGTTTGTTG 13680

TTTAGCAGAA ATTGCATCTT TCGGACCTAA CCTGTTAAAC TTAACATACT TGGAGAGACT 13740

TGATCTATTG AAACAATATC TTGAATTAAA TATTAAAGAA GACCCTACTC TTAAATATGT 13800

ACAAATATCT GGATTATTAA TTAAATCGTT CCCATCAACT GTAACATACG TAAGAAAGAC 13860

TGCAATCAAA TATCTAAGGA TTCGCGGTAT TAGTCCACCT GAGGTAATTG ATGATTGGGA 13920

TCCGGTAGAA GATGAAAATA TGCTGGATAA CATTGTCAAA ACTATAAATG ATAACTGTAA 13980

TAAAGATAAT AAAGGGAATA AAATTAACAA TTTCTGGGGA CTAGCACTTA AGAACTATCA 14040

AGTCCTTAAA ATCAGATCTA TAACAAGTGA TTCTGATGAT AATGATAGAC TAGATGCTAA 14100

TACAAGTGGT TTGACACTTC CTCAAGGAGG GAATTATCTA TCGCATCAAT TGAGATTATT 14160

CGGAATCAAC AGCACTAGTT GTCTGAAAGC TCTTGAGTTA TCACAAATTT TAATGAAGGA 14220

AGTCAATAAA GACAAGGACA GGCTCTTCCT GGGAGAAGGA GCAGGAGCTA TGCTAGCATG 14280

TTATGATGCC ACATTAGGAC CTGCAGTTAA TTATTATAAT TCAGGTTTGA ATATAACAGA 14340

TGTAATTGGT CAACGAGAAT TGAAAATATT TCCTTCAGAG GTATCATTAG TAGGTAAAAA 14400

ATTAGGAAAT GTGACACAGA TTCTTAACAG GGTAAAAGTA CTGTTCAATG GGAATCCTAA 14460

TTCAACATGG ATAGGAAATA TGGAATGTGA GAGCTTAATA TGGAGTGAAT TAAATGATAA 14520

GTCCATTGGA TTAGTACATT GTGATATGGA AGGAGCTATC GGTAAATCAG AAGAAACTGT 14580

TCTACATGAA CATTATAGTG TTATAAGAAT TACATACTTG ATTGGGGATG ATGATGTTGT 14640

TTTAGTTTCC AAAATTATAC CTACAATCAC TCCGAATTGG TCTAGAATAC TTTATCTATA 14700

TAAATTATAT TGGAAAGATG TAAGTATAAT ATCACTCAAA ACTTCTAATC CTGCATCAAC 14760

AGAATTATAT CTAATTTCGA AAGATGCATA TTGTACTATA ATGGAACCTA GTGAAATTGT 14820tttat caaaa cttaaaagat tgtcactctt ggaagaaaat aatctattaa aatggatcat 14s»0tttatcaaag aagaggaata atgaatggtt acatcatgaa atcaaagaag gagaaagaga 14940ttatggaatc atgagaccat atcatatggc actacaaatc tttggatttc aaatcaattt 15000aaatcatctg gcgaaagaat ttttatcaac cccagatctg actaatatca acaatataat 15060ccaaagtttt cagcgaacaa taaaggatgt tttatttgaa tggattaata taactcatga 15120tgataagaga cataaattag gcggaagata taacatattc ccactgaaaa ataagggaaa 15130gttaagactg ctatcgagaa gactagtatt aagttggatt tcattatcat tatcgactcg 15240attacttaca ggtcgctttc ctgatgaaaa atttgaacat agagcacac-a ctggatatgt 15300atcattagct gatactgatt tagaatcatt aaagttattg tcgaaaaaca tcattaagaa 15350ttacagagag tgtataggat caatatcata ttggtttcta accaaagaag ttaaaatact 15420tatgaaattg atcggtggtg ctaaattatt aggaattccc agacaatata aagaacccga 154s0agaccagtta ttagaaaact acaatcaaca tgatgaattt gatat cgatt aaaacataaa 15540tacaatgaag atatatccta acctttatct ttaagcctag gaatagacaa aaagtaagaa 15600aaacatgtaa tatatatata ccaaacagag ttcttctctt gtttggttat agtgagtcgt 15650attacaatc 15669

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 2:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 31 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

AATACGACTC ACTATAACCA AACAAGAGAA C 31

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 3:(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 24 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 3:CCAAGTACTA TGAGATGCTT CATT 24

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 4:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 31 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 4:CCCTATAATT TCAACATGTT GAGCCTATTT G 31

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 5:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 31 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 5:

GATTAAAATG TTGGTCGACT TAGTTGCTTC C 31

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 6:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 38 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 6:CCATAGAGAG TCCATGGAAA GCGACGCTAA AAACTATC 38

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 7:(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 37 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 7:CGGTGTCGTT TCTTTGTCGA CTCATTGGCA ATTGTTG 37

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 8:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 42 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 8:

GCAAAGCGTG CCCGGGCCAT GGACACTGAA TCTAACAATG GC 42

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 9:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 28 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico20 (C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 9:GAAATTCCTT AATCGATTCT CTAGATTC 28

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 10:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 30 pares de base(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 10:

CCCATCAACT GTAACATACG TAAGAAAGAC 30

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 11:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 29 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 11:GGTTAGGATA TGTCGACATT GTATTATG 29

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 12:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 43 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 12:GGGGTTATGC TACTGCAGGC TTTTTTTCTC CCTTAGCCAT CCG 43

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 13:(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 35 pares de base(B) TIPO: ácido nucleico(C) FILAMENTOS: único(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 13:

CTCCATTCTA GANTTATAAA AATTATAGAG TTCCC 35

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 14:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 15660 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 14:

taatacgact cactataacc aaacaagaga agaaacttgt ctgggaatat aaatttaact 60ttaaattaac ttaggattaa agacattgac tagaaggtca agaaaaggga actctataat 120ttcaaaaatg ttgagcctat ttgatacatt taatgcacgt agg caagaaa acataacaaa 130atcagccggt ggagctatca ttcctggaca gaaaaatact gtctctatat tcgcccttgg 240accgacaata actgatgata atgagaaaat gacattagct cttctatttc tatctcattc 300actagataat gagaaacaac atgcacaaag ggcagggttc ttggtgtctt tattgtcaat 3s0ggcttatgcc aatccagagc tctac ctaac aacaaatgga agtaatgcag atgtcaagta 420tgtcatatac atgattgaga aagatctaaa acggcaaaag tatggaggat ttgtggttaa 480gacgagagag atgatatatg aaaagacaac tgattggata tttggaagtg acctggatta 540tgatcaggaa actatgttgc agaacggcag gaacaattca acaattgaag accttgtcca 600cacatttggg tatccatcat gtttaggagc tcttataata cagatctgga tagttctggt 660caaagctatc actagtatct cagggttaag aaaaggcttt ttcacccgat tggaagcttt 720cagacaagat ggaacagtgc aggcagggct g gtattgag c ggtgacacag tggatcagat 780tgggtcaatc atgcggtctc aacagag ctt ggtaactctt atggttgaaa cattaataac 840aatgaatacc ag cagaaatg acctcacaac catagaaaag aatatacaaa ttgttggcaa 900ctacataaga gatgcaggtc tcgcttcatt cttcaataca atcagatatg gaattgagac 960cagaatggca gctttgactc tatccactct cagaccagat atcaatagat taaaagcttt 1020gatggaactg tatttatcaa agggaccacg cgctcctttc atctgtatcc tcagagatcc 1080tatacatggt gagttcgcac caggcaacta tcctgccata tggagctatg caatgggggt 1140ggcagttgta caaaatagag ccatgcaaca gtatgtgacg ggaagatcat atctagacat 1200tgatatgttc cagctaggac aag c agtagc acgtgatgcc gaagctcaaa tgag ct caac 1260ACTGGAAGAT GAACTTGGAG TGACACACGA ATCTAAAGAA AGCTTGAAGA GACATATAAG 1320

GAACATAAAC AGTTCAGAGA CATCTTTCCA CAAACCGACA GGTGGATCAG CCATAGAGAT 1330

GGCAATAGAT GAAGAGCCAG AACAATTCGA ACATAGAGCA GATCAAGAAC AAAATGGAGA 1440

ACCTCAATCA TCCATAATTC AATATGCCTG GGCAGAAGGA AATAGAAGCG ATGATCAGAC 1500

TGAGCAAGCT ACAGAATCTG ACAATATCAA GACCGAACAA CAAAACATCA GAGACAGACT 1560

AAACAAGAGA CTCAACGACA AGAAGAAACA AAGCAGTCAA CCACCCACTA ATCCCACAAA 1620

CAGAACAAAC CAGGACGAAA TAGATGATCT GTTTAACGCA TTTGGAAGCA ACTAATCGAA 1530

TCAACATTTT AATCTAAATC ΑΑΤΑΑΤΑΑΑΤ AAGAAAAACT TAGGATTAAA GAA7CCTATC 1740

ATACCGGAAT ATAGGGTGGT AAATTTAGAG TCTGCTTGAA ACTCAATCAA TAGAGAGTTG 1800

ATGGAAAGCG ATGCTAAAAA CTATCAAATC ATGGATTCTT GGGAAGAGGA ATCAAGAC-AT 1860

AAATCAACTA ATATCTCCTC GGCCCTCAAC ATCATTGAAT TCATACTCAG CACCGACCCC 1920

CAAGAAGACT TATCGGAAAA CGACACAATC AACACAAGAA CCCAGCAACT CAGTGCCACC 1980

ATCTGTCAAC CAGAAATCAA ACCAACAGAA ACAAGTGAGA AAGATAGTGG ATCAACTGAC 2040

AAAAATAGAC AGTCTGGGTC ATCACACGAA TGTACAACAG AAGCAAAAGA TAGAAATATT 2100

GATCAGGAAA CTGTACAGAG AGGACCTGGG AGAAGAAGCA GCTCAGATAG TAGAGCTGAG 2150

ACTGTGGTCT CTGGAGGAAT CCCCAGAAGC ATCACAGATT CTAAAAATGG AACCCAAAAC 2220

ACGGAGGATA TTGATCTCAA TGAAATTAGA AAGATGGATA AGGACTCTAT TGAGGGGAAA 2230

ATGCGACAAT CTGCAAATGT TCCAAGCGAG ATATCAGGAA GTGATGACAT ATTTACAACA 2340

GAACAAAGTA GAAACAGTGA TCATGGAAGA AGCCTGGAAT CTATCAGTAC ACCTGATACA 2400

AGATCAATAA GTGTTGTTAC TGCTGCAACA CCAGATGATG AAGAAGAAAT ACTAATGAAA 2450

AATAGTAGGA CAAAGAAAAG TTCTTCAACA CATCAAGAAG ATGACAAAAG AATTAAAAAA 2520

GGGGGAAAAG GGAAAGACTG GTTTAAGAAA TCAAAAGATA CCGACAACCA GATACCAACA 2530

TCAGACTACA GATCCACATC AAAAGGGCAG AAGAAAATCT CAAAGACAAC AACCACCAAC 2540

ACCGACACAA AGGGGCAAAC AGAAATACAG ACAGAATCAT CAGAAACACA ATCCTCATCA 2700

TGGAATCTCA TCATCGACAA CAACACCGAC CGGAACGAAC AGACAAGCAC AACTCCTCCA 2750

ACAACAACTT CCAGATCAAC TTATACAAAA GAATCGATCC GAACAAACTC TGAATCCAAA 2320

CCCAAGACAC AAAAGACAAA TGGAAAGGAA AGGAAGGATA CAGAAGAGAG CAATCGATTT 2330

ACAGAGAGGG CAATTACTCT ATTGCAGAAT CTTGGTGTAA TTCAATCCAC ATCAAAACTA 2S40

GATTTATATC AAGACAAACG AGTTGTATGT GTAC-CAAATG TACTAAACAA TGTAGATACT 3000

GCATCAAAGA TAGATTTCCT GGCAGGATTA GTCATAGGGG TTTCAATGGA CAACGACACA 3050

AAATTAACAC AGATACAAAA TGAAATGCTA AACCTCAAAG CAGATCTAAA GAAAATGGAC 3120

GAATCACATA GAAGATTGAT AGAAAATCAA AGAC-AACAAC TGTCATTGAT CACGTCACTA 3130

ATTTCAAATC TCAAAATTAT GACTGAGAGA GGAGGAAAGA AAGACCAAAA TGAATCCAAT 3240

GAGAGAGTAT CCATGATCAA AACAAAATTG AAAGAAGAAA AGATCAAGAA GACCAGGTTT 3300

GACCCACTTA TGGAGGCACA AGGCATTGAC AAGAATATAC CCGATCTATA TCGACATGCA 3360GGAGATACAC TAGAGAACGA TGTACAAGTT AAATCAGAGA TATTAAGTTC ATACAATGAG 3420

TCAAATGCAA CAAGACTAAT ACCCAAAAAA GTGAGCAGTA CAATGAGATC ACTAGTTGCA 3480

GTCATCAACA ACAGCAATCT CTCACAAAGC ACAAAACAAT CATACATAAA CGAACTCAAA 3540

CGTTGCAAAA ATGATGAAGA AGTATCTGAA TTAATGGACA TGTTCAATGA AGATGTCAAC 3500

AATTGCCAAT GATCCAACAA AGAAACGACA CCGAACAAAC AGACAAGAAA CAACAGTAGA 3060

TCAAAACCTG TCAACACACA CAAAATCAAG CAGAATGAAA CAACAGATAT CAATCAATAT 3720

ACAAATAAGA AAAACTTAGG ATTAAAGAAT AAATTAATCC TTGTCCAAAA TGAGTATAAC 3780

TAACTCTGCA ATATACACAT TCCCAGAATC ATCATTCTCT GAAAATC-GTC ATATAGAACC 3840

ATTACCACTC AAAGTCAATG AACAGAGGAA AGCAGTACCC CACATTAGAG TTGCCAAGAT 3900

CGGAAATCCA CCAAAACACG GATCCCGGTA TTTAGATGTC TTCTTACTCG GCTTCTTCGA 3950

GATGGAACGA ATCAAAGACA AATACGGGAG TGTGAATGAT CTCGACAGTG ACCCGAGTTA 4020

CAAAGTTTGT GGCTCTGGAT CATTACCAAT CGGATTGGCT AAGTACACTG GGAATGACCA 4080

GGAATTGTTA CAAGCCGCAA CCAAACTGGA TATAGAAGTG AGAAGAACAG TCAAAGCGAA 4140

AGAGATGGTT GTTTACACGG TACAAAATAT AAAACCAGAA CTGTACCCAT GGTCCAATAG 4200

ACTAAGAAAA GGAATGCTGT TCGATGCCAA CAAAGTTGCT CTTGCTCCTC AATGTCTTCC 4260

ACTAGATAGG AGCATAAAAT TTAGAGTAAT CTTCGTGAAT TGTACGGCAA TTGGATCAAT 4320

AACCTTGTTC AAAATTCCTA AGTCAATGGC ATCACTATCT CTACCCAACA CAATATCAAT 4380

CAATCTGCAG GTACACATAA AAACAGGGGT TCAGACTGAT TCTAAAGGC-A TAC-TTCAAAT 4440

TTTGGATGAG AAAGGCGAAA AATCACTGAA TTTCATGGTC CATCTCGGAT TGATCAAAAG 4500

AAAAGTAGGC AGAATGTACT CTGTTGAATA CTGTAAACAG AAAATCGAGA AAATGAGATT 45Õ0

GATATTTTCT TTAGGACTAG TTGGAGGAAT CAGTCTTCAT GTCAATGCAA CTGGGTCCAT 4620

ATCAAAAACA CTAGCAAGTC AGCTGGTATT CAAAAGAGAG ATTTGTTATC CTTTAATGGA 4680

TCTAAATCCG CATCTCAATC TAGTTATCTG GGCTTCATCA GTAGAGATTA CAAGAGTGGA 4740

TGCAATTTTC CAACCTTCTT TACCTGGCGA GTTCAGATAC TATCCTAATA TTATTGCAAA 4800

AGGAGTTGGG AAAATCAAAC AATGGAACTA GTAATCTCTA TTTTAGTCCG GACGTATCTA 4860

TTAAGCCGAA GCAAATAAAG GATAATCAAA AACTTAGGAC AAAAGAGGTC AATACCAACA 4920

ACTATTAGCA GTCACACTCG CAAGAATAAG AGAGAAGGGA CCAAAAAAGT CAAATAGGAG 4980

AAATCAAAAC AAAAGGTACA GAACACCAGA ACAACAAAAT CAAAACATCC AACTCACTCA 5040

AAACAAAAAT TCCAAAAGAG ACCGGCAACA CAACAAGCAC TGAACACAAT GCCAACTTCA 5100

ATACTGCTAA TTATTACAAC CATGATCATG GCATCTTTCT GCCAAATAGA TATCACAAAA 5150

CTACAGCACG TAGGTGTATT GGTCAACAGT CCCAAAGGGA TGAAGATATC ACAAAACTTT 5220

GAAACAAGAT ATCTAATTTT GAGCCTCATA CCAAAAATAG AAGACTCTAA CTCTTGTGGT 5280

GACCAACAGA TCAAGCAATA CAAGAAGTTA TTGGATAGAC TGATCATCCC TTTATATGAT 5340

GGATTAAGAT TACAGAAAGA TGTGATAGTA ACCAATCAAG AATCCAATGA AAACACTGAT 5400

CCCAGAACAA AACGATTCTT TGGAGGGGTA ATTGGAACCA TTGCTCTGGG AGTAGCAACC 5460TCAGCACAAA TTACAGCGGC AGTTGCTCTG GTTGAAGCCA AGCAGGCAAG ATCAGACATC 5520

GAAAAACTCA AAGAAGCAAT TAGGGACACA AACAAAGCAG TGCAGTCAGT TCAGAGCTCC 5 53 0

ATAGGAAATT TAATAGTAGC AATTAAATCA GTCCAGGATT ATGTTAACAA AGAAATCGTG 5 54 0

CCATCGATTG CGAGGCTAGG TTGTGAAGCA GCAGGACTTC AATTAGGAAT TGCATTAACA 57 0 0

CAGCATTACT CAGAATTAAC AAACATATTT GGTGATAACA TAGGATCGTT ACAAGAAAAA 5 75 0

GGAATAAAAT TACAAGGTAT AGCATCATTA TACCGCACAA ATATCACAGA AATATTCACA 55 2 0

ACATCAACAG TTGATAAATA TGATATCTAT GATCTGTTAT TTACAGAATC AATAAAGGTG 53 30

AGAGTTATAG ATGTTGACTT GAATGATTAC TCAATCACCC TCCAAGTCAG ACTCCCTTTA 5 94 0

TTAACTAGGC TGCTGAACAC TCAGATCTAC AAAGTAGATT CCATATCATA TAACATCCAA 5 00 0

AACAGAGA^T GGTATATCCC TCTTCCCAGC CATATCATGA CGAAAGGGGC ATTTCTAGGT 6050

GGAGCAGACG TCAAAGAATG TATAGAAGCA TTCAGCAGCT ATATATGCCC TTCTGATCCA 512 0

GGATTTGTAT TAAACCATGA AATAGAGAGC TGCTTATCAG GAAACATATC CCAATGTCCA 613 0

AGAACAACGG TCACATCAGA CATTGTTCCA AGATATGCAT TTGTCAATGC- AGGAGTGGTT 624 0

GCAAACTGTA TAACAACCAC CTGTACATGC AACGGAATTG GTAATAGAAT CAATCAACCA 6 3 00

CCTGATCAAG GAGTAAAAAT TATAACACAT AAAGAATGTA GTACAATAGG TATCAACGGA 6360

ATGCTGTTCA ATACAAATAA AGAAGGAACT CTTGCATTCT ATACACCAAA TGATATAACA 5420

CTAAACAATT CTGTTGCACT TGATCCAATT GACATATCAA TCGAGCTCAA CAAGGCCAAA 64 3 0

TCAGATCTAG AAGAATCAAA AGAATGGATA AGAAGGTCAA ATCAAAAACT AGATTCTATT 6 54 0

GGAAATTGGC ATCAATCTAG CACTACAATC ATAATTATTT TGATAATGAT CATTATATTG 66 CO

TTTATAATTA ATATAACGAT AATTACAATT GCAATTAAGT ATTACAGAAT TCAAAAGAGA 6650

AATCGAGTGG ATCAAAATGA CAAGCCATAT GTACTAACAA ACAAATAACA TATCTACAGA 6 720

TCATTAGATA TTAAAATTAT AAAAAACTTA GGAC-TAAAGT TACGCAATCC AACTCTACTC 6 7 30

ATATAATTGA GGAAGGACCC AATAGACAAA TCCAAATTCG AGATGGAATA CTGGAAGCAT 684 0

ACGAATCACG GAAAGGATGC TGGTAATGAG CTGGAGACGT CTATGGCTAC TCATGGCAAC 6900

AAGCTCACTA ATAAGATAAT ATACATATTA TGGACAATAA TCCTGGTGTT ATTATCAATA 6 96 0

GTCTTCATCA TAGTGCTAAT TAATTCCATC AAAAGTGAAA AGGCCCACGA ATCATTGCTG 702 0

CAAGACATAA ATAATGAGTT TATGGAAATT ACAGAAAAGA TCCAAATGGC ATCGGATAAT 7 03 0

ACCAATGATC TAATACAGTC AGGAGTGAAT ACAAGGCTTC TTACAATTCA GAGTCATGTC 714 0

CAGAATTACA TACCAATATC ATTGACACAA CAGATGTCAG ATCTTAGGAA ATTCATTAGT 72 00

GAAATTACAA TTAGAAATGA TAATCAAGAA GTGCTGCCAC AAAGAATAAC ACATGATGTA 72 6 0

GGTATAAAAC CTTTAAATCC AGATGATTTT TGGAGATGCA CGTCTGGTCT TCCATCTTTA 7320

ATGAAAACTC CAAAAATAAG GTTAATGCCA GGGCCGGGAT TATTAGCTAT GCCAACGACT 73 80

GTTGATGGCT GTGTTAGAAC TCCGTCTTTA GTTATAAATG ATCTGATTTA TGCTTATACC 74 40

TCAAATCTAA TTACTCGAGG TTGTCAGGAT ATAGGAAAAT CATATCAAGT CTTACAGATA 750 0

GGGATAATAA CTGTAAACTC AGACTTGGTA CCTGACTTAA ATCCTAGGAT CTCTCATACC 7560TTTAACATAA ATGACAATAG GAAGTCATGT TCTCTAGCAC TCCTAAATAT AGATGTATAT 7520

CAACTGTGTT CAACTCCCAA AGTTGATGAA AGATCAGATT ATGCATCATC AGGCATAGAA 7680

GATATTGTAC TTGATATTGT CAATTATGAT GGTTCAATCT CAACAACAAG ATTTAAGAAT 7740

AATAACATAA GCTTTGATCA ACCATATGCT GCACTATACC CATCTGTTGG ACCAGGGATA 7300

TACTACAAAG GCAAAATAAT ATTTCTCGGG TATGGAGGTC TTGAACATCC AATAAATGAG 7350

AATGTAATCT GCAACACAAC TGGGTGCCCC GGGAAAACAC AGAGAGACTG TAATCAAGCA 7520

TCTCATAGTA CTTGGTTTTC AGATAGGAGG ATGGTCAACT CCATCATTGT TGT7GACAAA 7930

GGCTTAAACT CAATTCCAAA ATTGAAAGTA TGGACGATAT CTATGCGACA AAATTACTGG 3040

GGGTCAGAAG GAAGGTTACT TCTACTAGGT AACAAGATCT ATATATATAC AAGATCTACA 100

AGTTGGCATA GCAAGTTACA ATTAGGAATA ATTGATATTA CTGATTACAG TG.-.TATAAGG 3150

ATAAAATGGA CATGGCATAA TGTGCTATCA AGACCAGGAA ACAATGAATG TCCATGGGGA 3220

CATTCATGTC CAGATGGATG TATAACAGGA GTATATACTG ATGCATATCC ACTCAATCCC 3230

ACAGGGAGCA TTGTGTCATC TGTCATATTA GACTCACAAA AATCGAGAGT GAACCCAGTC 3340

ATAACTTACT CAACAGCAAC CGAAAGAGTA AACGAGCTGG CCATCCTAAA CAGAACACTC 3400

TCAGCTGGAT ATACAACAAC AAGCTGCATT ACACACTATA ACAAAGGATA TTGTTTTCAT 3450

ATAGTAGAAA TAAATCATAA AAGCTTAAAC ACATTTCAAC CCATGTTGTT CAAAACAGAG 3520

ATTCCAAAAA GCTGCAGTTA ATCATAATTA ACCATAATAT GCATCAATCT ATCTATAATA 8580

CAAGTATATG ATAAGTAATC AGCAATCAGA CAATAGACAA AAGGGAAATA TAAAAAACTT 8540

AGGAGCAAAG CGTGCTCGGG AAATGGACAC TGAATCTAAC AATGGCACTG TATCTGACAT 3700

ACTCTATCCT GAGTGTCACC TTAACTCTCC TATCGTTAAA GGTAAAATAG CACAATTACA 8750

CACTATTATG AGTCTACCTC AGCCTTATGA TATGGATGAC GACTCAATAC TAGTTATCAC 8820

TAGACAGAAA ATAAAACTTA ATAAATTGGA TAAAAGACAA CGATCTATTA GAAGATTAAA 8330

ATTAATATTA ACTGAAAAAG TGAATGACTT AGGAAAATAC ACATTTATCA GATATCCAGA 8940

AATGTCAAAA GAAATGTTCA AATTATATAT ACCTGGTATT AACAGTAAAG TGACTGAATT 9000

ATTACTTAAA GCAGATAGAA CATATAGTCA AATGACTGAT GGATTAAGAG ATCTATGGAT 9050

TAATGTGCTA TCAAAATTAG CCTCAAAAAA TGATGGAAGC AATTATGATC TTAATGAAGA 9120

AATTAATAAT ATATCGAAAG TTCACACAAC CTATAAATCA GATAAATGGT ATAATCCATT 9180

CAAAACATGG TTTACTATCA AGTATGATAT GAGAAGATTA CAAAAAGCTC GAAATGAGAT 9240

CACTTTTAAT GTTGGGAAGG ATTATAACTT GTTAGAAGAC CAGAAGAATT TCTTATTGAT 9300

ACATCCAGAA TTGGTTTTGA TATTAGATAA ACAAAACTAT AATGGTTATC TAATTACTCC 9350

TGAATTAGTA TTGATGTATT GTGACGTAGT CGAAGGCCGA TGGAATATAA GTGCATGTGC 9420

TAAGTTAGAT CCAAAATTAC AATCTATGTA TCAGAAAGGT AATAACCTGT GGGAAGTGAT 9480

AGATAAATTG TTTCCAATTA TGGGAGAAAA GACATTTGAT GTGATATCGT TATTAGAACC 9540

ACTTGCATTA TCCTTAATTC AAACTCATGA TCCTGTTAAA CAACTAAGAG GAGC7TTTTT 9500

AAATCATGTG TTATCCGAGA TGGAATTAAT ATTTGAATCT AGAGAATCGA TTAAGGAATT 9550TCTGAGTGTA GATTACATTG ATAAAATTTT AGA7ATATTT AATAAGTCTA CAATAGATGA 972 0

AATAGCAGAG ATTTTCTCTT TTTTTAGAAC ATTTGGGCAT CCTCCATTAG AAGCTAGTAT 97 8 0

TGCAGCAGAA AAGGTTAGAA AATATATGTA TATTGGAAAA CAATTAAAAT TTGACACTAT 984 0

TAATAAATGT CATGCTATCT TCTGTACAAT.AATAATTAAC GGATATAGAG AGAGGCATGG 9 90 0

TGGACAGTGG CCTCCTGTGA CATTACCTGA TCATGCACAC GAATTCATCA TAAATGCTTA 9950

CGGTTCAAAC TCTGCGATAT CATATGAAAA TGCTGTTGAT TATTACCAGA GCTTTATAGG 10020

AATAAAATTC AATAAATTCA TAGAGCCTCA GTTAGATGAG GATTTGACAA TTTATATGAA 1008 0

AGATAAAGCA TTATCTCCAA AAAAATCAAA TTGGGACACA GTTTATCCTG CATC7AATTT 1014 0

ACTGTACCGT ACTAACGCAT CCAACGAATC ACGAAGATTA GTTGAAGTAT TTATAGCAC-A 10 2 00

TAGTAAATTT GATCCTCATC AGATATTGGA TTATGTAGAA TCTGGGGACT GGTTAGATGA 1025 0

TCCAGAATTT AATATTTCTT ATAGTCTTAA AGAAAAAGAG ATCAAACAGG AAGGTAGACT 1032 0

CTTTGCAAAA ATGACATACA AAATGAGAGC TACACAAGTT TTATCAGAGA CCCTACTTGC 1038 0

AAATAACATA GGAAAATTCT TTCAAGAAAA TGGC-ATGGTG AAGGGAGAGA TTGAATTACT 10440

TAAGAGATTA ACAACCATAT CAATATCAGG AGTTCCACGG TATAATGAAG TGTACAATAA 10500

TTCTAAAAGC CATACAGATG ACCTTAAAAC CTACAATAAA ATAAGTAATC TTAATTTC-TC .10500

TTCTAATCAG AAATCAAAGA AATTTGAATT CAAGTCAACG GATATCTACA ATGATGGATA 1062 0

CGAGACTGTG AGCTGTTTCC TAACAACAGA TCTCAAAAAA TACTGTCTTA ATTGGAGATA 10ό3 0

TGAATCAACA GCTCTATTTG GAGAAACTTG CAACCAAATA TTTGGATTAA ATAAATTGTT 10740

TAATTGGTTA CACCCTCGTC TTGAAGGAAG TACAATCTAT GTAGGTGATC CTTACTGTCC 10 800

TCCATCAGAT AAAGAACATA TATCATTAGA GGATCACCCT GATTCTGGTT TTTACGTTCA 103 50

TAACCCAAGA GGGGGTATAG AAGGATTTTG TCAAAAATTA TGGACACTCA TATCTATAAG 10 920

TGCAATACAT CTAGCAGCTG TTAGAATAGG CGTGAGGGTG ACTGCAATGG TTCAAGGAGA 10930

CAATCAAGCT ATAGCTGTAA CCACAAGAGT ACCCAACAAT TATGACTACA GAGTTAAGAA 11040

GGAGATAGTT TATAAAGATG TAGTGAGATT TTTTGATTCA TTAAGAGAAG TGATGGATGA 11100

TCTAGGTCAT GAACTTAAAT TAAATGAAAC GATTATAAGT AGCAAGATGT TCATATATAG 1115 0

CAAAAGAATC TATTATGATG GGAGAATTCT TCCTCAAGCT CTAAAAGCAT TATCTAGATG 11220

TGTCTTCTGG TCAGAGACAG TAATAGACGA AACAAGATCA GCATCTTCAA ATTTGGCAAC 112 3 0

ATCATTTGCA AAAGCAATTG AGAATGGTTA TTCACCTGTT CTAGGATATG CATGCTCAAT 11340

TTTTAAGAAT ATTCAACAAC TATATATTGC CCTTGGGATG AATATCAATC CAACTATAAC 114 00

ACAGAATATC AGAGATCAGT ATTTTAGGAA TCCAAATTGG ATGCAATATG CCTCTTTAAT 114 5 0

ACCTGCTAGT GTTGGGGGAT TCAATTACAT GGCCATGTCA AGATGTTTTG TAAGGAATAT 1152 0

TGGTGATCCA TCAGTTGCCG CATTGGCTGA TATTAAAAGA TTTATTAAGG CGAATCTATT 1158 0

AGACCGAAGT GTTCTTTATA GGATTATGAA TCAAGAACCA GGTGAGTCAT CTTTTTTGGA 1154 0

CTGGGCTTCA GATCCATATT CATGCAATTT ACCACAATCT CAAAATATAA CCACCATGAT 1170 0

ΑΑΑΑΑΑΤΑΤΑ ACAGCAAGGA ATGTATTACA AGATTCACCA AATCCATTAT TATCTGGATT 11750ATTCACAAAT ACAATGATAG AAGAAGATGA AGAATTAGCT GAGTTCCTGA TGGACAGGAA 1ΙΒ20

GGTAATTCTC CCTAGAGTTG CACATGATAT TCTAGATAAT TCTCTCACAG GAATTAGAAA 118 8 0

TGCCATAGCT GGAATGTTAG ATACGACAAA ATCACTAATT CGGGTTGGCA TAAATAGAGG 11940

AGGACTGACA TATAGTTTGT TGAGGAAAAT CAGTAATTAC GATCTAGTAC AATATGAAAC 12 000

ACTAAGTAGG ACTTTGCGAC TAATTGTAAG TGATAAAATC AAGTATGAAG ATATC-TGTTC 12 05 0

GGTAGACCTT GCCATAGCAT TGCGACAAAA GATGTGGATT CATTTATCAG GAGGAAGGAT 12120

GATAAGTGGA CTTGAAACGC CTGACCCATT AGAATTACTA TCTGGGGTAG TAATAACAGG 1218 0

ATCAGAACAT TGTAAAATAT GTTATTCTTC AGATGGCACA AACCCATATA CTTGGATGTA 12240

TTTACCCGGT AATATCAAAA TAGGATCAGC AGAAACAGGT ATATCGTCAT TAAGAGTTCC 12 3 00

TTATTTTGGA TCAGTCACTG ATGAAAGATC TGAAGCACAA TTAGGATATA TCAAGAATCT 123 5 0

TAGTAAACCT GCAAAAGCCG CAATAAGAAT AGCAATGATA TATACATGGG CATT7GGTAA 124 2 0

TGATGAGATA TCTTGGATGG AAGCCTCACA GATAGCACAA ACACGTGCAA ATTTTACACT 124 5 0

AGATAGTCTC AAAATTTTAA CACCGGTAGC TACATCAACA AATTTATCAC ACAGATTAAA 12 54 0

GGATACTGCA ACTCAGATGA AATTCTCCAG TACATCATTG ATCAGAGTCA GCAGATTCAT 12β00

AACAATGTCC AATGATAACA TGTCTATCAA AGAAGCTAAT GAAACCAAAG ATACTAATCT 126Ó0

TATTTATCAA CAAATAATGT TAACAGGATT AAGTGTTTTC GAATATTTAT TTAGATTAAA 1272 0

AGAAACCACA GGACACAACC CTATAGTTAT GCATCTGCAC ATAGAAGATG AGTGTTGTAT 127SO

TAAAGAAAGT TTTAATGATG AACATATTAA TCCAGAGTCT ACATTAGAAT TAATTCGATA 12 84 0

TCCTGAAAGT AATGAATTTA TTTATGATAA AGACCCACTC AAAGATGTGG ACTTATCAAA 12 900

ACTTATGGTT ATTAAAGACC ATTCTTACAC AATTGATATG AATTATTGGG ATGATACTGA 12 95 0

CATCATACAT GCAATTTCAA TATGTACTGC AATTACAATA GCAGATACTA TGTCACAAT7 13 02 0

AGATCGAGAT AATTTAAAAG AGATAATAGT TATTGCAAAT GATGATGATA TTAA7AGC77 13 03 0

AATCACTGAA TTTTTGACTC TTGACATACT TGTATTTCTC AAGACATTTG GTC-GATTATT 1314 0

AGTAAATCAA TTTGCATACA CTCTTTATAG TCTAAAAATA GAAGGTAGGG ATC7CATTTG 13 2 00

GGATTATATA ATGAGAACAC TGAGAGATAC TTCCCATTCA ATATTAAAAG TATTATCTAA 1325 0

TGCATTATCT CATCCTAAAG TATTCAAGAG GTTCTGGGAT TGTGGAGTTT TAAACCCTAT 1332 0

TTATGGTCCT AATACTGCTA GTCAAGACCA GATAAAACTT GCCCTATCTA TATGTGAATA 13380

TTCACTAGAT CTATTTATGA GAGAATGGTT GAATGGTGTA TCACTTGAAA TATACATTTG 1344 0

TGACAGCGAT ATGGAAGTTG CAAATGATAG GAAACAAGCC TTTATTTCTA GACACCTTTC 13 500

ATTTGTTTGT TGTTTAGCAG AAATTGCATC TTTCGGACCT AACCTGTTAA ACTTAACATA 13 55 0

CTTGGAGAGA CTTGATCTAT TGAAACAATA TCTTGAATTA AATATTAAAG AAGACCCTAC 13 520

TCTTAAATAT GTACAAATAT CTGGATTATT AATTAAATCG TTCCCATCAA CTGTAACATA 13 5 30

CGTAAGAAAG ACTGCAATCA AATATCTAAG GATTCGCGGT ATTAGTCCAC CTGAGGTAAT 13 74 0

TGATGATTGG GATCCGGTAG AAGATGAAAA TATGCTGGAT AACATTGTCA AAACTATAAA 13 800

TGATAACTGT AATAAAGATA ATAAAGGGAA TAAAATTAAC AATTTCTGGG GACTAGCACT 13 85 0TAAGAACTAT CAAGTCCTTA AAATCAGATC TATAACAAGT GATTCTGATG ATAATGATAG 13S20

ACTAGATGCT AATACAAGTG GTTTGACACT TCCTCAAGGA GGGAATTATC TATCGCATCA 13 93 0

ATTGAGATTA TTCGGAATCA ACAGCACTAG TTGTCTGAAA GCTCTTGAGT TATCACAAAT 14 04 0

TTTAATGAAG GAAGTCAATA AAGACAAGGA CAGGCTCTTC CTGGGAGAAG GAGCAGGAGC 14ICO

TATGCTAGCA TGTTATGATG CCACATTAGG ACCTGCAGTT AATTATTATA ATTCAGGTTT 1415 0

GAATATAACA GATGTAATTG GTCAACGAGA ATTGAAAATA TTTCCTTCAG AGGTATCATT 1422 0

AGTAGGTAAA AAATTAGGAA ATGTGACACA GATTCTTAAC AGGGTAAAAG TACTGTTCAA 142 3 0

TGGGAATCCT AATTCAACAT GGATAGGAAA TATGGAATGT GAGAGCTTAA TATGGAGTGA 14 34 0

ATTAAATGAT AAGTCCATTG GATTAGTACA TTGTGATATG GAAGGAGCTA TCGGTAAATC 144 00

AGAAGAAACT GTTCTACATG AACATTATAG TGTTATAAGA ATTACATACT TGATTGGGC-A 144δ0

TGATGATGTT GTTTTAGTTT CCAAAATTAT ACCTACAATC ACTCCGAATT GGTCTAGAAT 14 52 0

ACTTTATCTA ΤΑΤΑΑΑΤΤΑΤ ATTGGAAAGA TGTAAGTATA ATATCACTCA AAACTTCTAA 14 53 0

TCCTGCATCA ACAGAATTAT ATCTAATTTC GAAAGATGCA TATTGTACTA TAATGGAACC 14 54 0

TAGTGAAATT GTTTTATCAA AACTTAAAAG ATTGTCACTC TTGGAAGAAA ATAATCTATT 14 7 00

AAAATGGATC ATTTTATCAA AGAAGAGGAA TAATGAATGG TTACATCATG AAATCAAAGA 1475 0AGGAGAAAGA GATTATGGAA TCATGAGACC ATATCATATG GCACTACAAA TCTTTGGATT 14 32 0

TCAAATCAAT TTAAATCATC TGGCGAAAGA ATTTTTATCA ACCCCAGATC TGACTAATAT 148 3 0

CAACAATATA ATCCAAAGTT TTCAGCGAAC AATAAAGGAT GTTTTATTTG AATGGATTAA 14 94 0

TATAACTCAT GATGATAAGA GACATAAATT AGGCGGAAGA TATAACATAT TCCCACTGAA 15000

AAATAAGGGA AAGTTAAGAC TGCTATCGAG AAGACTAGTA TTAAGTTGGA TTTCATTATC 1505 0

ATTATCGACT CGATTACTTA CAGGTCGCTT TCCTGATGAA AAATTTGAAC ATAGAGCACA 1512 0

GACTGGATAT GTATCATTAG CTGATACTGA TTTAGAATCA TTAAAGTTAT TGTCGAAAAA 1518 0

CATCATTAAG AATTACAGAG AGTGTATAGG ATCAATATCA TATTGGTTTC TAACCAAAGA 1524 0

AGTTAAAATA CTTATGAAAT TGATCGGTGG TGCTAAATTA TTAGGAATTC CCAGACAATA 153 00

TAAAGAACCC GAAGACCAGT TATTAGAAAA CTACAATCAA CATGATGAAT TTGATATCGA 153 50

TTAAAACATA AATACAATGA AGATATATCC TAACCTTTAT CTTTAAGCCT AGGAATAGAC 154 2 0

AAAAAGTAAG AAAAACATGT AATATATATA TACCAAACAG AGTTCTTCTC TTGTTTGGTG 154 8 0GGTCGGCATG GCATCTCCAC CTCCTCGCGG TCCGGACCTG GGCATCCGAA GGAGGACGCA 15 54 0

CGTCCACTCG GATGGCTAAG GGAGAGCCTG CAGTAGCATA ACCCCTTGGG GCCTCTAAAC 155 00GGGTCTTGAG GGGTTTTTTG CTGAAAGGAG GAACTATATA CGCGTCGACG GGCCCCGCGC 1556 0(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 15:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 15666 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 15:TAATACGACT CACTATAGGA CCAAACAAGA GAnGAAACTT GTCTGGGAAT ATAAATTTAA SO

CTTTAAATTA ACTTAGGATT AAAGACATTG ACTAGAAGGT CAAGAAAAGG GAACTCTATA 12 0

ATTTCAAAAA TGTTGAGCCT ATTTGATACA TTTAATGCAC GTAGGCAAGA AAACATAACA 130

AAATCAGCCG GTGGAGCTAT CATTCCTGGA CAGAAAAATA CTGTCTCTAT ATTCGCCCTT 24 0

GGACCGACAA TAACTGATGA TAATGAGAAA ATGACATTAG CTCTTCTATT TCTATCTCAT 3 00

TCACTAGATA ATGAGAAACA ACATGCACAA AGGGCAGGGT TCTTGGTGTC TTTATTGTCA 360

ATGGCTTATG CCAATCCAGA GCTCTACCTA ACAACAAATG GAAGTAATGC AGATGTCAAG 420

TATGTCATAT ACATGATTGA GAAAGATCTA AAACGGCAAA AGTATGGAGG ATTTGTGGTT 430

AAGACGAGAG AGATGATATA TGAAAAGACA ACTGATTGGA TATTTGGAAG TGACCTGGAT 54 0

TATGATCAGG AAACTATGTT GCAGAACGGC AGGAACAATT CAACAATTGA AGACCTTGTC 6 00

CACACATTTG GGTATCCATC ATGTTTAGGA GCTCTTATAA TACAGATCTG GATAGTTCTG 5 50

GTCAAAGCTA TCACTAGTAT CTCAGGGTTA AGAAAAGGCT TTTTCACCCG ATTGGAAGCT 7 20

TTCAGACAAG ATGGAACAGT GCAGGCAGGG CTGGTATTGA GCGGTGACAC AGTGC-ATCAG 780

ATTGGGTCAA TCATGCGGTC TCAACAGAGC TTGGTAACTC TTATGGTTGA AACATTAATA 84 0

ACAATGAATA CCAGCAGAAA TGACCTCACA ACCATAGAAA AGAATATACA AATTC-TTGGC 900

AACTACATAA GAGATGCAGG TCTCGCTTCA TTCTTCAATA CAATCAGATA TGGAATTGAG 95 0

ACCAGAATGG CAGCTTTGAC TCTATCCACT CTCAGACCAG ATATCAATAG ATTAAAAGCT 102 0

TTGATGGAAC TGTATTTATC AAAGGGACCA CGCGCTCCTT TCATCTGTAT CCTCAGAGAT 103 0

CCTATACATG GTGAGTTCGC ACCAGGCAAC TATCCTGCCA TATGGAGCTA TGCAATGGGG 114 0

GTGGCAGTTG TACAAAATAG AGCCATGCAA CAGTATGTGA CGGGAAGATC ATATCTAGAC 12 00

ATTGATATGT TCCAGCTAGG ACAAGCAGTA GCACGTGATG CCGAAGCTCA AATGAGCTCA 12SO

ACACTGGAAG ATGAACTTGG AGTGACACAC GAATCTAAAG AAAGCTTGAA GAGACATATA 13 2 0

AGGAACATAA ACAGTTCAGA GACATCTTTC CACAAACCGA CAGGTGGATC AGCCATAGAG 13 3 0

ATGGCAATAG ATGAAGAGCC AGAACAATTC GAACATAGAG CAGATCAAGA ACAAAATGGA 14 4 0

GAACCTCAAT CATCCATAAT TCAATATGCC TGGGCAGAAG GAAATAGAAG CGATGATCAG 15 00

ACTGAGCAAG CTACAGAATC TGACAATATC AAGACCGAAC AACAAAACAT CAGAGACAGA 15 60

CTAAACAAGA GACTCAACGA CAAGAAGAAA CAAAGCAGTC AACCACCCAC TAATCCCACA 152 0

AACAGAACAA ACCAGGACGA AATAGATGAT CTGTTTAACG CATTTGGAAG CAACTAATCG 16 8 0

AATCAACATT TTAATCTAAA TCAATAATAA ATAAGAAAAA CTTAGGATTA AAGAATCCTA 174 0

TCATACCGGA ATATAGGGTG GTAAATTTAG AGTCTGCTTG AAACTCAATC AATAGAGAGT 1800

TGATGGAAAG CGATGCTAAA AACTATCAAA TCATGGATTC TTGGGAAGAG GAATCAAGAG 18 6 0

ATAAATCAAC TAATATCTCC TCGGCCCTCA ACATCATTGA ATTCATACTC AGCACCGACC 1920CCCAAGAAGA CTTATCGGAA AACGACACAA TCAACACAAG AACCCAGCAA CTCAGTGCCA 1330

CCATCTGTCA ACCAGAAATC AAACCAACAG AAACAAGTGA GAAAGATAGT GGATCAACTG 2 04 0

ACAAAAATAG ACAGTCTGGG TCATCACACG AATGTACAAC AGAAGCAAAA GATAC-AAATA 2100

TTGATCAGGA AACTGTACAG AGAGGACCTG GGAGAAGAAG CAGCTCAGAT AGTAGAGCTG 215 0

AGACTGTGGT CTCTGGAGGA ATCCCCAGAA GCATCACAGA TTCTAAAAAT GGAACCCAAA 22 2 0

ACACGGAGGA TATTGATCTC AATGAAATTA GAAAGATGGA TAAGGACTCT ATTGAGGGGA 222 0

AAATGCGACA ATCTGCAAAT GTTCCAAGCG AGATATCAGG AAGTGATGAC ATATTTACAA 2 340

CAGAACAAAG TAGAAACAGT GATCATGGAA GAAGCCTGGA ATCTATCAGT ACACCTGAT.-. 24 0 0

CAAGATCAAT AAGTGTTGTT ACTGCTGCAA CACCAGATGA TGAAGAAGAA ATACTAATC-A 24 SO

AAAATAGTAG GACAAAGAAA AGTTCTTCAA CACATCAAGA AGATGACAAA AGAATTAAAA 2 52 0

AAGGGGC-AAA AGGGAAAGAC TGGTTTAAGA AATCAAAAGA TACCGACAAC CAGATACCAA 2 530

CATCAGACTA CAGATCCACA TCAAAAGGGC AGAAGAAAAT CTCAAAGACA ACAACCACCA 2 54 0

ACACCGACAC AAAGGGGCAA ACAGAAATAC AGACAGAATC ATCAGAAACA CAATCCTCAT 2 7 00

CATGGAATCT CATCATCGAC AACAACACCG ACCGGAACGA ACAGACAAGC ACAACTCCTC 2 750

CAACAACAAC TTCCAGATCA ACTTATACAA AAGAATCGAT CCGAACAAAC TCTGAATCCA 2=20

AACCCAAGAC ACAAAAGACA AATGGAAAGG AAAGGAAGGA TACAGAAGAG AGCAATCGAT 23S0

TTACAGAGAG GGCAATTACT CTATTGCAGA ATCTTGGTGT AATTCAATCC ACATCAAAAC 2 94 0

TAGATTTATA TCAAGACAAA CGAGTTGTAT GTGTAGCAAA TGTACTAAAC AATGTAGATA 3 00 0

CTGCATCAAA GATAGATTTC CTGGCAGGAT TAGTCATAGG GGTTTCAATG GACAACGACA 3 050

CAAAATTAAC ACAGATACAA AATGAAATGC TAAACCTCAA AGCAGATCTA AAGAAAATGG 312 0

ACGAATCACA TAGAAGATTG ATAGAAAATC AAAGAGAACA ACTGTCATTG ATCACGTCAC 3ISO

TAATTTCAAA TCTCAAAATT ATGACTGAGA GAGGAGGAAA GAAAGACCAA AATGAATCCA. 3 24 0

ATGAGAGAGT ATCCATGATC AAAACAAAAT TGAAAGAAGA AAAGATCAAG AAGACCAGC-T 3 3 00

TTGACCCACT TATGGAGGCA CAAGGCATTG ACAAGAATAT ACCCGATCTA TATCGACATG 3 3Ó0

CAGGAGATAC ACTAGAGAAC GATGTACAAG TTAAATCAGA GATATTAAGT TCATACAATG 342 0

AGTCAAATGC AACAAGACTA ATACCCAAAA AAGTGAGCAG TACAATGAGA TCACTAGTTG 34 3 0

CAGTCATCAA CAACAGCAAT CTCTCACAAA GCACAAAACA ATCATACATA AACGAACTCA 3 54 0

AACGTTGCAA AAATGATGAA GAAGTATCTG AATTAATGGA CATGTTCAAT GAAC-ATGTCA 3 600

ACAATTGCCA ATGATCCAAC AAAGAAACGA CACCGAACAA ACAGACAAGA AACAACAGTA 3650

GATCAAAACC TGTCAACACA CACAAAATCA AGCAGAATGA AACAACAGAT ATCAATCAAT 3 72 0

ATACAAATAA GAAAAACTTA GGATTAAAGA ATAAATTAAT CCTTGTCCAA AATGAGTATA 3 730

ACTAACTCTG CAATATACAC ATTCCCAGAA TCATCATTCT CTGAAAATGG TCATATAGAA 3 84 0

CCATTACCAC TCAAAGTCAA TGAACAGAGG AAAGCAGTAC CCCACATTAG AGTTGCCAAG 3 900

ATCGGAAATC CACCAAAACA CGGATCCCGG TATTTAGATG TCTTCTTACT CGGCTTCTTC 3 96 0GAGATGGAAC GAATCAAAGA CAAATACGGG AGTGTGAATG ATCTCGACAG TGACCCGAGT 4 02 0TACAAAGTTT GTGGCTCTGG ATCATTACCA ATCGGATTGG CTAAGTACAC TGGGAATGAC 4080

CAGGAATTGT TACAAGCCGC AACCAAACTG GATATAGAAG TGAGAAGAAC AGTCAAAGCG 4140

AAAGAGATGG TTGTTTACAC GGTACAAAAT ATAAAACCAG AACTGTACCC ATGGTCCAAT 4 2 00

AGACTAAGAA AAGGAATGCT GTTCGATGCC AACAAAGTTG CTCTTGCTCC TCAATGTCTT 4 260

CCACTAGATA GGAGCATAAA ATTTAGAGTA ATCTTCGTGA ATTGTACGGC AATTGGATCA 43 20

ATAACCTTGT TCAAAATTCC TAAGTCAATG GCATCACTAT CTCTACCCAA CACAATATCA 4330

ATCAATCTGC AGGTACACAT AAAAACAGGG GTTCAGACTG ATTCTAAAGG GATAC-TTCAA 44 4 0

ATTTTGGATG AGAAAGGCGA AAAATCACTG AATTTCATGG TCCATCTCGG ATTGATCAAA 4 5 00

AGAAAAGTAG GCAGAATGTA CTCTGTTGAA TACTGTAAAC AGAAAATCGA GAAAATGAGA 4560

TTGATATTTT CTTTAGGACT AGTTGGAGGA ATCAGTCTTC ATGTCAATGC AACTGGGTCC 4Ó20

ATATCAAAAA CACTAGCAAG TCAGCTGGTA TTCAAAAGAG AGATTTGTTA TCCTTTAATG 4Ó30

GATCTAAATC CGCATCTCAil TCTAGTTATC TGGGCTTCAT CAGTAGAGAT TACAAGAGTG 4 740

GATGCAATTT TCCAACCTTC TTTACCTGGC GAGTTCAGAT ACTATCCTAA TATTATTGCA 4 30 0

AAAGGAGTTG GGAAAATCAA ACAATGGAAC TAGTAATCTC TATTTTAGTC CGGACGTATC 43 50

TATTAAGCCG AAGCAAATAA AGGATAATCA AAAACTTAGG ACAAAAGAGG TCAATACCAA 4 920

CAACTATTAG CAGTCACACT CGCAAGAATA AGAGAGAAGG GACCAAAAAA GTCAAATAGG 4 98 0

AGAAATCAAA ACAAAAGGTA CAGAACACCA GAACAACAAA ATCAAAACAT CCAACTCACT 504 0

CAAAACAAAA ATTCCAAAAG AGACCGGCAA CACAACAAGC ACTGAACACA ATGCCAACTT 5100

CAATACTGCT AATTATTACA ACCATGATCA TGGCATCTTT CTGCCAAATA GATATCACAA 5160

AACTACAGCA CGTAGGTGTA TTGGTCAACA GTCCCAAAGG GATGAAGATA TCACAAAACT 5 22 0

TTGAAACAAG ATATCTAATT TTGAGCCTCA TACCAAAAAT AGAAGACTCT AACTCTTGTG 52 8 0

GTGACCAACA GATCAAGCAA TACAAGAAGT TATTGGATAG ACTGATCATC CCTTTATATG 53 4 0

ATGGATTAAG ATTACAGAAA GATGTGATAG TAACCAATCA AGAATCCAAT GAAAACACTG 54 00

ATCCCAGAAC AAAACGATTC TTTGGAGGGG TAATTGGAAC CATTGCTCTG GGAGTAGCAA 54 60

CCTCAGCACA AATTACAGCG GCAGTTGCTC TGGTTGAAGC CAAGCAGGCA AGATCAGACA 5520

TCGAAAAACT CAAAGAAGCA ATTAGGGACA CAAACAAAGC AGTGCAGTCA GTTCAGAGCT 5 5 80

CCATAGGAAA TTTAATAGTA GCAATTAAAT CAGTCCAGGA TTATGTTAAC AAAGAAATCG 5 64 0

TGCCATCGAT TGCGAGGCTA GGTTGTGAAG CAGCAGGACT TCAATTAGGA ATTGCATTAA 5700

CACAGCATTA CTCAGAATTA ACAAACATAT TTGGTGATAA CATAGGATCG TTACAAGAAA 5 760

AAGGAATAAA ATTACAAGGT ATAGCATCAT TATACCGCAC AAATATCACA GAAATATTCA 53 2 0

CAACATCAAC AGTTGATAAA TATGATATCT ATGATCTGTT ATTTACAGAA TCAATAAAGG 53 8 0

TGAGAGTTAT AGATGTTGAC TTGAATGATT ACTCAATCAC CCTCCAAGTC AGACTCCCTT 594 0

TATTAACTAG GCTGCTGAAC ACTCAGATCT ACAAAGTAGA TTCCATATCA TATAACATCC 6 000

AAAACAGAGA ATGGTATATC CCTCTTCCCA GCCATATCAT GACGAAAGGG GCATTTCTAG 606 0

GTGGAGCAGA CGTCAAAGAA TGTATAGAAG CATTCAGCAG CTATATATGC CCTTCTGATC 612 0CAGGATTTGT ATTAAACCAT GAAATAGAGA GCTGCTTATC AGGAAACATA TCCCAATGTC 513 0

CAAGAACAAC GGTCACATCA GACATTGTTC CAAGATATGC ATTTGTCAAT GGAGGAGTGG 5 24 0

TTGCAAACTG TATAACAACC ACCTGTACAT GCAACGGAAT TGGTAATAGA ATCAATCAAC 5 300

CACCTGATCA AGGAGTAAAA ATTATAACAC ATAAAGAATG TAGTACAATA GGTATCAACG 6350

GAATGCTGTT CAATACAAAT AAAGAAGGAA CTCTTGCATT CTATACACCA AATGATATAA 642 0

CACTAAACAA TTCTGTTGCA CTTGATCCAA TTGACATATC AATCGAGCTC AACAAGGCCA 5 4SO

AATCAGATCT AGAAGAATCA AAAGAATGGA TAAC-AAGGTC AAATCAAAAA CTAGATTCTA 6 54 0

TTGGAAATTG GCATCAATCT AGCACTACAA TCATAATTAT TTTGATAATG ATCATTATAT 5 5 00

TGTTTATAAT TAATATAACG ATAATTACAA TTC-CAATTAA GTATTACAGA ATTCAAAAGA 555 0

GAAATCGAGT GGATCAAAAT GACAAGCCAT ATGTACTAAC AAACAAATAA CATATCTACA 5 72 0

GATCATTAGA TATTAAAATT ATAAAAAACT TAC-GAGTAAA GTTACGCAAT CCAACTCTAC 573 0

TCATATAATT C-AGGAAGGAC CCAATAGACA AATCCAAATT CGAGATGGAA TACTGGAAGC 5 34 0

ATACCAATCA CGGAAAGGAT GCTGGTAATG AGCTGGAGAC GTCTATGGCT ACTCATGC-CA 5 900

ACAAGCTCAC TAATAAGATA ATATACATAT TATGGACAAT AATCCTGGTG TTATTATCAA 595 0

TAGTCTTCAT CATAGTGCTA ATTAATTCCA TCAAAAGTGA AAAGGCCCAC GAATCATTC-C 7 02 0

TGCAAGACAT AAATAATGAG TTTATGGAAA TTACAGAAAA GATCCAAATG GCATCGGATA 70 3 0

ATACCAATGA TCTAATACAG TCAGGAGTGA ATACAAGGCT TCTTACAATT CAGAGTCATG 714 0

TCCAGAATTA CATACCAATA TCATTGACAC AACAGATGTC AGATCTTAGG AAATTCATTA 7200

GTGAAATTAC AATTAGAAAT GATAATCAAG AAGTGCTGCC ACAAAGAATA ACACATGATG 72 5 0

TAGGTATAAA ACCTTTAAAT CCAGATGATT TTTGGAGATG CACGTCTGGT CTTCCATCTT 73 2 0

TAATGAAAAC TCCAAAAATA AGGTTAATGC CAGGGCCGGG ATTATTAGCT ATGCCAACGA 73 30

CTGTTGATGG CTGTGTTAGA ACTCCGTCTT TAGTTATAAA TGATCTGATT TATGCTTATA 74 4 0

CCTCAAATCT AATTACTCGA GGTTGTCAGG ATATAGGAAA ATCATATCAA GTCTTACAGA 7 500

TAGGGATAAT AACTGTAAAC TCAGACTTGG TACCTGACTT AAATCCTAGG ATCTCTCATA 7560

CCTTTAACAT AAATGACAAT AGGAAGTCAT GTTCTCTAGC ACTCCTAAAT ATAGATGTAT 752 0

ATCAACTGTG TTCAACTCCC AAAGTTGATG AAAGATCAGA TTATGCATCA TCAGGCATAG 75 80

AAGATATTGT ACTTGATATT GTCAATTATG ATGGTTCAAT CTCAACAACA AGATTTAAGA 774 0

ATAATAACAT AAGCTTTGAT CAACCATATG CTGCACTATA CCCATCTGTT GGACCAGGGA 7 3 00

TATACTACAA AGGCAAAATA ATATTTCTCG GGTATGGAGG TCTTGAACAT CCAATAAATG 735 0

AGAATGTAAT CTGCAACACA ACTGGGTGCC CCGGGAAAAC ACAGAGAGAC TGTAATCAAG 7 920

CATCTCATAG TACTTGGTTT TCAGATAGGA GGATGGTCAA CTCCATCATT GTTGTTGACA 7 93 0

AAGGCTTAAA CTCAATTCCA AAATTGAAAG TATGGACGAT ATCTATGCGA CAAAATTACT 8040

GGGGGTCAGA AGGAAGGTTA CTTCTACTAG GTAACAAGAT CTATATATAT ACAAGATCTA 8100

CAAGTTGGCA TAGCAAGTTA CAATTAGGAA TAATTGATAT TACTGATTAC AGTGATATAA 816 0

GGATAAAATG GACATGGCAT AATGTGCTAT CAAGACCAGG AAACAATGAA TGTCCATGGG 822 0GACATTCATG TCCAGATGGA TGTATAACAG GAGTATATAC TGATGCATAT CCACTCAATC S23 0

CCACAGGGAG CATTGTGTCA TCTGTCATAT TAGACTCACA AAAATCGAGA GTGAACCCAG 8340

TCATAACTTA CTCAACAGCA ACCGAAAGAG TAAACGAGCT GGCCATCCTA AACAGAACAC 840 0

TCTCAGCTGG ATATACAACA ACAAGCTGCA TTACACACTA TAACAAAGGA TATTGTTTTC 846 0

ATATAGTAGA AATAAATCAT AAAAGCTTAA ACACATTTCA ACCCATGTTG TTCAAAACAG 8 52 0

AGATTCCAAA AAGCTGCAGT TAATCATAAT TAACCATAAT ATGCATCAAT CTATCTATAA 853 0

TACAAGTATA TGATAAGTAA TCAGCAATCA GACAATAGAC AAAAGGGAAA TATAAAAAAC 8 54 0

TTAGGAGCAA AGCGTGCTCG GGAAATGGAC AC7GAATCTA ACAATGGCAC TGTATCTGAC 8 700

ATACTCTATC CTGAGTGTCA CCTTAACTCT CC7ATCGTTA AAGGTAAAAT AGCACAATTA 3750

CACACTATTA TGAGTCTACC TCAGCCTTAT GATATGGATG ACGACTCAAT ACTAGTTATC 8320

ACTAGACAGA AAATAAAACT TAATAAATTG GATAAAAGAC AACGATCTAT TAGAAGATTA 8 8 80

AAATTAATAT TAACTGAAAA AGTGAATGAC TTAGGAAAAT ACACATTTAT CAGATATCCA 8 94 0

GAAATGTCAA AAGAAATGTT CAAATTATAT ATACCTGGTA TTAACAGTAA AGTGACTGAA 9 00 0

TTATTACTTA AAGCAGATAG AACATATAGT CAAATGACTG ATGGATTAAG AGATCTATC-G 90S0

ATTAATGTGC TATCAAAATT AGCCTCAAAA AATGATGGAA GCAATTATGA TCTTAATGAA 912 0

GAAATTAATA ATATATCGAA AGTTCACACA ACCTATAAAT CAGATAAATG GTATAATCCA. Sl8 0

TTCAAAACAT GGTTTACTAT CAAGTATGAT ATGAGAAGAT TACAAAAAGC TCGAAATGAG 92 4 0

ATCACTTTTA ATGTTGGGAA GGATTATAAC TTGTTAGAAG ACCAGAAGAA TTTCTTATTG 93 0 0

ATACATCCAG AATTGGTTTT GATATTAGAT AAACAAAACT ATAATGGTTA TCTAATTACT 93 6 0

CCTGAATTAG TATTGATGTA TTGTGACGTA GTCGAAGGCC GATGGAATAT AAGTC-CATGT 94 2 0

GCTAAGTTAG ATCCAAAATT ACAATCTATG TATCAGAAAG GTAATAACCT GTGGGAAGTG 948 0

ATAGATAAAT TGTTTCCAAT TATGGGAGAA AAGACATTTG ATGTGATATC C-TTATTAGAA 954 0

CCACTTGCAT TATCCTTAAT TCAAACTCAT GATCCTGTTA AACAACTAAC- AGGAGCTTTT 96 00

TTAAATCATG TGTTATCCGA GATGGAATTA ATATTTGAAT CTAGAGAATC GATTAAGGAA 96 6 0

TTTCTGAGTG TAGATTACAT TGATAAAATT TTAGATATAT TTAATAAGTC TACAATAGAT 972 0

GAAATAGCAG AGATTTTCTC TTTTTTTAGA ACATTTGGGC ATCCTCCATT AGAAGCTAGT 97 3 0

ATTGCAGCAG AAAAGGTTAG AAAATATATG TATATTGGAA AACAATTAAA ATTTGACACT 984 0

ATTAATAAAT GTCATGCTAT CTTCTGTACA ATAATAATTA ACGGATATAG AGAC-AGGCAT 9 900

GGTGGACAGT GGCCTCCTGT GACATTACCT GATCATGCAC ACGAATTCAT CATAAATGCT 996 0

TACGGTTCAA ACTCTGCGAT ATCATATGAA AATGCTGTTG ATTATTACCA GAGCTTTATA 10020

GGAATAAAAT TCAATAAATT CATAGAGCCT CAGTTAGATG AGGATTTGAC AATTTATATG 1008 0

AAAGATAAAG CATTATCTCC AAAAAAATCA AATTGGGACA CAGTTTATCC TGCATCTAAT 1014 0

TTACTGTACC GTACTAACGC ATCCAACGAA TCACGAAGAT TAGTTGAAGT ATTTATAGCA 10200

GATAGTAAAT TTGATCCTCA TCAGATATTG GATTATGTAG AATCTGGGGA CTGGTTAGAT 102 6 0

GATCCAGAAT TTAATATTTC TTATAGTCTT AAAGAAAAAG AGATCAAACA GGAAGGTAGA 10320CTCTTTGCAA AAATGACATA CAAAATGAGA GCTACACAAG TTTTATCAGA GACCCTACTT 103SO

GCAAATAACA TAGGAAAATT CTTTCAAGAA AATGGGATGG TGAAGGGAGA GATTGAATTA 10440

CTTAAGAGAT TAACAACCAT ATCAATATCA GGAGTTCCAC GGTATAATGA AGTGTACAAT 10500

AATTCTAAAA GCCATACAGA TGACCTTAAA ACCTACAATA AAATAAGTAA TCTTAATTTG 10 55 0

TCTTCTAATC AGAAATCAAA GAAATTTGAA TTCAAGTCAA CGGATATCTA CAATGATGGA 105 2 0

TACGAGACTG TGAGCTGTTT CCTAACAACA GATCTCAAAA AATACTGTCT TAATTGGAGA 105SO

TATGAATCAA CAGCTCTATT TGGAGAAACT TGCAACCAAA TATTTGGATT AAATAAATTG 10 74 0

TTTAATTGGT TACACCCTCG TCTTGAAGGA AC-TACAATCT ATGTAGGTGA TCCTTACTGT 10300

CCTCCATCAG ATAAAGAACA TATATCATTA GAGGATCACC CTGATTCTGG TTTTTACGTT IOS5 0

CATAACCCAA GAGGGGGTAT AGAAGGATTT TGTCAAAAAT TATGGACACT CATATCTATA 1092 0

AGTGCAATAC ATCTAGCAGC TGTTAGAATA GGCGTGAGGG TGACTGCAAT GGTTCAAGGA 10 93 0

GACAATCAAG CTATAGCTGT AACCACAAGA GTACCCAACA ATTATGACTA CAGAGTTAAG 11040

AAGGAGATAG TTTATAAAGA TGTAGTGAGA TTTTTTGATT CATTAAGAGA AGTGATGGAT 11100

GATCTAGGTC ATGAACTTAA ATTAAATGAA ACGATTATAA GTAGCAAGAT GTTCATATAT 1115 0

AGCAAAAGAA TCTATTATGA TGGGAGAATT C7TCCTCAAG CTCTAAAAGC ATTATCTAGA 1122 0

TGTGTCTTCT GGTCAGAGAC AGTAATAGAC GAAACAAGAT CAGCATCTTC AAATTTGGCA 112 8 0

ACATCATTTG CAAAAGCAAT TGAGAATGGT TATTCACCTG TTCTAGGATA TGCATGCTCA 1134 0

ATTTTTAAGA ATATTCAACA ACTATATATT GCCCTTGGGA TGAATATCAA TCCAACTATA 114 00

ACACAGAATA TCAGAGATCA GTATTTTAGG AATCCAAATT GGATGCAATA TGCCTCTTTA 114 5 0

ATACCTGCTA GTGTTGGGGG ATTCAATTAC ATC-GCCATGT CAAGATGTTT TGTAAGGAAT 1152 0

ATTGGTGATC CATCAGTTGC CGCATTGGCT GATATTAAAA GATTTATTAA GGCGAATCTA 115 8 0

TTAGA.CCGAA GTGTTCTTTA TAGGATTATG AATCAAGAAC CAGGTGAGTC ATCTTTTTTG 1154 0

GACTGGGCTT CAGATCCATA TTCATGCAAT TTACCACAAT CTCAAAATAT AACCACCATG 117 00

ATAAAAAATA TAACAGCAAG GAATGTATTA CAAGATTCAC CAAATCCATT ATTATCTGGA 1175 0

TTATTCACAA ATACAATGAT AGAAGAAGAT G.AAGAATTAG CTGAGTTCCT GATGGACAGG 1182 0

AAGGTAATTC TCCCTAGAGT TGCACATGAT ATTCTAGATA ATTCTCTCAC AGGAATTAGA 113 8 0

AATGCCATAG CTGGAATGTT AGATACGACA AAATCACTAA TTCGGGTTGG CATAAATAGA 1194 0

GGAGGACTGA CATATAGTTT GTTGAGGAAA ATCAGTAATT ACGATCTAGT ACAATATGAA 12 00 0

ACACTAAGTA GGACTTTGCG ACTAATTGTA AGTGATAAAA TCAAGTATGA AGATATGTGT 12 05 0

TCGGTAGACC TTGCCATAGC ATTGCGACAA AAGATGTGGA TTCATTTATC AGGAGGAAGG 1212 0

ATGATAAGTG GACTTGAAAC GCCTGACCCA TTAGAATTAC TATCTGGGGT AGTAATAACA 1218 0

GGATCAGAAC ATTGTAAAAT ATGTTATTCT TCAGATGGCA CAAACCCATA TACTTGGATG 1224 0

TATTTACCCG GTAATATCAA AATAGGATCA GCAGAAACAG GTATATCGTC ATTAAGAGTT 12 3 00

CCTTATTTTG GATCAGTCAC TGATGAAAGA TCTGAAGCAC AATTAGGATA TATCAAGAAT 123 5 0CTTAGTAAAC CTGCAAAAGC CGCAATAAGA ATAGCAATGA TATATACATG GGCATTTGGT 124 2 0AATGATGAGA TATCTTGGAT GGAAGCCTCA CAGATAGCAC AAACACGTGC AAATTTTACA 124 8 0

CTAGATAGTC TCAAAATTTT AACACCGGTA GCTACATCAA CAAATTTATC ACACAGATTA 1254 0

AAGGATACTG CAACTCAGAT GAAATTCTCC AGTACATCAT TGATCAGAGT CAGCAGATTC 12600

ATAACAATGT CCAATGATAA CATGTCTATC AAAGAAGCTA ATGAAACCAA AGATACTAAT 12660

CTTATTTATC AACAAATAAT GTTAACAGGA TTAAGTGTTT TCGAATATTT ATTTAGATTA 12 72 0

AAAGAAACCA CAGGACACAA CCCTATAGTT ATGCATCTGC ACATAGAAGA TGAGTGTTGT 127 60

ATTAAAGAAA GTTTTAATGA TGAACATATT AATCCAGAGT CTACATTAGA ATTAATTCGA 12 84 0

TATCCTGAAA GTAATGAATT TATTTATGAT AAAGACCCAC TCAAAGATGT GGACTTATCA 12 900

AAACTTATGG TTATTAAAGA CCATTCTTAC ACAATTGATA TGAATTATTG GGATGATACT 12 96 0

GACATCATAC ATGCAATTTC AATATGTACT GCAATTACAA T.-.GCAGATAC TATGTCACAA 13020

TTAGATCGAG ATAATTTAAA AGAGATAATA GTTATTGCAA ATGATGATGA TATTAATAGC 13 08 0

TTAATCACTG AATTTTTGAC TCTTGACATA CTTGTATTTC TCAAGACATT TGGTGGATTA 13140

TTAGTAAATC AATTTGCATA CACTCTTTAT AGTCTAAAAA TAGAAGGTAG GGATCTCATT 132 0 0

TGGGATTATA TAATGAGAAC ACTGAGAGAT ACTTCCCATT CAATATTAAA AGTATTATCT 132 6 0

AATGCATTAT CTCATCCTAA AGTATTCAAG AGGTTCTGGG ATTGTGGAGT TTTAAACCCT 13320

ATTTATGGTC CTAATACTGC TAGTCAAGAC CAGATAAAAC TTGCCCTATC TATATGTGAA 133 8 0

TATTCACTAG ATCTATTTAT GAGAGAATGG TTGAATGGTG TATCACTTGA AATATACATT 1344 0

TGTGACAGCG ATATGGAAGT TGCAAATGAT AGGAAACAAG CCTTTATTTC TAGACACCTT 13 500

TCATTTGTTT GTTGTTTAGC AGAAATTGCA TCTTTCGGAC CTAACCTGTT AAACTTAACA 13 56 0

TACTTGGAGA GACTTGATCT ATTGAAACAA TATCTTGAAT TAAATATTAA AGAAGACCCT 13 62 0

ACTCTTAAAT ATGTACAAAT ATCTGGATTA TTAATTAAAT CGTTCCCATC AACTGTAACA 13680

TACGTAAGAA AGACTGCAAT CAAATATCTA AGGATTCGCG GTATTAGTCC ACCTGAGGTA 1374 0

ATTGATGATT GGGATCCGGT AGAAGATGAA AATATGCTGG ATAACATTGT CAAAACTATA 13 8 00

AATGATAACT GTAATAAAGA TAATAAAGGG AATAAAATTA ACAATTTCTG GGGACTAGCA 1386 0

CTTAAGAACT ATCAAGTCCT TAAAATCAGA TCTATAACAA GTGATTCTGA TGATAATGAT 13 92 0

AGACTAGATG CTAATACAAG TGGTTTGACA CTTCCTCAAG GAGGGAATTA TCTATCGCAT 13980

CAATTGAGAT TATTCGGAAT CAACAGCACT AGTTGTCTGA AAGCTCTTGA GTTATCACAA 1404 0

ATTTTAATGA AGGAAGTCAA TAAAGACAAG GACAGGCTCT TCCTGGGAGA AGGAGCAGGA 14100

GCTATGCTAG CATGTTATGA TGCCACATTA GGACCTGCAG TTAATTATTA TAATTCAGGT 14160

TTGAATATAA CAGATGTAAT TGGTCAACGA GAATTGAAAA TATTTCCTTC AGAGGTATCA 14220

TTAGTAGGTA AAAAATTAGG AAATGTGACA CAGATTCTTA ACAGGGTAAA AGTACTGTTC 142 8 0

AATGGGAATC CTAATTCAAC ATGGATAGGA AATATGGAAT GTGAGAGCTT AATATGGAGT 1434 0

GAATTAAATG ATAAGTCCAT TGGATTAGTA CATTGTGATA TGGAAGGAGC TATCGGTAAA 144 00

TCAGAAGAAA CTGTTCTACA TGAACATTAT AGTGTTATAA GAATTACATA CTTGATTGGG 14460

GATGATGATG TTGTTTTAGT TTCCAAAATT ATACCTACAA TCACTCCGAA TTGGTCTAGA 1452 0ATACTTTATC TATATAAATT ATATTGGAAA GATGTAAGTA TAATATCACT CAAAACTTC T 14530AATCCTGCAT CAACAGAATT ATATCTAATT TCGAAAGATG CATATTGTAC TATAATGGAA 14540CCTAGTGAAA TTGTTTTATC AAAACTTAAA AGATTGTCAC TCTTGGAAGA AAATAATCTA 14700TTAAAATGGA TCATTTTATC AAAGAAGAGG AATAATGAAT GGTTACATCA TGAAATCAAA 147S0GAAGGAGAAA GAGATTATGG AATCATGAGA C CATAT CATA TGGCACTACA AATCTTTGGA 14320TTTCAAATCA ATTTAAATCA TCTGGCGAAA GAATTTTTAT CAACCCCAGA TCTGACTAAT 14880AT CAACAATA TAATCCAAAG TTTTCAGCGA ACAATAAAGG ATGTTTTATT TGAATGGATT 14940AATATAACTC ATGATGATAA GAGACATAAA TTAGGCGGAA GATATAACAT ATTCCCACTG 15000AAAAAT AAGG GAAAGTTAAG ACTGCTATCG AC-AAGACTAG TATTAAGTTG GATTTCATTA 15050TCATTATCGA CTCGATTACT TACAGGTCGC TTTCCTGATG AAAAATTTGA ACATAGAGCA 15120CAGACTGGAT ATGTATCATT AGCTGATACT GA7TTAGAAT CATTAAAGTT Ai ToιCGAaA 15180AACATCATTA AGAATTACAG AGAGTGTATA GGATCAATAT CATATTGGTT TCTAACCAAA 15240GAAGTTAAAA TACTTATGAA ATTGATCGGT GGTGCTAAAT TATTAGGAAT TCCCAGACAA 15300TATAAAGAAC CCGAAGACCA GTTATTAGAA AACTACAATC AACATGATGA ATTTG ATAT C 15350GATTAAAACA TAAATACAAT GAAGATATAT CCTAACCTTT ATCTTTAAGC CTAGG AAT AG 15420ACAAAAAG TA AGAAAAACAT G T AAT ATAT A TATACCAAAC AGAGTTCTTC TCTTGTTTGG 15430TGGGTCGGCA TGGCATCTCC ACCTCCTCGC GGTCCGGACC TGGGCATCCG AAGGAGGACG 15540CACGTCCACT CGGATGGCTA AGGGAGAGCC TGCAGTAGCA TAACCCCTTG GGGCCTCTAA 15500ACGGGTCTTG AGGGGTTTTT TGCTGAAAGG AGGAACTATA TACGCGTCGA CGGGCCCCGC 15550

GCTCAC

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 16:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 28 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 16:GGATTTGCGC GCAATTTAAA TCATCTGG 28

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 17:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 70 pares de base(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 17:

CCCAGGTCGG ACCGCGAGGA GGTGGAGATG CCATGCCAGC CCACCAAAAC AAGAGAAGAA ÓO

CTCTGTTTGG 70

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 18:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 45 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 18:

GGCCCGTCGA CGCGTAATAC GACTCACTAT AGGACCAAAC AAGAG 45

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 19:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 16 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 19:CGGCATCACG TGCTAC 16

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 20:(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 6843 pares de base(B) TIPO: ácido nucleico(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 20:

ATGTTGAGCC TATTTGATAC ATTTAATGCA CGTAGGCAAG AAAACATAAC AAAATCAGCC 5 0

GGTGGAGCTA TCATTCCTGG ACAGAAAAAT ACTGTCTCTA TATTCGCCCT TGGACCGACA 12 0

ATAACTGATG ATAATGAGAA AATGACATTA GCTCTTCTAT TTCTATCTCA TTCACTAGAT 130

AATGAGAAAC AACATGCACA AAGGGCAGGG TTCTTGGTGT CTTTATTGTC AATGGCTTAT 24 0

GCCAATCCAG AGCTCTACCT AACAACAAAT GGA^GTAATG CAGATGTCAA GTATGTCATA 3 00

TACATGATTG AGAAAGATCT AAAACGGCAA AAGTATGGAG GATTTGTGGT TAAGACGAGA 3 50

GAGATGATAT ATGAAAAGAC AACTGATTGG ATATTTGGAA GTGACCTGGA TTATGATC^G 420

GAAACTATGT TGCAGAACGG CAGGAACAAT TCAACAATTG AAGACCTTGT CCACACATTT 4 30

GGGTATCCAT CATGTTTAGG AGCTCTTATA ATACAGATCT GGATAGTTCT GGTCAAAGCT 540ATCACTAGTA TCTCAGGGTT AAGAAAAGGC TTTTTCACCC GATTGGAAGC TTTCAGACAA £00

GATGGAACAG TGCAGGCAGG GCTGGTATTG AGCGGTGACA CAGTGGATCA GATTGGGTCA 6SO

ATCATGCGGT CTCAACAGAG CTTGGTAACT CTTATGGTTG AAACATTAAT AACAATGAAT 72 0

ACCAGCAGAA ATGACCTCAC AACCATAGAA AAGAATATAC AAATTGTTGG CAACTACATA 78 0

AGAGATGCAG GTCTCGCTTC ATTCTTCAAT ACAATCAGAT ATGGAATTGA GACCAGAATG 34 0

GCAGCTTTGA CTCTATCCAC TCTCAGACCA GA7ATCAATA GATTAAAAGC TTTGATGGAA 90 0

CTGTATTTAT CAAAGGGACC ACGCGCTCCT TTCATCTGTA TCCTCAGAGA TCCTATACAT 950

GGTGAGTTCG CACCAGGCAA CTATCCTGCC ATATGGAGCT ATGCAATGGG GGTGGCAGTT 1020

GTACAAAATA GAGCCATGCA ACAGTATGTG ACGGGAAGAT CATATCTAGA CATTC-ATATG 103 0

TTCCAGCTAG GACAAGCAGT AGCACGTGAT GCCGAAGCTC AAATGAGCTC AACACTGGAA 1140

GATGAACTTG GAGTGACACA CGAATCTAAA GAAAGCTTGA AGAGACATAT AAGGAACATA 12 00

AACAGTTCAG AGACATCTTT CCACAAACCG ACAGGTGGAT CAGCCATAGA GATC-GCAATA 12 6 0

GATGAAGAGC CAGAACAATT CGAACATAGA GCAGATCAAG AACAAAATGG AGAACCTCAA 13 20

TCATCCATAA TTCAATATGC CTGGGCAGAA GGAAATAGAA GCGATGATCA GACTGAGCAA 13 3 0

GCTACAGAAT CTGACAATAT CAAGACCGAA CAACAAAACA TCAGAGACAG ACTAAACAAG 14 4 0

AGACTCAACG ACAAGAAGAA ACAAAGCAGT CAACCACCCA CTAATCCCAC AAACAGAACA 1500

AACCAGGACG AAATAGATGA TCTGTTTAAC GCATTTGGAA GCAACTAAGT CGACGATCCG 155 0

GCTGCTAACA AAGCCCGAAA GGAAGCTGAG TTGGCTGCTG CCACCGCTGA GCAATAACTA 152 0

GCATAACCCC TTGGGGCCTC TAAACGGGTC TTGAGGGGTT TTTTGCTGAA AGGAGGAACT 153 0

ATATCCGGAT CGAGATCAAT TCTGTGAGCG TATGGCAAAC GAAGGAAAAA TAGTTATAC-T 174 0

AGCCGCACTC GATGGGACAT TTCAACGTAA ACCGTTTAAT AATATTTTGA ATCTTATTCC 19 00

ATTATCTGAA ATGGTGGTAA AACTAACTGC TGTGTGTATG AAATGCTTTA AGGAGGCTTC 13 50

CTTTTCTAAA CGATTGGGTG AGGAAACCGA GATAGAAATA ATAGGAGGTA ATGATATGTA 192 0

TCAATCGGTG TGTAGAAAGT GTTACATCGA CTCATAATAT TATATTTTTT ATCTAAAAAA 1930

CTAAAAATAA ACATTGATTA AATTTTAATA TAATACTTAA AAATGGATGT TGTGTCGTTA 2 04 0

GATAAACCGT TTATGTATTT TGAGGAAATT GATAATGAGT TAGATTACGA ACCAGAAAGT 2100

GCAAATGAGG TCGCAAAAAA ACTGCCGTAT CAAGGACAGT TAAAACTATT ACTAGGAGAA 215 0

TTATTTTTTC TTAGTAAGTT ACAGCGACAC GGTATATTAG ATGGTGCCAC CGTAGTGTAT 222 0

ATAGGATCTG CTCCCGGTAC ACATATACGT TATTTGAGAG ATCATTTCTA TAATTTAGGA 22 8 0

GTGATCATCA AATGGATGCT AATTGACGGC CGCCATCATG ATCCTATTTT AAATGGATTG 2340

CGTGATGTGA CTCTAGTGAC TCGGTTCGTT GATGAGGAAT ATCTACGATC CATCAAAAAA 2 4 00

CAACTGCATC CTTCTAAGAT TATTTTAATT TCTGATGTGA GATCCAAACG AGGAGGAAAT 245 0

GAACCTAGTA CGGCGGATTT ACTAAGTAAT TACGCTCTAC AAAATGTCAT GATTAGTATT 252 0

TTAAACCCCG TGGCGTCTAG TCTTAAATGG AGATGCCCGT TTCCAGATCA ATGGATCAAG 2 58 0

GACTTTTATA TCCCACACGG TAATAAAATG TTACAACCTT TTGCTCCTTC ATATTCAGGG 2 54 0CCGTCGTTTT ACAACGTCGT GACTGGGAAA ACCCTGGCGT TACCCAACTT AATCGCCTTG 2700

CAGCACATCC CCCTTTCGCC AGCTGGCGTA ATAGCGAAGA GGCCCGCACC GATCGCCCTT 27 5 0

CCCAACAGTT GCGCAGCCTG AATGGCGAAT GGCGCGACGC GCCCTGTAGC GGCGCATTAA 2 520

GCGCGGCGGG TGTGGTGGTT ACGCGCAGCG TGACCGCTAC ACTTGCCAGC GCCCTAGCGC 2 38 0

CCGCTCCTTT CGCTTTCTTC CCTTCCTTTC TCGCCACGTT CGCCGGCTTT CCCCGTCAAG 2 94 0

CTCTAAATCG GGGGCTCCCT TTAGGGTTCC GATTTAGTGC TTTACGGCAC CTCGACCCCA 3000

AAAAACTTGA TTAGGGTGAT GGTTCACGTA GTGGGCCATC GCCCTGATAG ACGGTTTTTC 3 06 0

GCCCTTTGAC GTTGGAGTCC ACGTTCTTTA ATAGTGGACT CTTGTTCCAA ACTGGAACAA 312 0

CACTCAACCC TATCTCGGTC TATTCTTTTG ATTTATAAGG GATTTTGCCG ATTTCGGCCT 313 0

ATTGGTTAAA AAATGAGCTG ATTTAACAAA AATTTAACGC GAATTTTAAC AAAATATTAA 3 24 0

CGTTTACAAT TTCCCAGGTG GCACTTTTCG GGGAAATGTG CGCGGAACCC CTATTTGTTT 3 3 00

ATTTTTCTAA ATACATTCAA ATATGTATCC GCTCATGAGA CAATAACCCT GATAAATGCT 3 360

TCAATAATAT TGAAAAAGGA AGAGTATGAG TATTCAACAT TTCCGTGTCG CCCTTATTCC 34 2 0

CTTTTTTGCG GCATTTTGCC TTCCTGTTTT TGCTCACCCA GAAACGCTGG TGAAAGTAAA 3430

AGATGCTGAA GATCAGTTGG GTGCACGAGT GGGTTACATC GAACTGGATC TCAACAGCGG 3 54 0

TAAGATCCTT GAGAGTTTTC GCCCCGAAGA ACGTTTTCCA ATGATGAGCA CTTTTAAAGT 3 500

TCTGCTATGT GGCGCGGTAT TATCCCGTAT TGACGCCGGG CAAGAGCAAC TCGGTCGCCG 3 55 0

CATACACTAT TCTCAGAATG ACTTGGTTGA GTACTCACCA GTCACAGAAA AGCATCTTAC 3 72 0

GGATGGCATG ACAGTAAGAG AATTATGCAG TGCTGCCATA ACCATGAGTG ATAACACTGC 3 73 0

GGCCAACTTA CTTCTGACAA CGATCGGAGG ACCGAAGGAG CTAACCGCTT TTTTGCACAA 3 34 0

CATGGGGGAT CATGTAACTC GCCTTGATCG TTGGGAACCG GAGCTGAATG AAGCCATACC 3 900

AAACGACGAG CGTGACACCA CGATGCCTGT AGCAATGGCA ACAACGTTGC GCAAACTATT 3 950

AACTGGCGAA CTACTTACTC TAGCTTCCCG GCAACAATTA ATAGACTGGA TGGAGGCGGA 4 020

TAAAGTTGCA GGACCACTTC TGCGCTCGGC CCTTCCGGCT GGCTGGTTTA TTGCTGATAA 4 080

ATCTGGAGCC GGTGAGCGTG GGTCTCGCGG TATCATTGCA GCACTGGGGC CAGATGGTAA 4140

GCCCTCCCGT ATCGTAGTTA TCTACACGAC GGGGAGTCAG GCAACTATGG ATGAACGAAA 4200

TAGACAGATC GCTGAGATAG GTGCCTCACT GATTAAGCAT TGGTAACTGT CAGACCAAGT 4250

TTACTCATAT ATACTTTAGA TTGATTTAAA ACTTCATTTT TAATTTAAAA GGATCTAGGT 4 32 0

GAAGATCCTT TTTGATAATC TCATGACCAA AATCCCTTAA CGTGAGTTTT CGTTCCACTG 43 30

AGCGTCAGAC CCCGTAGAAA AGATCAAAGG ATCTTCTTGA GATCCTTTTT TTCTGCGCGT 444 0

AATCTGCTGC TTGCAAACAA AAAAACCACC GCTACCAGCG GTGGTTTGTT TGCCGGATCA 4 500

AGAGCTACCA ACTCTTTTTC CGAAGGTAAC TGGCTTCAGC AGAGCGCAGA TACCAAATAC 4 560

TGTCCTTCTA GTGTAGCCGT AGTTAGGCCA CCACTTCAAG AACTCTGTAG CACCGCCTAC 4620

ATACCTCGCT CTGCTAATCC TGTTACCAGT GGCTGCTGCC AGTGGCGATA AGTCGTGTCT 4 6 30

TACCGGGTTG GACTCAAGAC GATAGTTACC GGATAAGGCG CAGCGGTCGG GCTGAACGGG 4 74 0GGGTTCGTGC ACACAGCCCA GCTTGGAGCG AACGACCTAC ACCGAACTGA GATACCTACA 4'3C0

GCGTGAGCTA TGAGAAAGCG CCACGCTTCC CGAAGGGAGA AAGGCGGACA GGTATCCGGT 4 350

AAGCGGCAGG GTCGGAACAG GAGAGCGCAC GAGGGAGCTT CCAGGGGGAA ACGCCTGGTA 4 320

TCTTTATAGT CCTGTCGGGT TTCGCCACCT CTGACTTGAG CGTCGATTTT TGTGATGCTC 4 950

GTCAGGGGGG CGGAGCCTAT GGAAAAACGC CAGCAACGCG GCCTTTTTAC GGTTCCTGGC 304 0

CTTTTGCTGG CCTTTTGCTC ACATGTTCTT TCCTGCGTTA TCCCCTGATT CTGTGGATAA 5100

CCGTATTACC GCCTTTGAGT GAGCTGATAC CGCTCGCCGC AGCCGAACGA CCGAGCGCAG 5150

CGAGTCAGTG AGCGAGGAAG CGGAAGAGCG CCCAATAC3C AAACCGCCTC TCCCCGCGCG 5-2 0

TTGGCCGATT CATTAATGCA GCTGGCACGA CAGGTTTCCC GACTGGAAAG CGGGCAGTGA 52 3 0

GCGCAACGCA ATTAATGTGA GTTAGCTCAC TCATTAGGCA CCCCAGGCTT TACACTTTAT 53 40

GCTTCCGGCT CGTATGTTGT GTGGAATTGT GAGCGGATAA CAATTTCACA CAGGAAACAG 54 00

CTATGACCAT GATTACGCCA AGCTTTTGCG ATCAATAAAT GGATCACAAC CAGTATCTCT 54 5 0

TAACGATGTT CTTCGCAGAT GATGATTCAT TTTTTAAGTA TTTGGCTAGT CAAGATGATG 5 5 20

AATCTTCATT ATCTGATATA TTGCAAATCA CTCAATATCT AGACTTTCTG TTATTATTAT 55 30

TGATCCAATC AAAAAATAAA TTAGAAGCCG TGGGTCATTG TTATGAATCT CTTTCAGAGG 554 0

AATACAGACA ATTGACAAAA TTCACAGACT TTCAAGATTT TAAAAAACTG TTTAACAAGG 57 00

TCCCTATTGT TACAGATGGA AGGGTCAAAC TTAATAAAGG ATATTTGTTC GACTTTGTGA 57 5 0

TTAGTTTGAT GCGATTCAAA AAAGAATCCT CTCTAGCTAC CACCGCAATA GATCCTGTTA 5 520

GATACATAGA TCCTCGTCGC AATATCGCAT TTTCTAACGT GATGGATATA TTAAAGTCGA 5 530

ATAAAGTGAA CAATAATTAA TTCTTTATTG TCATCATSAA CGGCGGACAT ATTCAGTTGA 5 54 0

TAATCGGCCC CATGTTTTCA GGTAAAAGTA CAGAATTAAT TAGACGAGTT AGACGTTATC 50 0 0

AAATAGCTCA ATATAAATGC GTGACTATAA AATATTCTAA CGATAATAGA TACGGAACGG 5 35 0

GACTATGGAC GCATGATAAG AATAATTTTG AAGCATTGGA AGCAACTAAA CTATGTGA7G 512 0

TCTTGGAATC AATTACAGAT TTCTCCGTGA TAGGTATCGA TGAAGGACAG TTCTTTCCAG 5150

ACATT3TTGA ATTGATCTCG ATCCCGCGAA ATTAATACGA CTCACTATAG GGAC-ACCACA 52 4 0

ACGGTTTCCC TCTAGCGGGA TCAATTCCGC CCCTCTCCCT CCCCCCCCCC TAACGTTACT 5 300

GGCCGAAGCC GCTTGGAATA AGGCCGGTGT GCGTTTGTCT ATATGTTATT TTCCACCATA 5 350

TTGCCGTCTT TTGGCAATGT GAGGGCCCGG AAACCTGGCC CTGTCTTCTT GACGAGCATT 5 4 20

CCTAGGGGTC TTTCCCCTCT CGCCAAAGGA ATGCAAGGTC TGTTGAATGT CGTGAAGGAA 5430

GCAGTTCCTC TGGAAGCTTC TTGAAGACAA ACAACGTCTG TAGCGACCCT TTGCAGGCAG 5 54 0

CGGAACCCCC CACCTGGCGA CAGGTGCCTC TGCGGCCAAA AGCCACGTGT ATAAGATACA 5 500

CCTGCAAAGG CGGCACAACC CCAGTGCCAC GTTGTGAGTT GGATAGTTGT GGAAAGAGTC 5550

AAATGGCTCT CCTCAAGCGT ATTCAACAAG GGGCTGAAGG ATGCCCAGAA GGTACCCCAT 572 0

TGTATGGGAT CTGATCTGGG GCCTCGGTGC ACATGCTTTA CATGTGTTTA GTCGAGGTTA 573 0

AAAAACGTCT AGGCCCCCCG AACCACGGGG ACGTGG';'::1" CCTTTGAAAA ACACGATAAT 5 340

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 21:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 7107 pares de base

(B) TIPO: ácido nucieico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 21:

ATGGAAAGCG ACGCTAAAAA CTATCAAATC ATGGATTCTT GGGAAGAGGA ATCAAGAC-AT 6 0

AAATCAACTA ATATCTCCTC GGCCCTCAAC ATCATTGAAT TCATACTCAG CACCGACCCC 12 0

CAAGAAGACT TATCGGAAAA CGACACAATC AACACAAGAA CCCAGCAACT CAGTGCCACC 18 0

ATCTGTCAAC CAGAAATCAA ACCAACAGAA ACAAGTGAGA AAGATAGTGG ATCAACTGAC 24 0

AAAAATAGAC AGTCCGGGTC ATCACACGAA TGTACAACAG AAGCAAAAGA TAGAAATATT 3 00

GATCAGGAAA CTGTACAGAG AGGACCTGGG Aa--AGAAGCA GCTCAGATAG TAGAGCTGAG 350

ACTGTGGTCT CTGGAGGAAT CCCCAGAAGC ATCACAGATT CTAAAAATGG AACCCAAAAC 42 0

ACGGAGGATA TTGATCTCAA TGAAATTAGA AAGATGGATA AGGACTCTAT TGAGGGGAAA 43 0

ATGCGACAAT CTGCAAATGT TCCAAGCGAG ATATCAGGAA GTGATGACAT ATTTACAACA 54 0

GAACAAAGTA GAAACAGTGA TCATGGAAGA AGCCTGGAAT CTATCAGTAC ACCTGATACA 5 00

AGATCAATAA GTGTTGTTAC TGCTGCAACA CCAGATGATG AAGAAGAAAT ACTAATGAAA 550

AATAGTAGGA CAAAGAAAAG TTCTTCAACA CA7CAAGAAG ATGACAAAAG AATTAAAAAA 72 0

GGGGGAAAAG GGAAAGACTG GTTTAAGAAA TCAAAAGATA CCGACAACCA GATACCAACA 730

TCAGACTACA GATCCACATC AAAAGGGCAG AAGAAAATCT CAAAGACAAC AACCACCAAC 340

ACCGACACAA AGGGGCAAAC AGAAATACAG ACA3AATCAT CAGAAACACA ATCCTCATCA 9 00

TGGAATCTCA TCATCGACAA CAACACCGAC CGGAACGAAC AGACAAGCAC AACTCCTCCA 95 0

ACAACAACTT CCAGATCAAC TTATACAAAA GAATCGATCC GAACAAACTC TGAATCCAAA 102 0

CCCAAGACAC AAAAGACAAA TGGAAAGGAA AGGAAGGATA CAGAAGAGAG CAATCGATTT 103 0

ACAGAGAGGG CAATTACTCT ATTGCAGAAT CTTGGTGTAA TTCAATCCAC ATCAAAACTA. 114 0

GATTTATATC AAGACAAACG AGTTGTATGT GTAGCAAATG TACTAAACAA TGTAGATACT 12 0 0

GCATCAAAGA TAGATTTCCT GGCAGGATTA GTCATAGGGG TTTCAATGGA CAACGACACA 125 0

AAATTAACAC AGATACAAAA TGAAATGCTA AACCTCAAAG CAGATCTAAA GAAAATGGAC 1320

GAATCACATA GAAGATTGAT AGAAAATCAA AGAGAACAAC TGTCATTGAT CACC-TCACTA 13 8 0

ATTTCAAATC TCAAAATTAT. GACTGAGAGA GGAGGAAAGA AAGACCAAAA TGAATCCAAT 144 0

GAGAGAGTAT CCATGATCAA AACAAAATTG AAAGAAGAAA AGATCAAGAA GACCAGGTTT 15 00

GACCCACTTA TGGAGGCACA AGGCATTGAC AAGAATATAC CCGATCTATA TCGACATGCA 156 0

GGAGATACAC TAGAGAACGA TGTACAAGTT AAATCAGAGA TATTAAGTTC ATACAATGAG 152 0TCAAATGCAA CAAGACTAAT ACCCAAAAAA GTGAGCAGTA CAATGAGATC ACTAGTTGCA 158 0

GTCATCAACA ACAGCAATCT CTCACAAAGC ACAAAACAAT CATACATAAA CGAACTCAAA 17 4 0

CGTTGCAAAA ATGATGAAGA AGTATCTGAA TTAATGGACA TGTTCAATGA AGATGTCAAC 13 00

AATTGCCAAT GAGTCGACGA TCCGGCTGCT AACAAAGCCC GAAAGGAAGC TGAGTTGGCT 13 5 0

GCTGCCACCG CTGAGCAATA ACTAGCATAA CCCCTTGGGG CCTCTAAACG GGTCTTGAGG 192 0

GGTTTTTTGC TGAAAGGAGG AACTATATCC GGATCGAGAT CAATTCTGTG AGCGTATGGC 198 0

AAACGAAGGA AAAATAGTTA TAGTAGCCGC ACTCGATGGG ACATTTCAAC GTAAACCC-TT 2 04 0

TAATAATATT TTGAATCTTA TTCCATTATC TGAAATGGTG GTAAAACTAA CTGCTGTGTG 2100

TATGAAATGC TTTAAGGAGG CTTCCTTTTC TAAACGATTG GGTGAGGAAA CCGAGATAGA 216 0

AATAATAGGA GGTAATGATA TGTATCAATC GGTGTGTAGA AAGTGTTACA TCGACTCATA 22 2 0

ATATTATATT TTTTATCTAA AAAACTAAAA ATAAACATTG ATTAAATTTT AATATAATAC 2280

TTAAAAATGG ATGTTGTGTC GTTAGATAAA CCGTTTATGT ATTTTGAGGA AATTGATAAT 2 34 0

GAGTTAGATT ACGAACCAGA AAGTGCAAAT GAGGTCGCAA AAAAACTGCC GTATCAAGGA 2 4 00

CAGTTAAAAC TATTACTAGG AGAATTATTT TTTCTTAGTA AGTTACAGCG ACACGGTATA 24 6 0

TTAGATGGTG CCACCGTAGT GTATATAGGA TCTGCTCCCG GTACACATAT ACC-TTATTTG 2 52 0

AGAGATCATT TCTATAATTT AGGAGTGATC ATCAAATGGA TGCTAATTGA CGGCCGCCAT 2 580

CATGATCCTA TTTTAAATGG ATTGCGTGAT GTGACTCTAG TGACTCGGTT CGTTGATGAG 2 64 0

GAATATCTAC GATCCATCAA AAAACAACTG CATCCTTCTA AGATTATTTT AATTTCTGAT 2 700

GTGAGATCCA AACGAGGAGG AAATGAACCT AGTACGGCGG ATTTACTAAG TAATTACGCT 2760

CTACAAAATG TCATGATTAG TATTTTAAAC CCCGTGGCGT CTAGTCTTAA ATGGAGATGC 2 320

CCGTTTCCAG·ATCAATGGAT CAAGGACTTT TATATCCCAC ACGGTAATAA AATGTTACAA 2 3 80

CCTTTTGCTC CTTCATATTC AGGGCCGTCG TiTTACAACG TCGTGACTC-G GAAAACCCTG 2 94 0

GCGTTACCCA ACTTAATCGC CTTGCAGCAC ATCCCCCTTT CGCCAGCTGG CGTAATAGCG 3 000

AAGAGGCCCG CACCGATCGC CCTTCCCAAC AGTTGCGCAG CCTGAATGGC GAATGGCGCG 3 060

ACGCGCCCTG TAGCGGCGCA TTAAGCGCGG CGGGTGTGGT GGTTACGCGC AGCGTGACCG 312 0

CTACACTTGC CAGCGCCCTA GCGCCCGCTC CTTTCGCTTT CTTCCCTTCC TTTCTCGCCA 318 0

CGTTCGCCGG CTTTCCCCGT CAAGCTCTAA ATCGGGGGCT CCCTTTAGGG TTCCGATTTA 3 24 0

GTGCTTTACG GCACCTCGAC CCCAAAAAAC TTC-ATTAGGG TGATGGTTCA CGTAGTGGGC 3 3 00

CATCGCCCTG ATAGACGGTT TTTCGCCCTT TGACGTTGGA GTCCACGTTC TTTAATAGTG 3 36 0

GACTCTTGTT CCAAACTGGA ACAACACTCA ACCCTATCTC GGTCTATTCT TTTGATTTAT 342 0

AAGGGATTTT GCCGATTTCG GCCTATTGGT TAAAAAATGA GCTGATTTAA CAAAAATTTA 34 8 0

ACGCGAATTT TAACAAAATA TTAACGTTTA CAATTTCCCA GGTGGCACTT TTCGGGGAAA 3 54 0

TGTGCGCGGA ACCCCTATTT GTTTATTTTT CTAAATACAT TCAAATATGT ATCCGCTCAT 3 6 00

GAGACAATAA CCCTGATAAA TGCTTCAATA ATATTGAAAA AGGAAGAGTA TGAGTATTCA 3 66 0

ACATTTCCGT GTCGCCCTTA TTCCCTTTTT TGCGGCATTT TGCCTTCCTG TTTTTGCTCA 372 0CCCAGAAACG CTGGTGAAAG TAAAAGATGC TGAAGATCAG TTGGGTGCAC GAGTGGGT7A 37ÓO

CATCGAACTG GATCTCAACA GCGGTAAGAT CCTTGAGAGT TTTCGCCCCG AAGAACGTTT 3 34 0

TCCAATGATG AGCACTTTTA AAGTTCTGCT ATGTGGCGCG GTATTATCCC GTATTGACGC 3900

CGGGCAAGAG CAACTCGGTC GCCGCATACA CTATTCTCAG AATGACTTGG TTGAGTACTC 3SSO

ACCAGTCACA GAAAAGCATC TTACGGATGG CATGACAGTA AGAGAATTAT GCAGTGCTGC 4020

CATAACCATG AGTGATAACA CTGCGGCCAA CTTACTTCTG ACAACGATCG GAGGACCGAA 40 3 0

GGAGCTAACC GCTTTTTTGC ACAACATGGG GGATCATGTA ACTCGCCTTG ATCGTTGGGA 414 0

ACCGGAGCTG AATGAAGCCA TACCAAACGA CGAGCGTGAC ACCACGATC-C CTC-TAGCAA? 42 00

GGCAACAACG TTGCGCAAAC TATTAACTGG CC-AACTACTT ACTCTAGCTT CCCGGCAACA 4250

ATTAATAGAC TGGATGGAGG CGGATAAAGT TGΓAGGACCA CTTCTGCGCT CGGCCCTTCC 4220

GGCTGGCTGG TTTATTGCTG ATAAATCTGG AGCCGGTGAG CGTGGGTCTC GCGGTATCAT 43SO

TGCAGCACTG GGGCCAGATG GTAAGCCCTC CCGTATCGTA GTTATCTACA CGACGGGGAG 44 4 0

TCAGGCAACT ATGGATGAAC GAAATAGACA C-A7CGCTGAG ATAGGTGCCT CACTGATTAA 4 500

GCATTGGTAA CTGTCAGACC AAGTTTACTC ATATATACTT TAGATTGATT TAAAACTTCA 4 55 0

TTTTTAATTT AAAAGGATCT AGGTGAAGAT CCTTTTTGAT AATCTCATGA CCAAAATCCC 4 52 0

TTAACGTGAG TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGACCCCGTA GAAAAGATCA AAGGATCTTC 4δ30

TTGAGATCCT TTTTTTCTGC GCGTAATCTG CTGCTTGCAA ACAAAAAAAC CACCGCTACC 4 74 0

AGCGGTGGTT TGTTTGCCGG ATCAAGAGCT ACCAACTCTT TTTCCGAAGG TAACTGGCTT 4 SOO

CAGCAGAGCG CAGATACCAA ATACTGTCCT TC7AGTGTAG CCGTAGTTAG GCCACCACTT 4SSO

CAAGAACTCT GTAGCACCGC CTACATACCT CGCTCTGCTA ATCCTGTTAC CAGTGGCTGC 4 32 0

TGCCAGTGGC GATAAGTCGT GTCTTACCGG GTTGGACTCA AGACGATAGT TACCGGATAA 4 9S0

GGCGCAGCGG TCGGGCTGAA CGGGGGGTTC GTGCACACAG CCCAGCTTGG AGCGAACGAC 504 0

CTACACCGAA CTGAGATACC TACAGCGTGA GCTATGAGAA AGCGCCACGC TTCCCGAAGG 5100

GAGAAAGGCG GACAGGTATC CGGTAAGCGG CAGGGTCGGA ACAGGAGAGC GCACGAGGGA 516 0

GCTTCCAGGG GGAAACGCCT GGTATCTTTA TAGTCCTGTC GGGTTTCGCC ACCTCTGACT 522 0

TGAGCGTCGA TTTTTGTGAT GCTCGTCAGG GGGGCGGAGC CTATGGAAAA ACGCCAGCAA 52SO

CGCGGCCTTT TTACGGTTCC TGGCCTTTTG CTGGCCTTTT GCTCACATGT TCTTTCCTGC 534 0

GTTATCCCCT GATTCTGTGG ATAACCGTAT TACCGCCTTT GAGTGAGCTG ATACCGCTCG 54 00

CCGCAGCCGA ACGACCGAGC GCAGCGAGTC AGTGAGCGAG GAAGCGGAAG AGCGCCCAAT 54 50

ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGCTGGC ACGACAGGTT 55 2 0

TCCCGACTGG AAAGCGGGCA GTGAGCGCAA CGCAATTAAT GTGAGTTAGC TCACTCATTA 5530

GGCACCCCAG GCTTTACACT TTATGCTTCC GGCTCGTATG TTGTGTGGAA TTGTGAGCGG 554 0

ATAACAATTT CACACAGGAA ACAGCTATGA CCATGATTAC GCCAAGCTTT TGCGATCAAT 57 00

AAATGGATCA CAACCAGTAT CTCTTAACGA TGTTCTTCGC AGATGATGAT TCATTTTTTA 57 60

AGTATTTGGC TAGTCAAGAT GATGAATCTT CATTATCTGA TATATTGCAA ATCACTCAAT 5 82 0ATCTAGACTT TCTGTTATTA TTATTGATCC AATCAAAAAA TAAATTAGAA C-CCGTGGGTC 53 80

ATTGTTATGA ATCTCTTTCA GAGGAATACA GACAATTGAC AAAATTCACA GACTTTCAAG 5 94 0

ATTTTAAAAA ACTGTTTAAC AAGGTCCCTA TTGTTACAGA TGGAAGGGTC AAACTTAATA 6 000

AAGGATATTT GTTCGACTTT GTGATTAGTT TGATGCGATT CAAAAAAGAA TCCTCTCTAG 6 06 0

CTACCACCGC AATAGATCCT GTTAGATACA TAC-ATCCTCG TCGCAATATC GCA7TTTCTA 6X20

ACGTGATGGA TATATTAAAG TCGAATAAAG TGAACAATAA TTAATTCTTT ATTGTCATCA 6180

TGAACGGCGG ACATATTCAG TTGATAATCG GCCCCATGTT TTCAGGTAAA AGTACAGAAT 6 24 0

TAATTAGACG AGTTAGACGT TATCAAATAG CTCAATATAA ATGCGTGACT ATA.-_AATA.TT 6 3 00

CTAACGATAA TAGATACGGA ACGGGACTAT GGACGCATGA TAAGAATAAT TTTGAAGCAT 636 0

TGGAAGCAAC TAAACTATGT GATGTCTTGG AATCAATTAC AGATTTCTCC GTC-ATAGGTA 6420

TCGATGAAGG ACAGTTCTTT CCAGACATTG TTGAATTGAT CTCGATCCCG CGAAATTAAT 64 8 0

ACGACTCACT ATAGGGAGAC CACAACGGTT TCCCTCTAGC GGGATCAATT CCC-CCCCTCT 6 54 0

CCCTCCCCCC CCCCTAACGT TACTGGCCGA AC-CCGCTTGG AATAAGGCCG GTGTGCG7TT ÓSOO

GTCTATATGT TATTTTCCAC CATATTGCCG TCTTTTGGCA ATGTGAGGGC CCGGAAACCT 66 60

GGCCCTGTCT TCTTGACGAG CATTCCTAGG GGTCTTTCCC CTCTCGCCAA AGGAATGCAA 6 720

GGTCTGTTGA ATGTCGTGAA GGAAGCAGTT CCTCTGGAAG CTTCTTGAAG ACXAACAACG 5 730

TCTGTAGCGA CCCTTTGCAG GCAGCGGAAC CCCCCACCTG GCGACAGGTG CCTCTGCC-GC 6 84 0

CAAAAGCCAC GTGTATAAGA TACACCTGCA AAGGCGGCAC AACCCCAGTG CCACGTTGTG 6 900

AGTTGGATAG TTGTGGAAAG AGTCAAATGG CTCTCCTCAA GCGTATTCAA CAAGGGGCTG 6 96 0

AAGGATGCCC AGAAGGTACC CCATTGTATG GGATCTGATC TGGGGCCTCG GTGCACATGC 7020TTTACATGTG TTTAGTCGAG GTTAAAAAAC C-TCTAGGCCC CCCGAACCAC GGGGACGTGG 708 0

TTTTCCTTTG AAAAACACGA TAATACC 7107

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 22:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 12011 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 22:ATGGACACTG AATCTAACAA TGGCACTGTA TCTGACATAC TCTATCCTGA GTGTCACCTT SO

AACTCTCCTA TCGTTAAAGG TAAAATAGCA CAATTACACA CTATTATGAG TCTACCTCAG 12 0

CCTTATGATA TGGATGACGA CTCAATACTA GTTATCACTA GACAGAAAAT AAAACTTAAT 18 0

AAATTGGATA AAAGACAACG ATCTATTAGA AGATTAAAAT TAATATTAAC TGAAAAAGTG 24 0

AATGACTTAG GAAAATACAC ATTTATCAGA TATCCAGAAA TGTCAAAAGA AATGTTCAAA 300

TTATATATAC CTGGTATTAA CAGTAAAGTG ACTGAATTAT TACTTAAAGC AGATAGAACA 36 0

TATAGTCAAA TGACTGATGG ATTAAGAGAT CTATGGATTA ATGTGCTATC AAAATTAGCC 4 2 0

TCAAAAAATG ATGGAAGCAA TTATGATCTT AATGAAGAAA TTAATAATAT ATCGAAAGTT 4 8 0

CACACAACCT ATAAATCAGA TAAATGGTAT AATCCATTCA AAACATGGTT TACTATCAAG 54 0

TATGATATGA GAAGATTACA AAAAGCTCGA AATGAGATCA CTTTTAATGT TGGGAAGGAT 500

TATAACTTGT TAGAAGACCA GAAGAATTTC TTATTGATAC ATCCAGAATT GGTTTTGATA ÓSO

TTAGATAAAC AAAACTATAA TGGTTATCTA ATTACTCCTG AATTAGTATT GATGTATTGT 72 0

GACGTAGTCG AAGGCCGATG GAATATAAGT GCATGTGCTA AGTTAGATCC AAAATTACAA 780

TCTATGTATC AGAAAGGTAA TAACCTGTGG GAAGTGATAG ATAAATTGTT TCCAATTATG 84 0

GGAGAAAAGA CATTTGATGT GATATCGTTA TTAGAACCAC TTGCATTATC CTTAATTCAA 500

ACTCATGATC CTGTTAAACA ACTAAGAGGA GCTTTTTTAA ATCATGTGTT ATCCGAGATG 95 0

GAATTAATAT TTGAATCTAG AGAATCGATT AA3GAATTTC TGAGTGTAGA TTACATTGAT 102 0

AAAATTTTAG ATATATTTAA TAAGTCTACA ATAGATGAAA TAGCAGAGAT TTTCTCTTTT 108 0

TTTAGAACAT TTGGGCATCC TCCATTAGAA GC7AGTATTG CAGCAGAAAA GGTTAGAAAA 1140

TATATGTATA TTGGAAAACA ATTAAAATTT GACACTATTA ATAAATGTCA TGCTATCTTC 12 00

TGTACAATAA TAATTAACGG ATATAGAGAG AC-3CATGGTG GACAGTGGCC TCCTGTGACA 126 0

TTACCTGATC ATGCACACGA ATTCATCATA AATGCTTACG GTTCAAACTC TGCGATATCA 132 0

TATGAAAATG CTGTTGATTA TTACCAGAGC TTTATAGGAA TAAAATTCAA TAAATTCATA 13 80

GAGCCTCAGT TAGATGAGGA TTTGACAATT TATATGAAAG ATAAAGCATT ATCTCCAAAA 144 0

AAATCAAATT GGGACACAGT TTATCCTGCA TCTAATTTAC TGTACCGTAC TAACGCATCC 1500

AACGAATCAC GAAGATTAGT TGAAGTATTT ATAGCAGATA GTAAATTTGA TCCTCATCAG 156 0

ATATTGGATT ATGTAGAATC TGGGGACTGG TTAGATGATC CAGAATTTAA TATTTCTTAT 152 0

AGTCTTAAAG AAAAAGAGAT CAAACAGGAA GGTAGACTCT TTGCAAAAAT GACATACAAA 15 80

ATGAGAGCTA CACAAGTTTT ATCAGAGACA CTACTTGCAA ATAACATAGG AAAATTCTTT 17 4 0

CAAGAAAATG GGATGGTGAA GGGAGAGATT GAATTACTTA AGAGATTAAC AACCATATCA 13 00

ATATCAGGAG TTCCACGGTA TAATGAAGTG TACAATAATT CTAAAAGCCA TACAGATGAC 13 6 0

CTTAAAACCT ACAATAAAAT AAGTAATCTT AATTTGTCTT CTAATCAGAA ATCAAAGAAA 192 0

TTTGAATTCA AGTCAACGGA TATCTACAAT GATGGATACG AGACTGTGAG CTGTTTCCTA 198 0

ACAACAGATC TCAAAAAATA CTGTCTTAAT TGGAGATATG AATCAACAGC TCTATTTGGA 2 04 0ÜAAACTTGCA ACCAAATATT TGGATTAAAT AAATTGTTTA ATTGGTTACA CCCTCGTCTT 2100

GAAGGAAGTA CAATCTATGT AGGTGATCCT TACTGTCCTC CATCAGATAA AGAACATATA 2160

TCATTAGAGG ATCACCCTGA TTCTGGTTTT TACGTTCATA ACCCAAGAGG GGGTATAGAA 222 0

GGATTTTGTC AAAAATTATG GACACTCATA TCTATAAGTG CAATACATCT AGCAGCTGTT 2230

AGAATAGGCG TGAGGGTGAC TGCAATGGTT CAAGGAGACA ATCAAGCTAT AGCTGTAACC 234 0

ACAAGAGTAC CCAACAATTA TGACTACAGA GTTAAGAAGG AGATAGTTTA TAAAGATGTA 24 00

GTGAGATTTT TTGATTCATT AAGAGAAGTG ATGGATGATC TAGGTCATGA ACTTAAATTA 24SO

AATGAAACGA TTATAAGTAG CAAGATGTTC ATATATAGCA AAAGAATCTA TTATGATGGG 2 52 0

AGAATTCTTC CTCAAGCTCT AAAAGCATTA TCTAGATGTG TCTTCTGGTC AGAGACAGTA 25 80

ATAGACGAAA CAAGATCAGC ATCTTCAAAT TTGGCAACAT CATTTGCAAA AGCAATTGAG 2 64 0

AATGGTTATT CACCTGTTCT AGGATATGCA TGCTCAATTT TTAAGAACAT TCAACAACTA 2 7 00

TATATTGCCC TTGGGATGAA TATCAATCCA ACTATAACAC AGAATATCAG AGATCAGTAT 27 6 0

TTTAGGAATC CAAATTGGAT GCAATATGCC TCTTTAATAC CTGCTAGTG7 TGGGC-GATTC 2 820

AATTACATGG CCATGTCAAG ATGTTTTGTA AGGAATATTG GTGATCCATC AGTTGCCGCA 28 3 0

TTGGCTGATA TTAAAAGATT TATTAAGGCG AATCTATTAG ACCGAAGTC-T TCTTTATAGG 2 94 0

ATTATGAATC AAGAACCAGG TGAGTCATCT TTTTTGGACT GGGCTTCAC-A TCCATATTCA 3000

TGCAATTTAC CACAATCTCA AAATATAACC ACCATGATAA AAAATATAAC AGCAAGGAAT 3 05 0

GTATTACAAG ATTCACCAAA TCCATTATTA TCTGGATTAT TCACAAATAC AATGATAGAA 312 0

GAAGATGAAG AATTAGCTGA GTTCCTGATG GACAGGAAGG TAATTCTCCC TAGAGTTGCA 318 0

CATGATATTC TAGATAATTC TCTCACAGGA ATTAGAAATG CCATAGCTGG AATGTTAGAT 3 24 0

ACGACAAAAT CACTAATTCG GGTTGGCATA AATAGAGGAG GACTGACATA TAGTTTGTTG 3 3 00

AGGAAAATCA GTAATTACGA TCTAGTACAA TATGAAACAC TAAGTAGGAC TTTGCGACTA 3 360

ATTGTAAGTG ATAAAATCAA GTATGAAGAT ATGTGTTCGG TAGACCTTGC CATAGCATTG 342 0

CGACAAAAGA TGTGGATTCA TTTATCAGGA GGAAGGATGA TAAGTGGACT TGAAACGCCT 34 8 0

GACCCATTAG AATTACTATC TGGGGTAGTA ATAACAGGAT CAGAACATTG TAAAATATGT 3 54 0

TATTCTTCAG ATGGCACAAA CCCATATACT TGGATGTATT TACCCGGTAA TATCAAAATA 36 00

GGATCAGCAG AAACAGGTAT ATCGTCATTA AGAGTTCCTT ATTTTGGATC AGTCACTGAT 366 0

GAAAGATCTG AAGCACAATT AGGATATATC AAGAATCTTA GTAAACCTGC AAAAGCCGCA 3 720

ATAAGAATAG CAATGATATA TACATGGGCA TTTGGTAATG ATGAGATATC TTGGATGGAA 3 78 0

GCCTCACAGA TAGCACAAAC ACGTGCAAAT TTTACACTAG ATAGTCTCAA AATTTTAACA 3 840

CCGGTAGCTA CATCAACAAA TTTATCACAC AGATTAAAGG ATACTGCAAC TCAGATGAAA 3 900

TTCTCCAGTA CATCATTGAT CAGAGTCAGC AGATTCATAA CAATGTCCAA TGATAACATG 3 96 0

TCTATCAAAG AAGCTAATGA AACCAAAGAT ACTAATCTTA TTTATCAACA AATAATGTTA 4 020

ACAGGATTAA GTGTTTTCGA ATATTTATTT AGATTAAAAG AAACCACAGG ACACAACCCT 4 08 0ATAGTTATGC ATCTGCACAT AGAAGATGAG TGTTGTATTA AAGAAAGTTT TAATGATGAA 414 0

CATATTAATC CAGAGTCTAC ATTAGAATTA ATTCGATATC CTGAAAGTAA TGAATTTATT 4200

TATGATAAAG ACCCACTCAA AGATGTGGAC TTATCAAAAC TTATGGTTAT TAAAGACCAT 4250

TCTTACACAA TTGATATGAA TTATTGGGAT GATACTGACA TCATACATGC AATTTCAATA 4 32 0

TGTACTGCAA TTACAATAGC AGATACTATG TCACAATTAG ATCGAGATAA TTTAAAAGAG 4 3 80

ATAATAGTTA TTGCAAATGA TGATGATATT AATAGCTTAA TCACTGAATT TTTGACTCTT 4440

GACATACTTG TATTTCTCAA GACATTTGGT GGATTATTAG TAAATCAATT TGCATACACT 4 500

CTTTATAGTC TAAAAATAGA AGGTAGGGAT CTCATTTGGG ATTATATAAT GAGAACACTG 4550

AGAGATACTT CCCATTCAAT ATTAAAAGTA TTATCTAATG CATTATCTCA TCCTAAAGTA 4620

TTCAAGAGGT TCTGGGATTG TGGAGTTTTA AACCCTATTT ATGGTCCTAA TACTGCTAGT 4 6 80

CAAGACCAGA TAAAACTTGC CCTATCTATA TGTGAATATT CACTAGATCT ATTTATC-AGA 4740

GAATGGTTGA ATGGTGTATC ACTTGAAATA TACATTTGTG ACAGCGATAT GGAAGTTGCA 4 8 00

AATGATAGGA AACAAGCCTT TATTTCTAGA CACCTTTCAT TTGTTTGTTG TTTAGCAGAA 4 860

ATTGCATCTT TCGGACCTAA CCTGTTAAAC TTAACATACT TGGAGAGACT TGATCTATTG 4 92 0

AAACAATATC TTGAATTAAA TATTAAAGAA GACCCTACTC TTAAATATGT ACAAATATCT 4 9 30

GGATTATTAA TTAAATCGTT CCCATCAACT GTAACATACG TAAGAAAGAC TGCAATCAAA 5 04 0

TATCTAAGGA TTCGCGGTAT TAGTCCACCT GAGGTAATTG ATGATTGGGA TCCGGTAGAA 5100

GATGAAAATA TGCTGGATAA CATTGTCAAA ACTATAAATG ATAACTGTAA TAAAGATAAT 5150

AAAGGGAATA AAATTAACAA TTTCTGGGGA CTAGCACTTA AGAACTATCA AGTCCTTAAA 52 2 0

ATCAGATCTA TAACAAGTGA TTCTGATGAT AATGATAGAC TAGATGCTAA TACAAGTGGT 52 8 0

TTGACACTTC CTCAAGGAGG GAATTATCTA TCGCATCAAT TGAGATTATT CGGAATCAAC 534 0

AGCACTAGTT GTCTGAAAGC TCTTGAGTTA TCACAAATTT TAATGAAGGA AGTCAATAAA 54 00

GACAAGGACA GGCTCTTCCT GGGAGAAGGA GCAGGAGCTA TGCTAGCATG TTATGATGCC 54 60

ACATTAGGAC CTGCAGTTAA TTATTATAAT TCAGGTTTGA ATATAACAGA TGTAATTGGT 5 52 0

CAACGAGAAT TGAAAATATT TCCTTCAGAG GTATCATTAG TAGGTAAAAA ATTAGGAAAT 5 56 0

GTGACACAGA TTCTTAACAG GGTAAAAGTA CTGTTCAATG GGAATCCTAA TTCAACATGG 564 0

ATAGGAAATA TGGAATGTGA GAGCTTAATA TGGAGTGAAT TAAATGATAA GTCCATTGGA 5700

TTAGTACATT GTGATATGGA AGGAGCTATC GGTAAATCAG AAGAAACTGT TCTACATGAA 57Ó0

CATTATAGTG TTATAAGAAT TACATACTTG ATTGGGGATG ATGATGTTGT TTTAGTTTCC 5820

AAAATTATAC CTACAATCAC TCCGAATTGG TCTAGAATAC TTTATCTATA TAAATTATAT 58 80

TGGAAAGATG TAAGTATAAT ATCACTCAAA ACTTCTAATC CTGCATCAAC AGAATTATAT 5 94 0

CTAATTTCGA AAGATGCATA TTGTACTATA ATGGAACCTA GTGAAATTGT TTTATCAAAA 6 000

CTTAAAAGAT TGTCACTCTT GGAAGAAAAT AATCTATTAA AATGGATCAT TTTATCAAAG 6 06 0

AAGAGGAATA ATGAATGGTT ACATCATGAA ATCAAAGAAG GAGAAAGAGA TTATGGAATC 6120ATGAGACCAT ATCATATGGC ACTACAAATC TTTGGATTTC AAATCAATTT AAATCATCTG 5130

GCGAAAGAAT TTTTATCAAC CCCAGATCTG ACTAATATCA ACAATATAí.T CCAAAGTTTT 624 0

CAGCGAACAA TAAAGGATGT TTTATTTGAA TGGATTAATA TAACTCATGA TGATAAGAGA 63 00

CATAAATTAG GCGGAAGATA TAACATATTC CCACTGAAAA ATAAGGGAAA GTTAAGACTG 53 60

CTATCGAGAA GACTAGTATT AAGTTGGATT TCATTATCAT TATCGACTCG ATTACTTACA 64 20

GGTCGCTTTC CTGATGAAAA ATTTGAACAT AGAGCACAGA CTGGATATGT ATCATTAGCT 64 8 0

GATACTGATT TAGAATCATT AAAGTTATTG TCGAAAAACA TCATTAAGAA TTACAGAGAG 6 54 0

TGTATAGGAT CAATATCATA TTGGTTTCTA ACCAAAGAAG TTAAAATACT TATGAAATTG 6 600

ATTGGTGGTG CTAAATTATT AGGAATTCCC AGACAATATA AAGAACCCGA AGACCAGTTA 66 60

TTAGAAAACT ACAATCAACA TGATGAATTT GATATCGATT AAAACATAAA TAC.-.-.TGTCG 6720

ACGATCCGGC TGCTAACAAA GCCCGAAAGG AAGCTGAGTT GGCTGCTGCC ACCGCTGAGC 578 0

AATAACTAGC ATAACCCCTT GGGGCCTCTA AACGGGTCTT GAGGGGTTTT TTGCTG AA.-.G 584 0

GAGGAACTAT ATCCGGATCG AGATCAATTC TGTGAGCGTA TGGCAAACC-A AGGA-JkAATA 6 900

GTTATAGTAG CCGCACTCGA TGGGACATTT CAACGTAAAC CGTTTAATAA TATTTTGA-.T 5 95 0

CTTATTCCAT TATCTGAAAT GGTGGTAAAA CTAACTGCTG TGTGTATGAA ATGC7TTAAG 702 0

GAGGCTTCCT TTTCTAAACG ATTGGGTGAG GAAACCGAGA TAGAAATAAT AGGAGGTA-.T 703 0

GATATGTATC AATCGGTGTG TAGAAAGTGT TACATCGACT CATAATATTA TATT7TTTAT 714 0

CTAAAAAACT AAAAATAAAC ATTGATTAAA TTTTAATATA ATACTTAAAA ATGGATGTTG 7 2 00

TGTCGTTAGA TAAACCGTTT ATGTATTTTG AGGAAATTGA TAATGAGTTA GATTACGAAC 72 5 0

CAGAAAGTGC AAATGAGGTC GCAAAAAAAC TGCCGTATCA AGGACAGTTA AAAC7ATTAC 73 2 0

TAGGAGAATT ATTTTTTCTT AGTAAGTTAC AGCGACACGG TATATTAGAT GGTC-CCACCG 7380

TAGTGTATAT AGGATCTGCT CCCGGTACAC ATATACGTTA TTTGAGAGAT CATTTCTATA 744 0

ATTTAGGAGT GATCATCAAA TGGATGCTAA TTGACGGCCG CCATCATGAT CCTATTTTAA 7 5 00

ATGGATTGCG TGATGTGACT CTAGTGACTC GGTTCGTTGA TGAGGAATAT CTACGATCCA 7 56 0

TCAAAAAACA ACTGCATCCT TCTAAGATTA TTTTAATTTC TGATGTGAGA TCCAAACGAG 762 0

GAGGAAATGA ACCTAGTACG GCGGATTTAC TAAGTAATTA CGCTCTACAA AATGTCATGA 76 8 0

TTAGTATTTT AAACCCCGTG GCGTCTAGTC TTAAATGGAG ATGCCCGTTT CCAGATCAAT 7 74 0

GGATCAAGGA CTTTTATATC CCACACGGTA ATAAAATGTT ACAACCTTTT GCTCCTTCAT 78 0 0

ATTCAGGGCC GTCGTTTTAC AACGTCGTGA CTGGGAAAAC CCTGGCGTTA CCCAACTTAA 7860

TCGCCTTGCA GCACATCCCC CTTTCGCCAG CTGGCGTAAT AGCGAAGAGG CCCGCACCGA 7 92 0

TCGCCCTTCC CAACAGTTGC GCAGCCTGAA TGGCGAATGG CGCGACGCGC CCTGTAGCGG 7 98 0

CGCATTAAGC GCGGCGGGTG TGGTGGTTAC GCGCAGCGTG ACCGCTACAC TTGCCAGCGC 8 04 0

CCTAGCGCCC GCTCCTTTCG CTTTCTTCCC TTCCTTTCTC GCCACGTTCG CCGGCTTTCC 8100

CCGTCAAGCT CTAAATCGGG GGCTCCCTTT AGGGTTCCGA TTTAGTGCTT TACGGCACCT 815 0CGACCCCAAA AAACTTGATT AGGGTGATGG TTCACGTAGT GGGCCATCGC CCTGATAGAC 3220GGTTTTTCGC CCTTTGACGT TGGAGTCCAC GTTCTTTAAT AGTGGACTCT TGTTCCAAAC 3280TGGAACAACA CTCAACCCTA TCTCGGTCTA TTCTTTTGAT TTATAAGGGA TTTTGCCGAT 3340TTCGGCCTAT TGGTTAAAAA ATGAGCTGAT TTAACAAAAA TTTAACGCGA ATTTTAACAA 3400AATATTAACG TTTACAATTT CCCAGGTGGC ACTTTTCGGG GAAATGTGCG CGGAACCCCT 3460ATTTGTTTAT TTTTCTAAAT ACATTCAAAT ATGTATCCGC TCATGAGACA ATAACCCTGA 3520TAAATGCTTC AATAATATTG AAAAAGGAAG AG TATGAG TA TTCAACATTT CCGTGTCGCC 3580CTTATTCCCT TTTTTGCGGC ATTTTGCCTT CCTGTTTTTG CTCACCCAGA AACGCTGC-TG 3 54 0AAAGTAAAAG ATGCTGAAGA TCAGTTGGGT GCACGAGTGG GTTACATCGA ACTGGATCTC 3700AACAGCGGTA AGATCCTTGA . GAGTTTTCGC CCCGAAGAAC GTTTTCCAAT GATGAGCACT 3760TTTAAAGTTC TGCTATGTGG CGCGGTATTA TCCCGTATTG ACGCCGGGCA AGAGCAACTC 3320GGTCGCCGCA TACACTATTC TCAGAATGAC TTGGTTGAGT ACTCACCAGT CACAG AAAAG 3380CATCTTACGG ATGGCATGAC AGTAAGAGAA TTATGCAGTG CTGCCATAAC CATGAGTC-AT 3940AACACTGCGG CCAACTTACT TCTGACAACG ATCGGAGGAC CGAAGGAGCT AACCGCTTTT 2000TTG CACAACA TGGGGGATCA TGTAACTCGC CTTGATCGTT GGGAACCGGA GCTGAATGAA 9060GCCATACCAA ACGACGAGCG TGACACCACG ATGCCTGTAG CAATGGCAAC AACGTTGCGC 3120AAACTATTAA CTGGCGAACT ACTTACTCTA GCTTCCCGGC AACAATTAAT AGACTGGATG SlSOGAGGCGGATA AAGTTGCAGG ACCACTTCTG CGCTCGGCCC TTCCGGCTGG CTGGTTTATT 9240GCTGATAAAT CTGGAGCCGG TGAGCGTGGG TCTCGCGGTA TCATTGCAGC ACTt-GGGCCA 9300GATGGTAAGC CCTCCCGTAT CGTAGTTATC TACACGACGG GGAGTCAGGC AACTATGGAT 9360GAACGAAATA GACAGATCGC TGAGATAGGT GCCTCACTGA TTAAGCATTG GTAACTC-TCA 9420GACCAAGTTT ACTCATATAT ACTTTAGATT GATTTAAAAC TTCATTTTTA ATTTAAAAGG = 480ATCTAGGTGA AGATCCTTTT TGATAATCTC ATGACCAAAA TCCCTTAACG TGAGTTTTCG 9540TTCCACTGAG CGTCAGACCC CGTAGAAAAG ATCAAAGGAT CTTCTTGAGA TCCTTTTTTT 9600CTGCGCGTAA TCTGCTGCTT GCAAACAAAA AAACCACCGC TACCAGCGGT GGTTTGTTTG 9560CCGGATCAAG AGCTACCAAC TCTTTTTCCG AAGGTAACTG GCTTCAGCAG AGCGCAGATA S720CCAAATACTG TCCTTCTAGT GTAGCCGTAG TTAGGCCACC ACTTCAAGAA CTCTGTAGCA 9780CCGCCTACAT ACCTCGCTCT GCTAATCCTG TTACCAGTGG CTGCTGCCAG TGGCGATAAG 9840TCGTGTCTTA CCGGGTTGGA CTCAAGACGA TAGTTACCGG ATAAGGCGCA GCGGTCGGGC 9900TGAACGGGGG GTTCGTGCAC ACAGCCCAGC TTGGAGCGAA CGACCTACAC CGAACTGAGA 996 0TACCTACAGC GTGAGCTATG AGAAAGCGCC ACGCTTCCCG AAGGGAGAAA GGCGGACAGG 10020TATCCGGTAA GCGGCAGGGT CGGAACAGGA GAGCGCACGA GGGAGCTTCC AGGGGGAAAC 10030GCCTGGTATC TTTATAGTCC TGTCGGGTTT CGCCACCTCT GACTTGAGCG TCGATTTTTG 10140TGATGCTCGTTTCCTGGCCTGTGGATAACCGAGCGCAGCGCCCGCGCGTTGGCAGTGAGCCACTTTATGCGGAAACAGCTGTATCTCTTAAGATGATGAAATTATTATTGTTCAGAGGAA

CAGGGGGGCG

TTTGCTGGCC

GTATTACCGC

AGTCAGTGAG

GGCCGATTCA

GCAACGCAAT

TTCCGGCTCG

ATGACCATGA

ACGATGTTCT

T CTT CATTAT

ATCCAATCAA

TACAGACAAT

GAGCCTATGG

TTTTGCTCAC

CTTTGAGTGA

CGAGGAAGCG

TTAATGCAGC

TAATGTGAGT

TATGTTGTGT

TTACGCCAAG

TCGCAGATGA

CTGATATATT

AAAATAAATT

TGACAAAATT

AAAAACGCCA

ATGTTCTTTC

GCTGATACCG

GAAGAGCGCC

TGG CACGACA

TAGCTCACTC

GGAATTGTGA

CTTTTGCGAT

TGATTCATTT

GCAAATCACT

AGAAGCCGTG

CACAGACTTT

GCAACGCGGC

CTGCGTTATC

CTCGCCGCAG

CAATACGCAA

GGTTTCCCGA

ATTAGGCACC

GCGGATAACA

CAATAAATG ο

TTTAAGTATT

CAATATCTAG

GGTCATTGTT

CAAGATTTTA

CTTTTTACGG

CCCTGATTCT

CCGAACGACC

ACCGCCTCTC

CTGGAAAGCG

CCAGGCTTTA

ATTTCACACA

ATCACAACCA

TGGCTAGTCA

ACTTTCTGTT

ATGAATCTCT

AAAAACTGTT

102001026010320103801044010500105601062010680107401080010860

TAACAAGGTC CCTATTGTTA CAGATGGAAG GGTCAAACTT AATAAAGGAT - ιοί 1 Ι'ΟΛ 10920CTTTGTGATT AGTTTGATGC GATTCAAAAA AGAATCCTCT CTAGCTACCA CCGiAATAGA 10980TCCTGTTAGA TACATAGATC CTCGTCGCAA TATCGCATTT TCTAACGTGA TGGΑΤΑΤΑΤΤ 11040AAAG T CGAAT AAAGTGAACA ATAATTAATT CTTTATTGTC ATCATGAACG GCGGACATAT 11100TCAGTTGATA ATCGGCCCCA TGTTTTCAGG TAAAAGTACA GAATTAATTA 1 i 11160ACGTTATCAA ATAGCTCAAT ATAAATGCGT GACTATAAAA TATTCTAACG ATAATAGATA 11220CGGAACGGGA CTATGGACGC ATGATAAC-AA TAATTTTGAA GCATTGGAAG CAACTAAACT 11280ATGTGATGTC TTGGAATCAA TTACAGATTT CTZCGTGATA GGTATCGATG AAGGACAGTT 11340CTTTCCAGAC ATTGTTGAAT TGATCTCGAT CCCGCGAAAT TAATACGACT CACTATAGGG 11400AGACCACAAC GGTTTCCCTC TAGCGGGATC AATTCCGCCC CTCTCCCTCC CCCCCCCCTA 11460ACGTTACTGG CCGAAGCCGC TTGGAATAAG GCCGGTGTGC GTTTGTCTAT ATGΤΤΑΤΤΤΤ 11520CCACCATATT GCCGTCTTTT GGCAATGTGA GGGCCCGGAA ACCTGGCCCT GTCTTCTTGA 11580CGAGCATTCC TAGGGGTCTT TCCCCTCTCG CCAAAGGAAT GCAAGGTCTG TTC-AATGTCG 11640TGAAGGAAGC AGTTCCTCTG GAAGCTTCTT GAAGACAAAC AACGTCTGTA GCGACCCTTT 11700GCAGGCAGCG GAACCCCCCA CCTGGCGACA GGTGCCTCTG CGGCCAAAAG CCACGTGTAT 11760AAGATACACC TGCAAAGGCG GCACAACCCC AGTGCCACGT TGTGAGTTGG ATAGTTGTGG 11820AAAGAGTCAA ATGGCTCTCC TCAAGCGTAT T CAACAAGGG GCTGAAGGAT GCCCAGAAGG 11880TACCCCATTG TATGGGATCT GATCTGGGGC CTCGGTGCAC ATGCTTTACA TGTGTTTAGT 11940CGAGGTTAAA AAACGTCTAG GCCCCCCGAA CCACGGGGAC GTGGTTTTCC TTTGAAAAAC 12000ACGATAATAC C 12011(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 23:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 15 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 23:GATCGATGCT AGCCC 152) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 24:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 15 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 24:GATCGGGCTA GCATC 15

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 25:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 12 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 25:

TTACATGGCC AT 12

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 26:(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 12 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 26:

TC AC ATGGCG AT 12

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 27:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 12 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 27:TTTGGACTGGGC 12

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 28:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 12 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 28:TTTTGATTGG GC 12

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 29:(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 14 pares de base(B) TIPO: ácido nucleico(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 29:TGGTCCTAAT ACTG 14

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 30:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 14 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 30:TGGGCCTAAT ATCG 14

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 31:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 30 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 31:

GCATTATCTA GATGTGTCTT CTGGTCAGAG 30

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 32:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 30 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 32:CCTGAATTAT AATAATTAAC TGCAGGTCCT 30(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 33:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 26 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 33:

GGGAAAGAAT CCAGAGACAA GAACGG 26

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 34:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 26 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 34:GGTGAAGTTG TGGATCCATT TGATTG 26

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 35:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 24 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 35:CAACCTGTAA GGTACCAGCA TCCG 24

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 36:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 27 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQID NO: 36:GATATGGTGT TAGGCCTTGA TCTGTTC 27

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 37:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 29 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 37:CGCCATGGAA AAATCAGAGA TCCTCTTCT 29

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 38:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 31 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 38:

CTG GATCCTA ATTGGAGTTG TTACCCATGT A 31

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 39:(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 23 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 39:AACCATGGCT GAAAAAGGGA AAA 23

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 40:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 33 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 40:

GGTGAAGCTT AAGATGTGAT TTACATATT TTA 33

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 41:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 35 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 41:AAATAGGATC CCTACAGATC ATTAGATATT AAAAT 35

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 42:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 24 pares de base(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 42:

CGCCATGGTG TTCAGTGCTT GTTG 24

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQID NO: 43:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 31 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 43:CCACAAGCTT AATTAACCAT AATATGCATC A 31

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 44:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 29 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 44:TTCCATGGAT TTGGATTTGT CTATTGGGT 29

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 45:(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 15462 pares de base(B) TIPO: ácido nucleico(C) FILAMENTOS: único(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 45:

accaaacaag agaagaaact tgcttggtaa tataaattta acttaaaatt aacttaggat 50

ttaagacatt gactagaagg tcaagaaaag ggaactctat aatttcaaaa atgttgagcc 120

tatttgatac atttaatgca cgtaggcaag aaaacataac aaaatcagcc ggtggagcta 180

tcattcctgg acagaaaaat actgtctcta tattcgccct tggaccgaca ataactgatg 240

ataatgagaa aatgacatta gctcttctat ttctatctca ttcactagat aatgagaaac 300AACATGCACA AAGGGCAGGG TTCTTGGTGT C7TTATTGTC AATGGCTtAT GCGAATCCAG 3SO

AGCTC7ACCT AACAACAAAT GGAAGTAATG CAGATGCCAA GTATGTCATA TACATGATTG 420

AGAAAGATCT AAAACGGCAA AAGTATGGAG GATTTGTGGT TAAGACGAGA GAGATGATAT 480

ATGAAAAGAC AACTGATTGG ATATTTGGAA GTGACCTGGA TTATGATCAG GAAACTATGT 54 0

TGCAGAACGG CAGGAACAAT TCAACAATTG AAGACCTTGT CCACACATTT GGC-TATCCAT 600

CATGTTTAGG AGCTCTTATA ATACAGATCT GGATAGTTCT GGTCAAAGCT ATCACTAGTA 660

TCTCAGGGTT AAGAAAAGGC TTTTTCACCC GATTGGAAGC TTTCAGACAA GA7GGAACAG 72 0

TGCAGGCAGG GCTGGTATTG AGCGGTGACA CAGTGGATCA GATTGGGTCA ATCATGCGGT 78 0

CTCAACAGAG CTTGGTAACT CTTATGGTTG AAACATTAAT AACAATGAAT ACCAGCAGAA 34 0

ATGACCTCAC AACCATAGAA AAGAATATAC AAATTGTTGG CAACTACATA AGAGATGCAG 90 0

GTCTCGCTTC ATTCTTCAAT ACAATCAGAT ATGGAATTGA GACCAGAATG GCAGCTTTGA 95 0

CTCTATCCAC TCTCAGACCA GATATCAATA C-ATTAAAAGC TTTGATGGAA CTGTATTTAT 102 0

CAAAGGGACC ACGCGCTCCT TTCATCTGTA TCCTCAGAGA TCCTATACAT GGTGAGTTCG 108 0

CACCAGGCAA CTATCCTGCC ATATGGAGCT ATGCAATGGG GGTGGCAGTT GTACAAAATA 114 0

GAGCCATGCA ACAGTATGTG ACGGGAAGAT CATATCTAGA CATTGATATG TTCCAGCTAG 1200

GACAAGCAGT AGCACGTGAT GCCGAAGCTC AAATGAGCTC AACACTGGAA GATGAACTTG 1260

GAGTGACACA CGAAGCTAAA GAAAGCTTGA AGAGACATAT AAGGAACATA AACAC-TTCAG 1320

AGACATCTTT CCACAAACCG ACAGGTGGAT CAGCCATAGA GATGGCAATA GATGAAGAGC 13 8 0

CAGAACAATT CGAACATAGA GCAGATCAAG AACAAAATGG AGAACCTCAA TCATCCATAA 14 4 0

TTCAATATGC CTGGGCAGAA GGAAATAGAA GCGATGATCA GACTGAGCAA GCTACAGAAT 1500

CTGACAATAT CAAGACCGAA CAACAAAACA TCAGAGACAG ACTAAACAAG AGACTCAACG 1560

ACAAGAAGAA ACAAAGCAGT CAACCACCCA CTAATCCCAC AAACAGAACA AACCAGGACG 162 0

AAATAGATGA TCTGTTTAAC GCATTTGGAA GCAACTAATC GAATCAACAT TTTAATCTAA 16 8 0

ATCAATAATA AATAAGAAAA ACTTAGGATT AAAGAATCCT ATCATACCGG AATATAGGGT 174 0

GGTAAATTTA GAGTCTGCTT GAAACTCAAT CAATAGAGAG TTGATGGAAA GCGATGCTAA 1800

AAACTATCAA ATCATGGATT CTTGGGAAGA GGAATCAAGA GATAAATCAA CTAATATCTC 1860

CTCGGCCCTC AACATCATTG AATTCATACT CAGCACCGAC CCCCAAGAAG ACTTATCGGA 192 0

AAACGACACA ATCAACACAA GAACCCAGCA ACTCAGTGCC ACCATCTGTC AACCAGAAAT 19 30

CAAACCAACA GAAACAAGTG AGAAAGATAG TGGATCAACT GACAAAAATA GACAGTCTGG 2040

GTCATCACAC GAATGTACAA CAGAAGCAAA AGATAGAAAC ATTGATCAGG AAACTGTACA 2100

GAGAGGACCT GGGAGAAGAA GCAGCTCAGA TAGTAGAGCT GAGACTGTGG TCTCTGGAC-G 216 0

AATCCCCAGA AGCATCACAG ATTCTAAAAA TGGAACCCAA AACACGGAGG ATATTGATCT 222 0

CAATGAAATT AGAAAGATGG ATAAGGACTC TATTGAGGGG AAAATGCGAC AATCTGCAAA 22 8 0

TGTTCCAAGC GAGATATCAG GAAGTGATGA CATATTTACA ACAGAACAAA GTAGAAACAG 2340

TGATCATGGA AGAAGCCTGG AATCTATCAG TACACCTGAT ACAAGATCAA TAAGTGTTGT 24 00TACTGCTGCA ACACCAGATG ATGAAGAAGA AATACTAATG AAAAATAGTA CGAGAAAGAA 7.460

AAGTTCTTCA ACACATCAAG AAGATGACAA AAGAATTAAA AAAGGGGGAA AAGGGAAAGA 2 52 0

CTGGTTTAAG AAATCAAAAG ATACCGACAA CCAGATACCA ACATCAGACT ACAGATCCAC 2 580

ATCAAAAGGG CAGAAGAAAA TCTCAAAGAC AACAACCACC AACACCGACA CAAAGGGGCA 2 64 0

AACAGAAATA CAGACAGAAT CATCAGAAAC ACAATCCTCA TCATGGAATC TCATCATCGA 2 7 00

CAACAACACC GACCGGAACG AACAGACAAG CACAACTCCT CCAACAACAA CTTCCAGATC 2 7 60

AACTTATACA AAAGAATCGA TCCGAACAAA CTCTGAATCC AAACCCAAGA CACAAAAGAC 2 320

AAATGGAAAG GAAAGGAAGG ATACAGAAGA GAGCAATCGA TTTACAGAGA GGGCAATTAC 2880

TCTATTGCAG AATCTTGGTG TAATTCAATC CACATCAAAA CTAGATTTAT ATCAAGACAA 2 94 0

ACGAGTTGTA TGTGTAGCAA ATGTACTAAA CAATGTAGAT ACTGCATCAA AGA7AGATTT 3 0 00

CCTGGCAGGA TTAGTCATAG GGGTTTCAAT GGACAACGAC ACAAAATTAA CACAGATACA 3 06 0

AAATGAAATG CTAAACCTCA AAGCAGATCT AAAGAAAATG GACGAATCAC ATAGAAGATT 312 0

GATAGAAAAT CAAAGAGAAC AACTGTCATT GATCACGTCA CTAATTTCAA ATCTCAAAAT 318 0

TATGACTGAG AGAGGAGGAA AGAAAGACCA AAATGAATCC AATGAGAGAG TATCCATGAT 3 24 0

CAAAACAAAA TTGAAAGAAG AAAAGATCAA GAAGACCAGG TTTGACCCAC TTATGGAGGC 3 3 00

ACAAGGCATT GACAAGAATA TACCCGATCT ATATCGACAT GCAGGAGATA CACTAGAGAA 3360

CGATGTACAA GTTAAATCAG AGATATTAAG TTCATACAAT GAGTCAAATG CAACAAGACT 3420

AATACCCAAA AAAGTGAGCA GTACAATGAG ATCACTAGTT GCAGTCATCA ACAACAGCAA 34 80

TCTCTCACAA AGCACAAAAC AATCATACAT AAACGAACTC AAACGTTGCA AAAATGATGA 3 54 0

AGAAGTATCT GAATTAATGG ACATGTTCAA TGAAGATGTC AACAATTGCC AATGATCCAA 3 6 00

CAAAGAAACG ACACCGAACA AACAGACAAG AAACAACAGT AGATCAAAAC CTGTCAACAC 3 660

ACACAAAATC AAGCAGAATG AAACAACAGA TATCAATCAA TATACAAATA AGAAAAACTT 3 72 0

AGGATTAAAG AATAAATTAA TCCTTGTCCA AAATGAGTAT AACTAACTCT GCAATATACA 3 78 0

CATTCCCAGA ATCATCATTC TCTGAAAATG GTCATATAGA ACCATTACCA CTCAAAGTCA 3 84 0

ATGAACAGAG GAAAGCAGTA CCCCACATTA GAGTTGCCAA GATCGGAAAT CCACCAAAAC 3 900

ACGGATCCCG GTATTTAGAT GTCTTCTTAC TCGGCTTCTT CGAGATGGAA CGAATCAAAG 3 96 0

ACAAATACGG GAGTGTGAAT GATCTCGACA GTGACCCGAG TTACAAAGTT TGTGGCTCTG 4 020

GATCATTACC AATCGGATTG GCTAAGTACA CTGGGAATGA CCAGGAATTG TTACAAGCCG 4080

CAACCAAACT GGATATAGAA GTGAGAAGAA CAGTCAAAGC GAAAGAGATG GTTGTTTACA 414 0

CGGTACAAAA TATAAAACCA GAACTGTACC CATGGTCCAA TAGACTAAGA AAAGGAATGC 42 00

TGTTCGATGC CAACAAAGTT GCTCTTGCTC CTCAATGTCT TCCACTAGAT AGGAGCATAA 426 0

AATTTAGAGT AATCTTCGTG AATTGTACGG CAATTGGATC AATAACCTTG TTCAAAATTC 432 0

CTAAGTCAAT GGCATCACTA TCGTTAACCA ACACAATATC AATCAATCTG CAGGTACACA 438 0

TAAAAACAGG GGTTCAGACT GATTCTAAAG GGATAGTTCA AATTTTGGAT GAGAAAGGCG 444 0

AAAAATCACT GAATTTCATG GTCCATCTCG GATTGATCAA AAGAAAAGTA GGCAGAATGT 4 500ACTCTGTTGA ATACTGTAAA CAGAAAATCG AGAAAATGAG ATTGAlAm TCTTTAGGAC 4 56 0

TAGTTGGAGG AATCAGTCTT CATGTCAATG CAACTGGGTC CATATCAAAA ACACTAGCAA 45 2 0

GTCAGCTGGT ATTCAAAAGA GAGATTTGTT ATCCTTTAAT GGATCTAAAT CCGCATCTCA 468 0

ATCTAGTTAT CTGGGCTTCA TCAGTAGAGA TTACAAGAGT GGATGCAATT TTCCAACCTT 4 74 0

CTTTACCTGG CGAGTTCAGA TACTATCCTA ATATTATTGC AAAAGGAGTT GGGAAAATCA 4 8 00

AACAATGGAA CTAGTAATCT CTATTTTAGT CCGGACGTAT CTATTAAGCC GAAGCAAATA 4860

AAGGATAATC AAAAACTTAG GACAAAAGAG GTCAATACCA ACAACTATTA GCAGTCACAC 4 92 0

TCGCAAGAAT AAGAGAGAAG GGACCAAAAA AGTCAAATAG GAGAAATCA-A AACAAAAGGT 4 93 0

ACAGAACACC AGAACAACAA AATCAAAACA TCCAACTCAC TCAAAACAAA AATTCCAAAA 504 0

GAGACCGGCA ACACAACAAG CACTGAACAC AATGCCAACT TCAATACTGC TAATTATTAC 510 0

AACCATGATC ATGGCATCTT TCTGCCAAAT AGATATCACA AAACTACAGC ACGTAGGTGT 516 0

ATTGGTCAAC AGTCCCAAAG GGATGAAGAT ATCACAAAAC TTTGAAACAA GATATCTAAT 5220

TTTGAGCCTC ATACCAAAAA TAGAAGACTC TAACTCTTGT GGTGACCAAC AGATCAAGCA 5 23 0

ATACAAGAAG TTATTGGATA GACTGATCAT CCCTTTATAT GATGGATTAA GATTACAGAA 53 4 0

AGATGTGATA GTAACCAATC AAGAATCCAA TGAAAACACT GATCCCAGAA CAAAACGATT 54 00

CTTTGGAGGG GTAATTGGAA CCATTGCTCT GGGAGTAGCA ACCTCAGCAC AAATTACAGC 5460

GGCAGTTGCT CTGGTTGAAG CCAAGCAGGC AAGATCAGAC ATCGAAAAAC TCAAAGAAGC 552 0

AATTAGGGAC ACAAACAAAG CAGTGCAGTC AGTTCAGAGC TCCATAGGAA ATTTAATAGT 55 8 0

AGCAATTAAA TCAGTCCAGG ATTATGTTAA CAAAGAAATC GTGCCATCGA TTGCGAGGCT 5 640

AGGTTGTGAA GCAGCAGGAC TTCAATTAGG AATTGCATTA ACACAGCATT ACTCAGAATT 5 7 00

AACAAACATA TTTGGTGΑΤΑ ACATAGGATC GTTACAAGAA AAAGGAATAA AATTACAAGG 576 0

TATAGCATCA TTATACCGCA CAAATATCAC AGAAATATTC ACAACATCAA CAGTTGATAA 582 0

ATATGATATC TATGATCTGT TATTTACAGA ATCAATAAAG GTGAGAGTTA TAGATGTTGA 5880

CTTGAATGAT TACTCAATCA CCCTCCAAGT CAGACTCCCT TTATTAACTA GGCTGCTGAA 594 0

CACTCAGATC TACAAAGTAG ATTCCATATC ATATAACATC CAAAACAGAG AATGGTATAT 6000

CCCTCTTCCC AGCCATATCA TGACGAAAGG GGCATTTCTA GGTGGAGCAG ACGTCAAAGA 606 0

ATGTATAGAA GCATTCAGCA GCTATATATG CCCTTCTGAT CCAGGATTTG TATTAAACCA 6120

TGAAATAGAG AGCTGCTTAT CAGGAAACAT ATCCCAATGT CCAAGAACAA CGGTCACATC 6180

AGACATTGTT CCAAGATATG CATTTGTCAA TGGAGGAGTG GTTGCAAACT GTATAACAAC 624 0

CACCTGTACA TGCAACGGAA TTGGTAATAG AATCAATCAA CCACCTGATC AAGGAGTAAA 5 300

AATTATAACA CATAAAGAAT GTAGTACTGT GGGTATCAAC GGAATGCTGT TCAATACAAA 6360

TAAAGAAGGA ACTCTTGCAT TCTATACACC AAATGATATA ACACTAAACA ATTCTGTTAC 642 0

ACTGGATCCA ATTGACATAT CAATCGAGCT CAACAAGGCC AAATCAGATC TAGAAGAATC 64 8 0

AAAAGAATGG ATAAGAAGGT CAAATCAAAA ACTAGATTCT ATTGGAAATT GGCATCAATC 6 54 0

TAGCACTACA ATCATAATTA TTTTGATAAT GATCATTATA TTGTTTATAA TTAATATAAC 66 00GATAATTACA ATTGCAATTA AGTATTACAG AATTCAAAAG AGAAATCGAG TGC-ATCAA.-A 5Ó£0

TGACAAGCCA TATGTACTAA CAAACAAATA ACATATCTAC AGATCATTAG ATATTAAAAT 5 72 0

TATAAAAAAC TTAGGAGTAA AGTTACGCAA TCCAACTCTA CTCATATAAT TGAGGAAGGA 5 79 0

CCCAATAGAC AAATCCAAAT TCGAGATGGA ATACTGGAAG CATACCAATC ACGGAAAGGA 5 84 0

TGCTGGTAAT GAGCTGGAGA CGTCTATGGC TACTCATGGC AACAAGCTCA CTAATAAGAT 5 900

AATATACATA TTATGGACAA TAATCCTGGT GTTATTATCA ATAGTCTTCA TCATAGTGCT 5 96 0

AATTAATTCC ATCAAAAGTG AAAAGGCCCA CGAATCATTG CTGCAAGACA TAAATAATGA 7020

GTTTATGGAA ATTACAGAAA AGATCCAAAT GGCATCGGAT AATACCAATG ATCTAATACA 7 08 0

GTCAGGAGTG AATACAAGGC TTCTTACAAT TCAGAGTCAT C-TCCAGAATT ACATACCAAT 714 0

ATCATTGACA CAACAGATGT CAGATCTTAG GAAATTCATT AGTGAAATTA CAATTAGAAA 7 2 00

TGATAATCAA GAAGTGCTGC CACAAAGAAT AACACATGAT GTAGGTATAA AACCTTTAAA 72 6 0

TCCAGATGAT TTTTGGAGAT GCACGTCTGG TCTTCCATCT TTAATGAAAA CTCCAAAAAT 73 2 0

AAGGTTAATG CCAGGGCCGG GATTATTAGC TA7GCCAACG ACTGTTGATG GCTGTGTTAG 73 3 0

AACTCCGTCT TTAGTTATAA ATGATCTGAT TTATGCTTAT ACCTCAAATC TAATTACTCG 74 4 0

AGGTTGTCAG GATATAGGAA AATCATATCA AGTCTTACAG ATAGGGATAA TAACTGTAAA 7 5 00

CTCAGACTTG GTACCTGACT TAAATCCTAG GATCTCTCAT ACCTTTAACA TAAATGACAA 7 55 0

TAGGAAGTCA TGTTCTCTAG CACTCCTAAA TATAGATGTA TATCAACTGT GTTCAACTCC 7S2 0

CAAAGTTGAT GAAAGATCAG ATTATGCATC ATCAGGCATA GAAGATATTG TACTTGATAT 75 8 0

TGTCAATTAT GATGGTTCAA TCTCAACAAC AAGATTTAAG AATAATAACA TAAGCTTTGA 7 74 0

TCAACCATAT GCTGCACTAT ACCCATCTGT TGGACCAGGG ATATACTACA AAGGCAAAAT 7 8 00

AATATTTCTC GGGTATGGAG GTCTTGAACA TCCAATAAAT GAGAATGTAA TCTC-CAACAC 7 35 0

AACTGGGTGC CCCGGGAAAA CACAGAGAGA CTGTAATCAA GCATCTCATA GTAC7TGGTT 7 92 0

TTCAGATAGG AGGATGGTCA ACTCCATCAT TGTGGCTGAC AAAGGCTTAA ACTCAATTCC 798 0

AAAATTGAAA GTATGGACGA TATCTATGCG ACAAAATTAC TGGGGGTCAG AAGGAi-GGTT 8 04 0

ACTTCTACTA GGTAACAAGA TCTATATATA TACAAGATCT ACAAGTTGGC ATAGCAAGTT 8100

ACAATTAGGA ATAATTGATA TTACTGATTA CAGTGATATA AGGATAAAAT GGACATGGCA 915 0

TAATGTGCTA TCAAGACCAG GAAACAATGA ATGTCCATGG GGACATTCAT GTCCAGATGG 822 0

ATGTATAACA GGAGTATATA CTGATGCATA TCCACTCAAT CCCACAGGGA GCATTGTGTC 92 3 0

ATCTGTCATA TTAGACTCAC AAAAATCGAG AGTGAACCCA GTCATAACTT ACTCAACAGC 8 34 0

AACCGAAAGA GTAAACGAGC TGGCCATCCT AAACAGAACA CTCTCAGCTG GATATACAAC 84 00

AACAAGCTGC ATTACACACT ATAACAAAGG ATATTGTTTT CATATAGTAG AAATAAATCA 84 50

TAAAAGCTTA AACACATTTC AACCCATGTT GTTCAAAACA GAGATTCCAA AAAGCTGCAG 8 52 0

TTAATCATAA TTAACCATAA TATGCATCAA TCTATCTATA ATACAAGTAT ATGATAAGTA 8 58 0

ATCAGCAATC AGACAATAGA CAAAAGGGAA ATATAAAAAA CTTAGGAGCA AAGCGTGCTC 8 64 0

GGGAAATGGA CACTGAATCT AACAATGGCA CTGTATCTGA CATACTCTAT CCTGAGTGTC 8 7 00ACCTTAACTC TCCTATCGTT AAAGGTAAAA TAGCACAATT ACACACTATT ATGAGTCTAC 3 76 0

CTCAGCCTTA TGATATGGAT GACGACTCAA TACTAGTTAT CACTAGACAG AAAATAAAAC 8 820

TTAATAAATT GGATAAAAGA CAACGATCTA TTAGAAGATT AAAATTAATA TTAACTGAAA 8880

AAGTGAATGA CTTAGGAAAA TACACATTTA TCAGATATCC AGAAATGTCA AAAGAAATGT 8 94 0

TCAAATTATA TATACCTGGT ATTAACAGTA AAGTGACTGA ATTATTACTT AAAGCAGATA 9000

GAACATATAG TCAAATGACT GATGGATTAA C-AGATCTATG GATTAATGTG CTATCAAAAT 905 0

TAGCCTCAAA AAATGATGGA AGCAATTATG ATCTTAATGA AGAAATTAAT AATATATCGA 9120

AAGTTCACAC AACCTATAAA TCAGATAAAT GGTATAATCC ATTCAAAACA TGGTTTACTA 918 0

TCAAGTATGA TATGAGAAGA TTACAAAAAG CTCGAAATGA GATCACTTTT AATGTTGGGA S24 0

AGGATTATAA CTTGTTAGAA GACCAGAAGA ATTTCTTATT GATACATCCA GAATTGGTTT 93 0 0

TGATATTAGA TAAACAAAAC TATAATGGTT ATCTAATTAC TCCTGAATTA GTATTC-ATGT 93 6 0

ATTGTGACGT AGTCGAAGGC CGATGGAATA TAAGTGCATG TGCTAAGTTA GATCCAAAAT 94 2 0

TACAATCTAT GTATCAGAAA GGTAATAACC TGTGGGAAGT GATAGATAAA TTGTTTCCAA 94 8 0

TTATGG3AGA AAAGACATTT GATGTGATAT CGTTATTAGA ACCACTTGCA TTATCCTTAA S54 0

TTCAAACTCA TGATCCTGTT AAACAACTAA GAGGAGCTTT TTTAAATCAT GTGTTATCCG 9600

AGATGGAATT AATATTTGAA TCTAGAGAAT CC-ATTAAGGA ATTTCTGAGT GTAGATTACA 9660

TTGATAAAAT TTTAGATATA TTTAATAAGT CTACAATAGA TGAAATAGCA GAGATTTTCT 972 0

CTTTTTTTAG AACATTTGGG CATCCTCCAT TAGAAGCTAG TATTGCAGCA GAAAAGC-TTA 978 0

GAAAATATAT GTATATTGGA AAACAATTAA AATTTGACAC TATTAATAAA TGTCATGCTA 9 84 0

TCTTCTGTAC AATAATAATT AACGGATATA GAGAGAGGCA TGGTGGACAG TGGCCTCCTG 9 900

TGACATTACC TGATCATGCA CACGAATTCA TCATAAATGC TTACGGTTCA AACTCTGCGA 996 0

TATCATATGA AAATGCTGTT GATTATTACC AGAGCTTTAT AGGAATAAAA TTCAATAAAT 10020

TCATAGAGCC TCAGTTAGAT GAGGATTTGA CAATTTATAT GAAAGATAAA GCATTATCTC 10080

CAAAAAAATC AAATTGGGAC ACAGTTTATC CTGCATCTAA TTTACTGTAC CGTACTAACG 1014 0

CATCCAACGA ATCACGAAGA TTAGTTGAAG TATTTATAGC AGATAGTAAA TTTGATCCTC 10200

ATCAGATATT GGATTATGTA GAATCTGGGG ACTGGTTAGA TGATCCAGAA TTTAATATTT 102 60

CTTATAGTCT TAAAGAAAAA GAGATCAAAC AGGAAGGTAG ACTCTTTGCA AAAATGACAT 10320

ACAAAATC-AG AGCTACACAA GTTTTATCAG AGACCCTACT TGCAAATAAC ATAGGAAAAT 10380

TCTTTCAAGA AAATGGGATG GTGAAGGGAG AGATTGAATT ACTTAAGAGA TTAACAACCA 10440

TATCAATATC AGGAGTTCCA CGGTATAATG AAGTGTACAA TAATTCTAAA AGCCATACAG 10500

ATGACCTTAA AACCTACAAT AAAATAAGTA ATCTTAATTT GTCTTCTAAT CAGAAATCAA 10560

AGAAATTTGA ATTCAAGTCA ACGGATATCT ACAATGATGG ATACGAGACT GTGAGCTGTT 10620

TCCTAACAAC AGATCTCAAA AAATACTGTC TTAATTGGAG ATATGAATCA ACAGCTCTAT 10680

TTGGAGAAAC TTGCAACCAA ATATTTGGAT TAAATAAATT GTTTAATTGG TTACACCCTC 10740

GTCTTGAAGG AAGTACAATC TATGTAGGTG ATCCTTACTG TCCTCCATCA GATAAAGAAC 10800ATATATCATT AGAGGATCAC CCTGATTCTG GTTTTTACGT TCATAACCCA ^G1AidGGGTA iOSÇO

TAGAAGGATT TTGTCAAAAA TTATGGACAC TCATATCTAT AAGTGCAATA CATCTAGCAG 10 920

CTGTTAGAAT AGGCGTGAGG GTGACTGCAA TGGTTCAAGG AGACAATCAA GCTATAGCTG 1098 0

TAACCACAAG AGTACCCAAC AATTATGACT ACAGAGTTAA GAAGGAGATA GTTTATAAAG 1104 0

ATGTAGTGAG ATTTTTTGAT TCATTAAGAG AAGTGATGGA TGATCTAGGT CATC-AACTTA 11100

AATTAAATGA AACGATTATA AGTAGCAAGA TGTTCATATA TAGCAAAAGA ATCTATTATG 1116 0

ATGGGAGAAT TCTTCCTCAA GCTCTAAAAG CATTATCTAG ATGTGTCTTC TGGTCAGAGA 1122 0

CAGTAATAGA CGAAACAAGA TCAGCATCTT CAAATTTGGC AACATCATTT GCAAAAGCAA 112 8 0

TTGAGAATGG TTATTCACCT GTTCTAGGAT ATGCATGCTC AATTTTTAAG AATATTCAAC 11340

AACTATATAT TGCCCTTGGG ATGAATATCA ATCCAACTAT AACACAGAAT ATCAGAGA7C 114 00

AGTATTTTAG GAATCCAAAT TGGATGCAAT ATGCCTCTTT AATACCTGCT AGTGTTGGGG 114 60

GATTCAATCA CATGGCGATG TCAAGATGTT TTGTAAGGAA TATTGGTGAT CCA7CAGTTG 1152 0

CCGCATTGGC TGATATTAAA AGATTTATTA AGGCGAATCT ATTAGACCGA AGTGTTCTTT 11580

ATAGGATTAT GAATCAAGAA CCAGGTGAGT CATCTTTTTT TGATTGGGCT TCAGATCCAT 1164 0

ATTCATGCAA TTTACCACAA TCTCAAAATA TAACCACCAT GATAAAAAAT ATAACAGCAA 11700

GGAATGTATT ACAAGATTCA CCAAATCCAT TATTATCTGG ATTATTCACA AATACAATGA 11750

TAGAAGAAGA TGAAGAATTA GCTGAGTTCC TGATGGACAG GAAGGTAATT CTCCCTAGAG 1182 0

TTGCACATGA TATTCTAGAT AATTCTCTCA CAGGAATTAG AAATGCCATA GCTGGAATGT 1188 0

TAGATACGAC AAAATCACTA ATTCGGGTTG GCATAAATAG AGGAGGACTG ACATATAGTT 1194 0

TGTTGAGGAA AATCAGTAAT TACGATCTAG TACAATATGA AalCACTAAGT AGGACTTTGC 12 000

GACTAATTGT AAGTGATAAA ATCAAGTATG AAGATATGTG TTCGGTAGAC CTTGCCATAC- 12 05 0

CATTGCGACA AAAGATGTGG ATTCATTTAT CAGGAGGAAG GATGATAAGT GGACTTGAAA 1212 0

CGCCTGACCC ATTAGAATTA CTATCTGGGG TAGTAATAAC AGGATCAGAA CATTGTAAAA 1218 0

TATGTTATTC TTCAGATGGC ACAAACCCAT ATACTTGGAT GTATTTACCC GGTAATATCA 1224 0

AAATAGGATC AGCAGAAACA GGTATATCGT CATTAAGAGT TCCTTATTTT GGATCAGTCA 123 00

CTGATGAAAG ATCTGAAGCA CAATTAGGAT ATATCAAGAA TCTTAGTAAA CCTGCAAAAG 12 360

CCGCAATAAG AATAGCAATG ATATATACAT GGGCATTTGG TAATGATGAG ATATCTTGGA 12 420

TGGAAGCCTC ACAGATAGCA CAAACACGTG CAAATTTTAC ACTAGATAGT CTCAAAATTT 124 8 0

TAACACCGGT AGCTACATCA ACAAATTTAT CACACAGATT AAAGGATACT GCAACTCAGA 12 54 0

TGAAATTCTC CAGTACATCA TTGATCAGAG TCAGCAGATT CATAACAATG TCCAATGATA 12 5 00

ACATGTCTAT CAAAGAAGCT AATGAAACCA AAGATACTAA TCTTATTTAT CAACAAATAA 12 66 0

TGTTAACAGG ATTAAGTGTT TTCGAATATT TATTTAGATT AAAAGAAACC ACAGGACACA 12 72 0

ACCCTATAGT TATGCATCTG CACATAGAAG ATGAGTGTTG TATTAAAGAA AGTTTTAATG 1278 0

ATGAACATAT TAATCCAGAG TCTACATTAG AATTAATTCG ATATCCTGAA AGTAATGAAT 128 40

TTATTTATGA TAAAGACCCA CTCAAAGATG TGGACTTATC AAAACTTATG GTTATTAAAG 12 900ACCATTCTTA CACAATTGAT ATGAATTATT GGGATGATAC TGACATCAΓΑ CATC-GAAT.TT 12350

CAATATGTAC TGCAATTACA ATAGCAGATA CTATGTCACA ATTAGATCGA GATAATTTAA 13 02 0

AAGAGATAAT AGTTATTGCA AATGATGATG ATATTAATAG CTTAATCACT GAATTTTTGA 13 080

CTCTTGACAT ACTTGTATTT CTCAAGACAT TTGGTGGATT ATTAGTAAAT CAATTTGCAT 1314 0

ACACTCTTTA TAGTCTAAAA ATAGAAGGTA GC-GATCTCAT TTGGGATTAT ATAATGAGAA 132 0 0

CACTGAGAGA TACTTCCCAT TCAATATTAA AAGTATTATC TAATGCATTA TCTCATCCTA 13260

AAGTATTCAA GAGGTTCTGG GATTGTGGAG TTTTAAACCC TATTTATGGG CCTAATATCG 13320

CTAGTCAAGA CCAGATAAAA CTTGCCCTAT CTATATGTGA ATATTCACTA GATCTATTTA 133 8 0

TGAGAGAATG GTTGAATGGT GTATCACTTG AAATATACAT TTGTGACAGC GATATGGAAG 13440

TTGCAAATGA TAGGAAACAA GCCTTTATTT CTAGACACCT TTCATTTGTT TGTTGTTTAG 13 5 00

CAGAAATTGC ATCTTTCGGA CCTAACCTGT TAAACTTAAC ATACTTGGAG AGACTTGATC 13 5S0

TATTGAAACA ATATCTTGAA TTAAATATTA AAGAAGACCC TACTCTTAAA TATGTACAAA 13620

TATCTGGATT ATTAATTAAA TCGTTCCCAT C.-.-.CTGTAAC ATACGTAAGA AAGACTGCAA 13680

TCAAATATCT AAGGATTCGC GGTATTAGTC CACCTGAGGT AATTGATGAT TGGGATCCGG 13 74 0

TAGAAGATGA AAATATGCTG GATAACATTG TCAAAACTAT AAATGATAAC TGTAATAAAG 13 3 00

ATAATAAAGG GAATAAAATT AACAATTTCT GGGGACTAGC ACTTAAGAAC TATCAAGTCC 13 8 60

TTAAAATCAG ATCTATAACA AGTGATTCTG ATGATAATGA TAGACTAGAT GCTAATACAA 13 920

GTGGTTTGAC ACTTCCTCAA GGAGGGAATT A7CTATCGCA TCAATTGAGA TTATTCGGAA 13 980

TCAACAGCAC TAGTTGTCTG AAAGCTCTTG AGTTATCACA AATTTTAATG AAGGAAGTCA 14 040

ATAAAGACAA GGACAGGCTC TTCCTGGGAG AAGGAGCAGG AGCTÁTGCTA GCATGTTATG 14100

ATGCCACATT AGGACCTGCA GTTAATTATT ATAATTCAGG TTTGAATATA ACAGATGTAA 1416 0

TTGGTCAACG AGAATTGAAA ATATTTCCTT CAGAGGTATC ATTAGTAGGT AAAAAATTAG 14 22 0

GAAATGTGAC ACAGATTCTT AACAGGGTAA AAGTACTGTT CAATGGGAAT CCTAATTCAA 1428 0

CATGGATAGG AAATATGGAA TGTGAGAGCT TAATATGGAG TGAATTAAAT GATAAGTCCA 14 34 0

TTGGATTAGT ACATTGTGAT ATGGAAGGAG CTATCGGTAA ATCAGAAGAA ACTGTTCTAC 144 00

ATGAACATTA TAGTGTTATA AGAATTACAT ACTTGATTGG GGATGATGAT GTTGTTTTAG 14460

TTTCCAAAAT TATACCTACA ATCACTCCGA ATTGGTCTAG AATACTTTAT CTATATAAAT 14 52 0

TATATTGGAA AGATGTAAGT ATAATATCAC TCAAAACTTC TAATCCTGCA TCAACAGAAT 14 580

TATATCTAAT TTCGAAAGAT GCATATTGTA CTATAATGGA ACCTAGTGAA ATTGTTTTAT 14 64 0

CAAAACTTAA AAGATTGTCA CTCTTGGAAG AAAATAATCT ATTAAAATGG ATCATTTTAT 14 7 00

CAAAGAAGAG GAATAATGAA TGGTTACATC ATGAAATCAA AGAAGGAGAA AGAGATTATG 14 76 0

GAATCATGAG ACCATATCAT ATGGCACTAC AAATCTTTGG ATTTCAAATC AATTTAAATC 14 82 0

ATCTGGCGAA AGAATTTTTA TCAACCCCAG ATCTGACTAA TATCAACAAT ATAATCCAAA 148 8 0

GTTTTCAGCG AACAATAAAG GATGTTTTAT TTGAATGGAT TAATATAACT CATGATGATA 14 94 0

AGAGACATAA ATTAGGCGGA AGATATAACA TATTCCCACT GAAAAATAAG GGAAAGTTAA 1500CGACTGCTATC GAGAAGACTA GTATTAAGTT GGATTTCATT ATCRTTATCG TTACAGGTCG CTTTCCTGAT GAAAAATTTG AACATAGAGC ACAGACTGGA TATGTA TCAT 15120TAGCTGATAC TGATTTAGAA TCATTAAAGT TATTGTCGAA AAACATCATT AAGAAT TACA 15180GAGAGTGTAT AGGATCAATA TCATATTGGT TTCTAACCAA AGAAGTTAAA ATACTT ATGA 15240AATTGATCGG TGGTGCTAAA TTATTAGGAA TTCCCAGACA ATATAAAGAA CCCGAA GACC 15300AGTTATTAGA AAACTACAAT CAACATGATG AATTTGATAT CGATTAAAAC ATAAAT ACAA 15360TGAAGATATA TCCTAACCTT TATCTTTAAG CCTAGGAATA GACAAAAAGT AAGAAA .-ACA 15420TGTAATATAT ATATAC CAAA CAGAGTTCTT CTCTTGTTTG GT 15462

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 46:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 12 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico(C) FILAMENTOS: único

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(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 46:TTGTCTGGGA AT

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 47:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 12 pares de base

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(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 47:TTGCCTGGGA AT

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 48:(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 12 pares de base(B) TIPO: ácido nucleico(C) FILAMENTOS: único

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(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 48:TTGTTTGGGA AT 12

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 49:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 12 pares de base

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(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 49:TTGTCTGGTA AT 12

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 50:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 12 pares de base

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AACTTTAAAT TA 12

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 51:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 12 pares de base

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(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 51:AACTTAAAAT TA 12(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 52:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

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(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 52:

TTAAAGACAT TG 12

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 53:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 12 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 53:

TTT AAGACAT TG 12

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 54:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 12 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 54:GCAGATGTCA AG

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 55:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 12 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 55:

GC AG ATGCC A AG 12

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 56:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 12 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 56:CGAATCTAAA GA 12

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 57:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 12 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 57:CGAAGCTAAAGA 12

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 58:

Claims (54)

1. Molécula isolada de polinucleotídeo, caracterizada pelo fatode que compreende um promotor transcricional operavelmente ligado,seqüências de nucleotídeo codificando proteínas Ν, P e L de PIV, umaseqüência de polinucleotídeo que codifica um genoma ou antigenoma de PIVe um terminador transcricional, em que a dita seqüência de polinucleotídeoque codifica o dito genoma ou anti-genoma de PIV é modificado pelaintrodução de uma seqüência heteróloga de PIV selecionada de umaseqüência HPIV1, uma seqüência HPIV2, uma seqüência HPIV3, umaseqüência BPIV ou uma seqüência MPIV para formar um genoma ou anti-genoma quimérico de PIV, em que com a expressão de dita molécula depolinucleotídeo, produz-se um PIV infeccioso, atenuado e imunogênicocompreendendo dito genoma ou anti-genoma quimérico.

2. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que um gene ou segmento de genede PIV3 humano é substituído por um gene ou segmento de gene decontraparte de um PIV heterólogo.

3. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o gene ou segmento de genede contraparte é um gene ou segmento de gene glicoproteínico HN ou F doHPIVl ou HPIV2.

4. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 2, caracterizada pelo fato de que um gene glicoproteínico HNou F do PIVl ou PIV2 é substituído no lugar do gene glicoproteínico HN ouF da contraparte do HPIV3.

5. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a seqüência de polinucleotídeoque codifica o genoma ou o anti-genoma incorpora um gene ou segmento degene do BPIV.

6. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que incorpora uma seqüênciaheteróloga do RSV.

7. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a seqüência heteróloga doRSV é um gene ou segmento de gene G ou F.

8. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que incorpora uma seqüênciaheteróloga do vírus do sarampo.

9. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a seqüência heteróloga dovírus do sarampo é um gene ou segmento de gene HA ou F.

10. Molécula isolada de polinucleotídeo, caracterizada pelofato de que compreende um promotor transcricional operavelmente ligado,uma seqüência de polinucleotídeo que codifica um genoma ou antigenoma dePIV e um terminador transcricional, em que a dita seqüência depolinucleotídeo que codifica o dito genoma ou anti-genoma de PIV éselecionada do grupo consistindo de:i) p218 (131) (SEQ ID NO: 1);ii) p3/7 (131) (SEQ ID NO: 14); ouiii) p3/7 (131) 2G (SEQ ID NO: 15);que é modificado pela introdução de uma seqüênciaheteróloga de PIV selecionada de uma seqüência HPIV1, uma seqüênciaHPIV2, uma seqüência BPIV ou uma seqüência MPIV.

11. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que ditaseqüência de polinucleotídeo que codifica o dito genoma ou anti-genoma dePIV é adicionalmente modificada por uma inserção, rearranjo, supressão ousubstituição.

12. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a dita inserção, rearranjo,supressão ou substituição de nucleotídeo especifica uma alteração fenotípicaselecionada de atenuação, sensibilidade à temperatura, adaptação ao frio,tamanho pequeno de placa, restrição à faixa hospedeira ou uma mudança emum epítopo imunogênico do PIV.

13. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a dita seqüência depolinucleotídeo que codifica o dito genoma ou anti-genoma do PIV incorporamutações ts múltiplas.

14. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a dita seqüência depolinucleotídeo que codifica o dito genoma ou anti-genoma do PIV incorporamutações atenuadoras que não a ts múltiplas.

15. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a dita seqüência depolinucleotídeo que codifica o dito genoma ou anti-genoma do PIV incorporauma ou mais mutações do JS cp45.

16. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a dita seqüência depolinucleotídeo que codifica o dito genoma ou anti-genoma do PIV codificapelo menos uma substituição de aminoácido na proteína polimerase L.

17. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a substituição de aminoácidona proteína polimerase L ocorre em uma posição que corresponde a Tyr942,Leugg2 ou Thri558 do JS cp45.

18. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a dita seqüência depolinucleotídeo que codifica o dito genoma ou anti-genoma do PIV codificapelo menos uma substituição de aminoácido na proteína N.

19. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a substituição de aminoácidona proteína N ocorre em uma posição que corresponde aos resíduos Val96 ou Ser389 do JS cp45.

20. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a dita seqüência depolinucleotídeo que codifica o dito genoma ou anti-genoma do PIV codificapelo menos uma substituição de aminoácido na proteína C.

21. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a substituição de aminoácidona proteína C ocorre em uma posição que corresponde a Ilep6 do JS cp45.

22. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a dita seqüência depolinucleotídeo que codifica o dito genoma ou anti-genoma do PIV codificapelo menos uma substituição de aminoácido na proteína F.

23. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a substituição de aminoácidona proteína F ocorre em uma posição que corresponde a Ile42O ou Ala450 do JS cpA5.

24. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a dita seqüência depolinucleotídeo que codifica o dito genoma ou anti-genoma do PIV codificapelo menos uma substituição de aminoácido na proteína HN.

25. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a substituição de aminoácidona proteína HN ocorre em uma posição que corresponde ao resíduo Val384 doJS cp45.

26. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a dita seqüência depolinucleotídeo que codifica o dito genoma ou anti-genoma do PIV incorporapelo menos uma mutação em uma seqüência 3' líder.

27. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 26, caracterizada pelo fato de que a mutação na 3' líder ocorreem uma posição que corresponde ao nucleotídeo 23, 24, 28 ou 45 do JS cp45.

28. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a dita seqüência depolinucleotídeo que codifica o dito genoma ou anti-genoma do PIV incorporauma mutação em uma seqüência de início do gene N.

29. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 28, caracterizada pelo fato de que a mutação na seqüência deinício do gene N ocorre em uma posição que corresponde ao nucleotídeo 62do JS cp45.

30. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a dita seqüência depolinucleotídeo que codifica o dito genoma ou anti-genoma do PIV incorporauma das seguintes combinações de mutações:i) mutação dos nucleotídeos 23, 24, 25 e 45 da seqüência 3'líder, mutação do nucleotídeo 62 no sinal gênico de início do gene N,mutação do aminoácido correspondente a Val 96 para Ala e mutação doaminoácido correspondente a Ser 389 do gene N para Ala;ii) mutação do aminoácido correspondente a Ile420 daproteína F para Val e do aminoácido correspondente a Ala 450 da proteína Fpara Thr;iii) mutação dos nucleotídeos 23, 24, 25 e 45 da seqüência 3'líder, mutação do nucleotídeo 62 no sinal gênico de início do gene N,mutação do aminoácido correspondente a Val 96 para Ala e do aminoácidocorrespondente a Ser 389 do gene N para Ala, do aminoácido correspondentea Tyr 942 da proteína L para His, do aminoácido correspondente a Leu 992da proteína L para Phe e do aminoácido correspondente a Thr 1558 daproteína L para Ile;iv) mutação dos nucleotídeos 23, 24, 25 e 45 da seqüência 3'líder, mutação do nucleotídeo 62 no sinal gênico de início do gene N,mutação do aminoácido correspondente a Val 96 para Ala e mutação doaminoácido correspondente a Ser 389 do gene N para Ala; do aminoácidocorrespondente a Ile 96 da proteína C para Thr, do aminoácidocorrespondente a Pro 199 da proteína M para Thr, do aminoácidocorrespondente a Ile 420 da proteína F para Val e do aminoácidocorrespondente a Ala 450 da proteína F para Thr, e do aminoácidocorrespondente a Val 384 da proteína HN para Ala;v) mutação de nucleotídeos 23, 24, 25 e 45 da seqüência 3'líder, mutação de nucleotídeo 62 no sinal gênico de início do gene N,mutação do aminoácido correspondente a Val 96 para Ala e mutação doaminoácido correspondente a Ser 389 do gene N para Ala; do aminoácidocorrespondente a Ile 96 da proteína C para Thr, do aminoácidocorrespondente a Pro 199 da proteína M para Thr, do aminoácidocorrespondente a Ile 420 da proteína F para Val e do aminoácidocorrespondente a Ala 450 da proteína F para Thr, e do aminoácidocorrespondente a Val 384 da proteína HN para Ala, do aminoácidocorrespondente a Tyr 942 da proteína L para His, do aminoácidocorrespondente a Leu 992 da proteína L para Phe e do aminoácidocorrespondente a Thr 1558 da proteína L para lie.

31. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o PIV é HPIV3 incluindouma das seguintes combinações de mutações:i) mutação dos nucleotídeos 23, 24, 25 e 45 da seqüência 3'líder, mutação do nucleotídeo 62 no sinal gênico de início do gene N,mutação do aminoácido correspondente a Val 96 para Ala e mutação doaminoácido correspondente a Ser 389 do gene N para Ala;ii) mutação do aminoácido correspondente a Ile 96 da proteínaC para Thr;iii) mutação do aminoácido correspondente a Pro 199 daproteína M para Thr;iv) mutação do aminoácido correspondente a Ile 420 daproteína F para Val e do aminoácido correspondente a Ala 450 da proteína Fpara Thr;v) mutação do aminoácido correspondente a Val 384 daproteína HN para Ala;vi) mutação do aminoácido correspondente a Tyr 942 daproteína L para His, do aminoácido correspondente a Leu 992 da proteína Lpara Phe e do aminoácido correspondente a Thr 1558 da proteína L para lie;vii) mutação dos nucleotídeos 23, 24, 25 e 45 da seqüência 3'líder, mutação do nucleotídeo 62 no sinal gênico de início do gene N,mutação do aminoácido correspondente a Val 96 para Ala e do aminoácidocorrespondente a Ser 389 do gene N para Ala, do aminoácido correspondentea Tyr 942 da proteína L para His, do aminoácido correspondente a Leu 992da proteína L para Phe e do aminoácido correspondente a Thr 1558 daproteína L para lie;viii) mutação dos nucleotídeos 23, 24, 25 e 45 da seqüência 3'líder, mutação do nucleotídeo 62 no sinal gênico de início do gene N,mutação do aminoácido correspondente a Val 96 para Ala e mutação doaminoácido correspondente a Ser 389 do gene N para Ala; do aminoácidocorrespondente a Ile 96 da proteína C para Thr, do aminoácidocorrespondente a Pro 199 da proteína M para Thr, do aminoácidocorrespondente a Ile 420 da proteína F para Val e do aminoácidocorrespondente a Ala 450 da proteína F para Thr, e do aminoácidocorrespondente a Val 384 da proteína HN para Ala;ix) mutação de nucleotídeos 23, 24, 25 e 45 da seqüência 3'líder, mutação de nucleotídeo 62 no sinal gênico de início do gene N,mutação do aminoácido correspondente a Val 96 para Ala e mutação doaminoácido correspondente a Ser 389 do gene N para Ala; do aminoácidocorrespondente a Ile 96 da proteína C para Thr, do aminoácidocorrespondente a Pro 199 da proteína M para Thr, do aminoácidocorrespondente a Ile 420 da proteína F para Val e do aminoácidocorrespondente a Ala 450 da proteína F para Thr, e do aminoácidocorrespondente a Val 384 da proteína HN para Ala, do aminoácidocorrespondente a Tyr 942 da proteína L para His, do aminoácidocorrespondente a Leu 992 da proteína L para Phe e do aminoácidocorrespondente a Thr 1558 da proteína L para lie.

32. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a dita seqüência depolinucleotídeo que codifica o dito genoma ou anti-genoma do PIV incorporauma mutação estabilizada por substituições múltiplas de nucleotídeo em umcódon que especifica a mutação.

33. Molécula isolada de polinucleotídeo de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizada pelo fato de queincorpora uma seqüência de polinucleotídeo que codifica uma molécula quenão o PIV selecionada de uma citocina, um epítopo auxiliar T, um marcadorde restrição de sítio ou uma proteína de um patógeno microbiano capaz deevocar uma imuno resposta de proteção em um hospedeiro mamífero.

34. Composição de célula ou isenta de célula, caracterizadapelo fato de incluir que inclui um vetor de expressão que compreendeseqüências de polinucleotídeos codificando proteínas PIV, Ν, P e L, umamolécula isolada de polinucleotídeo que codifica um genoma ou anti-genomado PIV e um vetor de expressão que compreende uma ou mais moléculasisoladas de polinucleotídeo que codificam as proteínas Ν, P e L do PIV, pormeio do qual a expressão do dito genoma ou anti-genoma do PIV e asproteínas Ν, P e L produzem uma partícula de PIV infecciosa, atenuada eimunogênica.

35. Composição de célula ou isenta de célula de acordo com areivindicação 34, caracterizada pelo fato de que a partícula de PIV infecciosaé um vírus.

36. Composição de célula ou isenta de célula de acordo com areivindicação 34, caracterizada pelo fato de que a partícula de PIV infecciosaé uma partícula subviral.

37. Composição de célula ou isenta de célula de acordo com areivindicação 34, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo quecodifica o genoma ou anti-genoma do PIV e o um ou mais polinucleotídeosque codificam as proteínas Ν, P e L são incorporados dentro de um vetorúnico.

38. Partícula de PIV infeciosa, atenuada e imunogênica,caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo codificandoum genoma ou anti-genoma de PIV, uma proteína N, uma proteína P e umaproteína L, em que dita seqüência de polinucleotídeo codificando ditogenoma ou anti-genoma de PIV é modificada pela introdução de umaseqüência de PIV heteróloga selecionada dentre uma seqüência de HPIV1,uma seqüência de HPIV2, uma seqüência de HPIV3, uma seqüência de BPIVou uma seqüência de MPIV para formar um genoma ou anti-genoma de PIVquimérico.

39. Partícula de PIV infeciosa, atenuada de acordo com areivindicação 38, caracterizada pelo fato de que é uma partícula subviral.

40. Partícula de PIV infeciosa, atenuada de acordo com areivindicação 38, caracterizada pelo fato de que é um vírus.

41. Partícula de PIV infeciosa, atenuada de acordo com areivindicação 38, caracterizada pelo fato de que o genoma ou anti-genoma doPIV quimérico incorpora uma seqüência heteróloga do vírus RSV ou dosarampo.

42. Partícula de PIV infeciosa, atenuada de acordo com areivindicação 38, caracterizada pelo fato de que o genoma ou anti-genoma dePlV quimérico é selecionado de:i) p218 (131) (SEQ ID NO: 1);ii) p3/7 (131) (SEQ ID NO: 14); ouiii) p3/7 (131) 2G (SEQ ID NO: 15;que é modificado pela introdução de uma seqüência heteróloga de PIVselecionada de uma seqüência HPIV1, uma seqüência HPIV2, uma seqüênciaBPIV ou uma seqüência MPIV.

43. Partícula de PIV infeciosa, atenuada de acordo com areivindicação 38, caracterizada pelo fato de que o gene ou segmento de genede contraparte é um gene ou segmento de gene do gene glicoproteínico HNou F do HPIVl ou HPIV2.

44. Partícula de PIV infeciosa, atenuada de acordo com areivindicação 38, caracterizada pelo fato de que o genoma ou anti-genoma doPIV quimérico incorpora uma seqüência heteróloga do vírus RSV ou dosarampo.

45. Partícula de PIV infeciosa, atenuada de acordo com areivindicação 38, caracterizada pelo fato de que o genoma ou anti-genoma doPIV quimérico é adicionalmente modificado por uma inserção, rearranjo,supressão ou substituição que codifica uma alteração fenotípica selecionadade atenuação, sensibilidade à temperatura, adaptação ao frio, tamanhopequeno de placa ou restrição à faixa hospedeira, ou uma mudança em umepítopo imunogênico do PIV.

46. Partícula de PIV infeciosa, atenuada de acordo com areivindicação 45, caracterizada pelo fato de que o genoma ou anti-genoma doPIV quimérico incorpora mutações ts múltiplas.

47. Partícula de PIV infeciosa, atenuada de acordo com areivindicação 45, caracterizada pelo fato de que o genoma ou anti-genoma doPIV quimérico incorpora mutações atenuadoras não-to múltiplas.

48. Partícula de PIV infeciosa, atenuada de acordo com areivindicação 45, caracterizada pelo fato de que o genoma ou anti-genoma doPIV recombinante incorpora pelo menos uma mutação do JS cp45.

49. Partícula de PIV infeciosa, atenuada de acordo com areivindicação 48, caracterizada pelo fato de que a mutação do JS cpA5especifica uma substituição de aminoácido na proteína polimerase L.

50. Partícula de PIV infeciosa, atenuada de acordo com areivindicação 48, caracterizada pelo fato de que o genoma ou antigenoma dePIV quimérico inclui uma das seguintes combinações de mutações:i) mutação dos nucleotídeos 23, 24, 25 e 45 da seqüência 3'líder, mutação do nucleotídeo 62 no sinal gênico de início do gene N,mutação do aminoácido correspondente a Val 96 para Ala e mutação doaminoácido correspondente a Ser 389 do gene N para Ala;ii) mutação do aminoácido correspondente a Ile 96 da proteínaC para Thr;iii) mutação do aminoácido correspondente a Pro 199 daproteína M para Thr;iv) mutação do aminoácido correspondente a Ile 420 daproteína F para Val e do aminoácido correspondente a Ala 450 da proteína Fpara Thr;v) mutação do aminoácido correspondente a Val 384 daproteína HN para Ala;vi) mutação do aminoácido correspondente a Tyr 942 daproteína L para His, do aminoácido correspondente a Leu 992 da proteína Lpara Phe e do aminoácido correspondente a Thr 1558 da proteína L para lie;vii) mutação dos nucleotídeos 23, 24, 25 e 45 da seqüência 3'líder, mutação do nucleotídeo 62 no sinal gênico de início do gene N,mutação do aminoácido correspondente a Val 96 para Ala e do aminoácidocorrespondente a Ser 389 do gene N para Ala, do aminoácido correspondentea Tyr 942 da proteína L para His, do aminoácido correspondente a Leu 992da proteína L para Phe e do aminoácido correspondente a Thr 1558 daproteína L para lie;viii) mutação dos nucleotídeos 23, 24, 25 e 45 da seqüência 3'líder, mutação do nucleotídeo 62 no sinal gênico de início do gene N,mutação do aminoácido correspondente a Val 96 para Ala e mutação doaminoácido correspondente a Ser 389 do gene N para Ala; do aminoácidocorrespondente a Ile 96 da proteína C para Thr, do aminoácidocorrespondente a Pro 199 da proteína M para Thr, do aminoácidocorrespondente a Ile 420 da proteína F para Val e do aminoácido correspondente a Ala 450 da proteína F para Thr, e do aminoácidocorrespondente a Val 384 da proteína HN para Ala;ix) mutação de nucleotídeos 23, 24, 25 e 45 da seqüência 3'líder, mutação de nucleotídeo 62 no sinal gênico de início do gene N,mutação do aminoácido correspondente a Val 96 para Ala e mutação do aminoácido correspondente a Ser 389 do gene N para Ala; do aminoácidocorrespondente a Ile 96 da proteína C para Thr, do aminoácidocorrespondente a Pro 199 da proteína M para Thr, do aminoácidocorrespondente a Ile 420 da proteína F para Val e do aminoácidocorrespondente a Ala 450 da proteína F para Thr, e do aminoácido correspondente a Val 384 da proteína HN para Ala, do aminoácidocorrespondente a Tyr 942 da proteína L para His, do aminoácidocorrespondente a Leu 992 da proteína L para Phe e do aminoácidocorrespondente a Thr 1558 da proteína L para lie.

51. Partícula de PIV infeciosa, atenuada de acordo com areivindicação 38, caracterizada pelo fato de que uma mutação que especificauma alteração fenotípica selecionada de atenuação, sensibilidade àtemperatura, adaptação ao frio, tamanho pequeno de placa, restrição à faixahospedeira ou uma mudança em um epítopo imunogênico do PIV éincorporada em um antecedente quimérico do PIV que compreende umgenoma ou anti-genoma que tenha um ou mais genes ou segmentos de geneglicoproteínicos HN ou F do PIV3 substituídos por um ou mais genes ousegmentos de gene glicoproteínicos HN e F da contraparte PIVl ou PIV2.

52. Partícula de PIV infeciosa, atenuada de acordo com areivindicação 51, caracterizada pelo fato de que uma ou mais mutações do JScp45 são incorporadas no dito antecedente quimérico.

53. Partícula de PIV infeciosa, atenuada de acordo com areivindicação 38, caracterizada pelo fato de que o genoma ou anti-genoma dePIV quimérico é modificada para codificar uma molécula que não a do PIVselecionada de uma citocina, um epítopo auxiliar T, um marcador de restriçãode sítio ou uma proteína de um patógeno microbiano capaz de evocar umaimuno resposta de proteção em um hospedeiro mamífero.

54. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de quecompreende uma quantidade imunogenicamente eficaz de uma partícula dePIV infeciosa, atenuada como definida em qualquer uma das reivindicações- 38-49 ou 51-53 em um veículo farmaceuticamente aceitável.